DE69129226T2

DE69129226T2 - Glp-1-analoga verwendbar in der diabetesbehandlung

Info

Publication number: DE69129226T2
Application number: DE69129226T
Authority: DE
Inventors: Douglas I. Woodside Calif. Buckley; Joel F. Newton Centre Mass. Habener; Joanne B. Chestnut Ridge N.Y. Mallory; Svetlana New York N.Y. Mojsov
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1990-01-24
Filing date: 1991-01-24
Publication date: 1998-07-30
Anticipated expiration: 2011-01-25
Also published as: CA2073856A1; EP0512042B1; JP2004196825A; JP2001151798A; DE69129226D1; EP0512042A1; DK0512042T3; ATE164852T1; EP0512042A4; CA2073856C; WO1991011457A1; JP2003192698A; JP3262329B2; ES2113879T3; JP2005132848A; JPH05506427A

Description

Fachbereich

Die Erfindung betrifft den Bereich der Verbesserung pharmazeutischer Zusammensetzungen. Genauer gesagt betrifft die Erfindung Analoga des Glucagon-artigen Peptid-1-Fragments 7-36 oder 7-37 mit verbesserten pharmakologischen Eigenschaften.

Hintergrund der Erfindung

Der Glucose-Metabolismus wird durch eine Reihe von Peptidhormonen reguliert, zu denen Insulin, Glucagon und gastrisches inhibitorisches Peptid (GIP) zählen. Der komplexe Mechanismus, mittels dessen diese Peptidhormone den Metabolismus regulieren, und die Art und Weise, in der sie einander beeinflussen, ist zumindest teilweise aufgeklärt. So bindet beispielsweise Glucagon an Rezeptoren auf der Oberfläche der pankreatischen β-Zellen, in denen Insulin erzeugt wird, und stimuliert dadurch die Insulinsekretion. Es wurde vorgeschlagen, daß das Glucagon-artige Peptid 1 die Insulinsekretion stimuliert, doch konnte dies nicht bestätigt werden.
Einige dieser Hormone stammen von einem Glucagon-Vorläufer des Wirbeltiers namens "Proglucagon" ab, das ein aus 180 Aminosäuren bestehendes Peptid ist. Proteolyse und Verarbeitung dieses Peptids ergeben eine Reihe dieser Proteinhormone, wobei die Ergebnisse der Verarbeitung vom Ursprung der Zellen abhängen, bei denen dies stattfindet. Beim Schweine- und Rattenpankreas beispielsweise wird das Proglucagon zu Glucagon und einem mit Glicentin verwandtem pankreatischem Peptid weiterverarbeitet, bei dem es sich um ein großes Peptid handelt, das sowohl GLP-1- als auch GLP-2-Sequenzen enthält. Im Schweinedünndarm handelt es sich bei den sekretierten Produkten um das aus 69 Aminosäuren bestehende Glucagon-haltige Peptid Glicentin und die beiden Glucagon-artigen Sequenzen GLP-1 und GLP-2 als einzelne Peptide.
In jedem Fall aber umfaßt die Gesamtsequenz von Proglucagon die Glucagonsequenz mit 29 Aminosäuren, die GLP-1-Sequenz mit 36 oder 37 Aminosäuren und die GLP-2-Sequenz mit 34 Aminosäuren, getrennt durch Aminosäure-Spacer- Sequenzen.
Frühe Bestrebungen, dem GLP-1 ein Wirkungsmuster zuzuordnen, führten zu widersprüchlichen Ergebnissen und so zu der Schlußfolgerung, daß verkürzte Formen dieses Peptids biologisch wirksam sind. Mojsov, S., et al. J Clin Invest (1987) L9:616-619 beschreiben, daß lediglich das aus 31 Aminosäuren bestehende Peptid GLP-1 (7-37) die Freisetzung von Insulin aus dem Pankreas stark stimuliert, obschon sowohl die verkürzte als auch die Form der vollen Länge mit 37 Aminosäuren schon vorher in Pankreas und Darm festgestellt worden war. Es wurde gezeigt, daß auch GLP-1 (7-36), möglicherweise bei amidiertem Carboxyterminus, die Insulinfreisetzung wirksam vermittelt. (Siehe z.B. Holst, J.J., et al. FEBS Letters (1987) 211:169-174).
Die nachfolgend beschriebene Erfindung betrifft Analoga dieses GLP-1, die die erwünschte Kombination der Eigenschaften in Bezug auf eine wirksame Potenzierung der Glucose-induzierten Insulinsekretion und der Glucose-induzierten Hemmung der Glucagonsekretion ebenso wie auf die Halbwertszeit im Kreislauf aufweisen. Die physiologischen Wirkungen der verkürzten Formen auf die Potenzierung der Glucose-induzierten Insulinsekretion wurden, wie oben beschrieben, gezeigt von Holst, J.J., et al. und Mojsov, S., et al. (supra). Die Wirksamkeit der verkürzten Hormone bei der Hemmung der Glucagonfreisetzung wurde gezeigt von Orskov, C., et al. Endocrinol (1988) 123:2009-2013; Suzuki, S., et al. Diabetes Research: Clinical Practice (1988) 5 (Supp. 1):S30. Die Halbwertszeit im Kreislauf dieser verkürzten Formen ist kurz, nämlich nur etwa vier Minuten, wie gezeigt von Kreymann et al. The Lancet (December 5,1987) 1300-1303. Die modifizierten Formen dieser verkürzten GLP-1-Peptide machen die Optimierung dieser Eigenschaften möglich.
Es steht einiges an Literatur bezüglich der Untersuchung des Abbaus der Peptidhormone in der Leber und im Plasma und der Halbwertszeit solcher Hormone generell in vivo zur Verfügung. Eine frühe Abhandlung von McDonald, J.K. et al., J Biol Chem (1969) 244: 6199-6208 zeigte, daß eine Dipeptidase für den Abbau von Glucagon in Rattenleber verantwortlich war. Untersuchungen des Wachstumshormon-Freisetzungsfaktors, eines Mitglieds der allgemeinen Glucagon-, GLP-1, GLP-2-Familie, ergaben, daß dieses in vitro und auch in vivo durch eine Dipeptidase im Plasma schnell abgebaut wird (Frohman, L.A. et al., J Clin Invest (1986) 78:906- 913). Murphy, W.A. et al., in Peptide Research (1988) 1:3641, zeigte, daß einige, jedoch nicht alle alkylierten Peptide des Wachstumshormon-Freisetzungsfaktors eine höhere Wirksamkeit in vivo aufwiesen. So wurde beispielsweise besonders beim trusopropylierten GRF-29 eine 106fache Wirksamkeit gegenüber dem GRF-29 selbst festgestellt. Dagegen zeigte ein N-terminal methyliertes GRF-29 lediglich um 40% höhere Wirksamkeit gegenüber dem Eiter. Ebenso wurde gezeigt, daß die Substitution der D-Ala-Position 2 dieses Hormons seine Wirksamkeit steigerte. Es war natürlich nicht sicher, welcher Wirkung auf die Eigenschaften diese gesteigerte Wirksamkeit zugeschrieben werden konnte.
Von anderen wurden einige Modifikationen des GLP-1 (7-37) angestrebt. Es wurde gezeigt, daß die Deletion des Histidin-Restes an Position 7 die Wirksamkeit des Hormons stark vermindert (Suzuki, S., et al. (supra); Hendrick, G.K., et al. Abstract: Endocrine Society Meeting New Orleans, LA (1988)). Zur Auswirkung von einer oder mehreren C-terminalen Deletionen gibt es widersprüchliche Berichte (Suzuki, S., et al. (supra); Yanaihara, C., et al. Abstract for a Glucagon and Related Peptides Satellite Symposium, 8th International Congress of Endocrinology, July 15-16,1988, Osaka, Japan). Allerdings liegt eine umfangreiche Literatur bezüglich der Modifikationen anderer Mitglieder dieser Peptidhormon-Familie, wie etwa GIP, Glucagon- Freisetzungsfaktor (GRF), Sekretin und vasoaktives Intestinalpeptid (VIP) vor.

