DE69120138T2

DE69120138T2 - Kombinationen Hepatitis-C-Virus(HCV)-Antigene zur Anwendung in Immunoassays für Anti-HCV-Antikörper

Info

Publication number: DE69120138T2
Application number: DE69120138T
Authority: DE
Inventors: Qui-Lim Choo; Michael Houghton; George Kuo
Original assignee: Chiron Corp
Current assignee: Novartis Vaccines and Diagnostics Inc
Priority date: 1990-04-04
Filing date: 1991-04-03
Publication date: 1996-11-14
Anticipated expiration: 2011-04-04
Also published as: LTIP1747A; DK0450931T3; NO310241B1; ATE139343T1; FI106317B; EP0693687A1; EP0450931B1; HUT62706A; KR100206150B1; RU2130969C1; GB2257784A; GB2257784B; PL172133B1; LT3808B; DK0693687T3; IL97741A0; JPH05508219A; DE69131488T2; ES2134388T3; DK0693687T4

Description

Technisches Gebiet

Die Erfindung betrifft das Gebiet der Immunoassays auf HCV (zuvor als Non-A-, Non-B-Hepatitisvirus bezeichnet). Insbesondere betrifft sie Kombinationen aus HCV-Antigenen, die Immunoassays auf Anti-HCV-Antikörper in einem weiten Bereich erlauben.

Hintergrund

Die zuvor als Non-A-, Non-B-Hepatitis (NANBH) bekannte Erkrankung galt als eine übertragbare Erkrankung oder eine Familie von Erkrankungen, von denen angenommen wurde, daß sie durch ein Virus induziert werden, und die von anderen Forinen von Virus-assoziierten Lebererkrankungen unterscheidbar waren, einschließlich der durch die bekannten Hepatitisviren, d.h. Hepatitis-A-Virus (HAV), Hepatitis-B-Virus (HBV) und Delta- Hepatitisvirus (HDV) hervorgerufenen Hepatitisviruserkrankungen sowie die durch Cytanegalieviren (CMV) oder das Epstein-Barr-Virus (EBV) induzierten Hepatitiserkrankungen. NANBH wurde zuerst in Transfusionspatienten identifiziert. Die Übertragung vom Menschen auf den Schimpansen und die reinenweise Weitergabe bei den Schimpansen erbrachte den Nachweis, daß NANBH auf einen übertragbaren infektiösen Erreger oder übertragbare infektiöse Erreger zurückzuführen war. Der epidemiologische Beweis legt nahe, daß es drei Typen von NANBH gibt: ein epidemischer in Wasser entstandener Typ, ein im Blut entstandener oder parenteral übertragener Typ und ein sporadisch vorkommender (in der Gemeinschaft erworbener) Typ. Jedoch wurde bis jungst kein übertragbarer Erreger der für NANBH verantwortlich ist, identifiziert, und die klinlsche Diagnose und Identifikation von NANBH wurde in erster Linie durch Ausschluß anderer viraler Marker erzielt. Dnter den Verfahren, die verwendet wurden, um vermutliche NANBH- Antigene und -Antikörper nachzuweisen, waren die Agargeldiffusion, die Gegenstran-Immunelektrophorese, die Immunfluoreszenz:mikroskopie, die Immunelekronenmikroskopie, der Radioimmunoassay und der enzymgekoppelte Immunosorbentassay. Jedoch erwies sich keiner dieser Assays als ausreichend enpfindiich, spezifisch und reproduzierbar, um als diagnostischer Test auf NANBH verwendet werden zu können.
1987 identifizierten Wissenschaftler bei der Chiron Corporation (der Inbaber der vorliegenden Arineldung) die erste Nucleinsäure, die definitiv mit NANBH aus dem Blut verknüpft ist. Vgl. z.B. EP-A-318 216: Houghton et al., Science 244:359 (1989). Diese Veröffentlichungen beschreiben die donierung eines Isolats aus einer neuen viralen Klasse, das Hepatitis-C-Virus (HCV), wobei das beschriebene Prototypisolat darin als "HCV1" bezeichnet wurde. HCV ist ein flaviartiges Virus mit einem RNA-Genom.
Das US-Patent 5 350 671 (Houghton et al.), auf das hiermit Bezug genommen wird, beschreibt die Herstellung verschiedener rekombinanter HCV-Polypeptide durch Expression von HCV-cDNA und Absuchen dieser Polypeptide auf immunologische Reaktivität mit Seren aus HCV-Patienten. Dieses begrenzte Absuchen zeigte, daß mindestens fünf der getesteten Polypeptide sehr immunogen waren; d.h., diejenigen, die als 5-1-1, C100, C33c, CA279a und CA290a identifiziert wurden. Von diesen fünf Polypeptiden ist 5-1-1 in der vermutlichen NS4-Domane lokalisiert, umspannt C100, die vermutlichen NS3- und NS4-Domänen, ist C33c innerhalb der vermutlichen NS3-Domäne lokalisiert und sind CA279a und CA290a innerhalb der vermutlichen C-Domäne lokalisiert. Das Absuchen zeigt auch, daß kein einzelnes getestetes Polypeptid mit allen Seren immunologisch reaktiv war. So sind verbesserte Tests, die mit allen oder mehreren Proben aus HCV-positiven Individuen reagieren, wunschenswert.
Die EP-A-445 423, die am 22. Dezember 1990 angemeldet wurde und am 11. September 1991 veröffentlicht wurde, beschreibt Immunoassays auf HCV. Die EP-A-445 423 beschreibt die Verwendung des rekombinanten C100-3-Hefe/Hepatitis-C-Virus-SOD-Füsionspolypeptids (offenbart in der EP-A- 318 216) zusammen mit einem Polypeptid, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend u.a. aus p1, p35 und p99. Das Peptid p1 entspricht den Aminosäureresten 1 bis 75 der Fig. 1A (worin die Position 9 Lys und 11 Asn ist), p35 entspricht den Aminosäureresten 35 bis 75 der Fig. 1A, und p99 entspricht den Resten 99 bis 126 der Fig. 1A.
Die am 17. Oktober 1991 veröffentlichte WO91/15574 beschreibt u.a. gerelnigte Proteine und Glycopeptide von HCV, die in einem Diagnosesystem zum Nachweis von menschlichen HCV-Antiseren nützlich sind. Die EP-A- 442 394 beschreibt synthetische Peptide zum Nachweis von Antikörpern gegen HCV.

