DE60012721T2

DE60012721T2 - Analoge des magensaft inhibierenden peptides und ihre verwendung für die behandlung von diabetes

Info

Publication number: DE60012721T2
Application number: DE60012721T
Authority: DE
Inventors: Finbarr Paul Mary Ballymoney O'HARTE; Peter Raymond Portrush FLATT
Original assignee: UUTech Ltd
Current assignee: UUTech Ltd
Priority date: 1999-03-29
Filing date: 2000-03-29
Publication date: 2005-09-15
Anticipated expiration: 2020-03-30
Also published as: MXPA01009805A; DE60012721D1; ATE272650T1; AU3441400A; DE60012721T4; US7666838B2; US20050277590A1; US20080161244A1; US7326688B2; CA2367856A1; EP1171465B1; EP1171465A2; WO2000058360A3; US6921748B1; US20100267628A1; WO2000058360A2; CA2367856C; ES2225107T3; PT1171465E; DK1171465T3

Description

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf die Freisetzung von Insulin und die Kontrolle der Blutglucosekonzentration. Genauer bezieht sich die Erfindung auf die Verwendung von Peptiden zur Stimulierung der Freisetzung von Insulin, das Senken der Blutglucose und pharmazeutische Präparate zur Behandlung von Typ-2-Diabetes.
Das gastrische inhibitorische Polypeptid (GIP) und das Glukagon ähnliche Peptid-1 (7–36) Amid (gekürztes GLP-1; tGLP-1) sind zwei wichtige Insulin freisetzende Hormone, die als Reaktion auf Nahrungsaufnahme aus endokrinen Zellen in dem Darmtrakt sekretiert werden. Zusammen mit autonomen Nerven spielen sie eine lebenswichtige, unterstützende Rolle für die Pankreasinseln bei der Kontrolle von Glucosehomöostase und Nahrungsstoffwechsel.
Dipeptidyl-Peptidase IV (DPP IV; EC 3.4.14.5) ist als Schlüsselenzym, das für die Inaktivierung von GIP und tGLP-1 in Serum verantwortlich ist, identifiziert worden. DDP IV wird in Serum durch die Zugabe von Diprotin A (DPA, 0,1 mmol/l) vollständig inhibiert. Dies geschieht durch die schnelle Entfernung der N-terminalen Dipeptide Tyr¹-Ala² und His⁷-Ala⁸, was zu den Hauptmetaboliten GIP (3–42) bzw. GLP-1 (9-36)-Amid führt. Diesen gekürzten Peptiden soll es an biologischer Aktivität fehlen oder sie sollen gar als Antagonisten bei GIP- oder tGLP-1-Rezeptoren dienen. Die anfallenden biologischen Halbwertzeiten dieser Inkretin-Hormone in vivo sind daher sehr kurz und werden auf nicht länger als 5 Min. geschätzt.
Bei Umständen normaler Glucoseregulierung und B-Zellenempfindlichkeit der Bauchspeicheldrüse ist diese kurze Zeitdauer der Aktivität vorteilhaft bei der Erleichterung momentaner Einstellungen der homöostatischen Kontrolle. Das gegenwärtige Ziel einer eventuellen therapeutischen Rolle von Inkretin-Hormonen, insbesondere tGLP-1 in der NIDDM-Therapie wird jedoch zusätzlich zur Suche nach einem angemessenen Verabreichungsweg durch eine Anzahl von Faktoren vereitelt. Am beachtenswertesten sind von diesen der schnelle Peptidabbau und die schnelle Absorption (Spitzenkonzentrationen erreichen 20 Min.) und der resultierende Bedarf an sowohl hoher Dosierung als auch präziser Zeitplanung von Mahlzeiten. Neuste therapeutische Strategien haben sich auf präzipizierte Präparate konzentriert, um die Peptidabsorption und Inhibierung von GLP-1-Abbau unter Verwendung von spezifischen Inhibitoren von DPP IV zu verzögern. Eine mögliche therapeutische Rolle wird auch durch die Beobachtung vorgeschlagen, dass ein spezifischer Inhibitor von DPP IV, Isoleucinthiazolidid, den Blutzucker senke und die Insulinsekretion in mit Glucose behandelten, diabetischen fettleibigen Zuckerratten, vermutlich durch das Schützen vor Katabolismus der Inkretin-Horomone tGLP-1 und GIP, verbessere, siehe auch die Patentanmeldung DE 196 16 486 .
Viele Studien haben gezeigt, dass die tGLP-1-Infusion die B-Zellenempfindlichkeit der Bauchspeicheldrüse, Insultinsekretionoszillationen wiederherstellt und die Blutzuckerkontrolle in verschiedenen Patientengruppen mit IGT oder NIDDM verbesserte. Längerfristige Studien zeigen auch bedeutende Vorteile von tGLP-1-Injektionen in der NIDDM- und möglicherweise IDDM-Therapie, wodurch ein wichtiger Anreiz zur Entwicklung eines oral wirksamen oder langwirkenden tGLP-1-Analogs bereitgestellt wird. Es sind bereits mehrere Anläufe unternommen worden, um strukturell modifizierte Analoge von tGLP-1 zu produzieren, die gegenüber DPP-IV-Abbau widerstandsfähig sind. Eine bedeutende Verlängerung der Serum-Halbwertzeit wird bei His⁷-Glucitol-tGLP-1 und tGLP-1-Analogen, die bei Position 8 durch Gly, Aib, Ser oder Thr substituiert sind, beobachtet.
Diese strukturellen Modifikationen scheinen jedoch die Rezeptor bindende und insulinotrope Aktivität zu beeinträchtigen, wodurch ein Teil der Vorteile des Schutzes gegenüber proteolytischem Abbau gefährdet werden. In neusten Studien unter Verwendung von His⁷-Glucitol tGLP-1 wurde die Widerstandsfähigkeit gegenüber DPP IV und Serumabbau von starkem Verlust von Insulin freisetzender Aktivität begleitet.
GIP und tGLP-1 teilen nicht nur denselben Abbauweg sondern auch viele ähnliche physiologische Aktivitäten, einschließlich die Stimulierung von Insulin und die Somatostatin-Sekretion und die Verbesserung von Glucoseabgabe. Diese Aktivitäten werden als Hauptaspekte der Antihyperglykämieeigenschaften von tGLP-1 angesehen, und daher wird erwartet, dass GIP ähnliches Potential aufweist wie NIDDM-Therapie. Der Ausgleich durch GIP wird tatsächlich gehalten, um die kleinen Störungen von Glucosehomöostase, die in tGLP-1-Knockout-Mäusen beobachtet wurden, zu erläutern. Abgesehen von frühen Studien, ist das antidiabetische Potential von GIP bisher nicht erforscht worden, und tGLP-1 mag attraktiver erscheinen, da es von einigen als stärkeres Insulin-Sekretagogum angesehen wird, wenn es zu „sogenannten" physiologischen Konzentrationen, die durch RIA bewertet werden, infundiert wird.
Die vorliegende Erfindung hat zum Ziel, effektive Analoge von GIP bereitzustellen. Es ist ein Ziel der Erfindung, ein Arzneimittel zur Behandlung von Typ-2-Diabetes bereitzustellen.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist ein wirksames Peptidanalog des biologisch aktiven GIP (1–42), das verbesserte Charakteristiken zur Behandlung von Typ-2-Diabetes aufweist, bereitgestellt, wobei das Analog mindestens 15 Aminosäurereste von dem N-Terminus von GIP (1–42) und mindestens eine Aminosäuresubstitution oder -modifikation bei Position 1–3 aufweist und kein Tyr¹-Glucitol GIP (1–42) umfasst, beinhaltet.
Die Strukturen von humanem und porcinem GIP (1–42) sind nachstehend gezeigt. Das porcine Peptid weicht um lediglich zwei Aminosäuresubstitutionen bei Positionen 18 und 34 ab.
