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JP6501775B2 - 心不全治療用の環状ポリペプチド - Google Patents

心不全治療用の環状ポリペプチド Download PDF

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リチャードソン ウセラ，エイミー
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佳代 八十島
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Description

発明の分野
本発明は、投与を受ける対象において心血管疾患が治療されるように設計され、その野生型の対応物より高い耐分解性、およびそれと同等以上の生物活性を示す、改変ペプチドおよびポリペプチド配列を含む新規組成物に関する。本発明はまた、前記組成物の製造方法、および前記組成物を心血管疾患治療のために薬学的活性剤として使用する方法に関する。
発明の背景
西欧諸国における心不全の発生率は、６５才を過ぎた成人のおよそ１００人に１人である。最も一般的な病態は、心収縮性、したがって、心拍出量、すなわち、どちらかの心室によって排出される有効血液量が徐々に慢性的に不足することである。慢性心不全の患者は、代償不全、すなわち、心臓が十分な血液循環を維持できないという急性エピソードを伴う場合があり、その場合、心収縮性はさらに低下する。米国だけで、「急性非代償性心不全」（ＡＤＨＦ）での入院は、毎年約５０万件である。
ＡＤＨＦの現行の療法としては、利尿薬、血管拡張薬、およびイノトロープが挙げられ、これらは、心収縮性を直接増大させる。現用の静脈内イノトロープ（ドブタミン、ドーパミン、ミルリノン、レボシメンダン）は、不整脈などの有害事象および長期死亡率の増大と関連付けられているにもかかわらず、急性の状況で使用される。こうした傾向があることは、これらを慢性心不全に適用する妨げとなっている。ジゴキシンは、経口イノトロープ（oral inotrope）であるが、狭い治療指数、潜在的な催不整脈性の増大、および腎不全における禁忌による制約がある。
催不整脈性または死亡の傾向なしに心収縮性を増大させる心不全の療法は、ＡＤＨＦ用に差し迫って求められてはいるが、慢性心不全における未対応の膨大な医学的要求にも対処できるはずである。
アペリンは、アペリン受容体、アンジオテンシン様１受容体、アンジオテンシンＩＩ様１受容体などとも呼ばれる、以前はオーファンであったＧタンパク質共役型受容体（ＧＰＣＲ）ＡＰＪの、内因性リガンドである。アペリン／ＡＰＪ経路は、心血管系において広く発現され、アペリンは、前臨床モデルにおいて、有益な主要な心血管効果を示している。ヒトにおける急性アペリン投与は、末梢および冠動脈の血管拡張を引き起こし、心拍出量を増加させる（Circulation. 2010; 121:1818-1827）。結果として、ＡＰＪアゴニズムは、心不全患者にとっての重要な治療ターゲットとして浮上している。アペリン受容体ＡＰＪの活性化は、現行の療法の傾向を伴わずに、心収縮性を増大させ、心臓保護になると考えられている。しかし、自然のアペリンは、ｉｎ ｖｉｖｏでの半減期および作用持続期間が非常に短い。非常に短い半減期は、急速な血清クリアランス、およびペプチダーゼの作用によるタンパク質分解性分解を原因とする、このような治療用内因性ペプチド送達の、広く認められている主要な難題である。
この欠点を克服するために現在使用されている一手段は、一部の治療用ペプチドが分解されるとしても、十分治療上有効なままとなるように、問題の治療用ペプチドを高い投薬量（dosage）で患者に投与することである。しかし、この方法は、患者にとって快適ではない。大半の治療用ペプチドは経口投与することができないので、治療用ペプチドは、絶えず注入する、静脈内注射によって頻回注入する、または皮下注射という不便な経路によって頻回投与することのいずれかの必要があることになる。頻回投与が必要となる結果、潜在的可能性のある多くのペプチド治療薬には、許容されない非常に突出した治療コストが伴う。分解された多量のペプチドが存在することは、望ましくない副作用も生じる可能性がある。
投与の苦痛および高いコストは、魅力的な生物活性プロファイルを有する大半の治療用ペプチドが、薬物候補として開発され得ない、２つの理由である。
したがって、ペプチドの半減期を延長する１つの手法は、生物学的活性を依然として維持しながら、その分解の速度を緩めるように、治療用ペプチドを改変することである。
したがって、アペリンの機能を模倣するが、半減期が延長されており、自然に存在するアペリンと同等またはそれを超える生物活性を示す、ペプチドおよびポリペプチドを特定することが望ましい。さらに、立体配座の拘束、すなわち、ペプチドおよびポリペプチドが、追加のフォールディングまたは再配置（repositioning）の必要なしに、その受容体および／または他の経路ターゲットと相互作用し得るような活性立体配座状態を実現および維持する能力の増大を示す、アペリン類似体ペプチドおよびポリペプチドを特定することが望ましい。追加の手法としては、ペプチドを、腎臓を介したその排出を妨げる分子にコンジュゲートさせることにより、クリアランスの速度を減速することが挙げられる。
したがって、改変ペプチドの治療上の利点を依然として保持しつつ低い毒性を維持しながら、ｉｎ ｖｉｖｏでの作用持続時間をより長くするために半減期が延長されている、改変された治療用ペプチドが求められている。
発明の要旨
本発明は、問題の治療用ペプチドまたはポリペプチド、すなわち、ＡＰＪアゴニストを改変することにより、身体内でのペプチド分解の問題を克服することを対象とする。
本発明の目的は、ＡＰＪアゴニストとして有用であり、また、野生型アペリンおよび他の既知のアペリン類似体に優る次の改良点、すなわち、半減期の延長、投与後および／または可溶化後の分解に対するより強い免疫性、ならびに立体配座拘束の増強のうちの少なくとも１つを、すべて、野生型アペリンと同等またはそれを超える生物学的活性を示しながら保持する、新規のペプチドおよびポリペプチド、またはそのバイオコンジュゲートを提供することである。したがって、本発明のペプチドおよびポリペプチド、またはそのバイオコンジュゲートは、心不全などの心血管疾患、心不全と関連する障害および状態、ならびにＡＰＪ受容体活性の活性化に反応を示す障害および状態の治療または予防に特に有用である。
一実施形態では、本発明のペプチドおよびポリペプチド、またはそのバイオコンジュゲートは、心不全と関連する障害もしくは状態、またはＡＰＪ受容体活性の活性化（もしくはアゴニズム）に反応を示す障害の治療または予防に特に有用である。別の実施形態では、本発明のペプチドおよびポリペプチド、またはそのバイオコンジュゲートは、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作（cerebrovascular accident）、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、および子癇前症の治療において特に有用である。
本発明は、本明細書に記載するとおりの、ペプチドおよびポリペプチド、またはそのバイオコンジュゲート、医薬組成物、ならびにその製造および使用の方法に関する。本発明のペプチドおよびポリペプチドの例としては、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つに従うペプチドおよびポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩、ならびに、限定はしないが実験実施例を始めとする、本明細書において詳細に列挙するいずれかのペプチドまたはポリペプチド、およびそのバイオコンジュゲートが挙げられる。
したがって、本発明は、ペプチドまたはポリペプチド式（Ｉ）：
Ｘ１−Ｒ−Ｘ３−Ｘ４−Ｌ−Ｓ−Ｘ７−Ｘ８−Ｘ９−Ｘ１０−Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３
Ｉ
［式中、
Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、存在しないか、またはＱ、Ａ、もしくはｐＥのいずれかであり、あるいはＸ１は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、Ｄ−ｈＣから選択され；ここで、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖は、Ｘ７の側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ３は、Ｐであり、またはＸ３は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、およびＤ−ｈＣから選択され；ここで、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖は、Ｘ７の側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ４は、Ｒであり、またはＸ４は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、およびＤ−ｈＣから選択され；ここで、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖は、Ｘ７の側鎖とジスルフィド結合を形成し、
ここで、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４の１つだけは、Ｃ、ｃ、ｈＣ、およびＤ−ｈＣから選択される含硫アミノ酸（sulfur contain amino-acid）であり、
Ｘ７は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり；かつ、Ｘ７の側鎖は、Ｘ１、Ｘ３、またはＸ４いずれかのＣ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ８は、ＫまたはＦであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ａ、ａであり、または存在せず、
Ｘ１０は、Ｐであり、または存在せず、
Ｘ１１は、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍ、またはｆであり、
Ｘ１２は、存在しない、またはＰ、ｆ、ａ、Ｄ−Ｎｖａ、もしくはＤ−Ａｂｕであり、
Ｘ１３は、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、または（Ｎ−Ｍｅ）Ｆ、Ｆ、ｆ、ａ、ｙ、およびＮａｌから選択され；ここで、
Ｎｌｅは、Ｌ−ノルロイシンであり、
Ｄ−Ｎｌｅは、Ｄ−ノルロイシンであり、
Ｄ−ｈＣは、Ｄ−ホモシステインであり、
ｈＣは、Ｌ−ホモシステインであり、
Ｎａｌは、Ｌ−ナファタリン（L-naphathaline）であり、
Ｄ−Ｎｖａは、Ｄ−ノルバリンであり、
Ｄ−Ａｂｕは、Ｄ−２−アミノ酪酸であり、
ｐＥは、Ｌ−ピログルタミン酸である］
またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩、またはこれらと実質的に同等なポリペプチドを提供する。
本明細書においてさらに説明するとおり、本発明のペプチドおよびポリペプチドを構成するアミノ酸残基を表すのには、当業界で受け入れられている３文字または１文字略語を使用する。 「Ｄ」が前に付く場合を除き、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。 １文字略語が大文字であるとき、略語はＬ−アミノ酸を指す。１文字略語が小文字であるとき、略語はＤ−アミノ酸を指す。代わりに、Ｄ−アミノ酸は、略語文字の直前にＤの文字を添えて表す場合もあり、すなわち、「Ｄ」が前に付いているとき、そのアミノ酸は、Ｄ−アミノ酸である。
上で挙げた式Ｉのアミノ酸残基のいずれか、または本明細書に記載のその関連式、たとえば、式Ｉ〜ＩＶは、本発明のペプチドまたはポリペプチドが、機能活性および構造特性（たとえば、半減期の延長、分解からの保護、立体配座拘束）を依然として保持するという前提で、保存的な様式で置換されていてもよい。許容される保存的なアミノ酸置換の原理および例は、本明細書でさらに説明する。
本発明はさらに、
ａ． 式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのペプチドまたはポリペプチド、
ｂ． 半減期延長性部分（half-life extending moiety）
を含み、
前記ペプチドまたはポリペプチドと前記半減期は、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、
バイオコンジュゲートまたはその多量体を提供する。
「場合によりリンカーを介して」とは、式Ｉ〜ＩＶによるポリペプチドのペプチドが、直接（すなわち、リンカーなしで）半減期延長性部分に共有結合によって連結し、もしくは融合し、またはリンカーを介して半減期延長性部分に共有結合によって連結し、もしくは融合することを意味する。
本発明の半減期延長性部分は、ペプチドまたはポリペプチド類似体に、共有結合によって融合、付着、連結、またはコンジュゲートしていてよい。半減期延長性部分は、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー、コレステロール基、炭水化物、もしくはオリゴ糖、脂肪酸、またはサルベージ受容体に結合するいずれかの天然もしくは合成タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドでよい。半減期延長性部分は、血清半減期の長い血漿タンパク質（アルブミンおよび免疫グロブリン）に、場合によりリンカーを介して共有結合によって連結することが好ましい。他の実施形態では、半減期延長性部分は、アルブミン結合性残基である。本明細書で使用する「アルブミン結合性残基」とは、ヒト血清アルブミンに、非共有結合的に結合する残基を意味する。一実施形態では、アルブミン結合性残基は、親油性残基である。別の実施形態では、アルブミン結合性残基は、生理的ｐＨで負電荷を有する。アルブミン結合性残基は、通常、負電荷を有しうるカルボン酸を含む。アルブミン結合性残基の例としては、脂肪酸が挙げられる。他の実施形態では、半減期延長性部分は、ＩｇＧ定常ドメインもしくはその断片（たとえば、Ｆｃ領域）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはアルブミン結合性ポリペプチドもしくは残基、たとえば脂肪酸である。バイオコンジュゲートの半減期延長性部分の部分は、ヒト血清アルブミンまたはＦｃ領域であることが好ましい。バイオコンジュゲートの半減期延長性部分の部分は、Ｆｃ領域であることが最も好ましい。
半減期延長性部分は、本発明のバイオコンジュゲートの構成部分、たとえば、本発明のペプチドまたはポリペプチド（式Ｉ〜ＩＶ）の生物学的機能を増強するように、かつ／またはその妨げとならないようにして付着している。一部の実施形態では、本発明のポリペプチドは、半減期延長性部分に、場合によりリンカーを介して融合していてもよい。半減期延長性部分は、ＩｇＧ定常ドメインもしくはその断片（たとえば、Ｆｃ領域）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などのタンパク質、またはアルブミン結合性ポリペプチドもしくは残基（たとえば脂肪酸）でよい。本明細書で開示するこのようなタンパク質は、多量体を形成してもよい。
一部の実施形態では、半減期延長性部分（たとえば、ＨＳＡ、Ｆｃ、脂肪酸など）は、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのペプチドまたはポリペプチドのＮ末端に、共有結合によって連結または融合する。他の実施形態では、半減期延長性部分（たとえば、ＨＳＡ、Ｆｃ、脂肪酸など）は、本発明の式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのペプチドまたはポリペプチドのＣ末端に、共有結合によって連結または融合する。
本発明のポリペプチドまたはそのバイオコンジュゲートは、ＡＰＪ受容体の活性化を介して、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、および子癇前症の治療において有用である。
好ましい実施形態では、本発明のポリペプチド、またはそのバイオコンジュゲートは、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）の治療において有用である。
別の実施形態では、本発明は、そのような治療の必要のある対象において、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す障害または疾患を治療する方法であって、対象におけるＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す障害または疾患が治療されるような有効量の式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つに従うポリペプチドまたはそのアミド、塩のエステル（an ester of a salt）、またはそのバイオコンジュゲートを対象に投与する工程を含む方法に関する。
さらに別の実施形態では、本発明は、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つに従うポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートと、１種または複数の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物に関する。
さらに別の実施形態では、本発明は、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つに従うポリペプチド、またはそのアミド、エステルもしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートと、１種または複数の治療活性薬剤の医薬的組合せ（pharmaceutical combination）とを含む組合せに関する。
別の実施形態では、本発明は、その必要のある対象においてＡＰＪ受容体を活性化させる方法であって、治療有効量の式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つに従うポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートを対象に投与する工程を含む方法に関する。
発明の詳細な説明
本出願を説明する目的のために、別段指定しない限り、また相応しい場合は常に、以下の定義が適用され、単数形で使用する用語は、複数形の語も包含し、逆の場合も同様である。
本明細書で使用するとき、「ＡＰＪ受容体の変調に反応を示す障害または疾患」、「ＡＰＪの変調に反応を示す障害および状態」、「ＡＰＪ受容体活性の変調に反応を示す障害および状態」、「ＡＰＪ受容体活性の活性化（またはアゴニズム）に反応を示す障害」および同様の用語は、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、および子癇前症を包含する。
本明細書で使用するとき、「ＡＰＪ受容体活性の活性化」または「ＡＰＪ受容体の活性化」とは、ＡＰＪ受容体活性の増大を指す。ＡＰＪ受容体活性の活性化は、たとえば、本発明のペプチドおよびポリペプチドの投与による、ＡＰＪ受容体の「アゴニズム」とも呼ぶ。
本明細書で使用するとき、用語「ポリペプチド」および「ペプチド」は、互いに連結した２個以上のアミノ酸を指すのに、互換的に使用する。以下で表１に示す、珍しいまたは自然でないアミノ酸の略語を除き、当業界で受け入れられている３文字または１文字略語を使用して、本発明のペプチドおよびポリペプチドを構成するアミノ酸残基を表す。「Ｄ」が前に付く場合を除き、アミノ酸は、Ｌ−アミノ酸である。１文字略語が大文字であるとき、略語は、Ｌ−アミノ酸を指す。１文字略語が小文字であるとき、略語は、Ｄ−アミノ酸を指す。集まりまたは連なりまたはアミノ酸略語を使用して、ペプチドを表す。ペプチドは、Ｎ末端を左側にして示し、配列は、Ｎ末端からＣ末端に向かって記す。