Offenbarung der Erfindung

Die Anmelder führten zusätzliche serologische Untersuchungen an HCV-Antigenen durch, die bestätigen, daß kein einzelnes bis jetzt identifiziertes HCV-Polypeptid immunologisch mit allen Seren reaktiv ist. Dieses Fehlen eines einzelnen Polypeptids, das universell mit allen Seren aus Individuen mit HCV reaktiv ist, kann u.a. auf die Variation in den HCV-Epitopen von Stamm zu Stamm, die Variabilität in der humoralen Antwort von Individuum zu Individuum und/oder die Variation in der Serologie mit dem Zustand der Erkrankung zurückzufünren sein.
Diese zusätzlichen Studien ermöglichten den Anmeldern auch die Identifikation von Kombinationen von HCV-Antigenen, die eine effizientere Detektion von HCV-Antikörpern als von jedem einzelnen HCV-Polypeptid erlauben.
Eolglich betrifft ein Gesichtspunkt der Erfindung eine Kombination von Hepatitis-c-Virus-Epitopsequenzen (HCV) in einem oder mehreren Polypeptid(en), hergestellt durch chemische Synthese oder rekombinante Expression, immobilisiert auf der Oberfläche einer festen Matrix mit der Eignung zur Detektion von HCV durch einen Immunoassay, umfassend:
(a) eine erste Epitopsequenz aus der C-Domäne des HCV-Polyproteins;
(b) eine zweite Epitopsequenz aus einer zweiten Domäne des HCV- Polyproteins, wobei die Domäne
(i) die NS3-Domäne des HCV-Polyproteins;
(ii) die NS4-Domäne des HCV-Polyproteins; oder
(iii) die NS5-Domäne des HCV-Polyproteins ist;
und
(c) eine dritte Epitopsequenz aus einer dritten Domäne des HCV- Polyproteins, wobei die Domäne:
(i) die NS3-Domäne des HCV-Polyproteins;
(ii) die NS4-Domäne des HCV-Polyproteins; oder
(iii) die NS5-Domäne des HCV-Polyproteins ist;
wobei die dritte Domäne sich von der zweiten Domäne unterscheidet; mit der Maßgabe, daß die Kombination nicht das Peptid p1 mit C100-3, das Peptid p35 mit C100-3 oder das Peptid p99 mit C100-3 ist.
In einer Ausführungsform liegt die Kombination der HCV-Epitopsequenzen in Form eines Eusionsproteins, bestehend aus den Epitopen, vor. In einer alternativen Ausführungsform liegt die Kombination von Epitopsequenzen in Form von einzelnen Epitopen vor, die an eine gemeinsame feste Matrix gebunden sind. In einer noch weiteren Ausführungsform liegt die Kombination von Epitopsequenzen in Form eines Gemisches der individuellen Epitope vor.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen HCV in einer Säugerkörperkopponente, die vermutlich die Antikörper enthält, wobei man die Körperkomponente mit der vorstehend beschriebenen Kombination von HCV-Epitopsequenzen unter Bedingungen in Kontakt bringt, die die Antigen-Antikörper-Reaktion erlauben und die Anwesenheit von Immunkomplexen der Antikörper und der Epitopsequenzen nachweist.
Die Korperkomponente kann mit einer Reihe von HCV-Epitopsequenzen gleichzeitig oder aufeinanderfolgend in Kontakt gebracht werden.
Ein weiterer Gesichtspunkt der Erfindung ist ein Kit zur Dlirchtührung eines Assays zum Nachweis von Antikörpern gegen HCV in einer Säugerkörperkomponente, die vermutlich die Antikörper enthält, umfassend in abgepackter Kombination
(a) die Kombination aus HCV-Epitopsequenzen;
(b) Standard-Kontrollreagentien; und
(c) Anweisungen zur Durchführung des Assays.

Kurze Beschreibung der Figuren

In den Fig. ist:
Fig. 1 die Nucleotidsequenz des cDNA-Sinn- und -Anti-Sinnstrangs für das HCV-Polyprotein und die von dem Sinnstrang oodierte Aminosäuresequenz;
Fig. 2 eine schematische Darstellung der Aminosäuresequenz von Fig. 1, die die vermutlichen Domänen der HCV-Polypeptide zeigt.

Verfahren zur Durchführung der Erfindung

Definitionen

"HCV-Antigen" bedeutet ein Polypeptid aus mindestens etwa 5 Aminosäuren, ublicherweise mindestens etwa 8 bis 10 Aminosäuren, das ein Epitop definiert, das sich in einem Isolat von HCV befindet. Bevorzugt ist das Epitop für HCV einzigartig. Wenn ein Antigen durch einen alphanumerischen Code bezeichnet wird, stait[nt das Epitop von der HCV-Domäne und ist alphanumerisch spezifiziert.
"Synthetisch" in Verwendung zur Charakterisierung eines HCV-Antigens bedeutet, daß das HCV-Antigen von einem Menschen hergestellt wurde, beispielsweise durch chemische oder rekombinante Synthese.
"Domänen" bedeutet diejenigen Segmente des HCV-Polyproteins, die in Fig. 2 gezeigt sind, die im allgemeinen den vermutlichen Struktur- und Nichtstrukturproteinen von HCV entsprechen. Die Bezeichnungen der Domäne folgen im allgemeinen der Konvention, die verwendet wurde, um flavivirale Proteine zu bezeichnen. Die Lokalisationen der in Fig. 2 gezeigten Domänen sind nur Annäherungen. Die Bezeichnungen "NS" bedeuten "nichtstrukturelle" Domänen, während "S" die Domäne der Umhüllung bedeutet und "C" die Nucleocapsid- oder Kerndomäne bedeutet.
"Fusionspolypeptid" bedeutet ein Polypeptid, worin das HCV-Antigen/die HCV-Antigene Teil einer einzelnen kontinuierlichen Kette von Aminosäuren ist/sind, wobei die Kette nicht natürlicherweise vorkommt. Die HCV-Antigene können direkt miteinander durch Peptidbindungen verknüpft sein oder durch dazwischenliegende Aminosäuresequenzen getrennt sein. Die Fusionspolypeptide können auch Aminosäuresequenzen, die für HCV exogen sind, enthalten.
"Gemeinsame feste Matrix" bedeutet einen festen Körper, an den die einzelnen HCV-Antigene oder das Fusionspolypeptid, bestehend aus HCV- Antigenen, kovalent oder nichtkovalent, wie durch hydrophobe Adsorption, gebunden sind.
"Säugerkörperkomponente" bedeutet eine Flussigkeit oder ein Gewebe aus einem Säuger (z.B. einem Menschen), die/das ublicherweise von dem Individuum produzierte Antikörper enthält. Solche Komponenten sind auf dem Fachgebiet bekannt und umfassen ohne Beschränkung Blut, Plasma, Serum, Spinalflüssigkeit, Lymphflüssigkeit, Sekretionen des Atmungs-, Magendarm- oder Urogenitaltrakts, Tränen, Speichel, Milch, Leukogyten und Myelome.
"Immunologisch reaktiv" bedeutet, daß das infragekommende Antigen spezifisch mit dem Anti-HCV-Antikörper, der ublicherweise in einem signifikanten Anteil in Seren aus mit HCV infizierten Individuen vorhanden ist, reagiert.
"Immunkomplex" bedeutet die Kombination oder das gebildete Aggregat, wenn ein Antikörper an ein Epitop auf einem Antigen bindet.