Das Analog kann Modifikation durch die Zugabe von Fettsäure bei einer Epsilon-Aminogruppe von mindestens einem Lysinrest umfassen.
Die Erfindung umfasst Tyr¹-Glucitol GIP (1–42), das eine Zugabe von Fettsäure bei einer Epsilon-Aminogruppe von mindestens einem Lysinrest aufweist.
Fig. 1 Primäre Struktur des humanen gastrischen inhibitorischen Polypeptids (GIP)
Fig. 2 Primäre Struktur des procinen gastrischen inhibitorischen Polypeptids (GIP)
Analoge von GIP (1–42) können eine verbesserte Kapazität zur Stimulation der Insulinsekretion, der Verbesserung des Glucoseabbaus, der Verzögerung der Glucoseabsorption aufweisen oder können im Vergleich zu nativem GIP verbesserte Stabilität in Plasma aufzeigen. Sie können auch eine verbesserte Widerstandsfähigkeit gegenüber Abbau aufweisen.
Jede dieser Eigenschaften verbessert die Kraft des Analogs als therapeutisches Agens.
Analoge, die D-Aminosäure-Substitutionen in der 1., 2. und 3. Position und/oder N-glycierte, N-alkylierte, N-acetylierte oder N-acylierte Aminosäuren in der 1. Position aufweisen, sind in vivo gegenüber Abbau widerstandsfähig.
Verschiedene Aminosäuresubstitutionen an den zweiten und dritten Aminoendresten sind eingeschlossen, wie etwa GIP (1–42) Gly2, GIP (1–42) Ser2, GIP (1–42) Abu2, GIP (1–42) Aib, GIP(1–42) D-Ala2, GIP (1–42) Sar2, und GIP (1–42) Pro3.
Aminoterminal modifizierte GIP-Analoge umfassen N-glyciertes GIP (1–42), N-alkyliertes GIP (1–42), N-acyliertes GIP (1–42), N-Acetyl GIP (1–42) und N-Isopropyl GIP (1–42).
Weitere stabilisierte Analoge umfassen jene mit einer Peptidisosterbindung zwischen den Aminoendresten bei Positionen 2 und 3. Diese Analoge können gegenüber der Plasmaenzym-Dipeptyl-Peptidase IV (DDP IV), die hauptsächlich für die Inaktivierung von GIP durch das Entfernen des aminoterminalen Dipeptids Tyr1-Ala2 verantwortlich ist, widerstandsfähig sein.
In bestimmten Ausführungsformen stellt die Erfindung ein Peptid bereit, das stärker ist als humanes oder porcines GIP beim Mäßigen von Blutzuckerexkursionen, wobei das Peptid aus GIP (1–42) oder N-terminalen Fragmenten von GIP (1–42) besteht, das aus bis zu 15 bis 30 Aminosäureresten aus dem N-Terminus (d. h. GIP (1–15)-GIP (1–3)) besteht, wobei eine oder mehrere Modifikationen aus der Gruppe ausgewählt sind, die aus Folgendem besteht:

(a) Substitution von Ala² durch Gly
(b) Substitution von Ala² durch Ser
(c) Substitution von Ala² durch Abu
(d) Substitution von Ala² durch Aib
(e) Substitution von Ala² durch D-Ala
(f) Substitution von Ala² durch Sar
(g) Substitution von Glu³ durch Pro
(h) Modifikation von Tyr¹ durch Acetylierung
(i) Modifikation von Tyr¹ durch Acylierung
(j) Modifikation von Tyr¹ durch Alkylierung
(k) Modifikation von Tyr¹ durch Glycierung
(l) Umwandlung der Ala²-Glu³-Bindung in eine psi [CH2NH]-Bindung
(m) Umwandlung der Ala2-Glu3-Bindung in eine stabile Peptidisoter-Bindung
(n) (n-Isopropyl-H) 1GIP.

Die Erfindung stellt auch die Verwendung von Tyr¹-Glucitol GIP in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Diabetes bereit.
Die Erfindung stellt ferner verbesserte pharmazeutische Zusammensetzungen, einschließlich Analoge von GIP mit verbesserten pharmakologischen Eigenschaften, bereit.
Weitere mögliche Analoge umfassen gewisse üblich anzutreffende Aminosäuren, die nicht durch den genetischen Code kodiert sind, zum Beispiel Beta-Alanin (beta-Ala) oder andere Omega-Aminosäuren, wie etwa 3-Amino-Propion, 4-Aminobuttersäure und so weiter, Ornithin (Orn), Citrullin (Cit), Homoarginin (Har), t-Butyl-Alanin (t-BuA), t-Butyl-Glycin (t-BuG), N-Methylisoleucin (N-Melle), Phenylglycin (Phg) und Cyclohexylalanin (Cha), Norleucin (Nle), Cysteinsäure (Cya) und Methionin-Sulfoxid (MSO), Substitution der D-Form einer neutralen oder sauren Aminosäure oder der D-Form von Tyrosin um Tyrosin.
Gemäß der vorliegenden Erfindung ist auch eine pharmazeutische Zusammensetzung bereitgestellt, die zur Behandlung von Typ-II-Diabetes nützlich ist, die eine wirksame Menge des hierin beschriebenen Peptids unter Beimischung eines pharmazeutisch akzeptablen Trägers beinhaltet.
Die Erfindung stellt auch ein Verfahren zum N-terminalen Modifizieren von GIP oder Analogen davon bereit, wobei das Verfahren die Schritte des Synthetisierens des Peptids von der C-terminalen zu der vorletzten N-terminalen Aminosäure, des Zugebens von Tyrosin zu einem Rührersystem als Fmoc-geschützes Tyr(tBu)-Wang-Harz, des Entschützens des N-Terminus des Tyrosins und Eingehens einer Reaktion mit dem modifizierenden Agens, des Zulassens, dass die Reaktion zum Ende gelangt, des Spaltens des modifizierten Tyrosins von dem Wang-Harz und des Zugebens des modifizierten Tyrosins zu der Peptidsynthesereaktion beinhaltet.
Vorzugsweise ist das Agens Glucose, Essigsäureanhydrid oder Proglutaminsäure.
