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JP2001519354A - ヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体及びその調製方法と使用方法 - Google Patents

ヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体及びその調製方法と使用方法

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Publication number
JP2001519354A
JP2001519354A JP2000514923A JP2000514923A JP2001519354A JP 2001519354 A JP2001519354 A JP 2001519354A JP 2000514923 A JP2000514923 A JP 2000514923A JP 2000514923 A JP2000514923 A JP 2000514923A JP 2001519354 A JP2001519354 A JP 2001519354A
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JP
Japan
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group
conjugate
cryptate
fluorescent marker
fluorescent
Prior art date
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Pending
Application number
JP2000514923A
Other languages
English (en)
Inventor
エルベ バジン
ジェラール マチ
Original Assignee
セ ア エス バイオ アンテルナシィオナル
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by セ ア エス バイオ アンテルナシィオナル filed Critical セ ア エス バイオ アンテルナシィオナル
Publication of JP2001519354A publication Critical patent/JP2001519354A/ja
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    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H19/00—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof
    • C07H19/02—Compounds containing a hetero ring sharing one ring hetero atom with a saccharide radical; Nucleosides; Mononucleotides; Anhydro-derivatives thereof sharing nitrogen
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2458/00—Labels used in chemical analysis of biological material
    • G01N2458/40—Rare earth chelates

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  • Organic Chemistry (AREA)
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、核酸、あるいは、ヌクレオシド構造を有するもの、もしくは、核酸と相互作用が可能なものとされる、生物学的または臨床的に重要な分子の検出、局在化および／または単離のために使用することができる、新規なヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体に関する。さらに、本発明は、少なくとも１個のヌクレオチド蛍光接合体を含むポリヌクレオチドに関する。

Description

【発明の詳細な説明】
【０００１】 本発明は、特に、核酸、あるいは、ヌクレオシド構造を有するもの、もしくは
、核酸との相互作用が可能なものとされる、生物学的または臨床的に重要な分子
の検出、局在化および／または分離のために使用することができるヌクレオシド
もしくはヌクレオチド蛍光接合体に関する。
【０００２】 以下の記述においては、下記の略称が使用される。 ＲＮＡ：リボ核酸 ＤＮＡ：デオキシリボ核酸 Ａ：アデノシン Ｃ：シチジン Ｇ：グアノシン Ｔ：チミジン Ｕ：ウリジン Ｉ：イノシン サフィックスのＭＰ：一リン酸塩 サフィックスのＤＰ：二リン酸塩 サフィックスのＴＰ：三リン酸塩 プリフィックスのｄ：デオキシ
【０００３】 ＤＮＡの酵素合成反応にあっては、ＲＮＡまたはＤＮＡテンプレート，テンプ
レートがある部分に対して相補的な配列を有するオリゴヌクレオチドプライマー
，適切な酵素、及び、４種のデオキシヌクレオチド類ｄＡＴＰ，ｄＣＴＰ，ｄＧ
ＴＰ及びｄＴＴＰ（またはｄＵＴＰ）が用いられる。Ｅ．coli（大腸菌）ＤＮＡ
ポリメラーゼ，Ｔ７ ＤＮＡポリメラーゼ，ＤＮＡポリメラーゼの Klenow （ク
レノウ）断片，Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ及び逆転写酵素など種々の酵素類が
知られており、テンプートを必要としないという特殊な特性を有するターミナル
ヌクレオチジルトランスフェラーゼも斯かる酵素類に含められる。必要なプライ
マー及びテンプレートが異なること、及び、ＲＮＡポリメラーゼ存在下でリボヌ
クレオチド（ＡＴＰ，ＣＴＰ，ＧＴＰ及びＵＴＰ）が使用されることを除いて、
ＲＮＡ合成も同様に行われる。
【０００４】 ヌクレオチドもしくはポリヌクレオチドは、放射性標識（ 3Ｈ，32Ｐ，14Ｃ， 35 Ｓまたは 125Ｉ）を行うことができる。
【０００５】 標識分子の使用には、従来からの放射性同位元素が伴う欠点、即ち、放射能に
固有の危険性、さらには、放射性壊変及び放射線分解現象に起因する保存及び利
用の面での限界がある。
【０００６】 ヌクレオチドまたはポリヌクレオチドについての化学的標識にあっては、これ
らの欠点を回避することが可能であり、その旨は文献にも記載されている。例え
ば、ｄＵＴＰまたはＵＴＰから誘導されたヌクレオチドのビオチン標識について
は、文献：Langer P.R., Waldrop, A.A., Ward D.C., 1981, Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 78, 6633 −37、に記載されている。これらは、アルキルアミンアー
ムによってピリミジン環のＣ−５位にビオチンが結合した誘導体である。これら
の標識ヌクレオチドは、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼの作用によってインビ
トロでポリヌクレオチドに取り込まれ（ヨーロッパ特許：ＥＰ０ ０６３ ８７
９号）、ドットブロット反応（文献：Leary J.J., Brigati D.J.及び Ward D.D.
, 1983, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 80, 4045−49) という手段を用いて、核
酸の比色検出を行うことが可能とされる。
【０００７】 Ｎ−４−アミノアルキルデオキシシチジン及びＮ−６−アミノアルキルデオキ
シアデノシン誘導体に基づくその他のビオチン標識ヌクレオチド類似体について
は、米国特許第４，８２８，９７９号、及び、文献：Gebegehu G.G. ・他，Nucl
eic Acides Res., 1987, 15, 4513 −4534、に記載されている。
【０００８】 ｄＵＴＰ及びｄＡＴＰがＣ−８位でビオチン置換された誘導体、及び、７−デ
アザプリンのＣ−７置換の可能性についても、ヨーロッパ特許：ＥＰ０ ０６３
８７９号）に記載されている。
【０００９】 また、誘導体ｂｉｏ−１５−ｄＧＴＰについても、文献：Gilliam I.C.及び T
ener G.M., 1989, Nucleoside & Nucleotide, 8, 1453 −62、に記載されている
。フルオレセインまたはローダミンのような蛍光誘導体も、標識ヌクレオシド三
リン酸塩（ｄＡＴＰ，ｄＵＴＰ，ｄＣＴＰ）を介して核酸に取り込まれる（国際
特許出願：ＷＯ ９３ １９２０６）。プリン及びプリミジン上での置換位置及
びフルオレセイン誘導体によるジデオキシヌクレオチドの標識に使用できるスペ
ーサーアームの性質についての検討は、配列決定のためのチェーンターミネータ
に向けられたものではあったものの、標識ヌクレオチド化学（文献：Confalone
P.T., 1990, J. Heterocyclic Chem., 27, 31 −46) の概観を供するものとなっ
ている。
【００１０】 異なるトレーサで標識したヌクレオシド三リン酸塩（ビオチン−１１−ｄＵＴ
Ｐ， dig−１１−ｄＵＴＰ及びＦＩＴＣ−１１−ｄＵＴＰ）の併用によって、ハ
イブリダイゼーション時に異なる配列類の同時可視化が可能とされる（文献：RI
ED T. ・他，Proc. Natl. Acad. Sci. USA (1992), 89, 1388 −1392) 。
【００１１】 Ｆ１−ｄＵＴＰまたはＦ１−ｄＣＴＰのようなフルオレセイン標識デオキシヌ
クレオチドの取り込みは、また、未変性ヌクレオチドの一部のみを標識化合物で
置換することによって行うことができる：ｄＣＴＰ／Ｆ１−ｄＣＴＰ約２：１（
国際特許出願：ＷＯ ９３／１９２０６）。同特許は、酵素と実験条件を選択す
ることによって、１個のヌクレオチドの全体を標識ヌクレオチドによって置換可
能であると述べている。
【００１２】 この文献データは、三リン酸塩結合体の取り込み効率は、ビオチンのような分
子と結合させることによって、及び、それよりは程度は低いが結合を可能とする
アームの存在によって変化することを示している。
【００１３】 例えば、文献：Gebeyehu G. ・他，Nucleic Acids Res., 1987, 15, 4525、に
おいては、ＤＮＡポリメラーゼ存在下におけるニックトランスレーション反応の
もとでの種々の三リン酸塩類似体の取込み程度が、同一反応時間（９０分）の間
、未変性ヌクレオシド（１００％取込み）を基準として比較されている。
【００１４】 ヌクレオシド三リン酸塩と結合した分子（文献: Goodchild, J. Bioconjugate
Chem., 1990, p. 171; Kricka J., Non isotopic Blotting, and Sequencing(
“非同位元素性ブロッティング及び配列決定”); 1995, Academic Press, p. 47
;Zhu Z. ・他, Nucleic Acids Res., 1994, 3418−3422) は、中性であるかまた
は陰性荷電であり、かつ、必須のプラナー形状を有している比較的小さい( ＜８
００ Ｄａ）分子である。その結果、それらの容積は低下するが、ヌクレオシド
三リン酸塩の酵素的取込みを阻害するには充分である。
【００１５】 こうしたもとで、この発明は、新規なヌクレオシドもしくはヌクレオチド接合
体に係る。この新規なヌクレオシドもしくはヌクレオチド接合体は、少なくとも
１個の環内炭素原子，プリンもしくはピリミジン環の環外窒素原子、あるいは、
ペントフラノース単位を成す炭素原子が蛍光マーカーとの結合に関与するものと
された、未変性の，化学的に修飾された、もしくは、１種以上の標識分子類と結
合したリボヌクレオシド，リボヌクレオチド，デオキシリボヌクレオシドもしく
はデオキシリボヌクレオチドと、希土類クリプテートから成り、上述の原子と結
合した少なくとも１個の蛍光マーカーとを含むのとされる。
【００１６】 斯かる新規なヌクレオシドもしくはヌクレオチド接合体のより望ましいものは
、少なくとも１個の環内炭素原子あるいはプリンもしくはピリミジン環の環外窒
素原子が蛍光マーカーとの結合に関与するものとされた、未変性の，化学的に修
飾された、もしくは、１種以上の標識分子類と結合したリボヌクレオシド，リボ
ヌクレオチド，デオキシリボヌクレオシドもしくはデオキシリボヌクレオチドと
、希土類クリプテートから成り、上述の原子と結合した少なくとも１個の蛍光マ
ーカーとを含むものとされる。
【００１７】 このようなヌクレオシドもしくはヌクレオチド接合体は、標識ヌクレオシドあ
るいはヌクレオチドのいかなる適用においても使用でき、それらの使用で大きな
不利益をもたらすことがない。そして、それらは、一重鎖または二重鎖ＤＮＡに
おける取込みにおいて高い可能性を有している。
【００１８】 これらの性質は、希土類クリプテートが高分子量（１４００ Ｄａを超える）
を有する分子であるがゆえに驚くべきことであり、全体的に平面の分子に比べて
より高い立体阻害を示す三次元構造を有していて、錯体化されたイオンの存在に
よるイオン性があり、それらに陽性荷電を与える。
【００１９】 これらの構造的特性を考慮すれば、希土類クリプテートの陽性荷電は、三リン
酸塩基の陽性荷電と強く相互作用し、その反応性及び希土類クリプテートの蛍光
性の改変を期待することができる。
【００２０】 また、ポリメラーゼの如くの酵素の活性は反応媒体中のある錯化イオン類また
は錯化剤の存在及び濃度に敏感であるので、本発明に係る接合体は、特に、ポリ
ヌクレオチド合成において、ヌクレオチド三リン酸塩の取込みをかなり低下させ
、従って、低収率をもたらすことを期待することができる。
【００２１】 驚くべきことに、本発明による接合体が用いられて得られた結果から、本発明
による接合体が酵素反応を伴う状況のもとに用いられるとき、希土類クリプテー
トが、好ましくない影響をもたらさないだけでなく、固有の蛍光性を保持するこ
とが明らかにされた。
【００２２】 また、本発明による接合体が、新規の蛍光特性を有していること、及び、特に
前述の錯化希土類イオンの発光寿命が増大せしめられることも見出された。従っ
て、本発明による接合体は、蛍光を直接的あるいは間接的に測定することによる
量的または質的検出が行われる様々な状況下において、蛍光マーカーとして使用
することができる。
【００２３】 本発明に係るヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体は、その好ましい
例の場合、ＡＭＰ，ＡＤＰ，ＡＴＰ，ＧＭＰ，ＧＤＰ，ＧＴＰ，ＣＭＰ，ＣＤＰ
，ＣＴＰ，ＵＭＰ，ＵＤＰ，ＵＴＰ，ＴＭＰ，ＴＤＰ，ＴＴＰ，２Ｍｅ−ＡＭＰ
，２Ｍｅ−ＡＤＰ，２Ｍｅ−ＡＴＰ，１Ｍｅ−ＧＭＰ，１Ｍｅ−ＧＤＰ，１Ｍｅ
−ＧＴＰ，５Ｍｅ−ＣＭＰ，５Ｍｅ−ＣＤＰ，５Ｍｅ−ＣＴＰ，５ＭｅＯ−ＣＭ