Kombinationen aus HCV-Antigenen

Die Fig. 2 zeigt die vermutlichen Domänen des HCV-Polyproteins. Die Domänen, von denen sich die in den Kombinationen verwendeten Antigene ableiten, sind: C, S (oder E), NS3, NS4 und NS5. Die C-Domäne definiert vermutlich das Nucleocapsidprotein von HCV. Es erstreckt sich von dem N- terminalen Ende des Polyproteins bis zu etwa Aminosäure 120 von Fig. 1. Die S-Domäne definiert vermutlich das Hüllprotein des Virions und vermutlich das Matrix (M)-Protein und erstreckt sich vermutlich von etwa Aminosäure 120 bis Aminosäure 400 der Fig. 1. Die NS3-Domäne erstreckt sich von etwa Aminosäure 1050 bis Aminosäure 1640 und stellt vermutlich die virale Protease dar. Die NS4-Domäne erstreckt sich vom Ende von NS3 bis etwa kninosäure 2000. Die Funktion des NS4-Proteins ist gegenwärtig nicht bekannt. Schließlich erstreckt sich die NS5-Domäne von etwa Aminosäure 2000 bis zum Ende des Polyproteins und definiert vermutlich die virale Polymerase.
Die in Fig. 1 gezeigte Sequenz ist die Sequenz des HCV1-Isolats. Es wird erwartet, daß die Sequenzen anderer Stämme des HCVS aus dem Blut sich von der Sequenz in Fig. 1 unterscheiden können, insbesondere in den Hüll (S)- und Nucleocapsid (C)-Domänen. Die Verwendung von HCV-Antigenen mit solch differierenden Sequenzen soll unter den umfang der vorliegenden Erfindung fallen, vorausgesetzt jedoch, daß die Variation nicht signifikant die immunologische Reaktivität des Antigens gegenuber Seren aus mit HCV infizierten Personen erniedrigt.
Im allgemeinen umfassen die HCV-Antigene vollständige oder verkürzte Domänen, wobei die Domänenfragmente leicht auf Antigenität von einem Fachmann abgesucht werden können. Die einzelnen HCV-Antigene, die in der Kombination verwendet werden, umfassen bevorzugt den inmundominanten Anteil (d.h. den Anteil, der in erster Linie für die immunologische Reaktivität des Polypeptins verantwortlich ist) der angegebenen Domäne. Im Falle der C-Domäne ist es bevorzugt, daß das C-Domänen-Antigen einen Hauptteil der vollständigen Sequenz der Domäne umfaßt. Das Antigen mit der Bezeichnung C22 (siehe nachstehendes Beispiel 4) ist besonders bevorzugt. Das 5-Domäne-Antigen umfaßt bevorzugt die hydrophobe Sübdomäne am N-terminalen Ende der Domäne. Diese hydrophobe Subdomäne erstreckt sich von etwa Aminosäure 199 bis zur Aminosäure 328 der Fig. 1. Das HCV-Antigen mit der Bezeichnung S2 (siehe nachstehendes Beispiel 3) ist besonders bevorzugt. Sequenzen stromabwärts der hydrophoben Subdmäne können ggf. in das S-Domäne-Antigen aufgenommen werden.
Ein bevorzugtes NS3-Domäne-Antigen ist das Antigen mit der Bezeichnung C33c. Das Antigen umfaßt die Aminosäuren 1192 bis 1457 der Fig. 1. Ein bevorzugtes NS4-Antigen ist C100, das die Aminosäuren 1569 bis 1931 der Fig. 1 umfaßt. Ein bevorzugtes NS5-Antigen umfaßt die Aminosäuren 2054 bis 2464 der Fig. 1.
Das HCV-Antigen kann in Form eines Polypeptids, bestehend vollständig aus der HCV-Aminosäuresequenz, vorliegen oder es kann für HCV exogene Sequenzen enthalten (d.h. es kann in Form eines Flisionsproteins, das eine exogene Sequenz umfaßt, vorliegen). Im Falle eines rekombinant produzierten HCV-Antigens kann die Produktion des Antigens als Fusionsprotein, wie mit SOD, α-Faktor oder Ubiquitin (vgl. US-Patent Nrn. 4 751 180, 4 870 008 und US-Patentanmeldung SN Nr.390 599, angemeldet am 7. August 1989, die die Expression von SOD-, α-Faktor- und Ubiquitin-Fusionsproteinen beschreiben) die Expressionshöhe erhöhen und/oder die Wasserlöslichkeit des Antigens erhöhen. Füsionsproteine, wie die α-Faktor- und Ubiquitinfusion, werden durch den Expressionswirt prozessiert, wodurch die heterologe Sequenz entfernt wird. Der α-Faktor ist jedoch ein Sekretionssystem, während die Ubiquitinfusionen im Cyloplasma verbleiben.
Ferner kann die Kombination von Antigenen als Fusionsprotein produziert werden. Beispielsweise kann ein kontinuierliches DNA-Fragment, das C22 und C33c oodiert, kombiniert werden, in einen Expressionsvektor doniert werden und zur Expression eines Fusionsproteins von C22 und C33c verwendet werden. Auf ähnliche Weise können Fusionsproteine aus C22 und C100; C22 und S2; C22 und einem NS5-Antigen; C22, C33c und S2; C22, C100 und S2, und C22, C33c, C100 und S2 hergestellt werden. Alternative Fragmente zu den beispielhaft aufgeführten Domänen können ebenfalls verwendet werden.

Herstellung von HCV-Antigenen

Die erfindungsgemaßen HCV-Antigene werden bevorzugt rekombinant oder durch die bekannte chemische Festphasensynthese produziert. Sie können jedoch auch aus dissozuerten HCV oder HCV-Teilchen unter Verwendung von Affinitätschromatographie-Techniken, wobei Antikörper gegen die Antigene verwendet werden, isoliert werden.
Bei Produktion durch rekombinante Techniken können Standardverfahren zur Konstruktion von DNA, die das Antigen codiert, donierung der DNA in Expressionsvektoren, Transformation der Wirtszellen, wie Bakterien-, Hefe-, Insekten- oder Säugerzellen, und Expression einer solchen DNA unter Produktion des Antigens verwendet werden. Wie vorstehend angegeben, kann es zweckdienlich sein, das Antigen als Fusionsprotein zu exprimieren, um die Expression zu erhöhen, die Reinigung zu erleichtern oder die löslichkeit zu erhöhen. Beispiele für spezifische Verfahren zur Produktion repräsentativer HCV-Antigene sind in den nachstehenden Beispielen und in dem US-Patent 5 350 671 beschrieben.

Formulierung von Antigenen zur Verwendung in einem Immunoassay

Die HCV-Antigene können durch ihre Produktion in Form eines FUsionsproteins, bestehend aus zwei oder mehreren Antigenen, durch ihre einzelne Immobilisierung auf einer gemeinsamen festen Matrix oder durch ihre physikalische Vermischung kombiniert werden. Fusionsproteine des Antigens können auch auf einer festen Matrix immobilisiert werden (daran gebunden werden). Verfahren und Mittel zur kovalenten oder nichtkovalenten Bindung von Proteinen an feste Matrizes sind auf dem Fachgebiet bekannt. Die Natur der festen Oberfläche variiert in Anhägigkeit von dem Assayformat. Für Assays, die in Mikrotiterkavitäten durchgeführt werden, ist die feste Oberfläche die Wand der Kavität oder der Vertiefung. Für Assays unter Verwendung von Kügelchen ist die feste Oberfläche die Oberfläche des Kügelchens. In Assays unter Verwendung eines Tauchstabchens (d.h. eines festen Körpers, hergestellt aus einem porösen oder faserartigen Material, wie einem Stoff oder Papier) ist die Oberfläche die Oberfläche des Materials, aus dem das Tauchstabchen hergestellt ist. In Agglutinationsassays kann die feste Oberfläche die Oberfläche aus Latex- -oder Gelatineteilchen sein. Wenn einzelne Antigene an die Matrix gebunden werden, können sie homogen auf der Oberfläche verteilt werden oder darauf in einem Muster, wie Banden, verteilt werden, so daß ein Muster der Antigenbindung unterschieden werden kann.
Einfache Gemische der Antigene umfassen die Antigene in jedem beliebigen geeigneten Lösungsmittel oder Dispersionmedium.