Die Erfindung wird unter Bezugnahme auf das nachstehende, nicht einschränkende Beispiel und die begleitenden Zeichnungen darstellt, wobei:
1a den Abbau von GIP durch DPP IV veranschaulicht;
1b den Abbau von GIP und Tyr¹-Glucitol GIP durch DPP IV veranschaulicht;
2a den Abbau von GIP durch humanes Plasma veranschaulicht;
2b den Abbau von GIP und Tyr¹-Glucitol GIP durch humanes Plasma veranschaulicht;
3 Elektrospray-Ionisierungs-Massenspektrometrie von GIP, Tyr¹-Glucitol GIP und dem Haupt-Abbaufragment GIP (3–42) veranschaulicht;
4 die Auswirkungen von GIP und glyciertem GIP auf Plasma-Glucosehomöostase zeigt;
5 die Auswirkungen von GIP auf Plasma-Insulinreaktionen zeigt;
6 den DDP-IV-Abbau von GIP 1–42 veranschaulicht;
7 den DDP-IV-Abbau von GIP (Abu²) veranschaulicht;
8 den DDP-IV-Abbau von GIP (Sar²) veranschaulicht;
9 den DDP-IV-Abbau von GIP (Ser²) veranschaulicht;
10 den DDP-IV-Abbau von N-Acetyl-GIP veranschaulicht;
11 den DDP-IV-Abbau von glyciertem GIP veranschaulicht;
12 den Abbau von humanem Plasma von GIP veranschaulicht;
13 den Abbau von humanem Plasma von GIP (Abu²) veranschaulicht;
14 den Abbau von humanem Plasma von GIP (Sar²) veranschaulicht;
15 den Abbau von humanem Plasma von GIP (Ser²) veranschaulicht;
16 den Abbau von humanem Plasma von glyciertem GIP veranschaulicht;
17 die Auswirkungen verschiedener Konzentrationen von GIP 1–42 und GIP (Abu²) auf die Insulinfreisetzung aus bei 5,6 mM Glucose inkubierten BRIN-BD11-Zellen zeigt;
18 die Auswirkungen verschiedener Konzentrationen von GIP 1–42 und GIP (Abu²) auf die Insulinfreisetzung aus bei 16,7 mM Glucose inkubierten BRIN-BD11-Zellen zeigt;
19 die Auswirkungen verschiedener Konzentrationen von GIP 1–42 und GIP (Sar²) auf die Insulinfreisetzung aus bei 5,6 mM Glucose inkubierten BRIN-BD11-Zellen zeigt;
20 die Auswirkungen verschiedener Konzentrationen von GIP 1–42 und GIP (Sar²) auf die Insulinfreisetzung aus bei 16,7 mM Glucose inkubierten BRIN-BD11-Zellen zeigt;
21 die Auswirkungen verschiedener Konzentrationen von GIP 1–42 und GIP (Ser²) auf die Insulinfreisetzung aus bei 5,6 mM Glucose inkubierten BRIN-BD11-Zellen zeigt;
22 die Auswirkungen verschiedener Konzentrationen von GIP 1–42 und GIP (Ser²) auf die Insulinfreisetzung aus bei 16,7 mM Glucose inkubierten BRIN-BD11-Zellen zeigt;
23 die Auswirkungen verschiedener Konzentrationen von GIP 1–42 und N-Acetyl-GIP 1–42 auf die Insulinfreisetzung aus bei 5,6 mM Glucose inkubierten BRIN-BD11-Zellen zeigt;
24 die Auswirkungen verschiedener Konzentrationen von GIP 1–42 und N-Acetyl-GIP 1–42 auf die Insulinfreisetzung aus bei 16,7 mM Glucose inkubierten BRIN-BD11-Zellen zeigt;
25 die Auswirkungen verschiedener Konzentrationen von GIP 1–42 und glyciertem GIP 1–42 auf die Insulinfreisetzung aus bei 5,6 mM Glucose inkubierten BRIN-BD11-Zellen zeigt;
26 die Auswirkungen verschiedener Konzentrationen von GIP 1–42 und glyciertem GIP 1–42 auf die Insulinfreisetzung aus bei 16,7 mM Glucose inkubierten BRIN-BD11-Zellen zeigt;
27 die Auswirkungen verschiedener Konzentrationen von GIP 1–42 und GIP (Gly²) auf die Insulinfreisetzung aus bei 5,6 mM Glucose inkubierten BRIN-BD11-Zellen zeigt;
28 die Auswirkungen verschiedener Konzentrationen von GIP 1–42 und GIP (Gly²) auf die Insulinfreisetzung aus bei 16,7 mM Glucose inkubierten BRIN-BD11-Zellen zeigt;
29 die Auswirkungen verschiedener Konzentrationen von GIP 1–42 und GIP (Pro³) auf die Insulinfreisetzung aus bei 5,6 mM Glucose inkubierten BRIN-BD11-Zellen zeigt;
30 die Auswirkungen verschiedener Konzentrationen von GIP 1–42 und GIP (Pro³) auf die Insulinfreisetzung aus bei 16,7 mM Glucose inkubierten BRIN-BD11-Zellen zeigt.
Beispiel 1
Herstellung von N-terminal modifiziertem GIP und Analogen davon.
Die N-terminale Modifikation von GIP ist im Wesentlichen ein dreistufiger Prozess. Erstens wird GIP von seiner C-terminalen (beginnend bei einem Fmoc-Gln (Trt)-Wang-Harz, Novabiochem) bis zu seiner vorletzten N-terminalen Aminosäure (Ala2) auf einem automatisierten Peptidsynthesizer (Applied Biosystems, CA, USA) synthetisiert. Die Synthese erfolgt nach Standard-Fmoc-Peptid-Chemieprotokollen. Zweitens wird die N-terminale Aminosäure nativen GIPs (Tyr) einem manuellen Rührersystem als ein Fmoc geschütztes Tyr (tBu)-Wang-Harz zugegeben. Diese Aminosäure wird an ihrem N-Terminus (Piperidin in DMF (20 % v/v)) entschützt und mit einer hohen Konzentration an Glucose (Glycierung unter reduzierenden Bedingungen mit Natrium-Cynoborhydrid), Essigsäureanhydrid (Acetylierung), Pyroglutaminsäure (Pyroglutamin) usw. bis zu 24 h nach Bedarf eine Reaktion eingehen gelassen, dass die Reaktion zum Ende gelangt. Die Vollständigkeit der Reaktion wird unter Verwendung des Ninhydrin-Tests überwacht, der die Anwesenheit verfügbarer freier a-Aminogruppen bestimmt. Drittens wird (nachdem die Reaktion abgeschlossen ist) das nun strukturell modifizierte Tyr von dem Wang-Harz gespalten (95 % TFA und 5 % der angemessenen Radikalfänger gespalten. N. B. Tyr wird als eine problematische Aminosäure betrachtet und könnte spezielle Berücksichtigung erfordern) und die erforderliche Menge an N-terminal modifiziertem Tyr demzufolge direkt dem automatisierten Peptid-Synthesizer zugegeben, der die Synthese weiterführen wird, wodurch das N-terminal modifizierte Tyr auf das a-Amino von GIP (Ala2) geheftet wird und somit die Synthese des GIP-Analogs vervollständigt wird. Dieses Peptid wird von dem Wang-Harz (wie oben) gespalten und dann unter Verwendung des Standard-Büchnertrichters, Präzipitation, Rotationsverdampfung und Trocknungstechniken verarbeitet.
Beispiel 2
Das nachstehende Beispiel untersucht die Herstellung von Tyr¹-Glycitol-GIP zusammen mit der Evaluierung seiner antihyperglykämischen und Insulin freisetzenden Eigenschaften in vivo. Die Ergebnisse zeigen eindeutig, dass dieses neuartige GIP-Analog im Vergleich zu dem nativen GIP einen wesentlichen Widerstand gegenüber Aminopeptidasenabbau und erhöhter Glucose senkenden Aktivität aufzeigt.
Versuchsdesign und Verfahren
Materialien. Humanes GIP wurde von der American Peptide Company (Sunnyvale, CA, USA) gekauft. HPLC Grad Acetonitril wurde von Rathburn (Waikersburn, Schottland) erhalten. Sequenzierung Grad Trifluoressigsäure (TFA) wurde von Aldrich (Poole, Dorset, Vereinigtes Königreich) erhalten. Alle anderen gekauften Chemikalien, einschließlich Dextran T-70, Aktivkohle, Natrium-Cyanoborhydrid und Rinderserumalbumin-Fraktion V waren von Sigma (Poole, Dorset, Vereinigtes Königreich). Diprotin A (DPA) wurde von Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd. (Beeston, Nottingham, Vereinigtes Königreich) gekauft und Ratteninsulin-Standard für RIA wurde von Novo Industria (Kopenhagen, Dänemark) erhalten. Umkehrphasen Sep-Pak-Kartuschen (C-18) wurden von Millipore-Waters (Milford, MA, USA) gekauft. Alles in diesen Experimenten verwendete Wasser wurde unter Verwendung eines Milli-Q Wasserreinigungssystems (Millipore Corporation, Milford, MA, USA) gereinigt.