Ｐ，５ＭｅＯ−ＣＤＰ，５ＭｅＯ−ＣＴＰ，７−デアザ−ＡＴＰ及び７−デアザ
−ＧＴＰのうちから選択されたリボヌクレオチド、あるいは、もし適切であれば
、これらのリボヌクレオチドに対応するデオキシヌクレオチドまたはジデオキシ
リボヌクレオチドから選択されたデオキシリボヌクレオチド、特には、 塩基（主に、アミノアリル骨格もしくはアミノプロピン骨格）の５位において
官能基を有する−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸塩誘導体、もしくは、
ウリジン５’−三リン酸塩誘導体， 塩基の４位もしくは５位（５位の場合は、塩基が、主に、アミノアリルまたは
アミノプロピン骨格）において官能基を有する−２’−デオキシシチジン５’−
三リン酸塩誘導体、もしくは、シチジン５’−三リン酸塩誘導体， 塩基の６位もしくは８位において官能基を有する−２’−デオキシアデノシン
５’−三リン酸塩誘導体、もしくは、アデノシン５’−三リン酸塩誘導体， 塩基の６位もしくは８位において官能基を有する−２’−デオキシグアノシン
５’−三リン酸塩誘導体、もしくは、グアノシン５’−三リン酸塩誘導体， 塩基の７位において官能基を有する−２’−デオキシ−７−デアザアデノシン
５’−三リン酸塩誘導体、もしくは、７−デアザアデノシン５’−三リン酸塩誘
導体、及び、 塩基の７位において官能基を有する−２’−デオキシ−７−デアザグアノシン
５’−三リン酸塩誘導体、もしくは、７−デアザグアノシン５’−三リン酸塩誘
導体、 のうちから選択されたリボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドを含
んで成るものとされる。
【００２４】 本発明の目的のために使用できるヌクレオチド類は、また、三リン酸塩部分に
おいて化学的な修飾がなされたヌクレオチド、特に、アルファチオ三リン酸塩誘
導体を含む。
【００２５】 また、本発明に係るヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体の一例にあ
っては、リボヌクレオシドもしくはデオキシリボヌクレオシドが、Ａ，Ｇ，Ｃ，
Ｕ，Ｔ，対応するデオキシヌクレオシドもしくはジデオキシヌクレオシド及びそ
れらの化学的修飾類似体、特に、３’−アジド−３’−デオキシチミジン及びそ
の誘導体、及び、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ｕ及びＩの２',３’−ジデオキシアナログか
ら選択される。
【００２６】 蛍光マーカーは、好ましくは、テルビウムクリプテート，ユーロピウムクリプ
テート，サマリウムクリプテートまたはジスプロシウムクリプテートのうちから
選択された希土類クリプテートによって成るものとされる。
【００２７】 この明細書における以下の記述においては、用語“クリプテート”及び巨大環
及び多環という語彙は、J.M. Lehn による文献：Struct, Bonding (Berlin),16,
1, 1973 及び Acc. Chem. Res., 11, 49 (1978) において定義されている通りの
ものとする。
【００２８】 本発明に係るヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体の好ましい一例に
あっては、上述の希土類クリプテートは、下記の式：化１１によりあらわされる
巨大多環式化合物によって錯体化された少なくとも一つの希土類塩とされる。
【００２９】
【化１１】
【００３０】 式：化１１中、Ｚは３価または４価の原子を示し、Ｒは何も無いこと，水素，
水酸基，アミノ基もしくは炭化水素基を示し、互いに独立した２価の基である丸
で囲まれたＡ，Ｂ及びＣが、一つもしくは複数のヘテロ原子を含有してヘテロ巨
大環によって断続された炭化水素鎖であり、また、２価の基である丸で囲まれた
Ａ，Ｂ及びＣのうちの少なくとも一つが、少なくとも一つの分子部分を含有して
成るものか、あるいは、本質的に一つの分子部分から成るものとされ、その分子
部分が錯体化された希土類イオンの発光準位より大なる三重項エネルギーを有す
るものとされる。
【００３１】 上記の式：化１１によりあらわされる希土類クリプテートは、好ましくは、そ
の分子部分が、フェナントロリン，アントラセン，ベンゼン，ナフタレン，ビフ
ェニル及びテルフェニル，アゾベンゼン，アゾピリジン，ピリジン，ビピリジン
，ビスキノリン、及び、下記の式：化１２，化１３及び化１４によってあらわさ
れる化合物のうちから選択されるクリプテートとされる。
【００３２】
【化１２】 −Ｃ2 Ｈ4 −Ｘ1 −Ｃ6 Ｈ4 −Ｘ2 −Ｃ2 Ｈ4 −
【００３３】
【化１３】 −Ｃ2 Ｈ4 −Ｘ1 −ＣＨ2 −Ｃ6 Ｈ4 −ＣＨ2 −Ｘ2 −Ｃ2 Ｈ4 −
【００３４】 式：化１２及び化１３中、Ｘ1 及びＸ2 は、同一であっても相違していてもよ
く、酸素，窒素もしくは硫黄を示す。
【００３５】
【化１４】
【００３６】 式：化１４中、Ｘは酸素または水素である。
【００３７】 また、本発明に係るヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体の好ましい
一例にあっては、上述の蛍光マーカーは、巨大環式化合物：（２２）フェナント
ロリン；（２２）フェナントロリンアミド；（２２）アントラセン；（２２）ア
ントラセンアミド；（２２）ビイソキノリン；（２２）ビフェニル−ビス−ピリ
ジン；（２２）ビピリジン；（２２）ビピリジンアミド、及び、巨大環式トリス
−ビピリジン，トリス−フェナントロリン，フェナントロリン−ビス−ビピリジ
ン，ビイソキノリン−ビス−ビピリジン及びビス−ビピリジンジフェニルビピリ
ジンのうちの一つによって錯体化されたテルビウムまたはユーロピウムイオンか
ら成る希土類クリプテートとされる。
【００３８】 取り分け有効なマーカーは、ユーロピウムクリプテートＥｕトリスビピリジン
である。
【００３９】 これらの化合物は、例えば、ヨーロッパ特許：ＥＰ １８０ ４９２号に記載
されている。
【００４０】 また、希土類イオンと錯体を作り、ビピラジン，ビピリミジン及び窒素酸化物
基を含有した窒素複素環のうちから選択された分子部分を含んだ巨大多環式クリ
プテート化合物を用いることもできる。
【００４１】 ビピラジン部分を含んだ巨大多環式化合物は、文献：F. Bodar-Houillon ・他
，New J. Chem., 1996, 20, 1041−1045 に記載されている。また、ビピリミジ
ン部分を含んだ巨大多環化式合物は、文献：J.M. Lehn ・他，Helv. Chim. Acta
, 1992, 75, 1221 に記載されている。さらに、窒素酸化物基を含有した窒素複
素環を含んだ巨大多環化式合物は、文献：J.M. Lehn ・他，Helv. Chim. Acta,
1991, 74, 572 に記載されている。
【００４２】 蛍光マーカーとして使用する希土類クリプテートは、また、下記の式：化１５
及び化１６によりあらわされる巨大多環式化合物によって錯体化された少なくと
も一つの希土類塩から成るものとされてもよい。
【００４３】
【化１５】
【００４４】
【化１６】
【００４５】 式：化１５及び化１６中、下記の式：化１７によってあらわされる環は、下記
の式：化１８によってあらわされる環のうちの一つである。
【００４６】
【化１７】
【００４７】
【化１８】
【００４８】 上記の式：化１５〜化１８中、 −Ｙは、一つもしくは複数の二重結合、および／または、一つもしくは複数の
酸素，窒素，硫黄もしくはリンの如くのヘテロ原子、あるいは、一つもしくは複
数のカルバモイル基もしくはカルボキサミド基を含んだ線状もしくは分枝状Ｃ1 〜Ｃ20アルキレン基類から，Ｃ5 〜Ｃ8 シクロアルキレン基から、あるいは、Ｃ 6 〜Ｃ14アリレン基類から選択された２価の有機基から成る基もしくはスペーサ
アームであり、アルキレン基，シクロアルキレン基またはアリレン基は、アルキ
ル基，アリール基またはサルフォネート基により置換されて得られるものとされ
、 −Ｚは、生体物質と共有結合することができる官能基であり、 −Ｒは、メチル基または−Ｙ−Ｚ基であり、 −Ｒ’は、水素または−ＣＯＯＲ”基であり、Ｒ”は、Ｃ1 〜Ｃ10アルキル基
、好ましくは、メチル基，エチル基またはテルトブチル基であり、さもなくば、
−Ｒ’は、−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ｚ基である。
【００４９】 これらの化合物は、例えば、ヨーロッパ特許：ＥＰ ３２１ ３５３号に記載
されている。
【００５０】 本発明に係るヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体にあっては、上述
の蛍光マーカーは、直接にもしくはスペーサーアームを介して、リボヌクレオシ
ド，デオキシリボヌクレオシド，リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレ
オチドと結合したものとされる。
【００５１】 “直接結合”とは、リボヌクレオシド，デオキシリボヌクレオシド，リボヌク
レオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドの塩基、あるいは、ペントフラノー
ス単位における一つ以上の原子上に予め導入された官能基、もしくは、そこで生
成された官能基に対して、蛍光マーカーが結合することを意味するものと理解さ
れる。
【００５２】 この明細書においては、官能基とは、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド部分
が有している官能基、あるいは、斯かる部分に当業者に知られた方法によって導
入される官能基を意味し、これらの官能基は、直接にもしくは活性化後にクリプ
テート上またはクリプテートが有するスペーサーアーム上に存在する官能基に共
有結合することが可能とされる。このような官能基としては、ＮＨ2 官能基，Ｃ
ＯＯＨ官能基，ＣＨＯ官能基，ＯＨ官能基，ＳＨ官能基等があげられ、さらに、
置換によって（ハロゲン化物，スルホン酸，エポキシド）または添加によって（
マレイミドタイプの二重結合）共有結合を生成可能な官能基があげられる。これ
らの官能基は、通常、炭化水素鎖が担っており、それ自体は、ヌクレオシドもし
くはヌクレオチド部分と結合する。
【００５３】 これらの官能基を導入する方法は、文献：C. Kessler, Nonisotopic probing,
Blotting and Sequencing (“非同位元素性プロービング, ブロッティング及び
シークエンシング”), 2nd edition (第２版），L.J. Kricka(1995), Academic
Press社発行, ロンドン, 66−72頁 に記載されている。
【００５４】 このスペーサーアームは、例えば、一つもしくは複数の二重結合、および／ま
たは、一つもしくは複数の酸素，窒素，硫黄もしくはリンの如くのヘテロ原子、
あるいは、一つもしくは複数のカルバモイル基もしくはカルボキサミド基を含ん
だ線状もしくは分枝状Ｃ1 〜Ｃ20アルキレン基から，Ｃ5 〜Ｃ8 シクロアルキレ
ン基から、あるいは、Ｃ6 〜Ｃ14アリレン基から選択された２価の有機基から成
り、アルキレン基，シクロアルキレン基あるいはアリレン基は、アルキル基，ア
リール基またはスルフォン酸基により置換されて得られるものとされる。
【００５５】 特に、スペーサーアームは、下記の式：化１９及び化２０によりあらわされる
基のうちから選択される。
【００５６】
【化１９】
【００５７】
【化２０】
【００５８】 本発明に係るヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体の好ましい一例は
、デオキシリボヌクレオチドとしてのデオキシウリジン，蛍光マーカーとしての
ユーロピウムクリプテートＥｕトリス−ビピリジン、及び、スペーサーアームと
しての３−アミノアリル基を含む。
【００５９】 また、本発明に係るヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体の調製方法
は、少なくとも１個の環内炭素原子，プリンもしくはピリミジン環の環外窒素原
子、あるいは、ペントフラノース単位を成す炭素原子が蛍光マーカーとの結合に
関与するものとされた、未変性の，化学的に修飾された、もしくは、１種以上の
標識分子類と結合したリボヌクレオシド，リボヌクレオチド，デオキシリボヌク
レオシドもしくはデオキシリボヌクレオチドを、希土類クリプテートから成り、
少なくとも１個の環内炭素原子，プリンもしくはピリミジン環の環外窒素原子、
あるいは、ペントフラノース単位を成す炭素原子と結合した少なくとも１個の蛍
光マーカーと反応させ、生成された接合体を分離するものとされる。
【００６０】 この調製方法において使用できるリボヌクレオシド，デオキシリボヌクレオシ
ド，リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチド、及び、蛍光マーカー
は、上述した通りである。
【００６１】 リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドを含んだ本発明に係るヌ
クレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体は、ポリヌクレオチドの合成時もし
くは使用時における量的もしくは質的測定に適用するのに好適である。
【００６２】 また、本発明に係るポリヌクレオチドは、少なくとも１個の上述された如くの
リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドの蛍光接合体を構成要件ヌ
クレオチドとして含むものとされる。
【００６３】 さらに、本発明に係る接合体が取り込まれて得られるポリヌクレオチドは、１
を超える数の接合体を含むことができ、従って、１を超える数の蛍光マーカーを
含むことができる。
【００６４】 本発明に係るヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体を使用することに
よって、酵素的方法によるポリヌクレオチドの多重標識を行うことができる。こ
の技術により、標識ポリヌクレオチドを容易に得ることができ、従来技術である
化学的方法による蛍光標識を用いる場合に比べて、より優れた再現性を確保でき
る。特に、未反応ポリヌクレオチドおよび／または未反応官能基化蛍光マーカー
を媒体から除去するために必要とされる分離段階を回避できるという利点が得ら
れる。
【００６５】 二官能基クリプテートを使用する場合には、結合が１個のアームのみで起こり
、これによって、常にポリヌクレオチド合成の枠内で接合体の取込みを行うこと
が可能となる。
【００６６】 本発明に係るリボヌクレオチドまたはデオキシリボヌクレオチドを含んだ接接
合体は、少なくとも１個の核酸配列を含有する化合物の検出および／または局在
化のために使用することができる。
【００６７】 斯かる用途として、下記の如くの例をあげることができるが、これらは、本発