Assayformate unter Verwendung von Kombinationen von Antigenen

Die HCV-Antigene können in tatsächlich jedem beliebigen Assayformat, bei dem ein bekanntes Antigen zum Nachweis von Antikörpern verwendet wird, verwendet werden. Eine gemeinsame Besonderheit all dieser Assays ist die Tatsache, daß das Antigen mit der Korperkomponente, die vermutlich HCV-Antikörper enthält, unter Bedingungen in Kontakt gebracht wird, die die Bindung des Antigens an einen beliebigen derartigen in der Komponente vorhandenen Antikörper erlauben. Solche Bedingungen sind typischerweise die physiologische Temperatur, der pH-Wert und die Ionenstärke unter Verwendung eines Überschusses an Antigen. Auf die Inkubation des Antigens mit der Probe folgt die Detektion der aus dem Antigen bestehenden Immunkomplexe.
Die Anordnung der Immunoassays unterliegt einer großen Variationsbreite, und viele Formate sind auf dem Eachgebiet bekannt. Protokolle können beispielsweise feste Träger oder eine Immunpräzipitation verwenden. Die meisten Assays betreffen die Verwendung eines markierten Antikörpers oder Polypeptins. Die Marker können beispielsweise enzymatische, fluoreszierende, chemilumineszierende, radioaktive oder Farbstoffmoleküle sein. Ansays, die die Signale aus dem Immunokomplex amplifizieren, sind ebenfalls bekannt. Beispiele dafür sind Assays, in denen Biotin und Avidin verwendet werden und Enzym-markierte und -vermittelte Immunoassays, wie ELISA-Assays.
Der Immunoassay kann ohne Beschränkung in einem heterogenen oder in einem hornogenen Format stattfinden und ein standardtyp oder kompetitiver Typ sein. In einem heterogenen Format wird das Polypeptid typischerweise an eine feste Matrix oder einen festen Träger gebunden, um die Trennung der Probe von dem Polypeptid nach der Inkubation zu erleichtern. Beispiele für feste Träger, die verwendet werden können, sind Nitrocellulose (z.B. in einer Membran oder einer Mikrotiterkavitätsform), Polyvinylchlorid (z.B. in Folien oder Mikrotiterkavitäten), Polystyrollatex (z.B. in Kügelchen oder Mikrotiterplatten), Polyvinylidenfluorid (bekannt als Immulon ), diazotiertes Papier, Nylonmembranen, aktivierte Kügelchen und Protein A-Kügelchen. Beispielsweise können Dnnatech Immulon 1- oder Immulon 2-Mikrotiterplatten oder 6,4 mm (0,25 Inch) -Polystyrolkügelchen (Precision Plastic Ball) in dem heterogenen Format verwendet werden. Der feste Träger, der die antigenen Polypeptide enthält, wird typischerweise nach dessen Abtrennung von der Testprobe und vor der Detektion der gebundenen Antikörper gewaschen. Sowohl Standard als auch kompotitive Formate sind auf dem Fachgebiet bekannt.
In einem homogenen Format wird die Testprobe mit der Kombination von Antigenen in Lösung inkubiert. Beispielsweise kann dies unter Bedingungen stattfinden, die alle gebildeten Antigen-Antikörper-Komplexe prazipitieren. Sowohl Standard- als auch kompotitive Formate für diese Assays sind auf dem Fachgebiet bekannt.
In einem Standardformat wird die Menge der HCV-Antikörper, die den Antikörper-Antigen-Komplex bilden, direkt überwacht. Dies kann erzielt werden, indem man bestimmt, ob die markierten antixenogenen Antikörper (z.B. antihuman), die ein Epitop auf Anti-HCV-Antikörpern erkennen, infolge von Kooplexbildung binden. In einem koppetitiven Format wird die Menge der HCV-Antikörper in der Probe abgeleitet, indem man die kompetitive Wirkung auf die Bindung einer bekannten Menge an markiertem Antikörper (oder eines anderen konkurrierenden Liganden) in dem Komplex überwacht.
Gebildete Komplexe, umfassend einen Anti-HCV-Antikörper (oder im Falle von kompotitiven Assays die Menge des konkurrierenden Antikörpers), werden durch jede beliebige einer Anzahl bekannter Techniken in Abhängigkeit von dem Format nachgewiesen. Beispielsweise können nichtmarkierte HCV-Antikörper in dem Komplex unter Verwendung eines Konjugats aus Antixenogen-Ig, komplexiert mit einem Marker (z.B. einem Enzymmarker) nachgewiesen werden.
In einem Immunpräzipitations- oder Agglutinationsassayformat bildet die Reaktion zwischen den HCV-Antigenen und dem Antikörper ein Netzwerk, das aus der lösung oder Suspension ausfällt und eine sichtbare Schicht oder einen sichtbaren Film aus Präzipitat bildet. Wenn kein Anti-HCV- Antikörper in der Testprobe vorhanden ist, wird kein sichtbares Präzipitat gebildet.
Die HCV-Antigene werden typischerweise in Form eines Kits zur Verwendung in diesen Immunoassays gepackt. Das Kit enthält normalerweise in separaten Behältnissen die Kombination von Antigenen (entweder bereits an eine feste Matrix gebunden oder getrennt mit Reagentien, zu deren Bindung an die Matrix), Kontroll-Antikörper-Formulierungen (positiv und/oder negativ), den markierten Antikörper, wenn das Assayformat diesen benötigt, und signalerzeugende Reagentien (z.B. Enzymsubstrat), wenn der Marker nicht direkt ein Signal erzeugt. Anweisungen (z.B. schriftlich, als Band, VOR, CD-ROM etc.) zur Durchführung des Assays sind üblicherweise in dem Kit enthalten.
Die folgenden Beispiele sollen die Erfindung erläutern und dienen nicht dazu, die Erfindung in irgendeiner Weise zu beschränken.