Aufbereitung von Tyr¹-Glucitol GIP. Humanes GIP wurde mit Glucose unter reduzierenden Bedingungen in 10 mmol/l Natriumphosphat-Puffer bei einem pH-Wert von 7,4 24 h lang inkubiert. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 0,5 mol/l Essigsäure (30 μl) gestoppt und die Mischung auf eine Vydac (C-18) (4,6 × 250 mm) analytische HPLC-Säule angewandt (The Separations Group, Hesperia, CA, USA) und die Gradienten-Elutionsbedingungen wurden unter Verwendung von wässrigen/TFA- und Acetonitril-/TFA-Lösungen bewiesen. Den glycierten Höhepunkten entsprechende Fraktionen wurden gepoolt, unter Vakuum getrocknet, indem ein AES 1000 Speed Vac Konzentrator (Life Sciences International, Runcorn, Vereinigtes Königreich) verwendet wurde, und auf einer Supelcosil-(C-8) (4,6 × 150 mm) Säule (Supelco Inc., Poole, Dorste, Vereinigtes Königreich) zur Homogenität gereinigt.
Abbau von GIP und Tyr¹-Glucitol GIP durch DPP IV. HPLC gereinigtes GIP oder Tyr¹-Glucitol GIP wurden bei 37 °C mit DPP-IV (5 mU) verschiedene Zeitlängen lang in einem Reaktionsgemisch, das bis zu 500 μl mit 50 mmol/l Triethanolamin-HCl, pH-Wert 7,8 (endgültige Peptidkonzentration 1 umol/l) zusammengesetzt ist, inkubiert. Enzymatische Reaktionen wurden nach 0, 2, 4 und 12 Stunden durch die Zugabe von 5 μl 10 % (v/v) TFA/Wasser beendet. Es wurden Proben zu einem endgültigen Volumen von 1,0 ml mit 0,12 % (v/v) TFA erstellt und vor der HPLC-Analyse bei –20 °C gelagert.
Abbau von GIP und Tyr¹-Glucitol GIP durch humanes Plasma. Gepooltes humanes Plasma (20 μl), das sechs gesunden Menschen entnommen wurde, wurde bei 37 °C mit GIP oder Tyr¹-Glucitol GIP (10 μg) für 0 und 4 Stunden in einem zu 500 μl zusammengesetzten Reaktionsgemisch, das 50 mmol/l Triethanolamin/HCL-Puffer pH-Wert 7,8 enthält, inkubiert. Es wurden in Anwesenheit von Diprotin A (5 mU) auch Inkubationen 4 Stunden lang durchgeführt. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von 5 μl TFA beendet und das endgültige Volumen auf 1,0 ml unter Verwendung von 0,1 % v/v TFA/Wasser eingestellt. Die Proben wurden zentrifugiert (13 000 g, 5 Min.) und die überstehende Flüssigkeit auf eine C-18 Sep-Pak-Kartusche (Millipore-Waters) angewandt, die vorher vorbereitet und mit 0,1 % (v/v) TFA/Wasser gewaschen wurde. Nach dem Waschen mit 20 ml 0,12 % TFA/Wasser, wurde gebundenes Material durch Elution mit 2 ml 80 % (v/v) Acetonitril/Wasser freigesetzt und unter Verwendung eines Speed-Vac Konzentratoos (Runcorn, Vereinigtes Königreich) konzentriert. Das Volumen wurde auf 1,0 ml mit 0,12 % (v/v) TFA/Wasser vor der HPLC-Reinigung eingestellt.
HPLC-Analyse abgebauten GIPs und Tyr¹-Glucitol GIPs. Die Proben wurden auf eine Vydac C-18 weitporigen Säule, die mit 0,12 % (v/v) TFA/H₂0 bei einer Durchflussmenge von 1,0 ml/Min ausgeglichen wurde, angewandt. Unter Verwendung von 0,1 % (v/v) TFA in 70 % Acetonitril/H₂0, wurde die Konzentration von Acetonitril in dem eluierten Lösungsmittel von 0 % auf 31,5 % über 15 Min., auf 38,5 % über 30 Min. und von 38,5 % auf 70 % über 5 Min. unter Verwendung von linearen Gradienten erhöht. Das Absorptionsvermögen wurden bei 206 nm überwacht und die Spitzenbereiche unter Verwendung eines Model 2221 LKB-Integrators evaluiert. Manuell eingeholte Proben wurden unter Verwendung eines Speed-Vac Konzentrators konzentriert.
Elektrospray-Ionisierungs-Massenspektrometrie (ESI-MS). Proben für die ESI-MS-Analysen, die intakte und Abbaufragmente von GIP (aus DPP-IV- und Plasmainkubationen) sowie Tyr¹-Glucitol GIP enthielten, wurden durch HPLC weiter gereinigt. Peptide wurden in 100 μl Wasser aufgelöst (ungefähr 400 pmol) und auf den LCQ-Benchtop-Massenspektrometer (Finnigan MAT, Hemel Hempstead, Vereinigtes Königreich), der mit einer Mikrobohrwerkzeug C-18 HPLC-Säule (150 × 2,0 mm, Phenomenex, Vereinigtes Königreich, Ltd, Macclesfield) ausgestattet ist, angewandt. Proben (30 μl Direktschleifeninjektion) wurden bei einer Durchflussmenge von 0,2 ml/Min. unter isokratischen Bedingungen 35 % (v/v) Acetonitil/Wasser injiziert. Massenspektren wurden aus dem Quadrupol-Ionenfallenmassenanalysegerät erhalten und aufgezeichnet. Spektren wurden unter Verwendung des gesamten Ionenabtastmodus über den Masse-zu-Ladung-Bereich (m/z-Bereich) 150–2000 gesammelt. Die Molekularmasse von GIP und die verwandten Strukturen wurden aus den ESI-MS-Profilen unter Verwendung von prominenten multiplen aufgeladenen Ionen und der nachstehenden Gleichung M_r = iM_i–iM_h (wobei M_r = Molekularmasse; M_i = m/z-Verhältnis; i = Anzahl Aufladungen; M_h = Masse eines Protons) bestimmt.
In vivo biologische Aktivität von GIP und Tyr¹-Glucitol GIP. Die Auswirkungen von GIP und Tyr¹-Glucitol GIP auf Plasmaglucose und Insulinkonzentrationen wurden unter Verwendung von 10–12 Wochen alten männlichen Wistar-Ratten untersucht. Die Tiere wurden einzeln in einem klimatisierten Raum und 22 ± 2 °C bei einem 12 Stunden Licht/12 Stunden Dunkel Zyklus gehalten. Trinkwasser und eine Standard-Nagetierhaltungskost (Trouw Nutrition, Belfast) wurden ad libitum bereitgestellt. Die Nahrung wurde 18 Stunden lang vor der intraperitonealen Injektion von nur Glucose (18 mmol/kg Körpergewicht) oder in Kombination mit entweder GIP oder Tyr¹-Glucitol GIP (10 nmol/kg) entzogen. Prüflösungen wurden in einem endgültigen Volumen von 8 ml/kg Körpergewicht verabreicht. Blutproben wurden bei 0, 15, 30 und 60 Minuten von der abgetrennten Schwanzspitze von bei Bewusstsein befindlichen Ratten in gekühlten Fluorid/Heparin-Mikrozentrifugenröhrchen (Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland) gesammelt. Proben wurden unter Verwendung einer Beckman-Mikrozentrifuge ungefähr 30 Sekunden lang bei 13 000 g zentrifugiert. Plasmaproben wurden aliquotiert und bei –20 °C vor den Glucose- und Insulinermittlungen gelagert. Alle Tierstudien wurden in Übereinstimmung mit dem Animals (Scientific Procedures) Act 1986 durchgeführt.
Analysen.
Plasmaglucose wurde mittels einer automatisierten Glucose-Oxidase-Prozedur unter Verwendung einer Beckman-Glucoseoxydase-Analyseeinheit II [33] untersucht. Plasmainsulin wurde mittels des vorher beschriebenen Dextran-Kohle-Radioimmunoassays bestimmt [34]. Inkrementelle Bereiche unter Plasma-Glucose und Insulinkurven (AUC) wurden unter Verwendung eines Computerprogramms (CAREA) berechnet, indem die Trapezregel [35] mit Basislinien-Subtraktion angewandt wurde. Die Ergebnisse sind als mittlere ± SEM ausgedrückt und die Werte wurden unter Verwendung Student's ungepaartem t-Test verglichen. Die Datengruppen wurden als bedeutend unterschiedlich angesehen, wenn P < 0,05 war.