本発明のペプチドは、非天然アミノ酸（すなわち、自然界では発生しない化合物）を含んでおり、当業界で知られているような他のアミノ酸類似体をその代わりとして用いてもよい。
ある特定の非天然アミノ酸は、Deiters et al., J Am Chem Soc 125:11782-11783, 2003、Wang and Schultz, Science 301:964-967, 2003、Wang et al., Science 292:498-500, 2001、Zhang et al., Science 303:371-373, 2004、または米国特許第７，０８３，９７０号に記載の技術によって導入することができる。簡潔に述べると、こうした発現系の一部には、部位特異的突然変異誘発が関与して、本発明のポリペプチドをコードするオープンリーディングフレームに、アンバーＴＡＧなどのナンセンスコドンが導入される。次いで、このような発現ベクターは、導入されたナンセンスコドンに特異的なｔＲＮＡを利用することのできる宿主に導入され、選択された非天然アミノ酸を積み込んでいる。本発明のポリペプチドに諸部分をコンジュゲートさせる目的で有益な特定の非天然アミノ酸として、アセチレン側鎖およびアジド側鎖を有するものが挙げられる。
本発明のペプチド中の天然または天然でないアミノ酸の１つまたは複数は、コンジュゲーション、機能付与、または他の改変などのために、たとえば、炭水化物基、ホスフェート基、ファルネシル基、イソファルネシル基、脂肪酸基、リンカーなどの化学的エンティティを付加して改変してもよい。前記改変は、部位特異的に行っても、または部位特異的でなく行ってもよい。好ましい実施形態では、ペプチドの改変により、より安定したペプチド（たとえば、より長いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を示すもの）が得られる。こうした改変として、追加のＤ−アミノ酸の組み込みなどを挙げることができる。いかなる改変も、ペプチドの所望の生物学的活性の実質的妨げとなるべきでなく、このような改変により、ペプチドに対して、望ましい特性、たとえば、生物学的活性の増強を付与することができる。
前記改変は、本発明のタンパク質の生物学的特性を、野生型タンパク質に比べて強化するだけでなく、場合によっては、たとえば、標識およびタンパク質半減期延長剤用に、また前記変異体を固体支持体の表面に固定する目的で、付着点として役立つ。
ある特定の実施形態では、たとえば、半減期を延長し、または前記ポリペプチドおよび／またはペプチドの生物学的特性を別な形で改善する目的で、このような改変、たとえば、部位特異的な改変を使用して、本発明のポリペプチドおよび／またはペプチドに、コンジュゲート、たとえば、ＰＥＧ基を付着させる。前記技術については、本明細書でさらに記載する。
他の実施形態では、このような改変、たとえば、部位特異的改変を使用して、本発明のポリペプチドの半減期を延長する他のポリマー、小分子、および組換え型タンパク質配列を付着させる。このような一実施形態として、ポリペプチドおよび／またはペプチドに、脂肪酸または特定のアルブミン結合化合物を付着させるものが挙げられる。他の実施形態では、改変は、特定のアミノ酸タイプにおいてなされ、ポリペプチド上の１つまたは複数の部位において付着させることができる。
他の実施形態では、このような改変、たとえば、部位特異的改変を、野生型および／または変異体の多量体、たとえば、二量体（ホモ二量体またはヘテロ二量体）、三量体、または四量体を生成するための付着手段として使用する。こうした多量体タンパク質分子は、アミノ末端またはカルボキシ末端のいずれかにおいて、Ｆｃ、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）などの他のタンパク質に付着または縮合した、ＰＥＧ、糖、および／またはＰＥＧ−コレステロールコンジュゲートなどの基をさらに有する場合もある。
他の実施形態では、このような部位特異的改変を使用して、部位特異的に組み込まれたピロリシンもしくはピロリシン類似体または自然に存在しないアミノ酸（ｐａｒａ−アセチル−Ｐｈｅ、ｐａｒａ−アジド−Ｐｈｅ）の位置により、配向の制御および固体支持体表面へのそのようなタンパク質、ポリペプチドおよび／またはペプチドの付着、またはＰＥＧ、糖、および／もしくはＰＥＧ−コレステロールコンジュゲートなどの基を付着させることが可能になる、タンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチドを生成する。
他の実施形態では、このような部位特異的改変を使用して、タンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチドを部位特異的に架橋し、それによって、限定はしないが、ヘテロ二量体およびヘテロ三量体を始めとするヘテロオリゴマーを生成する。他の実施形態では、このような部位特異的改変を使用して、タンパク質、ポリペプチド、および／またはペプチドを部位特異的に架橋し、それによって、タンパク質−タンパク質コンジュゲート、タンパク質−ポリペプチドコンジュゲート、タンパク質−ペプチドコンジュゲート、ポリペプチド−ポリペプチドコンジュゲート、ポリペプチド−ペプチドコンジュゲート、またはペプチド−ペプチドコンジュゲートを生成する。他の実施形態では、部位特異的な改変として、１種類を越えるタイプの分子が、タンパク質、ポリペプチド、またはペプチドの単一部位において付着するのを可能にする分岐点を挙げることができる。
他の実施形態では、本明細書で列挙する改変は、部位特異的でなく行われ、本発明のタンパク質−タンパク質コンジュゲート、タンパク質−ポリペプチドコンジュゲート、タンパク質−ペプチドコンジュゲート、ポリペプチド−ポリペプチドコンジュゲート、ポリペプチド−ペプチドコンジュゲート、またはペプチド−ペプチドコンジュゲートを得ることができる。
一部の実施形態では、本発明は、本明細書で開示するペプチドまたはポリペプチドを特異的に結合する抗体などの抗体に結合した、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つの少なくとも１種のペプチドまたはポリペプチドを含む複合体を提供する。
当業者なら、本明細書に記載のポリペプチドのいずれかの配列において、その活性を必然的に低下させることなく、種々のアミノ酸置換、たとえば、保存的アミノ酸置換がなされてもよいことは理解されよう。本明細書で使用するとき、「その置換基として一般に使用されるアミノ酸」は、保存的置換（すなわち、化学的特徴が同等であるアミノ酸での置換）を包含する。保存的置換の目的で、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、グリシン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン、およびメチオニンが挙げられる。極性（親水性）天然アミノ酸としては、セリン、トレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン、およびグルタミンが挙げられる。正電荷を有する（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン、およびヒスチジンが挙げられる。負電荷を有する（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸およびグルタミン酸が挙げられる。アミノ酸置換の例としては、その対応するＤ−アミノ酸の代わりにＬ−アミノ酸を用いるもの、ホモシステインもしくは含チオール側鎖を有する他の非天然アミノ酸の代わりにシステインを用いるもの、ホモリシン、ジアミノ酪酸、ジアミノプロピオン酸、オルニチン、もしくは含アミノ側鎖を有する他の非天然アミノ酸の代わりにリシンを用いるもの、またはノルバリンの代わりにアラニンを用いるものなどが挙げられる。
本明細書で使用する用語「アミノ酸」とは、その構造でそうした立体異性体型が可能である場合、すべて、そのＤおよびＬ立体異性体の、自然に存在するアミノ酸、天然でないアミノ酸、アミノ酸類似体、および、自然に存在するアミノ酸と同様にして機能するアミノ酸模倣物を指す。アミノ酸は、本明細書では、その名称、一般に知られているその３文字記号、またはＩＵＰＡＣ−ＩＵＢ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ Ｎｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅ Ｃｏｍｍｉｓｓｉｏｎが推奨する１文字記号のいずれかで呼ぶ。
用語「自然に存在する」とは、自然界で見出され、人の手で操作されていない材料を指す。同様に、「自然に存在しない」や「自然でない」などは、本明細書で使用するとき、自然界で見出されない、または人の手で構造が改変されもしくは合成されている材料を指す。アミノ酸に関連して使用するとき、用語「自然に存在する」とは、２０種の通常のアミノ酸（すなわち、アラニン（ＡまたはＡｌａ）、システイン（ＣまたはＣｙｓ）、アスパラギン酸（ＤまたはＡｓｐ）、グルタミン酸（ＥまたはＧｌｕ）、フェニルアラニン（ＦまたはＰｈｅ）、グリシン（ＧまたはＧｌｙ）、ヒスチジン（ＨまたはＨｉｓ）、イソロイシン（ＩまたはＩｌｅ）、リシン（ＫまたはＬｙｓ）、ロイシン（ＬまたはＬｅｕ）、メチオニン（ＭまたはＭｅｔ）、アスパラギン（ＮまたはＡｓｎ）、プロリン（ＰまたはＰｒｏ）、グルタミン（ＱまたはＧｌｎ）、アルギニン（ＲまたはＡｒｇ）、セリン（ＳまたはＳｅｒ）、トレオニン（ＴまたはＴｈｒ）、バリン（ＶまたはＶａｌ）、トリプトファン（ＷまたはＴｒｐ）、およびチロシン（ＹまたはＴｙｒ）を指す。
本明細書で使用する用語「非天然（non-natural）アミノ酸」および「天然でない（unnatural）アミノ酸」は、同じであろうと異なっていようと、任意の生物中で、任意の生物からの未改変または改変遺伝子を使用して、生合成によって生成することのできないアミノ酸構造を、互換的に表すものである。これら用語は、自然に存在する（野生型）アペリンタンパク質配列または本発明の配列中に存在しないアミノ酸残基を指す。これらの用語は、限定はしないが、２０種の自然に存在するアミノ酸の１つ、セレノシステイン、ピロリシン（Ｐｙｌ）、またはピロリン−カルボキシ−リシン（Ｐｃｌ、たとえば、ＰＣＴ特許公開ＷＯ２０１０／４８５８２に記載のとおり）でない、改変アミノ酸および／またはアミノ酸類似体を包含する。このような非天然アミノ酸残基は、自然に存在するアミノ酸の置換によって、および／または自然に存在する（野生型）アペリンタンパク質配列もしくは本発明の配列への非天然アミノ酸の挿入によって導入することができる。非天然アミノ酸残基は、アペリン分子に所望の機能性、たとえば、機能性部分（たとえば、ＰＥＧ）を連結する能力が付与されるように組み込むこともできる。アミノ酸に関連して使用するとき、記号「Ｕ」は、本明細書で使用される「非天然アミノ酸」および「天然でないアミノ酸」を意味するものとする。
加えて、このような「天然でないアミノ酸」をタンパク質に組み込むのに、改変ｔＲＮＡおよび改変ｔＲＮＡシンセターゼ（ＲＳ）が必要であることも理解される。こうした「選択された」ｔＲＮＡ／ＲＳ直交対は、Ｓｃｈｕｌｔｚらが開発した選定方法によって、またはランダムもしくは標的変異によって生み出される。例として、ピロリン−カルボキシ−リシンは、ある生物から宿主細胞に移された遺伝子によって生合成で生成され、また天然のｔＲＮＡおよびｔＲＮＡシンセターゼ遺伝子を使用してタンパク質に組み込まれるので、「天然アミノ酸」であるが、ｐ−アミノフェニルアラニン（Generation of a bacterium with a 21 amino acid genetic code, Mehl RA, Anderson JC, Santoro SW, Wang L, Martin AB, King DS, Horn DM, Schultz PG. J Am Chem Soc. 2003 Jan 29;125(4):935-9を参照されたい）は、生合成で生成されるとはいえ、「選択された」ｔＲＮＡ／ｔＲＮＡシンセターゼ直交対によってタンパク質に組み込まれるので、「天然でないアミノ酸」である。
改変コードアミノ酸としては、限定はしないが、ヒドロキシプロリン、γ−カルボキシグルタメート、Ｏ−ホスホセリン、アゼチジンカルボン酸、２−アミノアジピン酸、３−アミノアジピン酸、ｂｅｔａ−アラニン、アミノプロピオン酸、２−アミノ酪酸、４−アミノ酪酸、６−アミノカプロン酸、２−アミノヘプタン酸、２−アミノイソ酪酸、３−アミノイソ酪酸、２−アミノピメリン酸、第三級−ブチルグリシン、２，４−ジアミノイソ酪酸、デスモシン、２，２’−ジアミノピメリン酸、２，３−ジアミノプロプリオン酸、Ｎ−エチルグリシン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−エチルアスパラギン、ホモプロリン、ヒドロキシリシン、ａｌｌｏ−ヒドロキシリシン、３−ヒドロキシプロリン、４−ヒドロキシプロリン、イソデスモシン、ａｌｌｏ−イソロイシン、Ｎ−メチルアラニン、Ｎ−メチルグリシン、Ｎ−メチルイソロイシン、Ｎ−メチルペンチルグリシン、Ｎ−メチルバリン、ナフチルアラニン、ノルバリン、ノルロイシン、オルニチン、ペンチルグリシン、ピペコリン酸およびチオプロリンが挙げられる。用語「アミノ酸」は、ある特定の生物における代謝産物であるが、タンパク質への組み込みについては遺伝暗号によってコードされていない、自然に存在するアミノ酸も包含する。このようなアミノ酸として、限定はしないが、オルニチン、Ｄ−オルニチン、およびＤ−アルギニンが挙げられる。
本明細書で使用する用語「アミノ酸類似体」とは、自然に存在するアミノ酸と同じ基礎化学構造、すなわち、単なる例として、水素、カルボキシル基、アミノ基、およびＲ基に結合したα−炭素を有する化合物を指す。アミノ酸類似体には、可逆的もしくは不可逆的に化学的ブロックがなされ、またはそのＣ末端カルボキシ基、そのＮ末端アミノ基、および／もしくはその側鎖官能基が化学的に改変されている、天然および天然でないアミノ酸が含まれる。そのような類似体として、限定はしないが、メチオニンスルホキシド、メチオニンスルホン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システイン、Ｓ−（カルボキシメチル）−システインスルホキシド、Ｓ−（カルボキシメチル）−システインスルホン、アスパラギン酸−（β−メチルエステル）、Ｎ−エチルグリシン、アラニンカルボキサミド、ホモセリン、ノルロイシン、およびメチオニンメチルスルホニウムが挙げられる。
Ｎａｌは、１−ナフチルアラニンと２−ナフチルアラニンの両方、好ましくは２−ナフチルアラニンを指す。
本明細書で使用するとき、用語「アミド」とは、Ｃ末端におけるカルボン酸基のアミド誘導体（たとえば、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ２、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ１〜６アルキル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−Ｃ１〜２アルキルフェニル、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−ＮＨＢｎ、−Ｃ（Ｏ）−４フェノキシピペリジン、または−Ｃ（Ｏ）Ｎ（Ｃ１〜６アルキル）２）を指す。
用語「アミド」は、Ｎ末端におけるアミノ基の誘導体（たとえば、−ＮＨＣ（Ｏ）Ｃ１〜１６アルキル、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）ｎＰｈ（ｎは、１〜６の整数である）、−ＮＨＣ（Ｏ）（ＣＨ２）２ＣＯ２Ｈ、４−Ｃｌ−Ｐｈ−（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、Ｃ１１Ｈ２３Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、Ｃ１３Ｈ２７Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−、Ｃ１５Ｈ２７Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−、Ｐｈ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−ＮＨ−、またはＣＨ３（ＯＣＨ２ＣＨ２）ｍＣ（Ｏ）ＮＨ−（ｍは、１〜１２の整数である）も指す。
本明細書で使用するとき、用語「エステル」とは、Ｃ末端におけるカルボン酸基のエステル誘導体（たとえば、−ＣＯＯＲ）形態を指し、エステルのＲは、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチルなどのＣ１〜６アルキル基、シクロペンチルやシクロヘキシルなどのＣ３〜８シクロアルキル基、フェニルやα−ナフチルなどのＣ６〜１０アリール基、Ｃ６〜１０アリール−Ｃ１〜６アルキル基、たとえば、ベンジル、フェネチル、ベンズヒドリルなどのフェニル−Ｃ１〜２アルキル基、およびα−ナフチルメチルなどのα−ナフチル−Ｃ１〜２アルキル基などを指す。経口投与用のエステルとして一般に使用されるピバロイルオキシメチルエステルなども挙げることができる。本発明のポリペプチドが、Ｃ末端以外の位置に追加のカルボキシル基またはカルボキシレート基を有するとき、こうした基がアミド化またはエステル化されているポリペプチドも、本発明のポリペプチドの範疇に入る。そうした場合において、エステルは、たとえば、上述のＣ末端エステルと同じ種類のエステルでよい。
用語アルキルとは、１〜２０個の炭素原子を含む完全不飽和の分枝状または非分枝状（または直鎖状もしくは線状）炭化水素部分を指す。アルキルは、１〜７個の炭素原子、より好ましくは１〜４個の炭素原子を含むことが好ましい。
用語アリールとは、環部分に６〜１０個の炭素原子を有する、単環式または二環式の芳香族炭化水素基を指す。アリールの代表例は、フェニルまたはナフチルである。
用語ヘテロアリールは、炭素原子および１〜５個のヘテロ原子から選択される５〜１０の環員を含んでおり、各ヘテロ原子は、Ｏ、ＮまたはＳから独立して選択され、ＳおよびＮは、種々の酸化状態に酸化されていてもよい、単環式または二環式ヘテロアリールを包含する。二環式ヘテロアリール系について、系は、完全に芳香族である（すなわち、すべての環が芳香族である）。
用語シクロアルキルとは、３〜１２個の炭素原子、好ましくは３〜８個、または３〜７個の炭素原子の、飽和または不飽和であるが非芳香族の単環式、二環式、または三環式炭化水素基を指す。二環式および三環式シクロアルキル系については、すべての環が非芳香族である。
用語ヘテロシクリルとは、４−、５−、６−、または７員の単環式であり、Ｏ、ＳおよびＮから選択される少なくとも１個のヘテロ原子を含んでおり、ＮおよびＳは、種々の酸化状態に場合により酸化されていてもよい、飽和または不飽和非芳香族（部分的不飽和）環を指す。一実施形態では、ヘテロシクリル部分は、５〜７個の環原子を含んでおり、Ｏ、ＳまたはＮから選択されるさらなるヘテロ原子も場合により含んでいる、飽和単環を表す。
用語「ＡＰＪ」（「アペリン受容体」、「アンジオテンシン様１受容体」、「アンジオテンシンＩＩ様１受容体」などとも呼ばれる）とは、３８０残基、７回膜貫通ドメインのＧｉ共役型受容体を指し、その遺伝子は、ヒトの１１番染色体の長腕上に位置する（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５１５２．１、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿００５１６１によってコードされる）。ＡＰＪは、１９９３年に、変性オリゴヌクレオチドプライマーを使用して、ヒトゲノムＤＮＡから初めてクローン化され（O’Dowd et al. Gene, 136:355-60、1993）、１型アンジオテンシンＩＩ受容体と有意に相同的である。しかし、この相同性にもかかわらず、アンジオテンシンＩＩは、ＡＰＪを結合しない。この内因性リガンドは、長年の間オーファンであったが、単離され、アペリンと命名された（Tatemoto et al., Biochem Biophys Res Commun 251, 471-6 (1998)）。
用語「アペリン」は、７７残基のプレタンパク質（ＮＣＢＩ参照配列：ＮＰ＿００５９１０９．３、ＮＣＢＩ参照配列：ＮＭ＿０１７４１３．３によってコードされる）を指し、これがプロセシングを受けて、生物学的活性型のアペリンペプチド、たとえば、アペリン−３６、アペリン−１７、アペリン−１６、アペリン−１３、アペリン−１２になる。「アペリン−３６」と呼ばれる全長成熟ペプチドは、３６アミノ酸を含むが、最も強力なアイソフォームは、「Ｐｙｒ−１−アペリン−１３またはＰｙｒ１−アペリン−１３」と呼ばれる、ピログルタミン酸化型のアペリン１３量体（アペリン−１３）である。種々のアペリン型は、たとえば、米国特許６，４９２，３２４Ｂ１に記載されている。
用語「コンジュゲート」と「バイオコンジュゲート」は、互換的に使用され、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドと半減期延長性部分とが、場合によりリンカーを介して共有結合によって付着した結果として生成したエンティティを指すものである。用語「コンジュゲート」または「バイオコンジュゲート」はまた、ＡＰＪアゴニストポリペプチドまたは式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩもしくはＩＶのポリペプチドと半減期延長性部分とが融合した結果として生成したエンティティも包含するものである。
用語半減期延長性部分は、ペプチドまたはポリペプチド類似体に、共有結合によって連結／付着または融合していてよい。半減期延長性部分は、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー、脂肪酸、コレステロール基、炭水化物、もしくはオリゴ糖、またはサルベージ受容体に結合するいずれかの天然もしくは合成タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドでよい。他の実施形態では、半減期延長性部分は、アルブミン結合性残基である。本明細書で使用する「アルブミン結合性残基」とは、ヒト血清アルブミンに、非共有結合的に結合する残基を意味する。一実施形態では、アルブミン結合性残基は、親油性残基である。別の実施形態では、アルブミン結合性残基は、生理的ｐＨで負電荷を有する。アルブミン結合性残基は、通常、負電荷を有しうるカルボン酸を含む。アルブミン結合性残基の例としては、脂肪酸が挙げられる。他の実施形態では、半減期延長性部分は、血清半減期の長い血漿タンパク質（アルブミンおよび免疫グロブリン）に、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結する。たとえば、半減期延長性部分は、ＩｇＧ定常ドメインもしくはその断片（たとえば、Ｆｃ領域）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはアルブミン結合性ポリペプチドもしくは残基（たとえば脂肪酸）である。バイオコンジュゲートの半減期延長性部分の部分は、Ｆｃ領域であることが最も好ましい。
用語「半減期の延長」または「血清半減期を延長する」または「半減期を延長すること」とは、改変された生物学的活性分子（たとえば、アペリン１３）の、その非改変型（または裸の形態のペプチド）と比べた、循環半減期の肯定的な変化の意味である。血清半減期は、生物学的活性分子が投与された後の様々な時点で血液サンプルを採取し、各サンプル中のその分子の濃度を求めることにより測定される。血清濃度の変化を経時的に測定することで、改変された分子（たとえば、コンジュゲートした分子）の血清半減期の算出が可能になる。改変された分子（たとえば、コンジュゲートした分子）の血清半減期を、非改変分子（たとえば、アペリン１３）と比較することにより、血清半減期またはｔ１／２の相対的な延長を明らかにすることができる。延長は、少なくとも２倍であることが望ましいが、より短い延長も有用となり得る。
本発明のポリペプチド：
本発明の種々の実施形態を本明細書に記載する。各実施形態において明記する特色を、明記された他の特色と組み合わせて、別の実施形態としてもよいことは、認識されるであろう。
したがって、実施形態１において、本発明は、ペプチドまたはポリペプチド式（Ｉ）：
［式中、
Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、存在しない、Ｑ、Ａ、もしくはｐＥのいずれかであり、またはＸ１は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、Ｄ−ｈＣから選択され；ここで、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖は、Ｘ７の側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ３は、Ｐであり、またはＸ３は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、およびＤ−ｈＣから選択され；ここで、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖は、Ｘ７の側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ４は、Ｒであり、またはＸ４は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、およびＤ−ｈＣから選択され；ここで、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖は、Ｘ７の側鎖とジスルフィド結合を形成し、
ここで、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４の１つだけは、Ｃ、ｃ、ｈＣ、およびＤ−ｈＣから選択される含硫アミノ酸であり、
Ｘ７は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり；かつ、Ｘ７の側鎖は、Ｘ１、Ｘ３、またはＸ４いずれかのＣ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ８は、ＫまたはＦであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ａ、もしくはａであり、または存在せず、
Ｘ１０は、Ｐであり、または存在せず、
Ｘ１１は、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍ、またはｆであり、かつ、
Ｘ１２は、存在しない、またはＰ、ｆ、ａ、Ｄ−Ｎｖａ、もしくはＤ−Ａｂｕであり、
Ｘ１３は、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、または（Ｎ−Ｍｅ）Ｆ、Ｆ、ｆ、ａ、ｙ、およびＮａｌから選択され；ここで、
Ｎｌｅは、Ｌ−ノルロイシンであり、
Ｄ−Ｎｌｅは、Ｄ−ノルロイシンであり、
Ｄ−ｈＣは、Ｄ−ホモシステインであり、
ｈＣは、Ｌ−ホモシステインであり、
Ｎａｌは、Ｌ−ナファタリン（L-naphathaline）であり、
Ｄ−Ｎｖａは、Ｄ−ノルバリンであり、
Ｄ−Ａｂｕは、Ｄ−２−アミノ酪酸であり、
ｐＥは、Ｌ−ピログルタミン酸である］
またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩、またはこれらと実質的に同等なポリペプチドを提供する。
したがって、実施形態２において、本発明は、式（ＩＩ）のペプチドまたはポリペプチド：
［式中、
Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、存在しない、Ｑ、Ａ、またはｐＥのいずれかであり、
Ｘ４は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり、
Ｘ７は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり；かつ、Ｘ７の側鎖は、Ｘ４の側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ８は、ＫまたはＦであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ａ、ａであり、または存在せず、
Ｘ１０は、Ｐであり、または存在せず、
Ｘ１１は、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｍ、Ｎｌｅ、またはｆであり、かつ、
Ｘ１２は、存在しないか、またはＰ、ｆ、ａ、Ｄ−Ｎｖａ、およびＤ−Ａｂｕから選択され、
Ｘ１３は、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、またはＦ、（Ｎ−Ｍｅ）Ｆ、ｆ、ａ、ｙ、およびＮａｌから選択される］
またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩、またはこれらと実質的に同等なポリペプチドを提供する。
したがって、実施形態２Ａにおいて、本発明は、式（ＩＩ）のペプチドまたはポリペプチド：
［式中、
Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、存在しないまたはｐＥのいずれかであり、
Ｘ４は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり、
Ｘ７は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり；かつ、Ｘ７の側鎖は、Ｘ４の側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ８は、ＫまたはＦであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ａ、ａであり、または存在せず、
Ｘ１０は、Ｐであり、または存在せず、
Ｘ１１は、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｎｌｅ、またはｆであり、かつ、
Ｘ１２は、存在しないか、またはＰ、ｆ、ａ、Ｄ−Ｎｖａ、およびＤ−Ａｂｕから選択され、
Ｘ１３は、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、またはＦ、（Ｎ−Ｍｅ）Ｆ、ｆ、ａ、ｙ、およびＮａｌから選択される］
またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩、またはこれらと実質的に同等なポリペプチドを提供する。
したがって、実施形態３において、本発明は、式ＩＩＩのペプチドまたはポリペプチド：
［式中、
Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、Ｃ、ｃ、ｈＣ、およびＤ−ｈＣから選択され、
Ｘ７は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり；ここで、Ｘ７の側鎖は、Ｘ１の側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ８は、ＫまたはＦであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ａ、ａであり、または存在せず、
Ｘ１０は、Ｐであり、または存在せず、
Ｘ１１は、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍ、またはｆであり、かつ、
Ｘ１２は、存在しないか、またはＰ、ｆ、ａ、Ｄ−Ｎｖａ、およびＤ−Ａｂｕから選択され、
Ｘ１３は、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、または（Ｎ−Ｍｅ）Ｆ、Ｆ、ｆ、ａ、ｙ、およびＮａｌから選択される］
またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩を提供する。
実施形態３Ａにおいて、本発明は、Ｘ１１が、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｎｌｅ、またはｆである式ＩＩＩのポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩に関する。
したがって、実施形態４において、本発明は、式ＩＶのペプチドまたはポリペプチド：
［式中、
Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、存在しない、Ｑ、Ａ、またはｐＥのいずれかであり、
Ｘ３は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり；Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖（wherein the side chain of C, c, hC or D-hC）、
Ｘ７は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり；かつ、Ｘ７の側鎖は、Ｘ３のＣ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ８は、ＫまたはＦであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ａ、ａであり、または存在せず、
Ｘ１０は、Ｐであり、または存在せず、
Ｘ１１は、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍ、またはｆであり、かつ、
Ｘ１２は、存在しないか、またはＰ、ｆ、ａ、Ｄ−Ｎｖａ、およびＤ−Ａｂｕから選択され、
Ｘ１３は、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、または（Ｎ−Ｍｅ）Ｆ、Ｆ、ｆ、ａ、ｙ、およびＮａｌから選択される］
またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩を提供する。
したがって、実施形態４Ａにおいて、本発明は、式ＩＶのペプチドまたはポリペプチド：
［式中、
Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、存在しないまたはｐＥのいずれかであり、
Ｘ３は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり；Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖、
Ｘ７は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり；かつ、Ｘ７の側鎖は、Ｘ３のＣ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ８は、ＫまたはＦであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ａ、ａであり、または存在せず、
Ｘ１０は、Ｐであり、または存在せず、
Ｘ１１は、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｎｌｅ、またはｆであり、かつ、
Ｘ１２は、存在しないか、またはＰ、ｆ、ａ、Ｄ−Ｎｖａ、およびＤ−Ａｂｕから選択され、
Ｘ１３は、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、または（Ｎ−Ｍｅ）Ｆ、Ｆ、ｆ、ａ、ｙ、およびＮａｌから選択される］
またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩を提供する。
実施形態５において、本発明は、Ｘ１がｐＥである、実施形態１、２、および４のいずれか１つに従うポリペプチド、またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩に関する。
実施形態５Ａにおいて、本発明は、Ｘ１がＡまたはＱである、実施形態１、２、および４のいずれか１つに従うポリペプチド、またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩に関する。この実施形態の特定の態様では、ペプチドは、半減期延長性部分に、そのＡまたはＱ Ｎ末端を介して、化学的に連結または融合する。
実施形態６において、本発明は、Ｘ１が存在しない、実施形態１、２、４、および４Ａのいずれか１つに従うポリペプチド、またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩に関する。
実施形態７において、本発明は、Ｎ末端がアミドである、実施形態１〜４および６のいずれか１つに従うポリペプチド、またはこのポリペプチドの塩に関する。
実施形態８において、本発明は、Ｎ末端が、式−ＮＨＲのアミドであり、Ｒが、アセチル、ベンゾイル、フェナシル、スクシニル、オクタノイル、４−フェニルブタノイル、４−Ｃｌ−Ｐｈ−（ＣＨ２）３Ｃ（Ｏ）−、またはＰｈ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−である、実施形態７に従うポリペプチド、またはこのポリペプチドの塩に関する。
実施形態８Ａにおいて、本発明は、Ｎ末端が、式ＮＨＲ１のアミドであり、Ｒ１がＣＨ３Ｃ（Ｏ）−、ＣＨ３−（Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２）ｍ−Ｃ（Ｏ）−、パルミトイル（Ｏ２Ｏｃ）ｐ、ミリストイル（Ｏ２Ｏｃ）ｐ、ラウロイル（Ｏ２Ｏｃ）ｐ、またはＰｈ−ＣＨ２ＣＨ２ＮＨＣ（Ｏ）−であり；ここで、
ｐは、１〜４の整数であり、
ｍは、１〜１２の整数であり、
ラウロイル（Ｏ２Ｏｃ）は、Ｃ１１Ｈ２３Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−であり、
ミリストイル（Ｏ２Ｏｃ）は、Ｃ１３Ｈ２７Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−であり、
パルミトイル（Ｏ２Ｏｃ）は、Ｃ１５Ｈ３１Ｃ（Ｏ）ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｏ−（ＣＨ２）２−Ｏ−ＣＨ２−Ｃ（Ｏ）−である、実施形態１〜４および７のいずれか１つに従うポリペプチドまたはこのポリペプチドの塩に関する。Ｎ末端アミドの例は、参照により本明細書に援用される、２０１２年１月２７日出願の米国仮出願第６１／５９１，５５７号（代理人整理番号ＰＡＴ０５４９６１−ＵＳ−ＰＳＰ）に記載されている。
実施形態９において、本発明は、Ｘ１３がＦまたはｆである、実施形態１〜８Ａのいずれか１つに従うポリペプチド、またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩に関する。
実施形態１０において、本発明は、Ｘ１３が存在しない、実施形態１〜８Ａのいずれか１つに従うポリペプチド、またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩に関する。
実施形態１１において、本発明は、Ｘ１２が存在しない、実施形態１〜１０のいずれか１つに従うポリペプチド、またはこのポリペプチドのアミド、およびエステル、もしくは塩に関する。
実施形態１２において、本発明は、Ｃ末端がアミドである、実施形態１〜１１のいずれか１つに従うポリペプチド、またはこのポリペプチドの塩に関する。
実施形態１３において、本発明は、Ｃ末端が、式−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２のアミドであり、Ｒ２が、−ＮＨ２、−ＮＨ−Ｍｅ、−ＮＨ−ＮＨＢｎ、−Ｎ（ＣＨ３）−（ＣＨ２）２−Ｐｈ、または−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｐｈである、実施形態１２に従うポリペプチドまたはこのポリペプチドの塩に関する。
実施形態１４において、本発明は、Ｘ８がＫである、実施形態１〜１３のいずれか１つに従うポリペプチド、またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩に関する。
実施形態１５において、本発明は、Ｘ９がＧである、実施形態１〜１４のいずれか１つに従うポリペプチド、またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩に関する。
実施形態１６において、本発明は、Ｘ１０がＰである、実施形態１〜１５のいずれか１つに従うポリペプチド、またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩に関する。
１９．
実施形態１７において、本発明は、Ｘ１１がＮｌｅまたはＤ−Ｎｌｅである、請求項１から１６のいずれか一項に従うポリペプチド、またはこのポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩に関する。
実施形態１７Ａにおいて、本発明は、Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３部分からなるＣ末端が、Ｎｌｅ−Ｐ−フェネチルアミン、Ｎｌｅ−Ｐ−（Ｎ−Ｍｅ）Ｆ、Ｎｌｅ−Ｐ−ＮＨ２、Ｎｌｅ−フェネチルアミン、（Ｄ−Ｎｌｅ）−フェネチルアミン、Ｎｌｅ−Ｐ−ｆ、Ｄ−Ｎｌｅ−ａ−ｆ、（Ｄ−Ｎｌｅ）−ＮＨ２、（Ｄ−Ｎｌｅ）−ｆ、（Ｄ−Ｎｌｅ）−ａ−ｄ、（Ｄ−Ｎｌｅ）−ａ−ｙ、（Ｄ−Ｎｌｅ）−（Ｄ−Ｎｖａ）−ｆ、Ｎｌｅ−Ｐ−Ｆ、Ｎｌｅ−Ｐ−ａ、Ｎｌｅ−Ｐ−ＮａＩ、および（Ｄ−Ｎｌｅ）−（Ｄ−Ａｂｕ）−ｆから選択される、実施形態１〜１７のいずれか１つに従うポリペプチドまたはこのポリペプチドの塩に関する。この実施形態の特定の一態様では、本発明は、Ｘ１１−Ｘ１２−Ｘ１３部分からなるＣ末端が、（Ｄ−Ｎｌｅ）−フェネチルアミン、（Ｄ−Ｎｌｅ）−ａ−ｆ、およびｆ−ａ−ｆから選択される、実施形態１７Ａに従うポリペプチドまたはこのポリペプチドの塩に関する。
一実施形態１７Ｂにおいて、本発明は、アミノ酸Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ７〜Ｘ１３の少なくとも２つが、Ｐｙｒ−１−アペリン−１３に存在する対応するアミノ酸と異なる、実施形態１〜１７のいずれか１つのペプチドまたはポリペプチドに関する。別の実施形態において、本発明は、アミノ酸Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ７〜Ｘ１３の少なくとも３つが、Ｐｙｒ−１−アペリン−１３に存在する対応するアミノ酸と異なる、実施形態１〜１８のいずれか１つのペプチドまたはポリペプチドに関する。さらに別の実施形態において、本発明は、アミノ酸Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ７〜Ｘ１３の少なくとも４つが、Ｐｙｒ−１−アペリン−１３に存在する対応するアミノ酸と異なる、実施形態１〜１８のいずれか１つのペプチドまたはポリペプチドに関する。
別の実施形態において、Ｘ１、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ７〜Ｘ１３アミノ酸は、以下の実施例の部におけるＸ１、Ｘ３、Ｘ４、およびＸ７〜Ｘ１３アミノ酸によって規定されるものである。
別の実施形態において、本発明による個々のポリペプチドは、以下の実施例の部において挙げるもの、またはそれらの薬学的に許容される塩である。
別段指定しない限り、用語「本発明のポリペプチド」とは、式（Ｉ）およびその下位式（式ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ）のポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩を指す。