Beispiel 1: Synthese des HCV-Antigens C33c

Das HCV-Antigen C33c enthält eine Sequenz aus der NS3-Domäne. Genau, es umfaßt die Aminosäuren 1192 bis 1457 der Fig. 1. Dieses Antigen wurde in Bakterien als Fusionsprotein mit menschlicher Superoxid-Disinutase (SOD) wie folgt produziert. Der Vektor pSODcf1 (Steiner et al. (1986), J. Virol. 58:9) wurde vollständig mit EcoRI und Bainfil gespalten, und das so erhaltene EcoRI-BamHI-Fragment wurde an den folgenden Linker unter Bildung von pcf1EF ligiert:
Ein cDNA-Clon, der die Aminosäuren 1192 bis 1457 codiert und EcoRI-Enden besaß, wurde in pcf1EF unter Bildung von pcf1EF/C33c insertiert. Diese Expressionskonstruktion wurde in E. coli-Zellen transformiert.
Die Transformanten wurden verwendet, um ein Fusionsprotein aus SOD am N-Terminus und im Leseraster das C33c-HCV-Antigen am C-Terminus zu exprimieren. Die Expression wurde durch Inokulieren von 1500 ml Luria- Brune, enthaltend Ampicillin (100 µg/ml) mit 15 ml einer Über-Nacht-Kultur der Transformanten durchgeführt. Die Zellen wurden bis zu einer O.D. von 0,3 gezüchtet, IPTG wurde zugesetzt, wodurch eine Endkonzentration von 2 mM erhalten wurde, und das Wachstum wurde fortgesetzt, bis die Zellen eine Dichte von 1 O.D. erreichten; zu diesem Zeitpunkt wurden sie durch Zentrifugation bei 3.000 x g bei 4ºC für 20 min geerntet. Die gepackten Zellen können bei -80ºC mehrere Nonate lang gelagert werden.
Um das SOD-C33c-Polypeptid zu reinigen, wurden die bakteriellen Zellen, in denen das Polypeptid esprimiert wurde, osmotisch geschockt und mechanisch aufgebrochen. Die SOD-C33c enthaltende unlösliche Fraktion wurde isoliert und einer Differentialextraktion mit einer alkalischen NaCl-Iösung unterworfen, und das Fusionspolypeptid in dem Extrakt wurde chromatographisch auf säulen aus S-Sepharose ( ) und Q-Sepharose ( ) gereinigt.
Der aus dem osmotischen Schock und dem mechanischen Aufbrechen hervorgehende Rohextrakt wurde nach dem folgenden Verfahren hergestellt. 1 g der gepackten Zellen wurde in 10 ml einer Lösung aus 0,02 M Tris-HCl, pH 7,5, 10 mM EDTA, 20 % Saccharose suspendiert und 10 min lang auf Eis in kubiert. Die Zellen wurden dann durch Zentrifugation mit 4.000 x g für 15 min bei 4ºC pelletiert. Nach Entfernen des Überstands wurden die Zellpellets in 10 ml Puffer Al (0,01 M Tris-HCl, pH 7(5, 1 irm EDTA, 14 mM β- Mercaptoethanol [DME] resuspendiert und 10 min lang auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden erneut bei 4.000 x g 15 min lang bei 4ºC pelletiert. Nach Entfernen des klaren Uberstands (periplasmatische Fraktion 1) wurden die Zellpellets in Puffer A1 resuspendiert, 10 min lang auf Eis inkubiert und erneut 15 min lang mit 4.000 x g bei 4ºC zentrifugiert. Der klare Überstand (periplasmatische Fraktion II) wurde entfernt, und das Zeilpellet in 5 ml Puffer A2 (0,02 M Tris-HCl, pH 7,5, 14 mM BME, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF) resuspendiert. Um die Zellen aufzubrechen, wurde die Suspension (5 ml) und 7,5 ml Dyno-mill, mit bleifreier Säure gewaschene Glaskugelchen (Durchmesser 0,01 bis 0,15 mm) (erhalten von Glen-Nills, Inc.) in ein Falcon-Röhrchen gegeben und mit Höchstgeschwindigkeit 2 min lang verwirbelt. Anschließend wurde auf Eis mindestens 2 min lang abgekühlt. Das Verwirbelungskühlverfahren wurde weitere viermal wiederholt. Nach dem Verwirbeln wurde die Aufschlämmung durch einen Sinterglastrichter mit sanfter Absaugung filtriert. Die Glas kügelchen wurden zweimal mit Puffer A2 gewaschen, und das Filtrat und die Waschwässer wurden vereinigt.
Die unlösliche Fraktion des Rohextrakts wurde durch 15minütige Zentrifugation mit 20.000 x g bei 4ºC gewonnen, zweimal mit 10 ml Puffer A2 gewaschen und in 5 ml MILLI-Q ( )-Wasser resuspendiert.
Eine Fraktion, die SOD-C33c enthielt, wurde von dem unlöslichen Material durch Zugabe von NaOH (2 M) und NaCl (2 M) zu der Suspension unter Erhalt einer Endkonzentration von jeweils 20 mM, Verwirbeln des Gemisches für 1 min, Zentrifugation für 20 min bei 20.000 x g bei 4ºC und Zurückhalten des Überstands isoliert.
Um SOD-C33c auf S-Sepharose ( ) zu reinigen, wurde die Überstandsfraktion auf eine Endkonzentration von 6 M Harnstoff, 0,05 N Tris-HCl, pH 7,5, 14 mM BME, 1 mM EDTA eingestellt. Diese Fraktion wurde dann auf eine Säule aus S-Sepharose ( )-Fast-Flow (1,5 x 10 cm), die mit Puffer B (0,05 M Tris-HCl, pH 7,5, 14 mM BME, 1 mM EDTA) äquilibriert worden war, aufgebracht. Nach dem Aufbringen wurde die Säule mit zwei Säulenvolumina Puffer B gewaschen. Der Durchfluß und die Waschfraktion wurden gewonnen. Die Fließgeschwindigkeit der Aufbringung und des Waschens betrug 1 ml/min; die gewonnenen Fraktionen betrugen 1 ml. Um die SOD-C33c enthaltenden Fraktionen zu identifizieren, wurden Aliquote der Fraktionen elektrophoretisch auf 10%igen Polyacrylamidgelen, die SDS enthielten, analysiert und anschließend mit Coomassie-Blau gefärbt. Die Fraktionen können auch mittels Western-Blots unter Verwendung eines Antikörpers gegen SOD analysiert werden. SOD-C33c enthaltende Fraktionen wurden vereinigt.
Die weitere Reinigung von SOD-C33c erfolgte auf einer Q-Sepharose ( )-Säule (1,5 x 5 cm), die mit Puffer B äquilibriert wurde. Die vereinigten Fraktionen, die SOD-C33c enthielten, die aus der Chromatographie auf S-Sepharose ( ) erhalten worden waren, wurden auf die Säule aufgebracht. Die Säule wurde dann mit Puffer B gewaschen und mit 60 ml eines Gradienten aus 0,0 bis 0,4 M NaCl in Puffer B eluiert. Die Fließgeschwindigkeit für die Aufbringung, Waschung und Elution betrug 1 ml/min; die gewonnenen Fraktionen betrugen 1 ml. Alle Fraktionen aus der Q-Sepharose ( )-Säule wurden, wie für die S-Sepharose ( )-Säule beschrieben, analysiert. Der Gipfel an SOD-C33c elulerte von der Säule bei etwa 0,2 M NaCl.
Das aus der Q-Sepharose -Säule erhaltene SOD-C33c war zu mehr als 90 % rein, wie durch die Analyse auf den Polyacrylamid-SDS-Gelen und dem Immunblot unter Verwendung eines gegen menschliche SOD gerichteten monodonalen Antikörpers beurteilt wurde.