Ergebnisse
Abbau von GIP und Tyr¹-Glucitol GIP durch DPP IV. 1 veranschaulicht die typischen Spitzenprofile, die aus der HPLC-Trennung der Produkte erhalten wurden, die aus der Inkubation von GIP (1a) oder Tyr¹-Glucitol GIP (1b) mit DPP IV für 0, 2, 4 und 12 Stunden erhalten wurden. Die Retentionszeiten von GIP and Tyr¹-Glucitol GIP bei t = 0 waren 21,93 Minuten bzw. 21,75 Minuten. Der Abbau von GIP war nach 4 Stunden Inkubation (54 % intakt) offensichtlich und nach 12 Stunden wurde der Hauptteil (60 % inktakten GIPs) in das einzelne Produkt mit einer Retentionszeit von 21,61 Minuten umgewandelt. Tyr¹-Glucitol GIP blieb durch die 2–12 Stunden Inkubation hindurch fast vollständig intakt. Die Trennung erfolgte auf einer Vydac C-18-Säule unter Verwendung von linearen Gradienten von 0 % bis 31,5 % Acetonitril über 15 Minuten, bis 38,5 % über 30 Minuten und von 38,5 bis 70 % Acetonitril über 5 Minuten.
Abbau von GIP und Tyr¹-Glucitol GIP durch humanes Plasma. 2 zeigt einen Satz typischer HPLC-Profile der Produkte, die aus der Inkubation von GIPs oder Tyr¹-Glucitol GIPSs mit humanem Plasma für 0 und 4 h erhalten wurden. GIP (2a) mit einer Retentionszeit von 22,06 Min. wurde schnell durch Plasma innerhalb von 4 Stunden Inkubation umgewandelt, was eine Hauptabbauspitze mit einer Retentionszeit von 21,74 Minuten erscheinen ließ. Im Gegensatz dazu resultierte die Inkubation von Tyr¹-Glucitol GIP unter ähnlichen Bedingungen (2b) nicht in die Bildung irgendwelcher erfassbarer Abbaufragmente während dieser Zeit mit nur einer einzelnen beobachteten Spitze mit einer Retentionszeit von 21,77 Minuten. Die Zugabe von Diprotin A, ein spezifischer Inhibitor von DPP IV, zu GIP während der 4 Stunden Inkubation inhibierte den Abbau des Peptids durch Plasma vollständig, Es sind. Spitzen, die intaktem GIP, GIP (3–42) und Tyr¹-Glucitol GIP entsprechen, angegeben. Eine Hauptspitze, die dem spezifischen DPP-IV-Inhibitor Tripeptid DPA entspricht, erscheint in den unteren Tafeln mit einer Retentionszeit von 16–29 Min.
Identifizierung von GIP-Abbaufragmenten durch ESI-MS. 3 zeigt die monoisotopischen Molekularmassen, die für GIP erhalten wurden, (Tafel A), Tyr¹-Glucitol GIP (Tafel B) und das Haupt-Plasma-Abbaufragment von GIP (Tafel C) unter Verwendung von ESI-MS. Die analysierten Peptide wurden von Plasmainkubationen wie in 2 gezeigt, gereinigt. Peptide wurden in 100 μl Wasser aufgelöst (ungefähr 400 pmol) und auf die LC/MS, die mit einer Mikrobohrwerkzeug C-18 HPLC Säule ausgestattet ist, angewandt. Proben (30 μl Direktschleifeninjektion) wurden bei einer Durchflussmenge von 0,2 ml/Min. unter isokratischen Bedingungen 35 % Acetonitil/Wasser angewandt. Massenspektren wurden unter Verwednung eines Vierpol-Ionenfalle-Massenanalysegeräts aufgezeichnet. Spektren wurden unter Verwendung des gesamten Ionenabtastmodus über den Masse-zu-Ladung-Bereich (m/z-Bereich) 150–2000 gesammelt. Die Molekularmasse (M_r) von GIP und die verwandten Strukturen wurden aus den ESI-MS-Profilen unter Verwendung von prominenten multiplen aufgeladenen Ionen und der nachstehenden Gleichung M_r = iM_i–iM_h bestimmt. Die exakte Molekularmasse (M_r) der Peptide wurde unter Verwendung der Gleichung M_r = iM_i-iM_h, wie im Versuchsdesign und Verfahren definiert, berechnet. Nachdem eine spektrale Mittelwertbildung unternommen worden war, wurden prominente Spezies mit Mehrfachladungen (M+3H)³⁺ und (M+4H)⁴⁺ von GIP bei m/z 1661,6 und 1246,8 erfasst, was intakter M_r 4981,8 bzw. 4983,2 Da (3A) entspricht. Ähnlich wurden für Tyr¹-Glucitol GIP ((M+4H)⁴⁺ und (M+5H)⁵⁺) bei m/z 1287,7 und 1030,3 erfasst, was intakten Molekularmassen von M^r 5146,8 bzw. 5146,5 Da (3B) entspricht. Der Unterschied zwischen den beobachteten Molekularmassen des vierpolig geladenen GIPs und der N-terminal modifizierten GIP-Spezies (163,6 Da) zeigte an, dass das letztgenannte Peptid ein einzelnes Glucitol-Addukt, das Tyr¹-Glucitol GIP entspricht, enthielt. 3C zeigt die prominenten mehrfach geladenen Spezies (M+3H)³⁺ und (M+4H)⁴⁺, die von dem Hauptfragment von GIP bei m/z 1583,8 und 1188,1 erfasst wurden, was intakter M^r 4748,4 bzw. 4748 Da (3C) entspricht. Dies entspricht der theoretischen Masse der N-terminal gekürzten Form des Peptids GIP (3–42). Dieses Fragment war auch das Hauptabbauprodukt von DPP-IV-Inkubationen (Daten nicht gezeigt).
Auswirkungen von GIP und Tyr¹-Glucitol GIP auf Plasma-Glucose-Homöostase. 4 und 5 zeigen die Auswirkungen von intraperitonealer (ip) Glucose alleine (18 mmol.kg) (Kontrollgruppe) und Glucose in Kombination mit GIP oder Tyr¹-Glucitol GIP (10 nmol/kg) auf Plasma-Glucose und Insulinkonzentrationen.
(4A) Plasma-Glucosekonzentrationen nach ip Glucose alleine (18 mmol/kg) (Kontrollgruppe) oder Glucose in Kombination mit entweder GIP von Tyr¹-Glucitol GIP (10 nmol/kg). Die Zeit der Injektion ist durch den Pfeil (0 Min.) angegeben. (4B) Plasma-Glucose AUC-Werte für 0–60 Min. nach Injektion. Die Werte sind mittlere ± SEM für sechs Ratten. **P < 0,01, ***P < 0,001 im Vergleich zu GIP und Tyr¹-Glucitol GIP; ✝P < 0,05, ✝✝P < 0,01 im Vergleich zu nicht gluciertem GIP.
(5A). Plasmainsulinkonzentrationen nach ip Glucose alleine (18 mmol/kg) (Kontrollgruppe) oder Glucose in Kombination mit entweder GIP oder glyciertem GIP (10 nmol/kg). Die Zeit der Injektion ist durch den Pfeil angegeben. (5B) Plasmainsulin AUC-Werte wurden für jede der 3 Gruppen bis zu 90 Minuten nach der Injektion berechnet. Die Zeit der Injektion ist durch den Pfeil (0 Min.) angegeben. Plasmainsulin AUC-Werte für 0–60 Min. nach Injektion. Die Werte sind mittlere ± SEM für sechs Ratten. *P < 0,05, **P < 0,001 im Vergleich zu GIP und Tyr¹-Glucitol GIP; ✝P < 0,05, ✝✝P < 0,01 im Vergleich zu nicht glyciertem GIP.