明の特許請求の範囲に記載された技術的思想を斯かる例に限定するものではない
。
【００６８】 例えば、染色体のマッピングまたは変異の検出のための特定ＤＮＡ配列の検出
および／または局在化。さらには、バイオメディカル研究に使用できる、もしく
は、臨床診断確定のためのプローブ合成。
【００６９】 さらに、例えば、ＤＮＡまたはＲＮＡポリメラーゼ，逆転写酵素，トランスフ
ェラーゼもしくはリガーゼ活性の如くの、核酸合成反応に関与する酵素について
の酵素活性の測定にあたり、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体が発
光して得られる蛍光を直接的または間接的に測定し、測定された蛍光に基づいて
、接合体の合成核酸ポリヌクレオチドへの取り込まれ度合いとの相関を求めるこ
とができる。
【００７０】 本発明に係るヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体は、ホスホジェス
テラーゼ，ＤＮＡｓｅもしくはＲＮＡｓｅ活性の如くの、核酸基質に対する酵素
の酸素活性を測定するために使用でき、その際接合体が直接または間接的に放出
する蛍光は、酸素活性または酵素活性に対する阻害のいずれかと相関している。
【００７１】 本発明に係るヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体は、ヘリカーゼま
たはインテグラーゼ活性のような核酸の構造を改変する酵素活性、あるいは、ト
ポイソメラーゼ活性のように核酸のトポロジーを改変する活性の測定に使用でき
る。
【００７２】 本発明に係るヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体は、例えば、接合
体が検出目的で取り込まれる、核酸を含む化合物を調製するためのマーカーとし
て使用することもできる。
【００７３】 さらに、本発明に係るヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体によって
活性される蛍光は、“直接的”、即ち、所定の波長域における励起後に接合体か
ら発光性の信号が放出されるか、あるいは、“間接的”、即ち、励起接合体、即
ち、“ドナー化合物”及び別の蛍光分子、即ち、“アクセプター化合物”の間の
非発光性エネルギー移動によって発光性信号の放出が誘発されるかのいずれかで
ある。
【００７４】 斯かる特殊な場合においては、以下の条件が満たされることになる。
【００７５】 先ず第一に、蛍光アクセプター化合物が、ドナーの発光スペクトルと少なくと
も部分的に重なり、かつ、その重複領域で高モル吸光度を有する吸収スペクトル
と、ドナーが弱い固有発光を有する波長領域にわたる発光スペクトルとを有して
いること。一方、前記アクセプター及びドナーは、互いに近傍に位置し、それら
の遷移双極子配向が略平行であること。
【００７６】 非発光性エネルギー移動の技術的原理については、文献：G. Mathis ・他，Cl
in. Chem., 1993, 39, 1953 −1959 に記載されている。
【００７７】 以下においては、本発明が実施例が参照されて説明される。斯かる説明におい
て、或る濃度については、単位容量（ｍｌであらわされる）当たりの所定の波長
（ｎｍであらわされる）に対する吸光単位（ＡＵ）で示され、測定溶液の光学密
度と同じ数値であらわされる。
【００７８】 実施例１：クリプテートユーロピウム・トリスビピリジンで標識したデオキ
シウリジン（接合体Ｋ−１１−ｄＵＴＰ）の合成
【００７９】 この接合体において、番号１１は、スペーサーアームとクリプテート構造がヌ
クレオチドに結合している官能基の総原子数を意味する（この事例での結合はピ
リミジンの５位にある）。
【００８０】 使用されたヌクレオシド三リン酸塩は、５−[ Ｎ−（６−アミノカプロイル）
−３−アミノアリル ]−２’−デオキシウリジン・５’−三リン酸塩] （ＡＨ−
ｄＵＴＰ）であり、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・トリフルオロアセトアミド
カプロエート（文献：(M.S. Urdea)・他, Nucleic Acids Res., 1988, 4937) と
５−（３−アミノアリル）−２’−デオキシウリジン・５−三リン酸塩とを反応
させることにより調製される。後者は、文献（(Langer)・他, Proc. Natl. Acad
. Sci. USA(1981) 78, 6633 〜6637) に記載された方法とそれに引き続く脱アン
モニア処理（ＮＨ4 ＯＨの３％水溶液，４５分，摂氏６０度）を行うことにより
調製される。この化合物は、ＤＥＡＥ−Sepharose （商標) ( Pharmacia ）が用
いられ、炭酸水素トリエチルアンモニウム直線勾配（０．１Ｍ〜０．３Ｍ）のも
とで精製される。
【００８１】 １）方法Ａ ＡＨ−ｄＵＴＰ６μｍｏｌ／ｍｌを含有した溶液６８μｌ（即ち、０．４μｍ
ｏｌ）が０．１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）（ｐＨ７．８）
２５０μｌによって希釈され、これに、下記のように調製したＮ−ヒドロキシス
クシンイミド・クリプテート溶液（４ｍｇ／ｍｌアセトニトリル溶液）３２０μ
ｌが加えられる。クリプテートユーロピウム[ （ビス−ｂｐｙ）−（ｂｐｙ−ジ
エステル）] （ヨーロッパ特許出願ＥＰ０ ３２１ ３５３号の実施例４、セク
ションＡに記載）にＮａＯＨが加えられて加水分解され、得られた二酸クリプテ
ートが、ＲＰ−１８ ＨＰＬＣ分離管が用いられて精製される（１％トリフルオ
ロ酢酸水溶液中におけるアセトニトリル勾配）。得られたクリプテートユーロピ
ウム [（ビス−ｂｐｙ）−（ｂｐｙ−二酸）] （４ｍｇ）が無水アセトニトリル
０．５ｍｌに溶解され、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド１ｍｇが加えられ、次い
で、アセトニトリル０．５ｍｌに溶解したジシクロヘキシルカルボジイミド１．
９ｍｇの溶液が加えられる。１６時間の反応後、ジシクロヘキシル尿素の沈殿が
濾去され、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド・クリプテートの溶液が直接カップリ
ングに使用される。
【００８２】 ４５分間攪拌された後、１Ｍ ＴＥＡＢ（ｐＨ８．５）１５μｌが加えられ、
この混合物が、Superdex ３０（商標) ＨＲ １０／３０分離管（Pharmacia ）
に注入され、１０％アセトニトリルを含んだ０．０５Ｍ ＴＥＡＢ（ｐＨ７）が
用いられて溶出される状態とされる（流速：１ｍ１／分）。
【００８３】 Ｒｔ＝約１６．４分とした化合物が集められ、この留分（留分１と呼ぶ）が減
圧（急速減圧）状態のもとで濃縮されて３５０μ１の容量とされる。この濃縮さ
れた留分１は、８ＡＵ304nm を含む。ε304 が約３５，０００と見積もられたも
とで、Ｋ−ｄＵＴＰの濃度は約０．７２ｍＭと見積もられる。
【００８４】 この留分１の一部（９０μ１）が同じ分離管に注入され、５％アセトニトリル
を含んだ２５ｍＭ酢酸トリエチルアンモニウムバッファー（ｐＨ７）が用いられ
て溶出される状態とされる。クロマトグラムにおけるピークに相当する留分が集
められ（１６分＜Ｒｔ＜１９分）、減圧（急速減圧）状態のもとで濃縮されてＫ
−ｄＵＴＰ溶液１５０μ１が得られる。この留分（留分２と呼ぶ）は、１．９５
ＡＵ304nm を含む。
【００８５】 この化合物はマススペクトルにより分析される（正モード電子スプレー）。 （Ｍ−２Ｈ）+ ＝１４３１ （Ｍ−２Ｈ＋ＣＨ3 ＣＯＯＨ）+ ＝１４９１
【００８６】 水溶液のＵＶスペクトラムは、２４１ｎｍに当該分子のヌクレオチド部分に特
徴的な最大吸収（λmax ＝２８９ｎｍ，ε＝７１００；λmax ＝２４０ｎｍ，ε
＝１０，７００）を有し、また、ユーロピウムクリプテートのλmax ＝３０５ｎ
ｍ（ε＝３０，０００）に近接した３０４ｎｍにも最大吸収を有する。Ａ304 ／
Ａ241 の比は約０．８３であり、これは提案構造に匹敵する。
【００８７】 ２）方法Ｂ ＡＨ−ｄＵＴＰ溶液０．０８μｍｏｌが０．１Ｍホウ酸バッファー（ｐＨ８．
６）８０μ１に溶解され、これに上記方法Ａによって調製されたＮ−ヒドロキシ
スクシンイミド・クリプテートの溶液（４ｍｇ／ｍ１）９０μ１が加えられる。
【００８８】 摂氏２０度のもとで６０分経過した後、１Ｍ ＴＥＡＢ（ｐＨ８．５）５μ１
及びＨ2 Ｏ ４５μ１が添加される。反応混合物全量が、Superdex peptide Ｈ
Ｒ１０／３０分離管（Pharmacia ）に注入され、１０％アセトニトリルを含んだ
０．０５Ｍ ＴＥＡＢ（ｐＨ７）が用いられて溶出される状態とされる（流速：
１ｍ１／分）。
【００８９】 Ｒｔ＝約１６．１分としたピーク部（３０４ｎｍに最大吸収を持ち、Ａ304 ／
Ａ241 の比は約０．７９である）に相当する留分が集められ、約０．０３μｍｏ
ｌの化合物（接合体）Ｋ−１１−ｄＵＴＰが得られる。
【００９０】 接合体Ｋ−１１−ｄＵＴＰをあらわす式を図２に示す。
【００９１】 実施例２：接合体Ｋ−１１−ｄＵＴＰのイオン交換による精製
【００９２】 使用した分離管は、ＤＥＡＥ Sepharose （商標）Fast Flow （Pharmacia ）
が充填され、１０％メタノールを含んだ１０ｍＭ ＴＥＡＥバッファーによって
平衡化されたＣ１０／２０分離管（Pharmacia Biotech., Uppsala, S) である。
非接合，官能化ユーロピウムトリス−ビピリジンクリプテートをも含むＫ−１１
−ｄＵＴＰの溶液が入れられ、その分離管がバッファーＡ（１０％メタノールを
含んだ１０ｍＭ ＴＥＡＢ）４０ｍ１が用いられての溶出に供される（流速：８
ｍ１／分）。留分４ｍ１が集められ、溶出した留分の蛍光が測定される（励起λ
＝３３７ｎｍ，発光λ＝６２０ｎｍ）。非接合クリプテートは、留分４及び５と
して、即ち、分離管における無効容量の直後に溶出される。
【００９３】 溶出が１０ｍＭ ＴＥＡＢ，１０％メタノール（１００ｍ１）から２００ｍＭ
ＴＥＡＢ，１０％メタノール（１００ｍ１）までの直線勾配下において継続さ
れ（８ｍ１／分）、留分５ｍ１が集められる。蛍光（６２０ｎｍ）は、４３〜４
４番目の管に集中することが観測され、このことは、Ｋ−１１−ｄＵＴＰが、約
０．１６ｍＭ ＴＥＡＢの濃度で溶出されることを示している。Ｋ−１１−ｄＵ
ＴＰを含む留分が併合されて濃縮される。
【００９４】 実施例３：−本鎖ＤＮＡ複写に際してのポリメラーゼによる接合体Ｋ−１１
−ｄＵＴＰの取込み（ＰＡＧＥ及びオートラジオグラフィーによる分析）
【００９５】 テンプレートＤＮＡは、以下のプライマーにより結合させたｋ−ｒａｓ遺伝子
（エキソンＩ）のフラグメントをＰＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅すること
により入手される。 ｋ−ｒａｓＥＸ１センスＳプライマー5'ｄ（ＧＧＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＡＡ
Ａ ＡＴＧ ＡＣＴ ＧＡＡ ＴＡＴ）3' ３ＡＵ260 ／ｍ１、即ち、約１．２．１０-5Ｍ含有原液 ｋ−ｒａｓＥＸ１アンチセンスＡＳプライマー5'ｄ（ＴＧＴ ＴＧＧ ＡＴ
Ｃ ＡＴＡ ＴＴＣ ＧＴＣ ＣＡＣ ＡＡＡ ＡＴＧ）3' ３ＡＵ260 ／ｍ１、即ち、約１．２．１０-5Ｍ含有原液
【００９６】 下記のＰＣＲ用にここで用いられたＡＳプライマーはその５’末端でビオチニ
ル化される。ビオチニル化二本鎖ＤＮＡは、以下のプロトコルに従ってＰＣＲに
より合成される。 ＰＣＲ媒質： ２５μ１のＢＵＡＭ（CIS bio international ）１０Ｘ ８μ１のアンチセンス−バイオプライマー ８μ１のセンスプライマー １０μ１のＴａｑポリメラーゼ（１．２５Ｕ／ｍ１） １０μ１のｄＮＴＰ（４種の未変性ｄＮＴＰ，各５ｍＭ） １００μ１のヒト胎盤ＤＮＡ（Sigma)，０．０１μｇ／μ１ ８９μ１のミリ−Ｑ水
【００９７】 ＰＣＲ媒質が５本のマイクロチューブ（５×５０μ１）に分注され、このチュ
ーブがサーモサイクラーに納められて、実施例５のプロトコルに従っての３１Ｐ
ＣＲサイクルが実施される。
【００９８】 ＰＣＲにより産生された二本鎖ＤＮＡ（ビオチンプライマー２５ｐｍｏｌに相
当）が、ダイナビーズ−ストレプトアビジンＭ−２８０（ダイナル，Ｎ）３００
μｇの存在下に培養される。
【００９９】 洗浄後、一本鎖ＤＮＡ（ＳＳ ＤＮＡ）が０．１Ｎ水酸化ナトリウム溶液が用
いられて溶出され、その後、上澄みが傾斜採取され、中和（希ＨＣ１）後に濃縮
されて残容量６０μ１とされる。
【０１００】 文献：J. Sambrook,・他, Molecular cloning, a laboratory manual, 1989
に記載されている如くの、32Ｐで標識したＡＳプライマー（非ビオチニル化）が
残りの操作に使用される。
【０１０１】 複写反応用培質は、以下のものが用いられて調製される。 - 実施例１により得られたＫ−１１−ｄＵＴＰ留分（Ｒｔ＝１６．４分 ）が
０．２５ｍＭに希釈されたもの - ｄＴＴＰ：０．２５ｍＭ - 各々が０．６２５ｍＭとされた３種のデオキシヌクレオチド三リン酸塩（ｄ
ＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ）の混合物 - Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ：１．２５Ｕ／μ１ - Ｔａｑ（ＢＵＡＭ）１０Ｘバッファー（CIS bio international) - ＡＳプライマー（３ＡＵ260 ／ｍ１）及び32Ｐ−標識ＡＳプライマー（０．
０６ＡＵ260 ／ｍ１）
【０１０２】 これらは下記の表１の如くに整理される。
【０１０３】
【表１】 ┌───────────────────────────┐ │ 容量（μ１） │ ├───────────────────────────┤ │ＢＵＡＭ １０Ｘ １ │ ├───────────────────────────┤ │Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ ０．２ │ ├───────────────────────────┤ │32ＰＳプライマー ２ │ ├───────────────────────────┤ │Ｓプライマー ０．３５│ ├───────────────────────────┤ │３種三リン酸塩 ０．５ │ ├───────────────────────────┤ │Ｋ−１１−ｄＵＴＰ ０．６ │ ├───────────────────────────┤ │ｄＴＴＰ ０．６ │ ├───────────────────────────┤ │ＳＳ ＤＮＡ ５ │ └───────────────────────────┘
【０１０４】 並行制御反応が実施される。ここでは、Ｋ−１１−ｄＵＴＰがｄＴＴＰ（０．
２５ｍＭ）０．６μ１に置き換えられ、媒質中のｄＴＴＰ濃度が他の３種の三リ
ン酸塩と同等となるようにされる。
【０１０５】 ポリアクリルアミドゲル電気泳動（ＰＡＧＥ）が用いられ、接合体Ｋ−１１−