Beispiel 2: Synthese des HCV-Antigens C100

Das HCV-Antigen C100 enthält Sequenzen aus den NS3- und NS4-Domänen. Genauer, es umfaßt die Aminosäuren 1569 bis 1931 aus Fig. 1. Dieses Antigen wurde in Hefe erzeugt. Ein cDNA-Fragment aus 1270 bp, das die vorstehenden Aminosäuren codiert, und EcoRI-Enden hatte, wurde hergestellt.
Die Konstruktion eines Hefe-Expressionsvektors, worin das Fragment direkt an den S. cerevisiae-ADH2/GAP-Promotor fusioniert war, wurde nach einem Protokoll durchgeführt, das die Amplifikation der C100-sequenz unter Verwendung eines PCR-Verfahrens, gefolgt von Ligierung der amplifizierten Sequenz, in einen donierungsvektor umfaßte. Nach der donierung wurde die C100-Sequenz herausgeschnitten und mit einer Sequenz, die den ADH2/GAP-Promotor enthielt, an ein großes Fragment eines Hefevektors ligiert, wodurch ein Hefe-Expressionsvektor erhalten wurde.
Die PPR-Amplifikation von C100 wurde unter Verwendung des Vektors pS3-56C100m, der durch Spaltung mit SalI linearisiert worden war, als Matrize durchgeführt. pS3-56, das ein pBR322-Derivat ist, enthält eine Expressionskassette, die aus dem hybriden ADH2/GAPDH-Hefepromotor stromaufwärts des Gens für menschliche Superoxid-Dismutase und einem stromabwärtigen α-Faktor-Transkriptionsterminator besteht.
Die Oligonucleotid-Primer, die zur Amplifikation verwendet wurden, wurden so entwickelt, daß sie die donierung in den Expressionsvektor erleichterten und daß sie ein Translations-Termnnations-Codon einführten. Genau, neue 5'-HindIII- und 3'-SalI-Spaltstellen wurden mit PCR-Oligonudeotiden erzeugt. Das Oligonucleotid, das die SalI-Spaltstelle enthalt, codiert auch die doppelten Terminations-Codons TAA und TGA. Das Oligonucleotid, das die HindIII-Spaltstelle enthält, enthält auch eine nichttranslatierte Leader-Sequenz, abgeleitet von dem pgap63-Gen, das unmittelbar stromaufwärts des AUG-Codons angeordnet ist. Das pEco63GAPDH- Gen wurde von Holland und Holland (1980) und von Kniskern et al. (1986) beschrieben. Die für die direkte Expression von C100M verwendeten PCR- Prrner-Sequenzen waren:
Die Amplifikation durch PCR unter Verwendung der Primer und der Matrize wurde mit einem Cetus-Perkin-Elmer-PCR-Kit durchgeführt und wurde nach den Angaben des Herstellers durchgeführt. Die PCR-Bedingungen betrugen 29 Zyklen bei 94ºC für 1 min, 37ºC für 2 min, 72ºC für 3 min, und die abschließende Inkubation wurde 10 min bei 72ºC durchgeführt. Die DNA kann über Nacht bei 4ºC oder -20ºC gelagert werden.
Nach der Amplifikation wurden die PCR-Produkte mit HindIII und SalI gespalten. Das Hauptprodukt aus 1,1 kb wurde elektrophoretisch auf einem Gel gereinigt, und das eluierte gereinigte Produkt wurde mit einem großen SalI-HindIII-Fragment von pBR322 ligiert. um die korrekten Rekombinanten zu isolieren, wurden kompotente HB101-Zellen mit den rekombinanten Vektoren transformiert, und nach der donierung wurden die gewünschen Rekombinanten auf der Basis der vorhergesagten Größe von HindIII-SalI-Fragmenten, die aus den Clonen herausgeschnitten wurden, identifiziert. Einer der done, der ein HindIII-SalI-Fragment mit korrekter Größe enthielt, wurde als pBR322/C100&supmin;d bezeichnet. Die Bestätigung, daß dieser Clon amplifiziertes C100 enthielt, erfolgte durch direkte Sequenzanalyse des HINDIII-SalI-Fragments.
Der Expressionsvektor, der C100 enthielt, wurde durch Ligieren des Hindlij-SalI-Fragments aus pBR322/C100&supmin;d an ein 13,1 kb-BamHI-SalI-Eragment von pBS24.1 und ein 1369 bp-BamHI-HindIII-Fragment, das den ADH2/GAP-Promotor enthielt, konstruiert. (Das zuletzt genannte Frageent ist in der EP-A-164 556 beschrieben). Das ADH2/GAP-Promotorfragment wurde durch Spalten des Vektors pPGAP/AG/HindIII mit HindIII und BamHI, gefolgt von einer Reinigung des 1369 bp-Fragments auf einem Gel erhalten.
Kompotente HB101-Zellen wurden mit den rekombinanten Vektoren transformiert; und korrekte Rekombinante wurden durch Erzeugen eines 2464 bp-Fragments und eines 13,1 kb-Fragments, erzeugt durch BamHI- und SalI-Spaltung der donierten Vektoren, identifiziert. Einer der donierten korrekten rekombinanten Vektoren wurde als pC100&supmin;d#3 bezeichnet.
Um C100 zu exprimieren, wurden kompotente Zellen des Saccharomyces cerevisiae-Stamms AB122 (MATa leu2 ura3-53 prb 1-1122 pep4-3 prcl- 407[cir-0]) mit dem Expressionsvektor pC100&supmin;d#3 transformiert. Die transformierten Zellen wurden auf URA-Sorbit plattiert, und einzelne Transformanten wurden dann auf Leu&supmin;-Platten ausgestrichen.
Die einzelnen Clone wurden in Leu&supmin;-, ura&supmin;-Medium mit 2 % Glukose bei 30ºC 24 bis 36 h lang gezeichtet. 1 l Hefeextrakt-Pepton-Medlum (YEP), das 2 % Glukose enthielt, wurde mit 10 ml der Über-Nacht-Kultur inokuliert, und die so erhaltene Kultur wurde bei 30ºC mit einer Ruhrgeschwindigkeit von 400 UpM und einer Belüftungsrate von 1 l Luft pro 1 l Medium pro min (d.h. 1 vvm) für 48 h lang gezüchtet. Der pH-Wert des Mediums wurde nicht kontrolliert. Die Kultur wurde in einem BioFlo II-Fermentor, hergestellt von New Brunswick Science Corp., bebrutet. Nach der Fermentation wurden die Zellen isoliert und auf C100-Expression analysiert.
Die Analyse auf durch die transformierten Zellen exprimiertes C100- Polypeptid wurde an Gesamtzell-Lysaten und Rohextrakten, hergestellt aus einzelnen Hefekolonien, erhalten von den Leu&supmin;-Platten, durchgeführt. Die Zell-Lysate und die Rohextrakte wurden durch Elektrophorese auf SDS-Polyacrylamidgelen und durch Western-Blots analysiert. Die Western-Blots wurden mit polydonalen Kaninchen-Antikörpern gegen das in Hefe exprimierte SOD-C100-Polypeptid abgesucht. Die erwartete Größe des C100-Polypeptids beträgt 364 Aminosäuren. Gemaß Gelanalyse besitzt das exprimierte Polypeptid ein MGr von 39,9 K.
Beide analytischen Verfahren zeigten, daß das exprimierte C100- Polypeptid in Gesamtzell-Lysaten vorhanden war, aber aus den Rohextrakten fehlte. Diese Ergebnisse legen nahe, daß das exprimierte C100-Polypeptid unlöslich sein kann.

Beispiel 3: Expression des HCV-Antigens 52

Das HCV-Antigen 52 enthält eine Sequenz aus dem hydrophoben N-Terminus der 5-Domäne. Es umfaßt die Aninosäuren 199 bis 328 der Eig. 1.
Das Protokoll zur Konstruktion des Expressionsvektors, der das S2- Polypeptid codiert und zu dessen Expression in Hefe, war dem analog, das für die Expression des in Beispiel 2 beschriebenen C100-Polypeptids verwendet wurde.
Die Matrize für die PCR-Reaktion war der Vektor pBR322/Pil4a, der durch Spaltung mit Hindih linearisiert worden war. Pil4a ist ein cDNA- Clon, der die Aminosäuren 199 bis 328 codiert.
Die als Primer zur Amplifikation mittels PCR der S2 codierenden Sequenz verwendeten Oligonudeotide waren die folgenden:
Für die 5'-Region der S2-Sequenz:
und
für die 3T-Region der S2-Sequenz:
Der Primer für die 5'-Region führt eine Hindlij-Spaltstelle und ein ATG-Startcodon in das auplifizierte Produkt ein. Der Primer für die 3'- Region führt Translations-Stoppcodons und eine SalI-Spaltstelle in das amelifizierte Produkt ein.
Die PCR-Bedingungen waren 29 Zyklen von 94ºC für 1 min, 37ºC für 2 min, 72 ºC für 3 min und die abschließende Inkubation erfolgte bei 72 ºC für 10 min.
Das Hauptprodukt der PCR-Reaktion war ein 413 bp-agment, das über ein Gel gereinigt wurde. Das gereinigte Fragment wurde an das große Fragment, das aus pBR322, gespalten mit HindIII erhalten worden war und an das Sah-Fragment ligiert, wodurch das Plasmid pBR322/S2d erhalten wurde.
Die Ligierung des 413 bp-HindIII-SalI-S2-Fragments mit dem 1,36 kb- BamHI-HindIII-Fragment, das den ADH2/GAP-Promotor enthielt und mit dem großen BamHI-SalI-Fragment des Hefevektors pBS24.1 ergab rekombinante Vektoren, die doniert wurden. Die korrekten rekottibinanten Vektoren wurden durch die Anwesenheit eines 1,77 kb-Fragments nach Spaltung mit BamHI und SalI identifiziert. Ein aus der amplifizierten Sequenz konstruierter Expressionsvektor, der die Sequenz, die S2 codiert, in direkter Fusion an den ADH2/GAP-Promotor enthält, wird als pS2d#9 identifiziert.

