JP2018124277A - 粒子含有組成物、免疫測定用試薬、免疫測定方法及び粒子の保存方法 - Google Patents

Abstract

【課題】粒子表面に固定化したＨＣＶ抗原のＮＳ３領域の安定性を高め、継続的に安定した測定が可能な粒子含有組成物、免疫測定用試薬、免疫測定方法及び粒子の保存方法を提供する。【解決手段】表面にＨＣＶ抗原のＮＳ３領域を固定化した粒子（Ａ）、ゼラチン（Ｂ）及び水を含有し、ｐＨが７〜９である粒子含有組成物。前記粒子含有組成物は更に糖類（Ｃ）を含有することが好ましく、糖類（Ｃ）に対するゼラチン（Ｂ）の重量比率［（Ｂ）／（Ｃ）］は０．０２５〜１．６であることが好ましい。【選択図】なし

Description

本発明は、粒子含有組成物、免疫測定用試薬、免疫測定方法及び粒子の保存方法に関する。

免疫測定試薬においては、主要構成要素として固相担体となる磁性粒子やガラスビーズ等の表面に測定対象物質、測定対象物質の類似物質、又は測定対象物質と特異的に結合する物質、例えば、抗原を固定化したものがある。免疫測定試薬においては、固相担体上に固定化した物質が一定の活性を維持していることが望まれる。経時的に物質の活性が低下したり、保存状態によって物質の活性が変化したのでは正確な測定結果は期待できず、免疫測定試薬としては、大きな問題である。

固相担体に固定化される抗原の物質自体は、緩衝液等に溶解した液状試薬や、凍結乾燥した凍結乾燥試薬等、それぞれの形態において様々な安定化方法が提案されている。液状試薬の場合、ＩｇＭ試薬溶液にウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）を添加して安定化する方法（特許文献１）、標識抗体をアミノ酸及びその誘導体を添加して安定化する方法（特許文献２）等が提案されている。また、凍結乾燥試薬の場合、酵素標識抗体溶液にスクロース、トレハロース又はデキストランを添加して凍結乾燥して安定化する方法（特許文献３）、が提案されている。しかしながら、固相担体上にこれらの物質を固定化し、液状での長期保存の場合における安定化方法としては、満足のいくものではない。多数検体同時迅速検査を目的とした自動化免疫測定装置の開発において、さらなる安定性の改善が望まれている。

特開平９−１２７１１４号公報 特開２０１１−２４１２０６号公報 特開昭６０−１４９９７２号公報

本発明の目的は、粒子表面に固定化したＨＣＶ抗原のＮＳ３領域の安定性を高め、継続的に安定した測定が可能な粒子含有組成物、免疫測定用試薬、免疫測定方法及び粒子の保存方法を提供することにある。

本発明者は、上記目的を達成するため鋭意検討した結果、本発明に到達した。即ち本発明は、表面にＨＣＶ抗原のＮＳ３領域を固定化した粒子（Ａ）、ゼラチン（Ｂ）及び水を含有し、ｐＨが７〜９である粒子含有組成物；前記粒子含有組成物を含有する免疫測定用試薬；前記免疫測定用試薬を用いて、試料中の測定対象物質を測定する免疫測定方法；表面にＨＣＶ抗原のＮＳ３領域を固定化した粒子（Ａ）を、ゼラチン（Ｂ）を含有する水溶液中で保存する粒子（Ａ）の保存方法であって、水溶液のｐＨが７〜９である粒子（Ａ）の保存方法である。

本発明の粒子含有組成物及び免疫測定用試薬は、長期保存後においても、粒子表面に固定化されたＨＣＶ抗原のＮＳ３領域の安定性が高い。また、本発明の粒子の保存方法は、粒子表面に固定化されたＨＣＶ抗原のＮＳ３領域を安定に保存することが可能である。更に、本発明の免疫測定方法は、長期保存後においても、高感度かつ正確性の高い臨床検査を可能とする。
尚、本発明において、「表面のＨＣＶ抗原のＮＳ３領域の安定性」及び「免疫測定用試薬の安定性」とは、粒子含有組成物及び免疫測定用試薬の作製直後と一定期間保存後のＨＣＶ抗原のＮＳ３領域の活性の変化が少ないことを意味する。

