DE69716905T2

DE69716905T2 - Analoge des glucagon ähnlichen peptides -2

Info

Publication number: DE69716905T2
Application number: DE69716905T
Authority: DE
Inventors: E. Crivici; J. Drucker; Martin Sumner-Smith
Original assignee: Allelix Biopharmaceuticals Inc; 1149336 Ontario Inc
Current assignee: Allelix Biopharmaceuticals Inc; 1149336 Ontario Inc
Priority date: 1996-04-12
Filing date: 1997-04-11
Publication date: 2003-07-24
Anticipated expiration: 2017-04-12
Also published as: HK1050204A1; CA2251576C; DK1231219T3; NZ332281A; ATE478892T1; BRPI9708566A; EP1231219A1; PT906338E; CA2251576A1; HK1033324A1; FR13C0013I2; HK1147761A1; BR9708566B1; DK0906338T3; ES2351661T3; HK1050204B; LU92153I2; EP2218734A2; EP2009024A1; EP2218734A3

Description

GEBIET DER ERFINDUNG

Diese Erfindung betrifft die Verwendung glucagonverwandter Peptide mit wachstumsfördernden Eigenschaften für intestinales Gewebe in der Herstellung von pharmazeutischen Mitteln und deren therapeutische Verwendung zur Behandlung verschiedener medizinischer Zustände, die sich aus dem beeinträchtigten Wachstum oder einem Verlust eines solchen Gewebes ergeben.

HINTERGRUND DER ERFINDUNG

Die Expression des Glucagongens ergibt eine gewebebestimmte Vielfalt von Peptidprodukten, die aus dem 160 Rest- Proglucagonprodukt verarbeitet werden. Die Organisation dieser Peptide innerhalb des Proglucagonvorläufers wurde durch das molekulare Klonen von Präproglucagon-cDNAs vom Ratten-, Hamster- und Rinderpankreas deutlich gemacht. Diese Analysen zeigten, dass Präproglucagon nicht nur die Sequenz von Glucagon und Glicentin enthält, sondern auch zwei zusätzliche glucagonartige Peptide (GLP-1 und GLP-2), die vom Glucagon und voneinander durch zwei Spacer- oder Zwischenpeptide (IP-I und IP-II) getrennt sind. Diese Peptide sind von Paaren basischer Aminosäuren flankiert, die für klassische Prohormon-Spaltungsstellen kennzeichnend sind, was darauf schließen lässt, dass sie nach der posttranslationalen Verarbeitung von Proglucagon freigesetzt werden könnten (Drucker, Pancreas, V1990, 5(4): 484).
Die Analyse der Peptide, die zum Beispiel vom Proglucagon in den Langerhans'-Pankreasinseln freigesetzt werden, lässt darauf schließen, dass das primäre Pankreaspeptid, das freigesetzt wird, das 29-mere Glucagon ist, während Glicentin, Oxyntomodulin, IP-II und die glucagonartigen Peptide im Dünn- und Dickdarm stärker vorherrschen. Dieser Nachweis, dass die glucagonartigen Peptide im Darm vorgefunden werden, hat die Erforschung der präzisen Struktur und möglichen Funktion(en) dieser neu entdeckten Darmpeptide angeregt. Die meisten Studien haben sich auf GLP-1 konzentriert, da mehrere Beweisketten darauf schließen ließen, dass GLP-1 ein wichtiges neues Regulationspeptid sein könnte. Tatsächlich wurde festgestellt, dass GLP-1 einer der stärksten bekannten peptidergen Stimuli für die Insulinfreisetzung ist, eine Wirkung die glukoseabhängig durch Wechselwirkung mit Rezeptoren auf pankreatischen β-Zellen vermittelt wird. GLP-1 und seine Derivate sind in Entwicklung zur Verwendung in der Behandlung von Diabetes.
Die physiologischen Rollen von Glicentin und Oxyntomodulin, der sogenannten "Enteroglucagone", werden ebenso erforscht, insbesondere in Bezug auf die Regulierung der Säuresekretion und des Wachstums intestinaler Zellen. Oxyntomodulin ist imstande, die pentagastrinstimulierte gastrische Säuresekretion dosisabhängig zu hemmen. Die Rolle von Glicentin in der Vermittlung von Änderungen der intestinalen Adaption und des Wachstums der intestinalen Schleimhaut wurde untersucht und die intestinotrophe Wirkung von Glicentin und dessen therapeutische Verwendung wurden kürzlich von Matsuno et al in EP 612,531, veröffentlicht am 31. August 1994, berichtet.
Im Gegensatz zu GLP-1 und anderen glucagonverwandten Peptiden ist die physiologische Rolle des glucagonartigen Peptids GLP-2 weiterhin kaum geklärt, trotz der Isolierung und Sequenzierung verschiedener GLP-2-Homologe, einschließlich jener des Menschen, der Ratte, des Rindes, des Schweins, des Meerschweinchens und Hamsters. Unter Verwendung von GLP-2-Antisera, die gegen synthetische Versionen von GLP-2 gezüchtet wurden, wurde in verschiedenen Gruppen bestimmt, dass GLP-2 vorwiegend in intestinalen und nicht pankreatischen Extrakten vorhanden ist (siehe Mosjov et al. J. 5101. Chem., 1986, 261(25): 11880; Orskov et al in Endocrinology, 1986, 119(4): 1467 und in Diabetologia, 1987, 30: 874 und in FEBS Letters, 1989, 247(2): 193; George et al. FEBS Letters, 1985 192(2): 275). In Bezug auf seine biologische Rolle berichten Hoosein et al (FEBS Letters, 1984, 178(1): 83), dass GLP-2 weder mit Glucoagon um die Bindung an Rattenleber- und - gehirngewebe konkurriert, noch die Adenylatcyclaseproduktion in Leberplasmamembranen stimuliert, sondern bei Konzentrationen von 30 bis 50 pM engimatisch die Adenylatcyclase sowohl in hypothalamischen als auch pituitären Gewebe der Ratte stimulieren kann. Eine Aufklärung der physiologischen Rolle von GLP-2 wäre eindeutig wünschenswert.

KURZDARSTELLUNG DER ERFINDUNG

Es wurden nun Analoge von GLP-2 entdeckt, die das Wachstum von Dünndarmgewebe fördern. Es ist daher eine allgemeine Aufgabe der vorliegenden Erfindung, solche GLP-2-Analoge bereitzustellen und für ihre therapeutische Verwendung und andere Zwecke zu sorgen.
In einem Aspekt der Erfindung wird die Verwendung eines GLP-2-Analogs bereitgestellt, das durch intestinotrophe Aktivität gekennzeichnet ist und mit der folgenden Formel übereinstimmt:
R1-(Y1)m-X1-X2-X3-X4-Ser5-Phe6-Ser7-Asp8-(P1)-Leu14-Asp15- Asn16-Leu17-Ala18-X19-X20-Asp21-Phe22-(P2)-Trp25-Leu26- Ile27-Gln28-Thr29-Lys30-(P3)-(Y2)N-R2,
worin sind:
X1 His oder Tyr;
X2 Ala oder eine Ala-Substitutions-Aminosäure, die dem Analog Beständigkeit gegenüber dem DPP-IV-Enzym vermittelt;
X3 Pro, HPro, Asp oder Glu;
X4 Gly oder Ala;
P1 Glu-X10-Asn-Thr-Ile oder Tyr-Ser-Lys-Tyr;
X10 Met oder eine oxidativ stabile Met-Substitutions- Aminosäure;
X19 Ala oder Thr;
X20 Arg, Lys, His oder Ala;
P2 Ile-Asn, Ile-Ala oder Val-Gln;
P3 eine kovalente Bindung oder Ile, Ile-Thr oder Ile-Thr- Asn;
R1 H oder eine N-terminale blockierende Gruppe;
R2 OH oder eine C-terminale blockierende Gruppe;
Y1 eine oder zwei basische Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe Arg, Lys und His;
Y2 eine oder zwei basische Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe Arg, Lys und His; und
m und n unabhängig 0 oder 1; und
worin mindestens eines von X1, X2, X3, X4, P1, X10, X19, X20, P2 und P3 kein Wildtyp GLP-2-Rest eines Säugers ist, in der Herstellung eines pharmazeutischen Mittels für die Förderung des Wachstums und/oder der Funktion von gastroinstestinalem Gewebe.
Besonders bevorzugte Analoge gemäß der oben genannten Formel sind jene, die gegenüber einer Spaltung durch das humane DPP-IV-Enzym beständig gemacht wurden, indem das Ala an Position X2 durch eine andere Aminosäure ersetzt wurde. Andere Analoge, die verwendet werden können, sind jene, die das oxidativ empfindliche Met an Position X10 durch einen Aminosäurerest ersetzen, der oxidativ stabil ist. Auf diese Weise haben die Analogpeptide im Vergleich zu GLP-2- Peptiden mit dem Wildtyp Met-Rest an dieser Position eine erhöhte Stabilität. Eine weitere bevorzugte Ausführungsform der Erfindung ist der Einbau einer basischen Aminosäure, ausgewählt aus His oder Lys, an Position X20. Diese Substitution ist vorteilhaft, wenn die GLP-2-Analoge chemisch synthetisiert sind. Der Arg-Rest, der normalerweise an dieser Position vorhanden ist, neigt dazu, Lösemittel, die in Peptidsyntheseverfahren verwendet werden, stark zu binden. Die Substitution von Arg ermöglicht eine leichtere Formulierung der synthetisch erzeugten GLP-2-Analoge zu pharmazeutisch annehmbaren Zusammensetzungen.
Insbesondere und gemäß einem Aspekt der Erfindung werden Verwendungen von Analogen eines GLP-2-Peptids bereitgestellt, ausgewählt aus einer GLP-2-Spezies von Säugern und N- und/oder C-terminal modifizierten Formen davon, in der Herstellung pharmazeutischer Mittel, wobei die Analoge intestinotrophe Aktivität haben und in Bezug auf das Säuger-GLP-2-Peptid wenigstens eine Aminosäuresubstitution an einer Position enthalten, die in Säuger-GLP-2's konserviert ist. In einem bevorzugten Aspekt enthalten die GLP-2-Analoge eine Substitution ausgewählt aus:
1) Einbau an Position 2 oder an Position 3 einer Substitutions-Aminosäure, die dem Analog Beständigkeit gegenüber Dipeptidyl-Peptidase-IV (in der Folge als DPP-IV bezeichnet) verleiht; und
2) Einbau an Position 10 einer oxidativ stabilen Met- Substitutions-Aminosäure; und
3) Einbau einer Substitutions-Aminosäure, die nicht Arg ist, an der Stelle X20.
In einem weiteren ihrer Aspekte stellt die Erfindung die Verwendungen intestinotropher Analoge eines Säuger GLP-2, vorzugsweise humanen GLP-2, in dem entweder der N- und/oder C-Terminus durch eine blockierende Gruppe oder zusätzliche Aminosäuren, oder die Substitution einer modifizierten oder alternativen Aminosäure modifiziert ist, in der Herstellung pharmazeutischer Mittel bereit. In einem weiteren Aspekt wird die Verwendung intestinotropher Analoge eines Säuger GLP-2, vorzugsweise humanen GLP-2, bereitgestellt, in welchen die Positionen X1, X4, X7, X16-X18, X25, X30 oder X33 eine Substitutions-Aminosäure enthalten, die nicht jene ist, die in natürlich vorkommenden Säuger-GLP-2's vorgefunden wird. Wahlweise stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt die Verwendung intestinotropher Analoge bereit, in welchen 3 bis 8 Reste von dem C-Terminus entfernt sind.
Außer der Förderung des Darmwachstums stellt die Erfindung in einem anderen ihrer Aspekte die Verwendung von Analogen von GLP-2 in der Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Behandlung einer gastrointestinalen Erkrankung bereit, durch Verabreichen an einen Patienten, der an einer gastrointestinalen Erkrankung leidet, einer therapeutisch wirksamen Menge eines GLP-2-Analogs der Erfindung, gemeinsam mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger zur Verringerung einer pathologischen Wirkung oder eines Symptoms der gastrointestinalen Erkrankung.
In einem weiteren Aspekt der Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, das zur Identifizierung intestinotropher Analoge von GLP-2 zweckdienlich ist, umfassend die Schritte:
1) Erhalten eines GLP-2-Analogs, das mit der oben dargestellten Formel 1 übereinstimmt;
2) Behandeln eines Säugers mit dem Analog unter Anwendung eines Therapieplans, der bei Einsatz für Ratten-GLP-2 eine intestinotrophe Wirkung auslösen kann; und
3) Ermitteln der Wirkung des Analogs auf das Dünndarmgewicht relativ zu einem scheinbehandelten Kontroll-Säuger, wodurch dieses intestinotrophe Analog von GLP-2 als ein Analog identifiziert wird, das eine Zunahme an diesem Gewicht auslöst.

AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG

Die Erfindung betrifft therapeutische und verwandte Verwendungen von GLP-2-Analogen, insbesondere zur Förderung des Wachstums von Gewebe des Dünndarms. Die Wirkung auf das Wachstum, die durch die vorliegenden GLP-2-Analoge hervorgerufen wird, manifestiert sich als Zunahme im Dünndarmgewicht relativ zu einer scheinbehandelten Kontrolle. Insbesondere wird davon ausgegangen, dass GLP-2- Analoge eine "intestinotrophe" Aktivität haben, wenn, bei Bewertung in dem hierin beispielhaft dargestellten Mausmodell, das Analog eine Zunahme im Dünndarmgewicht von wenigstens 10% relativ zu einem Kontrolltier, das nur einen Träger erhält, herbeiführt. Besonders geeignet zur therapeutischen Verwendung sind jene Analoge, die eine Zunahme von wenigstens 20% im Dünndarmgewicht herbeiführen; bevorzugt für die therapeutische Verwendung sind jene, die eine Zunahme im Dünndarmgewicht von 50% oder mehr herbeiführen. Die intestinotrophe Aktivität wird am deutlichsten in Bezug auf das Jejenum festgestellt, einschließlich des distalen Jejenums und insbesondere des proximalen Jejenums, und wird auch im Ileum festgestellt.
Zusätzlich zu dem Aufweisen einer intestinotrophen Aktivität, wie soeben definiert, enthalten die GLP-2- Analoge der vorliegenden Erfindung eine Aminosäure- Substitution an einer oder mehreren Stellen in einem GLP-2- Peptid-"Hintergrund", der entweder eine Säuger-GLP-2- Spezies an sich ist oder einer Variante einer Säuger-GLP-2- Spezies, in welcher der C-Terminus und/oder der N-Terminus durch Hinzufügen von einem oder mehreren basischen Resten verändert wurde oder modifiziert wurde, so dass er eine blockierende Gruppe der Art enthält, die normalerweise in der Peptidchemie verwendet wird, um Peptidtermini vor unerwünschten biochemischen Angriffen und einem in vivo Abbau zu schützen. Somit enthalten die vorliegenden Peptide eine Aminosäure-Substitution im Zusammenhang mit jeder Säuger-GLP-2-Spezies, einschließlich humanem GLP-2, Rinder- GLP-2, Ratten-GLP-2, Degu-GLP-2, Ochsen-GLP-2, Schweine- GLP-2, Meerschweinchen-GLP-2 und Hamster-GLP-2, deren Sequenzen von vielen Autoren berichtet wurden, einschließlich Buhl et al, J. Biol. Chem, 1988, 263(18): 8621.
In einem Aspekt der Erfindung stimmen die intestinotrophen Analoge von GLP-2 mit der folgenden Sequenz von Formel 1 (SEQ ID NR: 1) überein:
R1-(Y1)m-X1-X2-X3-X4-Ser5-Phe6-Ser7-Asp8-(P1)-Leu14-Asp15- Asn16-Leu17-Ala18-X19-X20-Asp21-Phe22-(P2)-Trp25-Leu26- Ile27-Gln28-Thr29-Lys30-(P3)-(Y2)n-R2,
worin sind:
X1 His oder Tyr;
X2 Ala oder eine Ala-Substitutions-Aminosäure, die dem Analog Beständigkeit gegenüber dem DPP-IV-Enzym vermittelt;
X3 Pro, HPro, Asp oder Glu;
X4 Gly oder Ala;
P1 Glu-X10-Asn-Thr-Ile oder Tyr-Ser-Lys-Tyr;
X10 Met oder eine oxidativ stabile Met-Substitutions- Aminosäure;
X19 Ala oder Thr;
X20 Arg, Lys, His oder Ala;
P2 Ile-Asn, Ile-Ala oder Val-Gln;
P3 eine kovalente Bindung oder Ile, Ile-Thr oder Ile-Thr- Asn;
R1 H oder eine N-terminale blockierende Gruppe;
R2 OH oder eine C-terminale blockierende Gruppe;
Y1 eine oder zwei basische Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe Arg, Lys und His;
Y2 eine oder zwei basische Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe Arg, Lys und His; und
m und n unabhängig 0 oder 1; und
worin mindestens eines von X1, X2, X3, X4, P1, X10, X19, X20, P2 und P3 kein Wildtyp GLP-2-Rest eines Säugers ist.
Die Wildtyp-Säguer-GLP-2-Reste, die an einer bestimmten Position auftreten, werden durch Ausrichten der GLP-2- Sequenzen, die von verschiedenen Säugerspezies isoliert wurden, und Vergleichen der Sequenz mit der humanen Sequenz (SEQ ID NR: 2) bestimmt, die in der Folge der Einfachheit wegen reproduziert ist:
Die Aminosäurereste, von welchen für den Zweck dieser Anmeldung bekannt ist, dass sie in Wildtyp-Säuger-GLP-2's an bestimmten Positionen auftreten, sind Folgende: Position X13 kann Ile oder Val sein; Position X16 kann Asn oder Ser sein; Position X19 kann Alanin oder Threonin sein; Position X20 kann Arg oder Lys sein; Position X27 kann Ile oder Leu sein; und Position X28 kann Gln oder His sein.
Die vorliegenden GLP-2-Analoge können gewünschte Aminosäure-Substitutionen in einen "Hintergrund" einbauen, der eine N-terminal oder C-terminal modifizierte Form eines Säuger-GLP-2-Peptids ist. Solche Analoge sind in Formel 1 (SEQ ID NR: 1) als jene dargestellt, in welchen R1 eine Nterminale blockierende Gruppe bildet und/oder, wenn m 1 ist, Y1 eine oder zwei basische Aminosäuren ist, wie Arg oder Lys; und/oder R2 eine C-terminale blockierende Gruppe ist; und/oder, wenn n 1 ist, Y2 unabhängig eine oder zwei basische Aminosäuren wie Arg oder Lys ist.
In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung ist das GLP- 2-Analog ein Analog von GLP-2 voller Länge, d. h., GLP-2(1- 33), und P3 ist daher die Sequenz Ile-Thr-Asn. Als Alternative können die GLP-2-Analoge am C-terminal abgestumpft sein, um GLP-2(1-32)-Formen, in welchen P3 Ile- Thr ist, oder GLP-2(1-31)-Formen, in welchen P3 Ile ist, oder GLP-2(1-30)-Formen, in welchen P3 eine kovalente Bindung ist, zu erhalten.
Die "blockierenden Gruppen", die durch R1 und R2 dargestellt sind, sind chemische Gruppen, die routinemäßig in der Peptidchemie verwendet werden, um durch Exopeptidase biochemische Stabilität und Aufschlussbeständigkeit zu verleihen. Zu geeigneten N-terminalen-Schutzgruppen zählen zum Beispiel C&sub1;&submin;&sub5; Alkanoylgruppen, wie Acetyl. Ebenso geeignet als N-terminale Schutzgruppen sind Aminosäure- Analoge, welchen die Aminofunktion fehlt, zum Beispiel Desamino-Tyr1. Zu geeigneten C-terminalen Schutzgruppen zählen Gruppen, die Ketone oder Amide am Kohlenstoffatom des C-terminalen Carboxyls bilden, oder Gruppen, die Ester am Sauerstoffatom des Carboxyls bilden. Keton- und esterbildende Gruppen umfassen Alkylgruppen, insbesondere verzweigte oder unverzweigte C&sub1;&submin;&sub5;-Alkylgruppen, z. B. Methyl-, Ethyl-, und Propylgruppen, während amidbildende Gruppen Aminofunktionen enthalten, wie primäre Amin- oder Alkylaminofunktionen, z. B. Mono-C&sub1;&submin;&sub5;-Alkylamino- und Di-C&sub1;&submin;&sub5;- Alkylaminogruppen, wie Methylamino, Ethylamino, Dimethylamino, Diethylamino, Methylethylamino und dergleichen. Aminosäure-Analoge sind auch für den Schutz des C-terminalen Endes der vorliegenden Verbindungen geeignet, zum Beispiel decarboxylierte Aminosäure-Analoge wie Agmatin.
Ausführungsformen der Erfindung enthalten insbesondere jene Analoge, in welchen m 0 und R1 eine blockierende Gruppe ist, wie Acetyl; und Analoge, in welchen m 0 und R2 eine Cterminale blockierende Gruppe ist, wie ein Amid oder ein Amin, z. B. -NH2.
In einem bevorzugten Aspekt der Erfindung sind die GLP-2- Analoge Analoge von entweder humanem GLP-2 oder von Ratten- GLP-2. Humanes GLP-2 wird hierin austauschbar als hGLP-2(1- 33) bezeichnet. Ratten-GLP-2 hat die Aminosäuresequenz von humanem GLP-2, enthält aber an Position 19 einen Thr-Rest anstelle eines Ala-Restes. Ratten-GLP-2 wird daher hierin entweder als rGLP-2(1-33) oder als das Thr¹&sup9;-Analog von humanem GLP-2 bezeichnet, d. h. als [Thr¹&sup9;]hGLP-2(1-33).
In besonders bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung enthalten die GLP-2-Analoge in Bezug %wohl auf die Analoge der Formel 1 (SEQ ID NR. 1) als auch auf die spezifischeren humanen oder Ratten-GLP-2-Analoge eine Aminosäure- Substitution, ausgewählt aus:
1) Einbau bei X2 und/oder bei X3 einer Substitutions- Aminosäure, die das Analog gegenüber Spaltung durch DPP-IV-Enzym beständig macht;
2) Einbau bei X10 einer oxidativ stabilen Met- Substitutions-Aminosäure; und
3) Einbau bei X20 einer Substitutions-Aminosäure, die nicht Arg ist.
In einem weiteren ihrer Aspekte stellt die Erfindung intestinotrophe Analoge eines Säuger-GLP-2, vorzugsweise humanen GLP-2, bereit, in dem entweder der N- und/oder der C-Terminus durch eine blockierende Gruppe, oder zusätzliche Aminosäuren oder die Substitution einer modifizierten oder alternativen Aminosäure modifiziert ist. In einem weiteren Aspekt werden intestinotrophe Analoge von Säuger-GLP-2, vorzugsweise humanem GLP-2, bereitstellt, in welchen die Positionen X1, X5, X7, X16-X18, X25, X30 oder X33 eine Substitutions-Aminosäure enthalten, die nicht jene ist, die in natürlich vorkommenden Säuger-GLP-2's vorgefunden wird. Wahlweise stellt die Erfindung in einem weiteren Aspekt intestinotrophe Analoge bereit, in welchen 3 bis 8 Reste von dem C-Terminus entfernt sind.