Beispiel 4: Synthese des HCV-C-Antigens

Das HCV-Antigen C22 stammt von der C-Demäne. Es umfaßt die Aminosäuren 1 bis 122 der Fig. 1.
Das Protokoll zur Konstruktion des Expressionsvektors, der das C- Polypeptid codiert und für dessen Expression in Hefe, war dem analog, das zur Expression des C100-Polypeptids verwendet wurde, welches vorstehend beschrieben ist, ausgenommen die folgenden Bedingungen.
Die Matrize für die PCR-Reaktion war pBR322/Ag30a, das mit HindIII linearisiert worden war. Ag30 ist ein cDNA-Clon, der die Aninnosäuren 1 bis 122 codiert. Die als Primer zur Amplifikation mittels PCR der C-codierenden Sequenz verwendeten Oligonucleotide waren die folgenden:
Für die 5'-Region der C-Sequenz:
und
für die 3'-Region der C-Sequenz:
Der Primer für die 5'-Region führt eine HindIII-Spaltstelle in das amplifizierte Produkt ein, und der Primer für die 3'-Region führt Translations-Stoppcodons und eine SalI-Spaltstelle ein. Die PCR wurde für 29 Zyklen von 94ºC für 1 min, 37ºC für 2 min, 72ºC für 3 min durchgeführt, und die abschließende Inkubation erfolgte 10 min lang bei 72ºC.
Das Hauptprodukt der PCR-Amplifikation ist ein 381 bp-Polynucleotid. Die Ligierung dieses Fragments mit dem SalI-HindIII großen SalI- HindIII-Fragment von pBR322 ergab das Plasmid pBR322/C2.
Die Ligierung des 381 b-HindIII-SalI-C-codierenden Fragments, herausgeschnitten aus pBR322/C2 mit dem 1,36 kb-BamHI-HINDIII-Fragment, das den ADH2/GAP-Promotor enthielt, und mit dem großen BamHI-SalI-Fragment des Hefevektors pBS24.1 ergab rekombinante Vektoren, die doniert wurden. Die korrekten rekombinanten Vektoren wurden durch die Anwesenheit eines 1,74 kb-Fragments nach Spaltung mit BamHI und SalI identifiziert. Ein aus der amplifizierten Sequenz konstruierter Expressionsvektor, der die Sequenz, die C in direkter Fusion an den ADH2/GAP-Promotor codiert, enthalt, wird als pC22 identifiziert.
Die Analyse auf das von den transformierten Zellen exprimierte C- Polypeptid wurde an Gesamt-Zellysaten und an, aus einzelnen Hefekolonien, die aus den Leu&supmin;-Platten erhalten worden waren, hergestellten Rohextrakten durchgeführt. Die Zellysate und die Rohextrakte wurden elektrophoretisch auf SDS-Polyacrylamidgelen analysiert. Das C-Polypeptid besitzt vermutlich 122 Aminosäuren, und durch Gelanalyse besitzt das exprimlerte Polypeptid ein MGr von etwa 13,6 Kd.

Beispiel 5: Synthese des NS5-Polypeptids

Dieses Polypeptid enthält eine Sequenz von dem N-Terminus der NS5- Domäne. Genauer, umfaßt es die Aminosäuren 2054 bis 2464 der Fig. 1. Das Protokoll für die Konstruktion des Expressionsvektors, der das NS5-Polypeptid codiert, und zu dessen Expression waren dem, das für die Espression von C33c verwendet wurde, analog (siehe Beispiel 1).

Beispiel 6: Radioimmunoassay (RIA) auf Antikörper gegen HCV

Die HCV-Antigene der Beispiele 1 bis 5 wurden in einem RIA-Format auf inre Fähigkeit, Antikörper gegen HCV im Serum von Patienten mit einer klinischen Diagnose von HCV (Non-A, Non-B) und in Serum von Blut von bezahlten Blutspendern nachzuweisen, getestet.
Der RIA beruhte auf dem Verfähren von Tsu und Herzenberg (1980) in SELECTED METHODS IN CELLULAR IMMUNOLOGY (W.H. Freeman & Co.), S.373-391. Allgemein wurden Mikrotiterplatten (Immulon 2, Removeawell Strips) mit gereinigtem HCV-Antigen beschlchtet. Die beschlchteten Platten werden mit den Senirproben oder geeigneten Kontrollen inkubiert. Während der Inkubation wird der Antikörper, sofern vorhanden, immunologisch an das Festphasen-Antigen gebunden. Nach der Entfernung des nichtgebundenen Materials und Waschen der Mikrotiterplatten werden Komplexe von meschlichem Antikörper-NANBV-Antigen durch Inkuation mit ¹²&sup5;I-markiertem Schaf-Anti- Mensch-Immunglobulin nachgewiesen. Nichtgebundener markierter Antikörper wird durch Aspiration entfernt, und die Platten werden gewaschen. Die Radioaktivität in den einzelnen Kavitäten wird bestimmt. Die Menge des gebundenen menschlichen Anti-HCV-Antikörpers ist der Radioaktivität in der Kavität proportional.
Genauer, 100 µl Aliquote, enthaltend 0,1 bis 0,5 ug des HCV-Antigens in 0,125 M Na-Boratpuffer, pH 8,3, 0,075 M NaCl (BBS) wurden jeder Kavität einer Mikrotiterplatte (Dynatech Immulon 2 Removeawell Strips) zugesetzt. Die Platte wurde bei 4ºC über Nacht in einer Feuchtkammer inkubiert, wonach die Antigenlösung entfernt wurde, und die Kavitäten wurden dreimal mit BBS, enthaltend 0,02 % Triton X-100 ( ) (BBST) gewaschen. um nichtspezifische Bindung zu verhindem, wurden die Kavitäten mit Rinderserumalbumin (BSA) durch Zugabe von 100 µl einer 5 mg/ml-Lösung von BSA in BBS, gefolgt von einer Inkubation bei Raumteriperatur, für 1 h beschlchtet. Nach dieser Inkubation wurde die BSA-Lösung entfernt. Die Antigene in den beschichteten Kavitäten wurden mit Serum durch Zugabe von 100 µl Serumproben, verdunnt 1:100 in 0,01 M Na-Phosphatpuffer, pH 7,2, 0,15 M NaCl (pBS), enthaltend 10 mg/ml BSA, und Inkubieren der serumhaltigen Kavitäten für 1 h bei 37ºC umgesetzt. Nach der Inkubation wurden die Serumproben durch Aspiration entfernt, und die Kavitäten wurden fünfmal mit BBST gewaschen. An das Antigen gebundener Antikörper wurde durch die Bindung von ¹²&sup5;-I-markiertem F' (ab) &sub2;-Schaf-Anti-Mensch-IgG an die beschichteten Kavitäten bestirimt. Aliquote der 100 µl der markierten Sonde (spezifische Aktivität 5 bis 20 µCi/ug) wurden jeder Kavität zugesetzt, und die Platten wurden bei 37 ºC 1 h lang inkubiert. Anschließend wurde überschüssige Sonde durch Aspiration entfernt, und es wurde fünfmal mit BBST gewaschen. Die Menge der in jeder Kavität gebundenen Radioaktivität wurde durch Aufzahlen in einem Zähler zum Nachweis der γ-Strahlung bestimmt.
Die nachstehende Tabelle 1 zeigt die Ergebnisse der Tests an Seren von Patienten mit einer HCV-Diagnose. Tabelle 1 PATIENT ANTIGEN PATIENT ANTIGEN PATIENT ANTIGEN PATIENT ANTIGEN PATIENT ANTIGEN PATIENT ANTIGEN crypto PATIENT ANTIGEN
AVH = akute virale Hepatitis
CVH = chronische virale Hepatitis
PTVH = virale Hepatitis nach Transfusion
IVDA intravenöser Drogensüchtiger
crypto = cryptogene Hepatitis
NOS = nicht offensichtliche Quelle
P = positiv
N = negativ
Gemaß diesen Ergebnissen reagierte kein einzelnes Antigen mit allen Seren. C22 und C33c waren die reaktivsten, und S2 reagierte mit einigen Seren aus einigen vermutlich akuten HCV-Fällen, mit denen kein anderes Antigen reagierte. Basierend auf diesen Ergebnissen ist die Kombination aus zwei Antigenen, die den größten Nachweisbereich ergeben wurden, C22 und C33c. Wenn man ein Maximum an akuten Infektionen nachweisen möchte, Inüßte S2 in die Kombination aufgenommen werden.
Die nachstehende Tabelle 2 zeigt die Ergebnisse der Testung an bezahlten Blutspendern. Tabelle 2 Antigene Spender Antigene Spender Antigene Spender Antigene Spender Antigene Spender Antigene Spender Antigene Spender
Die Ergebnisse an den bezahlten Spendern bestätigen allgemein die Ergebnisse aus den Seren von infizierten Individuen.