ｄＵＴＰ存在下の反応が、その全長がＤＮＡのコピーに相当するバンドであって
、４種の未変性ヌクレオチドのみを入れた対照反応で得られるバンドの移動度に
近似する移動度のバンドを生じることが証明される。さらに、電気泳動のプロフ
ィールは両事例において読取り得る非連続性を示さない。
【０１０６】 上述と同じ操作が、Ｋ−１１−ｄＵＴＰ ０．３μ１とｄＴＴＰ ０．９μ１
との組合せ（ｄＴＴＰ／Ｋ−１１−ｄＵＴＰ比＝３）を含む、種々のｄＴＴＰ／
Ｋ−１１−ｄＵＴＰ比が設定されたもとで実施された。
【０１０７】 同様に、複写反応がＤＮＡポリメラーゼＩ，クレノウフラグメントの存在下に
実施され（摂氏３７度，４５分）、実質的に同一の結果が得られた。
【０１０８】 これらの結果は、接合体ｄＵＴＰ／ユーロピウム・トリ−ビピリジン・クリプ
テートが、一本鎖ＤＮＡの複写に際し、実際にポリメラーゼ（Ｔａｑポリメラー
ゼまたはクレノウフラグメント）により組み込まれることを示す。
【０１０９】 実施例４：一本鎖ＤＮＡの複写に際してのポリメラーゼによる接合体Ｋ−１
１−ｄＵＴＰの取込み（非放射性エネルギー転移及び時間分解蛍光測定による確
認）
【０１１０】 実施例３に関連して記述された一本鎖ＤＮＡが使用される。そして、複写反応
の実行に使用されるマイクロチューブ（５０μ１）が、下記のものを収容したも
のとして準備される。
【０１１１】 - 実施例１により得られるＫ−１１−ｄＵＴＰ：０．２５ｍＭ留分（Ｒｔ＝１
６．４分） - ｄＴＴＰ：０．２５ｍＭ - 各々が０．６２５ｍＭとされる３種のデオキシヌクレオチド三リン酸塩（ｄ
ＡＴＰ，ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰ）の混合物 - ビオチニル化ＡＳプライマー（cf. 実施例３）：３ＡＵ260 ／ｍ１ - Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ：１．２５Ｕ／μ１ - Ｔａｑバッファー：ＢＵＡＭ １０Ｘ
【０１１２】 これらは下記の表２の如くに整理される。
【０１１３】
【表２】 ┌───────────────────────────┐ │ 容量（μ１） │ ├───────────────────────────┤ │ＢＵＡＭ １０Ｘ ５ │ ├───────────────────────────┤ │Ｔａｑ ポリメラーゼ １ │ ├───────────────────────────┤ │ビオチニル化プライマー １．７５│ ├───────────────────────────┤ │３種ｄＮＴＰの混合物 ２．５ │ ├───────────────────────────┤ │Ｋ−１１−ｄＵＴＰ ３ │ ├───────────────────────────┤ │ｄＴＴＰ ３ │ ├───────────────────────────┤ │ＳＳ ＤＮＡ ３０ │ ├───────────────────────────┤ │ミリ−Ｑ水 ３．７５│ └───────────────────────────┘
【０１１４】 チューブが摂氏９０度で２分間加熱（変性）され、次いで、サーモサイクラー
中において摂氏７０度で培養される。０分後，５分後，１０分後，１５分後及び
２０分後毎にサンプル（９μ１）が採取される。その一部が０．５Ｍ ＥＤＴＡ
（ｐＨ８）２μ１を収容したチューブに入れられる。
【０１１５】 それにより、反応混合物５０μ１当たり１２．５ｐｍｏｌのビオチニル化プラ
イマー、即ち、反応混合物１０μ１当たり２．５ｐｍｏｌのビオチニル化プライ
マーを得る。反応混合物１０μ１当たり１５０ｐｍｏｌのＫ−１１−ｄＵＴＰ
も存在する。
【０１１６】 サンプルが、バッファーＬ（０．１Ｍ リン酸塩，ｐＨ７，０．１５Ｍ Ｎａ
Ｃｌ，０．４Ｍ ＫＦ及び０．１％ ＢＳＡ）の２００μ１中に８μ１の割合で
存在するように希釈され、次いで、同じバッファー中において１／１０に希釈さ
れる。
【０１１７】 上述の如くに希釈されたサンプル２０μ１（ビオチン２．１０-14 ｍｏｌに相 当）が、マイクロプレート（PACKARD ＨＴＲＦ−９６、９６孔平底黒色低蛍光
マイクロプレート）の“テスト”ウエルにピペットで入れられる。バッファーＬ
で希釈した（最終濃度２．１０-8Ｍ）接合体ＳＡ−ＸＬ665 （ストレプトアビジ
ンと化学的に修飾されたアロフィコシアニンとの接合体 (CIS bio internationa
l ）３０μ１（６．５．１０-13 ｍｏｌのＳＡ、即ち、ビオチン換算３０当量）
が各“テスト”ウエルに加えられ、次いで、バッファーＬ２５０μ１が加えられ
る。
【０１１８】 希釈されたサンプル２０μ１が“ブランク”ウエルにピペットで加えられ、そ
こにバッファーＬ２８０μ１が加えられる。
【０１１９】 培養（摂氏３７度１５分間）後、ディスカバリー装置（PACKERD ：ＨＴＲＦマ
イクロプレートアナライザー）において、直ちに６２０ｎｍ及び６６５ｎｍでの
蛍光が読み取られる。
【０１２０】 蛍光強度の比、即ち、各テストについてのＲｅ＝Ｅ６６５／Ｅ６２０及び各ブ
ランクについてのＲｏ＝Ｂ６６５／Ｂ６２０が計算され、次いで、ＤＦ＝（Ｒｅ
−Ｒｏ）／Ｒｏの値を百分率であらわされるべく計算される。その結果は、下記
表３に示される如くである。
【０１２１】 表３にあっては、以後の実施例におけるように、波長を６２０ｎｍまたは６６
５ｎｍとする蛍光の測定値が、測定に使用した機器に対応する任意の蛍光単位で
あらわされている。
【０１２２】
【表３】 ┌───┬──┬───┬─────┬──┬───┬─────┬──┐ │時間 │E665│ E620 │Re＝E665 │B665│ B620 │Ro＝B665 │ DF │ │ (分) │ │ │ /E620│ │ │ ／B620│ │ ├───┼──┼───┼─────┼──┼───┼─────┼──┤ │ 0 │1590│35,770│ 0.044│1615│39,423│ 0.041│ 8%│ ├───┼──┼───┼─────┼──┼───┼─────┼──┤ │ 5 │3670│42,016│ 0.087│1718│42,961│ 0.040│118%│ ├───┼──┼───┼─────┼──┼───┼─────┼──┤ │ 10 │4077│40,448│ 0.100│1713│42,234│ 0.040│149%│ ├───┼──┼───┼─────┼──┼───┼─────┼──┤ │ 15 │4185│38,670│ 0.108│1633│40,089│ 0.040│166%│ ├───┼──┼───┼─────┼──┼───┼─────┼──┤ │ 20 │5357│49,403│ 0.108│1993│51,777│ 0.038│182%│ └───┴──┴───┴─────┴──┴───┴─────┴──┘
【０１２３】 反応時間関数としてＤＦ値をプロットすると、図１に示される如くに、酵素的
複写に際してのヌクレオチド取込み速度の典型的なプロフィールが得られる。
【０１２４】 実施例５：ＰＣＲに際しての接合体Ｋ−１１−ｄＵＴＰの取込み（非放射性
エネルギー転移及び時間分解蛍光測定による確認）
【０１２５】 １）ＰＣＲ 実施例３に関連して記述されたＳプライマー及びＡＳプライマーにより結合さ
せたｋ−ｒａｓ遺伝子のエキソン１の領域が増幅される。
【０１２６】 この操作により１１７ｂｐの長さと以下の配列（センス鎖）を持つ増幅産物が
生成される。
【０１２７】 5'ｄ（ＧＧＣ ＣＴＧ ＣＴＧ ＡＡＡ 1ＡＴＧ ＡＣＴ ＧＡＡ ＴＡＴ ＡＡＡ ＣＴＴ ＧＴＧ ＧＴＡ ＧＴＴ 10ＧＧＡ ＧＣＴ ＧＧＴ ＧＧ
Ｃ ＧＴＡ ＧＧＣ ＡＡＧ ＡＧＴ ＧＣＣ ＴＴＧ 20ＡＣＧ ＡＴＡ Ｃ ＡＧ Ｃ ＴＡ ＡＴＴ ＣＡＧ ＡＡＴ ＣＡＴ ＴＴＴ ＧＴＧ 30ＧＡＣ
ＧＡＡ ＴＡＴ ＧＡＴ ＣＣＡ ＡＣＡ）3'
【０１２８】 プルーブ（５６％Ｇ＋Ｃ）は、増幅された配列の中心部分（下線部分）から選
択される。ビオチンは、Ｎ−４−アミノヘキシル−ｄＣアームを介してその５’
末端に導入される。（文献：A.Roget ・他，Nucleic Acids Res., 1989, 17, 76
43〜7651) ：ＣＰプローブ：ビオチン−ｄＣ．ＧＣＣ ＴＴＧ ＡＣＧ ＡＴＡ ＣＡＧ Ｃ ．
【０１２９】 Ｋ−１１−ｄＵＴＰ留分（１３ＡＵ304 ／ｍ１）４８μ１は、ＴＥＡＡｃバッ
ファーから再精製され（cf. 実施例１，方法Ａ）、ミリ−Ｑ水３２μ１により希
釈される。それにより、Ｋ−１１−ｄＵＴＰの最終濃度は約０．２ｍＭとなる。
【０１３０】 ５ｍＭ ｄＡＴＰ，５ｍＭ ｄＣＴＰ，５ｍＭ ｄＧＴＰ及び３．５ｍＭ ｄ
ＴＴＰの４種の未変性デオキシヌクレオチド三リン酸塩の混合物が使用される。
【０１３１】 下記のＰＣＲ原液混合物が調製される。 - ２５μ１のＢＵＡＭバッファー（CIS bio international)１０Ｘ - １０μ１のｄＮＴＰ - ８μ１のＳプライマー - ８μ１のＡＳプライマー - １０μ１のＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（即ち、１２．５Ｕ） - ９μ１のミリ−Ｑ水
【０１３２】 ＰＣＲマイクロチューブにおいて、下記の表４に従い、ヒト胎盤ＤＮＡ（Sigm
a) ０．０１μｇ／μ１が用いられてＰＣＲ媒質が調製される。
【０１３３】
【表４】 ┌───────────┬──┬──┬───┬───┬───┬───┐ │ │Ｔ−│Ｔ＋│Ｋ１−│Ｋ１＋│Ｋ２−│Ｋ２＋│ ├───────────┼──┼──┼───┼───┼───┼───┤ │混合物 ( μｌ) │ 7│ 7│ 7│ 7│ 7│ 7│ ├───────────┼──┼──┼───┼───┼───┼───┤ │ｄＴＴＰ （μ１） │ 1.5│ 1.5│ 0│ 0│ 0│ 0│ ├───────────┼──┼──┼───┼───┼───┼───┤ │Ｋ−１１−ｄＵＴＰ │ 0│ 0│ 1│ 1│ 2│ 2│ │ （μ１） │ │ │ │ │ │ │ ├───────────┼──┼──┼───┼───┼───┼───┤ │ＤＮＡ （μ１） │ 0│ 10│ 0│ 10│ 0│ 10│ ├───────────┼──┼──┼───┼───┼───┼───┤ │ミリ−Ｑ水 （μｌ） │16.5│ 6.5│ 17│ 7│ 16│ 6│ ├───────────┼──┼──┼───┼───┼───┼───┤ │ [Ｋ−１１−ｄＵＴＰ] │ 0│ 0│ 8│ 8│ 16│ 16│ │ （μＭ） │ │ │ │ │ │ │ ├───────────┼──┼──┼───┼───┼───┼───┤ │ [ｄＴＴＰ] （μＭ） │ 200│ 200│ 140│ 140│ 140│ 140│ ├───────────┼──┼──┼───┼───┼───┼───┤ │ [Ｋ−１１−ｄＵＴＰ] │ −│ −│ 0.06│ 0.06│ 0.12│ 0.12│ │ ／ [ｄＴＴＰ] │ │ │ │ │ │ │ └───────────┴──┴──┴───┴───┴───┴───┘
【０１３４】 ＰＣＲは、以下のプロトコルに従って実施される。 １． ５分／摂氏９５度 ２．１ １分／摂氏９４度（変性） ２．２ １分／摂氏６０度（循環） ２．３ １分／摂氏７０度（伸長） （３１サイクル） ３．１ ８分／摂氏７０度（最終伸長）
【０１３５】 反応はアガロースゲル電気泳動によりモニターされる。ＤＮＡ（Ｔ＋，Ｋ１＋
及びＫ２＋）を収容したチューブのみが、予測された鎖長のバンドを与える（Bo
ehringer marker VIIIの１２４ｂｐのバンドとの比較による）。
【０１３６】 ２）エネルギー転移の時間分解測定 測定原理は、ビオチニル化ＣＰプローブが増幅されたＤＮＡフラグメント上に
ハイブリッド形成され、次いで、そのハイブリッドを接合体ＳＡ−ＸＬ665 （実
施例４にて定義されている）と接触させることから成る。ユーロピウムクリプテ
ート（ドナー）で標識した塩基が取り込まれ、ドナーが約３３７ｎｍで励起され
たとき、ＸＬ665 （アクセプタ）への非放射性エネルギー転移が起こる。
【０１３７】 この場合、アクセプタは６６５ｎｍで寿命の長い蛍光を発するが、このシグナ
ルはアクセプタ本来の寿命の短い蛍光から識別され得るものである。
【０１３８】 時間分解蛍光測定は、アクセプタ（“テスト”Ｅ６２０とＥ６６５）の存在下
及びアクセプタ（“ブランク”Ｂ６２０とＢ６６５）の不存在下において、波長
６２０ｎｍ及び６６５ｎｍについてなされ、次いで、比Ｒｅ＝Ｅ６６５／Ｅ６２
０及びＲｏ＝Ｂ６６５／Ｂ６２０が計算される。そして、ＤＦ＝（Ｒｅ−Ｒｏ）
／Ｒｏの値が、百分率であらわされるべく計算される。ＤＦの値の増大はエネル
ギー転移の存在、即ち、クリプテートが増幅されたＤＮＡに取り込まれたことを
示す。
【０１３９】 ＰＣＲから生成される媒質Ｋ１−，Ｋ１＋，Ｋ２−及びＫ２＋が使用される。
各ＰＣＲ媒質２μ１がマイクロチューブに入れられ、ＣＰプローブ（０．０３Ａ
Ｕ260 ／ｍ１）１０μ１及びＢＵＡＭバッファー（２Ｘ）１３μ１が添加される
。そして、チューブが密封され、密封されたチューブが、摂氏９４度のもとで１
０分間、次いで、摂氏５０度のもとで２０分間、サーモサイクラーにより加熱さ
れる。ハイブリッド形成媒質５μ１がバッファーＬ ２００μ１によって希釈さ
れる。そして、その希釈液４０μ１が、マイクロタイタープレートの“テスト”
ウエルにピペットで入れられ、また、その希釈液４０μ１が“ブランク”ウエル
にも入れられる（Packard ＨＴＲＦ９６孔平底マイクロプレート）。
【０１４０】 ３．１０-8Ｍ ＳＡ−ＸＬ665 （CIS bio international) ４０μ１及びバッ
ファーＬ ２００μ１が“テスト”ウエルに加えられ、バッファーＬ ２４０μ
１が“ブランク”ウエルに加えられる。
【０１４１】 摂氏３７度のもとで１５分間培養した後、直ちにディスカバリー装置（Packar
d)上で蛍光測定が行われる。
【０１４２】 その結果が下記の表５に示される如くに報告されている。
【０１４３】
【表５】 ┌────┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┐ │チューブ│ E665 │ E620 │ Re │ B665 │ B620 │ Ro │ DF │ ├────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┤ │Ｋ１− │ 889│16,053│0.0554│ 847│16,825│0.0503│ 10%│ ├────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┤ │Ｋ１＋ │ 2406│28,392│0.0847│ 1366│32,494│0.0420│ 102%│ ├────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┤ │Ｋ２− │ 1320│29,015│0.0455│ 1273│31,452│0.0405│ 12%│ ├────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┤ │Ｋ２＋ │ 3304│36,615│0.0902│ 1491│36,278│0.0411│ 120%│ └────┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴───┘