Die DPP-IV-beständige Klasse von GLP-2-Analogen besitzt besonders vorteilhafte Eigenschaften. Wie hierin gezeigt wird, hat sich erwiesen, dass die Säuger-GLP-2-Spezies gegenüber einer Spaltung durch das DPP-IV-Enzym empfindlich ist. Es hat sich auch gezeigt, dass diese Empfindlichkeit gegenüber DPP-IV das Ergebnis der Erkennungssequenz Ala²Asp³ ist, die in allen Säugerformen von GLP-2 vorgefunden sind. Daher wird von der vorliegenden Erfindung eine Klasse von GLP-2-Analogen bereitgestellt, die bei X2 und-/oder X3 eine Substitutions-Aminosäure enthalten, die dem GLP-2-Analog eine relative Beständigkeit gegenüber einer DPP-IV-vermittelten Spaltung verleiht, wie durch jede passende in vitro oder in vivo Bewertungstechnik bestimmt wird, die das Vorhandensein von GLP-2-Aufschlussprodukten erfassen kann. Ein DPP-IV-beständiges GLP-2-Analog wird als das GLP-2-Analog offenbart, das bei einer Rate verarbeitet oder abgebaut wird, die messbar langsamer als die Rate ist, bei welcher humanes GLP-2 unter denselben Bedingungen verarbeitet oder abgebaut wird.
Ein Test, der zur Bewertung der DPP-IV-Empfindlichkeit und Beständigkeit geeignet ist, ist in der Folge in Beispiel 3 im Zusammenhang mit Ergebnissen beschrieben, die tatsächlich erhalten wurden.
Die X2-Klasse von GLP-2-Analogen ist hierin bevorzugt. Diese Ala²-substituierten GLP-2-Analoge können bei X2 eine strukturell weite Vielfalt an Ala-Substitutions-Aminosäuren enthalten, um eine relative Beständigkeit gegenüber einem DPP-IV-Aufschluss zu erreichen. Eine ähnlich weite Vielfalt von Ala-Substitutions-Aminosäuren ermöglicht auch, dass das Analog die intestinotrophe Aktivität beibehält. Zum Zwecke der Identifizierung dieser DPP-IV-beständigen X2-Analoge, die auch die intestinotrophe Aktivität beibehalten, werden die X2-Analoge, die eine DPP-IV-Beständigkeit aufweisen, in dem Test, der in der Folge in Beispiel 4 beschrieben ist, auf intestinotrophe Aktivität durchmustert.
In Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung enthalten die Ala²-Substitutionen Stereoisomere von Aminosäuren, die andernfalls Substrate für DPP-IV wären, zum Beispiel D-Ala, D-HPr, βAla, t-Butyl-Gly, L-Penicillamin, α- Aminobuttersäure, Aminoisobuttersäure, Norvalin, L-Phenyl- Gly und D-Pro und natürlich vorkommende Aminosäuren, zum Beispiel, Glu, Lys, Ile, Ser, Asp, Phe, Lys, Met, Asn, Pro, Gln, Thr, Gly und Val. In spezifischen Ausführungsformen der Erfindung werden die folgenden Ala²-substituierten GLP- 2-Analoge bereitgestellt; [D-Ala²]GLP-2(1-33), [Gly²]rGLP- 2(1-33), [Val²]rGLP-2(1-33), [Gly²]hGLP-2(1-33), [tBuGly²]hGLP-2, [Asp²]hGLP-2(1-33) [Glu²]hGLP-2(1-33), [Phe²]hGLP-2(1-33), [His²]hGLP-2(1-33), [Ile²]hGLP-2(1-33), [Lys²]hGLP-2(1-33), [Met²]hGLP-2(1-33), [Asn²]hGLP-2(1-33), [Pro²]hGLP-2(1-33), [Gln²]hGLP-2(1-33), [Ser²]hGLP-2(1-33), [Thr²]hGLP-2(1-33), [Val²]hGLP-2(1-33), [Tyr²]hGLP-2(1-33), [D-Ala²]hGLP-2(1-33), [Pen²]hGLP-2(1-33), [bAla²]hGLP-2(1- 33), [aAbu²]hGLP-2(1-33), [Nval²]hGLP-2(1-33), [PhGly²]hGLP-2(1-33) und [Aib²]hGLP-2(1-33).
Die X2 GLP-2-Analoge können Aminosäure-Substitutionen an anderen Positionen enthalten. In Ausführungsformen der Erfindung umfassen solche Analoge jene, die Aminosäure- Substitutionen auch an einer oder mehreren der Positionen X1, X3, X4, X10, X19, X20 und X24 tragen, und umfassen daher jene, die gemäß der Formel 1 (SEQ ID NR: 1) wenigstens eine der folgenden Substitutionen enthalten: X1 ist Tyr; X3 ist Glu; X4 ist Ala, P1 ist Glu-X10-Asn-Thr- Ile, wobei X10 nicht Met ist, oder P1 ist Tyr-Ser-Lys-Tyr; X10 ist eine oxidativ stabile Met-Substitutions-Aminosäure; X19 ist Thr; X20 ist Lys oder Ala; P2 ist Val-Gln und P3 ist eine kovalente Bindung, Ile oder Ile-Thr oder Ile-Thr- Asn.
In Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung umfassen die X2-Analoge von GLP-2 jene, die auch eine der folgenden Substitutionen enthalten: X1 ist Ala; X3 ist Ala; X4 ist Ala, X10 ist eine oxidativ stabile Met-Substitutioris- Aminosäure wie Val, Ile, Asn, Glx, Tyr, Phe und vorzugsweise Leu, Nle, Ala, Ser und Gly; und P2 ist Ile- Ala. In spezifischen Ausführungsformen der Erfindung werden folgenden GLP-2-Analoge bereitgestellt: [D-Ala²Thr¹&sup9;]hGLP- 2(1-33), [Gly²Thr¹&sup9;]hGLP-2(1-33); [Val²Thr¹&sup9;]hGLP-2(1-33); [Gly²Ala²&sup4;]hGLP-2(1-33), [Gly²Ala¹&sup0;]hGLP-2(1-33); [Ala¹Gly²]hGLP-2(1-33); [Gly²Ala³]hGLP-2(1-33) und [Gly²Ala&sup4;]hGLP-2(1-33).
In einer verwandten Ausführungsform umfassen die X2-Analoge jene, welche die folgenden Substitutionen enthalten: GLP- 2[Gly²Ala&sup8;]hGLP-2; [Gly²Ala¹¹]hGLP-2; [Gly²Ala²¹]hGLP-2; [Gly²Ala&sup9;]hGLP-2; [Gly²Ala¹&sup6;]hGLP-2; [Gly²Ala¹&sup7;]hGLP-2; [Gly²Ala²&sup8;]hGLP-2; [Gly²Ala&sup5;]hGLP-2; [Gly²Ala³¹]hGLP-2; [Gly²Ala²&sup7;]hGLP-2; [Gly²Ala¹²]hGLP-2; [Gly²Ala¹³]hGLP-2; [Gly²Ala&sup7;]hGLP-2; [Gly²Ala&sup6;]hGLP-2; [Ser²Gln³]hGLP-2(1-33); [Gly²Ala²&sup5;]hGLP-2(1-33); [Gly²Ala²&sup6;]hGLP-2(1-33) [Gly²Ala¹&sup4;]hGLP-2(1-33); [Gly²Ala²³]hGLP-2(1-33); [Gly²Ala³&sup0;]hGLP-2(1-33); [Tyr¹Gly²]hGLP-2(1-33); [Gly²Arg³&sup4;]hGLP-2(1-34) und [Gly²Tyr³&sup4;]hGLP-2(1-34).
Als Alternative kann in dem Fall, wenn X2 Ala, hPr oder Pro ist, die DPP-IV-Beständigkeit durch Ersetzen von Asp³ durch eine Asp-Substitutions-Aminosäure, X3, die Pro oder hPR ist, verliehen werden.
Die vorliegende Erfindung stellt auch als andere Klasse von GLP-2-Analogen jene Analoge bereit, in welchen X10 eine oxidativ stabile Met-Substitutions-Aminosäure darstellt. Es hat sich gezeigt, dass die intestinotrophe Aktivität von Säuger-GLP-2 verringert wird, wenn Met in Position 10 oxidiert wird, und auch dass die intestinotrophe Aktivität beibehalten wird, wenn die Substitutions-Aminosäuren, die gegenüber einer Oxidation unempfindlich sind, durch eine Met¹&sup0;-Substitution ersetzt werden. Solche Met¹&sup0;- substituierten GLP-2-Analoge sind daher während der Synthese, Aufarbeitung und Lagerung stabiler. In Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind solche X10-Analoge von GLP-2 Analoge von humanem GLP-2. In besonderen Ausführungsformen der Erfindung umfassen solche Analoge: [Ser¹&sup0;]hGLP-2(1-33); [Nle¹&sup0;]hGLP-2(1-33) [Ala¹&sup0;]hGLP-2(1-33); [Leu¹&sup0;]rGLP-2(1-33); [Met(o)¹&sup0;]ratGLP- 2(1-33) und [Nle¹&sup0;]ratGLP-2(1-33).
Die X10-Analoge können auch Aminosäure-Substitutionen an einer oder mehreren Positionen enthalten, die nicht X10 sind. Wie zuvor festgehalten, umfassen solche Analoge zum Beispiel jene, die Substitutionen bei X2 enthalten und jene, in welchen P1 Tyr-Ser-Lys-Tyr ist, wie auch jene, in welchen einer der X-Substituenten oder der P-Substituenten, die in Formel 1 (SEQ ID NR: 1) dargestellt sind, andere als Wildtyp-Reste oder -Sequenzen sind. In besonderen Ausführungsformen enthalten die GLP-2-Analoge [Gly²Ala¹&sup0;]hGLP-2(1-33) und [Tyr&sup9;Ser¹&sup0;Lys¹¹Tyr¹²desIle¹³]hGLP- 2(1-33).
In anderen Ausführungsformen der Erfindung enthalten die GLP-2-Analoge einzelne Aminosäure-Substitutionen im Zusammenhang mit dem Säuger-GLP-2-Peptidhintergrund, in den sie eingeführt werden. Solche Analoge umfassen zum Beispiel jene Säuger-GLP-2-Analoge und insbesondere die humanen GLP- 2-Analoge, in welchen X1 Tyr ist; X3 Glu ist, X4 Ala ist; P1 Tyr-Ser-Lys-Tyr-(desIle) ist; P2 Ile-Ala oder Val-Gln ist; und P3 eine kovalente Bindung oder Ile oder Ile-Thr ist.
Weitere GLP-2-Analoge der Erfindung enthalten Änderungen des N- oder C-Terminus durch Hinzufügen von Aminosäuren, durch blockierende Gruppen oder durch substituierte Aminosäuren. Es werden auch intestinotrophe Analoge von Säuger-GLP-2, vorzugsweise humanem GLP-2, bereitgestellt, in welchen die Positionen X1, X5, X7, X16-X18, X25, X30 oder X33 eine Substitutions-Aminosäure enthalten, die nicht jene ist, die in von Natur aus vorkommenden Säuger-GLP-2's vorgefunden wird. Wahlweise stellt die Erfindung intestinotrophe Analoge bereit, in welchen 3 bis 8 Reste vom C-Terminus entfernt sind. Besondere Ausführungsformen solcher intestinotrophen Analoge umfassen: Ac-ratGLP-2(1- 33); ratGLP-2(1-30); ratGLP-2(1-25); ratGLP-2(1-33)Amid; [Arg-²,Arg-¹]ratGLP-2(2-33); [Pro¹]hGLP-2(1-33); [Gln²&sup0;]hGLP-2(1-33); [Asp¹]hGLP-2(1-33); [Tyr³&sup4;]hGLP-2(1- 34); [desNH2Tyr¹]hGLP-2(1-33); [Thr&sup5;]hGLP-2(1-33); [Ser¹&sup6;, Arg¹&sup7;,Arg¹&sup8;]hGLP-2(1-33); [Agm³&sup4;]hGLP 2(1-34); [Arg³&sup0;]hGLP- 2(1-33); [Ala&sup5;Ala&sup7;]hGLP-2(1-33); [Glu³³]hGLP-2(1-33); [Phe²&sup5;]hGLP-2(1-33); und [Tyr²&sup5;]hGLP-2(1-33).