Verglichen mit der Kontrollgruppe waren die Plasma-Glucose-Konzentrationen und der Bereich unter der Kurve (AUC) bedeutend niedriger im Anschluss an die Verabreichung von entweder GIP oder Tyr¹-Glucitol GIP (4A, B). Ferner waren individuelle Werte bei 15 und 30 Minuten zusammen mit AUC bedeutend niedriger im Anschluss an die Verabreichung von Tyr¹-Glucitol GIP im Vergleich zu GIP. Im Einklang mit den bewiesenen Insulin freisetzenden Eigenschaften von GIP, wurden die Plasma-Insulin-Konzentrationen von beiden mit Peptid behandelten Gruppen bedeutend angehoben bei 15 und 30 Minuten im Vergleich zu den Werten nach der Verabreichung von Glucose alleine (5A). Die insgesamten Insulinreaktionen, die als AUC geschätzt sind, waren ebenfalls bedeutend höher für die beiden mit Peptid behandelten Gruppen (5B). Trotz niedrigerer vorherrschender Glucosekonzentrationen als die mit GIP behandelte Gruppe, war die Plasmainsulinantwort, die als AUC berechnet wurde, im Anschluss an Tyr¹-Glucitol GIP bedeutend höher als nach GIP (5B). Der bedeutende Anstieg von Plasmainsulin bei 30 Minuten ist von besonderem Interesse, wobei nahegelegt wird, dass die Insulin freisetzende Aktivität von Tyr¹-Glucitol GIP langwieriger ist als GIP, selbst im Hinblick auf einen verminderten glykämischen Stimulus (4A, 5A).
Diskussion
Das zweiundvierzig Aminosäure-GIP ist ein wichtiges Inkretin-Hormon, das von endokrinen K-Zellen des Zwölffingerdarms und des Leerdarms nach der Nahrungsaufnahme in den Kreislauf freigesetzt wird. Der hohe Grad an struktureller Konservierung von GIP unter Spezies unterstützt die Ansicht, dass dieses Peptid eine wichtige Rolle im Stoffwechsel spielt. Die Sekretion von GIP wird direkt durch aktiv transportierte Nährstoffe in dem Darmlumen ohne eine bemerkenswerte Eingabe von autonomen Nerven stimuliert. Die wichtigsten Stimulanzien der GIP-Freisetzung sind einfache Zucker und ungesättigte langkettige Fettsäuren, wobei die Aminosäuren schwächere Wirkungen ausüben. Wie mit tGLP-1 ist die Insulin freisetzende Wirkung von GIP grundsätzlich glucoseabhängig. Dies bietet Schutz gegenüber Hypoglykämie und erfüllt dadurch eines der wünschenswertesten Merkmale jedes beliebigen gegenwärtigen oder potentiell neuen antidiabetischen Arzneimittels.
Die vorliegenden Ergebnisse zeigen das erste Mal, dass Tyr¹-Glucitol GIP gegenüber Serum- und DPP-IV-Abbau starken Widerstand aufzeigt. Unter Verwendung von ESI-MS zeigte die vorliegende Studie, dass natives GIP in vitro schnell in ein wichtiges 4748,4 Da Abbauprodukt gespalten wurde, das GIP (3–42) entsprach, was frühere Resultate bestätigte, die Matrixunterstützte Laserdesorptions/Ionisations-Massenspektrometrie verwendeten. Der Serumabbau wurde vollständig durch Diprotin A (Ile-Pro-Ile), ein spezifischer kompetitiver Inhibitor von DPP-IV inhibiert, wobei dieses als das Hauptenzym für die GIP-Aktivierung in vivo bestätigt wurde. Im Gegensatz dazu blieb Tyr¹-Glucitol GIP fast vollständig intakt nach der Inkubation mit Serum oder DPP-IV für bis zu 12 Stunden. Dies deutet darauf hin, dass die Glycierung von GIP an dem Amino-terminalen Tyr¹-Rückstand die potentielle Spaltungsstelle von DPP-IV maskiert und die Entfernung von dem Tyr¹-Ala²-Dipeptid von dem N-Terminus verhindert, was die Bildung von GIP (3–42) verhindert.
Im Einklang mit dem In-Vitro-Schutz gegen DPP-IV verbesserte die Verabreichung von Tyr¹-Glucitol GIP bedeutend die Antihyperglykämieaktivität and Insulin freisetzende Aktivität des Peptids, wenn es zusammen mit Glucose Ratten verabreicht wurde. Das native GIP verbesserte die Insulin-Freisetzung und reduzierte die Glykämieexkursion, wie sie in vielen früheren Studien beobachtet wurde. Die amino-terminale Glycierung von GIP erhöhte die Insulin freisetzenden und antihyperglykämischen Aktivitäten des Peptids um 62 % bzw. 38 %, wie von AUC-Messungen geschätzt. Eine detaillierte kinetische Analyse ist schwer aufgrund der notwendigen Einschränkung von Probenahmezeiten, jedoch sind die höheren Insulinkonzentrationen nach Tyr¹-Glucitol GIP im Gegensatz zu GIP bei 30 Minuten nach der Injektion indikativ für eine längere Halbwertzeit. Der Glykämieanstieg war in beiden mit Peptid behandelten Gruppen bescheiden und die Glucosekonzentrationen nach der Injektion von Tyr¹-Glucitol GIP waren konsistent niedriger als nach dem GIP. Da die insulinotropen Aktivitäten von GIP Glucoseabhängig sind, ist es wahrscheinlich, dass die Insulin freisetzende Kraft von Tyr¹-Glucitol GIP in den gegenwärtigen In-Vivo-Experimenten sehr unterschätzt wird.
In-Vitro-Studien in dem Labor der gegenwärtigen Erfinder unter Verwendung von auf Glucose reagierenden klonalen B-Zellen zeigten, dass die Insulin freisetzende Kraft von Tyr¹-Giucitol GIP mehrere Größenordnungen größer als GIP war und dass ihre Wirksamkeit empfindlicher gegenüber Änderungen in Glucosekonzentrationen innerhalb des physiologischen Bereichs war. Zusammen mit den vorliegenden In-Vivo-Beobachtungen, legt dies nahe, dass die N-terminale Glycierung von GIP Widerstand auf den DPP-IV-Abbau überträgt, während die Rezeptor bindenden und Insulin sekretorischen Wirkungen auf die B-Zelle verbessert werden. Diese Attribute von Tyr¹-Glucitol GIP sind in vivo vollständig exprimiert, wobei der DPP-IV-Widerstand den Abbau des Peptids zu GIP (3–42) behindert, wodurch die Halbwertzeit verlängert wird und die effektiven Konzentrationen des intakten biologisch aktiven Peptids verbessert werden. Es ist daher möglich, dass glyciertes GIP die Insulin-Sekretion in vivo sowohl durch verbesserte Kraft an dem Rezeptor als auch die Verbesserung des DPP-IV-Widerstands steigert. Viele Studien haben daher gezeigt, dass GIP (3–42) und andere N-terminal modifizierte Fragmente, einschließlich GIP (4–42), und GIP (17–42) entweder schwach effektiv oder inaktiv bei der Stimulierung der Insulinfreisetzung sind. Ferner bestehen Beweise, dass N-terminate Beseitigungen von GIP zu Rezeptor antagonistischen Eigenschaften in GIP Rezeptor transfizierten chinesischen Hamsternierenzellen [9] resultieren, was nahelegt, dass die Inhibition von GIP-Katabolismus auch den möglichen Feedback-Antagonismus auf dem Rezeptorniveau durch das gekürzte GIP (3–42) reduzieren würde.