【０１４４】 斯かる結果は、接合体Ｋ−１１−ｄＵＴＰがＰＣＲにより取り込まれることを
示している。さらに、増幅されたＤＮＡに結合したクリプテート分子の存在は、
この増幅されたＤＮＡに特異的なプローブとハイブリッド形成させることにより
証明することが可能であり、クリプテート及びハイブリッド形成プローブに結合
したアクセプタ間の非放射性エネルギー転移によって示され得るものとされる。
【０１４５】 実施例６：クリプテートユーロピウム・トリスビピリジンで標識したデオキシ
ウリジン（Ｋ−４−ｄＵＴＰ）の合成
【０１４６】 この化合物において、数字の４は、ヌクレオチドにクリプテート構造が結合し
ているアームの総原子数を示す（この事例での結合はピリミジンの５位にある）
。
【０１４７】 使用されるヌクレオシド三リン酸塩は、５−（３−アミノアリル）−２’−デ
オキシウリジン・５’−三リン酸塩（ＡＡ−ｄＵＴＰ）とされ、文献：Langer・
他，Proc. Natl. Acad. Sci. USA(1981), 78, 6633〜6637 に記載された方法に
よって調製される。この化合物は、ＤＥＡＥ−Sepharose （商標)(Pharmacia)が
用いられ、炭酸水素トリエチルアンモニウム勾配（１０ｍＭ〜３００ｍＭ）のも
とで精製される。
【０１４８】 ＡＡ−ｄＵＴＰ ５．４μｍｏｌ／ｍ１を含有した溶液６０μ１（即ち、０．
３μｍｏｌ）が０．１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）（ｐＨ７
．８）２４０μｌによって希釈され、これに活性化クリプテート [ＴＢＰ−（Ｅ
ｕ3+）] ４ｍｇ／ｍｌを含有したアセトニトリル溶液３００μｌ（即ち、０．８
５μｍｏｌ；約３当量）が加えられる。活性化クリプテート [ＴＢＰ−（Ｅｕ3+ ）] は、実施例１における方法Ａに従って調製され、その後直ちに使用される。
【０１４９】 ３５分間の振盪後、１Ｍ ＴＥＡＢ（ｐＨ８．５）１５μｌが加えられ、その
混合物が半量にまで濃縮される。次いで、 Superdex ３０（商標）ＨＲ１０／３
０分離管 (Pharmacia)に注入されて、分離管が１０％アセトニトリルを含んだ２
５ｍＭ ＴＥＡＢ（ｐＨ９）が用いられての溶出に供される（流速：１ｍ１／分
）。
【０１５０】 Ｒｔ＝約１６．３分とした化合物が集められ、この留分（留分１と呼ぶ）が減
圧（急速減圧）状態のもとで濃縮されて２００μ１の容量とされる。この濃縮さ
れた留分１は、同じ分離管に注入され、５％アセトニトリルを含んだ２５ｍＭ酢
酸トリエチルアンモニウムバッファー（ｐＨ７）が用いられて溶出される状態と
される。クロマトグラムにおけるピークに相当する留分が集められ（１６分＜Ｒ
ｔ＜１９分）、減圧（急速減圧）状態のもとで濃縮されてＫ−４−ｄＵＴＰ溶液
２６０μ１が得られる。この留分（留分２と呼ぶ）は、６．０ＡＵ303 を含む。
ε303 が約３５，０００と見積もられたもとで、Ｋ−４−ｄＵＴＰの濃度は約０
．６５ｍＭと見積もられる。
【０１５１】 この化合物はマススペクトルにより分析される（負モード電子スプレー）。 （Ｍ−４Ｈ）- ＝１３１５．５（Ｃ50Ｈ48ＥｕＮ11Ｏ17Ｐ3 についての計算値
：１３１９）
【０１５２】 水溶液のＵＶスペクトラムは、２４３ｎｍに当該分子のヌクレオシド部分に特
徴的な最大吸収（λmax ＝２８９ｎｍ，ε＝７１００；λmax ＝２４０ｎｍ，ε
＝１０，７００）を有し、また、ユーロピウムクリプテートのλmax ＝３０５ｎ
ｍ（ε＝２７，０００）に近接した３０３ｎｍにも最大吸収を有する。Ａ303 ／
Ａ240 の比は約０．８２であり、これは提案構造に匹敵する。
【０１５３】 接合体Ｋ−４−ｄＵＴＰをあらわす式を図２に示す。
【０１５４】 実施例７：クリプテートユーロピウム・トリスビピリジンで標識したウリジン
（Ｋ−１１−ＵＴＰ）の合成
【０１５５】 この化合物において、数字の１１は、ヌクレオチドにクリプテート構造が結合
しているアームの総原子数を示す（この事例での結合はピリミジンの５位にある
）。
【０１５６】 使用されるヌクレオシド三リン酸塩は、６−アミノカプロイル− [５−（３−
アミノアリル）ウリジン ５’−三リン酸塩] ( ＡＨ−ＵＴＰ）とされ、実施例
１に関連して記述されたようにして調製される。この化合物は、ＤＥＡＥ−Seph
arose （商標)(Pharmacia)が用いられ、炭酸水素トリエチルアンモニウム直線勾
配（２５ｍＭ〜３００ｍＭ）のもとで精製される。
【０１５７】 ０．１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）（ｐＨ７．８）中にＡ
Ｈ−ｄＵＴＰ １．１μｍｏｌ／ｍ１を含有した溶液４００μ１（即ち、０．４
４μｍｏｌ）が用いられ、それに活性化クリプテート [ＴＢＰ−（Ｅｕ3+）] ３
ｍｇ／ｍｌを含有したアセトニトリル溶液３６０μｌが加えられる。活性化クリ
プテート [ＴＢＰ−（Ｅｕ3+）] は、実施例１における方法Ａに従って調製され
、その後直ちに使用される。
【０１５８】 ４５分間の振盪後、１Ｍ ＴＥＡＢ（ｐＨ８．５）４０μｌが加えられ、その
混合物が Superdex peptide ３０（商標）ＨＲ１０／３０分離管 (Pharmacia)に
注入されて、分離管が１０％アセトニトリルを含んだ５０ｍＭ ＴＥＡＢ（ｐＨ
７）が用いられての溶出に供される（流速：１ｍ１／分）。
【０１５９】 Ｒｔ＝約１５．４分とした化合物が集められ、この留分（留分１と呼ぶ）が減
圧（急速減圧）状態のもとで濃縮されて２００μ１の容量とされる。斯かる濃縮
された留分１は、約１０ＡＵ304nm を含む。ε304 が約３５，０００と見積もら
れたもとで、Ｋ−１１−ＵＴＰの濃度は約０．３ｍＭと見積もられる。
【０１６０】 この留分１は、同じ分離管に注入され、５％アセトニトリルを含んだ２５ｍＭ
酢酸トリエチルアンモニウムバッファー（ｐＨ７）が用いられて溶出される状態
とされる。クロマトグラムにおけるピークに相当する留分が集められ（Ｒｔ＝約
１６．５分）、減圧（急速減圧）状態のもとで濃縮されてＫ−１１−ＵＴＰ溶液
２０２μ１が得られる。この留分（留分２と呼ぶ）は、７．５ＡＵ304nm を含む
。
【０１６１】 この化合物はマススペクトルにより分析される（負モード電子スプレー）。 （Ｍ−４Ｈ）- ＝１４４４．３（Ｃ56Ｈ58ＥｕＮ12Ｏ19Ｐ3 についての計算値
：１４４８．０）
【０１６２】 水溶液のＵＶスペクトラムは、２４１ｎｍに当該分子のヌクレオシド部分に特
徴的な最大吸収（λmax ＝２８９ｎｍ，ε＝７１００；λmax ＝２４０ｎｍ，ε
＝１０，７００）を有し、また、ユーロピウムクリプテートのλmax ＝３０５ｎ
ｍ（ε＝２７，０００）に近接した３０３ｎｍにも最大吸収を有する。Ａ304 ／
Ａ241 の比は約０．８０であり、これは提案構造に匹敵する。
【０１６３】 この化合物は、ＦＰＬＣ（モノ−Ｑカラム；Pharmacia)によって分析される。
バッファーＡ：１０％アセトニトリル含有２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．２
）。バッファーＢ：２０ｍＭ酢酸ナトリウム（ｐＨ５．０）及び１０％アセトニ
トリル含有１Ｍ ＬｉＣｌ。２５分以内にＢを０から３０％ととする直線勾配。
流速：１ｍｌ／分。Ｋ−１１−ＵＴＰはＲｔ＝１０．７分を有する。
【０１６４】 接合体Ｋ−１１−ＵＴＰをあらわす式を図３に示す。
【０１６５】 実施例８：ｄＵＴＰ及びＵＴＰとクリプテートユーロピウム・トリスビピリジ
ンとの接合体の寿命及びクリプテートのみの寿命の比較測定
【０１６６】 使用される参照クリプテートは、ヨーロッパ特許出願ＥＰ０ ３２１ ３５３
号の実施例４に記載されたクリプテートユーロピウム [（ビス−ｂｐｙ）（ｂｐ
ｙ−ジ（アミドエチレンアミン))] とされる( 以下、ＫＮＨ2 と呼ぶ）。
【０１６７】 ＫＮＨ2 水溶液原液が調製され、その濃度が、３０６ｎｍでの光学濃度をε30 6 ＝約３０，０００とみなしたもとで測定されて、決定される。原液（６．７×
１０-4Ｍ）が、０．１Ｍトリス−ＨＣ１バッファー（ｐＨ９）により１／１００
に希釈される。この中間希釈液１００μｌを、同じバッファー６００μｌにより
希釈する。並行して、Ｋ−１１−ｄＵＴＰ，Ｋ−４−ｄＵＴＰ及びＫ−１１−Ｕ
ＴＰ（実施例１，方法Ａ，実施例６及び実施例７に従って夫々調製される）を水
に溶かして原液とし、その濃度を、３０４ｎｍでの光学濃度（ε304 ＝約３５，
０００）を測定することにより、３×１０-5Ｍと見積もる。各原液を、０．１Ｍ
トリス−ＨＣｌバッファー（ｐＨ７．４）または、０．１Ｍトリス−ＨＣｌバッ
ファー（ｐＨ９）１ｍｌに対して５０μｌの割合で希釈する。
【０１６８】 ユーロピウムの発光寿命の値（τｍｓ）が、ＬＳ５０時間分解スペクトル蛍光
光度計（Perkin-Elmer) 及びHelma ５ｍｍ×５ｍｍセルが用いられて測定される
。その結果が、下記の表６に報告されている。
【０１６９】
【表６】 ┌──────────┬─────────┬─────────┐ │ │０．１Ｍトリスバッ│０．１Ｍトリスバッ│ │ 化合物 │ファー ｐＨ７．４│ファー ｐＨ９中寿│ │ │中寿命τ（ｍｓ） │命τ（ｍｓ） │ ├──────────┼─────────┼─────────┤ │Ｋ−１１−ｄＵＴＰ │ ０．５８７ │ ０．５９６ │ ├──────────┼─────────┼─────────┤ │Ｋ−４−ｄＵＴＰ │ ０．６２１ │ ０．６５１ │ ├──────────┼─────────┼─────────┤ │Ｋ−１１−ＵＴＰ │ ０．６３６ │ ０．６４０ │ ├──────────┼─────────┼─────────┤ │ＫＮＨ2 （基準） │ ０．３６８ │ ０．２６５ │ └──────────┴─────────┴─────────┘
【０１７０】 これらの結果は、ヌクレオチドとクリプテート分子とのカップリングが、基準
のクリプテートに比較してユーロピウムの寿命を延ばし、クリプテート／ヌクレ
オチド接合体の新たな特性を生じていることを示している。
【０１７１】 実施例９：オリゴヌクレオチド伸長に際してのターミナルヌクレオチジル転移
酵素によるＫ−１１−ｄＵＴＰの取込み（非放射性エネルギー転移及び時間分解
蛍光測定による確認）
【０１７２】 伸長反応の実行に使用されるマイロチューブが、下記のものを収容したものと
して準備される。 - ２５μｌの０．２Ｍトリス−酢酸バッファー（ｐＨ７．２） - ４μｌの２５ｍＭ塩化コバルト水溶液 - ５μｌの２．４μＭオリゴヌクレオチド水溶液（５’末端でビオチニル化し
た組成物Ａ2 Ｃ3 Ｇ7 Ｔ3 ） - ２μｌの０．０４ｍＭ濃度のＫ−１１−ｄＵＴＰ（留分２，実施例７に従っ
て調製される） - ８μｌの０．０４ｍＭ ｄＴＴＰ - ５μｌの水 - １μｌのターミナルデオキシヌクレオチジル転移酵素（ＴｎＴ，ＥＣ２．７
．７．３１）（Sigma: ３５Ｕ／μｌ）
【０１７３】 反応混合物２μｌが取り分けられて、６０ｍＭ ＥＤＴＡ ４μｌに加えられ
（ｔ0 ＝０分でのコントロールを得る）、残りは反応混合物が、反応速度検討用
に摂氏３７度で培養される。摂氏３７度，反応時間５分後，１０分後，２０分後
，４０分後，６０分後及び８０分後毎に、反応混合物２μｌが取り分けられて、
６０ｍＭ ＥＤＴＡ ４μｌに加えられる。この処理により、留分ｔ5 ，留分ｔ 10 等々が得られる。これらの留分ｔ0 , 留分ｔ5 ，留分ｔ10をバッファーＬ（０
．１Ｍリン酸塩バッファー，ｐＨ７；０．１５Ｍ ＮａＣｌ； ０．４Ｍ ＫＦ
； ０．１％ ＢＳＡ）２５０μｌで希釈する。
【０１７４】 上述の如くに希釈したサンプル５０μｌ（ビオチン２．３．１０-12 ｍｏｌ当
量）が、マイクロプレート（PACKARD: ＨＴＲＦ−９６，９６孔平底黒色低蛍光
マイクロプレート）の“テスト”ウエル（Ｅ0 ，Ｅ5 ，Ｅ10等々）にピペットで
入れられる。接合体ＳＡ−ＸＬ665 （CIS bio international)５０μ１によりバ
ッファーＬが希釈され（１．５．１０-8Ｍ）て各“テスト”ウエルに加えられ、
次いで、バッファーＬ １５０μｌが加えられる。
【０１７５】 “ブランク”が上述の反応混合物から調製されるが、その際、酵素の代わりに
水１μｌが加えられる。この混合物２μｌが取り分けられて、上記の処理及び希
釈操作に供される。この希釈サンプル５０μｌが、“ブランク”ウエルにピペッ
トで入れられ、これに接合体ＳＡ−ＸＬ665 ５０μｌ及びバッファーＬ １５０
μｌが加えられる。
【０１７６】 培養（摂氏３７度，１５分）後、その蛍光が、ディスカバリー装置（PACKARD:
ＨＴＲＦマイクロプレートアナライザー）が用いられて、波長６２０ｎｍ及び
６６５ｎｍについて読み取られる。
【０１７７】 蛍光強度の比、各テストに対するＲｅ＝Ｅ６６５／Ｅ６２０及び各ブランクに
対するＲｏ＝Ｂ６６５／Ｂ６２０が計算され、次いで、ＤＦ＝（Ｒｅ−Ｒｏ）／
Ｒｏの値が百分率であらわされるべく計算される。その結果が、下記の表７に示
される如くに報告されている。
【０１７８】
【表７】 ┌─────┬───┬───┬───┬───┬───┬───┬───┐ │時間（分）│ ０ │ ５ │１０ │２０ │４０ │６０ │８０ │ ├─────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┤ │Ｆ６６５ │ 602│ 1585│ 2186│ 3610│ 5347│ 8204│ 5542│ ├─────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┤ │Ｆ６２０ │ 9559│10,757│ 9921│11,023│10,754│10,589│ 8971│ ├─────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┤ │Ｒｅ │ │ │ │ │ │ │ │ │＝Ｆ６６５│ 0.063│ 0.147│ 0.22│ 0.327│ 0.497│ 0.77│ 0.618│ │／Ｆ６２０│ │ │ │ │ │ │ │ ├─────┼───┼───┼───┼───┼───┼───┼───┤ │ＤＦ │ 0│ 129│ 242│ 409│ 673│ 1104│ 865│ └─────┴───┴───┴───┴───┴───┴───┴───┘
【０１７９】 ブランクは、Ｂ665 ／Ｂ620 比０．０６４を有する。ｔ0 については、Ｅ665 ／Ｅ620 比０．０６３であり、転移はＤＦ＝１００×（Ｒｅ−Ｒｏ）／Ｒｏ＝１
００（０．０６３−０．０６４）／０．０６４、即ち、実質零である。この方法
によって各時間に対するＤＦが計算されることにより、ＤＦ値としてあらわされ
るエネルギー転移は経時的に増大することが観察され、Ｋ−１１−ｄＵＴＰが、
ターミナルヌクレオチジル転移酵素によりオリゴヌクレオチドに取り込まれてい