Beschreibung der Erfindung

Die Erfindung stellt modifizierte Formen des GLP-1-(7-34); -(7-35); -(7-38) oder -(7-37)-Humanpeptids oder deren C-terminal amidierte Formen bereit. Die nativen Peptide weisen folgende Aminosäure-Sequenz auf:
wobei (G), (R) und (G) in Abhängigkeit von der gegebenen Kettenlänge vorhanden oder abwesend sind. Die modifizierten Formen enthalten ein oder mehrere Veränderungen gegenüber der nativen Struktur und zeigen eine verbesserte Eignung für die therapeutische Anwendung. All diese modifizierten Formen weisen eine höhere Wirksamkeit bei der Potenzierung der Insulinsekretion oder eine höhere Stabilität in Plasma oder beides als Glucagon auf. Diese Wirksamkeit und erhöhte Stabilität läßt sich wie nachfolgend beschrieben beurteilen.
Es wird der standardmäßige Ein-Buchstaben-Abkürzungscode für Aminosäuren verwendet.
Die vorliegende Erfindung stellt ein als ein Therapeutikum für Typ-II-Diabetes nützliches Peptid bereit, welches bei der Stimulierung der Insulinfreisetzung aus Inselzellen wirksamer als Glucagon ist und bei welchem es sich handelt um
(H )&sup7;-GLP-1 (7-37),
(Y)&sup7;-GLP-1 (7-37),
(N-Acetyl-H)&sup7;-GLP-1 (7-37),
(N-Isopropyl-H)&sup7;-GLP-1 (7-37),
(A )&sup8;-GLP-1 (7-37),
(E )&sup9;-GLP-1 (7-37),
(D)&sup9;-GLP-1 (7-37),
(D )&sup9;-GLP-1 (7-37),
(F )¹&sup0;-GLP-1 (7-37),
(S)²²(R)²³(R)²&sup4;(Q)²&sup6;-GLP-1 (7-37) oder
(S)&sup8;(Q)&sup9;(Y)¹&sup6;(K)¹&sup8;(D)²¹-GLP-1 (7-37),
wobei auf eine Aminosäure in der D-Form hinweist;
oder ein Analog eines beliebigen der Obengenannten, wobei GLP-1 (7-37) durch GLP-1 (7-34), GLP-1 (7-35) oder GLP-1 (7-36) oder deren C-terminal amidierte Form ersetzt ist.
Bei einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein solches Peptid bereit, bei dem es sich handelt um
(H )&sup7;-GLP-1 (7-37),
(Y)&sup7;-GLP-1 (7-37),
(N-Acetyl-H)&sup7;-GLP-1 (7-37),
(N-Isopropyl-H)&sup7;-GLP-1 (7-37),
(A )&sup8;-GLP-1 (7-37),
(E )&sup9;-GLP-1 (7-37),
(D)&sup9;-GLP-1 (7-37),
(D )&sup9;-GLP-1 (7-37),
(F )¹&sup0;-GLP-1 (7-37),
(S)²²(R)²³(R)²&sup4;(D)²&sup6;-GLP-1 (7-37) oder
(S)&sup8;(Q)&sup9;(Y)¹&sup6;(K)¹&sup8;(D)²¹-GLP-1 (7-37).
Bei einer weiteren Ausführungsform stellt die Erfindung ein solches Peptid bereit, das darüber hinaus einen stärkeren Widerstand gegenüber Abbau in Plasma aufweist, und bei welchem es sich handelt um
(Ht)&sup7;-GLP-1 (7-37),
(N-Acetyl-H)&sup7;-GLP-1 (7-37),
(N-Isopropyl-H)&sup7;-GLP-1 (7-37) oder
(A )&sup8;-GLP-1 (7-37).
Bei anderen Ausführungsformen richtet sich die Erfindung auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die ein oder mehrere dieser Peptide als Wirkstoffe enthalten, und auf die Verwendung der Peptide bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Typ-II-Diabetes.

Kurzbeschreibung der Zeichnungen

In Abbildung 1 sind die Ergebnisse einer rad iomarkierten Sequenzanalyse auf den Abbau der beiden Analoga im Plasma gezeigt.
In Abbildung 2 sind die Ergebnisse verschiedener GLP-1-(7-37)-Analoga mit
Veränderungen in der Amino-terminalen Region gezeigt, um I-GLP-1 (7-39) aus aminoterminal-spezifischem Antiserum zu verdrängen.

Ausführungsformen der Erfindung

Die Analoga der Erfindung, bei denen es sich um modifizierte Formen des GLP-1 (7-34), (7-35), (7-36) oder (7-37) handelt, sind durch eine größere Wirksamkeit als Glucagon bei einem in vitro Assay, bei dem die Insulinfreisetzung aus isolierten Ratten inseln in Kultur gemessen wurde, und wahlweise durch eine größere Stabilität in Plasma oder beides gekennzeichnet.