本発明の粒子含有組成物は、表面にＨＣＶ抗原のＮＳ３領域を固定化した粒子（Ａ）、ゼラチン（Ｂ）及び水を含有し、ｐＨが７〜９の粒子含有組成物である。

粒子（Ａ）は、一般的に免疫測定の分野で使用されるものであれば特に限定されず、例えばガラスビーズ、ポリスチレンビーズ、磁性粒子、マイクロプレート及びラテックス等が代表的なものとして挙げられる。
これらの内、免疫測定における測定時間の短時間化の観点から好ましいのは磁性粒子であり、更に好ましいのは特開２０１４−２１０６８０号公報及び特開２０１３−０１９８８９号公報等に記載の磁性シリカ粒子である。
粒子（Ａ）を含む粒子含有組成物は、免役測定用試薬及びたんぱく質精製等に使用できるが、これらの中で免役測定用試薬の用途が最も好ましい。

磁性シリカ粒子は、シリカのマトリックス中に平均粒子径が１〜１５ｎｍで超常磁性を有する金属酸化物が分散されているものである。超常磁性とは、外部磁場の存在下で物質の個々の原子磁気モーメントが整列し誘発された一時的な磁場を示し、外部磁場を取り除くと、部分的な整列が損なわれ磁場を示さなくなることをいう。

平均粒子径が１〜１５ｎｍで超常磁性を示す超常磁性金属酸化物としては、鉄、コバルト、ニッケル及びこれらの合金等の酸化物が挙げられるが、磁界に対する感応性が優れていることから、酸化鉄が特に好ましい。超常磁性金属酸化物は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。

磁性シリカ粒子中の超常磁性金属酸化物の含有量の下限は、６０重量％が好ましく、更に好ましくは６５重量％であり、上限は９５重量％が好ましく、更に好ましくは８０重量％である。超常磁性金属酸化物の含有量が６０重量％以上であると、得られた磁性シリカ粒子の磁性が十分であるため、実際の用途面における分離操作に時間がかからない。９５重量％以下のものは合成が容易である。

本発明において、ＨＣＶ抗原のＮＳ３領域としては、Ｃ型肝炎ウィルスの非構造タンパク領域を示し、ＮＳ４Ａと結合してウィルス蛋白のプロセッシングとＲＮＡ複製に働くものである。

本発明において、粒子（Ａ）の表面にＨＣＶ抗原のＮＳ３領域を固定化する方法としては、一般的に免疫測定の分野で使用される固定化方法であれば特に限定はされず、例えば物理吸着させる方法が挙げられる。
より効率良く固定化させる観点から、グルタルアルデヒド、アルブミン、カルボジイミド、ストレプトアビジン、ビオチン及び官能基を有するアルキルアルコキシシランからなる群から選ばれる少なくとも１種の有機化合物を粒子（Ａ）表面に結合させ、それらを介して固定化させることが好ましい。
これらの有機化合物の内、（Ａ）表面に結合させる観点から、官能基を有するアルキルアルコキシシランが更に好ましい。
このような官能基を有するアルキルアルコキシシランとしては、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリエトキシシラン、２−（３，４−エポキシシクロヘキシル）エチルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリメトキシシラン、３−グリシドキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−グリシドキシプロピルトリエトキシシラン、ｐ−スチリルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルメチルジエトキシシラン、３−メタクリロキシプロピルトリエトキシシラン、３−アクリロキシプロピルトリメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルメチルジメトキシシラン、Ｎ−２−（アミノエチル）−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリメトキシシラン、３−アミノプロピルトリエトキシシラン、３−トリエトキシシリル−Ｎ−（１，３−ジメチル−ブチリデン）プロピルアミン、Ｎ−フェニル−３−アミノプロピルトリメトキシシラン、トリス−（トリメトキシシリルプロピル）イソシアヌレート、３−ウレイドプロピルトリアルコキシシラン、３−メルカプトプロピルメチルジメトキシシラン、３−メルカプトプロピルトリメトキシシラン及び３−イソシアネートプロピルトリエトキシシラン等が挙げられる。

本発明における粒子含有組成物中の粒子（Ａ）の含有量は、免疫測定用試薬の感度の観点から、粒子含有組成物の重量を基準として、０．００００２５〜０．０１重量％が好ましく、更に好ましくは０．０００５〜０．００３重量％である。