別段指定しない限り、用語「本発明のポリペプチド」、「本発明のペプチド」、「アペリンペプチドアゴニスト」などは、式Ｉおよびその下位式（式ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶ）のペプチドおよびポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩を指す。本発明のペプチドおよびポリペプチドは、限定はしないが、野生型アペリン、アペリン−１３、およびｐｙｒ−１−アペリン−１３を含めた、本明細書に記載の既知のアペリンペプチドおよびポリペプチドと比べて、実質的に同等または改善された活性および／または血漿安定性を示す。
本発明のペプチドおよびポリペプチドは、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのいずれか１つに従うペプチドおよびポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩、ならびに、限定はしないが実験実施例を含めた、本明細書において詳細に列挙するいずれかのペプチドまたはポリペプチドに対する同一性が少なくとも約９５％であるペプチドおよびポリペプチドも包含する。
本明細書で使用するとき、語句「相同アミノ酸配列」またはその変形形態は、アミノ酸レベルでの相同性が少なくとも指定されたパーセンテージであることを特徴とする配列を指し、「配列同一性」と互換的に使用する。相同アミノ酸配列には、保存的アミノ酸置換を含み、かつ、そのポリペプチドが、同じ結合および／または活性を有する、アミノ酸配列が含まれる。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、比較配列との同一性が、９９％までの少なくとも６０％以上であれば、相同である。一部の実施形態では、アミノ酸配列は、比較配列と、６０までの１以上のアミノ酸置換、付加、または欠失が共通していれば、相同である。一部の実施形態では、相同アミノ酸配列は、５以下または３以下の保存的アミノ酸置換を有する。
相同性は、ポリペプチドレベルでもよい。本発明のペプチドもしくはポリペプチドまたはその一部分と、異なるアミノ酸配列との同一性の程度またはパーセンテージは、２つの配列の配列比較（アラインメント（alignment））における正確な一致の数を、「発明配列」または「外来配列」のいずれか短い方の長さで割ったものとして算出される。結果は、同一性パーセントとして示す。
詳細な実施例に記載するアミノ酸配列との相同性が約８０〜９９．９％、好ましくは９０〜９９．９％であり、アペリン−１３またはｐｙｒ−１−アペリン−１３を凌ぐ血漿安定性を有するアミノ酸配列を含むポリペプチドは、本発明のポリペプチドの範疇に入る。一実施形態では、血漿安定性の改善は、少なくとも２倍である。一実施形態では、本発明のポリペプチドは、血漿安定性が少なくとも３０分である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドは、血漿安定性が少なくとも６０分、または少なくとも８０分、好ましくは少なくとも１００分、より好ましくは少なくとも１５０分である。
用語「実質的に同等」とは、受容体結合活性やシグナル伝達活性などの性質が同等であることを意味する。したがって、受容体結合活性の強度やポリペプチドの分子量などの度合いに差が存在しても差し支えない。
本明細書に記載のポリペプチド、または１または複数のアミノ酸の置換、欠失、付加、もしくは挿入によるその実質的同等物は、上の意味でのアミノ酸配列実質的同等物（複数可）を含むポリペプチドとして挙げることができる。本明細書に記載のポリペプチド、または１〜５、好ましくは１〜３、より好ましくは１もしくは２アミノ酸の天然もしくは天然でないアミノ酸での置換によるその実質的同等物は、上の意味でのアミノ酸配列実質的同等物（複数可）を含むポリペプチドとして挙げることができる。さらなる改変および変更として、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩまたはＩＶのペプチドまたはポリペプチドのアペリンアゴニスト活性が維持され、血漿安定性がピログルタミン酸化型（pyroglutamated form）のアペリン−１３より改善されている限り、Ｌ−アミノ酸のＤ−アミノ酸での置き換え、または、限定はしないが、リン酸化、カルボキシル化、アルキル化などを含めた他の変形形態を挙げることができる。
実施形態１９において、本発明はさらに、
ａ． 前述の実施形態のいずれかに従う、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、もしくはＩＶのペプチドもしくはポリペプチド、そのアミド、塩、またはエステル、
ｂ． 半減期延長性部分
を含み、
前記ペプチドまたはポリペプチドと、前記半減期延長性部分とは、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合する、
バイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。
実施形態１９Ａにおいて、半減期延長性部分は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶのペプチドのＮ末端に、場合によりリンカー部分を介して、付着する。
実施形態１９Ｂにおいて、半減期延長性部分は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶのペプチドのＣ末端に、場合によりリンカー部分を介して、共有結合によって連結または融合する。
実施形態１９Ｃにおいて、半減期延長性部分は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶのペプチドの側鎖に、共有結合によって連結または融合する、たとえば、半減期（half-life）は、Ｋ、Ｏｒｎ、Ｄａｂ、Ｄａｐ、ｈＫ、または４−アミノ−ｌｓｎの側鎖にあるアミノ基に、場合によりリンカー部分を介して、共有結合によって連結または融合する。半減期延長性部分は、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶのペプチドのＮ末端に、場合によりリンカー部分を介して付着することが好ましい。
実施形態２０において、本発明は、半減期延長性部分が、ＩｇＧ定常ドメインもしくはその断片、脂肪酸、またはヒト血清アルブミンである、実施形態１９に従うバイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。
実施形態２１において、本発明は、半減期延長性部分が、ＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）を有するＦｃＬＡＬＡ改変Ｆｃ断片である、実施形態１９または２０に従うバイオコンジュゲートに関する。
実施形態２２において、本発明は、半減期延長性部分が、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶのポリペプチドに、リンカーを介して、融合または共有結合によって連結するＦｃドメインであり、このリンカーは、次式：−［ＧＧＧＧＳ］ｎ−を有し、ｎは、１、２もしくは３であり、またはこのリンカーは、ＧＧもしくはＧＳであり、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶのポリペプチドは、自然に存在するアミノ酸を含む、実施形態２１に従うバイオコンジュゲートに関する。
実施形態２３において、本発明は、ポリペプチドが、ＱＲＰＣ＊ＬＳＣ＊ＫＧＰＭＰＦ、Ｃ＊ＲＰＲＬＳＣ＊ＫＧＰＭＰＦ、およびＱＲＣ＊ＲＬＳＣ＊ＫＧＰＭＰＦ（「＊」で印を付けた２つのアミノ酸は、その側鎖を介してジスルフィド結合またはアミド結合を形成しているアミノ酸を表す）から選択される式Ｉのポリペプチドである、実施形態２２に従うバイオコンジュゲートに関する。
実施形態２３Ａにおいて、本発明は、半減期延長性部分が、Ｃ末端リシンが欠失している、またはアラニンで置き換えられている改変Ｆｃドメインである、実施形態２２または２３に従うバイオコンジュゲートに関する。このようなＦｃ変異体は、同時出願の出願（米国仮出願第６２／０１５８４８号：代理人整理番号ＰＡＴ０５５７８１−ＵＳ−ＰＳＰ０２）に記載されており、アペリンペプチド／ポリペプチドと、より安定した融合タンパク質を生じている。
実施形態２４において、本発明は、半減期延長性部分がヒト血清アルブミンである、実施形態１９または２０に従うバイオコンジュゲートまたはその多量体に関する。
実施形態２５において、本発明は、ヒト血清アルブミンが、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドのＮ末端に、次式のリンカー：
［式中、ｘは、１〜２０であり、Ｒは、線状もしくは分枝状アルキレン、シクロアルキル、ヘテロアリールのアリール（aryl of heteroaryl）、またはこれらの組合せであり、Ｒ’は、線状または分枝状アルキレン、アリール、もしくはシクロアルキル、またはこれらの組合せである］
を介して化学的に連結する、実施形態２４に従うバイオコンジュゲートに関する。
実施形態２６において、本発明は、ヒト血清アルブミンが、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドのＣ末端に、次式のリンカー：
［式中、ｘは、１〜２０であり、Ｒは、線状または分枝状アルキレン、シクロアルキル、ヘテロアリールのアリール、またはこれらの組合せであり、Ｒ’は、線状または分枝状アルキレン、アリール、もしくはシクロアルキル、またはこれらの組合せである］
を介して、化学的に連結する、実施形態１９または２０に従うバイオコンジュゲートに関する。
他の実施形態では、本発明のバイオコンジュゲートは、次式を有する。
式中、ペプチドは、ペプチドのＮ末端であり、Ａは、アラニンであり、Ｈは、ヒスチジンであり、ｎは、１、２または３であり、ｍは、０または１であり、ＬおよびＬ２は、リンカーであり、Ｃ１は、フッ素で場合により置換されている単環式、二環式、または三環式の炭素環系またはヘテロ環系であり、Ｌ１は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレンリンカーであり、ここで、アルキレン鎖は、オキソ（＝Ｏ）で場合により置換されており、１個または複数の炭素は、ＯまたはＮＨで置き換えられている。この実施形態の特定の態様では、ＬおよびＬ２は、ＰＥＧリンカーである。
半減期延長性部分
本発明の半減期延長性部分は、ペプチドまたはポリペプチド類似体に共有結合によって付着、連結、コンジュゲートまたは融合していてよい。半減期延長性部分は、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などのポリマー、脂肪酸、コレステロール基、炭水化物、もしくはオリゴ糖、またはサルベージ受容体に結合するいずれかの天然もしくは合成タンパク質、ポリペプチド、もしくはペプチドでよい。半減期延長性部分は、血清半減期の長い血漿タンパク質（アルブミンおよび免疫グロブリン）に、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結することが好ましい。たとえば、半減期延長性部分は、ＩｇＧ定常ドメインもしくはその断片（たとえば、Ｆｃ領域）、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ）、またはアルブミン結合性ポリペプチドもしくは残基（たとえば脂肪酸）である。バイオコンジュゲートの半減期延長性部分の部分は、ヒト血清アルブミン、脂肪酸またはＦｃ領域であることが好ましい。
半減期延長性部分は、分子量が、出所の種に応じて、その単量体の形で、およそ６５〜６７キロダルトンの間である、血漿において最も豊富なタンパク質を指す、アルブミンを包含する。用語「アルブミン」は、「血清アルブミン」と互換的に使用され、本発明の改変ペプチドとコンジュゲートを形成するアルブミンの供給源を定義することにはならない。したがって、本明細書で使用する用語「アルブミン」は、血液や漿液などの自然供給源から精製されたアルブミンを指すこともあり、または化学合成もしくは組換え生成されたアルブミンを指すこともある。本発明の改変ペプチドまたはポリペプチドは、アルブミン表面上のシステイン−３４の遊離チオール基に、場合によりリンカーを介して、つながれることが優先される。
半減期延長性部分は、それぞれが、少なくとも１つのカルボン酸（たとえば、１、２、３または４つのＣＯ２Ｈ）で置換され、ヒドロキシル基で場合によりさらに置換されている、Ｃ６〜７０アルキル、Ｃ６〜７０アルケニル、またはＣ６〜７０アルキニル鎖であると定義することのできる、脂肪酸を包含する。脂肪酸の例は、式Ａ１、Ａ２、およびＡ３：
［Ｒ２は、ＣＯ２Ｈ、Ｈであり、
Ｒ３、Ｒ４、およびＲ５は、互いに独立して、Ｈ、ＯＨ、ＣＯ２Ｈ、−ＣＨ＝ＣＨ２、または−Ｃ≡ＣＨであり、
Ａｋ１は、分枝状Ｃ６〜Ｃ３０アルキレンであり、
ｑ、ｒ、およびｐは、互いに独立して、６〜３０の間の整数である］またはこれらのアミド、エステル、もしくは薬学的に許容される塩］によって規定される。
脂肪酸の例は、
［式中、Ａｋ２、Ａｋ３、Ａｋ４、Ａｋ５、およびＡｋ６は、独立して、（Ｃ８〜２０）アルキレンであり、Ｒ６およびＲ７は、独立して、（Ｃ８〜２０）アルキルである］から選択される。
より詳細には、脂肪酸は、
から選択される。
これらの脂肪酸部分は、同時出願の出願である米国仮出願第６２／０１５８６２号代理人整理番号ＰＡＴ０５６２７４−ＵＳ−ＰＳＰに記載されている。
半減期延長性部分は、単量体の形であろうと多量体の形であろうと、全抗体の消化によって得られる、または他の手段によって生成された、非抗原結合性断片の配列を含む分子または配列を指す、「未変性Ｆｃ」を包含し、ヒンジ領域を含んでいてもよい。未変性Ｆｃのもともとの免疫グロブリン供給源は、ヒト起源であることが好ましく、免疫グロブリンのいずれでもよいが、ＩｇＧ１およびＩｇＧ２が好ましい。未変性Ｆｃ分子は、共有結合性（すなわち、ジスルフィド結合）および非共有結合性の連係によって、二量体または多量体の形に連結されうる単量体ポリペプチドで構成されている。未変性Ｆｃ分子の単量体サブユニット間の分子間ジスルフィド結合の数は、クラス（たとえば、ＩｇＧ、ＩｇＡ、およびＩｇＥ）またはサブクラス（たとえば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＡ１、およびＩｇＧＡ２）に応じて、１〜４の範囲である。未変性Ｆｃの一例は、ＩｇＧのパパイン消化によって得られる、ジスルフィド結合型の二量体である（Ellison et al., 1982, Nucleic Acids Res. 10: 4071-9を参照されたい）。本明細書で使用する用語「未変性Ｆｃ」は、単量体、二量体、および多量体形態に対して総称的である。
半減期延長性部分は、未変性（native）Ｆｃから改変されてはいるが、サルベージ受容体、すなわちＦｃＲｎ（新生児Ｆｃ受容体）に対する結合部位を依然として含む分子または配列を指す、「Ｆｃ変異体」を包含する。国際公開第ＷＯ９７／３４６３１号およびＷＯ９６／３２４７８号は、典型的なＦｃ変異体、ならびにサルベージ受容体との相互作用について記載しており、参照により本明細書に援用される。したがって、用語「Ｆｃ変異体」は、非ヒト化未変性Ｆｃからヒト化された分子または配列を含みうる。さらに、未変性Ｆｃは、本発明のバイオコンジュゲートに必要とならない構造上の特色または生物学的活性をもたらすので除去してよい領域を含む。したがって、用語「Ｆｃ変異体」は、（１）ジスルフィド結合形成、（２）選択された宿主細胞との不適合、（３）選択された宿主細胞において発現された後のＮ末端不均一性、（４）グリコシル化、（５）補体との相互作用、（６）サルベージ受容体以外のＦｃ受容体への結合、または（７）抗体依存的な細胞傷害活性（ＡＤＣＣ）、に影響を及ぼす、またはこれらに関与する、１つまたは複数の未変性Ｆｃ部位もしくは残基を欠いている、または１つまたは複数のＦｃ部位もしくは残基が改変されている分子または配列を包含する。Ｆｃ変異体については、以下でさらに詳細に述べる。
半減期延長性部分は、Ｃ末端リシンが欠失している、またはアラニンで置き換えられている、Ｆｃ変異体を包含する。
半減期延長性部分とは、上で規定したとおりの未変性ＦｃならびにＦｃ変異体および配列を包含する「Ｆｃドメイン」を指す。Ｆｃ変異体および未変性Ｆｃ分子のように、用語「Ｆｃドメイン」は、全抗体から消化されていようが、他の手段によって生成されていようが、単量体または多量体の形の分子を包含する。本発明の一部の実施形態では、Ｆｃドメインは、式Ｉ’、または式Ｉ〜ＩＶのいずれかのポリペプチドに、たとえば、Ｆｃドメインとペプチド配列間の共有結合を介して、コンジュゲートさせることができる。このようなＦｃタンパク質は、Ｆｃドメインの連係によって多量体を形成することができ、そうしたＦｃタンパク質およびその多量体は両方とも、本発明の態様である。
半減期延長性部分は、改変配列を含む、抗体のＦｃ断片を意味するものとされる、「改変Ｆｃ断片」を包含する。Ｆｃ断片は、ＣＨ２、ＣＨ３、およびヒンジ領域の一部を含む、抗体の一部分である。改変Ｆｃ断片は、たとえば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、またはＩｇＧ４から導くことができる。ＦｃＬＡＬＡは、ＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）を有する改変Ｆｃ断片であり、低下した効率でＡＤＣＣを誘発し、ヒト補体を弱く結合および活性化する。Hessell et al. 2007 Nature 449:101-104。Ｆｃ断片への追加の改変については、たとえば、米国特許第７，２１７，７９８号に記載されている。
Ｆｃドメイン、またはＦｃドメインを含む分子に適用される用語「多量体」とは、共有結合性に連係した２つ以上のポリペプチド鎖を有する分子を指す。たとえば、ＩｇＧ分子は、通常は二量体を形成し、したがって、二量体ＩｇＧ分子を含むバイオコンジュゲートは、２本の式Ｉ、ＩＡ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶのポリペプチド鎖に融合することになる。
リンカー
リンカー基は、任意選択である。存在するとき、リンカー基は、主としてスペーサーとして働くので、その化学構造は肝要でない。
リンカーは、２つの反応性基／官能基を含んでおり、その一方がポリペプチドと、他方が半減期延長性部分と反応しうる、化学的部分である。リンカーの２つの反応性基は、連結基を介して連結され、その構造は、リンカーのペプチドおよび半減期延長性部分とのカップリングの妨げとならない限り、肝要でない。
リンカーは、ペプチド結合によって互いに連結されたアミノ酸で構成されたものでよい。本発明の一部の実施形態では、リンカーは、ペプチド結合によって連結された１〜２０個のアミノ酸で構成され、アミノ酸は、２０種の自然に存在するアミノ酸から選択される。種々の実施形態において、１〜２０個のアミノ酸は、アミノ酸のグリシン、セリン、アラニン、プロリン、アスパラギン、グルタミン、システイン、およびリシンから選択される。一部の実施形態では、リンカーは、グリシンやアラニンなどの、立体障害のない大多数のアミノ酸で構成される。一部の実施形態では、リンカーは、ポリグリシン、ポリアラニン、グリシンとアラニンの組合せ（ポリ（Ｇｌｙ−Ａｌａ）など）、またはグリシンとセリンの組合せ（ポリ（Ｇｌｙ−Ｓｅｒ）など）である。一部の実施形態では、リンカーは、ヒスチジン、アラニン、メチオニン、グルタミン、アスパラギン、およびグリシンから選択される、大多数のアミノ酸を含む。一部の実施形態では、リンカーは、ポリヒスチジン部分を含む。リンカーの例は、ＡＨ、ＭＨＡ、またはＡＨＡのモチーフを含むリンカーである。このようなモチーフは、同時係属出願および同時出願の出願である、代理人整理番号米国仮出願第６２／０１５８６２号：ＰＡＴ０５６２７４−ＵＳ−ＰＳＰおよび米国仮出願第６２／０１５８６８号：ＰＡＴ０５６２７５−ＵＳ−ＰＳＰに、ペプチドまたはポリペプチドのＮ末端における選択的なコンジュゲーションに有益であると記載されている。
リンカーの他の例は、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ、ＧＧＧＧＳ、ＧＳ、またはＧＧのモチーフを含む。
他の一部の実施形態では、リンカーは、酵素のための認識モチーフを含む。一例は、Ｃ末端において含めることのできるＬＰＸＴＧ／Ａモチーフであり、Ｘは、いずれかのアミノ酸、最も一般にはＥ：グルタミン酸である。（Ｌ：ロイシン、Ｐ：プロリン、Ｔ：トレオニン、Ｇ：グリシン、Ａ：アラニン）。（Carla P. Guimaraes et al.:“Site specific C-terminal and internal loop labeling of proteins using sortase-mediated reactions”, Nature protocols, vol 8, No 9, 2013, 1787-1799）
他の実施形態では、リンカーは、非天然アミノ酸から選択される１〜２０個のアミノ酸を含む。半減期延長性部分とコンジュゲートさせるには、３〜１５個のアミノ酸残基のリンカーが好ましいが、本発明は、いずれの長さまたは組成のリンカーも企図する。好ましいアミノ酸リンカーは、次式のＯ２Ｏｃ：
またはその繰返し単位である。
本明細書に記載のリンカーは、例示的なものであり、はるかに長い、また他の残基を含むリンカーが、本発明によって企図される。非ペプチドリンカーも、本発明によって企図される。
リンカーの連結部分は、１つまたは複数のアルキル基、アルコキシ基、アルケニル基、シクロアルキル基、アリール基、ヘテロアリール基、およびヘテロ環基、またはこれらの組合せを含んでよい。たとえば、アルキルリンカー、たとえば、−ＮＨ−（ＣＨ２）ｚ−Ｃ（Ｏ）−、−Ｓ−（ＣＨ２）ｚ−Ｃ（Ｏ）−または−Ｏ−（ＣＨ２）ｚ−Ｃ（Ｏ）−［式中、ｚは、２〜２０である］を使用することができる。こうしたアルキルリンカーは、限定はしないが、低級アルキル（たとえば、Ｃ１〜Ｃ６）、低級アシル、ハロゲン（たとえば、Ｃｌ、Ｂｒ）、ＣＮ、ＮＨ２、またはフェニルを含めた、いずれかの非立体障害性基でさらに置換されていてもよい。
リンカーは、ポリマーの性質のものでもよい。リンカーは、生物学的に安定または生分解性であるポリマー鎖または単位を含んでよい。連結が繰り返されているポリマーは、結合不安定性に応じて、生理的条件下で様々な程度の安定性を備えうる。ポリマーは、ポリカルボネート（−Ｏ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、ポリエステル（−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、ポリウレタン（−ＮＨ−Ｃ（Ｏ）−Ｏ−）、ポリアミド（−Ｃ（Ｏ）−ＮＨ−）などの結合を含んでいてよい。こうした結合は、例として示しており、本発明のポリマー鎖またはリンカーにおいて用いることのできる結合のタイプを限定するものではない。適切なポリマーとしては、たとえば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、ポリビニルピロリドン、ポリビニルアルコール、ポリアミノ酸、ジビニルエーテルマレイン酸無水物、Ｎ−（２−ヒドロキシプロピル）−メタクリルアミド、デキストラン、デキストラン誘導体、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール、ヘパリン、ヘパリン断片、多糖、セルロースおよびセルロース誘導体、デンプンおよびデンプン誘導体、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体、ポリアルキレングリコールおよびその誘導体のコポリマー、ポリビニルエチルエーテルなど、およびこれらの混合物が挙げられる。ポリマーリンカーは、たとえば、ＰＥＧである。典型的な非ペプチドリンカーは、ポリエチレングリコールリンカー：
［式中、ｙは、リンカーが１００〜５０００ｋＤ、たとえば、１００〜５００ｋＤの分子量を有するようなものである］
である。
連結部分は、たとえば（Ｏ２Ｏｃ）単位などの１つまたは複数のアミノ酸部分、またはグリシンもしくはセリン、Ｃ１〜４アルキレン−Ｃ（Ｏ）−、Ｃ１〜４アルキレン、−ＮＨ−Ｃ２〜６アルキレン−ＮＨ−もしくは−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−ジアミノ単位、またはこれらの組合せと、２つの反応性基または官能基を連結した連結部分とを含むことが好ましい。
反応性基または官能基は、マレイミド、チオール、またはピリジン−２−イルジスルファニルであることが好ましい。
半減期延長性部分に付着させる、ペプチドまたはポリペプチド、およびペプチド−リンカー構築物の調製：
本発明のアペリンペプチド、およびポリペプチドおよび／またはペプチド−リンカー構築物は、合成化学的方法もしくは組換え法のいずれかによって、または両方の方法を組み合わせて生成することができる。アペリンペプチドおよび／またはペプチド−リンカー構築物は、全長として調製してもよいし、または全長でない断片として合成し、つないでもよい。本発明のペプチドおよびポリペプチドは、ペプチド合成のための、それ自体が知られている手順によって生成することができる。ペプチド合成の方法は、固相合成および液相合成のいずれかのものでよい。すなわち、問題のペプチドおよびポリペプチドは、タンパク質を構成し得る部分的なペプチドまたはアミノ酸をその残部と縮合させ、生成物が保護基を有するとき、保護基を外し、その後、所望のペプチドを製造することができる。縮合および脱保護の既知の方法としては、以下の文献（１）〜（５）に記載の手順が挙げられる。
（１）M. Bodanszky and M. A. Ondetti, Peptide Synthesis, Interscience Publishers, New York, 1966、
（２）Schroeder and Luebke, The Peptide, Academic Press, New York, 1965、
（３）Nobuo Izumiya et al. Fundamentals and Experiments in Peptide Synthesis, Maruzen, 1975、
（４）Haruaki Yajima and Shumpei Sakakibara, Biochemical Experiment Series 1, Protein Chemistry IV, 205, 1977、および
（５）Haruaki Yajima (ed.), Development of Drugs-Continued, 14, Peptide Synthesis, Hirokawa Shoten
反応後、ペプチドは、溶媒抽出、カラムクロマトグラフィー、液体クロマトグラフィー、再結晶などの従来の精製技術を組み合わせて、精製および単離することができる。上述のように単離したペプチドが遊離化合物である場合、既知の方法によってペプチドを適切な塩に変換することができる。逆に、単離された生成物が塩である場合、既知の方法によってペプチドを遊離ペプチドに変換することができる。
ポリペプチドのアミドは、アミド化に適した、ペプチド合成用の樹脂を使用して得ることができる。樹脂としては、クロロメチル樹脂、ヒドロキシメチル樹脂、ベンズヒドリルアミン樹脂、アミノメチル樹脂、４−ベンジルオキシベンジルアルコール樹脂、４−メチルベンズヒドリルアミン樹脂、ＰＡＭ樹脂、４−ヒドロキシメチルメチルフェニルアセトアミドメチル樹脂、ポリアクリルアミド樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−ヒドロキシメチル）フェノキシ樹脂、４−（２’，４’−ジメトキシフェニル−Ｆｍｏｃ−アミノメチル）フェノキシ樹脂、塩化２−クロロトリチル樹脂などが挙げられる。このような樹脂を使用して、α−アミノ基および側鎖の官能基が適切に保護されているアミノ酸を、目的のペプチドの配列に従い、それ自体が知られている種々の縮合技術によって樹脂上で縮合させる。一連の反応の終盤に、ペプチドまたは保護されたペプチドを樹脂から外し、必要に応じて保護基を除去し、ジスルフィド結合を形成させて、目的のポリペプチドを得る。
上述の保護されたアミノ酸の縮合には、ＨＡＴＵ、ＨＣＴＵ、またはたとえばカルボジイミドなどの、ペプチド合成用の様々な活性化試薬を使用することができる。カルボジイミドとしては、ＤＣＣ、Ｎ，Ｎ’−ジイソプロピルカルボジイミド、およびＮ−エチル−Ｎ’−（３−ジメチルアミノプロピル）カルボジイミドが挙げられる。このような試薬を用いた活性化には、ラセミ化防止添加剤、たとえば、ＨＯＢｔまたはＯｘｙｍａ Ｐｕｒｅを使用することができる。保護されたアミノ酸は、活性化試薬およびラセミ化防止剤と共に、樹脂にそのまま加えてもよいし、または対称酸無水物、ＨＯＢｔエステル、またはＨＯＯＢｔエステルとして予め活性化し、次いで樹脂に加えてもよい。保護されたアミノ酸の活性化または樹脂との縮合のための溶媒は、ペプチド縮合反応に有用であることがわかっている溶媒の中から適正に選択することができる。たとえば、Ｎ，Ｎ−ジメチルホルムアミド、Ｎ−メチルピロリドン、クロロホルム、トリフルオロエタノール、ジメチルスルホキシド、ＤＭＦ、ピリジン、ジオキサン、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、アセトニトリル、酢酸エチル、またはこれらの適切な混合物を挙げることができる。
反応温度は、ペプチド結合形成に有用であることがこれまでにわかっている範囲から選択することができ、普通は、約−２０℃〜５０℃の範囲から選択する。活性化型アミノ酸誘導体は、一般に、１．５〜４倍過剰の割合で使用する。ニンヒドリン反応を利用した試験によって、縮合が不十分であるとわかったなら、十分な縮合を実現するために、保護基を除去せずに、縮合反応を繰り返すことができる。繰り返した縮合によって、それでも十分な程度の縮合がなされない場合、未反応のアミノ基を、無水酢酸またはアセチルイミダゾールでアセチル化することができる。
出発材料アミノ酸のアミノ基の保護基としては、Ｚ、Ｂｏｃ、第三級アミルオキシカルボニル、イソボルニルオキシカルボニル、４−メトキシベンジルオキシカルボニル、ＣＩ−Ｚ、Ｂｒ−Ｚ、アダマンチルオキシカルボニル、トリフルオロアセチル、フタリル、ホルミル、２−ニトロフェニルスルフェニル、ジフェニルホスフィノチオイル、またはＦｍｏｃが挙げられる。使用することのできるカルボキシ保護基としては、限定はしないが、上述のＣ１〜６アルキル、Ｃ３〜８シクロアルキル、およびＣ６〜１０アリール−Ｃ１〜２アルキル、ならびに２−アダマンチル、４−ニトロベンジル、４−メトキシベンジル、４−クロロベンジル、フェナシル、ベンジルオキシカルボニルヒドラジド、第三級ブトキシカルボニルヒドラジド、およびトリチルヒドラジドが挙げられる。
セリンおよびトレオニンのヒドロキシ基は、エステル化またはエーテル化によって保護することができる。前記エステル化に適した基としては、炭素から導かれる基、たとえば、低級アルカノイル基、たとえばアセチルなど、アロイル基、たとえばベンゾイルなど、ベンジルオキシカルボニル、およびエトキシカルボニルが挙げられる。前記エーテル化に適した基としては、ベンジル、テトラヒドロピラニル、および第三級ブチルが挙げられる。チロシンのフェノール性ヒドロキシル基の保護基としては、Ｂｚｌ、Ｃｌ２−Ｂｚｌ、２−ニトロベンジル、Ｂｒ−Ｚ、および第三級ブチルが挙げられる。
ヒスチジンのイミダゾールの保護基としては、Ｔｏｓ、４−メトキシ−２，３，６−トリエチルベンゼンスルホニル、ＤＮＰ、ベンジルオキシメチル、Ｂｕｍ、Ｂｏｃ、Ｔｒｔ、およびＦｍｏｃが挙げられる。
出発アミノ酸の活性化型カルボキシル基には、対応する酸無水物、アジ化物、および活性エステル、たとえば、ペンタクロロフェノール、２，４，５−トリクロロフェノール、２，４−ジニトロフェノール、シアノメチルアルコール、ｐ−ニトロフェノール、ＨＯＮＢ、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド、Ｎ−ヒドロキシフタルイミド、ＨＯＢｔなどのアルコールとのエステルなどが含まれる。出発アミノ酸の活性化型アミノ基には、対応するホスホルアミドが挙げられる。
保護基の脱離方法としては、パラジウムブラックやパラジウム炭素などの触媒の存在下で水素ガスを使用する触媒還元、無水フッ化水素、メタンスルホン酸、トリフルオロメタンスルホン酸、トリフルオロ酢酸、またはこうした酸の混合物での酸処理、ジイソプロピルエチルアミン、トリエチルアミン、ピペリジン、ピペラジンでの塩基処理、液体アンモニア中でのナトリウム金属による還元が挙げられる。上述の酸処理による脱離反応は、一般に、−２０℃〜４０℃の温度で実施され、アニソール、フェノール、チオアニソール、ｍ−クレゾール、ｐ−クレゾール、硫化ジメチル、１，４−ブタンジチオール、１，２−エタンジチオールなどのカチオンアクセプターを加えて、有利に行うことができる。ヒスチジンのイミダゾール基の保護に使用した２，４−ジニトロフェニル基は、チオフェノールでの処理によって脱離させることができ、トリプトファンのインドール基の保護に使用したホルミル基は、希水酸化ナトリウム溶液または希アンモニア水溶液でのアルカリ処理、ならびに１，２−エタンジチオール、１，４−ブタンジチオール存在下での上述の酸処理によって脱離させることができる。
出発材料の反応に関与すべきでない官能基の保護方法、使用することのできる保護基、保護基の除去方法、および反応に関与すべき官能基を活性化する方法は、すべて、既知の基および方法の中から公正に選択することができる。
アミド型のポリペプチドを得る別の方法は、Ｃ末端アミノ酸のα−カルボキシル基を最初にアミド化するステップと、次いでペプチド鎖を所望の鎖長までＮ側に伸長し、次いで、Ｃ末端ペプチドのα−アミノ基、および目的ポリペプチドの残部を形成することになるアミノ酸またはペプチドのα−カルボキシ基を選択的に脱保護するステップと、α−アミノ基および側鎖官能基が上述の適切な保護基で保護されている２つの断片を、上で挙げたものなどの混合溶媒中で縮合させるステップとを含む。この縮合反応のパラメータは、上述したのと同じものでよい。縮合によって得られた保護ペプチドから、上述の方法によってすべての保護基を除去して、その結果、所望の粗製ペプチドが得られる。この粗製ペプチドを、既知の精製手順によって精製し、主画分を凍結乾燥して、目的のアミド化ポリペプチドを得ることができる。ポリペプチドのエステルを得るには、Ｃ末端アミノ酸のａ−カルボキシル基を所望のアルコールと縮合させて、アミノ酸エステルを得、次いで、アミド生成について上述した手順に従う。
代わりに、組換え発現法が特に有用である。宿主細胞（ペプチドの配列をコードする核酸を含むように人工的に操作されており、転写および翻訳を行い、場合によりペプチドを細胞成長培地に分泌する細胞）を使用する組換えタンパク質発現は、当業界で日常的に使用される。組換え生成法については、通常、ペプチドのアミノ酸配列をコードする核酸が、従来の方法によって合成され、発現ベクターに組み込まれることになる。このような方法は、追加のペプチド配列または他のタンパク質もしくはタンパク質断片もしくはドメインに融合したペプチドを含むポリペプチド組成物の製造に特に好ましい。宿主細胞は、場合により、大腸菌（E.Coli）、ＣＯＳ−１、ＣＯＳ−７、ＨＥＫ２９３、ＢＨＴ２１、ＣＨＯ、ＢＳＣ−１、Ｈｅｐ Ｇ２、６５３、ＳＰ２／０、２９３、ｈｅＬａ、骨髄腫、リンパ腫、酵母、昆虫、もしくは植物細胞、またはこれらのいずれかの派生、不死化、もしくは形質転換細胞から選択される少なくとも１種でよい。
改変された治療用ペプチドもしくはポリペプチドおよび／またはペプチド−リンカー構築物は、半減期延長性部分上の利用可能な反応性官能基と反応して、共有結合を形成することのできる反応性基を含む。反応性基は、共有結合を形成しうる化学基である。反応性基は、一般に、カルボキシ、ホスホリル、アシル基、エステル、または混合無水物、マレイミド、イミデート、ピリジン−２−イル−ジスルファニルでよく、そのため、アルブミンまたはＦｃドメインのターゲット部位において、アミノ基、ヒドロキシル基、カルボキシ基、またはチオール基のような官能基と共有結合を形成しうる。アルブミンとの連結に関して特に重要な反応性基として、マレイミド含有基およびピリジン−２−イル−ジスルファニル含有基が挙げられる。
官能基は、アルブミンまたはＦｃドメイン上の基であり、改変ペプチドまたはポリペプチド上の反応性基がこれと反応して、共有結合を形成しうる。官能基としては、エステル反応性エンティティと結合するヒドロキシル基、マレイミド、マレイミド含有基またはピリジン−２−イルジスルファニル、イミデート、およびチオエステル基と反応するチオール基、カルボン酸、ホスホリル基、アシル基に結合するアミノ基、ならびにヒドラジン、ヒドラジド、またはヒドロキシルアミンと反応するカルボキシ基が挙げられる。
スキーム１〜３は、ペプチドが、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つに従うペプチドである、ペプチド−リンカー構築物の合成を記載するものである。
スキーム１に、式Ｉ〜ＩＶのポリペプチドのＮ末端に付着したリンカーを含んでいるマレイミドの合成を記載する。
ペプチドのＮ末端を、十分に確立されたアミドカップリング化学に従って、１つまたは複数のＯ２Ｏｃアミノ酸単位（ｘは、１〜２０、好ましくは１〜１０、より好ましくは３〜６である）とカップリングさせて、（１Ａ）を生成する。（１Ａ）の末端アミノ官能基を、活性化型の酸（１Ｂ）［式中、Ｒは、線状または分枝状のアルキレン、アリール、ヘテロアリール、シクロアルキル、またはこれらの組合せである］と反応させて、ペプチド−マレイミドを含んでいるリンカー構築物（１Ｃ）を生成する。活性化型の酸（１Ｂ）は、市販品として入手可能であり、またはその対応するカルボン酸から、当業者に知られている技術に従って容易に入手可能である。Ｒは、線状アルキレンであることが好ましく、Ｒは、−ＣＨ２−ＣＨ２−であることがより好ましい。代わりに、側鎖にアミノ官能基を含んでいるペプチド（たとえば、リシンを含んでいるペプチド）については、カップリング反応の前に、アロックなどの直交保護基（orthogonal protecting group）が必要となり、続いて追加の脱保護ステップを経て、（１Ｃ）を得る。
スキーム２Ａおよび２Ｂに、式ＩからＩＶのいずれか１つに従うポリペプチドのＮ末端に付着したリンカーを含んでいるピリジン−２−イル−ジスルファニルの合成を記載する。
ペプチド−リンカー構築物（１Ａ）を、スキーム１に記載のとおりに調製し、活性化した式（２Ａ）の酸［式中、Ｒ’は、線状または分枝状アルキレンである］とさらに反応させて、ペプチド−ピリジン−２−イル−ジスルファニルを含んでいるリンカー構築物（２Ｂ）を生成する。活性化型の酸（２Ａ）は、市販品として入手可能であり、またはその対応するカルボン酸から、当業者に知られている技術に従って容易に入手可能である。Ｒ’は、−ＣＨ２−ＣＨ２−であることが好ましい。代わりに、ペプチド−リンカー構築物（２Ｃ）を、ＨＯ２Ｃ−Ｒ’−ＳＨ、またはその保護された形態（たとえば、トリチルまたはＡｃｍ基、追加の脱保護ステップが必要となる）を使用して調製し、さらに（２Ｄ）と反応させて、ペプチド−ピリジン−２−イル−ジスルファニルを含んでいるリンカー構築物（２Ｂ）を生成することができる。
ペプチドのＣ末端にも、たとえば−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−または−ＮＨ−ＣＨ２ＣＨ２−Ｏ−ＣＨ２ＣＨ２−ＮＨ−などのジアミノ単位を使用して、同様の反応性基を、スキーム１、２Ａ、および２Ｂに記載したのと同様にして付着させる。このようなペプチド−リンカー構築物の非限定的な例は、以下である。
代わりに、マレイミドまたはピリジン−２−イル−ジスルファニル反応性基は、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つに従うポリペプチドに、スキーム３Ａ、３Ｂ、および３Ｃに従って付着させることができる。
ペプチドのＣ末端にあるカルボン酸基を、標準のアミドカップリング条件を使用して、１つまたは複数のＯ２Ｏｃアミノ酸単位と結合させて、（３Ａ）を生成する。末端カルボン酸官能基は、（３Ｂ）または（３Ｃ）［式中、ＲおよびＲ’は、上で規定したとおりである］のアミノ基と反応して、活性化型のペプチド−リンカー構築物（３Ｄ）または（３Ｅ）が生成される。加えて、ペプチドがカルボキシ官能基側鎖（たとえば、ＧｌｕまたはＡｓｐ）を含むとき、直交保護基（たとえば、Ｏ−アリル）および追加の脱保護ステップが必要となる。
システアミン２−クロロトリチル樹脂を使用して、ペプチド−リンカー構築物３Ｆを得、次いで３Ｇまたは３Ｈと反応させると、ペプチド−リンカー構築物３Ｉまたは３Ｅをそれぞれ生成することができる。
ペプチド−リンカー構築物（３Ｊ）は、ジアミン樹脂から得ることができ、（１Ｂ）または（２Ａ）とさらに反応させて、式（３Ｋ）または（３Ｌ）のペプチド−リンカー構築物をそれぞれ生成する。
スキーム１〜３Ｃには、より詳細には、アルブミンとのバイオコンジュゲートの調製において使用される、ペプチド−リンカー構築物を記載している。マレイミド反応性基およびピリジン−２−イル−ジスルファニル反応性基は、アルブミンのシステイン３４の−ＳＨ官能基と反応する。
スキーム３Ｄおよび３Ｅに、より一般にはクリックケミストリーとして知られるアジド−アルキンＨｕｉｓｇｅｎ付加環化における使用について、ペプチド−リンカー構築物の調製を記載する。
式中、ｍは、０または１であり、Ｃ１は、フッ素で場合により置換されている単環式、二環式、または三環式の炭素環またはヘテロ環系であり、Ｌ１は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレンリンカーであり、アルキレン鎖は、オキソ（＝Ｏ）で場合により置換されており、１個または複数の炭素は、ＯまたはＮＨで置き換えられている。シクロアルキン部分（３Ｄａ）は、市販品供給元から容易に入手可能である。加えて、タンパク質標識のためのクリックケミストリーにおける環式アルキンは、参照により本明細書に援用されるＵＳ２００９／００６８７３８に記載されている。詳細な例は、以下（実施例２０）に記載している。クリックハンドルは、ペプチドのＮ末端において、またはリシン残基側鎖上に導入することができる。
スキーム３Ｅには、場合によりリンカーＬ（たとえば、グリシンおよびセリンから選択される１つまたは複数のアミノ酸など）を介した、アペリンペプチドのＮ末端におけるアジドリシン残基の導入を記載している。アジド官能基は、クリックケミストリーのためのハンドルとして働く。詳細な例は、同時出願の出願（代理人整理番号ＰＡＴ０５５４１８−ＵＳ−ＰＳＰ２）に記載されている。
半減期延長性部分−リンカー構築物の調製：
スキーム３Ｆおよび３Ｇに、脂肪酸−リンカー構築物の調製を記載する。
式中、ＦＡは、脂肪酸であり、Ｌ２は、連結部分（たとえば、ＰＥＧ）であり、ＮＨＳは、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミドである。このような脂肪酸−リンカー構築物は、クリックケミストリーを使用するコンジュゲーションに使用される。脂肪酸が、ヒドロキシルや追加のカルボン酸などの官能基を含む事例では、そのような官能基の保護が必要となる場合もある。
式中、ＦＡ、ＮＨＳ、およびＬ２は、上でスキーム３Ｆにおいて規定している。このような脂肪酸構築物は、ペプチド上、好ましくはＮ末端上のアミノ官能基とのコンジュゲーションに使用される。
スキーム３Ｈに、Ｆｃ−リンカー構築物の調製を記載する。
ＡＨ−Ｆｃは、ＦｃのＮ末端に配列ＡＨ−を含んでいる構築物である。この構築物は、組換え法を使用して調製される。ＡＨ−配列によって、低いｐＨでＮ末端の選択的な改変が可能になる。このような選択的改変は、同時出願の出願（米国仮出願第６２／０１５８６８：代理人整理番号ＰＡＴ０５６２７５−ＵＳ−ＰＳＰおよび米国仮出願第６２／０１５８６２：ＰＡＴ０５６２７４−ＵＳ−ＰＳＰ）で開示されている。したがって、クリックハンドルは、Ｆｃ構築物のＮ末端において導入される。