Assays für Analoga mit erhöhter Stimulations-Eigenschaft der Insulinfreisetzung

Eine Gruppe von Analoga der Erfindung ist wirksamer als Glucagon bei der Stimulierung der Insulinfreisetzung aus Inselzellen. Mit "wirksamer als Glucagon bei der Stimulierung der Insulinfreisetzung aus Inselzellen" ist gemeint, daß das betreffende Analog eine größere Wirksamkeit bei einem in vitro Assay zeigte, der gewählt ist aus der Gruppe bestehend aus folgendem: Ratteninseln für diese Assays werden mittels des Verfahrens von Sutton, R. et al., Transplantation (1986) 42:689- 691 isoliert. Kurz gesagt werden hierbei männliche Sprague-Dawley-Ratten anästhesiert und das untere Ende des allgemeinen Gallenwegs mit einer an der Stelle fixierten 2-FG-Kanüle kanüliert. Die linken und rechten Gallen-Lebergänge werden dann oberhalb des Eintrittsbereichs der Pankreasgänge in das Gallensystem ligiert. Die Ratten werden durch Ausblutung getötet, woraufhin 3 ml einer Hankschen Lösung, enthaltend 7,5 mM CaCl&sub2;, 20 mM HEPESEingetragenes Warenzeichen in einem oder mehreren der benannten Staaten-Puffer und 1-6 mglml Typ-1-Collagenase in die Kanüle eingelassen werden, um das Pankreas gleichmäßig zu auszudehnen. Das Pankreas wird dann herausgeschnitten und vor der Inkubation in Hankscher Lösung, enthal-- tend 20 ml HEPESEingetragenes Warenzeichen in einem oder mehreren der benannten Staaten-Puffer bei 37ºC, in einen Becher auf Eis eingebracht.
Nach einer 13-25minütigen Inkubation wird das Pankreas entfernt und in Hanksche Lösung, enthaltend 5 g/l Rinderserumalbumin und 20 mM HEPESEingetragenes Warenzeichen in einem oder mehreren der benanntenStaaten-Puffer bei 4ºC eingebracht. Das gesamte Pankreasgewebe wird dann vorsichtig durch eine 14-FG-Nadel gespritzt, in weiterer Hankscher Lösung, enthaltend HEPES wie oben, bei 50 g über 10 Sek. hinweg zentrifugiert und der Überstand entfernt. Das Gewebepellet wird resuspendiert und nochmals vorsichtig gespritzt, gefolgt von einem weiteren Waschgang, woraufhin das dispergierte Gewebe durch ein Nylonmaschenfilter von 500 um Porengröße gegeben wird. Das filtrierte Gewebe wird bei 350 g über 5 Sek. hinweg zentrifugiert, der Überstand entfernt und das Gewebe dann in 25 % Ficoll, zubereitet in Hankscher Lösung mit HEPESEingetragenes Warenzeichen in einem oder mehreren der benannten Staaten-Puffer wie oben, suspendiert und darauf ein diskontinuierlicher Dichtegradient von 23%igen, 20%igen und 11 %igen Ficoll-Lösungen geschichtet. Dieser Dichtegradient wurde bei 750 g über 10 Min. hinweg bei 4ºC gewirbelt und das aus den obigen beiden Grenzflächen erhaltene Gewebe dreimal in Hankscher Lösung gewaschen und durch ein Präpariermikroskop zur Handauslese der Inseln betrachtet.
Bei einem Ansatz wird dann die Fähigkeit des GLP-1-Analogs zur Potenzierung der Sekretion aus diesen Inseln gemäß des Verfahrens von Schatz, H. et al., in "Methods in Diabetes Research" (1984) Band 1, Teil C; S.291-307, bestimmt. Bei diesem Verfahren werden 5-10 Inseln pro Reagenzglas in 1 ml Krebs-Ringer- Bicarbonatpuffer (KRB-Puffer) inkubiert. Für den Test wird Glucagon oder das modifizierte Analog der Erfindung bei 5-10 ug/ml zugegeben. Die Menge an freigesetztem Insulin kann mittels des Verfahrens von Jensen, S.L. et al. M J Physiol (1978) 235: E381-E386, gemessen werden.
Beim folgenden Protokoll handelt es sich um ein bevorzugtes Verfahren zur Messung der Stimulierung der Insulinsekretion. Nach der Verdauung mit
Collagenase können sich die Inseln durch Inkubation in DMEM (DulbeccosEingetragenes Warenzeichen in einem oder mehreren der benannten Staatenmodifiziertes "Eagle"-Medium 16 w/o Glucose), 2,8 mM Glucose, 10% fötales Rinderserum (FBS) bei 37ºC, 5% CO&sub2;, über Nacht regenerieren.
Am nächsten Tag werden die beim Experiment zu verwendenden Inseln in DMEM ohne Glucose, 0,2% BSA (Armour, klinische Qualität, zu aus 5% Lagervorrat hergestellt) für eine 60minütige Präinkubation in Serum-freiem, Glucose-freiem Medium eingegeben. Die Inseln werden mittels einer Eppendorf-Pipette aufgenommen und auf 60-mm-TC-Platten aufgebracht, die 8,0 ml Medium enthalten, und dann wieder in den Inkubator über 60 Min. hinweg eingebracht. Während der Aufbringung auf die Platten werden die Inseln gezählt. (Anmerkung: Jeder Datenpunkt umfaßt 5 Inseln, die Experimente werden gewöhnlich vierfach durchgeführt; daher werden 20 Inseln pro Datenpunkt verwendet.) Gewöhnlich beträgt die Rückgewinnung pro Pankreas 150-200 Inseln. Jegliche zweifelhaften Inseln - zu zerfetzt oder auseinanderfallend - werden nicht verwendet.
Während der 60minütigen Präinkubation wird das Experiment aufgebaut, so daß alles, was am Ende der Präinkubation noch zu tun bleibt, der Transfer der Inseln in Gruppen von 5 in die Experimentbedingungen ist. Das Experiment wird in 48-Napf- TC-Platten bei 0,5 ml Medium pro Napf vorgenommen. Dem DMEM-0,2% BSA wird Glucose bis zur gewünschten Konzentration (gewöhnlich 2,8 mM für hypoglykämische Bedingungen, 5,6 mM Glucose für euglykämische oder 16,7 mM Glucose für hyperglykämische Bedingungen) und die Testverbindung in verschiedenen Dosisbereichen (üblicherweise 1 pM bis 100 nM) zugegeben. Die Testverbindung wird aus dem bei -80ºC gelagerten Lagervorrat bei 0,3 mM hintereinander in Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) 0,2% BSA verdünnt, um einen Verlust an den Glasrohrwänden zu vermeiden. Nach Vermischung von Medium und Testverbindung werden jeweils 0,5 ml in die 4 Näpfe für vierfache Datenpunkte eingebracht.