本発明の粒子含有組成物は、ゼラチン（Ｂ）及び水を含む。
ゼラチン（Ｂ）には、公知のゼラチンが含まれ、分子量及び性状に限定はなく、いかなる動物（ホ乳、類、鳥類及び魚類等）から取得したものであってもよい。ゼラチンとしては例えばコラーゲンを酸又はアルカリによる化学処理後、加熱処理して製造した酸処理ゼラチン及びアルカリ処理ゼラチン等を挙げることができる。
更にこのゼラチンをアミノ基、イミノ基、カルボキシル基、メルカプト基及び水酸基等の官能基を周知の方法を利用し導入し、化学的に修飾したゼラチン誘導体を用いることもできる。

本発明の粒子含有組成物中のゼラチン（Ｂ）の含有量は、免疫測定用試薬の安定性の観点から、粒子含有組成物の重量を基準として、１〜８重量％が好ましく、更に好ましくは３〜６重量％である。

本発明の粒子含有組成物は、更に糖類（Ｃ）を含んでもよい。
糖類（Ｃ）としては、単糖類（Ｃ１）、二糖類（Ｃ２）及び多糖類（Ｃ３）が挙げられる。
単糖類（Ｃ１）としては、トリオース（ケトトリオース等）、テトロース（ケトテトロース等）、ペントース（ケトペントース、アルドペントース及びデオキシ糖等）、ヘキソース［ケトヘキソース（プシコース、フルクトース、ソルボース及びタガトース等）、アルドヘキソース（アロース、アルトロース、グルコース、マンノース、グロース、イドース、ガラクトース及びタロース等）及びデオキシ糖（フコース、フクロース及びラムノース等）等］並びにヘプトース（セドヘプツロース等）等が挙げられる。

二糖類（Ｃ２）としては、上記単糖類の内、２分子が脱水縮合してグリコシド結合を形成したものが挙げられ、具体的には、スクロース、ラクトース、トレハロース、マルトース及びセロビオース等が挙げられる。

多糖類（Ｃ３）としては、上記単糖類の内、３分子以上が脱水縮合してグリコシド結合を形成したものが挙げられ、具体的には、アミロース、アミロペクチン、グリコーゲン、セルロース、ヒアルロン酸、コンドロイチン硫酸及びヘパリンが挙げられる。

糖類（Ｃ）は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
糖類（Ｃ）としては、免疫測定用試薬の安定性の観点から、二糖類（Ｃ２）が好ましく、更に好ましいのはスクロース、ラクトース及びトレハロースであり、特に好ましいのはトレハロースである。

本発明の粒子含有組成物中の糖類（Ｃ）の含有量は、免疫測定用試薬の安定性の観点から、粒子含有組成物の重量を基準として、１〜４０重量％が好ましく、更に好ましくは１０〜２０重量％である。

粒子含有組成物中の糖類（Ｃ）に対するゼラチン（Ｂ）の重量比率［（Ｂ）／（Ｃ）］は、免疫測定用試薬の安定性の観点から、０．０２５〜１．６が好ましく、更に好ましくは０．１５〜０．５である。

本発明の粒子含有組成物は、更に無機塩（Ｄ）を含有してもよい。
無機塩（Ｄ）としては、アルカリ金属塩［ハロゲン化物（塩化ナトリウム、塩化カリウム、臭化ナトリウム及びフッ化ナトリウム等）、硫酸塩（硫酸ナトリウム及び硫酸カリウム等）、硝酸塩（硝酸ナトリウム及び硝酸カリウム等）及びリン酸塩（リン酸ナトリウム及びリン酸カリウム等）］、アルカリ土類金属塩［ハロゲン化物（塩化カルシウム及び塩化マグネシウム等）及び硫酸塩（硫酸マグネシウム等）］等が挙げられる。
これらの内、免疫測定用試薬の安定性の観点から、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硝酸ナトリウム及び硝酸カリウムが好ましい。
無機塩（Ｄ）は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。

粒子含有組成物中の無機塩（Ｄ）の含有量は、免疫測定用試薬の安定性の観点から、粒子含有組成物の重量を基準として、０．１〜２重量％が好ましく、更に好ましくは０．５〜１重量％である。

本発明の粒子含有組成物は、上記以外に、粒子表面にＨＣＶ抗原のＮＳ４領域、ＮＳ５領域及びＣＯＲＥ蛋白領域からなる群から選ばれる少なくとも１種の領域を固定化した粒子（Ａ’）を含有してもよい。