さらに別の実施形態では、Ｆｃ構築物をＣ末端において改変して、小さいソルターゼ（Sortase）認識モチーフ（ＬＰＸＴＧ／Ａ）を導入する。このようなＦｃ−認識モチーフは、組換え法を使用して調製される。このような構築物の例は、Ｆｃ−［ＧＧＧＧ］ｎ−ＬＰＥＴＧＧＬＥＶＬＦＱＧＰであり、ＧＧＬＥＶＬＦＱＧＰは、ソルターゼ処理の際に切り詰められる。
Ｆｃ ＡＰＪペプチド融合タンパク質の調製
生物学的に作製された多量体化分子、たとえば、ヒンジとして知られる含システイン領域の少なくとも一部を含む抗体Ｆｃは、多量体化された（たとえば、二量体の）形で分泌された、組換え発現させたタンパク質産物から調製することができる。本発明は、Ｆｃ領域のアミノ酸配列が、自然に存在する抗体において見られるＦｃまたは定常領域のアミノ酸配列と比べて変更されている改変Ｆｃ融合タンパク質も包含する。たとえば、Ｆｃ融合タンパク質は、ＦｃＲｎ結合親和性／または血清半減期の所望の特徴を得るために、変異によって操作（すなわち、改変）されていてもよい。改変Ｆｃ融合タンパク質の例は、参照により援用される米国特許第７，２１７，７９８号で開示されている。
本発明のＦｃ融合タンパク質は、たとえば、リンカー部分とペプチドまたはポリペプチド部分とを付着させることにより、合成的に変更されてもよい。加えて、組換え抗体由来のＦｃドメインを有する「改変」Ｆｃ融合タンパク質は、原核生物と真核生物両方の発現系を含めたいずれかの発現系において、またはファージディスプレイ法を使用して作製することができる。
Ｆｃ−［ＧＧＧＧＳ］、Ｆｃ−［ＧＧＧＧＳ］２、Ｆｃ−［ＧＧＧＧＳ］３、Ｆｃ−ＧＧ、Ｆｃ−ＧＳなどのＦｃ−リンカー構築物については、実験の部で後述する。［ＧＧＧＧＳ］、［ＧＧＧＧＳ］２、［ＧＧＧＧＳ］３、ＧＳ、およびＧＧリンカーは、ＦｃドメインのＣ末端またはＦｃドメインのＮ末端のいずれかに付着しており、Ｆｃは、未変性Ｆｃまたはその変異体である。Ｆｃ変異体の例としては、Ｃ末端リシンが欠失している、またはアラニンで置き換えられているＦｃが挙げられる。このようなＦｃ変異体は、同時出願の出願（代理人整理番号ＰＡＴ０５５７８１−ＵＳ−ＰＳＰ０２）に記載されている。
バイオコンジュゲート
本発明の一実施形態では、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つに従うペプチドまたはポリペプチドを、アルブミンのシステイン３４のチオール官能基にコンジュゲートさせる（化学的／共有結合性に付着させる）。この実施形態の一態様では、アルブミン−ペプチドは、アルブミンがペプチドのＮ末端にコンジュゲート（化学的に連結）している、バイオコンジュゲートを指す。さらに別の実施形態では、アルブミン−ペプチドは、アルブミンがペプチドのＣ末端にコンジュゲート（化学的に連結）している、バイオコンジュゲートを指す。
本発明の別の実施形態では、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つに従うペプチドまたはポリペプチドを、ヒトＩｇＧのＦｃ領域の１つまたは複数のドメインに融合させる。抗体は、機能の独立した２つの部分、すなわち、抗原を結合する、「Ｆａｂ」として知られる可変ドメインと、補体活性化や食細胞による攻撃などのエフェクター機能に関与する、「Ｆｃ」として知られる定常ドメインとを含む。Ｆｃは、長い血清半減期を有するのに対し、Ｆａｂは、短命である（Capon et al., 1989, Nature 337: 525-31）。治療用ペプチドまたはポリペプチドとつなぎ合わせたとき、Ｆｃドメインが、より長い半減期をもたらす（C. Huang, Curr. Opin. Biotechnol., 2009, 20, 692-699）。
一実施形態では、Ｆｃ−ペプチドは、Ｆｃ配列が、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つに従うペプチドのＮ末端に融合する、バイオコンジュゲートを指す。別の実施形態では、ペプチド−Ｆｃは、Ｆｃ配列がペプチドのＣ末端に融合するバイオコンジュゲートを指す。
Ｆｃ領域は、自然に存在するＦｃ領域でもよいし、または治療の質、循環時間、凝集の減少などの、ある特定の品質を向上させるために改変されていてもよい。
抗体の「Ｆｃ」ドメインと融合させることによる、タンパク質治療薬の有用な改変は、ＰＣＴ公開第ＷＯ００／０２４７８２号に詳細に記載されている。この文書では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）、デキストラン、Ｆｃ領域などの「ビヒクル」への連結が論じられている。
本発明の好ましい実施形態は、前述の実施形態のいずれか１つに従うペプチドまたはポリペプチドと半減期延長性部分とを含み、半減期延長性部分は、式Ｉ、ＩＩＩ、ＩＶ、またはＶのポリペプチドに、リンカーを介して融合するＦｃドメインである、バイオコンジュゲートである。本発明の一態様では、リンカーは、次式：−［ＧＧＧＧＳ］ｎ−を有し、ｎは、１、２もしくは３であり、またはリンカーは、ＧＧもしくはＧＳであり、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶのポリペプチドは、自然に存在するアミノ酸を含む。Ｆｃドメインとの融合に適する式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶのポリペプチドの例は、ＱＲＰＣ＊ＬＳＣ＊ＫＧＰＭＰＦ、Ｃ＊ＲＰＲＬＳＣ＊ＫＧＰＭＰＦ、およびＱＲＣ＊ＲＬＳＣ＊ＫＧＰＭＰＦである。この実施形態の好ましい一態様は、改変Ｆｃ断片（たとえば、ＦｃＬＡＬＡ）と、本明細書で規定するとおりの式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのペプチドまたはポリペプチドとを含む、上で規定したとおりのＦｃ−ペプチド融合バイオコンジュゲートである。
さらに別の実施形態では、本発明は、半減期延長性部分が、Ｃ末端リシンが欠失している、またはアラニンで置き換えられている改変Ｆｃドメインである、前述の実施形態のいずれか１つに従うバイオコンジュゲートに関する。
Ｆｃ領域に融合したペプチドは、融合していない対応物より、ｉｎ ｖｉｖｏで実質的により長い半減期を示すことがわかっている。また、Ｆｃ領域への融合によって、ポリペプチドの二量体化／多量体化が可能になる。
本発明の別の実施形態は、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つに従うペプチドまたはポリペプチドと、半減期延長性部分とを含み、半減期延長性部分は、ポリペプチドに化学的に連結されるＦｃドメインである、バイオコンジュゲートである。
コンジュゲートの調製：
スキーム４および５は、ＡＰＪアゴニストペプチド、または式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つに従うペプチドと、Ｆｃドメインやアルブミンなどの半減期延長性部分とをコンジュゲートさせる化学反応を説明するものである。
スキーム４では、式４Ａのペプチド−リンカーの、アルブミンのシステイン３４とのコンジュゲーションを図解する。
式中、Ｌは、ペプチドとマレイミド官能基間の連結部分を表す。詳細な実施形態では、Ｌは、スキーム１、３Ａ、３Ｂ、または３Ｃに開示のとおりの連結部分である。
スキーム５では、式８Ａのペプチド−リンカー構築物の、アルブミンのシステイン３４とのコンジュゲーションを図解する。
式中、Ｌは、ペプチドと−Ｓ−Ｓ−ピリジン官能基間の連結部分を表す。詳細な実施形態では、Ｌは、スキーム２、３Ａ、３Ｂ、または３Ｃに開示のとおりの連結部分である。
他のコンジュゲーション方法は、同時係属および同時出願の出願（米国仮出願第６２／０１５８６２号：代理人整理番号ＰＡＴ０５６２７４−ＵＳ−ＰＳＰ、米国仮出願第６２／０１５８６８号：ＰＡＴ０５６２７５−ＵＳ−ＰＳＰ、および米国仮出願第６２／０１５８４８号ＰＡＴ０５５７８１−ＵＳ−ＰＳＰ０２）に記載されている。そうした方法として、ペプチドの選択的なＮ−アシル化が挙げられ、スキーム６に要約される。
式中、ＡＨ−は、Ｎ末端での反応を促進するためにペプチドのＮ末端上に導入されたリンカーであり、Ｈは、ヒスチジンであり、Ａは、アラニンであり、ＦＡは、上述のとおりの脂肪酸、たとえば、式Ａ１〜Ａ３の脂肪酸であり、Ｌは、連結部分（たとえば、ＰＥＧ連結部分）である。低ｐＨ条件を使用すると、脂肪酸リンカー構築物６ａ（スキーム３Ｇに示したとおりに調製したもの）は、ペプチド上に、Ｎ末端において選択的に導入される。このような方法は、同時出願の特許出願（米国仮出願第６２／０１５８６８号：代理人整理番号ＰＡＴ０５６２７５−ＵＳ−ＰＳＰおよび米国仮出願第６２／０１５８４８号ＰＡＴ０５５７８１−ＵＳ−ＰＳＰ０２）に記載されている。
スキーム７および８は、クリックケミストリーを使用する本発明に従うコンジュゲートの生成を記載するものである。
スキーム１〜５に記載のとおりのコンジュゲートおよびペプチド−リンカー構築物の作製方法については、参照により本明細書に援用される、同時出願のＵＳ出願（米国仮出願第６１／８５８２５１号：代理人整理番号：ＰＡＴ０５５３２６−ＵＳ−ＰＳＰ３および米国仮出願第６１／８５８３０３号：ＰＡＴ０５５７８１−ＵＳ−ＰＳＰ）においても記載および例示されている。
スキーム９は、ソルターゼ酵素を使用する、ＡＰＪペプチドのＦｃ構築物とのコンジュゲーションを記載するものである。
式中、ｎは、１、２または３であり、Ｌは、任意選択のリンカー（たとえば、ポリグリシンリンカー）である。
医薬組成物
本発明のポリペプチド、またはそのアミド、塩のエステル、またはそのバイオコンジュゲートは、皮下、筋肉内、静脈内、腹腔内、鼻腔内、吸入、経口などを始めとする様々な手段のいずれかにおいて投与することができる。本発明の特に好ましい実施形態では、本発明のポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートの連続的な静脈内投与を用いる。本発明におけるポリペプチドまたはバイオコンジュゲートは、ボーラスとして、または一定期間にわたる連続注入として投与することができる。移植可能なポンプを使用してもよい。本発明のある特定の実施形態では、断続的または連続的なポリペプチドもしくはバイオコンジュゲート投与を、１日〜数日間（たとえば、２〜３日間以上）またはより長期間、たとえば、数週間、数か月、もしくは数年間継続する。一部の実施形態では、断続的または連続的なポリペプチド投与を少なくとも約３日間施す。他の実施形態では、断続的または連続的なポリペプチドもしくはバイオコンジュゲート投与を少なくとも約１週間施す。他の実施形態では、断続的または連続的なポリペプチドもしくはバイオコンジュゲート投与を少なくとも約２週間施す。投与中または複数回の投与の合間に、特定の閾値を上回る平均血漿ポリペプチド濃度を維持することが望ましい場合もある。望ましい濃度は、たとえば、対象の生理的状態、疾患重症度などに基づき決定することができる。そのような望ましい値（複数可）は、標準の臨床試験を実施して割り出すことができる。代わりに、ペプチドおよびそのコンジュゲートは、ＦｃＲｎ機序によって、経口的に送達することができるはずである（Nat Rev Immunol. 7(9), 715-25, 2007、Nat Commun. 3;3:610, 2012、Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol 304: G262-G270, 2013）。
別の態様では、本発明は、本発明のポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートと、１種または複数の薬学的に許容される担体とを含む医薬組成物を提供する。医薬組成物は、経口投与、非経口投与、直腸投与などの特定の投与経路用に製剤化することができる。加えて、本発明の医薬組成物は、固体形態（限定はせず、カプセル剤、錠剤、丸剤、顆粒、粉末、または坐剤を含む）、または液体形態（限定はせず、溶液、懸濁液、または乳濁液を含む）に仕立てることができる。医薬組成物は、滅菌などの従来の製薬業務にかけることができ、かつ／または、従来の不活性希釈剤、滑沢剤、または緩衝剤、ならびに保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液などの佐剤を含有してよい。
注射用途に適する医薬組成物は、通常、滅菌注射溶液または分散液を即座に調製するための、滅菌水溶液（水溶性の場合）または分散液と滅菌粉末を含む。
静脈内の投与については、適切な担体として、生理食塩水、静菌水、Ｃｒｅｍｏｐｈｏｒ ＥＬＴＭ（ＢＡＳＦ、ニュージャージー州Ｐａｒｓｉｐｐａｎｙ）、またはリン酸緩衝食塩水（ＰＢＳ）が挙げられる。すべての場合において、組成物は、滅菌とすべきであり、容易な注射適用性（syringability）が存在する程度に流動的にすべきである。好ましい医薬製剤は、製造および貯蔵の条件下で安定しており、細菌や真菌などの微生物による汚染作用に対抗して保存しなければならない。一般に、妥当な担体は、たとえば、水、エタノール、ポリオール（たとえば、グリセロール、プロピレングリコール、液体ポリエチレングリコールなど）、およびこれらの適切な混合物を含有する溶媒または分散媒でよい。適正な流動度は、たとえば、レシチンなどのコーティング剤の使用、分散液の場合では必要な粒径の維持、および界面活性剤の使用によって維持することができる。微生物による作用の予防は、種々の抗菌剤および抗真菌剤、たとえば、パラベン、クロロブタノール、フェノール、アスコルビン酸、チメロサールなどによって実現することができる。多くの場合、等張化剤、たとえば、糖、マンニトールなどのポリアルコール、ソルビトール、塩化ナトリウムを組成物に含めることが好ましい。注射用組成物の吸収の延長は、吸収を遅らせる薬剤、たとえば、モノステアリン酸アルミニウムやゼラチンを組成物に含めることにより実現できる。
ある特定の注射用組成物は、水性の等張性溶液または懸濁液であり、坐剤は、脂肪質の乳濁液または懸濁液から調製することが有利である。前記組成物は、滅菌され、かつ／または保存剤、安定剤、湿潤剤、乳化剤、溶解促進剤（solution promoter）、浸透圧調節用の塩、および／または緩衝液などの佐剤を含有するものでよい。加えて、前記組成物は、治療上価値のある他の物質も含有してよい。前記組成物は、従来の混合、造粒、またはコーティング法に従って調製され、それぞれ、約０．１〜７５％、または約１〜５０％の活性成分を含有する。
滅菌注射溶液は、必要に応じて、上で列挙した成分の１つまたは組合せを含有する適切な溶媒に、必要な量の活性化合物を混ぜた後、濾過滅菌することにより調製できる。分散液は、一般に、基礎の分散媒、および上で列挙したものからの他の必要な成分を含有する滅菌ビヒクルに、活性化合物を混ぜることにより調製される。滅菌注射溶液を調製するための滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、真空乾燥および凍結乾燥であるが、この方法では、活性成分の粉末と、所望の任意の追加成分が、予め滅菌濾過されたその溶液から得られる。
経口組成物は、一般に、不活性希釈剤または可食担体を含む。治療的経口投与の目的では、活性化合物は、賦形剤と混ぜ、錠剤、トローチ剤、またはカプセル剤、たとえばゼラチンカプセル剤の形で使用することができる。経口組成物は、含嗽液として使用するために流動性担体を使用して調製することもできる。薬学的に適合する結合剤、および／または佐剤材料を、組成物の一部として含めることができる。錠剤、丸剤、カプセル剤、トローチ剤などは、次の成分、すなわち、微結晶性セルロース、トラガカントゴム、ゼラチンなどの結合剤、デンプンやラクトースなどの賦形剤、アルギン酸、Ｐｒｉｍｏｇｅｌ、コーンスターチなどの崩壊剤、ステアリン酸マグネシウムやＳｔｅｒｏｔｅｓなどの滑沢剤、コロイド状二酸化ケイ素などの流動促進剤、スクロースやサッカリンなどの甘味剤、またはハッカ、サリチル酸メチル、オレンジ香料などの着香剤のいずれか、または同様の性質の化合物を含有してよい。経口送達用の製剤は、消化管内での安定性を向上させ、かつ／または吸収を強化するための薬剤が組み込まれていると有利な場合もある。
吸入による投与について、発明治療薬は、適切な噴射剤、たとえば、二酸化炭素などの気体を含有する加圧容器もしくは計量分配装置、またはネブライザーから、エアロゾルスプレーの形で送達することが好ましい。治療薬の全身送達のために、肺が広い表面積を備えていることは注目される。
薬剤は、たとえば、米国公開２００４００９６４０３に記載のものなどのポリマー系微小粒子に、または当業界で知られている他の広範な薬物送達ビヒクルのいずれかと共同して、カプセル封入することができる。本発明の他の実施形態では、たとえば、米国公開２００４００６２７１８に記載されているように、薬剤を荷電脂質と共同して送達する。後者の系は、治療用ポリペプチドであるインスリンの投与に使用されており、ペプチド剤の投与についてこの系の実益を示していることが注目される。
全身投与は、経粘膜的または経皮的手段によるものでもよい。
経皮的適用に適する組成物は、有効量の本発明のポリペプチドを適切な担体と共に含む。経皮送達に適する担体として、ホストの皮膚を介した透過を手助けする薬理学的に許容される被吸収性溶媒が挙げられる。経皮的デバイスは、たとえば、裏部材と、化合物を場合により担体と共に含有するレザバーと、場合により、ホストの皮膚の化合物を、長期間にわたって、制御され、予め決められた速度で送達するための速度制御バリアと、デバイスを皮膚に固定するための手段とを備えた絆創膏の形態である。
たとえば皮膚および眼への局所適用に適する組成物には、水溶液、懸濁液、軟膏、クリーム、ゲル、または、たとえばエアロゾルなどによる送達のためのスプレー製剤が含まれる。このような局所送達系は、特に、皮膚への適用に相応しくなる。すなわち、こうした局所送達系は、当業界でよく知られている美容製剤を含めた局所的使用に特に適する。このような組成物は、可溶化剤、安定剤、張性増強剤（tonicity enhancing agent）、緩衝剤、および保存剤を含有してもよい。
本明細書で使用するとき、局所適用は、吸入または鼻腔内適用にも関連することがある。こうした適用は、乾燥粉末吸入器から乾燥粉末（単独、混合物、たとえばラクトースとの乾燥ブレンドとして、またはたとえばリン脂質との混合型要素粒子としてのいずれか）の形で、または加圧容器、ポンプ、スプレー、アトマイザー、もしくはネブライザーからエアロゾルスプレー体裁の形で、適切な噴射剤を使用しまたは使用せずに、好都合に送達することができる。
本発明はさらに、活性成分としての本発明の化合物が分解する速度を減速する１種または複数の薬剤を含む医薬組成物および剤形を提供する。本明細書では「安定剤」と呼ぶ、そのような薬剤として、限定はしないが、アスコルビン酸などの酸化防止剤、ｐＨ緩衝液、または塩緩衝液などが挙げられる。
本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容される塩」とは、本発明のポリペプチドの生物学的有効性および特性を保持し、通常は生物学的または別な意味で望ましい塩を指す。多くの場合、本発明のポリペプチドは、アミノ基および／もしくはカルボキシル基またはそれと同様の基が存在するおかげで、酸および／または塩基の塩を形成することができる。
薬学的に許容される酸付加塩、たとえば、酢酸塩、アスパラギン酸塩、安息香酸塩、ベシル酸塩、臭化物／臭化水素酸塩、炭酸水素塩／炭酸塩、硫酸水素塩／硫酸塩、カンファースルホン酸塩、塩化物／塩酸塩、クロルテオフィリン酸塩（chlortheophyllonate）、クエン酸塩、エタンジスルホン酸塩、フマル酸塩、グルセプト酸塩、グルコン酸塩、グルクロン酸塩、馬尿酸塩、ヨウ化水素酸塩／ヨウ化物、イセチオン酸塩、乳酸塩、ラクトビオン酸塩、ラウリル硫酸塩、リンゴ酸塩、マレイン酸塩、マロン酸塩、マンデル酸塩、メシル酸塩、メチル硫酸塩、ナフトエ酸塩、ナプシル酸塩、ニコチン酸塩、硝酸塩、オクタデカン酸塩、オレイン酸塩、シュウ酸塩、パルミチン酸塩、パモ酸塩、リン酸塩／リン酸水素塩／リン酸二水素塩、ポリガラクツロン酸塩、プロピオン酸塩、ステアリン酸塩、コハク酸塩、スルホサリチル酸塩、酒石酸塩、トシル酸塩、およびトリフルオロ酢酸塩は、無機酸および有機酸に対して生成することができる。
塩を導くことのできる無機酸としては、たとえば、塩酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸などが挙げられる。塩を導くことのできる有機酸としては、たとえば、酢酸、プロピオン酸、グリコール酸、シュウ酸、マレイン酸、マロン酸、コハク酸、フマル酸、酒石酸、クエン酸、安息香酸、マンデル酸、メタンスルホン酸、エタンスルホン酸、トルエンスルホン酸、スルホサリチル酸などが挙げられる。薬学的に許容される塩基付加塩は、無機塩基および有機塩基に対して生成することができる。
塩を導くことのできる無機塩基としては、たとえば、アンモニウム塩、および周期表のＩ〜ＸＩＩ列の金属が挙げられる。ある特定の実施形態では、塩は、ナトリウム、カリウム、アンモニウム、カルシウム、マグネシウム、鉄、銀、亜鉛、および銅から導かれ、特に適切な塩として、アンモニウム、カリウム、ナトリウム、カルシウム、およびマグネシウム塩が挙げられる。
塩を導くことのできる有機塩基としては、たとえば、第一級、第二級、および第三級アミン、自然に存在する置換アミンを始めとする置換アミン、環状アミン、塩基性イオン交換樹脂などが挙げられる。ある特定の有機アミンとして、イソプロピルアミン、ベンザチン、コリネート（cholinate）、ジエタノールアミン、ジエチルアミン、リシン、メグルミン、ピペラジン、およびトロメタミンが挙げられる。
本発明の薬学的に許容される塩は、従来の化学的方法によって、親化合物、塩基性または酸性部分から合成することができる。一般に、そのような塩は、遊離酸形態のこうした化合物を化学量論量の相応しい塩基（Ｎａ、Ｃａ、Ｍｇ、またはＫの水酸化物、炭酸塩、炭酸水素塩など）と反応させる、または遊離塩基形態のこうした化合物を化学量論量の相応しい酸と反応させることにより調製できる。こうした反応は通常、水もしくは有機溶媒中または二者の混合物中で実施される。一般に、実用可能な場合、エーテル、酢酸エチル、エタノール、イソプロパノール、またはアセトニトリルのような非水性媒質の使用が望ましい。追加の適切な塩の一覧は、たとえば、“Remington’s Pharmaceutical Sciences”, 20th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pa., (1985)ならびにStahlおよびWermuthによる“Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use” (Wiley-VCH, Weinheim, Germany, 2002)で見ることができる。
本明細書で使用するとき、用語「薬学的に許容される担体」は、当業者に知られているであろうが、ありとあらゆる溶媒、分散媒、コーティング剤、界面活性剤、酸化防止剤、保存剤（たとえば、抗菌剤、抗真菌剤）、等張化剤、吸収遅延剤、塩、保存剤、薬物、薬物安定剤、結合剤、賦形剤、崩壊剤、滑沢剤、甘味剤、着香剤、色素など、およびこれらの組合せを包含する（たとえば、Remington’s Pharmaceutical Sciences, 18th Ed. Mack Printing Company, 1990, pp. 1289- 1329を参照されたい）。従来のいかなる担体も、活性成分と相容れない範囲にあるものを除き、治療組成物または医薬組成物におけるその使用を企図する。
本発明の方法：
アペリンファミリーのペプチドは、Ｇタンパク質共役型ＡＰＪ受容体の、知られている唯一の天然リガンドファミリーである。アペリン遺伝子は、７７アミノ酸のポリペプチドをコードし、このポリペプチドがプロセシングを受けて、生物学的活性型のアペリンペプチド、たとえば、アペリン−３６、アペリン−１７、アペリン−１６、アペリン−１３、アペリン−１２、およびピログルタミン酸改変型のアペリン−１３（Ｐｙｒ１−アペリン−１３）になる。これらアペリンペプチドのいずれでも１種が、ＡＰＪ受容体に結合すると、ＧｉおよびＧｑタンパク質を介してシグナルを伝達する。心筋細胞では、ＧｉまたはＧｑとの共役によって、細胞内ｐＨが変化し、ＰＬＣが活性化され、ＩＰ３が産生され、それにより筋フィラメントのカルシウム感受性が増強され、最終的に心収縮性が増大する。Ｇｉ共役により、活性化型Ｇｓ、アデニリルシクラーゼ、およびｃＡＭＰの産生が抑制され、ｐＡｋｔレベルが上昇して、心臓保護につながる。血管内皮細胞では、Ｇｉを介したＡＰＪ活性化、ｐＡＫＴによって、一酸化窒素（ＮＯ）産生が増大し、これにより平滑筋弛緩が増進される結果、全体として血管が拡張する。
慢性安定心不全の患者は、心収縮性がさらに低下し、症状が悪化する、不定期の急性代償不全エピソードを伴う。こうした増悪は、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）と呼ばれる。ＡＤＨＦの現行の療法としては、利尿薬、血管拡張薬、およびイノトロープが挙げられ、これらは、心収縮性を直接増大させる。現用の静脈内イノトロープ（ドブタミン、ドーパミン、ミルリノン、レボシメンダン）は、不整脈などの有害事象を伴い、長期死亡率を増大させることでよく知られている。本発明の合成アペリンポリペプチド類似体またはそのバイオコンジュゲートは、催不整脈性または死亡の傾向なしに心収縮性を増大させるＡＤＨＦ療法となり、慢性心不全における未対応の膨大な医学的要求に対処するものである。
実際に、ヒトにおける急性アペリン治療（５分）の結果、冠血管は拡張し、心拍出量は改善される。しかし、天然のアペリンは、ｉｎ ｖｉｖｏでのｔ１／２（秒）および作用持続時間（数分）が非常に短い。本発明の強力な合成アペリンペプチドアゴニスト、またはそのバイオコンジュゲートは、天然のアペリンに比べて半減期が長い。
心筋細胞におけるＡＰＪ受容体の活性化により、ａ）Ｇｉ／Ｇｑ、ＰＬＣ、およびＣａ２＋を介した心収縮性が向上し、ｂ）Ｇｉ、ｐＡｋｔ活性化を介した心臓保護が講じられるが、（他のイノトロープで見られるような）ｃＡＭＰの漸増は伴わない。加えて、内皮細胞におけるＡＰＪアゴニズムによって、動脈の血管は拡張され、これが、左心室の仕事量を軽減することにより、さらに心不全のためになる。まとめると、合成アペリンポリペプチド類似体は、全体としての心機能を向上させ、催不整脈を減少させ、生存利益をもたらし得る。
より最近では、アペリンの糖尿病およびインスリン抵抗性への潜在的な関与に焦点を当てた前臨床研究がいくつか発表されている。アペリンは、１）筋肉、脂肪、および心臓におけるグルコースの取込みを改善することによって血糖レベルを下げ、２）膵臓β細胞をＥＲストレスおよび後続のアポプトーシスから保護し、３）β細胞におけるインスリン分泌を減少させ、４）脂肪組織において、カテコールアミンによって誘発される脂肪分解を調節することが示されている。ｐＡＫＴ経路の活性化は、こうした過程と関連付けられている。
式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つに従うポリペプチドまたは薬学的に許容されるその塩は、遊離の形態または薬学的に許容される塩の形態、またはそのバイオコンジュゲートで、たとえば次の部で示すとおりのｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏ試験において示されるような、価値のある薬理学的特性、たとえば、ＡＰＪ受容体アゴニズム特性を示し、したがって、療法に必要となる。
本発明のポリペプチドまたは薬学的に許容されるその塩、またはそのバイオコンジュゲートは、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、および子癇前症から選択される適応症の治療において有用となり得る。
したがって、別の実施形態として、本発明は、ＡＰＪ受容体活性と関連する疾患を治療するための、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートの使用を提供する。別の実施形態では、療法は、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患から選択される。別の実施形態では、疾患は、前述の一覧から選択され、急性非代償性心不全が適切である。この実施形態のさらに別のサブセットにおいて、本発明は、ＡＰＪ受容体活性と関連する疾患を治療するための医薬の製造における、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートの使用を提供する。
したがって、別の実施形態として、本発明は、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートの、療法における使用を提供する。別の実施形態では、療法は、ＡＰＪ受容体の活性化（アゴニズム）によって治療することのできる疾患から選択される。
別の実施形態では、本発明は、治療上許容される量の式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドまたはそのアミド、塩のエステル、またはそのバイオコンジュゲートの投与を含む、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患の治療方法を提供する。別の実施形態では、疾患は、上述の一覧から選択され、急性非代償性心不全が適切である。
この実施形態のさらに別のサブセットにおいて、本発明は、治療上許容される量の式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートの投与を含む、ＡＰＪ受容体の活性と関連する疾患の治療方法を提供する。
治療に用いることになる、本発明の医薬組成物または組合せの有効量は、たとえば、治療の状況および目的に左右される。当業者には、したがって、治療に相応しい投薬量レベルが、幾分、送達される分子、融合タンパク質変異体を使用する適応症、投与経路、ならびに患者の大きさ（体重、体表面、または臓器サイズ）および状態（年齢および全般的健康状態）に応じて様々となることは理解されよう。それに応じて、臨床医は、最適な治療効果を得るために、投薬量を設定し、投与経路を変更することができる。典型的な投薬量は、上述の要因に応じて、約０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲またはそれ以上となり得る。他の実施形態では、投薬量は、０．１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまで、または１μｇ／ｋｇから約１００ｍｇ／ｋｇまでの範囲となり得る。
投薬の頻度は、使用する製剤中の二重機能タンパク質の薬動学的パラメータに応じて決まる。通常、臨床医は、所望の効果を実現する投薬量に到達するまで組成物を投与する。したがって、組成物は、単一用量として、一定期間にわたる（同量の所望の分子を含有するかどうかは定かでない）２回以上の用量として、または移植デバイスもしくはカテーテルによる連続的な注入として、投与することができる。適切な投薬量のさらなる微調整は、当業者によって型通りになされ、当業者によって型通りに行われる作業領域の範囲内である。適切な投薬量は、適切な用量反応データを使用して突き止めることができる。
本発明のポリペプチドまたはそのバイオコンジュゲートの「治療有効量」という用語は、対象の生物学的または医学的反応、たとえば、症状の改善、状態の緩和、疾患進行の緩慢化もしくは遅延、または疾患の予防などを惹起する、本発明のポリペプチド（またはバイオコンジュゲート）の量を指す。非限定的な一実施形態では、用語「治療有効量」は、対象に投与されたとき、（１）（ｉ）ＡＰＪ受容体の活性化によって改善され、（ｉｉ）ＡＰＪ受容体の活性と関連し、または（ｉｉｉ）ＡＰＪ受容体の異常な活性を特徴とする状態、障害、もしくは疾患、またはその症状を少なくとも部分的に緩和し、抑制し、予防し、かつ／または改善させ、または（２）ＡＰＪ受容体を活性化するのに有効である、本発明のポリペプチドの量を指す。
非限定的な別の実施形態では、用語「治療有効量」は、細胞、組織、非細胞生物材料、または培地に投与されたとき、ＡＰＪ受容体を少なくとも部分的に活性化するのに有効である、本発明のポリペプチドの量を指す。当業者の認めるところとなるとおり、特定の薬剤の、有効である絶対量は、所望の生物学的終点、送達する薬剤、ターゲット組織などの要因に応じて様々となり得る。当業者には、「治療有効量」を、単一用量にして投与してもよいし、または複数回の用量の投与によって実現してもよいことは理解される。たとえば、心不全治療のための薬剤の場合、有効量は、患者の臨床的改善、たとえば、運動耐性／能力の向上、血圧の上昇、体液停留の減少、および／または心臓機能性、たとえば、駆出率、運動能力（消耗までの時間）などの定量試験に関する結果の改善をもたらすのに十分な量でよい。
本明細書で使用するとき、用語「対象」とは、動物を指す。通常、動物は哺乳動物である。対象は、たとえば、霊長類（たとえば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、ラット、マウス、魚、鳥なども指す。ある特定の実施形態では、対象は霊長類である。さらに他の実施形態では、対象はヒトである。
本明細書で使用するとき、用語「抑制する」、「抑制」、または「抑制すること」とは、所与の状態、症状、障害、もしくは疾患の軽減もしくは抑止、または生物学的活性もしくは過程のベースライン活性の有意な低下をいう。
本明細書で使用するとき、任意の疾患または障害を「治療する」、「治療すること」、またはその「治療」という用語は、一実施形態では、疾患または障害を改善させる（すなわち、疾患またはその臨床症状の少なくとも１つの発生を緩慢にし、阻止し、または軽減する）ことをいう。別の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、患者によって識別されない場合があるものを含めて、少なくとも１つの身体的パラメータを緩和し、または改善させることをいう。さらに別の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、疾患または障害を、身体的に（たとえば、識別可能な症状の安定化）、生理的に（たとえば、身体的パラメータの安定化）、または両方において、変調することをいう。さらに別の実施形態では、「治療する」、「治療すること」、または「治療」は、疾患または障害の発症、発生、または進行を防ぎ、または遅らせることをいう。
本明細書で使用するとき、用語「予防する」、「予防すること」、および「予防」とは、療法（たとえば、治療薬）の投与または療法の組合せ（たとえば、治療薬の組合せ）の投与の結果として生じる、対象における障害の１つまたは複数の症状の再発、発症、または発生の予防をいう。
本明細書で使用するとき、対象が、生物学的に、医学的に、または生活の質において治療の恩恵を受けることになる場合、その対象は、そのような治療の「必要がある」。
本明細書で使用するとき、本発明の文脈で（特に特許請求の範囲の文脈で）使用する用語「ａ」、「ａｎ」、「ｔｈｅ」、および同様の用語は、本明細書で別段指摘しない限り、また文脈と明らかに矛盾しない限り、単数と複数の両方を包含すると解釈される。
本明細書に記載の方法はすべて、本明細書で別段指摘しない限り、またはそうでなくとも文脈と明らかに矛盾しない限り、適切などんな順序で実施してもよい。本明細書において提供される、ありとあらゆる例または例示的な言い回し（たとえば、「など」）の使用は、単に本発明をより明解にするためのものであり、別途特許請求する本発明の範囲を限定するものでない。
本発明によるポリペプチドの活性は、以下に記載する次のｉｎ ｖｉｔｒｏ法によって評価することができる。
ｈＡＰＪカルシウムフラックスアッセイ：
３８４ウェルフォーマットにおいて、２５ｕｌ成長培地に、Ｃｈｅｍ−５ ＡＰＪ安定細胞（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ＃ＨＴＳ０６８Ｃ）を１０，０００細胞／ウェルで播き、次いで、３７℃の組織培養インキュベーターにおいて２４時間成長させた。アッセイの１時間前に、２．５ｍＭのプロベネシドを含有する２５ｕｌ／ウェルのＦＬＩＰＲ Ｃａｌｃｉｕｍ ４色素（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｄｅｖｉｃｅｓ Ｒ８１４２）を加え、３７℃の組織培養インキュベーターにおいて細胞を１時間インキュベートした。ペプチドをＨＢＳＳ、ＨＥＰＥＳ、および０．１％ＢＳＡ緩衝液に可溶化し、三通りに５０ｕＭから５ｐＭまで１０倍ずつ連続希釈した。ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａを使用して、色素を有する細胞にペプチドを加えた（１：５、１０ｕＭ〜１ｐＭの範囲の最終ペプチド濃度にする）。細胞の内側のＦＬＩＰＲ色素は、カルシウムに結合後に蛍光を発光し、細胞の外側からの蛍光は遮蔽された。ＦＬＩＰＲ Ｔｅｔｒａにおいて４７０〜４９５の励起波長および５１５〜５７５の発光波長を使用して、蛍光を測定した。読取りは、ペプチドを加える１０秒前に開始して、合計３分間行った。最大−最小値を算出し、各ペプチド濃度に対してプロットし、ＧｒａｐｈＰａｄ ｐｒｉｓｍソフトウェアを使用して、ペプチドによるカルシウムフラックス刺激について、曲線変曲点におけるＥＣ５０値を算出した。
血漿安定性アッセイ：
材料：
作業溶液：１ｍｇ／ｍＬの試験物をＭｉｌｌｉ−Ｑ水中に調製する。
抽出溶液：０．１％のギ酸および４００ｎｇ／ｍＬのグリブリドを含有するメタノール：アセトニトリル：水（１：１：１）
血漿：Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＬＬＣ（ニューヨーク州Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ）から購入した雄のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット血漿（ヘパリンナトリウム添加）
全血：Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＬＬＣ（ニューヨーク州Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ）から購入した雄Ｓｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙ全血（ヘパリンナトリウム添加）
肺ホモジネート：Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＬＬＣ（ニューヨーク州Ｌｉｖｅｒｐｏｏｌ）から雄のＳｐｒａｇｕｅ Ｄａｗｌｅｙラットの肺を購入した。肺は、５倍体積の１倍ＰＢＳを加えた後、ポリトロンホモジナイザーを使用してホモジナイズした。ホモジネートを４℃にて９０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。上清を３０００ｒｐｍで３０分間再び遠心分離して、澄んだ上清を作った。タンパク質濃度は、市販のキット（Ｐｉｅｒｃｅ、Ｔｈｅｒｍｏ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）を使用して求めた。
サンプル調製手順：（ペプチド）
試験物は、次の生物学的材料、すなわち、ヘパリン処置ラット血漿、ヘパリン処置ラット全血、または肺ホモジネートのうちの１つにおいて調製した。血漿および全血サンプルは、９９５ｕＬのラット血漿または全血に１ｍｇ／ｍＬの作業溶液５ｕＬを加えることにより、５０００ｎｇ／ｍＬで調製した。肺ホモジネートサンプルは、肺ホモジネートをリン酸緩衝溶液（ＰＢＳ）で１ｍｇ／ｍｌのタンパク質濃度に希釈した後、５ｕＬの作業溶液を加えて、９９５ｕＬの希釈された肺ホモジネートとすることにより調製した。サンプルは、水浴インキュベーターにおいて、穏やかに振盪（６５〜７５ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベートした。０分、５分、１５分、３０分、６０分、１２０分、および２４０分の時点で、インキュベートサンプルの２５ｕＬのアリコートを９６ウェルプレートに移し、１５０ｕＬの抽出溶液を使用して、直ちにタンパク質を沈殿させた。インキュベート実験が完了した後、サンプルプレートを４℃にて４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離した。その後、ピペット操作装置（Ｔｅｃａｎ Ｔｅｍｏ）を使用して、上清を別のプレートに移し、すべてのサンプルに５０ｕＬの水を加えた。プレートは、ＬＣ−ＭＳ分析の前にボルテックスした。
サンプル調製手順（コンジュゲート）
１ｍｇ／ｍＬの作業溶液５ｕＬをラット血漿４９５ｕＬに加えることにより、試験物を５０，０００ｎｇ／ｍＬで調製する。サンプルは、水浴インキュベーターにおいて、穏やかに振盪（６５〜７５ｒｐｍ）しながら３７℃でインキュベートする。０時間、０．５時間、１時間、２時間、４時間、６時間、および２４時間の時点で、インキュベートサンプルの５０ｕＬのアリコートを９６ウェルプレートに移し、４０ｍＭのＴＣＥＰ（トリス（２−カルボキシエチル）ホスフィン）１００ｕＬを各サンプルに加える。反応混合物を３７℃で１時間インキュベートする。反応が完了した後、３００ｕＬのアセトニトリルを使用して、タンパク質を沈殿させる。サンプルプレートを４℃にて４０００ｒｐｍで１０分間遠心分離する。その後、ピペット操作装置（Ｔｅｃａｎ Ｔｅｍｏ）を使用して、１２５ｕＬの上清を別のプレートに移し、すべてのサンプルに５０ｕＬの水を加える。プレートは、ＬＣ−ＭＳ分析の前にボルテックスする。
ＬＣ−ＭＳ安定性分析のサンプル
ＨＰＬＣ：オートサンプラーを備えたＡｇｉｌｅｎｔ １２９０ ＨＰＬＣ
カラム：ＭＡＣ−ＭＯＤ ＡＣＥ Ｃ１８、３μｍ、３０ｍｍ×内径２．１ｍｍ
移動相Ａ：０．１％のギ酸アセトニトリル溶液
移動相Ｂ：０．１％のギ酸水溶液
勾配プログラム：
質量分析計：Ａｇｉｌｅｎｔ Ｑ−ＴＯＦ６５３０
データ取得モード：１００〜１０００ｍ／ｚの質量範囲での完全走査
データ取得および分析ソフトウェア：ＭａｓｓＨｕｎｔｅｒ
データ分析：
安定性アッセイ：安定性半減期（ｔ１／２）の値は、各時点におけるピーク面積を、初期（ｔ＝０）ピーク面積を基準とした残存パーセントに変換することにより求めた。
残存パーセント＝１００×（サンプルピーク面積）÷（ｔ＝０ピーク面積）
残存パーセント値の自然対数を算出し、サンプル時間に対してプロットした（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）。この直線の傾きｋを、線形回帰によって求めた（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ）。
次いで、安定性半減期を、式ｔ１／２＝０．６９３÷ｋによって算出した。
代替活性ベースの血漿安定性アッセイ：
次の変更を加えて、上述のカルシウムフラックスプロトコールに従った。ペプチドは、ここでも５％ラット血漿（Ｂｉｏｒｅｃｌａｍａｔｉｏｎ ＃ＲＡＴＰＬＮＡＨＰ−Ｍ、ヘパリンＮａ処置したもの）と共にインキュベートした。３７℃の組織培養インキュベーターでインキュベートした後、ｔ０およびｔ２４時間の時点で読み取った。分単位のペプチド血漿半減期を、次の計算によって推定した。
１）ＬＮ（（ｔ０時点のＥＣ５０）／（ｔ２４時間時点のＥＣ５０））
２）上の値の傾きを算出
３）ｔ１／２＝０．６９３／（傾き２）
（上述のとおりの）試験アッセイを使用すると、本発明のポリペプチドは、以下に示す表２および表３に従う有効性および安定性を示した。