Nach der Präinkubationsperiode werden 5 Inseln pro Napf zugegeben. Die Inseln werden mittels Eppendorf-Pipette in Volumen von 25 pl aufgenommen. Die Inkubation wird über weitere 60 Min. fortgesetzt, in welchem Zeitraum 0,3 ml pro Napf abgeerntet werden, wobei das Mitnehmen von Inseln sorgsam vermieden wird. Die Näpfe werden dann nochmals auf die lnselzahl geprüft. Das Medium wird dann hinsichtlich des lnsulingehalts unter Verwendung eines Insulin-RIAS beurteilt. Wird das Medium nicht sofort analysiert, so wird es bei -20ºC bis zum Assay gelagert. Die Dosis-Wirkung-Kurven für die Insulinsekretion werden aufgetragen und der ED&sub5;&sub0; aus den Kurven errechnet.
Eine höhere Wirksamkeit im Vergleich zu Glucagon wird entweder als höhere Mengen an durch das Analog unter Verwendung derselben Konzentrationen von Glucagon und Analog freigesetztem Insulin oder alternativ dazu als dieselbe Menge an freigesetztem Insulin, doch unter Verwendung einer geringeren Konzentration von Analog als Glucagon definiert.
Die vorangegangenen Assays stellen zwar spezifische Kriterien zur Beurteilung einer erhöhten Wirksamkeit dar, doch können auch alternative Assays als Ersatz für die zuvor benannten verwendet werden.
Ein weiterer Test auf die Wirksamkeit der Verbindungen der Erfindung mißt ihre Fähigkeit zur Stimulierung der CAMP-Produktion in RIN 1046-38-Zellen. Dieser Assay kann wie folgt durchgeführt werden:
Am Tag 1 werden 5 x 105 RIN 1046-38-Zellen (Drucker, D.J., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84:3434-3438) in die einzelnen Näpfe einer 6-Napf-Schale mit 2,5 ml M199 Kulturmedium ausgesät. Am Tag 4 werden die Zellen nochmals mit frischem Medium eingebracht und am Tag 5 der Assay durchgeführt Zu diesem Zeitpunkt befinden sich 2,0-2,5 x 106 Zellen in jedem Napf. Die Assays werden nur bei Zellpassage ≤24 durchgeführt.
Zum Zeitpunkt -60 Min. werden die Monoschichten zweimal mit 2,5 ml PBS gewaschen, und das Medium wird zu 1,0 ml DMEM-Medium plus 4,5 g/l Glucose und 0,1% BSA (Assay-Medium) ausgetauscht. Zum Zeitpunkt 0 wird das Medium abgesaugt und 1,0 ml frischen Assay-Mediums, das die Testverbindung erhält, eingebracht. Die Testverbindung wird in einem Volumen von 50 ul PBS plus 0,1% BSA zugegeben; die Kontrollen werden lediglich in Trägersubstanz zugegeben. Die Inkubation wird über 0 bis 60 Min. fortgesetzt.
Nach Beendigung werden das konditionierte Medium und die Monoschicht abgeerntet, um sowohl den extra- als auch den intrazellulären cAMP-Gehalt zu messen. Für die extrazelluläre Messung wird das Medium abgetrennt und zentrifugiert, um jegliche Zelltrümmer zu entfernen. Für die intrazelluläre Bestimmung wird nach Abtrennung des Mediums 1,0 ml eiskaltes 95%iges Ethanol zur Monoschicht zugegeben. Die Zellen werden durch Abschaben eingesammelt, anhand von 2 Schockgefrier4auftau-Zyklen unter Verwendung von Flüssig-N&sub2; lysiert und die Zelltrümmer dann durch Zentrifugieren entfernt. Teilmengen (1/40 des Napf- Gehalts) von konditioniertem Medium und Ethanol-Zellextrakt werden zweifach auf die cAMP-Gehalte unter Verwendung eines RIA-Analysensatzes anhand des acetylierten Protokolls gemessen.
Wie oben ist eine höhere Wirksamkeit im Vergleich zu Glucagon entweder als höhere cAMP-Stimulierung durch sowohl das Analog als auch das Glucagon bei derselben Konzentration oder dieselbe cAMP-Stimulierung durch das Analog bei einer niedrigeren Konzentration definiert.
Es können auch andere Assays zur Messung der erhöhten Wirksamkeit auf die Stimulierung der Insulinfreisetzung verwendet werden.
Die Fähigkeit der Verbindungen, die Freisetzung von Insulin zu potenzieren, kann sowohl in vitro als auch in vivo getestet werden. Die Insulinfreisetzung kann unter Verwendung eines standard mäßigen Antikörper-Assays sowohl bei der Analyse von Plasma bei in vivo-Untersuchungen als auch bei der Analyse von Medien oder Perfusionsflüssigkeit in vitro nachgewiesen werden.
So wird beispielsweise bei einem nützlichen in vitro Assay das Pankreasinfusions- Analyseverfahren von Penhos, J.C., et al. Diabetes (1969) L8:733-738 verwendet, wie beim Verfahren von Weir, G.C., et al. J Clin Investigat (1974) 54:1403-1412 angewandt. Die Insulinsekretion kann auch mittels des von Holst, J.J., et al. FEBS Letters (1987) 211:169-174 (supra) beschriebenen Verfahrens gemessen werden. Ebenfalls als Analysemethode der insulinotropen Wirkung nützlich ist die Messung der Stimulierung von Adenylat-Cyclase bei der RIN 1046-38-Zellinie. Drucker, D.J., et al., Proc Natl Acad Sci USA (1987) 84:3434-3438 (supra).
Die Hemmung der Glucagonfreisetzung kann gezeigt werden, wie von Orstov, C., et al. Endocrinol (1988)123:2009-2013; Suzuki, S., et al. Diabetes Research: Clinical Practice (1988) 5 (Supp. 1): S30 (beide supra) beschrieben.