ＨＣＶ抗原のＮＳ４領域、ＮＳ５領域及びＣＯＲＥ蛋白領域としては、一般的に免疫測定の分野で使用されているものであれば特に限定されないが、取り扱いが容易であることから、ペプチド又はリコンビナント抗原が好ましい。
固定化方法は、上記ＨＣＶ抗原のＮＳ３領域の固定化方法と同様である。

粒子含有組成物中のＨＣＶ抗原のＮＳ４領域、ＮＳ５領域及びＣＯＲＥ蛋白領域からなる群から選ばれる少なくとも１種を固定化した粒子（Ａ’）の含有量は、免疫測定用試薬の感度の観点から、粒子含有組成物の重量を基準として、０．００００２５〜０．０１重量％が好ましく、更に好ましくは０．０００５〜０．００３重量％である。

本発明の粒子含有組成物中は、上記以外に、タンパク質を含有してもよい。
タンパク質としては、一般的に免疫測定の分野で測定されるものであれば特に限定はされず、例えばウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、カゼイン及びスキムミルク等が挙げられる。
タンパク質は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
粒子含有組成物中のタンパク質の含有量は、免疫測定用試薬の安定性の観点から、粒子含有組成物の重量を基準として、０．０１〜５重量％が好ましく、更に好ましくは０．１〜３重量％である。

本発明の粒子含有組成物のｐＨは、７〜９である。ｐＨが７未満であるとＨＣＶ抗原のＮＳ３領域の安定性が悪く、ｐＨ９より大きくなると測定値のバックグラウンドが高くなり測定結果に悪影響を与え、正しい測定値が得られない。
尚、ｐＨは、ＪＩＳ Ｋ０４００−１２−１０：２０００に準拠して測定温度２５℃で測定される。

本発明の粒子含有組成物は、上記以外に、緩衝剤を含有してもよい。
緩衝剤としては、一般的に免疫測定の分野で使用され、上記ｐＨの間に緩衝能をもつのであれば特に限定はされず、リン酸、炭酸、トリス（ヒドロキシメチル）アミノメタン−塩酸、Ｎ，Ｎ−ビス（２−ヒドロキシエチル）グリシン、４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジンプロパンスルホン酸、Ｎ−［トリス（ヒドロキシメチル）メチル］グリシン及びＮ−（２−ヒドロキシエチル）ピペラジン−Ｎ’−２−エタンスルホン酸等が挙げられる。
緩衝剤は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
粒子含有組成物中の緩衝剤の含有量は、ｐＨの安定性の観点から、粒子含有組成物中の濃度として、０．００１〜１Ｍが好ましく、更に好ましくは０．０１〜０．１Ｍである。

本発明において、粒子含有組成物は、粒子（Ａ）、ゼラチン及び水を含有し、ｐＨが７〜９であれば特に制限なく製造できるが、粒子（Ａ）上のＨＣＶ抗原の安定性の観点から、ゼラチンを含むｐＨが７〜９の水溶液中に粒子（Ａ）を添加して粒子含有組成物とすることが好ましい。

本発明の粒子含有組成物の保存条件としては、一般的に免疫測定用試薬の保存で用いられる方法であれば、特に限定はない。
保存温度としては、粒子（Ａ）上に固定化されているＨＣＶ抗原の活性を損なわない一般的保管温度である２℃〜１０℃が好ましい。
容器としては、耐久性のある保管容器であれば、特に限定はないが、例えばクライオチューブ［サーモフィッシャーサイエンティフィック（株）製］、遠沈管［コーニングインターナショナル（株）製］、マイクロチューブ［エッペンドルフ（株）製］、スクリュー管［（株）マルエム製］、ＰＣＲチューブ［日本ジェネティクス（株）製］が挙げられる。
また、保存中の粒子含有組成物中の粒子は、沈殿状態又は分散状態のどちらの状態でもよい。
保存期間としては、特に限定はないが、粒子（Ａ）上に固定化されているＨＣＶ抗原の安定性の観点から、１．５年以内が好ましい。

本発明の免疫測定用試薬は、上記粒子含有組成物を含有するものであれば特に限定されず、免疫測定用試薬として粒子含有組成物をそのまま使用してもよい。
また、免疫測定用試薬は、上記粒子含有組成物以外に、免疫測定における非特異的反応を抑制する目的で、タンパク質、界面活性剤及び高分子化合物等を含む免疫反応緩衝液を含有していてもよい。