Die vorliegenden GLP-2-Analoge können gemäß der hierin bereitgestellten Anleitung unter Verwendung von Standardtechniken der Peptidchemie synthetisiert werden und können auf intestinotrophe Aktivität bewertet werden. In Bezug auf die Synthese kann das ausgewählte GLP-2-Analog durch eine Reihe von Techniken hergestellt werden, die zur Erzeugung von Peptidprodukten allgemein bekannt sind. Diese GLP-2-Analoge, die nur L-Aminosäuren enthalten, können in kommerziellen Mengen durch Anwendung der rekombinanten DNA- Technologie erzeugt werden. Zu diesem Zweck ist die DNA, die für das gewünschte GLP-2-Analog codiert, in einen Expressionsvektor eingefügt und in einen mikrobiellen, z. B. Hefe- oder anderen zellulären Wirt transformiert, der dann unter Bedingungen kultiviert wird, die für die GLP-2- Expression geeignet sind. Eine Reihe von Genexpressionssystemen wurde für diesen Zweck angepasst, die für gewöhnlich die Expression des gewünschten Gens von Expressionsregulationselementen antreiben, die von Natur aus von dem gewählten Wirt verwendet werden. Da GLP-2 für seine Aktivität die translationale Glycosylierung nicht benötigt, kann seine Produktion am einfachsten in bakteriellen Wirten, wie E. coli, erreicht werden. Für eine solche Produktion kann DNA, die für das gewählte GLP-2 codiert, zweckdienlich unter die Expressionskontrollen der lac-, trp- oder PL-Gene von E. coli gestellt werden. Als Alternative zur Expression einer. DNA, die für das GLP-2an sich codiert, kann der Wirt so angepasst werden, dass er das GLP-2-Peptid als Fusionsprotein exprimiert, in dem das GLP-2 lösbar an ein Trägerprotein gebunden ist, das eine Isolierung und Stabilität des Expressionsproduktes erleichtert.
In einer Methode, die generell für die Produktion eines gewählten GLP-2-Analogs anwendbar ist und die notwendigerweise verwendet wird, um GLP-2-Analoge zu erzeugen, die nicht-genetisch codierte Aminosäuren und N- und C-terminal derivatisierte Formen enthalten, werden die gut etablierten Techniken einer automatischen Peptidsynthese verwendet, von welcher allgemeine Beschreibungen zum Beispiel in J. M. Stewart und J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2. Ausgabe, 1984, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois; und in M. Bodanszky und A. Bodanszky, The Practice of Peptide Synthesis, 1984, Springer-Verlag, New York; Applied Biosystems 430A Users Manual, 1987, ABI Inc., Foster City, Kalifornien, zu finden sind. In diesen Techniken wird ein GLP-2-Analog aus seinem C-terminalen, harzkonjugierten Rest durch die sequentielle Hinzufügung von gut geschützten Aminosäuren unter Verwendung entweder der Fmoc- oder tBoc-Protokolle gezüchtet, die zum Beispiel von Orskov et al. 1989, supra, beschrieben sind.
Für den Einbau von N- und/oder C-blockierenden Gruppen, können auch Protokolle verwendet werden, die für Festphasenpeptidsyntheseverfahren üblich sind. Für den Einbau von C-terminalen blockierenden Gruppen wird zum Beispiel die Synthese des gewünschten Peptids für gewöhnlich unter Verwendung eines Trägerharzes als Festphase durchgeführt, das chemisch modifiziert wurde, so dass die Spaltung von dem Harz zu einem GLP-2-Peptid führt, das die gewünschte C-terminale blockierende Gruppe hat. Zur Bereitstellung von Peptiden, bei welchen der C-Terminus zum Beispiel eine primäres Amin blockierende Gruppe enthält, wird die Synthese unter Verwendung eines p- Methylbenzhydrylamin- (MBHA-) Harzes durchgeführt, so dass, wenn die Synthese vollendet ist, die Behandlung mit Fluorwasserstoffsäure das gewünschte C-terminal amidierte Peptid freisetzt. Ebenso wird der Einbau einer n-Methylamin blockierenden Gruppe am C-Terminus unter Verwendung von N- Methylaminoethyl-derivatisiertem DVB Harz erreicht, das nach der HF-Behandlung ein Peptid freisetzt, das einen N- methylamidierten C-Terminus trägt. Der Schutz des C- Terminus durch Veresterung kann auch unter Verwendung herkömmlicher Prozeduren erreicht werden. Dies setzt die Verwendung einer Kombination aus Harzblockierender Gruppe voraus, welche die Freisetzung eines seitenkettengeschützten Peptids von dem Harz zulässt, so dass eine anschließende Reaktion mit dem gewünschten Alkohol möglich ist, um die Esterfunktion zu bilden. FMOC- Schutzgruppen in Verbindung mit DVB-Harz, derivatisiert mit Methoxyalkoxybenzylalkohol oder äquivalentem Linker, können für diesen Zweck verwendet werden, wobei die Abspaltung vom Träger durch TFA in Dichloromethan erfolgt. Die Veresterung der zweckdienlich aktivierten Carboxylfunktion, z. B. mit DCC, kann dann durch die Zugabe des gewünschten Alkohols fortschreiten, wonach eine Schutzentfernung und Isolierung des veresterten GLP-2-Peptids folgt.
Der Einbau N-terminaler blockierender Gruppen kann erreicht werden, während das synthetisierte GLP-2-Peptid noch an dem Harz haftet, zum Beispiel durch Behandlung mit einem geeigneten Anhydrid und Nitril. Für den Einbau einer Acetyl blockierenden Gruppe am N-Terminus kann das harzgekoppelte Peptid zum Beispiel mit 20% Essigsäureanhydrid in Acetonitril behandelt werden. Das N-blockierte GLP-2-Analog kann dann von dem Harz abgespalten, vom Schutz befreit und anschließend isoliert werden.
Sobald das gewünschte GLP-2-Analog synthetisiert, vom Harz abgespalten und vollständig vom Schutz befreit ist, wird das Peptid dann gereinigt, um die Gewinnung eines einzigen Oligonucleotids mit der gewählten Aminosäuresequenz zu garantieren. Die Reinigung kann unter Verwendung jeder der Standardmethoden erreicht werden, die Umkehrphasen- Hochdruckflüssigchromatographie (RP-HPLC) auf alkylierten Silica-Säulen, z. B. C&sub4;-, C&sub8;- oder C&sub1;&sub8;-Silica, umfassen. Eine solche Säulenfraktionierung wird im Allgemeinen durch Verwendung linearer Gradienten durchgeführt, z. B. von 10 bis 90% organischem Lösemittel mit steigenden %, z. B. Acetonitril in wässerigem Puffer, das für gewöhnlich eine geringe Menge (z. B. 0,1%) Paarbildungsmittel, wie TFA oder TEA, enthält. Als Alternative kann Ionenaustausch-HPLC zur Trennung von Peptidspezies auf der Basis ihre Ladungseigenschaften verwendet werden. Die Säulenfraktionen werden gesammelt und jene, die Peptid der gewünschten/erforderlichen Reinheit enthalten, werden wahlweise gepoolt. In einer Ausführungsform der Erfindung wird das GLP-2-Analog dann in etablierter Weise zum Austausch der Spaltungssäure (z. B. TFA) mit einer pharmazeutisch annehmbaren Säure, wie Essig-, Salz-, Phosphor-, Malein-, Wein-, Bernsteinsäure und dergleichen, behandelt, um ein pharmazeutisch annehmbares Säureadditionssalz des Peptids zu erzeugen.
Zur Verabreichung an Patienten wird das GLP-2-Analog oder sein Salz vorzugsweise in pharmazeutisch annehmbarer Form bereitgestellt, z. B. als Präparation, die, z. B. durch ein 0,22 u Filter, sterilfiltriert und im Wesentlichen pyrogenfrei ist. Vorzugsweise wandert das zu formulierende GLP-2-Analog als einzelner oder individualisierter Peak auf HPLC, weist eine gleichförmige und authentische Aminosäurezusammensetzung und -sequenz in der Analyse auf und erfüllt ansonsten Standards, die von verschiedenen nationalen Behörden erstellt sind, welche die Qualität pharmazeutischer Produkte regulieren.
Zur therapeutischen Verwendung wird das gewählte GLP-2- Analog mit einem Träger formuliert, der pharmazeutisch annehmbar ist und zur Abgabe des Peptids über den gewählten Verabreichungsweg geeignet ist. Geeignete pharmazeutisch annehmbare Träger sind jene, die für gewöhnlich bei Arzneimitteln auf Peptidbasis verwendet werden, wie Verdünnungsmittel, Bindemittel und dergleichen. Es kann auf "Remington's Pharmaceutical Sciences", 17. Ausgabe, Mack Publishing Company, Easton, Penn., 1985, in Bezug auf Anleitungen zur Arzneimittelformulierung im Allgemeinen verwiesen werden. In einer Ausführungsform der Erfindung werden die Verbindungen zur Verabreichung durch Infusion formuliert, z. B., wenn sie als flüssige Nahrungsergänzungen für Patienten auf einer vollständigen parentetalen Ernährungstherapie verwendet werden, oder durch Injektion, z. B. subkutan, intramuskulär oder intravenös, und werden daher als wässerige Lösungen in steriler und pyrogenfreier Form verwendet und wahlweise auf einen physiologisch verträglichen pH gepuffert, z. B. einen leicht sauren oder physiologischen pH. Somit können die Verbindungen in einem Träger wie destilliertem Wasser oder, was wünschenswerter ist, in Kochsalzlösung, phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder 5% Dextroselösung verabreicht werden. Die Wasserlöslichkeit des GLP-2-Analogs kann nach Wunsch durch Einfügung eines Löslichkeitsverstärkers, wie Essigsäure, verstärkt werden.
Der wässerige Träger oder das Vehikel kann zur Verwendung als Injektionsmittel mit einer Menge an Gelatine ergänzt werden, um das GLP-2-Analog an oder nahe der Injektionsstelle zu deponieren, so dass es langsam an die gewünschte Wirkungsstelle abgegeben wird. Es wird erwartet, dass die Gelatinekonzentrationen, die zum Erreichen der Depotwirkung effektiv sind, im Bereich von 10 bis 20% liegen. Alternative Gelierungsmittel, wie Hyaluronsäure, können auch als Depotmittel nützlich sein.