Assays auf eine erhöhte Stabilität gegenüber Abbau

Die therapeutische Wirksamkeit der GLP-1-Analoga der Erfindung kann auch durch Verfügbarmachen von Analoga mit erhöhten Halbwertszeiten in vivo gefördert werden. Mit "erhöhter Halbwertszeit in vivo" ist die nachgewiesene Fähigkeit gemeint, gegenüber einem Abbau in Gegenwart von Plasma beständig zu sein, gemäß einem Assay, gewählt aus der Gruppe bestehend aus folgenden. Bei allen Assays wird das Plasma durch Sammeln von Blut in heparinisierten Glasröhrchen, Lagerung der Glasröhrchen auf Eis und Zentrifugieren bei etwa 3.000 UpM über 10 Minuten hinweg in einer Tischzentrifuge präpariert. Das abgetrennte Plasma wird bei 4ºC gelagert.

A. Radiomarkierte Sequenzierung:

Das GLP-Analog wird mittels Radioiodierung bei Position 19 unter Verwendung standardmäßiger Radiomarkierungsverfahren markiert. Nach Wechsel in RIA-Puffer (50 mM NaHPO&sub4;, pH 7,4, 0,25% BSA (Armour, Insulin- und Ffa4rei), 0,5% BME, 0,002% Polylysin (Sigma 15.000 mw), 0,05% Tween 20, 0,1% NaN&sub3;) werden das radioiod lerte Peptid (etwa 10&sup5; cpm/so ml) und kaltes nicht-jodiertes Peptid (20 pH 100 nM) in 2 ml Plasma zu einer Endkonzentration von 1 nM eingebracht und in einem zirkulierenden Wasserbad über zuvor festgelegte Zeiträume hinweg inkubiert. Die Gesamtmenge an dem Plasma zugegebenem RIA-Puffer übersteigt niemals 5% des Gesamtvolumens. Am Ende der Inkubation werden 10% Bacitracin (Gew/Vol) in Wasser zu einer Endkonzentration von 0,1 % zum Stoppen der Reaktion zugegeben.
Das Plasma wird dann unter Verwendung von C18-Sep-Pak zur Trennung von Analog und jeglicher Fragmente von der Masse der Plasmaproteine extrahiert. Die Sep-PakEingetragenes Warenzeichen in einem oder mehreren der benannten Staaten-Patronen (Waters) werden mit 2 ml 1-Propanol gewaschen, gefolgt von 2 ml Wasser, und dann mit 2 ml an 20%igem CH&sub3;CN, enthaltend 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) (Puffer A), äquilibriert
Das Bacitracin-behandelte Plasma wird in 20%igem CH&sub3;CN zubereitet, wobei das CH&sub3;CN 0,1% TFA enthält, und wird langsam mittels einer 3-ml-Kunststoffspritze durch die Patrone ausgedrückt. Die Patrone wird dann zweimal mit 1 ml Puffer A gewaschen und mit einer einzigen Spülung mit 2 ml von 50%igem CH&sub3;CN, enthaltend 0,1% TFA (Puffer B), in ein silikonisiertes 12 x 75-Glasröhrchen eluiert. Die rückgewonnene Menge an Analog oder Fragmenten beträgt über 90%.
Die Eluate werden auf 100 ul in einem Speed-vac konzentriert und in ein 1,5 ml Eppendorf-Röhrchen eingetragen, in das eine Puffer-Spülung von 1 ml aus dem ursprünglichen Röhrchen gegeben worden war.
Werden die Analoga von GLP-1 (7-37) verwendet, so werden die Konzentrate, um jegliches Analog oder dessen Fragmente zu reinigen, mit 5 ul Antiserum behandelt, das zu einem synthetischen Peptid entsprechend den Resten 24-37 präpariert wurde, welches GLP-1, GLP-1 (7-37), doch nicht GLP-1 (7-36) erkennt. Werden die kürzeren Formen der Analoga verwendet, so werden altern ierende carboxyterminalspezifische Antiseren (in derselben Weise, doch unter Verwendung eines Peptids entsprechend den Resten 24-34, 24-35 oder 24-36 als Immunogen hergestellt) verwendet. Dem werden 100 pl einer 10%igen (Gewnol) Lösung von Protein-ASepharoseEingetragenes Warenzeichen in einem oder mehreren der benannten Staaten(Pharmacia) in PBS zugegeben und das Gemisch danach bei 4ºC unter leichtem Schütteln über Nacht inkubiert. Die SepharoseEingetragenes Warenzeichen in einem oder mehreren der benannten Staatenwird dann durch 5sekündiges Wirbeln in einer Eppendorf-Zentrifuge bei 4ºC pelletiert, woraufhin das Pellet zweimal mit kaltem RIA-Puffer und viermal mit kaltem PBS gewaschen wird.
Es wurden polyklonale Antiseren in weißen Neuseeland-Kaninchen gegen ein synthetisches Peptidfragment entsprechend den Resten 24-37 von GLP-1 (7-37) unter Verwendung des Verfahrens von Mosjoy, S. et al., J Biol Chem (1986) 261:11880-11889 gezüchtet. Die anfänglichen Immunisierungen wurden in die Inguinallymphknoten unter Verwendung von Freundschem kompletten Adjuvans vorgenommen. Zwei subkutane Auffrischungen wurden in einwöchigen Intervallen auf die anfängliche Immunisierung hin unter Verwendung von Freundschem inkomplettem Adjuvans vorgenommen. Für eine Einzelimmunisierung oder Auffrischung wurden 100 ug Peptid und 100 ug methyliertes BSA, gelöst in 0,3 ml Phosphat-gepufferter Kochsalzlösung (PBS) mit 0,9 ml Adjuvans emulgiert. Die Blutentnahmen (50 ml) begannen 6 Wochen nach der ersten Immunisierung und wurden daraufhin in einmonatigen Intervallen fortgesetzt. Wiederholungen der Auffrischungen wurden wie oben vorgenommen, wenn die Titer merklich vom Niveau der vorangegangenen Blutentnahme abgesunken waren.
Das Serum wurde durch Verklumpenlassen des Blutes bei 4ºC über Nacht präpariert. Der Klumpen wurde mittels Zentrifugation bei 2000 g über 15 Minuten hinweg pelletiert und das Serum entfernt. Das Serum wird in Teilmengen bei -20ºC oder -80ºC gelagert.
Die Peptide werden dann aus dem Antikörper-Protein-A-Sepharose-Komplex mittels dreimaligem Waschen mit 100 ul Puffer B eluiert. Die kombinierten 300 ul aus den Waschgängen werden dann direkt in ein ABI Modell 477A-Sequenziergerät gebracht und dieses gemäß der Anleitung des Herstellers betrieben. Aus jedem Zyklus werden dann Fraktionen zur Zählung abgeleitet. Die Zählung kann in 4 ml wässriger Szintillationssubstanz (ACS, Amersham) vorgenommen werden.
In Abhängigkeit vom Zyklus, bei dem die Markierung auftaucht, ist das Ausmaß des Abbaus vom N-Terminus an bestimmt. Hat kein Abbau vom N-Terminus im GLP-1 (7-37)-Analog stattgefunden, so taucht die gesamte Markierungssubstanz im 13. Zyklus auf, entsprechend dem Tyrosin an Position 19; hat ein Abbau stattgefunden, so taucht die Markierung in früheren Zyklen auf.

B. Assay mittels RP-HPLC

Das vorangegangene Verfahren stellt zwar ein eindeutiges Kriterium zum Nachweis einer längeren Halbwertszeit im Plasma dar, doch kann ebenso auch eine alternative Form des Assays für diese Eigenschaft angewandt werden. Bei einem komfortablen Assay kann das Analog auf seinen Abbau zu Fragmenten unter Verwendung der Umkehrphasen-HPLC ausgewertet werden, da die Fragmente zum Analog als solchem verschiedene Rückhaltezeiten aufweisen. Bei diesem Assay wird das Analog dem Plasma über verschiedene Zeiträume hinweg zugegeben und ähnlich dem oben beschriebenen Verfahren für die radiomarkierte Sequenzeanalyse rückgewonnen. Genau gesagt wird das Analog bei einer Konzentration von 100 nM in RIA-Puffer einem ml Plasma zu einer Endkonzentration von 1 nM untergemischt und nach der Inkubation bei 37ºC im zirkulierenden Wasserbad über verschiedene, zuvor festgelegte Zeiträume hinweg die Reaktion gestoppt, indem das Plasma auf 0,1 % (Gew/Vol) in Bacitracin gebracht wird.
Die Peptide werden dann mittels Sep-Pak-Extraktion wie oben beschrieben gereinigt. Die Eluate werden auf etwa 1 ml auf einem Speed-vac eluiert, mit 1 ml destilliertem Wasser verdünnt, bei -80ºC eingefroren und über Nacht lyophilisiert. Das Pulver wird in 0,5 ml Puffer C (0,1% TFA in Wasser) pro ml Ausgangsplasma resuspendiert, und 0,25 ml werden auf einen Hewlett-Packard 1 090L Flüssigchromatograph unter Verwendung einer AlltechEingetragenes Warenzeichen in einem oder mehreren der benannten Staaten -C18-Säule (0,45 x 25 cm; 10 um Teilchengröße) mit einer Brownlee 2 cm C18 Schutzsäule gespritzt. Die Extraktion wird bei OD&sub2;&sub1;&sub4; während des gesamten Durchlaufs überwacht; die Lösungsmittel-Fließgeschwindigkeit betrug 1 ml/min. Ein Gradient zwischen Puffer C und Puffer D (0,1% TFA in Acetonitril) wird über eine 40minütige Durchlaufzeit hinweg hergestellt. Der Gradient beginnt bei 35% D, wird über die ersten beiden Minuten nach Injektion aufrechterhalten und dann auf 42% D über 24 Minuten hinweg erhöht. Der Gradient wird dann für die nächsten beiden Minuten auf 60% D erhöht, 2 Minuten lang auf diesem Niveau gehalten und dann über die nächsten beiden Minuten hinweg zu 35% D abgesenkt. Für die verbliebenen 8 Minuten des Durchlaufs verbleibt der % D bei 35%. Während der ersten 30 Minuten jedes Durchlaufs werden Fraktionen in 0,5minütigen Intervallen gesammelt und in einem Speed-vac getrocknet. Die Proben können auf das Vorhandensein von Analog oder Fragment unter Verwendung eines RIA analysiert werden (Messen der Konkurrenz mit markiertem GLP-1 (7-37) um die Bindung an C-terminal-spezifisches Antiserum) oder mittels eines beliebigen herkömmlichen oder komfortablen alternativen Verfahrens.
Die Radioimmunoassays für den Amino- oder Carboxylterminus von GLP-1 (7-37) verwenden ein einziges Antikörper-Verdrängungsformat. Die Bindung von ¹²&sup5;I-GLP-1 (7-37) an Antikörper wird durch Erhöhen der Konzentrationen an unmarkiertem Peptid in Lösung zunehmend verdrängt. An Antikörper gebundenes iodiertes Peptid wird von freiem iodiertem Peptid in Lösung durch Ausfällung des Antikörper-Peptid- Komplexes mit Pansorbintm (Boehringer Mannheim) getrennt. Das resultierende Pellet wird dann auf einem Gammazähler ausgezählt.