免疫反応緩衝液中のタンパク質としては上述の粒子含有組成物に使用されるタンパク質と同様のもののほかに、動物血清及び動物抗体等が挙げられ、非特異的反応の抑制の観点から、動物抗体が好ましく、マウス抗体、ウサギ抗体、ヒツジ抗体、ヤギ抗体及びウマ抗体が好ましい。
動物抗体の濃度は、非特異的反応の抑制の観点から、粒子含有組成物の重量を基準として、０．０００１〜０．２重量％が好ましく、更に好ましくは０．０５〜０．１重量％である。

免疫反応緩衝液中の界面活性剤としては、公知の非イオン界面活性剤、両性界面活性剤及びアニオン界面活性剤が含まれ、非特異的反応の抑制の観点から、水溶性の非イオン界面活性剤が好ましい。

水溶性の非イオン界面活性剤としては、高級アルコールエチレンオキサイド（エチレンオキサイドを以下ＥＯと略記）付加物、脂肪酸ＥＯ付加物、脂肪酸アミドＥＯ付加物、ソルビタン脂肪酸エステルＥＯ付加物及びポリプロピレングリコールＥＯ付加物等の公知（特開平８−２６１９４３号公報等に記載）の界面活性剤が使用できる。

界面活性剤は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
界面活性剤の含有量は、非特異的反応の抑制の観点から、粒子含有組成物の重量を基準として、０．０１〜５重量％が好ましく、更に好ましくは０．１〜３重量％である。

免疫反応緩衝液中の高分子化合物としては、一般的に免疫測定の分野で使用されるものであれば特に限定されず、例えばポリエチレングリコール、ポリビニルアルコール、ポリビニルピロリドン、Ｂｌｏｃｋｍａｓｔｅｒ［ＪＳＲ（株）製］及びＬｉｐｉｄｕｒｅ［日油（株）製］が挙げられる。

高分子化合物は、１種を単独で用いても２種以上を併用してもよい。
高分子化合物の含有量は、非特異的反応の抑制の観点から、粒子含有組成物の重量を基準として、高分子化合物の純分が、０．００１〜３重量％であることが好ましく、更に好ましくは０．５〜１重量％である。

免疫測定用試薬は、上記粒子含有組成物以外に、標識物質により標識されたＨＣＶ抗原のＮＳ３領域、或いは、標識物質により標識されたＨＣＶ抗原のＮＳ３領域と特異的に結合する抗ＨＣＶ抗体と特異的に結合する物質（標識物質により標識された抗ヒトＩｇＧ抗体）を含有する試薬（以下、標識試薬と略記する場合がある）を含有してもよい。また、標識物質により標識されたＨＣＶ抗原のＮＳ４領域、ＮＳ５領域及びＣＯＲＥ蛋白領域を含有していてもよい。

標識するために用いられる標識物質としては、例えば酵素免疫測定法（ＥＩＡ）において用いられるアルカリホスファターゼ、β−ガラクトシダーゼ、ペルオキシダーゼ（以下ＰＯＤと略記）、マイクロペルオキシダーゼ、グルコースオキシダーゼ、グルコース−６−リン酸脱水素酵素、リンゴ酸脱水素酵素、ルシフェラーゼ、チロシナーゼ、酸性ホスファターゼ等の酵素、例えば放射免疫測定法（ＲＩＡ）に於いて用いられる^99mＴｃ、¹³¹Ｉ、¹²⁵Ｉ、¹⁴Ｃ、³Ｈ、³²Ｐ等の放射性同位元素、例えば蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）に於いて用いられるフルオレセイン、ダンシル、フルオレスカミン、クマリン、ナフチルアミン或いはこれらの誘導体、グリーン蛍光タンパク質（ＧＦＰ）等の蛍光性物質、例えばルシフェリン、イソルミノール、ルミノール、ビス（２，４，６−トリフロロフェニル）オキザレート等の発光性物質、例えばフェノール、ナフトール、アントラセン或いはこれらの誘導体等の紫外部に吸収を有する物質、例えば４−アミノ−２，２，６，６−テトラメチルピペリジン−１−オキシル、３−アミノ−２，２，５，５−テトラメチルピロリジン−１−オキシル、２，６−ジ−ｔ−ブチル−α−（３，５−ジ−ｔ−ブチル−４−オキソ−２，５−シクロヘキサジエン−１−イリデン）−ｐ−トリオキシル等のオキシル基を有する化合物に代表されるスピンラベル化剤としての性質を有する物質等が挙げられる。
これらの内、感度等の観点から、酵素及び蛍光性物質が好ましく、更に好ましいのはアルカリホスファターゼ、ＰＯＤ及びグルコースオキシダーゼであり、特に好ましいのはＰＯＤである。