本発明のポリペプチドまたはそのバイオコンジュゲートは、アペリン−１３またはｐｙｒ−１−アペリン−１３と同様のＡＰＪ受容体効力を備え得る。一実施形態では、本発明のポリペプチドまたはそのバイオコンジュゲートは、ＥＣ５０が１００ｎＭ未満である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドまたはそのバイオコンジュゲートは、ＥＣ５０が５０ｎＭ未満、好ましくは２５ｎＭ未満、より好ましくは１５ｎＭ未満である。さらに別の実施形態では、本発明のポリペプチドまたはそのバイオコンジュゲートは、ＥＣ５０が１０ｎＭ未満である。
本発明のポリペプチドまたはそのバイオコンジュゲートは、アペリン−１３またはｐｙｒ−１−アペリン−１３に優る血漿安定性を有することもある。一実施形態では、血漿安定性の改善は、少なくとも２倍である。一実施形態では、本発明のポリペプチドまたはそのバイオコンジュゲートは、血漿安定性が少なくとも３０分である。別の実施形態では、本発明のポリペプチドまたはそのバイオコンジュゲートは、血漿安定性が、少なくとも６０分、または少なくとも８０分、好ましくは少なくとも１００分、より好ましくは少なくとも１５０分である。
本発明のポリペプチドまたはそのバイオコンジュゲートは、他の１種または複数の治療薬と同時に投与してもよいし、またはその前もしくは後に投与してもよい。本発明のポリペプチドまたはバイオコンジュゲートは、同じもしくは異なる投与経路で別々に投与してもよいし、または他の薬剤と同じ医薬組成物にして一緒に投与してもよい。
一実施形態では、本発明は、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドまたはそのアミド、塩のエステル、またはそのバイオコンジュゲートと、少なくとも１種の他の治療薬とを含む、療法において同時、別個、または順次使用するための一体型調製物としての製品を提供する。一実施形態では、療法は、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す疾患または状態の治療である。
一体型調製物として提供される製品としては、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドまたはそのアミド、塩のエステル、またはそのバイオコンジュゲートと、他の治療薬（複数可）とを同じ医薬組成物中に一緒に、または式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートと、他の治療薬（複数可）とを別個の形態で、たとえば、キットの形で含む組成物が挙げられる。
一実施形態では、本発明は、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートと、別の治療薬（複数可）とを含む医薬組成物を提供する。場合により、医薬組成物は、上述のとおりの薬学的に許容される賦形剤を含んでもよい。
一実施形態では、本発明は、２種以上の別個の医薬組成物を含み、その少なくとも１種が、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートを含有する、キットを提供する。一実施形態では、キットは、容器、隔てられたボトル、分包ホイルなどの、前記組成物を別個に保持する手段を含む。このようなキットの一例は、錠剤、カプセル剤などの包装に一般に使用されるようなブリスターパックである。
本発明のキットは、たとえば経口と非経口の、異なる剤形を投与する、別個の組成物を異なる投薬間隔で投与する、または別個の組成物を互いに合わせて漸増するのに使用することもできる。服薬遵守を支援するために、本発明のキットは通常、投与の説明書を含む。
本発明の併用療法では、本発明のペプチドまたはバイオコンジュゲートと他の治療薬は、同じまたは異なる製造業者によって製造および／または製剤化されたものでよい。さらに、本発明のペプチドまたはバイオコンジュゲートと他の治療薬は、（ｉ）（たとえば、本発明の化合物と他の治療薬を含むキットの場合において）組合せ製品が医師に渡る前に、（ｉｉ）投与のすぐ前に医師自身によって（または医師の指導のもとで）、（ｉｉｉ）たとえば、本発明のポリペプチドまたはバイオコンジュゲートと他の治療薬が順次投与される際、患者自身で、併用療法に一体化されるものでよい。
したがって、本発明は、医薬が別の治療薬との投与用に調製される、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態を治療するための、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートの使用を提供する。本発明はまた、医薬が、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートと投与される、アペリン受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態を治療するための別の治療薬の使用も提供する。
本発明はまた、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートが、別の治療薬との投与用に調製される、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態の治療方法において使用するための、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドまたは薬学的に許容されるその塩、またはそのバイオコンジュゲートを提供する。本発明はまた、他の治療薬が、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートとの投与用に調製される、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態の治療方法において使用するための、別の治療薬を提供する。本発明はまた、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートを別の治療薬と投与する、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態の治療方法において使用するための、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートを提供する。本発明はまた、他の治療薬を式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートと投与する、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態の治療方法において使用するための、別の治療薬を提供する。
本発明はまた、患者が、別の治療薬で（たとえば、２４時間以内に）予め治療を受けている、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態を治療するための、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートの使用を提供する。本発明はまた、患者が、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートで（たとえば、２４時間以内に）予め治療を受けている、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または状態を治療するための、別の治療薬の使用を提供する。
一実施形態では、他の治療薬は、イノトロープ、βアドレナリン性受容体遮断薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）、エンドセリン拮抗薬、レニン阻害薬、利尿薬、ＡｐｏＡ−Ｉ模倣薬、抗糖尿病薬、抗肥満薬（obesity-reducing agent）、アルドステロン受容体遮断薬、エンドセリン受容体遮断薬、アルドステロンシンターゼ阻害薬（ＡＳＩ）、ＣＥＴＰ阻害薬、抗凝血薬、リラキシン、ＢＮＰ（ネシリチド）、およびＮＥＰ阻害薬から選択される。
第２の薬剤または治療と「組み合わせて」という用語は、本発明のポリペプチドまたはバイオコンジュゲート（たとえば、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つに従うポリペプチド、または本明細書に別な形で記載するポリペプチド）を第２の薬剤または治療と同時投与すること、最初に本発明の化合物を投与した後、第２の薬剤または治療を投与すること、および最初に第２の薬剤または治療を投与した後、本発明のペプチドからバイオコンジュゲートを投与することを包含する。
用語「第２の薬剤」は、本明細書に記載の疾患または障害、たとえば、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す障害または疾患、たとえば、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、および子癇前症の症状を治療、予防、または軽減することが当業界で知られている任意の薬剤を包含する。
第２の薬剤の例としては、イノトロープ、βアドレナリン性受容体遮断薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）、エンドセリン拮抗薬、レニン阻害薬、利尿薬、ＡｐｏＡ−Ｉ模倣薬、抗糖尿病薬、抗肥満薬、アルドステロン受容体遮断薬、エンドセリン受容体遮断薬、アルドステロンシンターゼ阻害薬（ＡＳＩ）、ＣＥＴＰ阻害薬、抗凝血薬、リラキシン、ＢＮＰ（ネシリチド）、および／またはＮＥＰ阻害薬が挙げられる。
本明細書で使用するイノトロープとしては、たとえば、ドブタミン、イソプロテレノール、ミルリノン、アミリノン（amirinone）、レボシメンダン、エピネフリン、ノルエピネフリン、イソプロテレノール、およびジゴキシンが挙げられる。
本明細書で使用するβアドレナリン性受容体遮断薬としては、たとえば、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、カルテオロール、メトプロロール、ナドロール、プロプラノロール、ソタロール、およびチモロールが挙げられる。
本明細書で使用する抗凝血薬としては、ダルテパリン、ダナパロイド、エノキサパリン、ヘパリン、チンザパリン、ワルファリンが挙げられる。
用語「ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬」（β−ヒドロキシ−β−メチルグルタリル−補酵素Ａ還元酵素阻害薬とも呼ばれる）は、血中コレステロールを始めとする脂質レベルを下げるのに使用することのできる活性薬剤を包含する。例としては、アトルバスタチン、セリバスタチン、コンパクチン、ダルバスタチン、ジヒドロコンパクチン、フルインドスタチン（fluindostatin）、フルバスタチン、ロバスタチン、ピタバスタチン、メバスタチン、プラバスタチン、ロスバスタチン、リバスタチン（rivastatin）、シンバスタチン、およびベロスタチン（velostatin）、またはこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
用語「ＡＣＥ阻害薬」（アンジオテンシン変換酵素阻害薬とも呼ばれる）は、アンジオテンシンＩをアンジオテンシンＩＩにする酵素的分解を妨げる分子を包含する。このような化合物は、血圧の調節およびうっ血性心不全の治療に使用することができる。例としては、アラセプリル、ベナゼプリル、ベナゼプリラート、カプトプリル、セロナプリル（ceronapril）、シラザプリル、デラプリル、エナラプリル、エナプリラート（enaprilat）、ホシノプリル、イミダプリル、リシノプリル、モエキシプリル、モベルトプリル（moveltopril）、ペリンドプリル、キナプリル、ラミプリル、スピラプリル、テモカプリル、およびトランドラプリル、またはこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
用語「エンドセリン拮抗薬」は、ボセンタン（ＥＰ５２６７０８Ａを参照のこと）、テゾセンタン（ＷＯ９６／１９４５９を参照のこと）、またはこれらの薬学的に許容される塩を包含する。
用語「レニン阻害薬」は、ジテキレン（ditekiren）（化学名：［１Ｓ−［１Ｒ＊，２Ｒ＊，４Ｒ＊（１Ｒ＊，２Ｒ＊）］］−１−［（１，１−ジメチルエトキシ）カルボニル］−Ｌ−プロリル−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［２−ヒドロキシ−５−メチル−１−（２−メチルプロピル）−４−［［［２−メチル−１−［［（２−ピリジニルメチル）アミノ］カルボニル］ブチル］アミノ］カルボニル］ヘキシル］−Ｎ−α−メチル−Ｌ−ヒスチジンアミド）；テルラキレン（化学名：［Ｒ−（Ｒ＊，Ｓ＊）］−Ｎ−（４−モルホリニルカルボニル）−Ｌ−フェニルアラニル−Ｎ−［１−（シクロヘキシルメチル）−２−ヒドロキシ−３−（１−メチルエトキシ）−３−オキソプロピル］−Ｓ−メチル−Ｌ−システイネアミド）；アリスキレン（化学名：（２Ｓ，４Ｓ，５Ｓ，７Ｓ）−５−アミノ−Ｎ−（２−カルバモイル−２，２−ジメチルエチル）−４−ヒドロキシ−７−｛［４−メトキシ−３−（３−メトキシプロポキシ）フェニル］メチル｝−８−メチル−２−（プロパン−２−イル）ノナンアミド）およびザンキレン（化学名：［１Ｓ−［１Ｒ＊［Ｒ＊（Ｒ＊）］，２Ｓ＊，３Ｒ＊］］−Ｎ−［１−（シクロヘキシルメチル）−２，３−ジヒドロキシ−５−メチルヘキシル］−α−［［２−［［（４−メチル−１−ピペラジニル）スルホニル］メチル］−１−オキソ−３−フェニルプロピル］−アミノ］−４−チアゾールプロパンアミド）、もしくはこれらの塩酸塩、またはＳｐｅｅｄｅｌが開発したＳＰＰ６３０、ＳＰＰ６３５、およびＳＰＰ８００、または式（Ａ）および（Ｂ）：
のＲＯ６６−１１３２およびＲＯ６６−１１６８、または
これらの薬学的に許容される塩を包含する。
用語「アリスキレン」は、詳細に定義しない場合、遊離塩基とその塩の両方、特に薬学的に許容されるその塩、最も好ましくはその半フマル酸塩であると理解される。
用語「カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）」は、ジヒドロピリジン（ＤＨＰ）および非ＤＨＰ（たとえば、ジルチアゼム型およびベラパミル型ＣＣＢ）を包含する。例としては、アムロジピン、ベプリジル、ジルチアゼム、フェロジピン、リオシジン（ryosidine）、イスラジピン、ラシジピン、ニカルジピン、ニフェジピン、ニグルジピン、ニルジピン（niludipine）、ニモジピン、ニソルジピン、ニトレンジピン、ベラパミル、およびニバルジピン（nivaldipine）が挙げられ、フルナリジン、プレニラミン、ジルチアゼム、フェンジリン、ガロパミル、ミベフラジル、アニパミル（anipamil）、チアパミル、およびベラパミル、またはこれらの薬学的に許容される塩からなる群から選択される代表的非ＤＨＰであることが好ましい。ＣＣＢは、降圧薬、抗狭心症薬、または抗不整脈薬として使用することができる。
用語「利尿薬」は、チアジド誘導体（たとえば、クロロチアジド、ヒドロクロロチアジド、メチルクロチアジド（methylclothiazide）、およびクロロタリドン（chlorothalidon））を包含する。
用語「ＡｐｏＡ−Ｉ模倣薬」は、Ｄ４Ｆペプチド（たとえば、式Ｄ−Ｗ−Ｆ−Ｋ−Ａ−Ｆ−Ｙ−Ｄ−Ｋ−Ｖ−Ａ−Ｅ−Ｋ−Ｆ−Ｋ−Ｅ−Ａ−Ｆ）を包含する。
アンジオテンシンＩＩ受容体拮抗薬または薬学的に許容されるその塩は、アンジオテンシンＩＩ受容体のＡＴ１受容体サブタイプに結合するが、結果として受容体を活性化しない活性成分であると理解される。ＡＴ１受容体が抑制される結果として、こうした拮抗薬は、たとえば、降圧薬として、またはうっ血性心不全の治療に用いることができる。
ＡＴ１受容体拮抗薬のクラスは、構造上の特色が異なっている化合物を含み、実用上好ましいのは、非ペプチド性化合物である。たとえば、バルサルタン、ロサルタン、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、サプリサルタン（saprisartan）、タソサルタン、テルミサルタン、次式
のＥ−１４７７という呼称の化合物、次式
のＳＣ−５２４５８という呼称の化合物、および次式
のＺＤ−８７３１という呼称の化合物、または、各場合において、薬学的に許容されるその塩からなる群から選択される化合物を挙げることができる。
好ましいＡＴ１受容体拮抗薬は、カンデサルタン、エプロサルタン、イルベサルタン、ロサルタン、テルミサルタン、バルサルタンである。他にも好ましいのは、市販されている薬剤であり、最も好ましいのは、バルサルタンまたは薬学的に許容されるその塩である。
用語「抗糖尿病薬」は、膵臓細胞からのインスリンの分泌を促進するインスリン分泌増強剤を包含する。例としては、ビグアナイド誘導体（たとえば、メトホルミン）、スルホニル尿素（ＳＵ）（たとえば、トルブタミド、クロルプロパミド、トラザミド、アセトヘキサミド、４−クロロ−Ｎ−［（１−ピロリジニルアミノ）カルボニル］−ベンゼンスルホンアミド（グリコピルアミド（glycopyramide））、グリベンクラミド（グリブリド）、グリクラジド、１−ブチル−３−メタニリル尿素、カルブタミド（carbutamide）、グリボヌリド（glibonuride）、グリピジド、グリキドン、グリソキセピド、グリブチアゾール（glybuthiazole）、グリブゾール（glibuzole）、グリヘキサミド（glyhexamide）、グリミジン、グリピンアミド（glypinamide）、フェンブタニド（phenbutanide）、およびトリルシクラミド（tolylcyclamide））、またはこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。別の例としては、フェニルアラニン誘導体（たとえば、式
のナテグリニド［Ｎ−（ｔｒａｎｓ−４−イソプロピルシクロヘキシルカルボニル）−Ｄ−フェニルアラニン］（ＥＰ１９６２２２およびＥＰ５２６１７１を参照のこと）、レパグリニド［（Ｓ）−２−エトキシ−４−｛２−［［３−メチル−１−［２−（１−ピペリジニル）フェニル］ブチル］アミノ］−２−オキソエチル｝安息香酸］（ＥＰ５８９８７４、ＥＰ１４７８５０Ａ２、詳細には、６１頁の実施例１１、およびＥＰ２０７３３１Ａ１を参照のこと）、カルシウム（２Ｓ）−２−ベンジル−３−（ｃｉｓ−ヘキサヒドロ−２−イソインドリンリカルボニル）−プロピオネート二水和物（たとえば、ミチグリニド（ＥＰ５０７５３４を参照のこと））、およびグリメピリド（ＥＰ３１０５８を参照のこと）が挙げられる。
本発明のペプチドおよびポリペプチドと組み合わせて使用することのできる第２の薬剤の別の例として、ＤＰＰ−ＩＶ阻害薬、ＧＬＰ−１およびＧＬＰ−１アゴニストが挙げられる。
ＤＰＰ−ＩＶは、ＧＬＰ−１の不活性化を担う。より詳細には、ＤＰＰ−ＩＶは、ＧＬＰ−１受容体アンタゴニストを発生させ、それによってＧＬＰ−１に対する生理的反応が短縮される。ＧＬＰ−１は、膵臓のインスリン分泌の主要な刺激物質であり、グルコース処理に直接有益な影響を及ぼす。
ＤＰＰ−ＩＶ（ジペプチジルペプチダーゼＩＶ）阻害薬は、ペプチド性でも、または好ましくは、非ペプチド性でもよい。ＤＰＰ−ＩＶ阻害薬は、各場合につき、たとえば、ＷＯ９８／１９９９８、ＤＥ１９６１６４８６Ａ１、ＷＯ００／３４２４１、およびＷＯ９５／１５３０９において、各場合につき、特に、化合物請求項および作業実施例の最終生成物において全般かつ詳細に開示されており、最終生成物、医薬調製物、および特許請求の範囲の主題は、これら刊行物を参照することにより、本明細書に援用される。好ましいのは、それぞれ、ＷＯ９８／１９９９８の実施例３およびＷＯ００／３４２４１の実施例１において詳細に開示されている化合物である。
ＧＬＰ−１（グルカゴン様ペプチド１）は、たとえば、W.E. SchmidtらによるDiabetologia, 28, 1985, 704-707およびＵＳ５，７０５，４８３に記載されているインスリン分泌性タンパク質である。
用語「ＧＬＰ−１アゴニスト」は、特にＵＳ５，１２０，７１２、ＵＳ５，１１８６６６、ＵＳ５，５１２，５４９、ＷＯ９１／１１４５７、およびC. OrskovらによるJ. Biol. Chem. 264 (1989) 12826において開示されているＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２の変異体および類似体を包含する。別の例としては、化合物中ＧＬＰ−１（７−３６）ＮＨ２分子の第３７位においてＡｒｇ３６のカルボキシ末端側アミド官能基がＧｌｙで置換されているＧＬＰ−１（７−３７）、ならびにＧＬＮ９−ＧＬＰ−１（７−３７）、Ｄ−ＧＬＮ９−ＧＬＰ−１（７−３７）、アセチルＬＹＳ９−ＧＬＰ−１（７−３７）、ＬＹＳ１８−ＧＬＰ−１（７−３７）、特にＧＬＰ−１（７−３７）ＯＨ、ＶＡＬ８−ＧＬＰ−１（７−３７）、ＧＬＹ８−ＧＬＰ−１（７−３７）、ＴＨＲ８−ＧＬＰ−１（７−３７）、ＭＥＴ８−ＧＬＰ−１（７−３７）、および４−イミダゾプロピオニル−ＧＬＰ−１を含めたその変異体および類似体が挙げられる。GreigらによるDiabetologia 1999, 42, 45-50に記載されているＧＬＰアゴニスト類似体エキセンディン−４も、特に好まれる。
定義「抗糖尿病薬」には、損なわれたインスリン受容体機能を回復させて、インスリン抵抗性を減らし、その結果としてインスリン感受性を増強するインスリン感受性増強剤も含まれる。例としては、血糖降下性チアゾリジンジオン誘導体（たとえば、グリタゾン、（Ｓ）−（（３，４−ジヒドロ−２−（フェニル−メチル）−２Ｈ−１−ベンゾピラン−６−イル）メチル−チアゾリジン−２，４−ジオン（エングリタゾン）、５−｛［４−（３−（５−メチル−２−フェニル−４−オキサゾリル）−１−オキソプロピル）−フェニル］−メチル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（ダルグリタゾン）、５−｛［４−（１−メチル−シクロヘキシル）メトキシ）−フェニル］メチル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（シグリタゾン）、５−｛［４−（２−（１−インドリル）エトキシ）フェニル］メチル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（ＤＲＦ２１８９）、５−｛４−［２−（５−メチル−２−フェニル−４−オキサゾリル）−エトキシ）］ベンジル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（ＢＭ−１３．１２４６）、５−（２−ナフチルスルホニル）−チアゾリジン−２，４−ジオン（ＡＹ−３１６３７）、ビス｛４−［（２，４−ジオキソ−５−チアゾリジニル）メチル］フェニル｝メタン（ＹＭ２６８）、５−｛４−［２−（５−メチル−２−フェニル−４−オキサゾリル）−２−ヒドロキシエトキシ］ベンジル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（ＡＤ−５０７５）、５−［４−（１−フェニル−１−シクロプロパンカルボニルアミノ）−ベンジル］−チアゾリジン−２，４−ジオン（ＤＮ−１０８）５−｛［４−（２−（２，３−ジヒドロインドール−１−イル）エトキシ）フェニル］メチル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン、５−［３−（４−クロロ−フェニル］）−２−プロピニル］−５−フェニルスルホニル）チアゾリジン−２，４−ジオン、５−［３−（４−クロロフェニル］）−２−プロピニル］−５−（４−フルオロフェニル−スルホニル）チアゾリジン−２，４−ジオン、５−｛［４−（２−（メチル−２−ピリジニル−アミノ）−エトキシ）フェニル］メチル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（ロシグリタゾン）、５−｛［４−（２−（５−エチル−２−ピリジル）エトキシ）フェニル］−メチル｝チアゾリジン−２，４−ジオン（ピオグリタゾン）、５−｛［４−（（３，４−ジヒドロ−６−ヒドロキシ−２，５，７，８−テトラメチル−２Ｈ−１−ベンゾピラン−２−イル）メトキシ）−フェニル］−メチル｝−チアゾリジン−２，４−ジオン（トログリタゾン）、５−［６−（２−フルオロ−ベンジルオキシ）ナフタレン−２−イルメチル］−チアゾリジン−２，４−ジオン（ＭＣＣ５５５）、５−｛［２−（２−ナフチル）−ベンゾオキサゾール−５−イル］−メチル｝チアゾリジン−２，４−ジオン（Ｔ−１７４）および５−（２，４−ジオキソチアゾリジン−５−イルメチル）−２−メトキシ−Ｎ−（４−トリフルオロメチル−ベンジル）ベンズアミド（ＫＲＰ２９７））が挙げられる。
これ以外の抗糖尿病薬としては、タンパク質チロシンホスファターゼ（ＰＴＰアーゼ）の阻害薬、抗糖尿病性非小分子模倣化合物、グルタミン−フルクトース−６−リン酸アミドトランスフェラーゼ（ＧＦＡＴ）の阻害薬のような、インスリンシグナル伝達経路モジュレーター；グルコース−６−ホスファターゼ（Ｇ６Ｐアーゼ）の阻害薬、フルクトース−１，６−ビスホスファターゼ（Ｆ−１，６−Ｂｐアーゼ）の阻害薬、グリコーゲンホスホリラーゼ（ＧＰ）の阻害薬、グルカゴン受容体拮抗薬、ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）の阻害薬のような、肝臓グルコース産生の調節不全に影響を及ぼす化合物；ピルビン酸脱水素酵素キナーゼ（ＰＤＨＫ）阻害薬；胃内容排出の阻害薬；インスリン；ＧＳＫ−３の阻害薬；レチノイドＸ受容体（ＲＸＲ）アゴニスト；β−３ＡＲのアゴニスト；脱共役タンパク質（ＵＣＰ）のアゴニスト；非グリタゾン型ＰＰＡＲγアゴニスト；ＰＰＡＲα／ＰＰＡＲγ二重アゴニスト；抗糖尿病性含バナジウム化合物；グルカゴン様ペプチド１（ＧＬＰ−１）やＧＬＰ−１アゴニストのようなインクレチンホルモン；β細胞イミダゾリン受容体アンタゴニスト；ミグリトール；α２−アドレナリンアンタゴニスト；ならびにこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。
一実施形態では、本発明は、治療有効量の式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つの定義に従うポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートと、アセブトロール、アテノロール、ベタキソロール、ビソプロロール、メトプロロール、ナドロール、プロプラノロール、ソタロール、チモロールなどのβ−アドレナリン受容体遮断薬；ＡＴ１遮断薬などのアンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト；ＤＰＰＩＶ阻害薬（たとえば、ビルダグリプチン）やＧＬＰ１ペプチドアゴニストなどの抗糖尿病薬から選択される１種または複数の治療活性薬剤とを含む組合せ、詳細には医薬的組合せを提供する。
用語「抗肥満薬」は、リパーゼ阻害薬（たとえば、オーリスタット）および食欲抑制薬（たとえば、シブトラミンおよびフェンテルミン）を包含する。
アルドステロンシンターゼ阻害薬または薬学的に許容されるその塩は、アルドステロンの産生を抑制する特性を有する活性成分であると理解される。アルドステロンシンターゼ（ＣＹＰ１１Ｂ２）は、副腎皮質におけるアルドステロン産生の最後のステップ、すなわち、１１−デオキシコルチコステロンのアルドステロンへの変換を触媒する、ミトコンドリアのシトクロムＰ４５０酵素である。いわゆるアルドステロンシンターゼ阻害薬によるアルドステロン産生の抑制は、低カリウム血症、高血圧、うっ血性心不全、心房細動、または腎不全の治療に奏効する変異形態であることが知られている。このようなアルドステロンシンターゼ抑制活性は、当業者によって、標準のアッセイ（たとえば、ＵＳ２００７／００４９６１６）に従い、容易に見極められる。
アルドステロンシンターゼ阻害薬のクラスは、ステロイド性および非ステロイド性両方のアルドステロンシンターゼ阻害薬を含み、後者が最も好ましい。
市販品として入手可能なアルドステロンシンターゼ阻害薬または保健当局によって承認されているアルドステロンシンターゼ阻害薬が好ましい。
アルドステロンシンターゼ阻害薬のクラスは、構造上の特色が異なっている化合物を含む。非ステロイド性アルドステロンシンターゼ阻害薬の例は、式
のファドロゾールの塩酸塩（米国特許４６１７３０７および４８８９８６１）の（＋）鏡像異性体、または適切な場合、薬学的に許容されるその塩である。
前記組合せにおいて有用なアルドステロンシンターゼ阻害薬は、たとえば、ＵＳ２００７／００４９６１６において、特に、化合物請求項および作業実施例の最終生成物において全般かつ詳細に開示されている化合物および類似体であり、最終生成物、医薬調製物、および特許請求の範囲の主題は、この刊行物を参照することにより、本明細書に援用される。本発明における使用に適する好ましいアルドステロンシンターゼ阻害薬としては、限定はせず、４−（６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−イル）−３−メチルベンゾニトリル；５−（２−クロロ−４−シアノフェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−カルボン酸（４−メトキシベンジル）メチルアミド；４’−フルオロ−６−（６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］アゼピン−５−イル）ビフェニル−３−カルボニトリル；５−（４−シアノ−２−メトキシフェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−カルボン酸ブチルエステル；４−（６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−イル）−２−メトキシベンゾニトリル；５−（２−クロロ−４−シアノフェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−カルボン酸４−フルオロベンジルエステル；５−（４−シアノ−２−トリフルオロメトキシフェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−カルボン酸メチルエステル；５−（４−シアノ−２−メトキシフェニル）−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−カルボン酸２−イソプロポキシエチルエステル；４−（６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−イル）−２−メチルベンゾニトリル；４−（６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−イル）−３−フルオロベンゾニトリル；４−（６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−イル）−２−メトキシベンゾニトリル；３−フルオロ−４−（７−メチレン−６，７−ジヒドロ−５Ｈ−ピロロ［１，２−ｃ］イミダゾール−５−イル）ベンゾニトリル；ｃｉｓ−３−フルオロ−４−［７−（４−フルオロ−ベンジル）−５，６，７，８−テトラヒドロ−イミダゾ［１，５−ａ］ピリジン−５−イル］ベンゾニトリル；４’−フルオロ−６−（９−メチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］アゼピン−５−イル）ビフェニル−３−カルボニトリル；４’−フルオロ−６−（９−メチル−６，７，８，９−テトラヒドロ−５Ｈ−イミダゾ［１，５−ａ］アゼピン−５−イル）ビフェニル−３−カルボニトリル、または各場合において、その（Ｒ）もしくは（Ｓ）鏡像異性体、または適切な場合、薬学的に許容されるその塩が挙げられる。
用語アルドステロンシンターゼ阻害薬は、ＷＯ２００８／０７６８６０、ＷＯ２００８／０７６３３６、ＷＯ２００８／０７６８６２、ＷＯ２００８／０２７２８４、ＷＯ２００４／０４６１４５、ＷＯ２００４／０１４９１４、ＷＯ２００１／０７６５７４で開示されている化合物および類似体も包含する。
さらに、アルドステロンシンターゼ阻害薬は、米国特許出願ＵＳ２００７／０２２５２３２、ＵＳ２００７／０２０８０３５、ＵＳ２００８／０３１８９７８、ＵＳ２００８／００７６７９４、ＵＳ２００９／００１２０６８、ＵＳ２００９００４８２４１、およびＰＣＴ出願ＷＯ２００６／００５７２６、ＷＯ２００６／１２８８５３、ＷＯ２００６１２８８５１、ＷＯ２００６／１２８８５２、ＷＯ２００７０６５９４２、ＷＯ２００７／１１６０９９、ＷＯ２００７／１１６９０８、ＷＯ２００８／１１９７４４、および欧州特許出願ＥＰ１８８６６９５において開示されている化合物および類似体も包含する。本発明における使用に適する好ましいアルドステロンシンターゼ阻害薬として、限定はせず、Ｓｐｅｅｄｅｌが開発した８−（４−フルオロフェニル）−５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ１［１，４１オキサジン；４−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）−２−フルオロベンゾニトリル；４−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）−２，６−ジフルオロベンゾニトリル；４−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）−２−メトキシベンゾニトリル；３−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）ベンゾニトリル；４−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）フタロニトリル；４−（８−（４−シアノフェニル）−５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）ベンゾニトリル；４−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）ベンゾニトリル；４−（５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン−８−イル）ナフタレン−１−カルボニトリル；８−［４−（１Ｈ−テトラゾール−５−イル）フェニル１−５，６−ジヒドロ−８Ｈ−イミダゾ［５，１−ｃ］［１，４］オキサジン、または各場合において、その（Ｒ）もしくは（Ｓ）鏡像異性体、または適切な場合、薬学的に許容されるその塩が挙げられる。
前記組合せにおいて有用なアルドステロンシンターゼ阻害薬は、たとえば、ＷＯ２００９／１５６４６２およびＷＯ２０１０／１３０７９６において、特に、化合物請求項および作業実施例の最終生成物において全般かつ詳細に開示されている化合物および類似体、最終生成物、医薬調製物、および特許請求の範囲の主題である。本発明における組合せに適する好ましいアルドステロンシンターゼ阻害薬としては、３−（６−フルオロ−３−メチル−２−ピリジン−３−イル−１Ｈ−インドール−１−イルメチル）−ベンゾニトリルヒドロクロリド、１−（４−メタンスルホニル−ベンジル）−３−メチル−２−ピリジン−３−イル−１Ｈ−インドール、２−（５−ベンジルオキシ−ピリジン−３−イル）−６−クロロ−１−メチル−１Ｈ−インドール、５−（３−シアノ−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ニコチン酸エチルエステル、Ｎ−［５−（６−クロロ−３−シアノ−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピリジン−３−イルメチル］−エタンスルホンアミド、ピロリジン−１−スルホン酸 ５−（６−クロロ−３−シアノ−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピリジン−３−イルエステル、Ｎ−メチル−Ｎ−［５−（１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピリジン−３−イルメチル］−メタンスルホンアミド、６−クロロ−１−メチル−２−｛５−［（２−ピロリジン−１−イル−エチルアミノ）−メチル］−ピリジン−３−イル｝−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル、６−クロロ−２−［５−（４−メタンスルホニル−ピペラジン−１−イルメチル）−ピリジン−３−イル］−１−メチル−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル、６−クロロ−１−メチル−２−｛５−［（１−メチル−ピペリジン−４−イルアミノ）−メチル］−ピリジン−３−イル｝−１Ｈ−インドール−３−カルボニトリル、モルホリン−４−カルボン酸［５−（６−クロロ−３−シアノ−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピリジン−３−イルメチル］−アミド、Ｎ−［５−（６−クロロ−１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピリジン−３−イルメチル］−エタンスルホンアミド、Ｃ，Ｃ，Ｃ−トリフルオロ−Ｎ−［５−（１−メチル−１Ｈ−インドール−２−イル）−ピリジン−３−イルメチル］−メタンスルホンアミド、Ｎ−［５−（３−クロロ−４−シアノ−フェニル）−ピリジン−３−イル］−４−トリフルオロメチル−ベンゼンスルホンアミド、Ｎ−［５−（３−クロロ−４−シアノ−フェニル）−ピリジン−３−イル］−１−フェニル−メタンスルホンアミド、Ｎ−（５−（３−クロロ−４−シアノフェニル）ピリジン−３−イル）ブタン−１−スルホンアミド、Ｎ−（１−（５−（４−シアノ−３−メトキシフェニル）ピリジン−３−イル）エチル）エタンスルホンアミド、Ｎ−（（５−（３−クロロ−４−シアノフェニル）ピリジン−３−イル）（シクロプロピル）メチル）エタンスルホンアミド、Ｎ−（シクロプロピル（５−（１Ｈ−インドール−５−イル）ピリジン−３−イル）メチル）エタンスルホンアミド、Ｎ−（シクロプロピル（５−ナフタレン−１−イル−ピリジン−３−イル）メチル）エタンスルホンアミド、エタンスルホン酸［５−（６−クロロ−１−メチル−１Ｈ−ピロロ［２，３−ｂ］ピリジン−２−イル）−ピリジン−３−イルメチル］−アミドおよびエタンスルホン酸｛［５−（３−クロロ−４−シアノ−フェニル）−ピリジン−３−イル］−シクロプロピル−メチル｝−エチル−アミドが挙げられる。
用語「エンドセリン受容体遮断薬」は、ボセンタンおよびアンブリセンタンを包含する。
用語「ＣＥＴＰ阻害薬」とは、コレステリルエステル転送タンパク質（ＣＥＴＰ）を媒介とする、種々のコレステリルエステルおよびトリグリセリドのＨＤＬからＬＤＬおよびＶＬＤＬへの輸送を抑制する化合物を指す。このようなＣＥＴＰ抑制活性は、当業者によって、標準のアッセイ（たとえば、米国特許第６，１４０，３４３号）に従い、容易に見極められる。例として、米国特許第６，１４０，３４３号および米国特許第６，１９７，７８６号で開示されている化合物（たとえば、［２Ｒ，４Ｓ］４−［（３，５−ビス−トリフルオロメチル−ベンジル）−メトキシカルボニル−アミノ］−２−エチル−６−トリフルオロメチル−３，４−ジヒドロ−２Ｈ−キノリン−１−カルボン酸エチルエステル（トルセトラピブ）、米国特許第６，７２３，７５２号で開示されている化合物（たとえば、（２Ｒ）−３−｛［３−（４−クロロ−３−エチル−フェノキシ）−フェニル］−［［３−（１，１，２，２−テトラフルオロ−エトキシ）−フェニル］−メチル］−アミノ｝−１，１，１−トリフルオロ−２−プロパノール）、米国特許出願第１０／８０７，８３８号で開示されている化合物、米国特許第５，５１２，５４８号で開示されているポリペプチド誘導体、それぞれJ. Antibiot., 49(8): 815- 816 (1996)およびBioorg. Med. Chem. Lett.; 6:1951-1954 (1996)で開示されているロセノノラクトン誘導体およびコレステリルエステルの含リン酸類似体が挙げられる。さらに、ＣＥＴＰ阻害薬として、ＷＯ２０００／０１７１６５、ＷＯ２００５／０９５４０９、ＷＯ２００５／０９７８０６、ＷＯ２００７／１２８５６８、ＷＯ２００８／００９４３５、ＷＯ２００９／０５９９４３、およびＷＯ２００９／０７１５０９で開示されているものも挙げられる。
用語「ＮＥＰ阻害薬」とは、中性エンドペプチダーゼ（ＮＥＰ）ＥＣ３．４．２４．１１を抑制する化合物を指す。例として、カンドキサトリル、カンドキサトリラート、デキセカドトリル（Dexecadotril）、エカドトリル（Ecadotril）、ラセカドトリル、サンパトリラート（Sampatrilat）、ファシドトリル、オマパトリラート、ゲモパトリラート（Gemopatrilat）、ダグルトリル（Daglutril）、ＳＣＨ−４２４９５、ＳＣＨ−３２６１５、ＵＫ−４４７８４１、ＡＶＥ−０８４８、ＰＬ−３７、および（２Ｒ，４Ｓ）−５−ビフェニル−４−イル−４−（３−カルボキシ−プロピオニルアミノ）−２−メチル−ペンタン酸エチルエステル、またはこれらの薬学的に許容される塩が挙げられる。ＮＥＰ阻害薬には、米国特許第ＵＳ５，１５５，１００号で開示されているようなホスホノ／ビアリール置換ジペプチド誘導体も含まれる。ＮＥＰ阻害薬には、ＰＣＴ出願第ＷＯ２００３／１０４２００号で開示されているようなＮ−メルカプトアシルフェニルアラニン誘導体も含まれる。ＮＥＰ阻害薬には、ＰＣＴ出願第ＷＯ２００８／１３３８９６、ＷＯ２００９／０３５５４３、またはＷＯ２００９／１３４７４１で開示されているような二重作用性降圧薬も含まれる。他の例としては、ＵＳ出願第１２／７８８，７９４号、第１２／７８８，７６６号、および第１２／９４７，０２９号で開示されている化合物が挙げられる。ＮＥＰ阻害薬として、ＷＯ２０１０／１３６４７４、ＷＯ２０１０／１３６４９３、ＷＯ２０１１／０６１２７１、ならびにＵＳ仮出願第６１／４１４１７１号および第６１／４１４１６３号で開示されている化合物も挙げられる。
一実施形態では、本発明は、対象においてＡＰＪ受容体を活性化する方法であって、治療有効量の、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つの定義に従うポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートを対象に投与する工程を含む方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、対象において、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す障害または疾患を治療する方法であって、治療有効量の、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つの定義に従うポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートを対象に投与する工程を含む方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、対象において、ＡＰＪ受容体の活性化（アゴニズム）に反応を示す障害または疾患を治療する方法であって、障害または疾患が、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、および子癇前症から選択される方法を提供する。
一実施形態では、本発明は、医薬として使用するための、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つの定義に従うポリペプチドまたはそのバイオコンジュゲートを提供する。