C. Verlust der Bindung an N-terminal-spezifische Antikörper:

Ein dritter Ansatz zur Auswertung der Halbwertszeit in Plasma verwendet polyklonale oder monoklonale Antikörper, die spezifisch zum N-Terminus präpariert sind und die nicht an abgebaute Analoga binden. Diese Antiseren wurden gegen ein synthetisches Peptid entsprechend GLP-1 (7-22) gezüchtet, welches einen zusätzlichen Cystein-Rest am Carboxylterminus enthält und spezifisch an KLH über das Cystein unter Verwendung von mal-sac-HSNA gekoppelt wird, wie von Aldwin, L. et al. Analytical Biochem (1987) 164:494-501 beschrieben. Die polyklonalen Antikörper wurden in weißen Neuseeland-Kaninchen gezüchtet, indem eine Primärimmunisierung in die Inguinallymphknoten von 500 ug Konjugat, emulgiert mit Freundschem kompletten Adjuvans, verabreicht wurde, woraufhin in zweiwöchigen Intervallen zwei Auffrischungen von jeweils 200 ug in Freundschem inkomplettem Adjuvans erfolgten. Das Blut (50 ml) wird daraufhin monatlich entnommen und es erfolgen Auffrischungen, wenn die Titer niedrig sind. Zur Erzeugung monoklonaler Antikörper wurden Balbic-Mäuse intraperitoneal mit 200 ug Konjugat in 0,5 ml Freundschem komplettem Adjuvans immunisiert. Die Mäuse erhielten 2wöchentlich Auffrischungen von 100 ug Konjugat in 0,5 ml Freunschem inkomplettem Adjuvans. Die aus der Milz dieser Mäuse isolierten Zellen wurden mit Fox-NY-Zellen verschmolzen, um monoklonale Zellinien zu erzeugen. Die monoklonalen, sekretierenden Zellinien werden unter Anwendung der standardmäßigen Kohler-Millstein-Technologie erzeugt. Die monoklonalen Überstände und polyklonalen Seren werden unter Verwendung eines ELISA-Verfahrens zum Binden an GLP-1 (7-37), doch nicht an GLP-1 (8-37) durchgemustert. Die Spezifität wird mittels standardmäßigem Lösungsphasen-RIA bestätigt.
Die Kinetik des Abbaus von GLP-1 (7-37) wird durch Zugabe des Analogs zum Humanplasma in RIA-Puffer verfolgt, wobei im allgemeinen 10 ul an 100fach konzentriertem Peptid 1 ml Plasma zum Erhalt der gewünschten Konzentration zugegeben wird; die Probe wird dann in 37ºC warmem Wasserbad inkubiert, und 3fache 50-ul-Teilmengen werden zu verschiedenen Zeitpunkten entnommen. Die Teilmengen werden für den Radioimmunoassay unter Anwendung einer Konkurrenz um die Bindung an den N-terminal-spezifischen Antikörper mit radioiodiertem GLP-1 (7-37) sofort in Ethanol ausgefällt. Das Verschwinden der Fähigkeit, mit GLP-1-(7- 37)-Peptid zu konkurrieren, weist auf den Abbau des Analogs hin. Bei all diesen Assays weist das getestete Analog eine erhöhte Stabilität auf, wenn es weniger schnell abgebaut wird als GLP-1 (7-37).

Die Analoga

Die Nomenklatur, die zur Beschreibung der GLP-1-Analogverbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet wurde, folgt der herkömmlichen Praxis, bei der die Aminogruppe links und die Carboxygruppe rechts jeder Aminosäure im Peptid vorausgesetzt wird. In den Formeln, die ausgewählte spezifische Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung darstellen, sind die Amino- und Carboxy-terminalen Gruppen, obschon oftmals nicht spezifisch gezeigt, als in der Form vorliegend zu verstehen, die sie bei physiologischen pH-Werten annehmen würden, sofern nicht anders spezifiziert. Daher sind der N-terminale H&spplus;&sub2; und C-terminale O&supmin; bei physiologischem pH-Wert als vorhanden zu verstehen, obschon nicht notwenigerweise spezifiziert und gezeigt, und zwar sowohl in den spezifischen Beispielen als auch in den generischen Formeln.
Das vorangegangene beschreibt den Status der Termini bei neutralem pH-Wert; das heißt natürlich, daß die Säurezusatzsalze oder die basischen Salze der Peptide ebenfalls im Rahmen der Erfindung liegen. Bei hohem pH-Wert können die basischen Salze des C-Terminus und der Carboxyl-haltigen Seitenketten in ungiftigen pharmazeutisch geeigneten Basen bestehen, wobei zu geeigneten Gegenionen zum Beispiel Na&spplus;, K&spplus;, Ca&spplus;&spplus; und ähnliche zählen. Auch pharmazeutisch geeignete ungiftige organische Kationen können als Gegenionen verwendet werden. Außerdem können, wie oben erläutert, die Peptide als die entsprechenden Amide hergestellt werden.
Geeignete Säurezusatzsalze bezüglich des N-Terminus oder der Aminogruppehaltigen Seitenketten umfassen die aus anorganischen Säuren gebildeten Salze, wie etwa Salzsäure, Schwefelsäure oder Phosphorsäure, und die aus organischen Säuren gebildeten Salze, wie etwa Essigsäure, Zitronensäure oder andere pharmazeutisch geeignete ungiftige Säuren.
Bei den gezeigten Peptiden ist jeder codierte Rest, wo geeignet, durch eine Einzelbuchstaben-Bezeichnung entsprechend dem Trivialnamen der Aminosäure gemäß der folgenden konventionellen Liste dargestellt:
Bei den spezifischen Peptiden der vorliegenden Anwendung ist die L-Form jeglichen Aminosäure-Rests mit einem optischen Isomer gemeint, wenn nicht durch ein hochgestelltes Kreuzzeichen ( ) ausdrücklich anders angegeben. Obschon die Reste bei den Analoga der Peptide der Erfindung normalerweise in der natürlichen L-Form der optischen Isomere vorliegen, können ein oder zwei, vorzugsweise eine Aminosäure zusätzlich zur spezifizierten "D-Form derselben Aminosäure"-Substitution für die natürlich vorkommende Aminosäure in der D-Konfiguration vorliegen.
Bei der zur Bezeichnung spezifischer Analoga verwendeten Notation sind die modifizierten Positionen als hochgestellte Indizes an der zu ersetzenden Aminosäure dargestellt; so ist
(H )&sup7;-GLP-1 (7-37) die notierte GLP-1 (7-37)-Form, bei der die D-Form von Histidin an Position 7 substituiert ist;
(S)²²(R)²³(R)²&sup4;(Q)²&sup6;-GLP-1 (7-37) bezieht sich auf die 7-37-GLP-Form mit Serin an Position 22, Arginin an Positionen 23 und 24 und Glutamin an Position 26.