Beispiel 7: ELISA-Bestimmungen von HCV-Antikörpern unter Verwendung einer Kombination von HCV-Antigenen

Mit einer Kombination von C22- und C33c-Antigenen beschichtete Platten werden wie folgt hergestellt. Eine Lösung aus Beschlchtungspuffer (50 mM Na-Borat, pH 9,0), 21 ml/Platte, BSA (25 µg/ml), C22 und C33c (jeweils 2,50 µg/ml) wird kurz vor der Zugabe zu den Removeawell-Immulon-1-Platten (Dynatech Corp.) hergestellt. Nach 5minütigem Vermischen wird 0,2 ml/Kavität Lösung den Platten zugesetzt; sie werden bedeckt und 2 h lang bei 37ºC inkubiert. Danach wird die Lösung abgesaugt. Die Kavitäten werden einmal mit 400 µl Waschpuffer (100 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 140 mM Natriumchlorid, 0,1 % (Gew./Vol.) Casein, 1 % (Gew./Vol.) Triton X-100 ( ), 0,01 % (Gew./Vol) Thimerosal) gewaschen. Nach Entfernen der Waschlösung werden 200 µl/Kavität Postcoat-Lösung (10 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 150 mM Natriumchlorid, 0,1 % (Gew./Vol) Casein, 3 % Saccharose und 2 mM Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)) zugesetzt, die Platten werden locker bedeckt, um die Verdeapfung zu verhindem, und sie werden bei Raumterrperatur 30 min lang stehengelassen. Die Kavitäten werden dann abgesaugt, um die Lösung zu entfernen und über Nacht trocken lyophilisiert, ohne Erhitzen im Lager. Die hergestellten Platten können bei 2 bis 8ºC in versiegelten Aluminiembeuteln mit einem Trockenmittel (3 g Sorb-it - Packs) gelagert werden.
Um die ELISA-Bestimmung durchzuführen, werden 20 µl Serumprobe oder Kontrollprobe einer Kavität, die 200 µl eines Probenverdünnungsmittels (100 mM Natriumphosphat, pH 7,4, 500 mM Natriumchlorid, 1 mM EDTA, 0,1 % (Gew./Vol.) Casein, 0,01 % (Gew./Vol.) Thimerosal, 1 % (Gew./Vol.) Triton X-100 ( ), 100 µg/ml Hefeextrakt) enthält, zugesetzt. Die Platten werden versiegelt und 2 h lang bei 37ºC inkubiert, wonach die Lösung durch Aspiration entfernt wird. Die Kavitäten werden dreimal mit 400 µl Waschpuffer (Phosphat-gepufferte Kochsalzlösung (pBS), enthaltend 0,05 % Tween 20 ( ) gewaschen. Die gewaschenen Kavitäten werden mit 200 ul Maus-Anti-menschiiches IgG-Meerrettichperoxidase (HPP) -Konj ugat, enthalten in einer Lösung aus Ortho-Konjugatverdünner (10 mM Natriumphosphat, pH 7,2, 150 mM Natriumchlorid, 50 % (Vol./Vol) fötales Rinderserum, 1 % (Vol./Vol.) hitzebehandeltes Pferdeserum, 1 mM K&sub3;Fe(CN)&sub6;, 0,05 % (Gew./Vol.) Tween 20, 0,02 % (Gew./Vol.) Thimerosal) behandelt. Die Behandlung dauert 1 h bei 37ºC. Die Lösung wird durch Aspiration entfernt, und die Kavitäten werden dreimal mit 400 ml Waschpuffer gewaschen, der ebenfalls durch Aspiration entfernt wird. Um die Menge des gebundenen Enzymkonjugats zu bestirnmen, werden 200 µl Substratlösung (10 mg o-Phenylendiamindihydrochlorid pro 5 ml Entwickierlösung) zugesetzt. Die Entwicklerlösung enthält 50 mM Natriumcitrat, eingestellt auf pH 5,1 mit Phosphorsäure und 0,6 µl/ml 30%iger H&sub2;O&sub2;. Die die Substratlösung enthaltenden Platten werden im Dunkeln 30 min lang bei Raumtemperatur inkubiert, die Reaktionen werden durch die Zugabe von 50 µl/ml 4 N Schwefelsäure gestoppt, und die OD-Werte werden bestimmt.
Auf ähnliche Weise können ELISAs unter Verwendung von Füsionsproteinen von C22 und C33c, und C22, C33c, und S 2 und Kombinationen von C22 und C100, C22 und S2, C22 und einem NS5-Antigen, C22, C33c und S2, und C22, C100 und S2 durchgeführt werden.

Claims

1. Kombination von Hepatitis-C-virus-(HCV-)Epitopsequenzen in einem oder mehreren Polypeptid(en), hergestellt durch chemische Synthese oder rekombinante Expression, immobilisiert auf der Oberfläche einer festen Matrix, mit der Eignung zum Nachweis von HCV in einem Immunoassay, umfassend:

(a) eine erste Epitopsequenz aus der C-Domäne des HCV-Polyproteins;

(b) eine zweite Epitopsequenz aus einer zweiten Domäne des HCV-Polyproteins, wobei die Domäne:

(i) die NS3-Domäne des HCV-Polyproteins;

(ii) die NS4-Domäne des HCV-Polyproteins; oder

(iii) die NS5-Domäne des HCV-Polyproteins ist; und

(c) eine dritte Epitopsequenz aus einer dritten Domäne des HCV-Polyproteins, wobei die Domäne:

(i) die NS3-Domäne des HCV-Polyproteins;

(ii) die NS4-Domäne des HCV-Polyproteins; oder

(iii) die NS5-Domäne des HCV-Polyproteins ist;

wobei die dritte Domäne sich von der zweiten Domäne unterscheidet;

mit der Maßgabe, daß die Kombination nicht das Peptid p1

mit C100-3, das Peptid p35 mit C100-3 oder das Peptid p99

mit C100-3 ist.

2. Kombination nach Anspruch 1, worin die zweite Domäne NS3 ist.

3. Kombination nach Anspruch 1, worin die zweite Domäne NS4 ist.

4. Kombination nach Anspruch 1, umfassend:

(a) eine erste Epitopsequenz aus der C-Domäne des HCV-Polyproteins;

(b) eine zweite Epitopsequenz aus der NS3-Domäne des HCV-Polyproteins; und

(c) eine dritte Epitopsequenz aus der NS4-Domäne des HCV-Polyproteins.

5. Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 4, worin die feste Matrix die Oberfläche einer Kavität einer Mikrotiterpiatte, eines Kügelchens oder eines Tauchstäbchens ist.

6. Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die ersten, zweiten und dritten Epitopsequenzen in den ersten, zweiten bzw. dritten Polypeptiden in individueller Bindung an die feste Matrix enthalten sind.

7. Kombination nach Anspruch 6, worin die feste Matrix ein Tauchstäbchen ist und die Polypeptide individuell in einem Muster so verteilt sind, daß die Bindung an das erste, zweite und dritte Polypeptid unterschieden werden kann.

8. Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 5, worin die Kombination in Form eines Fusions-Polypeptids vorliegt.

9. Verfahren zum Nachweis von Antikörpern gegen das Hepatitis-C-Virus (HCV) in einer Körperkomponente eines Säugers, der vermutlich die Antikörper enthält, wobei man die Körperkomponente mit der Kombination nach einem der Ansprüche 1 bis 8 unter Bedingungen in Kontakt bringt, die eine Antikörper-Antigen-Reaktion erlauben, und die Anwesenheit von Immunkomplexen aus den Antikörpern und den Polypeptid- Epitopsequenzen nachweist.

10. Kit zur Durchführung eines Assays zum Nachweis von Antikörpern gegen das Hepatitis-C-Antigen (HCV) in einer Körperkomponente eines Säugers, der vermutlich die Antikörper enthält, umfassend in abgepackter Kombination:

(a) die Kombination aus HCV-Epitopsequenzen nach einem der Ansprüche 1 bis 9;

(b) standard-Kontrollreagentien; und

(c) Anweisungen zur Durchführung des Assays.