標識試薬には、酵素免疫測定標識物質により標識されたＨＣＶ抗原のＮＳ３領域、或いは、標識物質により標識されたＨＣＶ抗原のＮＳ３領域と特異的に結合する抗体と特異的に結合する物質以外に緩衝液等を含むことができる。
標識試薬に使用される緩衝液としては、免疫測定に一般的に用いられる緩衝液を好ましく用いることができ、例えば、上述の粒子含有組成物に使用される緩衝剤と同様のものが挙げられ、緩衝剤の濃度及びｐＨも上述の粒子含有組成物に使用される場合と同様である。

本発明の免疫測定用試薬は、本発明の粒子含有組成物及び標識試薬以外に、化学発光試薬を含んでいてもよい。
化学発光試薬は、上記の標識物質に基づき選択され、例えば、標識物質がＰＯＤである場合、２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物及び化学発光増強剤を必須構成成分とする化学発光試薬第１液と、酸化剤及び水を必須構成成分とする化学発光試薬第２液とを含む。

２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物としては、例えば、特開平２−２９１２９９号公報、特開平１０−３１９０１５号公報及び特開２０００−２７９１９６号公報等に記載の公知の２，３−ジヒドロ−１，４−フタラジンジオン化合物及びこれらの混合物等が使用できる。
これらの内、ルミノール、イソルミノール、Ｎ−アミノヘキシル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＨＥＩ）、Ｎ−アミノブチル−Ｎ−エチルイソルミノール（ＡＢＥＩ）及びこれらの金属塩（アルカリ金属塩等）が好ましく、更に好ましいのはルミノール及びその金属塩であり、特に好ましいのはルミノールのナトリウム塩である。

化学発光増強剤としては、例えば、特開昭５９−５００２５２号公報、特開昭５９−１７１８３９号公報及び特開平２−２９１２９９号公報等に記載の公知の化学発光増強剤及びこれらの混合物等が使用できる。
これらの内、化学発光増強効果等の観点から、フェノール骨格含有化合物が好ましく、更に好ましいのはＰ−ヨードフェノール、４−（シアノメチルチオ）フェノール及び４−シアノメチルチオ−２−クロロフェノールであり、特に好ましいのは４−（シアノメチルチオ）フェノールである。

化学発光試薬第１液は、液体であることが好ましく、また、酵素の蛍光強度の観点からはアルカリ性であることが好ましい。
第１液のｐＨは、７〜１１が好ましく、更に好ましくは８〜１０である。
尚、ｐＨは、ＪＩＳ Ｋ０４００−１２−１０：２０００に準拠して測定温度２５℃で測定される。

化学発光試薬第２液が含有する酸化剤としては、例えば、特開平８−２６１９４３号公報及び特開２０００−２７９１９６号公報等に記載の公知の酸化剤等［無機の過酸化物｛｝過酸化水素、過ホウ酸ナトリウム及び過ホウ酸カリウム、ペルオキソ酸化合物（ペルオクソ硫酸及びペルオキソリン酸等｝及び有機過酸化物（過酸化ジアルキル及び過酸化アシル等）等］の水溶液が挙げられる。
これらの内、保存安定性等の観点から、過酸化水素水溶液、過ホウ酸ナトリウム水溶液及び過ホウ酸カリウム水溶液が好ましく、更に好ましいのは過酸化水素水溶液である。

本発明の免疫測定方法は、上記本発明の免疫測定用試薬を用いて、試料中の抗ＨＣＶ抗体（測定対象物質）を測定する免疫測定方法である。

免疫測定方法として、具体的には、以下の方法が含まれる。
本発明の免疫測定用試薬を用いて行う以外は免疫測定の分野で一般的に行われる、文献［例えば、酵素免疫測定法第２版（石川栄治ら編集、医学書院）１９８２年］記載のサンドイッチ法、競合法及び特開平６−１３００６３号公報記載の測定法に準じて行えばよい。