Bevorzugte Ausführungsformen

A. Erhöht stimulatorische Analoga

Bezüglich der Analoga mit einer erhöhten Insulin-stimulierenden Wirksamkeit sind jene Analog-Zusammensetzungen der Erfindung besonders bevorzugt, bei denen lediglich eine begrenzte Zahl von Modifikationen oder Substitutionen relativ zur verkürzten GLP-1 -Form vorgenommen werden. Die folgenden spezifischen Analoga sind bevorzugt:
(H )&sup7;-GLP-1 (7-37)
(Y)&sup7;-GLP-1 (7-37),
(N-Acetyl-H)&sup7;-GLP-1 (7-37),
(N-Isopropyl-H)&sup7;-GLP-1 (7-37),
(A )&sup8;-GLP-1 (7-37),
(E )&sup9;-GLP-1 (7-37),
(D)&sup9;-GLP-1 (7-37),
(D )&sup9;-GLP-1 (7-37),
(F )¹&sup0;-GLP-1 (7-37),
(S)²²(R)²³(R)²&sup4;(Q)²&sup6;-GLP-1 (7-37) und
(S)&sup8;(Q)&sup9;(Y)¹&sup6;(K)¹&sup8;(D)²¹-GLP-1 (7-37).

B. Analoga mit erhöhter Stabilität

Einige Analoga der Erfindung weisen sowohl eine erhöhte stimulierende Wirksamkeit bei der Insulinfreisetzung als auch eine erhöhte Stabilität auf. Bei diesen Analoga zählen zu bevorzugten Substitutionen für das Histidin an Position 7 die D-Form des Histidin. Eine bevorzugte Substitution für Alanin an Position 8 ist die D-Form des Alanin.
Die folgenden spezifischen Analoga sind bevorzugt:
(H )&sup7;-GLP-1 (7-37)
(N-Acetyl-H)&sup7;-GLP-1 (7-37),
(N-Isopropyl-H)&sup7;-GLP-1 (7-37) und
(A )&sup8;-GLP-1 (7-37).

Herstellung

Die Analoga der Erfindung können unter Anwendung standard mäßiger Festphasen- Methoden für die Synthese von Peptiden hergestellt werden. Wie allgemein bekannt, können Peptide der erforderlichen Länge unter Verwendung handelsüblicher Ausrüstungen und Reagenzien gemäß den Anleitungen der Hersteller zum Blockieren störender Gruppen, Schützen der umzusetzenden Aminosäure, Koppeln, Schutzentfernen und Abdecken der nicht-umgesetzten Reste hergestellt werden. Geeignete Geräte sind beispielsweise von Applied Biosystems in Foster City, California, oder Biosearch Corporation in San Raphael, California, erhältlich.
Bei einem bevorzugten Verfahren werden die Peptide unter Verwendung standardmäßiger, automatisierter Festphasen-Syntheseprotokolle mit t-Butoxycarbonyl-or- Aminosäuren bei geeignetem Seitenkettenschutz synthetisiert. Das fertiggestellte Peptid wird vom Festphasenträger genommen, indem gleichzeitig der Seitenkettenschutz unter Anwendung des standard mäßigen Fluorwasserstoff-Verfahrens entfernt wird. Die Rohpeptide werden mittels semipräparativer Umkehrphasen-HPLC (VydacEingetragenes Warenzeichen in ein oder mehreren der benannten Staaten C18) unter Verwendung von Acetonitril-Gradienten in 0,1% Trifluoressigsäure (TFA) gereinigt. Die Peptide werden zur Entfernung des Acetonitrils vakuumgetrocknet und aus der Lösung von 0,1% TFA lyophilisiert. Die Reinheit wird mittels analytischer RP-HPLC verifiziert. Die Peptide können Iyophilisiert und dann entweder in Wasser oder 0,01 M Essigsäure bei Konzentrationen von 1-2 mg/ml nach Gewicht löslich gemacht werden.
Die Verwendung der zuvor erwähnten synthetischen Verfahren ist erforderlich, wenn nicht-codierte Aminosäuren oder die D-Formen der Aminosäuren in den Peptiden vorkommen. Bei Gen-codierten Peptiden jedoch kann auch auf rekombinante Methoden unter Verwendung leicht synthetisierbarer DNA-Sequenzen in handelsüblichen Expressionssystemen zurückgegriffen werden.

Formulierung und Verabreichung

Die Analoga der Erfindung sind bei der Behandlung des Typ-II-Diabetes nützlich. Die Analoga können in vielfältigen Formulierungen systemisch verabreicht werden, wie im Fachbereich allgemein bekannt. Die für die speziellen Verabreichungsformen der Peptide geeigneten Formulierungen sind beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, letzte Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania, aufgeführt. Im allgemeinen wird für die Formulierungen eine wirksame Menge des Analogs oder der Analoggemische und mindestens ein pharmazeutisch geeigneter Arzneimittelträger verwendet.
Eine Vielzahl von Verabreichungsformen ist für die systemische Behandlung nützlich, z.B. die intravenöse, intramuskuläre, subkutane oder intraperitoneale Injektion; die transmembrane oder transdermale Verabreichung unter Verwendung geeigneter Suppositorien oder Sprays; und in geeigneter Formulierung die orale Verabreichung. Zu geeigneten Arzneimittelträgern für die Injektion zählen verschiedene physiologische Puffer, z.B. Hanksche Lösung und Ringersche Lösung; geeignete transmembrane oder transdermale Formulierungen enthalten Penetriermittel, z.B. Gallensalze oder Fusidinate; und typische orale Formulierungen enthalten Schutzmittel, die die Verdauung des Wirkstoffs hemmen. Ebenso stehen auch verschiedene Retard-Formulierungen unter Verwendung makromolekularer Matrices, wie etwa Pyrrolidonen und Methylcellulose, zur Verfügung. Alternative Wirkstoff-Transportsysteme umfassen Liposome und Mikroemulsionen. Eine Vielfalt von Formulierungen ist herstellbar und die Bereitstellung der geeigneten Formulierungen für die ausgewählten Peptide und Verabreichungsformen ist von den Fachleuten allgemein erfaßt.
Ein üblicher Dosierungsbereich für die Verbindungen der Erfindung liegt bei etwa 1 pg/kg-1 mg/kg Körpergewicht, obschon es sich hierbei um Annäherungen handelt, da dies von einer großen Anzahl von Faktoren abhängt, einschließlich der Wirksamkeit des Analogs, seiner Halbwertszeit im Kreislauf, den individuellen Eigenschaften des Patienten und ähnlichem. Die Optimierung der Verabreichung von Insulin zur Diabetes-Behandlung bei Patienten ist wohlbekannt, und auch hierbei werden ähnliche Optimierungsprotokolle angewandt.

Beispiele

Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung veranschaulichen, doch nicht beschränken.

Beispiel 1

Erhöhte Insulin-Stimulierung durch die Analoga der Erfindung

Wie in Abbildung 2 gezeigt, wurden die Analoga der Erfindung mit einer Vielzahl von Substituenten, was die native Struktur modifiziert, hergestellt. Einige dieser Analoga wurden im obengenannten Adenylat-Cyclase-Assay getestet; die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. TABELLE 1
Die Wirksamkeit der verschiedenen Analoga der Erfindung liegt also gemäß des insulinotropischen Assays in einem nützlichen Bereich.