Die GLP-2-Analoge der Erfindung können auch als Implantationsvorrichtung mit langsamer Freisetzung zur verlängerten und anhaltenden Verabreichung des GLP-2- Analogs formuliert sein. Zu Beispielen für solche Formulierungen mit anhaltender Freisetzung zählen Zusammensetzungen aus biokompatiblen Polymeren, wie Poly(milchsäure), Poly(milch-co-glycolsäure), Methylcellulose, Hyaluronsäure; Collagen und dergleichen. Die Struktur, Wahl und Verwendung abbaubarer Polymere in Arzneimittelfreigabevehikeln wurde in mehreren Veröffentlichungen im Überblick dargestellt, einschließlich A. Domb et al., Polymers for Advanced Technologies 3: 279- 292 (1992). Zusätzliche Richtlinien für die Wahl und Verwendung von Polymeren in pharmazeutischen Formulierungen finden sich in dem Text von M. Chasin und R. Langer (Hrsg.), "Biodegradable Polymers as Drug Delivery Systems", Band 45 von "Drugs and the Pharmaeutical Sciences", M. Dekker, New York, 1990. Liposome können auch verwendet werden, um für die anhaltende Freisetzung eines GLP-2- Analogs zu sorgen. Einzelheiten, wie liposomale Formulierungen von Arzneimitteln von Interesse zu verwenden und herzustellen sind, finden sich unter anderen in U.S. Pat. Nr. 4, 944, 948; U.S. Pat. Nr. 5,008,050; U.S. Pat. Nr. 4,921,706; U.S. Pat. Nr. 4,927,637; U.S. Pat. Nr. 4,452,747; U.S. Pat. Nr. 4,016,100; U.S. Pat. Nr. 4,311,712; U.S. Pat. Nr. 4,370,349; U.S. Pat. Nr. 4,372,949; U.S. Pat. Nr. 4,529,561; U.S. Pat. Nr. 5,009,956; U.S. Pat. Nr. 4,725,442; U.S. Pat. Nr. 4,737,323; U.S. Pat. Nr. 4,920,016. Formulierungen mit anhaltender Freisetzung sind von besonderem Interesse, wenn es wünschenswert ist, eine, hohe örtliche Konzentration eines GLP-2-Analogs bereitzustellen.
Das GLP-2-Analög kann in Form eines sterilabgefüllten Fläschchens oder einer Ampulle verwendet werden, das/die eine intestinotrophe Menge des Peptids entweder in einer Einheitsdosis- oder Mehrfachdosismenge enthält. Das Fläschchen oder die Ampulle kann das GLP-2-Analog und den gewünschten Träger als verabreichungsfertige Formulierung enthalten. Als Alternative kann das Fläschchen oder die Ampulle das GLP-2-Peptid in einer Form, wie einer lyophilisierten Form, enthalten, die zur Rekonstitution in einem geeigneten Träger, wie phosphatgepufferter Kochsalzlösung, geeignet ist.
Als Alternative zu injizierbaren Formulierungen kann das GLP-2-Analog zur Verabreichung über andere Wege formuliert sein. Orale Dosierungsformen, wie Tabletten, Kapseln und dergleichen, können nach standardmäßigen pharmazeutischen Praktiken formuliert werden. Gemäß der vorliegenden Erfindung wird das GLP-2-Analog verabreicht, um Patienten zu behandeln, die von einem Wachstum des Dünndarmgewebes profitieren würden. Die Wirkungen des GLP-2-Analogs auf dieses Gewebe, wie durch die Ergebnisse bewiesen wird, die hierin als Beispiel angeführt sind, ist dramatisch und würde eindeutig jenen Patienten nutzen, die an Erkrankungen oder Zuständen leiden, die durch Abnormalitäten in der Schleimhaut des Dünndarmtraktes gekennzeichnet sind, umfassend Ulzera und entzündliche Störungen; angeborene und erworbene Verdauungs- und Absorptionsstörungen, einschließlich der Malabsorptionssyndrome; und Erkrankungen und Zustände, die durch einen Verlust der Dünndarmschleimhautfunktion verursacht werden, insbesondere bei Patienten, die eine umfassende parenterale Ernährung erhalten oder die infolge eines chirurgischen Eingriffs einer Resektion des Dünndarms unterzogen wurden und am Kurzdarm-Syndrom und Cul-de-Sac-Syndrom leiden. Die therapeutische Behandlung mit GLP-2-Analog wird so verabreicht, dass die Krankheitssymptome verringert oder beseitigt werden und/oder der Ernährungsstatus bei diesen Patienten verbessert wird, der mit ihrer verringerten Schleimhautfunktion im Darmtrakt in Zusammenhang steht. Zum Beispiel wird das GLP-2-Analog an einen Patienten mit einem entzündlichen Darmzustand in einer Menge verabreicht, die ausreicht, um die Darmbeschwerden und Diarrhö, die durch den Zustand verursacht werden, zu verbessern. Zusätzlich kann das GLP-2-Arialog an Patienten mit Malabsorptionsstörungen verabreicht werden, um die Nahrungsmittelabsorption zu verstärken und somit den Ernährungsstatus solcher Patienten zu verbessern.
Im Allgemeinen sind Patienten, die von einer größeren Dünndarmmasse und daraus folgenden verstärkten Schleimhautfunktion des Dünndarms profitieren würden, Kandidaten für die Behandlung mit GLP-2-Analog. Besondere Zustände, die mit GLP-2-Analog behandelt werden können, umfassen die verschiedenen Formen der Sprue, einschließlich der einheimischen Sprue, die aus einer toxischen Reaktion auf α-Gliadin von Weizen resultiert und durch einen starken Verlust an Dünndarmzotten gekennzeichnet ist; tropischen Sprue, die aus einer Infektion resultiert und durch eine teilweise Abflachung der Zotten gekennzeichnet ist; hypogammaglobulinäischen Sprue, die allgemein bei Patienten mit allgemeinem variablen Immunmangel oder mit Hypogammaglubulinämie beobachtet wird und durch eine deutliche Abnahme der Zottenhöhe gekennzeichnet ist. Die therapeutische Wirksamkeit der GLP-2-Analog-Behandlung kann durch Darmbiopsie, um die Zottenmorphologie zu prüfen, durch biochemische Bewertung der Nahrungsmittelabsorption, durch Gewichtszunahme beim Patienten, oder durch eine Verbesserung der Symptome, die mit diesen Zuständen zusammenhängen, überwacht werden. Andere Zustände, die mit GLP-2-Analog behandelt werden können oder für die GLP-2- Analog prophylaktisch nützlich sein kann, umfassen strahlungsbedingte Enteritis, infektiöse oder postinfektiöse Enteritis, Enteritis regionalis (Morbus Crohn), Dünndarmschädigung infolge toxischer oder anderer chemotherapeutischer Mittel und Patienten mit Kurzdarm- Syndrom.
Die therapeutische Dosierung und der Therapieplan, die für die Patientenbehandlung am geeignetsten sind, sind natürlich abhängig von der zu behandelnden Erkrankung und dem Zustand, dem Gewicht des Patienten und anderen Parametern unterschiedlich. Die in der Folge dargelegten Ergebnisse zeigen, dass eine Dosis von GLP-2-Peptid, die etwa 100 ug/kg (oder weniger) entspricht, die zweimal täglich 10 Tage lang verabreicht wird, sehr signifikante Anstiege in der Dünndarmmasse hervorrufen kann. Es wird erwartet, dass viel geringere Dosen, z. B. im ug/kg Bereich, und eine kürzere oder längere Dauer oder Frequenz der Behandlung auch therapeutisch zweckdienliche Ergebnisse liefern, d. h., eine statistisch signifikante Erhöhung insbesondere der Dünndarmmasse. Es wird auch erwartet, dass der Therapieplan die Verabreichung von Erhaltungsdosen beinhaltet, die zur Umkehr der Geweberückbildung geeignet sind, die nach Beendigung der anfängliche Behandlung eintritt. Als Richtlinie für die geeignetsten Dosierungsgrößen und das Dosierungsschema zur Verwendung beim Menschen dienen die hierin dargelegten Ergebnisse, die in richtig angelegten klinischen Versuchen bestätigt werden können.
Ein effektives Dosierungs- und Behandlungsprotokoll kann durch herkömmliche Mittel bestimmt werden, beginnend mit einer geringen Dosis bei Versuchstieren, gefolgt von höheren Dosierungen unter Überwachung der Wirkungen, wie auch durch systematische Veränderung des Dosierungsschemas. Zahlreiche Faktoren können von einem Kliniker in Betracht gezogen werden, wenn er eine optimale Dosierung für einen bestimmten Patienten bestimmt. Vorherrschend unter diesen ist die Menge an GLP-2, die normalerweise im Plasma zirkuliert, die bei gesunden erwachsenen Menschen in der Größenordnung von 151 umol/ml im Ruhezustand liegt und auf 225 umol/ml nach einer Nahrungsaufnahme steigt. Orskow, C. und Heist, J. J., 1987, Scand. J. Clin. Lav. Invest. 47: 165. Zusätzliche Faktoren umfassen die Größe des Patienten, das Alter des Patienten, den allgemeinen Zustand des Patienten, die besondere Erkrankung, die behandelt wird, die Schwere der Erkrankung, das Vorhandensein anderer Arzneimittel in dem Patienten, die in vivo Aktivität des GLP-2-Analogs und dergleichen. Die Versuchsdosierungen wären unter Berücksichtigung der Ergebnisse von Tierversuchen und der klinischen Literatur zu wählen. Für den Durchschnittsfachmann ist offensichtlich, dass Informationen, die Bindungskonstanten und Ki, die von in vitro GLP-2-Bindungskonkurrenztests abgeleitet werden, auch in der Berechnung von Dosierungen verwendet werden können, wie auch die berechnete Halbwertzeit des GLP-2-Analogs in vivo.
Eine typische Dosis eines GLP-2-Peptids für den Menschen wäre von etwa 10 ug/kg Körpergewicht/Tag bis etwa 10 mg/kg/Tag, vorzugsweise von etwa 50 ug/kg/Tag bis etwa 5 mg/kg/Tag, und insbesondere von etwa 100 ug/kg/Tag bis 1 mg/kg/Tag. Da die GLP-2-Analoge der Erfindung bis zu 10 oder sogar 100 Mal stärker sein können als GLP-2, könnte eine typische Dosis eines solchen GLP-2-Analogs geringer sein, zum Beispiel, von etwa 100 ng/kg Körpergewicht/Tag bis 1 mg/kg/Täg, vorzugsweise 1 ug/kg/Tag bis 50 ug/kg/Tag, und insbesondere 1 ug/kg/Tag bis 100 ug/kg/Tag.
Die intestinotrophen GLP-2-Analoge der Erfindung sind ebenso sowohl zur Verstärkung des Darmwachstums als auch zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen bei Nutztieren und Haustieren zweckdienlich.