ることを示している。
【０１８０】 実施例１０、クリプテート分子を取り込んだオリゴヌクレオチドの光物理的性
質 ＴｎＴによりＫ−１１−ｄＵＴＰを取り込む反応は、すべての量を３倍に増し
て、実施例９に従って実施される。ＤＦが時間関数として測定されることにより
、Ｋ−１１−ｄＵＴＰの取込みが同じ理屈に従うことが証明される。反応時間８
０分後に、反応が４００ｍＭ ＥＤＴＡ溶液１２μｌをもって停止される。反応
混合物１０５μｌが取り分けられて、１０ｍＭリン酸塩バッファー（ｐＨ７．４
）に平衡化されたＮＡＰ５分離管（Pharmacia)に供される。
【０１８１】 オリゴヌクレオチドがバッファー６００μｌが用いられて溶出する状態におか
れる。この留分（“留分１”（排除体積））が、以下のようにして分析される。
【０１８２】 ５０μｌの留分１がマイクロプレートのウエルに入れられ、バッファーＬ ２
００μｌが加えられて“クリプテート・ブランク”とされる。５０μｌの留分１
，５０μｌの接合体ＳＡ−ＸＬ665 （CIS bio international)（バッファーＬ中
１．５．１０-8Ｍ）、及び、１５０μｌのバッファーＬが、隣接する“テスト”
ウエルに入れられる。そして、蛍光がディスカバリー装置（PACKARD: ＨＴＲＦ
マイクロプレートアナライザー）が用いられて、波長６２０ｎｍ及び６６５ｎｍ
について測定される。
【０１８３】 測定結果が下記の表８に示される。
【０１８４】
【表８】 ┌─────┬──────┬──────┐ │ │ Ｆ６６５ │ Ｆ６２０ │ ├─────┼──────┼──────┤ │ブランクＫ│ ２３４３│６７，４８１│ ├─────┼──────┼──────┤ │テスト │４２，９８２│３７，７２２│ └─────┴──────┴──────┘
【０１８５】 ＤＦは１００×（Ｒｅ−Ｒｏ）／Ｒｏ＝１００（１．１４−０．０３４７）／
０．０３４７＝３１８０％と計算されるので、この留分はクリプテート標識オリ
ゴヌクレオチドを含んでいる。
【０１８６】 溶出が継続されて得られた留分（留分２，留分３，・・・・）は、留分１に比
して低いＤＦ値と６２０ｎｍでの高い末補正蛍光とを有しており、斯かる留分が
過剰の非取込みＫ−１１−ｄＵＴＰを含むことが観察される。
【０１８７】 留分１（オリゴヌクレオチド鎖に取り込まれたクリプテート分子に相当する）
の蛍光が、既知濃度のクリプテートを含む標準溶液の蛍光と比較されることによ
り、留分１中のオリゴヌクレオチド見積り量を２．１０-11 として、留分１は約
５．１０-11 ｍｏｌのクリプテートを含むと見積もられる。5 ．１０-11 ／２．
１０-11 ＝２. ５という数の標識クリプテート- 標識ヌクレオチドがオリゴヌク
レオチド鎖あたりに取り込まれていることが観察される。
【０１８８】 注意すべきことは、Ｋ−ｄＵＴＰ及びｄＴＴＰが同時に、また、無秩序に取り
込まれていることである。
【０１８９】 様々な数のヌクレオチドＴ及び平均して少なくとも２つのヌクレオチドＫ−ｄ
Ｕが、それゆえに各オリゴヌクレオチド鎖の３’末端に取り込まれている。
【０１９０】 寿命τは、ｌｏｇＥ620 ＝ｆ（ｔ）をプロットすることにより得られる直線の
傾斜から計算される。
【０１９１】 蛍光寿命は、クリプター時間分解蛍光光度計（CIS bio international)が用い
られ、波長３３７ｎｍでの励起により、留分１（１０ｍＭリン酸塩バッファー，
ｐＨ７．４）に含まれる標識したオリゴヌクレオチドに関し、６２０ｎｍについ
て測定される。その結果により得られる寿命はτ= ８６６μｓである。この寿命
は、同一の条件下で測定された接合体Ｋ−１１−ｄＵＴＰ（τ＝６８１μｓ）の
寿命より長い。
【０１９２】 従って、観察結果はオリゴヌクレオチド鎖に取り込まれたクリプテートの寿命
が増加していることを示す。
【０１９３】 実施例１１：クリプテートユーロピウム・トリスビピリジンで標識したアデノ
シン（接合体Ｋ−８−ＡＴＰ）の合成
【０１９４】 この化合物において、数字の８はヌクレオチドにクリプテート構造が結合して
いるスペーサーアームの総原子数を示す（この事例での結合はプリンの８位にあ
る）。
【０１９５】 使用されるヌクレオシド三リン酸塩は [８−（６−アミノヘキシル）アデノシ
ン ５’−三リン酸塩（ＡＨ−ＡＴＰ，Sigma ）とされる。ＡＨ−ＡＴＰ ０．
１μｍｏｌを０．１Ｍ炭酸水素トリエチルアンモニウム（ＴＥＡＢ）（ｐＨ８）
１００μｌに溶解させた溶液を用い、それに活性化クリプテート [ＴＢＰ−（Ｅ
ｕ3+）] ４ｍｇ／ｍｌを含有したアセトニトリル溶液１００μｌが加えられる。
活性化クリプテート [ＴＢＰ−（Ｅｕ3+）] （アセトニトリル中ＮＨＳ／ＤＣＣ
）は、実施例１の方法Ａに従って調製され、その後直ちに使用される。
【０１９６】 ３５分間の振盪後、１Ｍ ＴＥＡＢ ５μｌが加えられ、その混合物が半量に
まで濃縮される。次いで、 Superdex peptide ３０（商標）ＨＲ１０／３０分離
管 (Pharmacia)に注入されて、分離管が１０％アセトニトリルを含んだ５０ｍＭ
ＴＥＡＢ（ｐＨ８）が用いられての溶出に供される（流速：１ｍ１／分）。
【０１９７】 Ｒｔ＝約１６．７分とした化合物が集められ、この留分（留分１と呼ぶ）が減
圧（急速減圧）状態のもとで濃縮されて２００μ１の容量とされる。この濃縮さ
れた留分１は、同じ分離管に注入され、５％アセトニトリルを含んだ２５ｍＭ酢
酸トリエチルアンモニウムバッファー（ｐＨ７）が用いられて溶出される状態と
される。クロマトグラムにおけるピークに相当する留分が集められ（Ｒｔ＝約１
７．２分）、減圧（急速減圧）状態のもとで濃縮される。
【０１９８】 この水溶液のＵＶスペクトラムは、波長２４５ｎｍ，ヌクレオシドに特徴的な
λmax （λmax ＝２７９ｎｍ，ε＝２１，０００）に近接した波長２８３ｎｍ、
及び、ユーロピウムクリプテートに特徴的なλmax ＝３０５ｎｍ（ε＝２７，０
００）に近接した波長３０３ｎｍにおいて、最大吸収を有する。Ａ305 ／Ａ280 の比は約１であり、これは提案構造に匹敵する。
【０１９９】 接合体Ｋ−８−ＡＴＰをあらわす式を図３に示す。
【０２００】 実施例１２：生体外転写反応に際してのＵＴＰとクリプテートユーロピウム・
トリス−ビピリジンとの接合体（Ｋ−１１−ＵＴＰ）の取込み（非放射性エネル
ギー転移及び時間分解蛍光測定による確認）
【０２０１】 この実施例は、Ｋ−１１−ＵＴＰとバイオ−１４−ＣＴＰ（ＣＴＰ／ビオチン
接合体）との生体外転写による１個の同一ＲＮＡ分子への同時取込みに関する。
【０２０２】 １／転写
【０２０３】 プロモータ（Ｔ７プローターを含有し、ＥｃｏＲＩにより線状化した、プラス
ミドＤＮＡ ｐＳＴＰ１８及びｐＳＴＰ１９）を含有した二本鎖ＤＮＡをＲＮＡ
に転写する反応は、ＳＰ６／Ｔ７転写キット（Boehringer-Mannheim)が用いられ
て行われる。得られる転写物は、１０３５塩基の鎖長を有する。
【０２０４】 最終濃度０．５ｍＭのリボヌクレチドに加えて、転写媒質は、０．２％のＫ−
１１−ＵＴＰ及び３０％のバイオ−１４−ＣＴＰを含み、これらは当該鎖に無作
為に取り込まれる。
【０２０５】 実施例７に関連して記述された留分２であるＫ−１１−ＵＴＰが水により希釈
されて、２０μＭ濃度とされる。
【０２０６】 バイオ−１４−ＣＴＰ溶液は、市販のビオチン−１４−ＣＴＰの１０ｍＭ溶液
（Gibco −ＢＲＬ／Life Technologies)を水によって希釈することにより調製さ
れる。
【０２０７】 転写媒質は、ＰＣＲ用マイクロチューブ中（０．５ｍｌ）に下記の表９に示さ
れるものが収容されて調製される。
【０２０８】
【表９】 ┌────────────┬────┬──────┬────────┐ │ │ 容量 │ 最終濃度 │標識ｒＮＴＰ │ │ │ │ │／標識ｒＮＴＰ │ │ │ │ │＋未変性ｒＮＴＰ│ ├────────────┼────┼──────┼────────┤ │転写バッファー（１０Ｘ）│ ２μｌ│ │ │ ├────────────┼────┼──────┼────────┤ │プラスミドＤＮＡ（Ｔ７）│ ２μｌ│ │ │ │ （０．５μｇ／μｌ） │ │ │ │ ├────────────┼────┼──────┼────────┤ │ＡＴＰ（５ｍＭ） │ ２μｌ│ ０．５ｍＭ│ │ ├────────────┼────┼──────┼────────┤ │ＧＴＰ（５ｍＭ） │ ２μｌ│ ０．５ｍＭ│ │ ├────────────┼────┼──────┼────────┤ │ＵＴＰ（５ｍＭ） │ ２μｌ│ ０．５ｍＭ│ │ ├────────────┼────┼──────┼────────┤ │Ｋ−１１−ＵＴＰ │ ２μｌ│ ２μＭ│ ０．４％│ │ （２０μＭ） │ │ │ │ ├────────────┼────┼──────┼────────┤ │ＣＴＰ（３．５ｍＭ） │ ２μｌ│０．３５ｍＭ│ │ ├────────────┼────┼──────┼────────┤ │バイオ−１４−ＣＴＰ │ ２μｌ│０．１５ｍＭ│ ３０％│ │ （１．５ｍＭ） │ │ │ │ ├────────────┼────┼──────┼────────┤ │ＲＮアーゼ インヒビター│ １μｌ│ │ │ │ （２０Ｕ／μｌ） │ │ │ │ ├────────────┼────┼──────┼────────┤ │Ｈ2 Ｏ │ １μｌ│ │ │ ├────────────┼────┼──────┼────────┤ │Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ│ ２μｌ│ │ │ ├────────────┼────┼──────┼────────┤ │総容量 │２０μｌ│ │ │ └────────────┴────┴──────┴────────┘
【０２０９】 酵素添加後、反応媒体２μｌが取り分けられ、５０ｍＭ ＥＤＴＡ溶液（ｐＨ
８）３８μｌにて希釈される。さらに、この溶液１９μｌが取り分けられて、バ
ッファーＬ １１４μｌにて希釈される。そして、この溶液が、ｔ0 ＝０分での
バックグランド・コントロールとして使用される。
【０２１０】 反応混合物が、摂氏３７度のサーモサイクラーに載置される。所定の反応時間
（６０分，９０分及び１２０分）後、反応混合物２μｌが取り分けられ、先と同
様にして、５０ｍＭ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）３８μｌにて希釈され、さらに、その
溶液１９μｌが取り分けられて、バッファーＬ １１４μｌにて希釈される。
【０２１１】 反応時間０分後，６０分後，９０分後及び１２０分後に夫々相当する各希釈溶
液５０μｌが、黒色マイクロプレート（PACKARD: ＨＴＲＦ−９６孔平底マイク
ロプレート）に入れられる。
【０２１２】 バッファーＬ中における濃度６．２５．１０-7Ｍを有するＳＡ−ＸＬ665 溶液
（CIS bio international)５０μｌが加えられ、次いで、バッファーＬ １００
μｌが加えられる。
【０２１３】 ２／エネルギー転移の時間分解測定
【０２１４】 培養（室温１５分）後、ディスカバリー装置（PACKARD)が用いられて、波長６
２０ｎｍ及び６６５ｎｍの蛍光が測定される。
【０２１５】 各反応時間について、エネルギー転移が比Ｒｅ＝Ｆ６６５／Ｆ６２０が計算さ
れることにより評価される。時間ｔ0 に対する比Ｒｏ＝Ｆ６６５／Ｆ６２０は、
それによりバックグランドレベルが評価されるものとなる。転写反応混合物内の
酵素を等容量の水により置換えたもの２μｌを希釈して同様に測定することによ
り、同じバックグランドレベルが得られる。
【０２１６】 エネルギー転移は、各経過時間について式ＤＦ＝（Ｒｅ−Ｒｏ）／Ｒｏにより
計算される。その結果が下記の表１０に示される如くに報告されている。
【０２１７】
【表１０】 ┌───┬────┬──────┬───────┬─────────┐ │ 時 │Ｆ６６５│ Ｆ６２０ │Ｒｅ │ＤＦ │ │ 間 │ │ │ ＝Ｆ６６５ │ ＝（Ｒｅ−Ｒｏ）│ │（分）│ │ │ ／Ｆ６２０│ ／Ｒｏ │ │ │ │ │ │ （％） │ ├───┼────┼──────┼───────┼─────────┤ │ ０│２１０８│１４，６７２│ ０．１４３│ ０│ ├───┼────┼──────┼───────┼─────────┤ │ ６０│６３２９│１８，７５５│ ０．３３７│ １３５│ ├───┼────┼──────┼───────┼─────────┤ │ ９０│６６７２│１７，０２６│ ０．３９２│ １７４│ ├───┼────┼──────┼───────┼─────────┤ │１２０│７３８６│１８，１７９│ ０．４０６│ １８４│ └───┴────┴──────┴───────┴─────────┘
【０２１８】 ＤＦ値の増加が観測されるが、これはＫ−１１−ＵＴＰ及びバイオ−ＣＴＰが
転写されたＲＮＡに取り込まれたことによるエネルギー転移の増加をあらわして
いる。
【０２１９】 上述の転写反応は、アガロースゲル（３％）上の電気泳動によってモニターさ
れる。
【０２２０】 大なるバンドが観測されるが、これは生成されたＲＮＡフラグメントの完全性
を示している。このバンドは、未変性のｒＮＴＰのみにおいて行われた転写によ
り生じるバンドの移動と同じ移動度によって特徴づけられる。
【０２２１】 図４に示すように、反応時間関数としてのＤＦ値曲線は、酵素による転写に際
してのヌクレオチド取込み反応速度の代表的プロフィールをあらわす。これらの
結果は、接合体Ｋ−１１−ＵＴＰがＲＮＡポリメラーゼにより効率的に取り込ま
れていることを示している。
【０２２２】 実施例１３：生体外転写反応に際しての接合体Ｋ−１１−ｄＵＴＰの取込み（
受容体プローブとのハイブリッド形成後における非放射性エネルギー転写及び時
間分解蛍光測定による確認）
【０２２３】 二本鎖ＤＮＡのＲＮＡへの転写反応は、転写キット（Gibco BRL)が使用されて
行われる。Ｔ７プロモーターを含む二本鎖ＤＮＡは、それ自体、一対のプライマ
ーが用いられて行われるＰＣＲにより入手される。このプライマーの一つは、Ｔ
７ ＲＮＡポリメラーゼ（ＥＣ２．７．７．６）のプロモーター配列を含む。得
られる転写物は、１１５塩基の理論鎖長を有する。
【０２２４】 ＲＮＡポリメラーゼによる転写の一般原理は、文献：J. Sambrook ・他, Mole
cular cloning, a laboratory manual, 2nd edition, CSH Press, 1989, p.5.58
and 5.59 に記載されている。
【０２２５】 他のＲＮＡポリメラーゼ、例えば、ＳＰ６またはＴ３ ＲＮＡポリメラーゼな
どの使用が可能とされるが、その場合、ＰＣＲプライマーの配列は当該ＲＮＡポ
リメラーゼの特異プロモーターを取り込ませるために修飾されることになる。
【０２２６】 プロモーターの取込みについては、文献：A.Rolfs ・他，PCR:Clinical Diagn
ostics and Research, Springer-Velag (1992)、及び、D.Y.Kwoth ・他, Proc.