Beispiel 2

Erhöhte Stabilität der GLP-1 -Analoga

A. Nachweis der Inaktivierungsweise

Das gekürzte GLP-1-(7-37)-Hormon wurden radioiodiert und das gereinigte Peptid mit Plasma inkubiert und mittels radiomarkierter Sequenzierung wie oben beschrieben analysiert. Die Sequenzierung wurde an den Proben zum Zeitpunkt Null, 15 Minuten und 60 Minuten vorgenommen. Zum Zeitpunkt Null wurde ein einzelner Peak der Radioaktivität bei Zyklus 13 festgestellt, was auf keinen Abbau hinwies. Nach 15 Minuten war die Menge der Radioaktivität bei Zyklus 13 vermindert und in Zyklus 11 erhöht. Nach 60minütiger Inkubation tauchten fast die gesamten Zäh lungen bei Zyklus 11 auf.
Hieraus ergibt sich, daß eine einzige Dipeptidylaminopeptidase-Spaltung für den Abbau des GLP-1 (7-37)-Peptids verantwortlich ist.
Die vorangegangenen Ergebnisse stimmen mit dem mittels RIA unter Verwendung N-terminal-spezifischer und C-terminal-spezifischer Antiseren gemessenen Abbau überein. Wurde, wie oben beschrieben, mit Plasma inkubiert und mittels RIA getestet, so war keine Abnahme der Fähigkeit des rückgewonnenen Fragments zur Hemmung der Bindung des radiomarkierten GLP-1 (7-37) an carboxyterminalspezifischen Antikörper feststellbar; die Fähigkeit zur Hemmung der Bindung an den aminoterminal-spezifischen Antikörper verminderte sich jedoch nach einer Stunde auf nahezu Null.

B. Mittels radiomarkierter Seguenzierung getestete GLP-1 (7-37)-Analoga

Das Verfahren der rad iomarkierten Sequenzierung zur Analyse des Abbaus wurde unter Verwendung eines GLP-1-(7-37)-Analogs durchgeführt, das entweder D-Asp in der 9-Position oder D-Ala in der 8-Position enthielt. Die Ergebnisse dieses Assays sind in Abbildung 3 gezeigt. Abbildung 3A zeigt die Ergebnisse für (D )&sup9;-GLP-1 -(7-37), und Abbildung 3B zeigt die Ergebnisse für (A )&sup8;-GLP-1 (7-37). Wie in diesen Abbildung gezeigt, wird das (D )&sup9;-Analog in ähnlicher Weise abgebaut wie GLP-1 (7-37); dagegen zeigte das (A )&sup8;-Analog nach 60 Minuten nahezu keinen Abbau.

C. Mittels RIA getestete Analoga

Der N-terminal-spezifische Antikörper kann zur Messung des Abbaus der Analoga nur dann verwendet werden, wenn er zur Kreuzreaktion mit diesen Analoga, die selbst Veränderungen im N-Terminus aufweisen, fähig ist. In Abbildung 4 sind die Ergebnisse für an Positionen 7, 8 und 9 modifizierten Analoga gezeigt. (Y)&sup7;, (H )&sup7; und (A )&sup8; scheinen, wennauch nur in hohen Konzentrationen, zur Kreuzreaktion in der Lage zu sein, (D )&sup9; dagegen nicht. Die kreuzreagierenden Peptide wurden mit Plasma über 60 Minuten hinweg bei hohen Konzentrationen (10-100 nM) inkubiert und mittels RIA unter Anwendung des RIAS gegen den N-terminal-spezifischen Antikörper getestet. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen in Paragraph B wurde das (A )&sup8;-Analog nach 60 Minuten nicht abgebaut, ebensowenig wie das (H )&sup7;-Analog. Das (Y)&sup7;-Analog dagegen wurde abgebaut.

D. Mittels HPLC als Protease-resistent nachgewiesene Analoga

Der Beständigkeit verschiedener Analoga gegen Abbau im Vergleich zu GLP-1 (7-37) wurde ebenfalls mittels HPLC, wie oben beschrieben, getestet. Die Inkubationszeit in Plasma betrug 60 Minuten; nach diesem Zeitraum war entweder kein Abbau beobachtbar, oder er war abgeschlossen. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt.

Claims

1. Peptid, das als ein Therapeutikum für Typ-II-Diabetes nützlich und wirksamer als Glucagon bei der Stimulierung der Insulinfreisetzung aus Inselzellen ist und bei welchem es sich handelt um

(H )&sup7;-GLP-1 (7-37),

(Y)&sup7;-GLP-1 (7-37),

(N-Acetyl-H)&sup7;-GLP-1 (7-37),

(N-Isopropyl-H)&sup7;-GLP-1 (7-37),

(A )&sup8;-GLP-1 (7-37),

(E )&sup9;-GLP-1 (7-37),

(D)&sup9;-GLP-1 (7-37),

(D )&sup9;-GLP-1 (7-37),

(F )¹&sup0;-GLP-1 (7-37),

(S)²²(R)²³(R)²&sup4;(Q)²&sup5;-GLP-1 (7-37) oder

(S)&sup8;(Q)&sup9;(Y)¹&sup6;(K)¹&sup8;(D)²¹-GLP-1 (7-37),

wobei auf eine Aminosäure in der D-Form hinweist;

oder ein Analog eines beliebigen der obengenannten, bei dem GLP-1 (7-37) durch GLP-1 (7-34), GLP-1 (7-35) oder GLP-1 (7-36) oder deren C-terminale Amid-Form ersetzt ist.

2. Peptid nach Anspruch 1, bei welchem es sich handelt um

(H )&sup7;-GLP-1 (7-37),

(Y)&sup7;-GLP-1 (7-37),

(N-Acetyl-H)&sup7;-GLP-1 (7-37),

(N-Isopropyl-H)&sup7;-GLP-1 (7-37),

(A )&sup8;-GLP-1 (7-37),

(E )&sup9;-GLP-1 (7-37),

(D)&sup9;-GLP-1 (7-37),

(D )&sup9;-GLP- 1(7-37),

(F )¹&sup0;-GLP-1 (7-37),

(S)²²(R)²³(R)²&sup4;(Q)²&sup6;-GLP-1 (7-37) oder

(S)&sup8;(Q)&sup9;(Y)¹&sup6;(K)¹&sup8;(D)²¹-GLP-1 (7-37).

3. Peptid nach Anspruch 2, bei welchem es sich handelt um

(H )&sup7;-GLP-1 (7-37),

(N-Acetyl-H)&sup7;-GLP-1 (7-37),

(N-Isopropyl-H)&sup7;-GLP-1 (7-37),

(A )&sup8;-GLP-1 (7-37),

4. Pharmazeutische Zusammensetzung, die zur Behandlung von Typ-II-Diabetes nützlich ist und die eine wirksame Menge eines Peptids, wie in einem der vorangehenden Ansprüche definiert, in Mischung mit einem pharmazeutisch geeigneten Arzneimittelträger umfaßt.

5. Verwendung eines Peptids, wie in einem der Ansprüche 1 bis 3 definiert, bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung des Typ-II-Diabetes.