Beispiel 1 - GLP-2-Analog-Synthese

Die Festphasenpeptidsynthese ("solid phase peptide synthesis" - SPPS) wird manuell in einem 300 Milliliter (ml) Gefäß auf einer 3 millimol (mmol) Waage durchgeführt, wobei 6 Gramm (g) Chlormethyl- (Merriefield) Harz (für C- terminale freie Säurepeptide) mit einer Substitution von 0,5 Milliäquivalenten (meq) pro Gramm verwendet werden. Aminosäuren sind am Amino-Terminus mit der t- Butyloxycarbonyl- (tBoc-) Gruppe geschützt. Die Seitenketten von trifunktionalen Aminosäuren sind mit den Benzyl- (Bz, für Serin und Threonin), Benzyloxymethyl- (BOM, für Histidin), 2-Bromobenzyloxycarbonyl- (2-BrZ, für Tyrosin), 2-Chlorobenzyloxycarbonyl- (2-ClZ, für Lysin), Cyclohexyl- (cHex, für Asparagin- und Glutaminsäure) und Tosyl- (Tos, für Arginin) Gruppen geschützt. Die erste Aminosäure ist an das Chlormethylharz durch Veresterung der geschützten Aminosäure in Gegenwart von Kaliumfluorid (KF) gekoppelt. C-terminale Amidpeptide werden auf einem 4- Methylbenzhydrylamin- (MBHA-) Harz auf einer 3 mmol Waage unter Verwendung von 6 g Harz mit einer Substitution von 0.5 meq/g synthetisiert. Die erste Aminosäure ist an das MBHA-Harz gemäß der Prozedur gekoppelt, die für die Peptidverlängerung beschrieben ist.
Die Amino-Gruppen-Schutzentfernung wird unter Verwendung von 50% Trifluoressigsäure (TFA) in Dichloromethan (CH&sub2;Cl&sub2;) ausgeführt, gefolgt von einer Neutralisierung unter Verwendung von zwei Waschschritten mit 10% Triethylamin (Et&sub3;N) in CH&sub2;Cl&sub2;. Die Peptidverlängerung wird unter Verwendung der N,N-Dicyclohexylcarbodiimid/1- Hydroxybenzotriazol- (DCC/HOBt-) Aktivierung in CH&sub2;Cl&sub2;/Dimethylformamid (DMF) durchgeführt. Die wachsende Peptidkette wird nach einem solchen Verlängerungsschritt mit 20% Ac&sub2;O in CH&sub2;Ol&sub2; blockiert. Das Peptidharz wird nach jedem Verlängerungs-, Blockierungs- ("Capping") und Schutzentfernungsschritt mit Isopropanol (iPrOH) und Methanol (MeOH) gewaschen. Die Waschungen werden einmal wiederholt. N-terminale Acetylpeptide werden durch Acetylierung der terminalen Aminogruppe mit 20% Ac&sub2;O in CH&sub2;Cl&sub2; nach der Schutzentfernung und Neutralisierung, wie beschrieben, hergestellt. Harzgebundene Produkte werden routinemäßig durch ein Tief-Hoch-Verfahren unter Verwendung von Fluorwasserstoff (HF) enthaltend Dimethylsulfid (DMS) und p-Cresol als Spülmittel gespalten.
Rohpeptide werden durch präparative Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) unter Verwendung einer Vydac C18, 15-20 um Porenweite, 2 Inch · 12 Inch, Umkehrphasen-Silikasäule unter Verwendung einer Gradientenelution mit 0,1% TFA in Wasser, modifiziert mit Acetonitril, gereinigt. Die Elution wird bei 220 Nanometer (nm) aufgezeichnet. Jede gesammelte Fraktion wird durch analytische HPLC unter Verwendung einer Vidac C18, 5 um, 4,6 · 254 Millimeter (mm) Umkehrphasen-Silikasäule durch Gradientenelution unter Verwendung von 0,1% TFA in Wasser, modifiziert mit Acetonitril, auf Reinheit analysiert und bei 215 nm aufgezeichnet. Fraktionen, die eine Reinheit von mehr als 95% zeigen, werden vereint und lyophilisiert. Acetatsalze der Peptide werden aus den TFA- Salzen durch Auflösen des lyophilisierten Pulvers in Wasser hergestellt, wobei, falls notwendig, Acetonitril zur Unterstützung der Auflösung zugegeben wird. Die Lösung wird durch ein protoniertes Bio-Rex-70 Kationenaustauschharz geleitet. Das Harz wird mit 5 Bettvolumen Wasser gewaschen und das harzgebundene Peptid wird mit 50% Essigsäure in Wasser eluiert. Der Eluent wird mit Wasser verdünnt und lyophilisiert.
Das fertige lyophilisierte Pulver wird durch zwei analytische Umkehrphasen-HPLC-Verfahren unter Verwendung einer Vydac C18, 5 um, 4,6 · 254 Millimeter (mm) Umkehrphasen-Silikasäule auf Reinheit analysiert. Die beiden verwendeten Lösemittelsysteme sind ein Gradient von Wasser, der mit Triethylaminphosphat, modifiziert mit Acetonitril, auf pH 2,25 eingestellt ist, und ein Gradient von 0,1% TFA in Wasser, modifiziert mit Acetonitril. Der Säuleneluent wird bei 215 nm aufgezeichnet. Die Identität jedes Produktes wird durch Aminosäurenanalyse und durch Elektroskopie-Massenspektroskopie bestätigt.
Die GLP-2-Analoge werden dann, wie in der Folge in Beispiel 2 beschrieben, formuliert. Jedes der GLP-2-Analoge ist bei Raumtemperatur vollständig in Wasser löslich, wenn nicht anders angegeben.

Beispiel 2 - GLP-2-Analog-Formulierung

Die GLP-2-Analoge wurden zur Injektion entweder in phosphatgepufferter Kochsalzlösung oder als gelatinehältige Depotformulierung formuliert. Für die PBS-formulierten GLP- 2-Analog-Zubereitungen wurde zunächst eine 10X PBS- Stammlösung unter Verwendung von 80 g NaCl (BDH ACS 783), 2 g KCl (BDH ACS 645), 11,5 g Na&sub2;HPO&sub4; (Anachemia AC-8460 und 2 g KH&sub2;PO&sub4; (Malinekrodt AR7100) hergestellt, die mit sterilem destillierten Wasser auf ein Gesamtvolumen von einem Liter aufgefüllt wurde. Die fertige Arbeitslösung wurde durch 10 : 1 Verdünnung der Stammlösung mit sterilem destillierten Wasser erhalten und, falls notwendig, unter Verwendung ausreichender Volumina von 10N NaOH auf pH 7,3- 7,4 eingestellt. Die Arbeitslösung wurde dann 30 Minuten autoklaviert. In der fertigen PBS-Arbeitlösung waren die Konzentrationen 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 4,3 mM Na&sub2;HPO&sub4;·7H&sub2;O und 1,4 mM KH&sub2;PO&sub4;.
Das GLP-2-Analog wird als pulverförmiges Peptid der PBS- Arbeitslösung nach Bedarf zugegeben, um Formulierungen mit den gewünschten Peptidkonzentrationen zu erhalten. Zur Erzeugung einer PBS-Lösung eines GLP-2-Analogs mit 130 mg/l, werden zum Beispiel 5,2 mg GLP-2-Analog in 40 ml PBS gelöst, um eine GPL-2-Konzentration von 130 ug/ml zu erhalten, 0,5 ml werden zweimal täglich injiziert.
Zur Erzeugung der GLP-2-Analog-Formulierungen auf Gelatinebasis wurde zunächst eine Gelatinelösung durch Auflösen von 12 Gramm Gelatine (Sigma, G-8150 Lot #54H07241 Typ A von Schweinehaut [9000-70-8] ~ 300 Bloom) in 100 ml destilliertem Wasser hergestellt. Die Gelatinelösung wurde dann autoklaviert, bei 37ºC erwärmt, und das zuvor in phosphatgepufferter Kochsalzlösung, wie oben beschrieben, aufgelöste GLP-2-Peptid wurde dann zugegeben, um bestimmte gewünschte Peptidkonzentrationen zu erreichen. Zum Beispiel wurden zur Erzeugung einer PBS-Lösung auf Gelatinebasis des GLP-2, bei einer Konzentration von 130 mg/l, 10 ml einer. PBS-Lösung, die mit 5,2 mg GLP-2 hergestellt worden war, mit 30 ml der 20% Gelatine-Arbeitslösung, wie oben beschrieben, verdünnt. Die Lösung wurde durch schonendes Pipettieren gemischt, um eine fertige Lösung von 130 mg/l GLP-2 in PBS/15% Gelatine zu erhalten.

Beispiel 3 - Test auf Beständigkeit gegenüber Dipeptidyl- Peptidase IV

Die folgenden Peptide wurden, auf Beständigkeit gegenüber Dipeptidyl-Peptidase IV (DPP-IV) getestet: ein Kontrollpeptid, rGLP-2; das [D-Ala²]rGLP-2-Analog; und das [Gly²]rGLP-2-Analog. Zur Durchführung des Tests wurden 2,5 Mikroliter (ul) einer Lösung aus humanem placentalen DPP-IV (Calbiochem, La Jolla, Ca, Kat. #317624), enthaltend 0,125 Millieinheiten (mE) Enzym in 50% Glycerol, 10 mM Tris, pH 7,8, EDTA und 0,02% NaN&sub3; zu 50 ul einer Lösung des Testpeptids zugegeben, die mit einer Konzentration von 0,2 mg/ml in PBS bei pH 7,4 hergestellt worden war. Die Mischung wurde bei 37ºC in einem zirkulierenden Wasserbad 24 Stunden inkubiert. Die Inkubation wurde durch Zugabe von 50 ul einer Lösung aus Diprotin A abgeschreckt, die mit einer Konzentration von 4 mg/ml in PBS hergestellt worden war. Jedes Peptid wurde zweifach getestet.
Jede Probe wurde durch Umkehrphasen- (RP-) HPLC wie folgt getestet: 90 ul der abgeschreckten Inkubationsmischung wurden auf eine Rainin Dynamax Säule, 300 Å, C18, 5 Mikron, 4,6 · 250 Millimeter, injiziert. Die Proben wurden mit 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) in Wasser, modifiziert mit 0,1 % Acetonitril, unter Verwendung eines linearen Gradienten und einer Strömungsrate von 1 ml pro Minute eluiert. Die Probenkomponenten wurden bei 214 Nanometer (nm) erfasst. Das Spaltungsausmaß wurde durch relative Integration des Peaks, der dem Spaltungsprodukt entsprach, im Vergleich zu jenem des verbleibenden, nicht aufgeschlossenen Mutterpeptids gemessen. Es wurde bestätigt, dass das Spaltungsprodukt des Kontrollpeptids, rGLP-2(1-33), das rGLP-2(3-33) sein sollte, aus der Spaltung zwischen den Resten Ala² und Asp³ erhalten wurde, indem die Retentionszeit dieser Komponente mit jener eines synthetischen Peptidstandards, rGLP-2(3-33), verglichen und das Produkt von der HPLC gesammelt und durch Massenspektrometrie analysiert wurde.
Nach einer Inkubation über 24 Stunden waren 22% des Kontrollpeptids, rGLP-2, durch DPP-IV gespalten. Es wurden keine Spaltungsprodukte für die Peptide [D-Ala²]rGLP-2 und [Gly²]rGLP-2 nach 24 Stunden nachgewiesen.