Natl. Acad. Sci.USA (1989), 86, 1173-1177 に記載されている。
【０２２７】 １／ＲＮＡポリメラーゼのプロモーターを含む二本鎖ＤＮＡの調製
【０２２８】 用いられるプロトコルは、デオキシヌクレオチドのみが用いられて１１７ｂｐ
の一次ＰＣＲ産物が生成される場合以外、実施例５に関連して記述されたものと
略同じとされる。
【０２２９】 第２のＰＣＲ（二次ＰＣＲ）は、標的ＤＮＡ（ＤＮＡ）として一次ＰＣＲ産物
の１／１００希釈液２μｌが用いられて実施される。この第２のＰＣＲのために
、ｋ−ｒａｓＥＸ１アンチセンスプライマーが、下記の配列をとるＴ７−ＡＳと
呼ばれるプライマーに置換えられる。
【０２３０】 5'ｄ（ＴＡＡ ＴＡＣ ＧＡＣ ＴＣＡ ＣＴＡ ＴＡＧ ＧＧＧ ＴＧＧ
ＡＴＣ ＡＴＡ ＴＴＣ ＧＴＣ ＣＡＣ ＡＡＡ ＡＴＧ）3'
【０２３１】 上記配列における下線部分が、Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼのプロモーター配列
に相当する。
【０２３２】 ｋ−ｒａｓＥＸ１センスプライマーは：以下の配列を有する：
【０２３３】 5'ｄ（ＣＴＧ．ＣＴＧ．ＡＡＡ．ＡＴＧ．ＡＣＴ．ＧＡＡ．ＴＡＴ）3'
【０２３４】 この第２のＰＣＲ後に得られる二本鎖ＤＮＡは、１３２ｂｐの理論鎖長と以下
の配列（センス鎖）とを有する。 5'ｄ（ＣＴＧ．ＣＴＧ．ＡＡＡ．ＡＴＧ．ＡＣＴ．ＧＡＡ．ＴＡＴ．ＡＡＡ．
ＣＴＴ．ＧＴＧ．ＧＴＡ．ＧＴＴ．ＧＧＡ．ＧＣＴ．ＧＧＴ．ＧＧＣ．ＧＴＡ． ＧＧ Ｃ．ＡＡＧ．ＡＧＴ．ＧＣＣ．ＴＴＧ．ＡＣＧ．ＡＴＡ．ＣＡＧ．ＣＴＡ．
ＡＴＴ．ＣＡＧ．ＡＡＴ．ＣＡＴ．ＴＴＴ．ＧＴＧ．ＧＡＣ．ＧＡＡ．ＴＡＴ．
ＧＡＴ．ＣＣＡ．ＣＣＣ．ＣＴＡ．ＴＡＧ．ＴＧＡ．ＧＴＣ．ＧＴＡ．ＴＴＡ） 3'
【０２３５】 上記配列における下線部分が、Ｔ７配列（センス鎖）をあらわし、破線部分が
、ハイブリッド形成に際してのプローブに対応する配列をあらわす。
【０２３６】 転写は下記のＲＮＡ配列（転写されたＤＮＡフラグメントのアンチセンス鎖に
相同の配列）を生じるが、この場合、下線部分はビオチニル化プローブにより認
識される配列に相当する。
【０２３７】 5'ｐｐｐＧ．ＵＧＧ．ＡＵＣ．ＡＵＡ．ＵＵＣ．ＧＵＣ．ＣＡＣ．ＡＡＡ．
ＡＵＧ．ＡＵＵ．ＣＵＧ．ＡＡＵ．ＵＡＧ．ＣＵＧ．ＵＡＵ．ＣＧＵ．ＣＡＡ．
ＧＧＣ．ＡＣＵ．ＣＵＵ．ＧＣＣ．ＵＡＣ．ＧＣＣ．ＡＣＣ．ＡＧＣ．ＵＣＣ． ＡＡＣ ．ＵＡＣ．ＣＡＣ．ＡＡＧ．ＵＵＵ．ＡＵＡ．ＵＵＣ．ＡＧＵ．ＣＡＵ．
ＵＵＵ．ＣＡＧ．ＣＡＧ．ＧＣＣ3'
【０２３８】 用いられるＲＡＳ１２Ｎプローブは、５’末端においてビオチニル化され、下
記の配列を有する。
【０２３９】 ビオチン−5'ｄ（ＧＴＴ．ＧＧＡ．ＧＣＴ．ＧＧＴ．ＧＧＣ．ＧＴＡ．ＧＧ）3'
【０２４０】 ２／転写：
【０２４１】 最終濃度を０．５ｍＭとする未変性リボヌクレオチドに加えて、転写媒質は、
２％のＫ−１１−ＵＴＰを含み、これがＲＮＡ鎖に無作為に取り込まれる。
【０２４２】 実施例７に関連して記述された留分２のＫ−１１−ＵＴＰは、水によって希釈
されて１００μＭの濃度とされる。
【０２４３】 転写媒質は、ＰＣＲ用マイクロチューブ中（０．５ｍｌ）に下記の表１１に示
されるものが収容されて調製される。
【０２４４】
【表１１】 ┌────────────┬────┬────┬─────────┐ │ │ 容量 │最終濃度│Ｋ−１１−ＵＴＰ／│ │ │ │ │（Ｋ−１１−ＵＴＰ│ │ │ │ │ ＋ＵＴＰ） │ ├────────────┼────┼────┼─────────┤ │転写バッファー（５Ｘ） │ 10μｌ│ │ │ ├────────────┼────┼────┼─────────┤ │正ＰＣＲ ＤＮＡ（Ｔ７）│ 22μｌ│ │ │ │ （０．５μｇ／μｌ） │ │ │ │ ├────────────┼────┼────┼─────────┤ │ＤＴＴ， ０．１Ｍ │ 2 μｌ│ │ │ ├────────────┼────┼────┼─────────┤ │ｒＮＴＰ 混合物 │ 5 μｌ│0.5 ｍＭ│ │ │ （各５ｍＭ） │ │ │ │ ├────────────┼────┼────┼─────────┤ │Ｋ−１１−ＵＴＰ │ 5 μｌ│ 10μＭ│ 2%│ │ （１００μＭ） │ │ │ │ ├────────────┼────┼────┼─────────┤ │ＲＮアーゼ・インヒビター│ 2 μｌ│ │ │ │ （２０Ｕ／μｌ） │ │ │ │ ├────────────┼────┼────┼─────────┤ │Ｈ2 Ｏ │0.5 μｌ│ │ │ ├────────────┼────┼────┼─────────┤ │Ｔ７ ＲＮＡポリメラーゼ│0.5 μｌ│ │ │ │ （５０Ｕ／μｌ） │ │ │ │ ├────────────┼────┼────┼─────────┤ │総容量 │ 50μｌ│ │ │ └────────────┴────┴────┴─────────┘
【０２４５】 反応混合物が、摂氏４０度のサーモサイクラーに１２０分間載置され、次いで
、反応が０．２Ｍ ＥＤＴＡ（ｐＨ８）４μｌをもって停止される。
【０２４６】 反応媒質２μｌがＰＣＲマイクロチューブに入れられ、ＲＡＳ１２Ｎプローブ
（水中濃度０．０３ＡＵ260 ／ｍｌ）１０μｌによって希釈されて、ハイブリッ
ド形成バッファー（１００ｍＭリン酸バッファー，ｐＨ７．４，０．１％ＢＳＡ
，１Ｍ ＮａＣｌ）１３μｌが加えられる。この混合物が、摂氏７０度のもとで
１０分間加熱され、次いで、サーモサイクラー中において摂氏４５度のもとで２
０分間ハイブリッド形成される。
【０２４７】 ハイブリッド形成媒質５．５μｌが、バッファーＬ（ｑｓｐ２００μｌ）によ
って希釈され、希釈されたハイブリッド形成媒質ＨＴpos とされる。
【０２４８】 ブランクは、上述のプロトコルに従って転写が行われることにより調製される
。但し、その際、正のＰＣＲ ＤＮＡは、負のＰＣＲから生成されて標的ＤＮＡ
を含まない、等容量のＰＣＲ媒質によって置き換えられる。
【０２４９】 負の転写媒質（２μｌ）が停止され、次いで、ハイブリッド形成が上述のよう
にして行われて、混合物がバッファーＬにより希釈され、希釈されたハイブリッ
ド形成媒質ＨＴneg とされる。
【０２５０】 ３／エネルギー転移の時間分解測定
【０２５１】 クリプテートがＲＮＡ鎖に取り込まれていることは、ＲＮＡ配列に相補的なプ
ローブとのハイブリッド形成により証明されるが、このプローブは、ストレプト
アビジン／ビオチンを介して接合体ＳＡ−ＸＬ665 （CIS bio international)に
よって標識される。
【０２５２】 ＨＴpos 媒質５０μｌとバッファーＬ中における濃度を１．５．１０-10 Ｍと
するものに希釈された接合体ＳＡ−ＸＬ665 （CIS bio international)５０μｌ
とが、黒色マイクロプレート（PACKARD: ＨＴＲＦ−９６孔平底マイクロプレー
ト）のウエルに入れられ、バッファーＬ １００μｌが加えられる。これらのウ
エルは、エネルギー転移を可能とし、それが、実施例５に関連して記述された如
くに、Ｒｅ＝Ｅ６６５／Ｅ６２０が計算されることにより測定される。
【０２５３】 ＨＴneg 媒質５０μｌが隣接ウエルに入れられ、接合体ＳＡ−ＸＬ665 ５０μ
ｌとバッファーＬ １００μｌとが上述の如くに加えられる。これらのウエルは
、Ｒｏが計算されることによりバックグランドを評価できるものとして使用され
る。
【０２５４】 蛍光は、ディスカバリー装置（PACKARD)が用いられて、波長６２０ｎｍ及び６
６５ｎｍについて測定される。
【０２５５】 エネルギー転移は、各経過時間について式ＤＦ＝（Ｒｅ−Ｒｏ）／Ｒｏにより
計算される。その結果が下記の表１２に示される如くに報告されている。
【０２５６】
【表１２】 ┌────┬────┬──────┬────────────┬───┐ │媒質 │Ｅ６６５│Ｅ６２０ │Ｒｅ＝Ｅ６６５／Ｅ６２０│ＤＦ │ │ │ │ │ │（％）│ ├────┼────┼──────┼────────────┼───┤ │ＨＴpos │ ７３８│１７，９００│ ０．０４１│ │ ├────┼────┼──────┼────────────┼───┤ │ＨＴneg │１７１４│１５，０１０│ ０．１１４│１７８│ └────┴────┴──────┴────────────┴───┘
【０２５７】 標的ＤＮＡの存在下に転写が実施された場合、１７８％の転移が観察される。
【図面の簡単な説明】
【図１】反応時間関数としてＤＦ値のプロット軌跡をあらわすグラフを示す
図である。
【図２】接合体Ｋ−１１−ｄＵＴＰ及び接合体Ｋ−４−ｄＵＴＰをあらわす
式を示す図である。
【図３】接合体Ｋ−１１−ＵＴＯ及びＫ−８−ＡＴＰをあらわす式を示す図で
ある。
【図４】反応時間関数としてのＤＦ値曲線をあらわすグラフを示す図である。
【手続補正書】
【提出日】平成１２年４月１１日（２０００．４．１１）
【手続補正１】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】発明の名称
【補正方法】変更
【補正内容】
【発明の名称】ヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体及びその調 製 方法と使用方法
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ，ＭＬ， ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＧＭ，Ｋ Ｅ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ) ，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ， ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，Ｄ Ｋ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ，ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ， ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，Ｌ Ｕ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ， ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，Ｕ Ｇ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ Ｆターム(参考） 4C057 BB02 BB05 CC03 DD01 LL18 LL19 LL22 LL37 LL41 LL45 MM02 MM04 MM06

Claims (25)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】少なくとも１個の環内炭素原子，プリンもしくはピリミジン環
    の環外窒素原子、あるいは、ペントフラノース単位を成す炭素原子が蛍光マーカ
    ーとの結合に関与するものとされた、未変性の，化学的に修飾された、もしくは
    、１種以上の標識分子類と結合したリボヌクレオシド，リボヌクレオチド，デオ
    キシリボヌクレオシドもしくはデオキシリボヌクレオチドと、 希土類クリプテートから成り、上記原子と結合した少なくとも１個の蛍光マー
    カーと、 を含むことを特徴とするヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体。
  2. 【請求項２】少なくとも１個の環内炭素原子あるいはプリンもしくはピリミ
    ジン環の環外窒素原子が蛍光マーカーとの結合に関与するものとされた、未変性
    の，化学的に修飾された、もしくは、１種以上の標識分子類と結合したリボヌク
    レオシド，リボヌクレオチド，デオキシリボヌクレオシドもしくはデオキシリボ
    ヌクレオチドと、 希土類クリプテートから成り、上記原子と結合した少なくとも１個の蛍光マー
    カーと、 を含むことを特徴とするヌクレオシドまたはヌクレオチド蛍光接合体。
  3. 【請求項３】ＡＭＰ，ＡＤＰ，ＡＴＰ，ＧＭＰ，ＧＤＰ，ＧＴＰ，ＣＭＰ，
    ＣＤＰ，ＣＴＰ，ＵＭＰ，ＵＤＰ，ＵＴＰ，ＴＭＰ，ＴＤＰ，ＴＴＰ，２Ｍｅ−
    ＡＭＰ，２Ｍｅ−ＡＤＰ，２Ｍｅ−ＡＴＰ，１Ｍｅ−ＧＭＰ，１Ｍｅ−ＧＤＰ，
    １Ｍｅ−ＧＴＰ，５Ｍｅ−ＣＭＰ，５Ｍｅ−ＣＤＰ，５Ｍｅ−ＣＴＰ，５ＭｅＯ
    −ＣＭＰ，５ＭｅＯ−ＣＤＰ，５ＭｅＯ−ＣＴＰ，７−デアザ−ＡＴＰ及び７−
    デアザ−ＧＴＰから選択されたリボヌクレオチド、または、これらのリボヌクレ
    オチドに対応するデオキシリボヌクレオチドもしくはジデオキシリボヌクレオチ
    ドから選択されたデオキシリボヌクレオチドを含むヌクレオチドの蛍光接合体と
    されることを特徴とする請求項１または請求項２記載の接合体。
  4. 【請求項４】リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌクレオチドが、 塩基の５位において官能基を有する−２’−デオキシウリジン５’−三リン酸
    塩誘導体、もしくは、ウリジン５’−三リン酸塩誘導体， 塩基の４位もしくは５位において官能基を有する−２’−デオキシシチジン５
    ’−三リン酸塩誘導体、もしくは、シチジン５’−三リン酸塩誘導体， 塩基の６位もしくは８位において官能基を有する−２’−デオキシアデノシン
    ５’−三リン酸塩誘導体、もしくは、アデノシン５’−三リン酸塩誘導体， 塩基の６位もしくは８位において官能基を有する−２’−デオキシグアノシン