一実施形態では、本発明は、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す障害または疾患を治療するための医薬の製造における、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つの定義に従うポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートの使用を提供する。別の実施形態では、本発明は、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す障害または疾患を治療するための医薬の製造における、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つの定義に従うポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートの使用であって、前記障害または疾患が、詳細には、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、および子癇前症から選択される、使用を提供する。
本発明の例示：ペプチドおよびポリペプチド合成
ペプチドは、標準の固相Ｆｍｏｃ化学によって合成した。ペプチドは、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成装置（Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．、米国トゥーソン）およびＬｉｂｅｒｔｙマイクロ波ペプチド合成装置（ＣＥＭ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、米国ノースカロライナ）において組み立てた。Ｃ末端上に遊離カルボン酸、またはＣ末端上にＮ，Ｎ−二置換カルボキサミドを有するペプチドは、２−クロロトリチルクロリド−ＰＳ−樹脂（ＡＢＣＲ、ドイツ国カールスルーエ、またはＡｎａＳｐｅｃ，Ｉｎｃ．、米国カリフォルニア州）から合成した。Ｃ末端上に非置換カルボキサミドを有するペプチドは、Ｆｍｏｃ保護されたＲｉｎｋ−Ａｍｉｄｅ−ＡＭ−ＰＳ樹脂（Ｍｅｒｃｋ、ドイツ国ダルムシュタット）から合成した。Ｃ末端上にＮで一置換されているカルボキサミドを有するペプチドは、アミンが導入されたＢＡＬ−ＡＭ−ＰＳ樹脂（ＥＭＣ Ｍｉｃｒｏｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎｓ、ドイツ国チュービンゲン）から合成した。
ペプチドは、分取逆相ＨＰＬＣによって精製した。次のカラムを使用した。
− Ｗａｔｅｒｓ ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、３０×１００ｍｍ、部品番号１８６００２５７２（カラム１本または連続したカラム２本）
− Ｗａｔｅｒｓ Ａｔｌａｎｔｉｓ Ｐｒｅｐ ＯＢＤ Ｔ３カラム、５μｍ、３０×１５０ｍｍ、部品番号１８６００３７０３
− Ｗａｔｅｒｓ ＳｕｎＦｉｒｅ Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤカラム、５μｍ、３０×５０ｍｍ、部品番号１８６００２５７２
移動相は、溶離液Ａ（０．１％ＴＦＡ Ｈ２Ｏ水溶液）と溶離液Ｂ（ＡＣＮ）からなるものとした。勾配は、分離の問題の特定の要件に基づき設計した。純粋な生成物をＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥した。
生成物は、λ＝２１４ｎｍでのＵＶ検出を使用する分析ＨＰＬＣおよびエレクトロスプレーイオン化を使用するＵＰＬＣ−ＭＳによって分析した。
表４において例示するペプチドは、以下に記載する一般手順を使用して合成した。非置換のＮ末端またはＣ末端は、それぞれ、イタリック体のＨ−または−ＯＨで示す。
「＊」で印を付けた２つのアミノ酸は、その側鎖を介してジスルフィド結合またはアミド結合を形成しているアミノ酸を表す
分析方法
１ａ）ＨＰＬＣ−分析方法Ａ
− カラム：Ｗａｔｅｒｓ ＸＢｒｉｄｇｅ（商標）Ｃ１８（５０×４．０ｍｍ）、３．５μｍ、部品番号：１８６００３０３１
− 溶離液Ａ：０．０７％ＴＦＡ水溶液／溶離液Ｂ：０．１％ＴＦＡ ＡＣＮ溶液
− 流量：１．５ｍｌ／分
− 温度：４０℃
− 勾配：
１ｂ）ＨＰＬＣ−分析方法Ｂ
− カラム：ＸＢｒｉｄｇｅ ＢＥＨ３００ Ｃ１８（１００×４．６ｍｍ）、３．０μｍ、部品番号：１８６００３６１２
− 溶離液Ａ：０．１％ＴＦＡ水溶液／溶離液Ｂ：０．１％ＴＦＡ ＡＣＮ溶液
− 流量：１．０ｍｌ／分
− 温度：４０℃
− 勾配：
２ａ）ＵＰＬＣ−ＭＳ−分析方法Ｃ
− カラム：Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ３００ Ｃ１８（５０×２．１ｍｍ）、１．７μｍ、部品番号：１８６００３６８５
− 溶離液Ａ：０．０５％ＴＦＡ水溶液／溶離液Ｂ：０．０４％ＴＦＡ ＡＣＮ溶液
− 流量：１．０ｍｌ／分
− 温度：８０℃
− 勾配：
２ｂ）ＵＰＬＣ−ＨＲＭＳ−分析方法Ｄ
− Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ（登録商標）ＢＥＨ Ｃ１８、１．７μｍ、２．１×５０ｍｍ、部品番号：１８６００２３５０
− 溶離液Ａ：０．０５％ＦＡ＋３．７５ｍＭの酢酸アンモニウム水溶液、溶離液Ｂ：０．０４％ＦＡ ＡＣＮ溶液
− 流量：１．０ｍｌ／分
− 温度：５０℃
− 勾配：４．４分で２〜９８％
３）分析方法Ｅ：
− ＸＢｒｉｄｇｅ Ｃ１８カラム、３．５μｍ、３．０×３０ｍｍ
− 溶離液：Ａ：水（０．１％ギ酸）、Ｂ：ＣＡＮ
− 流速：２ｍＬ／分
− 勾配：０分間４０％のＢ、１．７０分で４０％〜９５％のＢ、２．０分間９５％のＢ、２．１分間４０％のＢ
− 質量分析計：Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＥＳＩ 走査範囲１５０〜１６００
− ＨＰＬＣ：Ａｇｉｌｅｎｔ １１００シリーズ
− 温度：４０Ｃ
３）分析方法Ｆ：
− Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ １．７μｍ ２．１×５０ｍｍ
− 溶離液：Ａ：水（０．１％ギ酸）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ギ酸）
− 流速：１ｍＬ／分
− 勾配：０分間２％のＢ、１．７分で２％〜９８％のＢ、２．０６分間９８％のＢ、２．１６分間２％のＢ
− 質量分析計：Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＥＳＩ 走査範囲１２０〜１６００
− ＨＰＬＣ：ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ
− 温度：５０Ｃ
３）分析方法Ｇ：
− Ａｃｑｕｉｔｙ ＢＥＨ １．７μｍ ２．１×５０ｍｍ
− 溶離液：Ａ：水（０．１％ギ酸）、Ｂ：ＡＣＮ（０．１％ギ酸）
− 流速：１ｍＬ／分
− 勾配：０分間４０％のＢ、１．４０分で４０％〜９８％のＢ、２．０５分間９８％のＢ、２．１分間４０％のＢ
− 質量分析計：Ｓｉｎｇｌｅ Ｑｕａｄｒｕｐｏｌｅ ＥＳＩ 走査範囲１２０〜１６００
− ＨＰＬＣ：ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ
− 温度：５０Ｃ
実施例１〜３８のペプチドの分析データは、表５にまとめて示すが、上述の分析方法を使用して生成したものである。
一般合成手順
１）最初のアミノ酸の２−クロロトリチルクロリド樹脂への導入およびＦｍｏｃ除去
２−クロロトリチルクロリド樹脂（１当量、１．０〜１．６ｍｍｏｌ／ｇ）をＤＣＭで十分に洗浄した。所望のアミノ酸（通常、１．６ｍｍｏｌ／ｇの導入を考えて、樹脂に対して０．５〜２当量）を、ＤＣＭ（樹脂１グラムあたり約１０ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（１．６ｍｍｏｌ／ｇの導入を考えて、樹脂に対して４当量）に溶解させた。溶液を樹脂に加え、懸濁液を室温で３〜１６時間振盪した。樹脂を排出し、次いで、ＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（１７：２：１）、ＤＣＭ、ＤＭＡ、ＤＣＭで順次、十分に洗浄した。
Ｆｍｏｃ除去および導入量の算定については、樹脂をピペリジン／ＤＭＡ（１：４）または４−メチルピペリジン／ＤＭＡ（１：４）（最初の樹脂１グラムあたり１２×１０ｍＬ）と共に繰り返し振盪し、ＤＭＡ（最初の樹脂１グラムあたり２×１０ｍＬ）で洗浄した。合わせた溶液をＭｅＯＨで希釈して、体積Ｖを最初の樹脂１グラムあたり２５０ｍＬとした。この溶液の２ｍＬのアリコート（Ｖａ）をＭｅＯＨでさらに希釈して２５０ｍＬ（Ｖｔ）とした。ＵＶ吸収を、ＭｅＯＨを基準として２９９．８ｎｍで測定して、吸収Ａを得た。樹脂を、順次ＤＭＡ、ＤＣＭ、ＤＭＡ、ＤＣＭで十分に洗浄し、高真空中にて４０℃で乾燥させて、ｍ ｇの樹脂を得た。
樹脂への導入量は、式：
導入量［ｍｏｌ／ｇ］＝（Ａ×Ｖｔ×Ｖ）／（ｄ×ε×Ｖａ×ｍ）
（ｄ：セルの幅、ε＝７８００Ｌ ｍｏｌ−１ｃｍ−１）
に従って算出した。
２）固相ペプチド合成
２ａ）Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）合成装置における合成サイクルＡ
樹脂をＤＭＡで洗浄した。ピペリジン／ＤＭＡ（１：４）または４−メチルピペリジン／ＤＭＡ（１：４）で繰り返し処理して、Ｆｍｏｃを除去した。樹脂をＤＭＡで洗浄した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸（３当量、０．３Ｍ ＮＭＰ溶液）、ＨＣＴＵ（３当量、０．３Ｍ ＮＭＰ溶液）、およびＤＩＰＥＡ（４．５当量、０．９Ｍ ＮＭＰ溶液）を加えた後、懸濁液を、窒素中にて、特定の要件に応じて通常は１５分〜４時間、室温で混合することにより、カップリングを行った。ＤＭＡで洗浄した後、カップリングステップを、特定の要件に応じて通常は１〜３回繰り返した。ＤＭＡで洗浄した後、Ａｃ２Ｏ／ピリジン／ＤＭＡ（１：１：８）の混合物を加え、引き続いて懸濁液を室温で混合することにより、キャッピングを行った。樹脂をＤＭＡで洗浄した。
２ａ）Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）合成装置における合成サイクルＢ
樹脂をＤＭＡで洗浄した。４−メチルピペリジン／ＤＭＡ（１：４）で繰り返し処理して、Ｆｍｏｃを除去した。樹脂をＤＭＡで洗浄した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸（３当量、０．２Ｍ ＮＭＰ溶液）、ＨＣＴＵ（３当量、０．３Ｍ ＮＭＰ溶液）、およびＤＩＰＥＡ（３．３当量、０．６６Ｍ ＮＭＰ溶液）を加えた後、懸濁液を、窒素中にて、特定の要件に応じて通常は１５分〜４時間、室温で混合することにより、カップリングを行った。ＤＭＡで洗浄した後、カップリングステップを、特定の要件に応じて通常は１〜３回繰り返した。ＤＭＡで洗浄した後、Ａｃ２Ｏ／ピリジン／ＤＭＡ（１：１：８）の混合物を加え、引き続いて懸濁液を室温で混合することにより、キャッピングを行った。樹脂をＤＭＡで洗浄した。
２ｂ）Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）合成装置での合成サイクルＣ
樹脂をＤＭＡで洗浄した。ピペリジン／ＤＭＡ（１：４）または４−メチルピペリジン／ＤＭＡ（１：４）で繰り返し処理して、Ｆｍｏｃを除去した。樹脂をＤＭＡで洗浄した。Ａｃ２Ｏ／ピリジン／ＤＭＡ（１：１：８）の混合物を加え、引き続いて懸濁液を室温で混合することにより、キャッピングを行った。樹脂をＤＭＡで洗浄した。
２ｃ）Ｌｉｂｅｒｔｙ（商標）合成装置における合成サイクルＤ
樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。２０％ピペリジン／ＤＭＦでの処理（通常、０．１ｍｍｏｌあたり７ｍｌ ２回）によって、Ｆｍｏｃを除去した。樹脂をＤＭＦおよびＤＣＭで洗浄した。Ｆｍｏｃ−アミノ酸（５当量、０．２Ｍ ＤＭＦ溶液）、ＨＣＴＵ（５当量、０．５Ｍ ＤＭＦ溶液）、およびＤＩＰＥＡ（１０当量、２Ｍ ＮＭＰ溶液）を加えた後、０〜２０ワットのマイクロ波電力を用い、懸濁液を、窒素中にて、特定の要件に応じて通常は５〜５０分間、７５または５０℃で混合することにより、カップリングを行った。ＤＭＦで洗浄した後、カップリングステップを、特定の要件に応じて１回繰り返してもよいであろう。樹脂をＤＭＦで洗浄した。
３）保護基の除去を伴うまたは伴わない樹脂からの切断
３ａ）切断方法Ａ
樹脂（０．１ｍｍｏｌ）を、９５％のＴＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）水溶液（３ｍＬ）と共に室温で２時間振盪した。切断溶液を濾別し、新鮮な溶液を加えた（３ｍＬ）。懸濁液を室温で１時間振盪し、次いで切断溶液を濾別した。新鮮な溶液を加え（３ｍＬ）、懸濁液を室温で１時間振盪した。切断溶液を濾別した。合わせた切断溶液を、冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）の混合物（３５ｍＬ）上にゆっくりと注いで、沈殿を得た。懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。残渣を冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）（１０〜２０ｍＬ）で洗浄し、懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。このステップを１〜２回行った。固体を高真空中で乾燥させた。
３ｂ）切断方法Ｂ
樹脂（０．１ｍｍｏｌ）を９５％ＴＦＡ／／ＴＩＳ／ＤＴＴ（９５：２．５：２．５）水溶液（３ｍＬ）と共に室温で３時間振盪した。切断溶液を濾別した。樹脂を９５％ＴＦＡ水溶液（１ｍＬ）で１回すすいだ。合わせた切断および洗浄溶液を、冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）の混合物（１０〜１５ｍＬ）上へゆっくりと注いで、沈殿を得た。懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。残渣にジエチルエーテル（１０ｍＬ）を加え、懸濁液を３分間ボルテックスし、遠心分離し、上清を廃棄した。洗浄過程を２回繰り返した。固体を高真空中で乾燥させた。
３ｃ）切断方法Ｃ
樹脂（０．１ｍｍｏｌ）にＨＦＩＰ／ＤＣＭ（１：３）（３ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で２０分間振盪した。切断溶液を濾別し、集めた。この手順を２回繰り返した。最後に、樹脂をＨＦＩＰ／ＤＣＭ（１：３）（１ｍＬ）で１回洗浄した。合わせた切断および洗浄溶液を真空中で濃縮乾燥した。粗生成物をＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥した。
４）ジスルフィド生成
４ａ）環化方法Ａ
完全に脱保護された線状前駆体ペプチドを、Ｈ２Ｏ／ＤＭＳＯ（９：１）または（４：１）に溶解させて、通常は０．５〜７ｍＭの濃度とした。次いで、反応混合物を、要件に応じて通常は１６〜９６時間、室温で撹拌し、次いで高真空中で濃縮乾燥した。
４ｂ）環化方法Ｂ
完全に脱保護された線状前駆体ペプチド（１当量）をＨ２Ｏに溶解させて、通常は約１〜２５ｍＭの濃度とした。５０ｍＭのＩ２ ＡｃＯＨ溶液（１〜２当量）を加え、完全な変換が実現されるまで、混合物を室温で撹拌した。０．５Ｍのアスコルビン酸Ｈ２Ｏ溶液を加えて、過剰のＩ２を失活させた。
以下では、代表的な実施例の合成について記載する。
［実施例９］
Ａｃ−Ｃ＊−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｃ＊−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｐ−ＮＭｅ（フェネチル）（ジスルフィドＣ１−Ｃ７）の合成
− 中間体９ａの調製
（２−クロロトリチルクロリド樹脂へのＦｍｏｃ−Ｐ−ＯＨの導入、Ｆｍｏｃ除去、および樹脂への導入量の算定）
２−クロロトリチルクロリド樹脂（２．００ｇ、３．２０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３回）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−Ｐ−ＯＨ（１．０８ｇ、３．２０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（２０ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（２．２４ｍＬ、１２．８ｍｍｏｌ）に溶かした溶液を加え、懸濁液を室温で３時間振盪した。樹脂をＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（１７：２：１）（３回）、ＤＣＭ（３回）、ＤＭＡ（３回）、ＤＣＭ（３回）で十分に洗浄した。
次いで、樹脂をピペリジン／ＤＭＡ（１：４）の混合物（各回１２ｍＬ）で２分間、１２回処理した。ピペリジン／ＤＭＡ溶液を集めて、樹脂への導入量を算定した（一般手順を参照されたい）。
樹脂をＤＣＭ（３回）、ＤＭＡ（３回）、ＤＣＭ（３回）で十分に洗浄し、真空中で乾燥させて、中間体９ａ（２．２５ｇ、導入量＝１．１２ｍｍｏｌ／ｇ）を得た。
− 中間体９ｂの調製
（線状ペプチドの組み立て）
中間体９ａ（８９ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）を、Ｐｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成装置での固相ペプチド合成にかけた。カップリングを以下のとおりに実施した。
− 中間体９ｃの調製
（樹脂からのＨＦＩＰ切断）
中間体９ｂ（０．１００ｍｍｏｌ）にＨＦＩＰ／ＤＣＭ（１：３）（３ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で２０分間振盪した。切断溶液を濾別し、集めた。この手順を２回繰り返した。最後に、樹脂をＨＦＩＰ／ＤＣＭ（１：３）（１ｍＬ）で１回洗浄した。合わせた切断および洗浄溶液を真空中で濃縮乾燥した。粗生成物をＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、中間体９ｃ（３７．２ｍｇ、１４．８μｍｏｌ）を白色の固体として得た。
− 中間体９ｄの調製
（アミド生成および保護基の除去）
中間体９ｃ（３７．０ｍｇ、＝１４．７μｍｏｌ）およびＴＢＴＵ（７．１ｍｇ、２２．１μｍｏｌ）をＤＣＭ（５ｍＬ）に溶解させた。ＤＩＰＥＡ（５．１μｌ、２９．４μｍｏｌ）を加え、溶液を室温で２分間撹拌した。Ｎ−メチル−フェネチルアミン（３．２μｌ、２２．１μｍｏｌ）を加え、反応液を室温で１時間４０分撹拌し、次いでＥｔＯＡｃ／ｎ−ブタノール（９：１）（５０ｍＬ）と５％ＮａＨＣＯ３水溶液（５ｍＬ）とに分配した。有機層を５％ＮａＨＣＯ３水溶液（５ｍＬ）、ブライン（５ｍＬ）で洗浄し、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、真空中で濃縮乾燥した。
残渣を９５％ＴＦＡ／ＴＩＳ／ＥＤＴ（９５：２．５：２．５）水溶液（５ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を室温で３時間撹拌し、次いで、冷ヘプタン／エーテル（１：１）（３５ｍＬ）上へ注いだ。懸濁液を遠心分離し、溶媒をデカントした。残渣を冷ジエチルエーテル／ヘプタン（１：１）（１０ｍＬ）で２回洗浄し、次いで真空中で乾燥させて、中間体９ｄ（２７．０ｍｇ、１４．７μｍｏｌ）をベージュ色の固体として得た。生成物は、精製せずに次のステップにかけた。
実施例９の調製
（ジスルフィド生成および精製）
中間体９ｄ（２６．９ｍｇ、１４．７μｍｏｌ）をＨ２Ｏ（３．７ｍＬ）に溶解させた（溶液は、わずかに濁っていた）。５０ｍＭのＩ２ ＡｃＯＨ溶液（０．３５３ｍＬ、１７．６μｍｏｌ）を加え、混合物を室温で３０分間撹拌した。０．５Ｍのアスコルビン酸Ｈ２Ｏ溶液（０．０４４ｍＬ、２２．１μｍｏｌ）を加えて、過剰のヨウ素を失活させた。溶液を約３．５ｍＬに濃縮し、次いで分取逆相ＨＰＬＣにかけた。画分を凍結乾燥して、実施例９（６．８ｍｇ、３．７μｍｏｌ）を白色の固体として得た。
純粋な生成物を、分析ＨＰＬＣ（分析方法Ａ、ｔＲ＝３．７５分）およびＵＰＬＣ−ＭＳ（分析方法Ｃ、測定値：［Ｍ＋３］３＋＝４９５．３、計算値：［Ｍ＋３］３＋＝４９５．３）によって分析した。
［実施例１２］
Ａｃ−ｃ＊−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｃ＊−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｎｌｅ−Ｐ−Ｆ−ＯＨ（ジスルフィドＣ１−Ｃ７）の合成
− 中間体１２ａの調製
（２−クロロトリチルクロリド樹脂へのＦｍｏｃ−Ｆ−ＯＨの導入、Ｆｍｏｃ除去、および樹脂への導入量の算定）
２−クロロトリチルクロリド樹脂（１０．０ｇ、１６．０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３回）で洗浄した。Ｆｍｏｃ−Ｆ−ＯＨ（１２．４ｇ、３２．０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１００ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（１１．２ｍＬ、６４．０ｍｍｏｌ）に溶かした溶液を加え、懸濁液を室温で５時間振盪した。樹脂をＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（１７：２：１）（３回）、ＤＣＭ（３回）、ＤＭＡ（３回）、ＤＣＭ（３回）で十分に洗浄した。
次いで、樹脂をピペリジン／ＤＭＡ（１：４）の混合物（各回５０ｍＬ）で２分間、１２回処理した後、ＤＭＡ（２回）で洗浄した。ピペリジン／ＤＭＡ溶液およびＤＭＡ洗浄溶液を集めて、樹脂への導入量を算定した（一般手順を参照されたい）。
樹脂をＤＣＭ（３回）、ＤＭＡ（３回）、ＤＣＭ（３回）で十分に洗浄し、真空中で乾燥させて、中間体１２ａ（１２．８ｇ、導入量＝０．７９ｍｍｏｌ／ｇ）を得た。
− 中間体１２ｂの調製
（線状ペプチドの組み立て）
中間体１２ａ（１２７ｍｇ、０．１０ｍｍｏｌ）をＰｒｅｌｕｄｅ（商標）ペプチド合成装置での固相ペプチド合成にかけた。カップリングを以下のとおりに実施した。
− 中間体１２ｃの調製
（保護基の除去を伴う樹脂からの切断、および精製）
中間体１２ｂ（０．１０ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（４回）で慎重に洗浄した。９５％のＴＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）水溶液の混合物（２ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で２時間振盪した。切断溶液を濾別し、新鮮な切断溶液（２ｍＬ）を加えた。懸濁液を室温で１時間振盪し、次いで切断溶液を濾別した。新鮮な溶液（２ｍＬ）を加え、懸濁液を室温で１時間振盪した。切断溶液を濾別した。合わせた切断溶液を、冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）の混合物（３０ｍＬ）上に注いで、沈殿を得た。混合物を遠心分離し、上清を廃棄した。固体を冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）（１０ｍＬ）で再び洗浄し、混合物を遠心分離し、上清を廃棄した。固体を真空中で乾燥させた。粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥して、中間体１２ｃ（５３ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）を得た。
− 実施例１２の調製
（環化および精製）
中間体１２ｃ（５３ｍｇ、０．０２９ｍｍｏｌ）をＨ２Ｏ／ＤＭＳＯ（９：１）（１８ｍＬ）に溶解させた。反応混合物を室温で４０時間撹拌し、次いで真空中で濃縮乾燥した。粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、凍結乾燥して、実施例１２を白色の固体（２７．４ｍｇ、０．０１４ｍｍｏｌ）として得た。
純粋な生成物を、分析ＨＰＬＣ（分析方法Ａ、ｔＲ＝３．５１分）およびＵＰＬＣ−ＭＳ（分析方法Ｃ、測定値：［Ｍ＋３］３＋＝５０５．３、計算値：［Ｍ＋３］３＋＝５０５．３）によって分析した。
［実施例１８］
Ａｃ−（Ｄ−ｈＣ）＊−Ｒ−Ｐ−Ｒ−Ｌ−Ｓ−（ｈＣ）＊−Ｋ−Ｇ−Ｐ−ｆ−ａ−ｆ−ＯＨ（ジスルフィドＣ１−Ｃ７）の合成
固体支持体上での線状ペプチド合成：
Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｐｈｅ−Ｗａｎｇ樹脂（置換率：０．６６ｍｍｏｌ／ｇ）を、標準のＦｍｏｃ化学によるマニュアル固相ペプチド合成にかけた。０．３ｍｍｏｌの樹脂をＤＭＦ中で３０分間膨潤させ、ＤＭＦを排出し、樹脂を２０％のＤＭＦ中ピペリジンで３０分間処理して、Ｆｍｏｃ基を除去した。樹脂をＤＭＦで３回洗浄し、予め活性化させたＦｍｏｃアミノ酸溶液（Ｆｍｏｃアミノ酸／ＨＢＴＵ／ＨＯＢｔ／ＮＭＭ＝３：３：３：６当量）で２時間カップリングさせた。各カップリングの後にニンヒドリン試験を実施して、カップリング効率を確認した。
Ｎ末端まで、Ｆｍｏｃ保護基の除去および保護されたアミノ酸のカップリングを繰り返すことにより、樹脂上にペプチド鎖を組み立てた。
最後のアミノ酸をカップリングさせた後、ペプチド樹脂をＤＭＦおよびエチルエーテルで洗浄し、真空中で乾燥させた。乾燥させたペプチド樹脂を、ＴＦＡ切断カクテル（ＴＦＡ／チオールアニソール／フェノール／ＥＤＴ／Ｈ２Ｏ＝８７．５：５：２．５：２．５：２．５、ｖ／ｖ）で処理して、側鎖保護基を切断および除去した。粗製ペプチドを冷エーテルから沈殿させ、濾取し、高真空中で乾燥させた。粗製ペプチドをＨＰＬＣ（カラム：２インチＤｅｌｔａ Ｐａｋ Ｃ１８、波長：２１５ｎｍ）で精製して、所望の生成物を得た。
環化：
粗製ペプチドそれぞれを水−アセトニトリル（Ａ．Ｃ．Ｓ．試薬、Ｆｉｓｈｅｒ）に１ｍｇ／ｍＬの濃度で溶解させ（およそ８０％：２０％、水：アセトニトリル、Ｖ：Ｖ）、溶液に、Ｉ２（Ａ．Ｃ．Ｓ．試薬、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）を５０％のＡｃＯＨ（Ａ．Ｃ．Ｓ．試薬、Ｆｉｓｈｅｒ）／Ｈ２Ｏに溶かした０．１Ｍ溶液を、Ｉ２の色が消えずに残るまで、激しく撹拌しながら滴下添加した。酸化が完了したら（分析ＨＰＬＣおよび質量分析によってモニターした）、１ＭのＬ−アスコルビン酸（Ａ．Ｃ．Ｓ．試薬、Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ）水溶液を、溶液が無色になるまで、継続的に撹拌しながら滴下添加して、過剰のＩ２を還元した。濾過した後、上記溶液を２インチＣ１８カラムにかけ（２１５ｎｍで検出）、ＴＦＡ緩衝液（緩衝液Ａ、０．１％の水中ＴＦＡ（Ａ．Ｃ．Ｓ．グレード、ＮｕＧｅｎｅｒａｔｉｏｎ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＬＬＣ）；緩衝液Ｂ、１００％のアセトニトリル）を使用して精製し、純度が９５％を越える画分を集め、凍結乾燥によって乾燥させた。
［実施例２１］
ｐＥ−Ｒ−Ｃ＊−Ｒ−Ｌ−Ｓ−Ｃ＊−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）−ａ−ｆ−ＯＨ（ジスルフィドＣ３−Ｃ７）の合成
− 中間体２１ａの調製
（２−クロロトリチルクロリド樹脂へのＦｍｏｃ−ｆ−ＯＨの導入、Ｆｍｏｃ除去、および樹脂への導入量の算定）
２−クロロトリチルクロリド樹脂（５．０ｇ、８．０１ｍｍｏｌ）を、Ｆｍｏｃ−ｆ−ＯＨ（３．１０ｇ、８．０１ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（５０ｍＬ）およびＤＩＰＥＡ（５．５９ｍＬ、３２．０ｍｍｏｌ）に溶かした溶液と、上述の一般手順と同様に反応させて、中間体２１ａ（５．８７ｇ、導入量＝０．８９７ｍｍｏｌ／ｇ）を得た。
− 中間体２１ｂの調製
（鎖状ペプチドの組み立て）
中間体２１ａ（０．１００ｍｍｏｌ）をＬｉｂｅｒｔｙ（商標）マイクロ波ペプチド合成装置での固相ペプチド合成にかけた。カップリングを次のとおりに実施した。
− 中間体２１ｃの調製
（保護基の除去を伴う樹脂からの切断、次いで精製）
中間体２１ｂ（０．１ｍｍｏｌ）に９５％ＴＦＡ／ＥＤＴ／ＤＴＴ（９５：２．５：２．５）水溶液の混合物（２ｍＬ）を加えた。懸濁液を室温で２時間振盪し、次いで切断溶液を濾別した。次いで、樹脂を９５％ＴＦＡ／ＥＤＴ／ＴＩＳ（９５：２．５：２．５）水溶液（２ｍＬ）で再び処理し、室温で１時間振盪し、濾過した。合わせた切断および洗浄溶液を冷ヘプタン／ジエチルエーテル（１：１）の混合物（１１ｍＬ）上へ注いで、沈殿を得た。懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄した。残渣にジエチルエーテル（１０ｍＬ）を加え、懸濁液を３分間ボルテックスし、遠心分離し、上清を廃棄した。洗浄過程を２回繰り返した。固体を高真空中で乾燥させた。粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、中間体２１ｃ（５５ｍｇ、０．０３０ｍｍｏｌ）を得た。
− 実施例２１の調製
（環化および精製）
中間体２１ｃ（１８ｍｇ、９．９７μｍｏｌ）をＨ２Ｏ（１．０ｍＬ）に溶解させた。撹拌した溶液に、５０ｍＭのＩ２ ＡｃＯＨ溶液（０．２４ｍＬ、１２μｍｏｌ）を一度で加え、ＬＣＭＳによって反応の完了が示されるまで、溶液を室温で終夜撹拌した。０．５Ｍのアスコルビン酸Ｈ２Ｏ溶液（２４μｍｏｌ、１２μｍｏｌ）を加えて、過剰のＩ２を失活させた。粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、実施例２１を白色の固体（１２ｍｇ、６．３２μｍｏｌ）として得た。
純粋な生成物を、分析ＨＰＬＣ（分析方法Ｂ、ｔＲ＝７．３５分）およびＵＰＬＣ−ＨＲＭＳ（分析方法Ｄ、測定値：［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝７３０．３５５、計算値：［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝７３０．３６１）によって分析した。
［実施例３２］
ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｃ＊−Ｌ−Ｓ−Ｃ＊−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）−ＮＨ（フェネチル）（ジスルフィドＣ４−Ｃ７）アセテートの合成
− 中間体３２ａの調製
（２−クロロトリチルクロリド樹脂へのＦｍｏｃ−Ｄ−Ｎｌｅ−ＯＨの導入、Ｆｍｏｃ除去、および樹脂への導入量の算定）
２−クロロトリチルクロリド樹脂（５０．０ｇ、８５．０ｍｍｏｌ）を のＤＣＭ（４００ｍＬ）に懸濁させ、懸濁液を１０分間撹拌し、次いで溶媒を排出し、樹脂をＤＣＭ（３×２００ｍＬ）で洗浄した。次いで、樹脂に、Ｆｍｏｃ−Ｄ−Ｎｌｅ−ＯＨ（２４．０ｇ、６８．０ｍｍｏｌ）およびＤＩＰＥＡ（９６．５ｍｌ、５５２．５ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（１２０．０ｍＬ）に溶かした溶液を加え、懸濁液を窒素でフラッシュし、室温で５分間撹拌した。別の分のＤＩＰＥＡ（２２．７ｍｌ、１２７．５ｍｍｏｌ）を加え、反応混合物を室温で終夜撹拌した。
反応混合物を排出し、樹脂をＤＣＭ（３×２５０ｍＬ）で各回２分間洗浄した。樹脂をＤＣＭ／ＭｅＯＨ／ＤＩＰＥＡ（７０：１５：１５）混合物（２×２５０ｍＬ）で各回１０分間かけて失活させた。
樹脂をピペリジン／ＤＭＦ（１：３）（１×３００ｍＬ）で５分間処理することにより、Ｆｍｏｃ基を切断した。樹脂を排出し、次いで（１×３００ｍＬ）１５分間、続いて洗浄ステップ：ＤＭＦ（６×２５０ｍＬ、各回２分）、イソプロパノール（２×２５０ｍＬ、各回２分）、およびＴＢＭＥ（６×２５０ｍＬ、各回２分）。樹脂を真空中にて３５℃で２４時間乾燥させて、中間体３２ａ（５７．８ｇ、導入量＝１．０８ｍｍｏｌ／ｇ）を得た。
− 中間体３２ｂの調製
（線状ペプチドの組み立て）
中間体３２ａ（１８．５ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を、自動ペプチド合成装置（ＣＳＢＩＯ５３６（商標））での固相ペプチド合成にかけた。カップリングサイクルは、次のとおりに定めた。
− アミノ酸カップリング：ＡＡ（３．０当量）、ＤＩＣ（３．０当量）、ＨＯＢｔ（３．０当量）、ＤＭＦ（以下の表を参照されたい）
− 洗浄：ＤＭＦ（４×１５０ｍＬ、各回２分）
− Ｆｍｏｃ脱保護：ピペリジン／ＤＭＦ（１：３）（１５０ｍＬで５分間、次いで１５０ｍＬで１５分間）
− 洗浄：ＤＭＦ（６×１５０ｍＬ、各回２分）
ペプチドを組み立てた後、樹脂を、ＤＭＦ（６×１５０ｍＬ、各回２分）、イソプロパノール（６×１５０ｍＬ、各回２分）、およびＴＢＭＥ（６×１５０ｍＬ、各回２分）で洗浄した。ペプチド樹脂を高真空中にて３５℃で終夜乾燥させて、中間体３２ｂ（５７．６ｇ、２０．０ｍｍｏｌ）を得た。
− 中間体３２ｃの調製
（樹脂からのＨＦＩＰ切断）
中間体３２ｂの一部（２７ｇ、９．３７ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（３００ｍＬ）に懸濁させ、１５分間撹拌した。樹脂を排出し、次いでＨＦＩＰ／ＤＣＭ（３：７）（３×２７０ｍＬ、各回１５分）で処理した。切断溶液を濾別し、集めた。樹脂をＤＣＭ（３×３００ｍＬ）で洗浄した。合わせた切断および洗浄溶液を真空中で濃縮乾燥した。白色の粉末を真空中にて３５℃で終夜乾燥させて、中間体３２ｃ−バッチ１（２３．５ｇ、９．３７ｍｍｏｌ）を得た。
別の分の中間体３２ｂ（２８．０ｇ、９．７２ｍｍｏｌ）で、上で言及した手順を繰り返して、中間体３２ｃ−バッチ２（２６．１ｇ、９．７２ｍｍｏｌ）を得た。
− 中間体３２ｄの調製
（フェネチルアミンの溶液相カップリング）
中間体３２ｃ−バッチ２（２０．０ｇ、７．４４ｍｍｏｌ、１．０当量）およびＨＡＴＵ（５．２３ｇ、１３．８ｍｍｏｌ、１．８５当量）をＤＭＦ（４００ｍＬ）に溶解させた。フェネチルアミン（１．６７ｇ、１３．８ｍｍｏｌ、１．８５当量）およびＤＩＰＥＡ（３．５６ｇ、２７．６ｍｍｏｌ、３．７１当量）をＤＭＦ（６０ｍＬ）に溶かした溶液を加えた。
反応混合物を室温で３０分間撹拌し、次いで０℃に冷却し、次いでブライン（４６０ｍＬ）を加えた。懸濁液を１０分間撹拌し、次いで生成物を濾過によって単離した。濾過ケークをＨ２Ｏ（３００ｍＬ）で洗浄し、次いでこれを慎重に取り出し、次いでＤＣＭ（３００ｍＬ）に溶解させた。溶液をＭｇＳＯ４で乾燥させ、次いで真空中で濃縮乾燥した。粗生成物をシリカゲルでのフラッシュクロマトグラフィー（溶離液：ＤＣＭおよびＤＣＭ／ｉＰｒＯＨ（８：２））にかけて、中間体３２ｄ−バッチ１（１４．４ｇ、６．６ｍｍｏｌ）を得た。
中間体３２ｃ−バッチ１（２３．４ｇ、９．３７ｍｍｏｌ）で、フラッシュクロマトグラフィーを除外して同じ手順を繰り返して、中間体３２ｄ−バッチ２（２８．０ｇ、９．３７ｍｍｏｌ）を得た。
− 中間体３２ｅの調製
（保護基除去）
中間体３２ｄ−バッチ２（２８．０ｇ、９．３７ｍｍｏｌ）をＴＦＡ／ＤＣＭ／ＥＤＴ／ＴＩＳ（９０：５：２．５：２．５）（２９０ｍＬ）に溶解させ、反応液を室温で２時間撹拌した。
切断溶液を濾別し、冷ＴＢＭＥ（３Ｌ）（０〜４℃）上に注いだ。濁った懸濁液を氷水浴中で３０分間撹拌し、次いでｐｏｒｅ ４ガラスフィルターで濾過した。こうして得られた白色の固体をＴＢＭＥ（２×１００ｍＬ）で洗浄し、次いで真空中にて３５℃で終夜乾燥させて、中間体３２ｅ−バッチ１（８．９ｇ、５．９ｍｍｏｌ）を得た。
中間体３２ｄ−バッチ１（１４．４ｇ、６．６ｍｍｏｌ）で同じ手順を繰り返して、中間体３２ｅ−バッチ２（９．６ｇ、６．３ｍｍｏｌ）を得た。
− 実施例３２の調製
１）環化
中間体３２ｅ（５．０ｇ、３．３ｍｍｏｌ）を水（５００ｍＬ）に溶解させた。ヨウ素（１．１８ｇ、４．６６ｍｍｏｌ、１．４１当量）の酢酸（９３ｍＬ）溶液を一度に加えた。反応混合物を室温で１０分間撹拌した。アスコルビン酸（１．０３ｇ、５．８３ｍｍｏｌ、１．７７当量）の水（５．８ｍＬ）溶液を加え、反応混合物を１０分間撹拌し、濾過し、精製まで４℃で保管した。
１８．３ｇ（１２．１ｍｍｏｌ）の中間体３２ｅが処理されるまで、同じ環化手順を繰り返した。
２）精製
環式ペプチドの溶液を、注入１回あたりペプチド０．５〜５．０ｇずつとして、分取ＨＰＬＣにかけた。純度が９５％より高い画分をプールし、凍結乾燥して、４．８９ｇ（３．２ｍｍｏｌ）の合計量の精製ペプチド（ＴＦＡ塩）を得た。
３）イオン交換による酢酸塩生成
ＯＨ−型の強陰イオン交換樹脂（Ｉｏｎ ｅｘｃｈａｎｇｅｒ ＩＩＩ、Ｍｅｒｃｋ）７５ｇ（１００ｍＬ）を焼結ガラスフィルター（空孔率３）に入れ、次いで酢酸／水（１：３）の溶液（３００ｍＬ）を加え、懸濁液を２分間手作業で撹拌し、次いで樹脂を排出した。別の分の酢酸／水（１：３）（３００ｍＬ）で、この過程を繰り返した。中性の排液が観察されるまで、樹脂を脱イオン水で洗浄した。次いで、樹脂を、焼結ガラスフィルター（空孔率３）を備えた４×２０ｃｍカラムに移した。
４．８ｇの精製ペプチドを脱イオン水（５０ｍＬ）に溶解させ、カラムに加えた。生成物を脱イオン水（２００ｍＬ）で溶離させた。ＴＬＣスポッティングによって、生成物の溶離を制御し、豊富な画分をプールし、凍結乾燥して、実施例３２（４．１ｇ、２．９ｍｍｏｌ）を得た。
純粋な生成物を、分析ＨＰＬＣ（分析方法Ｂ、ｔＲ＝８．０１分）およびＵＰＬＣ−ＨＲＭＳ（分析方法Ｄ、測定値：［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝６４３．３２８、計算値：［Ｍ＋２Ｈ］２＋＝６４３．３２４）によって分析した。酢酸含有量は７．９９〜８．２７％であり、含水量は１．９４〜１．９６％であった。
他の実施例は、似たようにして合成した。
− 実施例１〜８、１０、１１、１３〜１７、２０、２８〜３１は、実施例１２と同様に合成した。
− 実施例１９、２６、２７、３６〜３８は、実施例１８と同様に合成した。
− 実施例２２〜２５、３３〜３５は、実施例２１と同様に合成した。
バイオコンジュゲート実施例：
［実施例３９］
アルブミン−ＰＰＡ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｃ＊−Ｌ−Ｓ−Ｃ＊−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）フェネチルアミン［ＰＰＡは、３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパン酸である］
ステップ１：アルブミン脱キャッピング
− ＴＣＥＰによる脱キャッピング
１５ｍＬチューブに入った、アルブミン（５００ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ、ヒト血清からの凍結乾燥粉末）を１０ｍＬのＰＢＳ １×緩衝液に溶かした溶液に、ＴＣＥＰ塩酸塩の溶液（生物学グレード精製水中１．０７４ｍｇ）を一度に加えた。得られた溶液を室温で１時間振盪し、次いで脱塩し、２本のＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−４遠心式フィルター（３０Ｋ ＭＷＣＯ）で洗浄した。フィルターを４Ｋ ｇで４０分間スピンにかけ、濾液を廃棄した。各フィルターに３ｍＬの生物学グレード精製水を加えてそれぞれ洗浄し（１４Ｋ ｇで１０分間スピンにかけ）、洗浄過程を３回繰り返した。脱キャッピングされたＨＳＡを水（合計約２０ｍＬ）に溶解させた。溶液を５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移し、凍結乾燥して、結晶質の粉末（５００ｍｇ）を得た。
純粋な生成物をＵＰＬＣ−ＭＳによって分析した（分析方法Ｆ、測定値：６６４３９．０、予想値：６６４３７）。
− 脱キャッピングされたＨＳＡ中の遊離チオール基の数の算定
２ｍＬチューブに入った、この脱キャッピングされたＨＳＡ（２ｍｇ）を４００μＬのＰＢＳ ｐＨ７．４に溶かした溶液に、６−マレイミドヘキサン酸（１３μｇ）の水溶液を加えた。得られた溶液を室温で２時間振盪した。ＵＰＬＣ−ＭＳ（分析方法Ｇ）によって、単一付加物の生成だけが示された。測定値：６６６４９．０、予想値：６６６４８。
− ＤＴＴによる脱キャッピング
１５ｍＬチューブに入った、アルブミン（４００ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ、ヒト血清からの凍結乾燥粉末）を５ｍＬのＰＢＳ １×緩衝液に溶かした溶液に、ＤＴＴの溶液（０．２３２μｌ、生物学グレード精製水中２ｍｇ／ｍＬ）を一度に加えた。得られた溶液を室温で２時間振盪し、次いで脱塩し、２０本のＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−０．５遠心式フィルター（１０Ｋ ＭＷＣＯ）で洗浄した。フィルターを１４Ｋ ｇで１０分間スピンにかけ、濾液を廃棄した。各フィルターの頂部に生物学グレード精製水を加えてそれぞれ洗浄し（１４Ｋ ｇで１０分間スピンにかけ）、洗浄過程を６回繰り返した。脱キャッピングされたＨＳＡを水（合計約２０ｍＬ）に溶解させた。溶液を５０ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移し、凍結乾燥して、結晶質の粉末（３７６ｍｇ）を得た。
純粋な生成物をＵＰＬＣ−ＭＳによって分析した（分析方法Ｇ、測定値：６６４３８．５、予想値：６６４３７）。
− 脱キャッピングされたＨＳＡ中の遊離チオール基の数の算定
２ｍＬチューブに入った、この脱キャッピングされたＨＳＡ（３ｍｇ）を４００μＬのＰＢＳ ｐＨ７．４に溶かした溶液に、３−マレイミドプロピオン酸（２５μｇ）の水溶液を加えた。得られた溶液を室温で終夜振盪した。ＵＰＬＣ−ＭＳ（分析方法Ｇ）によって、単一付加物の生成だけが示された。測定値：６６６０８．０、予想値：６６６０６。
− システインによる脱キャッピング
２ｍＬチューブに入った、アルブミン（１２０ｍｇ、Ａｌｄｒｉｃｈ、ヒト血清からの凍結乾燥粉末）を１ｍＬの５０ｍＭ ＰＢＳ緩衝液ｐＨ８．０に溶かした溶液に、システイン（１０．９４ｍｇ）を一度に加えた。得られた溶液を室温で１時間振盪し、次いで脱塩し、２本のＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−０．５遠心式フィルター（１０Ｋ ＭＷＣＯ）で洗浄した。フィルターを１４Ｋ ｇで１０分間スピンにかけ、濾液を廃棄した。各フィルターの頂部に生物学グレード精製水を加えてそれぞれ洗浄し（１４Ｋ ｇで１０分間スピンにかけ）、洗浄過程を５回繰り返した。脱キャッピングされたＨＳＡを、水（合計４ｍＬ）に溶解させた。溶液を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移し、凍結乾燥して、結晶質の粉末（１０８ｍｇ）を得た。
純粋な生成物をＵＰＬＣ−ＭＳによって分析した（分析方法Ｇ、測定値：６６４３９、予想値：６６４３７）。
− 脱キャッピングされたＨＳＡ中の遊離チオール基の数の算定
２ｍＬチューブに入った、この脱キャッピングされたＨＳＡ（３ｍｇ）を５００μＬのＰＢＳ ｐＨ７．４に溶かした溶液に、３−マレイミドプロピオン酸（１５μｇ）の水溶液を加えた。得られた溶液を室温で１時間振盪した。ＵＰＬＣ−ＭＳ（分析方法Ｇ）によって、単一付加物の生成だけが示された。測定値：６６６０８．０、予想値：６６６０６。
ステップ２：
ペプチド−リンカー構築物１：ＰＰＡ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｃ＊−Ｌ−Ｓ−Ｃ＊−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）フェネチルアミン［ＰＰＡは、３−（ピリジン−２−イルジスルファニル）プロパン酸である］の合成