Beispiel 4 - GLP-2-Analog-Bewertung

Empfänger waren CD1-Mäuse, die vom Charles River Laboratory (Ontario, Kanada) erhalten wurden. Die CD1-Mäuse waren altersangepasste Weibchen zum Zeitpunkt der Injektion (n = 3 bis 4 pro Gruppe), 6 Wochen alt, wenn nicht anders angegeben. Vor Beginn des Experiments wurden die Tiere mindestens 24 Stunden auf die Laboranlage akklimatisiert. Tiere wurden durch Ohrstanzung identifiziert. Die Mäuse waren während der Versuche weder in ihrer Diät noch Aktivität eingeschränkt. Der Hell/Dunkelzyklus dauerte 12 Stunden, von 18 Uhr bis 6 Uhr. Kontrollen waren alters- und geschlechtsangepasste (n = 3 bis 4) Tiere. Den Mäusen wurden zweimal täglich (b.i.d) 2,5 ug Peptid in einem Gesamtvolumen von 0,5 cc PBS subkutan injiziert und sie wurden täglich in der Laboranlage beobachtet. 10 oder 14 Tage nach der Injektion wurden die Tiere getötet und mindestens 20 Stunden vor der Tötung fasten gelassen.
Die Mäuse wurden mit CO&sub2; anästhetisiert und durch Herzpunktur ausgeblutet. Das Blut wurde in 75 ul TED (Trasylol; EDTA (5000 KIE/ml: 1,2 mg/ml; Diprotin-A) gesammelt und das Blut wurde bei 14 k · g 5 Minuten zentrifugiert und das Plasma wurde vor der Analyse bei -70 gelagert. Der Dünndarm wurde aus der Peritonealhöhle, vom Pylorus bis zum Zäkum, entfernt, gereinigt, gewogen und gemessen. Für Vergleichszwecke wurden Sektionen von jedem Tier von der identischen anatomischen Position erhalten. Fragmente, die jeweils 1,5 bis 2,0 cm lang waren, würden 8 ± 2 cm, 18 ± 2 cm, 32 ± 2 cm vom Pylorus für die Histomorphometrie erhalten, die das proximale Jejunum, distale Jejunum und distale Ileum darstellten. Jedes Dünndarmfragment wurde der Länge nach an der dem Mesenterium abgewandeten Dünndarmseite in einem Gewebeblock geöffnet und dann über Nacht auf 10% Formalin (Vol/Vol) gelegt, dann auf 70% ETOH überführt.
Die prozentuale Veränderung im Dünndarmgewicht wurde durch Division der mittleren Veränderung im Darmgewicht analog behandelter Mäuse relativ zu Mäusen, die nur mit dem Vehikel behandelt worden waren, durch das mittlere Darmgewicht von Mäusen, die nur mit dem Vehikel behandelt wurden waren, und Multiplikation dieser Zahl mit 100 berechnet.
Die Ergebnisse der Bewertung der intestinotrophen Aktivität sind in Tabelle 1 angeführt: TABELLE 1
Aus der obigen Tabelle ist sofort ersichtlich, dass Analoge von Säuger-GLP-2-Molekülen eine verstärkte intestinotrophe Aktivität haben können. Ferner ist klar, dass sich, abhängig von der durchgeführten Substitution, verschiedene Werte einer intestinotrophen Aktivität manifestieren. Zum Beispiel hat [Gly²]rGLP-2 eine deutlich verstärkte intestinotrophe Aktivität im Vergleich zu dem von Natur aus vorkommenden Molekül; [Gly²]hGLP-2 hat eine deutlich erhöhte intestinotrophe Aktivität im Vergleich zu rGLP-2 und [Leu¹&sup0;]rGLP-2 hat eine Zunahme von weniger als 50% in der intestinotrophen Aktivität.
Die folgenden Versuche wurden durchgeführt um zu bestätigen, dass die. Zunahme im Darmgewicht, die bei Versuchstieren beobachtet wurde, die mit DPP-IV-beständigen Analogen von GLP-2 behandelt worden waren, im Vergleich zu Tieren, die mit Wildtyp-GLP-2 behandelt worden waren, teilweise auf die DPP-IV-beständige Eigenschaft der Moleküle zurückzuführen war. Bei diesem Versuch wurde die Verfügbarkeit eines Rattenstamms mit DPP-IV-Mangel, Fisher 334 DPP-IV-Ratten, genutzt. Die Wirkung von rGLP-2- Injektionen auf das Dünndarmgewicht bei den Fisher-Ratten mit DPP-IV-Mangel wurde mit jener bei normalen Sprague- Dawley-Ratteh verglichen.
In den folgenden Versuchen wurde den Sprague-Dawley-Ratten zweimal täglich rGLP-2 in der Gelatine-Formulierung s.c. injiziert. Den Fisher-Ratten wurden zweimal täglich GLP-2- Peptide (sowohl rGLP-2 als auch rGLP-2-Analoge) in PBS s.c. injiziert.
Normale Sprague-Dawley-Ratten, die mit rGLP-2, 2,5 ug b.i.d oder 25 ug b.i.d., behandelt worden waren, zeigten keine prozentuale Veränderung im Dünndarmgewicht im Vergleich zu Kontrolltieren, die nur das Vehikel erhielten. Fisher 334 DPP-IV-Ratten (Tiere mit DPP-IV-Mangel) zeigten jedoch eine Zunahme von etwa 40-50% in der prozentualen Veränderung des Dünndarmgewichts, wenn sie mit 20 ug b.i.d rGLP-2 behandelt wurden, im Vergleich zu Tieren, die nur mit dem Vehikel behandelt wurden. Ferner zeigten Tiere mit DPP-IV- Mangel, die mit 20 ug [Gly²]rGLP-2 behandelt wurden, eine Zunahme von 50-60% in der prozentualen Veränderung des Dünndarmgewichts im Vergleich zu Tieren, die nur den Vektor erhielten. Ferner zeigten Fisher 344 Wildtyp-Ratten eine Zunahme von 75-85% des Dünndarmgewichts gegenüber Kontrolltieren, die nur das Vehikel erhielten, wenn sie mit 20 ug b.i.d. [Gly²]rGLP-2 behandelt wurden.
Die oben genannten Ergebnisse deuten nachdrücklich darauf hin, dass GLP-2 in vivo in normalen Ratten durch Spaltung der beiden N-terminalen Reste durch ein DPP-IV-artiges Enzym inaktiviert wird. Ferner zeigen diese Ergebnisse, dass ein GLP-2-Analog, das so modifiziert ist, dass es gegenüber einer Spaltung durch DPP-IV beständig ist, eine deutliche Zunahme im Darmgewicht bei normalen Ratten herbeiführte, vermutlich infolge einer erhöhten GLP-2 Halbwertzeit in vivo.
Da die DPP-IV Spaltungsstelle in allen bekannten, von Natur aus vorkommenden Formen von GLP-2 konserviert ist, scheint es wahrscheinlich, dass in Säugetieren die DPP-IV-Spaltung ein wichtiger und wahrscheinlich der primäre Mechanismus ist, durch den GLP-2 in vivo inaktiviert wird. Es ist wesentlich, dass GLP-2-Analoge, die gegenüber einer DPP-IV- Spaltung beständig sind, verbesserte intestinotrophe Aktivität im Vergleich zur nativen Form haben.

Beispiel 5

Versuche, welche die Dünndarm induzierende Aktivität verschiedener Analoge bewerteten, wurden wie zuvor in Beispiel 4 beschrieben, wiederholt. In diesen Versuchen wurde die Dünndarm induzierende Aktivität jedes Analogs in Mäusen relativ zu jener des nativen Ratten-GLP-2(1-33) (ausgedrückt als 100% Aktivität) berechnet. Die Beständigkeit von Analogen gegenüber einer DPP-IV-Spaltung wurde wie zuvor in Beispiel 3 beschrieben durchgeführt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt. TABELLE 2

SEQUENZLISTE

(1) ALLGEMEINE INFORMATION:

(i) ANMELDER: 11 49 336 Ontario Inc. Allelix Biopharmaceuticals Inc.
(ii) TITEL DER ERFINDUNG: Glucagonartige Peptid-2- Analoge
(iii) ANZAHL DER SEQUENZEN: 2
(iv) ADRESSE FÜR SCHRIFTVERKEHR:
(A) ADRESSAT: Osler, Hoskin & Harcourt
(B) STRASSE: 50 O'Connor Street
(C) STADT: Ottawa
(D) STAAT: Ontario
(E) LAND: Kanada
(F) POSTLEITZAHL: KIP 6L2
(v) COMPUTERLESBARE FORM:
(A) MEDIUMART: Diskette
(B) COMPUTER: IBM PC-kompatibel
(C) BETRIEBSSYSTEM: PC-DOS/MS-DOS
(D) SOFTWARE: PatentIn Release #1.0, Version #1.30
(vi) AKTUELLE ANMELDEDATEN:
(A) ANMELDENUMMER: PCT/CA97/00252
(B) EINREICHDATUM: 11. April 1997
(C) KLASSIFIZIERUNG:
(viii) INFORMATION ZU RECHTSANWALT/AGENT:
(A) NAME: Aitken, David W.
(B) REGISTRIERUNGSNUMMER:
(C) REFERENZ/REGISTERNUMMER: 12391 Int. PCT
(ix) TELEKOMMUNIKATIONSINFORMATION
(A) TELEFON: (613) 235-7234
(B) TELEFAX: (613) 235-2867
(C) TELEX:

(2) INFORMATION ZUR SEQ ID NR: 1

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 37 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANG:
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) MOLEKÜLART: Peptid
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 1
(C) WEITERE INFORMATIONEN: Eine basische Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe Arg, Lys und His. Xaa kann in der Sequenz
vorhanden sein oder nicht.
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 2
(C) WEITERE INFORMATIONEN: Eine basische Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe Arg, Lys und His. Xaa kann in der Sequenz vorhanden sein oder nicht:
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 3
(C) WEITERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "His oder Tyr"
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 4
(C) WEITERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "Ala oder eine Ala-Substitutions-Aminosäure, die dem Analog Beständigkeit gegenüber dem DPP-IV- Enzym verleiht"
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 5
(C) WEITERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "Pro, Hpro, Asp oder Glu"
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 6
(C) WEITERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "Gly oder Ala"
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 11
(C) WEITERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "Xaa ist entweder Glu oder Tyr"
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 12
(C) WEITERE INFORMATIONEN: Ser, wenn Position 11 Tyr ist, andernfalls Met oder eine oxidativ stabile Met-Substitutions-Aminosäure
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 13
(C) WEITERE INFORMATIONEN: Lys, wenn Position 11 Tyr ist, oder Asn
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 14
(C) WEITERE INFORMATIONEN: Tyr, wenn Position 11 Tyr ist, oder Thr
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 15
(C) WEITERE INFORMATIONEN: Ile. oder Xaa ist nicht vorhanden, wenn Position 11 Tyr ist
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 21
(C) WEITERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "Ala oder Thr"
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 22
(C) WEITERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "Arg, Lys, His oder Ala"
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 25
(C) WEITERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "Xaa ist Ile oder Val"
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 26
(C) WEITERE INFORMATIONEN: /Anmerkung = "Xaa ist Asn oder Ala, wenn Position 20 Ile ist. Xaa ist Gln, wenn Position 20 Val ist"
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 33
(C) WEITERE INFORMATIONEN: "Ile oder eine kovalente Bindung"
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 34
(C) WEITERE INFORMATIONEN: "Thr, wenn Position 34 Ile ist, oder eine kovalente Bindung"
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 35
(C) WEITERE INFORMATIONEN: "Asn, wenn Position 35 Thr ist, oder eine kovalente Bindung"
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 3.6
(C) WEITERE INFORMATIONEN: Eine basische Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe Arg, Lys und His. Xaa kann in der Sequenz vorhanden sein oder nicht.
(ix) MERKMALE:
(A) NAME/SCHLÜSSEL: Modifizierte Stelle
(B) POSITION: 37
(C) WEITERE INFORMATIONEN: Eine basische Aminosäure, ausgewählt aus der Gruppe Arg, Lys und His. Xaa kann in der Sequenz vorhanden sein oder nicht. (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 1:

(2) INFORMATION FÜR SEQ ID NO: 2:

(i) SEQUENZEIGENSCHAFTEN:
(A) LÄNGE: 33 Aminosäuren
(B) ART: Aminosäure
(C) STRANG:
(D) TOPOLOGIE: unbekannt
(ii) MOLEKÜLART: Peptid (xi) SEQUENZBESCHREIBUNG: SEQ ID NR: 2:

Claims

1. Verwendung eines GLP-2-Analogs, gekennzeichnet durch intestinotrophe Aktivität und übereinstimmend mit Formel 1:

R1-(Y1)m-X1-X2-X3-X4-Ser5-Pher6-Ser7-Asp8(P1)-Leu14-Asp15-Amt16- Leu17-Ala18-X19-X20-Asp21-Phe22-(P2)-Trp25-Leu26-Ile27-Gln-28- Thr29-Lys30-(P3)-(Y2)n-R2,

worin sind:

X1 His oder Tyr

X2 Ala oder eine Ala-Substitutions-Aminosäure, die dem Analog Beständigkeit gegenüber dem DPP-IV-Enzym vermittelt;

X3 Pro, HPro, Asp oder Glu;

X4 Gly oder Ala;

P1 Glu-X10-Asn-Thr-Ile oder Tyr-Ser-Lys-Tyr;

X10 Met oder eine oxidativ stabile Met-Substitutions-Aminosäure;

X19 Ala oder Thr;

X20 Arg, Lys, His oder Ala;

P2 Ile-Asn, Ile-Ala oder Val-Gln;

P3 eine kovalente Bindung oder Ile, Ile-Thr oder Ile-Thr-Asp;

R1 H oder eine N-terminal blockierende Gruppe;

R2 OH oder eine C-terminal blockierende Gruppe;

Y1 ein oder zwei basische Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe Arg, Lys und His;

Y2 ein oder zwei basische Aminosäuren, ausgewählt aus der Gruppe Arg, Lys und His; und m und n unabhängig 0 oder 1; und

worin mindestens eines von X1, X2, X3, X4, P1, X10, X20, P2 und P3 kein Wildtyp GLP-2-Rest eines Säugers ist, in der Herstellung eines pharmazeutischen Mittels für die Förderung des Wachstums und/oder der Funktion von gastrointestinalem Gewebe.

2. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach Anspruch 1 zur Förderung des Wachstums und/oder der Funktion des Dünndarmgewebes.

3. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach Anspruch 1 oder 2 für die Prophylaxe oder Behandlung einer gastrointestinalen Erkrankung, Krankheit oder Störung.

4. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach Anspruch 3, wobei die gastrointestinale Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Ulcera, Verdauungsstörungen, Malabsorptionssyndromen, Kurzdarm-Syndrom, Cul-de-Sac-Syndrom, entzündliche Darmerkrankung, einheimische Sprue, tropische Sprue, hypogammaglobulinamische Sprue, strahlungsbedingte Enteritis, infektiöse oder postinfektiöse Enteritis, Enteritis regionalis (Morbus Crohn), Dünndarmschädigung in Folge toxischer oder anderer chemotherapeutischer Mittel sowie Kurzdarm-Syndrom.

5. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach Anspruch 4 zur Behandlung von Dünndarmschädigung in Folge eines chemotherapeutischen Mittels.

6. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach Anspruch 4, für die Prophylaxe von Dünndarmschädigung in Folge eines chemotherapeutischen Mittels.

7. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach Anspruch 4 zur Behandlung strahlungsbedingter Enteritis.

8. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach Anspruch 4 für die Prophylaxe von strahlungsbedingter Enteritis.

9. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche, worin X2 des GLP-2-Analogs eine Ala-Substitutions-Aminosäure ist, die dem Analog Beständigkeit gegenüber dem DPP-IV-Enzym vermittelt.

10. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche, worin mindestens eines von X1, X3, X4, X10, X20, P1, P2, P3, Y1, Y2, R1 und R2 kein Wildtyp GLP-2-Rest eines Säugers ist.

11. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche, worin X2 ausgewählt ist aus D-hPr, D-Pro, D-Ala, Val, Lys und Ile.

12. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche 1 bis 11, worin X2 Gly ist.

13. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche, worin X10 eine oxidativ stabile Met-Substitutions-Aminosäure ist.

14. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche, worin X20 His oder Lys ist.

15. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche, worin X1 His ist.

16. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche, worin X3 Asp ist.

17. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche, worin X4 Gly ist.

18. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche, worin P1 Glu-X10-Asn-Thr-Ile ist.

19. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche, worin P2 Ile-Asn ist.

20. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche, worin P3 Ile-Thr-Asp ist.

21. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche, worin m Null ist.

22. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche, worin n Null ist.

23. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche, worin R1 H ist.

24. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche, worin R2 OH ist.

25. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche 1 bis 8, worin das GLP-2-Analog ein Human-GLP-2-Analog ist, worin mindestens eines von X1, X2, X3, X4, P1, X10, X20, P2 und P3 kein Wildtyp GLP-2-Rest eines Säugers ist.

26. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche 1 bis 8, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

[Tyr1]rGLP-2; [Ala4]rGLP-2; Ac-ratGLP-2(1-33); ratGLP- 2(1-30); ratGLP-2(1-25); ratGLP-2(1-33)amide; [desNH2Tyr1]hGLP-2(1-33); und [Val23Gln24]hGLP-2.

27. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche 1 bis 8, worin das Analog ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

[Prc3]hGLP-2; [HPr3]hGLP-2; [Glu3Thr19]hGLP-2; und [Thr19Lys20]hGLP-2.

28. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche 1 bis 8, worin das Analog [Gly-2]hGLP-2 ist.

29. Verwendung eines intestinotrophen Analogs eines Human-GLP-2-Peptids, worin das Analog mindestens eine Aminosäure-Substitution aufweist, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

a) Einbau bei Ala2 (X2) und/oder Asp3 (X3) einer Substitutions-Aminosäure, die das Analog gegenüber Spaltung durch DPP-IV-Enzym beständig macht;

b) Einbau einer Substitutions-Aminosäure an der Stelle Met10 (X10), die oxidativ stabil ist; und

c) Einbau einer Substitutions-Aminosäure, die nicht Arg ist, an der Stelle Arg20 (X20) in der Herstellung eines pharmazeutischen Mittels für die Förderung des Wachstums und/oder der Funktion von gastrointestinalem Gewebe.

30. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach Anspruch 29 zur Förderung des Wachstums und/oder der Funktion von Dünndarmgewebe.

31. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach Anspruch 29 oder 30 für die Prophylaxe oder Behandlung einer gastrointestinalen Erkrankung, Krankheit oder Störung.

32. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach Anspruch 31, worin die gastrointestinale Erkrankung ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Ulcera, Verdauungsstörungen, Malabsorptionssyndrome, Kurzdarm-Syndrom ("short-gut syndrome"), Cul-de-Sac- Syndrom, entzündliche Darmerkrankung, einheimische Sprue, tropische Sprue, hypogammaglobulinämische Sprue, strahlungsbedingte Enteritis, infektiöse oder postinfektiöse Enteritis, Enteritis regionalis (Morbus Crohn), Dünndarmschädigung in Folge toxischer oder anderer chemotherapeutischer Mittel sowie Kurzdarm-Syndrom ("short bowel syndrome").

33. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach Anspruch 32 zur Behandlung von Dünndarmschädigung durch ein chemotherapeutisches Mittel.

34. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach Anspruch 32 für die Prophylaxe einer Dünndarmschädigung in Folge eines chemotherapeutischen Mittels.

35. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach Anspruch. 32 für die Behandlung strahlungsbedingter Enteritis.

36. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach Anspruch 32 für die Prophylaxe strahlungsbedingter Enteritis.

37. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche 29 bis 36, worin das Analog ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

[D-Ala2Thr19]hGLP-2; [Gly2Thr19]hGLP-2; [AlalGly2]hGLP-2; [GlyZAla3]hGLP-2; [Gly2Ala4]hGLP-2; [Gly2Ala5]hGLP-2; [Gly2Ala6]hGLP-2; [Gly2Ala7]hGLP-2; [Gly2Ala8]hGLP-2; [Gly2Ala9]hGLP-2; [Gly2Ala10]hGLP-2; [Gly2Ala11]hGLP-2; [Gly2Ala12]hGLP- 2; [Gly2Ala13]hGLP-2; [Gly2A1a16]hGLP-2; [Gly2Ala17]hGLP- 2; [Val2Thr19]hGLP-2; [Gly2Ala20]hGLP-2; [Gly2AIa21]hGLP- 2; [Gly2Ala24]hGLP-2; [Gly2Ala27]hGLP-2; [Gly2Ala28]hGLP-2; und [Gly2Ala31]hGLP-2.

38. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche 29 bis 36, worin das Analog ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus:

[Ser10]hGLP-2(1-33); [Nle10]hGLP-2(1- 33); [Ala10]hGLP-2(1-33); [Leu10]rGLP-2(1-33), [Nle10]ratGLP-2)1-33); [Gly2Ala10]hGLP-2(1-33); und [Met(O)10]ratGLP-2(1-33) und [Tyr9Ser10LysTyr12 (desIle13)]hGLP-2(1-33).

39. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach einem der vorgenannten Ansprüche 29 bis 36, worin das Analog ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus: [Gly2, Ala25]hGLP-2(1-33); [Gly2, Ala26]hGLP-2(1-33); [Ser2, Gln3]hGLP-2(1-33); [Gly2, Ala14]hGLP-2(1-33); [Gly2, Ala23]hGLP-2(1-33); [Gly2, Ala30]hGLP-2(1-33); [Tyr1, Gly2]hGLP-2(1-33); [Gly2, Arg34]hGLP-2(1-34); [Gly2, Tyr34]hGLP-2(1-34); [tBuGly2]hGLP-2; [Asp2]hGLP-2(1-33); [Glu2]hGLP-2(1-33); [Phe2]hGLP-2(1-33); [His2]hGLP-2(1-33); [Ile2]hGLP-2(1- 33); [Lys2]hGLP-2(1-33); [Met2]hGLP-2(1-33); [Asn2]hGLP- 2(1-33); [Pro2]hGLP-2(1-33); [Gln2]hGLP-2(1-33); [Ser2]hGLP-2(1-33); [Thr2]hGLP-2(1-33); [Val2]hGLP-2(1- 33); [Tyr2]hGLP-2(1-33); [D-Ala2]hGLP-2(1-33); [Pen2]hGLP-2(1-33); [bAla2]hGLP-2(1-33); [aAbu2]hGLP-2(1- 33); [Nva12]hGLP-2(1-33); [PhGly2]hGLP-2(1-33); und [Aib2]hGLP-2(1-33).

40. Verwendung eines GLP-2-Analogs, gekennzeichnet durch intestinotrophe Aktivität und aufweisend eine Aminosäure-Substitution an mindestens einer der Stellen X1, X5, X7, X16, X17, X18, X30 und X33 bei der Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Förderung des Wachstums und/oder der Funktion von gastrointestinalem Gewebe.

41. Verwendung eines GLP-2-Analogs nach Anspruch 40, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

[Thr5]hGLP-2(1-33); [Ser16, Arg17, Arg18]hGLP-2(1-33); [Arg30]hGLP-2(1-33); [Ala5, Ala7]hGLP-2(1-33); [Glu33]hGLP-2(1-33); [Phe25]hGLP-2(1-33); und [Tyr25]hGLP-2(1-33).

42. Verwendung eines GLP-2-Analogs, gekennzeichnet durch intestinotrophe Aktivität und aufweisend eine Deletion von 3 bis 8 Resten vom c-Terminus in der Herstellung eines pharmazeutischen Mittels für die Förderung des Wachstums und/oder der Funktion von gastrointestinalem Gewebe.

43. Verwendung eines GLP-2-Analogs, gekennzeichnet durch intestinotrophe Aktivität und ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus:

[Arg-2, Arg-1]ratGLP-2(2-33); [Pro1]hGLP-2(1-33); [Gln20]hGLP-2(1-33); [Asp1]hGLP-2(1-33); [Tyr34]hGLP-2(1- 34); [Agm34]hGLP-2(1-34); und [Asn33]hGLP-2(1-33)

und in der Herstellung eines pharmazeutischen Mittels zur Forderung des Wachstums und/oder der Funktion von gastrointestinalem Gewebe.

44. Verfahren zum Identifizieren intestinotropher Analoga von GLP-2, umfassend die Schritte:

a) Erhalten eines GLP-2-Analogs nach Anspruch 1;

b) Behandeln eines Säugers mit diesem Analog unter Anwendung eines Therapieplans, der bei Einsatz für rat-GLP-2 (Ratten-GLP-2) eine intestinotrophe Wirkung auslösen kann; und

c) Ermitteln der Wirkung des Analogs auf das Dünndarmgewicht relativ zu einem scheinbehandelten Kontroll-Säuger, wodurch dieses intestinotrophe Analog von GLP-2 als ein Analog identifiziert wird, das eine Zunahme an diesem Gewicht auslöst.