    ５’−三リン酸塩誘導体、もしくは、グアノシン５’−三リン酸塩誘導体， 塩基の７位において官能基を有する−２’−デオキシ−７−デアザアデノシン
    ５’−三リン酸塩誘導体、もしくは、７−デアザアデノシン５’−三リン酸塩誘
    導体、及び、 塩基の７位において官能基を有する−２’−デオキシ−７−デアザグアノシン
    ５’−三リン酸塩誘導体、もしくは、７−デアザグアノシン５’−三リン酸塩誘
    導体、 のうちから選択されることを特徴とする請求項１から請求項３までのいずれかに
    記載の接合体。
  5. 【請求項５】リボヌクレオシドもしくはデオキシリボヌクレオシドが、Ａ，
    Ｇ，Ｃ，Ｕ，Ｔ，対応するデオキシヌクレオシドまたはジデオキシヌクレオシド
    及びそれらの化学的修飾類似体類のうちから選択されたものとされる、ヌクレオ
    シド蛍光接合体とされることを特徴とする請求項１記載の接合体。
  6. 【請求項６】デオキシリボヌクレオシドが、３’−アジド−３’−デオキシ
    チミジン及びその誘導体、及び、Ａ，Ｔ，Ｃ，Ｇ，Ｕ及びＩの２',３’−ジデオ
    キシ類似体類のうちから選択されることを特徴とする請求項５記載の接合体。
  7. 【請求項７】蛍光マーカーが、直接またはスペーサーアームを介して、リボ
    ヌクレオシド，デオキシリボヌクレオシド，リボヌクレオチドもしくはデオキシ
    リボヌクレオチドの塩基またはペントフラノース単位への導入もしくはそこで生
    成された官能基に結合していることを特徴とする請求項１から請求項６までのい
    ずれかに記載の接合体。
  8. 【請求項８】蛍光マーカーが、テルビウムクリプテート，ユーロピウムクリ
    プテート，サマリウムクリプテートもしくはジスプロシウムクリプテートとされ
    ることを特徴とする請求項１から至請求項７までのいずれかに記載の接合体。
  9. 【請求項９】蛍光マーカーが、式： 【化１】 （この式中、Ｚは３価または４価の原子を示し、Ｒは何も無いこと，水素，水酸
    基，アミノ基もしくは炭化水素基を示し、互いに独立した２価の基である丸で囲
    まれたＡ，Ｂ及びＣが、一つもしくは複数のヘテロ原子を含有してヘテロ巨大環
    によって断続された炭化水素鎖であり、また、上記２価の基である丸で囲まれた
    Ａ，Ｂ及びＣのうちの少なくとも一つが、少なくとも一つの分子部分を含有して
    成るものか、あるいは、本質的に一つの分子部分から成るものとされ、その分子
    部分が錯体化された希土類イオンの発光準位より大なる三重項エネルギーを有す
    るものとされる。） によりあらわされる巨大多環式化合物によって錯体化された少なくとも１個の希
    土類塩から成る希土類クリプテートとされることを特徴とする請求項１から請求
    項８までのいずれかに記載の接合体。
  10. 【請求項１０】蛍光マーカーが、式：化１によりあらわされる希土類クリプ
    テートであって、その分子部分がフェナントロリン，アントラセン，ベンゼン，
    ナフタレン，ビフェニル及びテルフェニル，アゾベンゼン，アゾピリジン，ピリ
    ジン，ビピリジン，ビスキノリン、及び、式： 【化２】 −Ｃ2 Ｈ4 −Ｘ1 −Ｃ6 Ｈ4 −Ｘ2 −Ｃ2 Ｈ4 − 【化３】 −Ｃ2 Ｈ4 −Ｘ1 −ＣＨ2 −Ｃ6 Ｈ4 −ＣＨ2 −Ｘ2 −Ｃ2 Ｈ4 − （式：化２及び化３中、Ｘ1 及びＸ2 は、同一であっても相違していてもよく、
    酸素，窒素もしくは硫黄を示す。） 【化４】 （式：化４中、Ｘは酸素または水素である。） によってあらわされる化合物のうちから選択されることを特徴とする請求項９記
    載の接合体。
  11. 【請求項１１】蛍光マーカーが、巨大環式化合物：（２２）フェナントロリ
    ン；（２２）フェナントロリンアミド；（２２）アントラセン；（２２）アント
    ラセンアミド；（２２）ビイソキノリン；（２２）ビフェニル−ビス−ピリジン
    ；（２２）ビピリジン；（２２）ビピリジンアミド、及び、巨大環式トリス−ビ
    ピリジン，トリス−フェナントロリン，フェナントロリン−ビス−ビピリジン，
    ビイソキノリン−ビス−ビピリジン及びビス−ビピリジンジフェニルビピリジン
    のうちの一つによって錯体化されたテルビウムまたはユーロピウムイオンから成
    る希土類クリプテートとされることを特徴とする請求項９または請求項１０記載
    の接合体。
  12. 【請求項１２】蛍光マーカーが、ユーロピウムクリプテートＥｕトリスビピ
    リジンとされることを特徴とする請求項１１記載の接合体。
  13. 【請求項１３】蛍光マーカーが、ビピラジン，ビピリミジン及び窒素酸化物
    基を含有した窒素複素環のうちから選択された分子部分を含んだ巨大多環式化合
    物によって錯体化された、少なくとも１個の希土類塩から成る希土類クリプテー
    トとされることを特徴とする請求項１から請求項８までのいずれかに記載の接合
    体。
  14. 【請求項１４】蛍光マーカーが、式： 【化５】 【化６】 （式：化５及び化６中、式： 【化７】 によりあらわされる環は、式： 【化８】 によりあらわされる環のうちの一つである。そして、式：化５〜化８中、 −Ｙは、一つもしくは複数の二重結合、および／または、一つもしくは複数の
    酸素，窒素，硫黄もしくはリンの如くのヘテロ原子、あるいは、一つもしくは複
    数のカルバモイル基もしくはカルボキサミド基を含んだ線状もしくは分枝状Ｃ1 〜Ｃ20アルキレン基類から，Ｃ5 〜Ｃ8 シクロアルキレン基から、あるいは、Ｃ 6 〜Ｃ14アリレン基類から選択された２価の有機基から成る基もしくはスペーサ
    アームであり、上記アルキレン基，シクロアルキレン基またはアリレン基は、ア
    ルキル基，アリール基またはスルフォン酸基により置換されて得られるものとさ
    れ、 −Ｚは、生体物質と共有結合することができる官能基であり、 −Ｒは、メチル基または−Ｙ−Ｚ基であり、 −Ｒ’は、水素または−ＣＯＯＲ”基であり、Ｒ”は、Ｃ1 〜Ｃ10アルキル基
    、好ましくは、メチル基，エチル基またはテルトブチル基であり、さもなくば、
    −Ｒ’は、−ＣＯ−ＮＨ−Ｙ−Ｚ基である。） によってあらわされる巨大多環式化合物によって錯体化された、少なくとも１個
    の希土類塩から成る希土類クリプテートとされることを特徴とする請求項１から
    請求項８までのいずれかに記載の接合体。
  15. 【請求項１５】蛍光マーカーが、スペーサーアームを介して、リボヌクレオ
    シド，デオキシリボヌクレオシド，リボヌクレオチドもしくはデオキシリボヌク
    レオチドと結合したものとされ、また、スペーサーアームが、一つもしくは複数
    の二重結合、および／または、一つもしくは複数の酸素，窒素，硫黄もしくはリ
    ンの如くのヘテロ原子、あるいは、一つもしくは複数のカルバモイル基もしくは
    ガルボキサミド基を含んだ線状もしくは分枝状Ｃ1 〜Ｃ20アルキレン基から，Ｃ 5 〜Ｃ8 シクロアルキレン基から、あるいは、Ｃ6 〜Ｃ14アリレン基から選択さ
    れた２価の有機基から成り、上記アルキレン基，シクロアルキレン基あるいはア
    リレン基は、アルキル基，アリール基またはサルフォネート基により置換されて
    得られるものとされることを特徴とする請求項１から請求項１４までのいずれか
    に記載の接合体。
  16. 【請求項１６】スペーサーアームが、式： 【化９】 及び、式： 【化１０】 によってあらわされる基のうちから選択されることを特徴とする請求項１５記載
    の接合体。
  17. 【請求項１７】デオキシリボヌクレオチドがデオキシウリジンとされ、蛍光
    マーカーがユーロピウムクリプテートＥｕトリス−ビピリジンとされ、スペーサ
    ーアームが３−アミノアリル基とされることを特徴とする請求項１から請求項１
    ５までのいずれかに記載の接合体。
  18. 【請求項１８】少なくとも１個の環内炭素原子，プリンもしくはピリミジン
    環の環外窒素原子、あるいは、ペントフラノース単位を成す炭素原子が蛍光マー
    カーとの結合に関与するものとされた、未変性の，化学的に修飾された、もしく
    は、１種以上の標識分子類と結合したリボヌクレオシド，リボヌクレオチド，デ
    オキシリボヌクレオシドもしくはデオキシリボヌクレオチドを、希土類クリプテ
    ートから成り、上記原子と結合した少なくとも１個の蛍光マーカーと反応させる
    ことを特徴とするヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体の調製方法。
  19. 【請求項１９】少なくとも１個の環内炭素原子，プリンもしくはピリミジン
    環の環外窒素原子、あるいは、ペントフラノース単位を成す炭素原子が蛍光マー
    カーとの結合に関与するものとされた、未変性の，化学的に修飾された、もしく
    は、１種以上の標識分子類と結合したリボヌクレオシド，リボヌクレオチド，デ
    オキシリボヌクレオシドもしくはデオキシリボヌクレオチドと、希土類クリプテ
    ートから成り、上記原子と結合した少なくとも１個の蛍光マーカーと、を含んで
    成るヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体を、マーカーとして用いるこ
    とを特徴とするヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体の使用方法。
  20. 【請求項２０】少なくとも１個の環内炭素原子，プリンもしくはピリミジン
    環の環外窒素原子、あるいは、ペントフラノース単位を成す炭素原子が蛍光マー
    カーとの結合に関与するものとされた、未変性の，化学的に修飾された、もしく
    は、１種以上の標識分子類と結合したリボヌクレオシド，リボヌクレオチド，デ
    オキシリボヌクレオシドもしくはデオキシリボヌクレオチドと、希土類クリプテ
    ートから成り、上記原子と結合した少なくとも１個の蛍光マーカーと、を含んで
    成るヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体を、核酸合成反応における構
    成要素ヌクレオチドとして用いることを特徴とするヌクレオシドもしくはヌクレ
    オチド蛍光接合体の使用方法。
  21. 【請求項２１】少なくとも１個の環内炭素原子，プリンもしくはピリミジン
    環の環外窒素原子、あるいは、ペントフラノース単位を成す炭素原子が蛍光マー
    カーとの結合に関与するものとされた、未変性の，化学的に修飾された、もしく
    は、１種以上の標識分子類と結合したリボヌクレオシド，リボヌクレオチド，デ
    オキシリボヌクレオシドもしくはデオキシリボヌクレオチドと、希土類クリプテ
    ートから成り、上記原子と結合した少なくとも１個の蛍光マーカーと、を含んで
    成るヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体を、オリゴヌクレオチド探査
    子の調製のための中間体として用いることを特徴とするヌクレオシドもしくはヌ
    クレオチド蛍光接合体の使用方法。
  22. 【請求項２２】核酸合成反応に関与する酵素についての酵素活性の測定にあ
    たり、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体が発光して得られる蛍光を
    直接的または間接的に測定し、測定された蛍光に基づいて、上記接合体の合成核
    酸ポリヌクレオチドへの取り込まれ度合いとの相関を求めることを特徴とする請
    求項２０に記載の使用方法。
  23. 【請求項２３】酵素活性が、ＤＮＡあるいはＲＮＡポリメラーゼ，逆転写酵
    素，トランスフェラーゼまたはリガーゼ活性とされることを特徴とする請求項２
    ２記載の使用方法。
  24. 【請求項２４】核酸合成反応に関与する酵素についての酵素活性の測定にあ
    たり、ヌクレオシドもしくはヌクレオチド蛍光接合体を核酸合成反応における構
    成要素ヌクレオチドとして用いることを特徴とする請求項２０記載の使用方法。
  25. 【請求項２５】少なくとも１個の環内炭素原子，プリンもしくはピリミジン
    環の環外窒素原子、あるいは、ペントフラノース単位を成す炭素原子が蛍光マー
    カーとの結合に関与するものとされた、未変性の，化学的に修飾された、もしく
    は、１種以上の標識分子類と結合したリボヌクレオシド，リボヌクレオチド，デ
    オキシリボヌクレオシドもしくはデオキシリボヌクレオチドと、希土類クリプテ
    ートから成り、上記原子と結合した少なくとも１個の蛍光マーカーとを含み、蛍
    光マーカーが、式： 【化１】 （この式中、Ｚは３価または４価の原子を示し、Ｒは何も無いこと，水素，水酸
    基，アミノ基もしくは炭化水素基を示し、互いに独立した２価の基である丸で囲
    まれたＡ，Ｂ及びＣが、一つもしくは複数のヘテロ原子を含有してヘテロ巨大環
    によって断続された炭化水素鎖であり、また、上記２価の基である丸で囲まれた
    Ａ，Ｂ及びＣのうちの少なくとも一つが、少なくとも一つの分子部分を含有して
    成るものか、あるいは、本質的に一つの分子部分から成るものとされ、その分子
    部分が錯体化された希土類イオンの発光準位より大なる三重項エネルギーを有す
    るものとされる。） によりあらわされる巨大多環式化合物によって錯体化された少なくとも１個の希
    土類塩から成る希土類クリプテートとされる、少なくとも一つのヌクレオシドも
    しくはヌクレオチド蛍光接合体から成ることを特徴とするポリヌクレオチド。
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