− 中間体１ａの調製
（線状ペプチドの組み立て）Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｃ＊−Ｌ−Ｓ−Ｃ＊−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）フェネチルアミン
− フェネチルアミン−ＡＭＥＢＡ樹脂（Ａｌｄｒｉｃｈ、０．２５ｍｍｏｌ）をＬｉｂｅｒｔｙ（商標）マイクロ波ペプチド合成装置での固相ペプチド合成にかける。カップリングを以下のとおりに実施する。
− 中間体１ｂの調製
（保護基の除去を伴う樹脂からの切断、次いで精製）
６ｍＬのＴＦＡ／ＴＩＰＳ／水（９５：２．５：２．５）中の１．５４ｇのＤＴＴおよび０．７５ｍＬのチオアニソールでできた溶液を、中間体１ａ（０．２５ｍｍｏｌ）に加え、懸濁液を室温で５時間振盪する。切断溶液を濾別し、樹脂を９５％ＴＦＡ水溶液で洗浄する。合わせた切断および洗浄溶液を冷ジエチルエーテル上に注いで、沈殿を得る。懸濁液を遠心分離し、上清を廃棄する。残渣にジエチルエーテルを加え、懸濁液を３分間ボルテックスし、遠心分離し、上清を廃棄する。洗浄過程を３回繰り返す。固体を高真空中で乾燥させる。粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、中間体１ｂを得る。
− 中間体１ｃの調製
（環化および精製
中間体１ｂをＨ２Ｏ（２．０ｍＬ）に溶解させる。撹拌した溶液に、５０ｍＭのＩ２ ＡｃＯＨ溶液（１．３当量）を一度に加え、溶液を室温で終夜撹拌し、ＬＣ／ＭＳによって、反応の完了が示される。０．５Ｍのアスコルビン酸Ｈ２Ｏ溶液を加えて、過剰のＩ２を失活させる。粗生成物を分取ＨＰＬＣによって精製し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、中間体１ｃを得る。
− ペプチド−リンカー構築物１中間体１ｃの調製
中間体１ｃ、２，２’−ジチオジピリジン（３当量）のＡＣＮ中混合物を、２５℃で１時間振盪する。反応混合物をＭｅＯＨで希釈し、濾過する。溶液を分取ＨＰＬＣによって精製し、ＡＣＮ／Ｈ２Ｏから凍結乾燥して、ペプチド−リンカー構築物１を得る。
ステップ３：ペプチド−リンカー構築物／アルブミンコンジュゲーション
脱キャッピングされたＨＳＡ（１００ｍｇ）をＰＢＳ緩衝液（６ｍＬ）に溶かした溶液を、ＰＰＡ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｏ２Ｏｃ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｃ＊−Ｌ−Ｓ−Ｃ＊−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）フェネチルアミン（水中に２当量）の溶液で処理する。得られた溶液を室温で１時間振盪し、次いで脱塩し、４本のＡｍｉｃｏｎ Ｕｌｔｒａ−０．５遠心式フィルター（１０Ｋ ＭＷＣＯ）で洗浄する。フィルターを１３Ｋ ｇで１０分間スピンにかけ、濾液を廃棄する。各フィルターの頂部に生物学グレード精製水を加えてそれぞれ洗浄し（１３Ｋ ｇで１０分間スピンにかけ）、洗浄過程を６回繰り返す。コンジュゲートを水（合計４ｍＬ）に溶解させる。溶液を１５ｍＬのＦａｌｃｏｎチューブに移し、凍結乾燥して、実施例３９を得る。
［実施例４０］
ＢＣＮ−ＰＥＧリンカーを介して脂肪酸にコンジュゲートさせたアペリン環状ペプチド：
ステップ１：アペリン環状ペプチド−ＢＣＮ構築物の調製：ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｃ＊−Ｌ−Ｓ−ＣＰ−Ｎ６−［［（１α，８α，９α）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメトキシ］カルボニル］−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）−ＮＨ（フェネチル）［ジスルフィドＣ４−Ｃ７］の調製
ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｃ＊−Ｌ−Ｓ−Ｃ＊−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）−ＮＨ（フェネチル）トリアセテート［ジスルフィドＣ４−Ｃ７］（実施例３２：１００ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）、炭酸水素ナトリウム（３８ｍｇ、０．４５２ｍｍｏｌ）、および水（８３ｕＬ）をＤＭＦ（１ｍＬ）に混ぜた混合物を、室温で１０分間撹拌し、次いで、（１Ｒ，８Ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチルスクシンイミジルカーボネート（Ｂｅｒｒｙ＆ａｓｓｏｃｉａｔｅｓ、２０ｍｇ、０．０６８ｍｍｏｌ）を加えた。反応混合物を室温で９０分間撹拌した。混合物に１ｍＬの水を加え、得られた溶液を凍結乾燥して粉末を得、これをそれ以上精製せずに次のステップに使用した。
ステップ２：ジ−ｔｅｒｔ−ブチル２−（ウンデカ−１０−イン−１−イル）マロネート
Ｎ２中にて、マロン酸ジ−ｔｅｒｔ−ブチル（８００ｍｇ、３．７０ｍｍｏｌ）をＤＭＦ（９ｍＬ）に０℃で溶解させ、ＮａＨ（１４８ｍｇ、３．７０ｍｍｏｌ）を加える。反応液を０℃で３０分撹拌し、１１−ブロモ−デカ−１−エン（３．３３ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下添加して、黄色の溶液を得る。反応液を０℃で２時間撹拌し、次いで室温に温め、１６時間撹拌する。混合物をＥｔＯＡｃ（７５ｍＬ）に溶かし、Ｈ２Ｏ（２５ｍＬ）で洗浄する。水性層をＥｔＯＡｃ（７５ｍＬ）で抽出し、合わせた有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮する。混合物をフラッシュカラム（１２ｇシリカカートリッジ、０〜２０％のＥｔＯＡｃ／ヘプタン）で精製し、画分を濃縮して、所望の生成物を得る。
ステップ３：１１，１１−ジ−ｔｅｒｔ−ブチル１−エチルドコサ−２１−エン−１，１１，１１−トリカルボキシレート
ステップ２からの化合物（０．４４２ｍｍｏｌ）を０℃でＤＭＦ（２ｍＬ）に溶解させ、ＮａＨ（２１．２３ｍｇ、０．５３１ｍｍｏｌ）を加える。反応液を０℃で１５分間撹拌し、エチル１１−ブロモウンデカノエート（１４３ｍｇ、０．４８６ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下添加する。反応液を室温に温め、１６時間撹拌する。混合物をＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）で希釈し、Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）で１回洗浄する。水性層をＥｔＯＡｃ（４０ｍＬ）で１回抽出し、有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮する。サンプルを１ｍＬのＤＣＭに溶解させ、フラッシュカラム（１２ｇシリカカラム、０〜２０％のＥｔＯＡｃ／ヘプタン、１５分）で精製する。画分を合わせ、濃縮して、所望の生成物を得る。
ステップ４：１２，１２−ビス（ｔｅｒｔ−ブトキシカルボニル）トリコサ−２２−エン酸
Ｎ２中にて、ステップ３からの化合物（０．０３７ｍｍｏｌ）のｔＢｕＯＨ（１ｍＬ）溶液に、３０℃でＫＯｔＢｕ（１１４ｍｇ、１．０１２ｍｍｏｌ）のｔＢｕＯＨ（２ｍＬ）溶液を加える。混合物を室温で撹拌し、ＴＬＣ（１：１のＥｔＯＡｃ／ヘキサン、ＫＭｎＯ４、還流）によってモニターする。反応が完了した後、１Ｍ ＨＣｌ（２０ｍＬ）で反応混合物を失活させ、ＥｔＯＡｃ（２５ｍＬ）で２回抽出する。有機層を合わせ、Ｎａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮する。材料をそれ以上精製せずに持ち越した。
ステップ５：ドコサ−２１−エン−１，１１，１１−トリカルボン酸
ステップ４からの化合物（０．０２２ｍｍｏｌ）にＴＦＡ（２ｍＬ）を加え、反応液を室温で１時間撹拌する。混合物をＤＣＭ（１０ｍＬ）で希釈し、濃縮する。材料をＥｔＯＡｃ（１０ｍＬ）に溶かし、Ｈ２Ｏ（２０ｍＬ）で洗浄する。有機層をＮａ２ＳＯ４で乾燥させ、濾過し、濃縮する。粗製材料を１ｍＬのＭｅＯＨに溶解させ、ＭＳ起動式ＨＰＬＣ（MS-triggered HPLC）（Ｓｕｎｆｉｒｅ ３０×５０ｍｍ ５ｕｍカラム ０．１％ＴＦＡ含有ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ ７５ｍｌ／分、１．５ｍｌ注入、３．５分かけて４５〜７０％のＡＣＮ）で精製する。
ステップ６：２−（（（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）オキシ）カルボニル）−２−（ウンデカ−１０−エン−１−イル）トリデカン二酸
Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（９９ｍｇ、０．８６２ｍｍｏｌ）およびドコサ−２１−エン−１，１１，１１−トリカルボン酸（中間体４５：４００ｍｇ、０．９０８ｍｍｏｌ）をＤＣＭ（７ｍＬ）およびＴＨＦ（０．７ｍＬ）に溶かした溶液に、ＤＣＭ（２ｍＬ）中ＤＣＣ（１８７ｍｇ、０．９０８ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を終夜撹拌した後、溶媒を蒸発させた。残渣をＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０〜５０ｍｍ、５５〜８０％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、表題化合物（１５５ｍｇ、０．２８８ｍｍｏｌ、３２％）を得た。ＬＣＭＳ方法Ｅによる。Ｒｔ＝１．５１分、Ｍ＋Ｈ ５３８．３；
ステップ７：脂肪酸−ＰＥＧリンカー
アジド−ｄＰＥＧ２３−アミン（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｄｅｓｉｇｎ：１６４ｍｇ、０．１４９ｍｍｏｌ）およびステップ６からの化合物（８０ｍｇ、０．１４９ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（２．５ｍＬ）に溶解させた。ＤＩＰＥＡ（３９μＬ、０．２３３ｍｍｏｌ）を加え、反応液を終夜撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ、４５〜７０％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、化合物Ａ（９７ｍｇ、０．０６１ｍｍｏｌ、４１％）およびＢ（３２ｍｇ、０．０２１ｍｍｏｌ、１４％）を得た。ＬＣＭＳ ＺＱ１方法Ｅ Ｒｔ＝１．３５分、［Ｍ＋２Ｈ］＋２ ７６１．９；
ステップ８：実施例４０の調製：
ｐＥ−Ｒ−Ｐ−Ｃ＊−Ｌ−Ｓ−Ｃ＊−Ｎ６−［［（１α，８α，９α）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメトキシ］カルボニル］−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）−ＮＨ（フェネチル）［ジスルフィドＣ４−Ｃ７］（１ｍＬの水中にステップ１からの生成物５０ｍｇ、０．０３４ｍｍｏｌ）とステップ７からの化合物Ａ（２６８ｕＬの水中に５２ｍｇ）の混合物を、室温で約３時間撹拌した。次いで、反応混合物を分取ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ ３０×５０ｍｍ ５ｕｍカラム ０．１％ＴＦＡ含有ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ ７５ｍｌ／分、５分で１５〜４０％のＡＣＮの勾配）によって精製した。生成物画分を凍結乾燥して、表題生成物をＴＦＡ塩（２４ｍｇ、２１％）として得た。ＬＣＭＳ（Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７ｕｍ ２．１×５０ｍｍ、５０℃、溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ギ酸、勾配 ５．１５分かけて２％〜９８％のＢ／Ａ）：保持時間：２．７７分、ＭＳ［Ｍ＋２］２＋：実測値：１４９１．８８０８、計算値：１４９１．８５６０。
［実施例４１］
Ｎ末端における脂肪酸とのアペリン環状ペプチドコンジュゲート
ステップ１：Ａ−Ｈ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｃ−Ｌ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−ＤＮｌｅ−フェネチルアミン中間体４１ａの合成
フェネチルアミン−ＡＭＥＢＡ樹脂（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、０．１ｍｍｏｌ、１．０ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ａｒｇ残基に２倍の標準Ａｒｇを用い、ＤＮｌｅが２倍テンポでカップリングされる、自動ペプチド合成装置（ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ）での固相ペプチド合成にかけた。アミノ酸は、０．２Ｍ ＤＭＦ溶液として調製した。標準カップリングサイクルは、次のとおりに定めた。
− アミノ酸カップリング：ＡＡ（５当量）、ＨＡＴＵ（５当量）、ＤＩＥＡ（２５当量）
− 洗浄：ＤＭＦ（３×７ｍＬ）
− Ｆｍｏｃ脱保護：２０％ピペリジン／０．１Ｍ ＨＯＢｔ（２×７ｍＬ）
− 洗浄：ＤＭＦ（４×７ｍＬ、次いで１×５ｍＬ）
ペプチドを組み立てた後、樹脂をＤＭＦ（２×５０ｍＬ）およびＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で洗浄し、次いで真空中で乾燥させて、中間体４１ａ（２７６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を得た。
ステップ２：中間体４１ｂの調製（樹脂からのペプチドの切断）
中間体４１ａ（２７６ｍｇ、０．１ｍｍｏｌ）を４ｍＬのＴＦＡ溶液（３７ｍＬのＴＦＡ、１ｍＬのＨ２Ｏ、１ｍＬのＴＩＰＳ、３．０６ｇのＤＴＴ）と合わせ、室温で３時間振盪した。溶液を樹脂から取り去り、４０ｍＬの冷Ｅｔ２Ｏ中に沈殿させた。溶液をボルテックスし、氷上で１０分間静置した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。溶媒を除去し、白色の固体を冷Ｅｔ２Ｏ（各回４０ｍＬ）でもう２回洗浄し、遠心分離（各回５分）し、デカントした。固体を真空中で終夜乾燥させて、中間体４１ｂ−バッチ１（１７．４ｍｇ、０．０１２ｍｍｏｌ）を得た。ＬＣＭＳ（ＳＱ２生成物分析−酸性−ペプチド−極性、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、５０℃）：Ｒｔ＝１．８３分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］１５１３．５。
ステップ３：中間体４１ｃの調製（システイン残基の環化）
中間体４１ｂ−バッチ１および２（２９．６ｍｇ、０．０２０ｍｍｏｌ）を、水（３ｍＬ）および１０滴のＤＭＳＯに溶解させて、わずかに濁った溶液を得た。ヨウ素（５０ｍＭ ＨＯＡｃ溶液、０．７８３ｍＬ、０．０３９ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下添加し、反応液を室温で終夜混合した。粗反応液のＬＣＭＳ分析によって、出発材料の完全な変換が示された。色が消失するまで、０．５Ｍのアスコルビン酸を滴下添加した。材料をＭＳ起動式ＨＰＬＣで精製した。プールされた画分を凍結乾燥すると、７ｍｇの所望の生成物が白色の粉末（４．６３μｍｏｌ、２４％）として得られた。ＬＣＭＳ（ＳＱ２生成物分析−酸性−ペプチド、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、５０℃）：Ｒｔ＝０．９０分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］１５１１．８。
ステップ４：１−ベンジル３−ｔｅｒｔ−ブチル２−ウンデシルマロネート
Ｎ２中の０℃のＮａＨ（１６０ｍｇ、４．０ｍｍｏｌ）ＤＭＦ（８ｍＬ）懸濁液に、ＤＭＦ（２ｍＬ）中ベンジルｔｅｒｔ−ブチルマロネート（１．０ｇ、４．０ｍｍｏｌ）を加えた。混合物を５０分間撹拌し、その後、ＤＭＦ（２ｍＬ）中１−ブロモウンデカンを加えた。さらに１時間撹拌した後、反応液を室温に温めた。反応を終夜持続させた。Ｅｔ２Ｏ（１００ｍＬ）と水（２０ｍＬ）を加えて、反応液を分配した。水性相をＥｔ２Ｏ（１００ｍＬ）で抽出し、合わせた有機材料をＮａ２ＳＯ４で乾燥させた。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュカラム（Ｃ１８ １２ｇ、４０〜１００％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、表題化合物を無色の油状物（１．１４ｇ、２．８２ｍｍｏｌ、７１％）として得た。ＬＣＭＳ方法Ｆ Ｒｔ＝１．５８分、Ｍ＋Ｎａ ４２７．４；
ステップ５：１，１１−ジベンジル１１−ｔｅｒｔ−ブチルドコサン−１，１１，１１−トリカルボキシレート
表題化合物は、ステップ４からの化合物（１７７ｍｇ、０．２８４ｍｍｏｌ）を出発材料として使用し、実施例４０のステップ３と同様の要領で合成して、無色の油状物（１５３ｍｇ、０．２１３ｍｍｏｌ、７５％）を得た：
ステップ６：１３−（ベンジルオキシ）−２−（（ベンジルオキシ）カルボニル）−１３−オキソ−２−ウンデシルトリデカン酸
ステップ５からの化合物（２００ｍｇ、０．２９５ｍｍｏｌ）のＤＣＭ（３ｍＬ）溶液に、ＴＦＡ（０．６ｍＬ）を加え、反応液を室温で３時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュカラム（シリカ１２ｇ、０〜１５％のＥｔＯＡｃ／ＨＥＰ）によって精製して、表題化合物（１７７ｍｇ、０．２８４ｍｍｏｌ、９６％）を得た：
ステップ７：１，１１−ジベンジル１１−（２，５−ジオキソシクロペンチル）ドコサン−１，１１，１１−トリカルボキシレート
表題化合物は、ステップ６からの化合物（１７７ｍｇ、０．２８４ｍｍｏｌ）を出発材料として使用し、実施例４０のステップ６と同様の要領で合成して、無色の油状物（１５３ｍｇ、０．２１３ｍｍｏｌ、７５％）を得た：
ステップ８：
アミノ−ＰＥＧ２４−酸を装入したバイアルに、中間体３４（１４５ｍｇ、０．２０１ｍｍｏｌ）をＴＨＦ（１．５ｍＬ）およびＤＣＭ（１．５ｍＬ）に溶かした溶液を加えた。ＤＩＰＥＡ（８８μＬ、０．５０４ｍｍｏｌ）を加え、反応液をシェーカープレート上で１５時間撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣を超臨界流体クロマトグラフィー（Ｗａｔｅｒｓ ＨＩＬＩＣ ２０×１５０ｍｍ、１５〜２５％のＭｅＯＨ／ＣＯ２）によって精製して、中間体３５（１５１ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ、４３％）を得た。ＬＣＭＳ方法Ｅ Ｒｔ＝１．３０分、［Ｍ＋２Ｈ］＋２ ８７６．４；
ステップ９：
中間体３５（１５０ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）およびＮ−ヒドロキシスクシンイミドをＤＣＭ（１．５ｍＬ）に溶かした溶液に、ＤＣＭ（０．２６５ｍＬ）中ＤＣＣ（２２ｍｇ、０．１０３ｍｍｏｌ）を加えた。反応液を１．５時間撹拌した。追加のＴＨＦ（０．５ｍＬ）中Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（１０ｍｇ）およびＤＣＭ（０．２６５ｍＬ）中ＤＣＣ（２２ｍｇ）を加え、反応液を終夜撹拌した。溶媒を蒸発させ、残渣をフラッシュカラム（シリカ１２、０〜５％のＭｅＯＨ／ＤＣＭ）によって精製して、中間体３６（１５９ｍｇ、定量的）を白色の固体として得た。ＬＣＭＳ方法Ｇ Ｒｔ＝１．５５分、［Ｍ＋Ｈ３Ｏ＋Ｈ］＋２ ９３３．９。
ステップ１０：
ステップ９からの化合物（１５９ｍｇ、０．０８６ｍｍｏｌ）のＴＨＦ（５ｍＬ）溶液に、１０％Ｐｄ炭素（４．６ｍｇ、４．３ｍｏｌ）のＴＨＦ（１ｍＬ）懸濁液を加えた。反応液を水素中に置き、４０分間撹拌した。さらにＰｄ炭素（７ｍｇ、６．５μｍｏｌ）を加え、水素中でもう１時間撹拌した。反応液をメンブランフィルターに通し、濾液を蒸発にかけた。残渣をＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ Ｃ１８ ３０×５０ｍｍ、４５〜７０％のＡＣＮ／水＋０．１％ＴＦＡ）によって精製して、表題化合物（８３ｍｇ、０．０４７ｍｍｏｌ、５４％）を得た。ＬＣＭＳ方法Ｇ Ｒｔ＝１．０３分、［Ｍ＋２Ｈ］＋２ ８３５．２；
ステップ４：アペリン構築物Ａ−Ｈ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｃ−Ｌ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−ＤＮｌｅ−フェネチルアミンと脂肪酸−ＰＥＧ構築物とを含むコンジュゲート（Ｎ末端コンジュゲーション）−実施例４１の調製
１０ｍｇ／ｍＬのＮＨＳ−脂肪酸（実施例４０のステップ７からの生成物Ａ）の溶液を、Ｈ２Ｏ中に調製した。中間体４１ｃ（１．５ｍｇ、０．９９３μｍｏｌ）を３０ｍＭのｐＨ４ ＮａＯＡｃ緩衝液（６７２μＬ）に溶解させ、ＮＨＳ−脂肪酸（０．８５０ｍＬ、５．１０μｍｏｌ）を加えた。反応液を室温で１６時間混合し、その時点で、追加の１．５ｍｇのＮＨＳ−脂肪酸（Ｈ２Ｏ中１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、反応液を室温で１６時間混合した。８ｍｇのＮＨＳ−脂肪酸（Ｈ２Ｏ中１０ｍｇ／ｍＬ）を加え、反応液を室温で３日間混合し、１．７ｍｇのＮＨＳ−脂肪酸（Ｈ２Ｏ中１０ｍｇ／ｍＬ）を加えた。混合物を室温で１６時間振盪し、Ｍ作動式ＨＰＬＣで精製して、１．７ｍｇの表題化合物を白色の粉末（０．５１０μｍｏｌ、５１％）として得た。ＬＣＭＳ（ＳＱ２生成物分析−酸性−ペプチド−極性、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、５０℃）：Ｒｔ＝３．８７分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ＋２／２］１５３３．１、［Ｍ＋Ｈ＋３／３］１０２２．９。
［実施例４２］
ＡＨ−Ｆｃのアペリン環状ペプチドとのコンジュゲーション
ステップ１：ＡＨ−Ｆｃ構築物の調製：
構築物クローン化：
マウスＩｇκ鎖シグナルペプチドに続いてヒトＦｃおよび短いビス−アミノ酸配列（ＡＨ）を含んでいるＤＮＡ断片を、５’−ＮｈｅＩおよび３’−ＥｃｏＲＩ制限部位を用いた遺伝子合成（ＧｅｎｅＡｒｔ）によってコドン最適化した。得られる配列を、ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩの両方を用いて制限消化し、ＣＭＶプロモーターの下流で、ベクターｐＰＬ１１４６のＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位に連結した。連結を大腸菌（E coli）ＤＨ５α細胞に形質転換し、適正な挿入物を含んでいるコロニーを、ＤＮＡ配列決定によって鑑別した。示す配列は、センス鎖についてのものであり、５’から３’方向に伸びている。
ＡＨ−Ｆｃ構築物の配列：
ＡＨ−Ｆｃタンパク質発現および精製：
標準のポリエチレンイミン法を使用して、１ｍｌあたり１×１０６細胞の密度で、ＡＨ−Ｆｃ発現プラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した。次いで、５００ｍｌの培養物を、３Ｌフラスコ中のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において３７℃で４日間成長させた。
ＡＨ−Ｆｃタンパク質を、清澄化した条件培地から精製した。簡潔に述べると、５００ｍｌの条件培地を、４ｍｌ／分で、５ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に流した。０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４を含有する２０カラム体積のＰＢＳでカラムを洗浄し、次いで、ＡＨ−Ｆｃタンパク質を０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．７）で溶離させ、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）で中和し、ＰＢＳに対して透析した。タンパク質収量は、条件培地５００ｍｌあたり１０〜２０ｍｇであり、エンドトキシンレベルは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＥＮＤＯＳＡＦＥ ＰＴＳ試験によって測定したとき、１ＥＵ／ｍｇを下回った。
ＡＨ−Ｆｃタンパク質の品質管理：
ＡＨ−Ｆｃタンパク質のＬＣ／ＭＳ：ピークは、不均一であり、二量体について予想されるより約３ｋＤａ大きかった。これは、Ｎ−連結型グリコシル化コンセンサス部位を有するＦｃについて予想されるＮ−連結型グリコシル化の特性を示している。
還元されたＮ−脱グリコシルＡＨ−Ｆｃタンパク質のＬＣ／ＭＳ：鋭利なピークを示す。ＡＨ−Ｆｃの分子量は、予想どおりであった。Ｃ末端のシステインは、タンパク質を切断から保護すると思われる。
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００での分析的サイズ排斥：Ｆｃ−アペリンタンパク質は、８９％〜１００％の間の二量体、０〜１０％の四量体、および０〜１％の凝集体を有する。
還元ＳＤＳ／ＰＡＧＥ：すべてのタンパク質が、主に、予想されたサイズのモノマーとして移動した。
ステップ２：ＮＨ２−アジドＬｙｓ−ＧＧＧＧＳ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｃ−Ｌ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−Ｄｎｌｅ−フェネチルアミンの合成
フェネチルアミン−ＡＭＥＢＡ樹脂（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、０．２５ｍｍｏｌ、１．０ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ａｒｇ残基に２倍の標準Ａｒｇを用い、Ｄ−Ｎｌｅおよびアジドリシンが２倍テンポでカップリングされる、自動ペプチド合成装置（ＣＥＭ Ｌｉｂｅｒｔｙ Ｂｌｕｅ Ｍｉｃｒｏｗａｖｅ）での固相ペプチド合成にかけた。アミノ酸は、０．２Ｍ ＤＭＦ溶液として調製した。標準カップリングサイクルは、次のとおりに定めた。
− アミノ酸カップリング：ＡＡ（５当量）、ＨＡＴＵ（５当量）、ＤＩＥＡ（２５当量）
− 洗浄：ＤＭＦ（３×７ｍＬ）
− Ｆｍｏｃ脱保護：２０％ピペリジン／０．１Ｍ ＨＯＢｔ（２×７ｍＬ）
− 洗浄：ＤＭＦ（４×７ｍＬ、次いで１×５ｍＬ）
ペプチドを組み立てた後、樹脂をＤＭＦ（２×５０ｍＬ）およびＤＣＭ（２×５０ｍＬ）で洗浄し、次いで真空中で乾燥させて、中間体４２ａ（７７０ｍｇ、０．２５０ｍｍｏｌ）を得た。
ステップ３：中間体４２ｂの調製（樹脂からのペプチドの切断）
中間体４２ａ（７７０ｍｇ、０．２５０ｍｍｏｌ）を半分に分け、各サンプルを６ｍＬのＴＦＡ溶液（３７ｍＬのＴＦＡ、１ｍＬのＨ２Ｏ、１ｍＬのＴＩＰＳ、２．５６９ｇ（２０当量）のＤＴＴ）と合わせ、室温で３時間振盪した。溶液を樹脂から取り去り、４０ｍＬの冷Ｅｔ２Ｏ中に沈殿させた。溶液をボルテックスし、氷上で１０分間静置した後、４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。溶媒を除去し、白色の固体を冷Ｅｔ２Ｏ（各回４０ｍＬ）でもう２回洗浄し、遠心分離（各回５分）し、デカントした。固体を真空中で終夜乾燥させ、Ｍ起動式ＨＰＬＣで精製して、中間体４３ｂを白色の粉末（８０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ、８０％）として得た。ＬＣＭＳ（ＳＱ２生成物分析−酸性−ペプチド−極性、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、５０℃）：Ｒｔ＝２．３２分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ＋２／２］８８８．０。
ステップ４：中間体４２ｃの調製（システイン残基の環化）
中間体４２ｂ（８０ｍｇ、０．０４５ｍｍｏｌ）を水（１．２５ｍＬ）に溶解させ、ヨウ素（５０ｍＭ ＨＯＡｃ溶液、１．８０４ｍＬ、０．０９０ｍｍｏｌ）をゆっくりと滴下添加し、反応液を室温で３時間混合した。粗反応液のＬＣＭＳ分析によって、出発材料の完全な変換が示された。色が消失するまで、０．５Ｍのアスコルビン酸を滴下添加した。材料をＭＳ起動式ＨＰＬＣで精製した。プールされた画分を凍結乾燥すると、２０．１ｍｇの所望の生成物が白色の粉末（０．０４５ｍｍｏｌ、２５％）として得られた。ＬＣＭＳ（ＳＱ２生成物分析−酸性−ペプチド−極性、Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８カラム、１３０Å、１．７μｍ、２．１ｍｍ×５０ｍｍ、５０℃）：Ｒｔ＝２．１７分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ＋２／２］８８６．８。
ステップ５：Ｆｃ−ＡＨ ＢＣＮの調製（ＡＨ−Ｆｃ Ｎ末端上でのクリックハンドルの取り付け）
Ｆｃ−ＡＨ（ステップ１より：１ｍＬ、３ｍｇ／ｍＬ、０．１１７μｍｏｌ）を３０ｍＭのＮａＯＡｃ ｐＨ４．０（４．３ｍＬ）に溶解させ、１０ｍｇ／ｍＬの（１Ｒ，８Ｓ，９ｓ）−ビシクロ［６．１．０］ノナ−４−イン−９−イルメチル（２，５−ジオキソピロリジン−１−イル）カーボネート（ＢＣＮ）のＤＭＳＯ（０．７０ｍＬ）保存液をゆっくりと加え、反応液を室温で３日間、シェーカープレートに載せた。ＢＣＮ（０．２５ｍＬ）を加え、反応液を室温で３日間混合した。ＢＣＮ（０．７０ｍＬ）を加え、反応液を室温で１６時間混合した。溶液は、１０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ遠心フィルターを使用し、反応液を５回希釈および濃縮することにより、３０ｍＭのＮａＯＡｃ ｐＨ４．０に換えて、体積を９００μＬとした。溶液を遠心分離し、上清を除去した。濃度は、Ａ２８０によって１．７３ｍｇ／ｍＬ（１．５６ｍｇ、２６％）と測定された。ＬＣＭＳ（ＱＴ２、タンパク質＿２０〜７０ｋＤａ＿３分、Ｐｒｏｓｗｉｆｔ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ４．６×５０ｍｍ、５０℃、溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：ＣＡＮ＋０．１％ギ酸、２分かけて２〜９８％）Ｒｔ＝１．５８分。
ステップ６：実施例４２の調製：中間体４３ｃにコンジュゲートさせたＦｃ−ＨＡ−ＢＣＮ
５０ｍｇ／ｍＬの中間体４２ｃのＨ２Ｏ保存液を調製した。（ステップ５からの）Ｆｃ−ＨＡ−ＢＣＮの３０ｍＭ ＮａＯＡｃ ｐＨ４．０保存液（１．７３ｍｇ／ｍＬ、１．５６ｍｇ、０．０３０μｍｏｌ）に、中間体４３ｃ（５３．７μＬ、１．５１５μｍｏｌ）を加え、反応液を室温で１６時間混合した。溶液は、５０ｋＤａ ＭＷＣＯ Ａｍｉｃｏｎ遠心フィルターを使用し、反応液を５回希釈および濃縮することにより、３０ｍＭのＮａＯＡｃ ｐＨ４．０に換えて、体積を２５０μＬとした。濃度は、Ａ２８０によって３．３２ｍｇ／ｍＬ（８３０μｇ、５０％）と測定された。ＬＣＭＳ（ＱＴ２、タンパク質＿３５〜７０ｋＤａ＿３分、Ｐｒｏｓｗｉｆｔ Ｍｏｎｏｌｉｔｈ ４．６×５０ｍｍ、５０℃、溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：ＣＡＮ＋０．１％ギ酸、２分かけて１０〜８０％のＢ）Ｒｔ＝１．４３分、ＭＳ［Ｍ（グリコシル化）＋Ｈ］５４５２４．５。
［実施例４３］
ソルターゼを使用してのＦｃ−アペリンコンジュゲート：
ステップ１：Ｆｃ−ソルターゼ構築物の調製：
構築物クローン化：
マウスＩｇκ鎖シグナルペプチドに続いてヒトＦｃおよびソルターゼ認識配列（ＬＰＸＴＧ）を含んでいるＤＮＡ断片を、５’−ＮｈｅＩおよび３’−ＥｃｏＲＩ制限部位を用いた遺伝子合成（ＧｅｎｅＡｒｔ）によってコドン最適化した。得られる配列を、ＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩの両方を用いて制限消化し、ＣＭＶプロモーターの下流で、ベクターｐＰＬ１１４６のＮｈｅＩおよびＥｃｏＲＩ部位に連結した。連結を大腸菌（E coli）ＤＨ５α細胞に形質転換し、適正な挿入物を含んでいるコロニーを、ＤＮＡ配列決定によって鑑別した。示す配列は、センス鎖についてのものであり、５’から３’方向に伸びている。
タンパク質発現および精製：
標準のポリエチレンイミン法を使用して、１ｍｌあたり１×１０６細胞の密度で、Ｆｃ−ソルターゼ発現プラスミドＤＮＡをＨＥＫ２９３Ｔ細胞に形質移入した。次いで、５００ｍｌの培養物を、３Ｌフラスコ中のＦｒｅｅＳｔｙｌｅ ２９３ Ｍｅｄｉｕｍ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）において３７℃で４日間成長させた。
Ｆｃ−ソルターゼタンパク質を、清澄化した条件培地から精製した。簡潔に述べると、５００ｍｌの条件培地を、４ｍｌ／分で、５ｍｌのＨｉＴｒａｐ ＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ）に流した。０．１％のＴｒｉｔｏｎ Ｘ−１１４を含有する２０カラム体積のＰＢＳでカラムを洗浄し、次いで、Ｆｃ−ソルターゼタンパク質を、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．７）で溶離させ、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）で中和し、ＰＢＳに対して透析した。タンパク質収量は、条件培地５００ｍｌあたり１０〜２０ｍｇであり、エンドトキシンレベルは、Ｃｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ ＥＮＤＯＳＡＦＥ ＰＴＳ試験によって測定したとき、１ＥＵ／ｍｇを下回った。
Ｆｃ−ソルターゼタンパク質の品質管理
未変性Ｆｃ−ソルターゼタンパク質のＬＣ／ＭＳ：ピークは、不均一であり、二量体について予想されるより約３ｋＤａ大きかった。これは、Ｎ−連結型グリコシル化コンセンサス部位を有するＦｃについて予想されるＮ−連結型グリコシル化の特性を示している。
還元されたＮ−脱グリコシルＦｃ−ソルターゼのＬＣ／ＭＳ：ピークは鋭利であった。分子量は、おそらくはシステイン２個分の還元のために、理論上より２ダルトン小さかった。
Ｓｕｐｅｒｄｅｘ ２００での分析的サイズ排斥：Ｆｃ−ソルターゼタンパク質は、８９％〜１００％の間の二量体、０〜１０％の四量体、および０〜１％の凝集体を有する。
還元ＳＤＳ／ＰＡＧＥ：タンパク質は、主に、予想されたサイズのモノマーとして移動した。
ステップ２：ソルターゼコンジュゲーション用のアペリンペプチド（Ｈ２Ｎ−ＧＧＧＧＧＱＲＰＣ＊ＬＳＣ＊ＫＧＰ（Ｄ−Ｎｌｅ）フェネチルアミン）の調製
ステップ２ａ：中間体４３ａの調製
フェネチルアミン−ＡＭＥＢＡ樹脂（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、０．２５ｇ、０．２５ｍｍｏｌ、１．０ｍｍｏｌ／ｇ）を、Ａｒｇ残基に２倍の標準Ａｒｇを用いた、自動ペプチド合成装置（ＣＥＭ ＬＩＢＥＲＴＹ）での固相ペプチド合成にかけた。アミノ酸は、０．２Ｍ ＤＭＦ溶液として調製した。カップリングサイクルは、次のとおりに定めた。
− アミノ酸カップリング：ＡＡ（４．０当量）、ＨＡＴＵ（４．０当量）、ＤＩＥＡ（２５当量）
− 洗浄：ＤＭＦ（３×１０ｍＬ、各回１分）
− Ｆｍｏｃ脱保護：ピペリジン／ＤＭＦ（１：４）（１０ｍＬ、７５℃で１分間、次いで１０ｍＬ、７５℃で３分間）
− 洗浄：ＤＭＦ（４×１０ｍＬ、各回１分）
ペプチドを組み立てた後、樹脂をＤＭＦ（３×１０ｍＬ）、ＤＣＭ（３×１０ｍＬ）で洗浄した。ペプチド樹脂を真空中にて室温で乾燥させて、中間体４３ａ（０．６２２ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）を得た。
ステップ２ｂ：中間体４２ｂ、Ｈ２Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｃ−Ｌ−Ｓ−Ｃ−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）−ＮＨ（フェネチル）の調製
１）切断および保護基の除去
中間体４３ａ（０．６２２ｇ、０．２５ｍｍｏｌ）に、９５％ＴＦＡ／２．５％Ｈ２Ｏ／２．５％ＴＩＰＳの３ｍＬの溶液およびＤＴＴ（７７１ｍｇ、５．００ｍｍｏｌ）を加え、得られる混合物を室温で３時間振盪し、次いで濾過した。濾液を４０ｍＬの冷エーテルに滴下し、次いで４０００ｒｐｍで５分間遠心分離した。溶媒を除去し、白色の固体をエーテル（３×４０ｍＬ）で洗浄し、ボルテックスし、遠心分離した。固体を高真空中にて２５℃で１時間乾燥させた。
２）精製
次いで、上記の白色の固体を分取ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ（商標）Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ（商標）３０×５０ｍｍ ５ｕｍカラム ０．１％ＴＦＡ含有ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ ７５ｍｌ／分、８分で１０〜３０％のＡＣＮの勾配）によって精製した。生成物画分を凍結乾燥して、中間体４３ｂをＴＦＡ塩（４４ｍｇ、１１％）として得た。
ステップ３：Ｈ２Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｃ＊−Ｌ−Ｓ−Ｃ＊−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）−ＮＨ（フェネチル）（ジスルフィドＣ９−Ｃ１２）、中間体４３ｃの調製
０．９ｍＬのＨ２Ｏ中の中間体４３ｂ（４４ｍｇ、０．０２８ｍｍｏｌ）に、Ｉ２（５０ｍＭのＡｃＯＨ溶液、１．１ｍＬ ０．０５５ｍｍｏｌ）を滴下添加した。混合物を室温で終夜振盪した。ＬＣ／ＭＳによって、反応が完了したことが示された。反応混合物に、溶液の色が消失するまで、０．５Ｍのアスコルビン酸溶液（ＭｅＯＨ／Ｈ２Ｏ＝１／１）を数滴加えた。混合物を、ＨＰＬＣ精製に向けてＭｅＯＨで希釈した。分取ＨＰＬＣ（Ｓｕｎｆｉｒｅ（商標）Ｐｒｅｐ Ｃ１８ ＯＢＤ（商標）３０×５０ｍｍ ５ｕｍカラム ０．１％ＴＦＡ含有ＡＣＮ／Ｈ２Ｏ ７５ｍｌ／分、８分で１０〜３０％のＡＣＮの勾配）によって精製を行った。生成物画分を凍結乾燥して、Ｈ２Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｃ＊−Ｌ−Ｓ−Ｃ＊−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）−ＮＨ（フェネチル）（ジスルフィドＣ９−Ｃ１２）中間体４３ｃをＴＦＡ塩（１３ｍｇ、３０％）として得た。ＬＣ／ＭＳ（ＱＴ２、生成物分析−ＨＲＭＳ−酸性、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ ＢＥＨ Ｃ１８ １．７ｕｍ ２．１×５０ｍｍ、５０℃、溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ギ酸、勾配 ５．１５分かけて２％〜９８％のＢ／Ａ）：保持時間：０．９８分、ＭＳ［Ｍ＋２］２＋：実測値：１５８７．７９９３、計算値：１５８７．８６８。
ステップ３：Ｆｃ−ソルターゼと中間体４３ｃのソルターゼコンジュゲーション
１）化学酵素的ソルターゼコンジュゲーション
氷浴上で、ＰＢＳ（ｐＨ７．４）緩衝液中のＦｃ−ソルターゼ（６９８μｌ、０．０４０μｍｏｌ、３．１５ｍｇ／ｍＬ）に、Ｈ２Ｎ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｇ−Ｑ−Ｒ−Ｐ−Ｃ＊−Ｌ−Ｓ−Ｃ＊−Ｋ−Ｇ−Ｐ−（Ｄ−Ｎｌｅ）−ＮＨ（フェネチル）（ジスルフィドＣ９−Ｃ１２）（６４．１μＬ、２．０１８μｍｏＬ、５０ｍｇ／ｍＬ）をＴｒｉｓ−８．０緩衝液に溶かした溶液に続いて、５２０μＭのソルターゼＡ（７８μＬ、０．０４０μｍｏＬ）の５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｃｌ ｐＨ７．４溶液、１５０ｍＭのＮａＣｌを加えた。混合物を室温で終夜振盪した。ＬＣ／ＭＳによって、反応が完了したことが示された。
２）精製および脱塩
上記溶液を、ＡＴＴＡ ＸＰＲＥＳＳにおいて、４ｍＬ／分で、５ｍＬのＨｉＴｒａｐ Ｍａｂ Ｓｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅカラム（ＧＥ Ｌｉｆｅｓｃｉｅｎｃｅｓ ＃１１−００３４−９５）に流した。カラム上で、実施例４３を２０カラム体積（ＣＶ）のＰＢＳ＋０．１％Ｔｒｉｔｏｎ １１４で洗浄し、０．１Ｍのグリシン（ｐＨ２．７）で溶離させ、１ＭのＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ９）で中和し、ＰＢＳに対して透析した。精製された溶液を、Ｚｅｂａ Ｓｐｉｎｇ Ｄｅｓａｌｔｉｎｇ Ｃｏｌｕｍｎ，５ｍＬ（８９８９１）を使用して脱塩して、１．５ｍＬの目的の溶液を得、平均濃度は、０．５９８ｍｇ／ｍＬであり、回収率は、９０％であった。ＬＣＭＳ（ＱＴ２、タンパク質＿２０〜７０ｋＤａ＿３分、ＡｃＱｕｉｔｙ ＰｒｏＳｗｉｆｔ ＲＰ−３Ｕ ４．６×５０ｍｍ、１．０ｍＬ／分、溶離液Ａ：水＋０．１％ギ酸、溶離液Ｂ：アセトニトリル＋０．１％ギ酸、勾配 ３分かけて２％〜９８％のＢ／Ａ）：Ｒｔ＝１．５５分、ＭＳ［Ｍ＋Ｈ］５８８４５．００００。
実施例４３の配列：
［ＬＳＬＳＰＧＫＧＧＧ ＧＳＬＰＥＴＧＧＧＧＧは、リンカーを表し、ＱＲＰＣ＊ＬＳＣ＊ＫＧＰ（Ｄ−Ｎｌｅ）フェネチルアミンは、ポリペプチドを表す。］
下の実施例のポリペプチドは、ＡＰＪ受容体効力について、ＥＣ５０値が約０．０１ｎＭ〜約１１００ｎＭの範囲にあることがわかった。以下の実施例のポリペプチドは、血漿安定性が２分より長い、５分より長い、１０分より長い、２０分より長い、５０分より長い、６０分より長いことがわかった。
本発明のポリペプチドは、ＡＰＪ受容体のアゴニストとして有用であり、したがって、本明細書で開示する疾患などの、ＡＰＪ受容体の活性化に反応を示す疾患および状態の治療において有用であるとみなすことができる。
さらに、こうしたペプチドの半減期は、ヒト血清アルブミンまたはＦｃドメインなどの半減期延長性部分を有する、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つに従うペプチドまたはポリペプチドを含むバイオコンジュゲートの生成によって、さらに延長され得る。
こうして本発明の例示的な実施形態について述べてきたが、当業者は、内部の開示が例示的なものに過ぎないこと、ならびに本発明の範囲内で他の種々の代替形態、改造形態、および変更形態を案出してもよいことを留意すべきである。したがって、本発明は、本明細書で例示するような詳細な実施形態に限定されない。