サンドイッチ法は、例えば、測定対象物質を含む試料と表面にＨＣＶ抗原のＮＳ３領域を固定化した粒子（Ａ）とを接触させて、粒子表面に測定対象物質と特異的に結合する物質と測定対象物質との複合体を形成させ、更に該複合体に、標識された測定対象物質と特異的に結合する物質を接触させて、粒子に固定化されたＨＣＶ抗原のＮＳ３領域と測定対象物質と標識された測定対象物質と特異的に結合する物質との複合体（標識複合体）を形成させ、該標識複合体をＢ／Ｆ分離して、標識複合体中の標識物質量を測定し、その結果に基づいて試料中の測定対象物質を測定すればよい。
この方法においては、測定対象物質とＨＣＶ抗原のＮＳ３領域が固定化された粒子（Ａ）とを反応させた後、標識された測定対象物質と特異的に結合する物質を反応させているが、標識された測定対象物質と特異的に結合する物質と測定対象物質とを反応させた後にＨＣＶ抗原のＮＳ３領域が固定化された粒子（Ａ）とを反応させても、これら３つを同時に反応させても構わない。

上記サンドイッチ法におけるＢ／Ｆ分離とは、上記標識複合体と、標識複合体の形成に関与しなかった標識された測定対象物質と特異的に結合する物質との分離を意味し、具体的には、粒子に固定化されたＨＣＶ抗原のＮＳ３領域、粒子に固定化されたＨＣＶ抗原のＮＳ３領域と測定対象物質との複合体及び上記の標識複合体と、他の成分（試料中の測定対象物質以外の成分、標識複合体の形成に関与しなかった標識された測定対象物質と特異的に結合する物質）との分離を意味する。
また、Ｂ／Ｆ分離工程は標識複合体の形成後には必須の工程であるが、粒子表面にＨＣＶ抗原のＮＳ３領域と測定対象物質との複合体を形成させた後においても実施することができる。

本発明の免疫測定法において、試料、粒子、標識された測定対象物質と特異的に結合する物質、標識物質により標識された測定対象物質又はその類似物質等を接触させる方法としては、免疫測定の分野で一般的になされる撹拌、混合等の処理により、粒子が分散されればよい。
反応時間は、各試薬の濃度応じて適宜設定することができるが、１〜２０分が好ましく、更に好ましくは３〜１０分である。

本発明の免疫測定法におけるＢ／Ｆ分離は、例えば、粒子が磁性シリカ粒子の場合、磁性を利用し、反応槽の外側等から磁石等により磁性シリカ粒子を集めて、反応液を排出し、洗浄液を加えた後、磁石を取り除き、磁性シリカ粒子を混合して分散させ、洗浄することによりなされる。上記操作を１〜３回繰り返してもよい。洗浄液としては、一般的に免疫測定の分野で用いられるものであれば特に限定はされない。

標識物質又はその活性の測定方法としては、放射免疫測定法（ＲＩＡ）、酵素免疫測定法（ＥＩＡ）、蛍光免疫測定法（ＦＩＡ）及び化学発光免疫測定法（ＣＬＩＡ及びＣＬＥＩＡ）が挙げられ、短時間での免疫測定における感度の観点から、ＥＩＡ、ＣＬＩＡ及びＣＬＥＩＡが好ましく、更に好ましいのはＣＬＥＩＡである。

本発明の粒子（Ａ）の保存方法は、上記表面にＨＣＶ抗原のＮＳ３領域を固定化した粒子（Ａ）をゼラチン（Ｂ）を含有する水溶液中で保存する粒子（Ａ）の保存方法であって、水溶液のｐＨが７〜９である粒子（Ａ）の保存方法である。
保存温度としては、粒子（Ａ）上に固定化されているＨＣＶ抗原の活性を損なわない一般的保管温度である２〜４５℃が好ましい。
また、容器及び保存期間として好ましいのは、上記粒子含有組成物の保存条件と同様である。
また、本発明においては、ゼラチン（Ｂ）を含有する水溶液中で２０〜４５℃で保存する場合においても、固相担体表面に固定化したＨＣＶ抗原の活性を維持し、安定性を高めることができる。この場合、水溶液中に、更に糖類（Ｃ）及び／又は無機塩（Ｄ）を含有することにより、安定性を高めることができる。
２０〜４５℃で保管する場合の保管期間としては、特に限定はないが、粒子（Ａ）上に固定化されているＨＣＶ抗原の安定性の観点から、１日〜４週間が好ましい。