Zusätzlich zu seinen insulinotropen Wirkungen können eine Anzahl anderer potentiell wichtiger extrapankreatischer Wirkungen von GIP der verbesserten antihyperglykämischen Aktivität und anderen vorteilhaften metabolischen Wirkungen von Tyr¹-Glucitol GIP beitragen. Diese umfassen die Stimulierung von Glucoseaufnahme in Adipozyten, die erhöhte Synthese von Fettsäuren und die Aktivierung von Lipoproteinlipase in adiposem Gewebe. GIP fördert auch die Plasma-Triglycerid-Clearance als Reaktion auf orale Fettbelastung. Es hat sich gezeigt, dass GIP in der Leber die insulinabhängige Inhibition von Glycogenolyse verbessert. GIP reduziert auch sowohl die Glucagon stimulierte Lipolyse in adiposem Gewebe als auch die hepatische Glucoseproduktion. Schließlich deuten neuste Resultate darauf hin, dass GIP eine potente Wirkung auf die Glucoseaufnahme und den Metabolismus in isoliertem Zwerchfellmuskel von Mäusen hat. Letztere Aktivität kann mit tGLP-1 geteilt werden, und beide Peptide weisen die zusätzlichen Vorteile des Stimulierens von Somatostatin-Sekretion und dem Verlangsamen der Magenentleerung und der Nahrungsaufnahme auf.
Zum Schluss hat diese Studie zum ersten Mal aufgezeigt, dass die Glycierung von GIP an dem amino-teminalen Tyr¹-Rückstand den GIP-Katabolismus durch das Beeinträchtigen der proteolytischen Aktivitäten von Serum-Peptidasen begrenzt und dadurch seine Halbwertzeit in vivo verlängert. Diese Wirkung wird durch die antihyperglykämische Aktivität und erhöhten Insulinkonzentrationen in vivo verstärkt, was nahe legt, dass die DPP IV resistenten Analoge neben tGLP-1 als potentiell nützliche therapeutische Agenzien für NIDDM erforscht werden sollten. Tyr¹-Glucitol GIP scheint in dieser Hinsicht besonders interessant zu sein, da eine derartige amino-terminale Modifikation von GIP die glucoseabhängige insulinotrope Kraft eher verstärkt als beeinträchtigt, wie dies kürzlich für tGLP-1 beobachtet wurde.
Beispiel 3
Dieses Beispiel betrachtete weiter die Fähigkeit zusätzlicher N-terminaler struktureller Modifikationen von GIP durch das Verhindern der Inaktivierung durch DPP und in Plasma und ihrer zugehörigen Erhöhung sowohl der Insulin freisetzenden Kraft als auch des potentiellen therapeutischen Wertes. Natives humanes GIP, glyciertes GIP, acetyliertes GIP und eine Anzahl von GIP-Analogen mit N-terminalen Aminosäuresubstitutionen wurden getestet.
Materialien und Methoden
Reagenzien
Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) Grad Acetonitril wurde von Rathburn (Walkersburn, Schottland) erhalten. Sequenzierung Grad Trifluoressigsäure (TFA) wurde von Aldrich (Poole, Dorset, Vereinigtes Königreich) erhalten. Dipeptidyl-Peptidase IV wurde von Sigma (Poole, Dorset, Vereinigtes Königreich) gekauft und Diprotin A wurde von Calbiochem-Novabiochem (Beeston, Nottingham, Vereinigtes Königreich) gekauft. RPMI 1640 Gewebekulturmedium, fetales Kalbsserum, Penicillin und Streptomycin wurden alle von Gibco (Paisley, Strathclyde, Vereinigtes Königreich) gekauft. Alles in diesen Experimenten verwendete Wasser wurde unter Verwendung eines Milli-Q Wasserreinigungssystems (Millipore, Millford, MA, USA) gereinigt. Alle anderen verwendeten Chemikalien waren von der höchsten verfügbaren Reinheit.
Synthese von GIP und N-terminal modifizierten GIP-Analogen
GIP, GIP (Abu2), GIP (Sar2), GIP (Ser2), GIP (Gly2) und GIP (Pro3) wurden auf einem Applied Biosystems automatisierten Peptidsynthesizer (Modell 432A) unter Verwendung eines feste Phase Standard-Fmoc-Vorgangs sequentiell synthetisiert, wobei mit einem Fmoc-Gln-Wang-Harz begonnen wurde. Im Anschluss an die Spaltung von dem Harz durch Trifluoressigsäure: Wasser, Thioanisol, Ethanedithiol (90/2,5/5/2,5, ein Gesamtvolumen von 20 ml/g Harz), der Harz wurde durch Filtrierung entfernt und das Filtratvolumen wurde unter reduziertem Druck gesenkt. Trockener Diethylether wurde langsam zugegeben, bis ein Präzipitat beobachtet wurde. Das Präzipitat wurde durch Zentrifugieren mit langsamer Geschwindigkeit in Diethylether resuspendiert und wieder zentrifugiert, wobei dieser Vorgang mindestens fünf mal durchgeführt wurde. Die Kügelchen wurden dann in vacuo getrocknet und durch Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie mit umgekehrten Phasen (HPLC) auf einem Waters Millennium 2010 Chromatographiesystem (Software-Version 2.1.5.) als rein bewertet. N-terminal glyciertes und acetyliertes GIP wurde durch die geringfügige Modifikation eines veröffentlichten Verfahrens präpariert.
Elektrospray-Ionisierungs-Massenspektrometrie (ESI-MS) wurde wie in Beispiel 2 beschrieben, durchgeführt.
Der Abbau von GIP und neuartigen GIP-Analogen von DPP-IV- und humanem Plasma wurde wie in Beispiel 2 beschrieben durchgeführt.
Kultur von Insulin sekretierenden Zellen
BRIN-BD11-Zellen [30] wurden in sterilen Gewebekulturflaschen (Corning, Glass Works, Vereinigtes Königreich) unter Verwendung eines RPMI-1640 Gewebekulturmediums, das 10 % (v/v) fetales Kalbsserum, 1 % (v/v) Antibiotika (100 U/ml Penizillin, 0,1 mg/ml Streptomycin) und 11,1 mM Glucose enthielt, kultiviert. Die Zellen wurden bei 37 °C in einer Atmosphäre von 5 % CO₂ und 95 % Luft unter Verwendung eines LEEC-Brutschranks (Laboratory Technical Engineering, Nottingham, Vereinigtes Königreich) gehalten.
Akute Tests auf Insulinsekretion
Vor dem Experiment wurden die Zellen von der Oberfläche der Gewebekulturflaschen mit Hilfe von Trypsin/EDTA (Gibco) gesammelt, in 24-Multiwell-Platten (Nunc, Roskilde, Dänmark) bei einer Dichte von 1,5 × 105 Zellen pro Well angeimpft und über Nacht bei 37 °C anhaften gelassen. Vor den akuten Tests auf Insulinfreisetzung wurden 40 Min. lang eine Vorinkubation bei 37 °C in 1,0 ml Krebs Ringer Bicarbonatpuffer (115 mM NaCl, 4,7 mM KCl, 1,28 mM CaCl₂, 1,2 mM KH₂PO₄, 1,2 mM MgSO₄, 10 mM NaHCO₃, 5 g/l Rinderserumalbumin, pH-Wert 7,4) supplementiert mit 1,1 mM Glucose durchgeführt. Die Testinkubationen wurden bei zwei Glucosekonzentrationen (5,6 mM und 16,7 mM) mit einem Bereich an Konzentrationen (10^–13 bis 10^–8 M) GIP oder GIP-Analogen durchgeführt (n = 12). Nach 20 Min. Inkubation wurde der Puffer aus jedem Well entfernt und es wurden Allquote (200 μl) verwendet, um durch Radioimmunoassay [31] Insulin zu messen.