本発明は、以下の態様を包含し得る。
［１］
次式Ｉを有する環状ポリペプチド：

［式中、
Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、存在しない、Ｑ、Ａ、もしくはｐＥのい
ずれかであり、またはＸ１は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、Ｄ−ｈＣから選択され；ここで、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖は、Ｘ７の側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ３は、Ｐであり、またはＸ３は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、およびＤ−ｈＣから選択され；ここで、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖は、Ｘ７の側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ４は、Ｒであり、またはＸ４は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、およびＤ−ｈＣから選択され；ここで、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖は、Ｘ７の側鎖とジスルフィド結合を形成し、ここで、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４の１つだけは、Ｃ、ｃ、ｈＣ、およびＤ−ｈＣから選択される含硫アミノ酸であり、
Ｘ７は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり；かつ、Ｘ７の側鎖は、Ｘ１、Ｘ３、またはＸ４いずれかのＣ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ８は、ＫまたはＦであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ａ、ａであり、または存在せず、
Ｘ１０は、Ｐであり、または存在せず、
Ｘ１１は、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍ、またはｆであり、かつ、
Ｘ１２は、存在しない、またはＰ、ｆ、ａ、Ｄ−Ｎｖａ、もしくはＤ−Ａｂｕであり、
Ｘ１３は、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、または（Ｎ−Ｍｅ）Ｆ、Ｆ、ｆ、ａ、ｙ、およびＮａｌから選択され；ここで、
Ｎｌｅは、Ｌ−ノルロイシンであり、
Ｄ−Ｎｌｅは、Ｄ−ノルロイシンであり、
Ｄ−ｈＣは、Ｄ−ホモシステインであり、
ｈＣは、Ｌ−ホモシステインであり、
Ｎａｌは、Ｌ−ナファタリン（L-naphathaline）であり、
Ｄ−Ｎｖａは、Ｄ−ノルバリンであり、
Ｄ−Ａｂｕは、Ｄ−２−アミノ酪酸であり、
ｐＥは、Ｌ−ピログルタミン酸である］
または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩、またはこれらと実質的に同等なポリペプチド。
［２］
式ＩＩ：

［式中、
Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、存在しないか、またはＱ、Ａ、およびｐＥから選択されるかのいずれかであり、
Ｘ４は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり、
Ｘ７は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり；かつ、Ｘ７の側鎖は、Ｘ４の側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ８は、ＫまたはＦであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ａ、ａであり、または存在せず、
Ｘ１０は、Ｐであり、または存在せず、
Ｘ１１は、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍ、またはｆであり、かつ、
Ｘ１２は、存在しないか、またはＰ、ｆ、ａ、Ｄ−Ｎｖａ、およびＤ−Ａｂｕから選択され、
Ｘ１３は、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、またはＦ、（Ｎ−Ｍｅ）Ｆ、ｆ、ａ、ｙ、およびＮａｌから選択される］
を有する、上記［１］に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
［３］
式ＩＩＩ：

［式中、
Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、Ｃ、ｃ、ｈＣ、およびＤ−ｈＣから選択され、
Ｘ７は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり；ここで、Ｘ７の側鎖は、Ｘ１の側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ８は、ＫまたはＦであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ａ、ａであり、または存在せず、
Ｘ１０は、Ｐであり、または存在せず、
Ｘ１１は、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍ、またはｆであり、かつ、
Ｘ１２は、存在しないか、またはＰ、ｆ、ａ、Ｄ−Ｎｖａ、およびＤ−Ａｂｕから選択され、
Ｘ１３は、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、または（Ｎ−Ｍｅ）Ｆ、Ｆ、ｆ、ａ、ｙ、およびＮａｌから選択される］
を有する、上記［１］に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
［４］
式ＩＶ：

［式中、
Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、存在しない、Ｑ、Ａ、またはｐＥのいずれかであり、
Ｘ３は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり；ここで、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖、
Ｘ７は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり；かつ、Ｘ７の側鎖は、Ｘ３のＣ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
Ｘ８は、ＫまたはＦであり、
Ｘ９は、Ｇ、Ａ、ａであり、または存在せず、
Ｘ１０は、Ｐであり、または存在せず、
Ｘ１１は、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍ、またはｆであり、かつ、
Ｘ１２は、存在しないか、またはＰ、ｆ、ａ、Ｄ−Ｎｖａ、およびＤ−Ａｂｕから選択され、
Ｘ１３は、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、または（Ｎ−Ｍｅ）Ｆ、Ｆ、ｆ、ａ、ｙ、およびＮａｌから選択される］
を有する、上記［１］に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
［５］
Ｘ１がｐＥである、上記［１］、［２］、および［４］のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
［６］
Ｘ１が存在しない、上記［１］、［２］、および［４］のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
［７］
Ｎ末端がアミドである、上記［１］から［４］および［６］のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドの塩。
［８］
Ｎ末端が、式−ＮＨＲのアミドであり、Ｒが、アセチル、ベンゾイル、フェナシル、スクシニル、オクタノイル、４−フェニルブタノイル、４−Ｃｌ−Ｐｈ−（ＣＨ ２ ） ３ Ｃ（Ｏ）−、またはＰｈ−ＣＨ ２ ＣＨ ２ ＮＨＣ（Ｏ）−である、上記［７］に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドの塩。
［９］
Ｘ１３がＦまたはｆである、上記［１］から［８］のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
［１０］
Ｘ１３が存在しない、上記［１］から［８］のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
［１１］
Ｘ１２が存在しない、上記［１］から［１０］のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、およびエステル、もしくは塩。
［１２］
Ｃ末端がアミドである、上記［１］から［１１］のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドの塩。
［１３］
Ｃ末端が、式−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２のアミドであり、Ｒ２が、−ＮＨ ２ 、−ＮＨ−Ｍｅ、−ＮＨ−ＮＨＢｎ、または−ＮＨ−（ＣＨ ２ ） ２ −Ｐｈである、上記［１２］に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドの塩。
［１４］
Ｘ８がＫである、上記［１］から［１３］のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
［１５］
Ｘ９がＧである、上記［１］から［１４］のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
［１６］
Ｘ１０がＰである、上記［１］から［１５］のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
［１７］
Ｘ１１がＮｌｅまたはＤ−Ｎｌｅである、上記［１］から［１６］のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
［１８］

［表において、「 ＊ 」で印を付けた２つのアミノ酸は、ジスルフィドを形成しているアミノ酸を表す］
から選択される、上記［１］に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
［１９］
ａ．上記［１］から［１８］のいずれか一項に記載のペプチドもしくはポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩と、
ｂ．半減期延長性部分と
を含むバイオコンジュゲートまたはその多量体であって、前記ペプチドまたはポリペプチドと半減期延長性部分は、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合される、バイオコンジュゲートまたはその多量体。
［２０］
前記半減期延長性部分が、ＩｇＧ定常ドメインもしくはその断片またはヒト血清アルブミンである、上記［１９］に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体。
［２１］
前記半減期延長性部分が、ＬＡＬＡ変異（Ｌ２３４Ａ、Ｌ２３５Ａ）を有するＦｃＬＡＬＡ改変Ｆｃ断片である、上記［１９］または［２０］に記載のバイオコンジュゲート。
［２２］
前記半減期延長性部分が、式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶのポリペプチドに、リンカーを介して融合されるＦｃドメインであり、ここで、前記リンカーは、次式：
−［ＧＧＧＧＳ］ｎ−
を有し、ｎは、１、２または３であるか、または前記リンカーは、ＧＳまたはＧＧであり、前記の式Ｉ、ＩＩ、ＩＩＩ、またはＩＶのポリペプチドは、自然に存在するアミノ酸を含む、上記［２１］に記載のバイオコンジュゲート。
［２３］
前記ポリペプチドが、ＱＲＰＣ ＊ ＬＳＣ ＊ ＫＧＰＭＰＦ、Ｃ ＊ ＲＰＲＬＳＣ ＊ ＫＧＰＭＰＦ、およびＱＲＣ ＊ ＲＬＳＣ ＊ ＫＧＰＭＰＦ（ここで「 ＊ 」で印を付けた２つのアミノ酸は、その側鎖を介してジスルフィド結合またはアミド結合を形成しているアミノ酸を表す）から選択される式Ｉのポリペプチドである、上記［２２］に記載のバイオコンジュゲート。
［２４］
前記半減期延長性部分が、Ｃ末端リシンが欠失している、またはアラニンで置き換えられた改変Ｆｃドメインである、上記［２２］または［２３］に記載のバイオコンジュゲート。
［２５］
前記半減期延長性部分がヒト血清アルブミンである、上記［１９］または［２０］に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体。
［２６］
前記ヒト血清アルブミンが、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドのＮ末端に、次式のリンカー：

［式中、ｘは、１〜２０であり、Ｒは、線状もしくは分枝状アルキレン、シクロアルキル、ヘテロアリールのアリール、またはこれらの組合せであり、Ｒ’は、線状もしくは分枝状アルキレン、アリール、もしくはシクロアルキル、またはこれらの組合せである］
を介して化学的に連結される、上記［２５］に記載のバイオコンジュゲート。
［２７］
前記ヒト血清アルブミンが、式Ｉ〜ＩＶのいずれか１つのポリペプチドのＣ末端に、次式のリンカー：

［式中、ｘは、１〜２０であり、Ｒは、線状もしくは分枝状アルキレン、シクロアルキル、ヘテロアリールのアリール、またはこれらの組合せであり、Ｒ’は、線状もしくは分枝状アルキレン、アリール、もしくはシクロアルキル、またはこれらの組合せである］
を介して化学的に連結される、上記［１９］または［２０］に記載のバイオコンジュゲート。
［２８］
前記半減期延長性部分が脂肪酸である、上記［１９］に記載のバイオコンジュゲート。
［２９］
前記脂肪酸が、

［式中、Ａｋ ２ 、Ａｋ ３ 、Ａｋ ４ 、Ａｋ ５ 、およびＡｋ ６ は、独立して、（Ｃ ８ 〜 ２０ ）アルキレンであり、Ｒ ６ およびＲ ７ は、独立して、（Ｃ ８〜２０ ）アルキルである］
から選択される、上記［２８］に記載のバイオコンジュゲート。
［３０］
次式：

［式中、ペプチドは、ペプチドのＮ末端であり、ｎは、１、２または３であり、ｍは、０または１であり、Ａは、アラニンであり、Ｈは、ヒスチジンであり、Ｌ２は、リンカーであり、Ｃ１は、フッ素で場合により置換されている単環式、二環式、または三環式の炭素環系またはヘテロ環系であり、Ｌ １ は、Ｃ１〜Ｃ２０アルキレンリンカーであり、ここで、アルキレン鎖は、オキソ（＝Ｏ）で場合により置換されており、かつ、ここで１個または複数の炭素は、ＯまたはＮＨで置き換えられる］
を有する、上記［１９］、［２８］、または［２９］に記載のバイオコンジュゲート。
［３１］
その必要のある対象において、ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または障害を治療または予防する方法であって、
治療有効量の上記［１］から［３０］のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲートを前記対象に投与する工程を含む、方法。
［３２］
前記疾患または障害が、急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、および子癇前症から選択される、上記［３１］に記載の方法。
［３３］
医薬として使用するための、上記［１］から［３０］のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲート。
［３４］
ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または障害の治療または予防において使用するための、上記［１］から［３０］のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはそのバイオコンジュゲート。
［３５］
急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、または子癇前症の治療において使用するための、上記［１］から［３０］のいずれか一項に記載のポリペプチド、そのアミド、塩のエステル、またはそのバイオコンジュゲート。
［３６］
治療有効量の上記［１］から［３０］のいずれか一項に記載のポリペプチド、そのアミド、塩のエステル、またはそのバイオコンジュゲートと、１種または複数の治療活性のある共薬剤（co-agent）とを含む、組合せ。
［３７］
前記共薬剤が、イノトロープ、βアドレナリン受容体遮断薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）、エンドセリンアンタゴニスト、レニン阻害薬、利尿薬、ＡｐｏＡ−Ｉ模倣薬、抗糖尿病薬、抗肥満薬、アルドステロン受容体遮断薬、エンドセリン受容体遮断薬、アルドステロンシンターゼ阻害薬（ＡＳＩ）、ＣＥＴＰ阻害薬、抗凝血薬、リラキシン、ＢＮＰ（ネシリチド）、および／またはＮＥＰ阻害薬から選択される、上記［３６］に記載の組合せ。
［３８］
治療有効量の上記［１］から［３０］のいずれか一項に記載のポリペプチド、そのアミド、塩のエステル、またはそのバイオコンジュゲートと、１種または複数の薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。

Claims (23)

  1. 次式Ｉ（配列番号１）からなる環状ポリペプチド：


    ［式中、
    Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、存在しない、Ｑ、Ａ、もしくはｐＥのいずれかであり、またはＸ１は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、およびＤ−ｈＣから選択され；ここで、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖は、Ｘ７のＣ、ｃ、ｈＣまたはＤ−ｈＣの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
    Ｘ３は、Ｐであり、またはＸ３は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、およびＤ−ｈＣから選択され；ここで、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖は、Ｘ７のＣ、ｃ、ｈＣまたはＤ−ｈＣの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
    Ｘ４は、Ｒであり、またはＸ４は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、およびＤ−ｈＣから選択され；ここで、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖は、Ｘ７のＣ、ｃ、ｈＣまたはＤ−ｈＣの側鎖とジスルフィド結合を形成し、ここで、Ｘ１、Ｘ３、およびＸ４の１つだけは、Ｃ、ｃ、ｈＣ、およびＤ−ｈＣから選択される含硫アミノ酸であり、
    Ｘ７は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり；かつ、Ｘ７の側鎖は、Ｘ１、Ｘ３、またはＸ４のうちの１つのＣ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
    Ｘ８は、ＫまたはＦであり、
    Ｘ９は、Ｇ、Ａ、ａであり、または存在せず、
    Ｘ１０は、Ｐであり、または存在せず、
    Ｘ１１は、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍ、またはｆであり、かつ、
    Ｘ１２は、存在しない、またはＰ、ｆ、ａ、Ｄ−Ｎｖａ、もしくはＤ−Ａｂｕであり、かつ
    Ｘ１３は、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、または（Ｎ−Ｍｅ）Ｆ、Ｆ、ｆ、ａ、ｙ、およびＮａｌから選択され；ここで、
    Ｎｌｅは、Ｌ−ノルロイシンであり、
    Ｄ−Ｎｌｅは、Ｄ−ノルロイシンであり、
    Ｄ−ｈＣは、Ｄ−ホモシステインであり、
    ｈＣは、Ｌ−ホモシステインであり、
    Ｎａｌは、Ｌ−ナファタリン（L-naphathaline）であり、
    Ｄ−Ｎｖａは、Ｄ−ノルバリンであり、
    Ｄ−Ａｂｕは、Ｄ−２−アミノ酪酸であり、
    ｐＥは、Ｌ−ピログルタミン酸である］
    または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
  2. 式ＩＩ（配列番号２）：


    ［式中、
    Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、存在しないか、またはＱ、Ａ、およびｐＥから選択されるかのいずれかであり、
    Ｘ４は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり、
    Ｘ７は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり；かつ、Ｘ７のＣ、ｃ、ｈＣまたはＤ−ｈＣの側鎖は、Ｘ４のＣ、ｃ、ｈＣまたはＤ−ｈＣの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
    Ｘ８は、ＫまたはＦであり、
    Ｘ９は、Ｇ、Ａ、ａであり、または存在せず、
    Ｘ１０は、Ｐであり、または存在せず、
    Ｘ１１は、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍ、またはｆであり、かつ、
    Ｘ１２は、存在しないか、またはＰ、ｆ、ａ、Ｄ−Ｎｖａ、およびＤ−Ａｂｕから選択され、かつ、
    Ｘ１３は、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、またはＦ、（Ｎ−Ｍｅ）Ｆ、ｆ、ａ、
    ｙ、およびＮａｌから選択される］
    からなる、請求項１に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
  3. 式ＩＩＩ（配列番号４）：


    ［式中、
    Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、Ｃ、ｃ、ｈＣ、およびＤ−ｈＣから選択され、
    Ｘ７は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり；ここで、Ｘ７のＣ、ｃ、ｈＣまたはＤ−ｈＣの側鎖は、Ｘ１のＣ、ｃ、ｈＣまたはＤ−ｈＣの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
    Ｘ８は、ＫまたはＦであり、
    Ｘ９は、Ｇ、Ａ、ａであり、または存在せず、
    Ｘ１０は、Ｐであり、または存在せず、
    Ｘ１１は、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍ、またはｆであり、
    Ｘ１２は、存在しないか、またはＰ、ｆ、ａ、Ｄ−Ｎｖａ、およびＤ−Ａｂｕから選択され、かつ、
    Ｘ１３は、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、または（Ｎ−Ｍｅ）Ｆ、Ｆ、ｆ、ａ、ｙ、およびＮａｌから選択される］
    からなる、請求項１に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
  4. 式ＩＶ（配列番号５）：


    ［式中、
    Ｘ１は、ポリペプチドのＮ末端であり、かつ、存在しない、Ｑ、Ａ、またはｐＥのいずれかであり、
    Ｘ３は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり；
    Ｘ７は、Ｃ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣであり；ここで、Ｘ７のＣ、ｃ、ｈＣまたはＤ−ｈＣの側鎖は、Ｘ３のＣ、ｃ、ｈＣ、またはＤ−ｈＣの側鎖とジスルフィド結合を形成し、
    Ｘ８は、ＫまたはＦであり、
    Ｘ９は、Ｇ、Ａ、ａであり、または存在せず、
    Ｘ１０は、Ｐであり、または存在せず、
    Ｘ１１は、Ｄ−Ｎｌｅ、Ｎｌｅ、Ｍ、またはｆであり、
    Ｘ１２は、存在しないか、またはＰ、ｆ、ａ、Ｄ−Ｎｖａ、およびＤ−Ａｂｕから選択され、かつ、
    Ｘ１３は、Ｃ末端であり、かつ、存在しないか、または（Ｎ−Ｍｅ）Ｆ、Ｆ、ｆ、ａ、ｙ、およびＮａｌから選択される］
    からなる、請求項１に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
  5. Ｘ１がｐＥである、請求項１、２、および４のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
  6. Ｘ１３がＦまたはｆである、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
  7. Ｘ１３が存在しない、請求項１から５のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
  8. Ｘ１２が存在しない、請求項１から７のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、およびエステル、もしくは塩。
  9. Ｃ末端がアミドである、請求項１から８のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドの塩。
  10. Ｃ末端が、式−Ｃ（Ｏ）−Ｒ２のアミドであり、Ｒ２が、−ＮＨ２、−ＮＨ−Ｍｅ、−ＮＨ−ＮＨＢｎ、または−ＮＨ−（ＣＨ２）２−Ｐｈである、請求項９に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドの塩。
  11. Ｘ８がＫである、請求項１から１０のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
  12. Ｘ９がＧである、請求項１から１１のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
  13. Ｘ１０がＰである、請求項１から１２のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
  14. Ｘ１１がＮｌｅまたはＤ−Ｎｌｅである、請求項１から１３のいずれか一項に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。


  15. ［表において、「＊」で印を付けた２つのアミノ酸は、ジスルフィドを形成しているアミノ酸を表す］
    から選択される（出現する順に、それぞれ、配列番号１９〜５７）、請求項１に記載のポリペプチド、または前記ポリペプチドのアミド、エステル、もしくは塩。
  16. ａ．請求項１から１５のいずれか一項に記載のポリペプチド、またはそのアミド、エステル、もしくは塩と、
    ｂ．半減期延長性部分と
    を含むバイオコンジュゲートまたはその多量体であって、前記ポリペプチドと半減期延長性部分は、場合によりリンカーを介して、共有結合によって連結または融合される、バイオコンジュゲートまたはその多量体。
  17. 前記半減期延長性部分が、ＩｇＧ定常ドメインもしくはその断片またはヒト血清アルブミンである、請求項１６に記載のバイオコンジュゲートまたはその多量体。
  18. 医薬として使用するための、請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはバイオコンジュゲートもしくはその多量体を含む、医薬組成物。
  19. ＡＰＪ受容体のアゴニズムに反応を示す疾患または障害を治療または予防するための医薬組成物であって、請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリペプチドまたはそのアミド、エステル、もしくは塩、またはバイオコンジュゲートもしくはその多量体を含む、医薬組成物。
  20. 急性非代償性心不全（ＡＤＨＦ）、慢性心不全、肺高血圧、心房細動、Ｂｒｕｇａｄａ症候群、心室性頻拍、アテローム性動脈硬化症、高血圧、再狭窄、虚血性心血管疾患、心筋症、心臓線維症、不整脈、水分貯留、糖尿病（妊娠糖尿病を含む）、肥満、末梢動脈疾患、脳血管発作、一過性脳虚血発作、外傷性脳損傷、筋萎縮性側索硬化症、熱傷（日焼けを含む）、または子癇前症を治療するための医薬組成物であって、請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリペプチド、そのアミド、エステル、もしくは塩、またはバイオコンジュゲートもしくはその多量体を含む、医薬組成物。
  21. 治療有効量の請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリペプチド、そのアミド、エステル、もしくは塩、またはバイオコンジュゲートもしくはその多量体を含む医薬組成物であって、前記医薬組成物は、１種または複数の治療活性のある共薬剤（co-agent）と組合せて使用される、医薬組成物。
  22. 前記共薬剤が、イノトロープ、βアドレナリン受容体遮断薬、ＨＭＧ−ＣｏＡ還元酵素阻害薬、アンジオテンシンＩＩ受容体アンタゴニスト、アンジオテンシン変換酵素（ＡＣＥ）阻害薬、カルシウムチャネル遮断薬（ＣＣＢ）、エンドセリンアンタゴニスト、レニン阻害薬、利尿薬、ＡｐｏＡ−Ｉ模倣薬、抗糖尿病薬、抗肥満薬、アルドステロン受容体遮断薬、エンドセリン受容体遮断薬、アルドステロンシンターゼ阻害薬（ＡＳＩ）、ＣＥＴＰ阻害薬、抗凝血薬、リラキシン、ＢＮＰ（ネシリチド）、および／またはＮＥＰ阻害薬から選択される、請求項２１に記載の医薬組成物。
  23. 治療有効量の請求項１から１７のいずれか一項に記載のポリペプチド、そのアミド、エステル、もしくは塩、またはバイオコンジュゲートもしくはその多量体と、１種または複数の薬学的に許容される担体とを含む、医薬組成物。
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