Statistische Analyse
Die Ergebnisse sind als mittlere ± S.E.M. ausgedrückt und die Werte wurden unter Verwendung von Student's ungepaartem t-Test verglichen. Die Datengruppen wurden als bedeutend unterschiedlich angesehen, wenn P < 0,05 war.
Ergebnisse und Erörterung
Die strukturelle Identifizierung von GIP und GIP-Analogen durch ESI-MS Die monoisotopischen Molekularmassen der Peptide wurden unter Verwendung von ESI-MS bestimmt. Nachdem spektrale Durchschnittsmessung durchgeführt worden war, wurden prominente mehrfach geladene Spezies (M+3H) 3+ und (M+4H) 4+ für jedes Peptid erfasst. Berechnete Molekularmassen bestätigten die strukturelle Identität synthetischen GIPs und jedes der N-Terminalen Analoge.
Abbau von GIP und neuartigen GIP-Analogen durch DPP IV
6–11 stellen die typischen Spitzenprofile dar, die von der Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie-Trennung der Reaktionsprodukte erhalten wurden, welche durch die Inkubation von GIP, GIP (Abu2), GIP (Sar2), GIP (Ser2), glyciertem GIP und acetyliertem GIP mit DPP IV für 0, 2, 4, 8 und 24 h erhalten wurden. Die in Tabelle 1 zusammengefassten Ergebnisse zeigen an, dass glyciertes GIP, acetyliertes GIP, GIP (Ser2) und GIP (Abu2) widerstandsfähiger sind als natives GIP gegenüber In-Vitro-Abbau mit DPP IV. Aus diesen Daten scheint GIP (Sar2) weniger widerstandsfähig zu sein.
Abbau von GIP und GIP-Analogen durch humanes Plasma
12–16 zeigen einen repräsentativen Satz von HPLC-Profilen, die von der Inkubation von GIP und GIP-Analogen mit humanem Plasma für 0, 2, 4, 8 und 24 h erhalten wurden. Es wurden nach 24 h Inkubation in Gegenwart von DPA auch Beobachtungen angestellt. Diese Ergebnisse sind in Tabelle 2 zusammengefasst und sind allgemein mit DPP-IV-Inkubationen vergleichbar, jedoch sind die Bedingungen, die In-Vivo-Bedingungen widerspiegeln weniger enzymatisch schlimm. GIP wurde durch das Plasma schnell abgebaut. Im Vergleich zeigten alle getesteten Analoge Widerstand gegenüber Plasmaabbau auf, einschließlich GIP (Sar2), das aus DPP-IV-Daten am wenigsten widerstandsfähig aller getesteter Peptide zu sein schien. DPA inhibierte wesentlich den Abbau von GIP und aller getesteter Analoge mit vollständiger Beseitigung von Abbau in den Fällen von GIP (Abu2), GIP (Ser2) und glyciertem GIP. Dies zeigt an, dass DPP-IV ein Hauptfaktor bei dem In-Vivo-Abbau von GIP ist.
Dosisabhängige Auswirkungen von GIP und neuartigen GIP-Analogen auf Insulinsekretion
17–30 zeigen die Auswirkungen einer Reihe von Konzentrationen von GIP, GIP (Abu2), GIP (Sar2), GIP (Ser2), acetyliertem GIP, glyciertem GIP, GIP (Gly2) und GIP (Pro3) auf Insulinsekretion von BRIN-BD11-Zellen bei 5,6 und 16,7 mM Glucose. Natives GIP provozierte eine prominente und dosisabhängige Stimulation von Insulinsekretion. Im Einklang mit früheren Studien [28] wies das glycierte GIP-Analog eine bedeutend größere insulinotrope Reaktion im Vergleich zu nativem Peptid auf. N-terminal acetyliertes GIP wies ein ähnliches Muster auf und das GIP (Ser2) Analog provozierte ebenfalls eine starke Reaktion. Aus diesen Tests schienen GIP (Gly2) und GIP (Pro3) die am wenigsten potenten Analoge hinsichtlich der Insulinfreisetzung zu sein. Andere getestete stabile Analoge, und zwar GIP (Abu2) und GIP (Sar2), wiesen ein komplexes Muster von Empfindlichkeit in Abhängigkeit von der angewandten Glucosekonzentration und -dosis auf. Daher waren sehr niedrige Konzentrationen äußerst potent unter hyperglykämischen Bedingungen (16,7 mM Glucose). Dies legt nahe, dass sich selbst diese Analoge als therapeutisch nützlich bei der Verwendung von Typ-2-Diabetes erweisen können, wenn insulinotrope Kapazität zusammen mit In-Vivo-Abbau die Peptidkraft diktiert.
Tabelle 1: % verbleibenden intakten Peptids nach der Inkubation mit DPP-IV
Tabelle 2: % verbleibenden intakten Peptids nach der Inkubation mit humanem Plasma
Die Tabellen repräsentieren den Prozentsatz des intakten Peptids (d. h. GIP 1-42) relativ zu dem Hauptabbauprodukt GIP 3–42. Die Werte wurden von in dreifacher Ausfertigung durchgeführten HPLC-Spuren entnommen und die mittleren und S.E.M.-Werte wurden berechnet. DPA ist Diprotin A, ein spezifischer Inhibitor von DPP IV.

Claims

Ein Peptidanalog von GIP (1–42), das mindestens 15 Aminosäurereste von dem N-terminalen Ende des GIP (1–42), das mindestens eine Aminosäuresubstitution oder -modifikation bei Position 1–3 aufweist und kein Tyr¹-Glucitol GIP (1–42) umfasst, beinhaltet und biologisch aktiv ist.
Peptidanalog gemäß Anspruch 1, das die Modifikation durch die Zugabe von Fettsäure bei einer Epsilon-Aminogruppe von mindestens einem Lysinrest umfasst.
Peptidanalog des biologisch aktiven GIP (1–42), wobei das Analog ein durch die Zugabe von Fettsäure bei einer Epsilon-Aminogruppe von mindestens einem Lysinrest modifiziertes Tyr¹-Glucitol GIP (1-42) ist.
Peptidanalog gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Substitution oder Modifikation aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus D-Aminosäuresubstitutionen an 1, 2 und/oder 3 Positionen und/oder N-terminaler Glycierung, Alkylierung, Acetylierung oder Acylierung besteht.
Peptidanalog gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Aminosäure an der 2. oder 3. Position durch Lysin, Serin, 4-Aminobuttersäure, Aib, D-Alanin, Sarcosin oder Prolin substituiert ist.
Peptidanalog gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei der N-Terminus durch eine der Gruppe von Modifikationen einschließlich Glycierung, Alkylierung, Acetylierung oder durch die Zugabe einer Isopropylgruppe modifiziert ist.
Die Verwendung eines Peptidanalogs gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche bei der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung von Diabetes.
Eine pharmazeutische Zusammensetzung einschließlich eines Analogs gemäß einem der vorhergehenden Ansprüche 1–6.
Pharmazeutische Zusammensetzung gemäß Anspruch 8 unter Beimischung zu einem pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Ein Verfahren zum N-terminalen Modifizieren von GIP oder Peptidanalogen davon, wobei das Verfahren die Schritte des Synthetisierens des Peptids von der C-terminalen zu der vorletzten N-terminalen Aminosäure, des Zugebens von Tyrosin als Fmoc-geschützes Tyr (tBu)-Wang-Harz, des Entschützens des N-Terminus des Tyrosins und Eingehens einer Reaktion mit dem modifizierenden Agens, des Zulassens, dass die Reaktion zum Ende gelangt, des Spaltens des modifizierten Tyrosins von dem Wang-Harz und des Zugebens des modifizierten Tyrosins zu der Peptidsynthesereaktion beinhaltet.
Verfahren gemäß Anspruch 10, wobei das modifizierende Agens aus der Gruppe ausgewählt ist, die Glucose, Essigsäureanhydrid oder Pyroglutaminsäure beinhaltet.