以下、実施例により、本発明を更に説明するが、本発明はこれに限定されるものではない。

＜実施例１＞
以下に示す方法により、ＨＣＶ抗原ＮＳ３領域を固定化した磁性シリカ粒子を含有する粒子含有組成物（ＮＳ３結合磁性シリカ粒子試薬）、免疫反応緩衝液、標識試薬（ＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧ抗体試薬）、ルミノール発光試薬及び過酸化水素水から構成される本発明の免疫測定用試薬（Ｓ−１）を得た。

磁性シリカ粒子の作製：
反応容器に塩化鉄（ＩＩＩ）６水和物２．７部、塩化鉄（ＩＩ）４水和物１．０重量部及び水３７５重量部を仕込んで溶解させて５０℃に昇温し、撹拌下温度を５０〜５５℃の保持しながら、２５重量％アンモニア水溶液３．８重量部と水１００重量部を混合した溶液を１時間かけて滴下し、滴下後１時間撹拌し、オレイン酸１０．５重量部加え、２時間撹拌を継続した。室温に冷却後、デカンテーションにより固液分離して得られたオレイン酸が吸着したマグネタイト粒子を水５０重量部で洗浄する操作を３回行った。得られたオレイン酸が吸着したマグネタイト粒子を容器に仕込み、デカン５．７重量部及びテトラエトキシシラン２．２重量部を加えて混合し、分散液（１）を調製した。
反応容器に２５重量％アンモニア水溶液３９．０重量部、イソプロパノール５５．４重量部、ソルビタンモノオレエート２．９重量部（三洋化成工業株式会社製「イオネットＳ−８０」）及びポリオキシエチレン（付加モル数２０モル）アルキルエーテル（三洋化成工業株式会社「エマルミン２００」）２．０重量部を加えてクリアミックス（エムテクニック社製）を用いて混合し、５０℃に昇温後、クリアミックスの回転数６，０００ｒｐｍで攪拌しながら、上記分散液（１）を１時間かけて滴下後、５０℃で１時間反応させた。反応後、２，０００ｒｐｍで５分間遠心分離して微粒子の存在する上清を除いた。得られた固相に水５０重量部を加えて粒子を分散させて１，０００ｒｐｍで１０分間遠心分離後、微粒子の存在する上清を除く操作を１０回行った。続いて、得られた固相に水５０重量部を加えて粒子を分散させて５００ｒｐｍで５分間遠心分離することにより、大きな粒子径の粒子を沈降させて目的とする粒子径を有する粒子を含有する上清（１）を回収した。残った固相に水５０重量部を加えて５００ｒｐｍで５分間遠心分離後、上清（２）を回収する操作を２回行い、固相中に存在する目的とする粒子径を有する粒子を回収した。次に、上清（１）及び（２）について、磁石を用いて粒子を集磁し、集磁された粒子を８０℃で８時間乾燥させて磁性シリカ粒子を得た。

ＮＳ３結合磁性シリカ粒子試薬の作製：
０．１重量％γ−アミノプロピルトリエトキシシラン含有アセトン溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に上記磁性シリカ粒子４０ｍｇを加え、２５℃で１時間反応させ、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去した。次いで脱イオン水４０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を５回行った。次いで、この洗浄後の磁性シリカ粒子を０．２重量％グルタルアルデヒド含有水溶液４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１時間反応させた。そして、脱イオン水４０ｍＬを加えて蓋をし、ポリスチレン瓶をゆっくりと２回倒置攪拌した後、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、液をアスピレーターで吸引除去して磁性シリカ粒子を洗浄した。この洗浄操作を１０回行った。更にこの洗浄後の磁性シリカ粒子をＨＣＶ抗原のＮＳ３領域［「リコンビナントＮＳ３」、フナコシ（株）製］１０μｇ／ｍＬの濃度で含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ８．７）１２０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で３時間反応させた。反応後、ネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を集磁後、ＨＣＶ抗原のＮＳ３領域含有リン酸緩衝液を除去した。次いで、磁性シリカ粒子を１重量％のカゼイン含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）４０ｍＬの入った蓋付きポリエチレン瓶に加え、２５℃で１２時間浸漬させた後、ネオジウム磁石でシリカ粒子を集磁後、１重量％のカゼイン含有のリン酸緩衝液を除去し、表面にＨＣＶ抗原のＮＳ３領域を固定化した磁性シリカ粒子（Ａ−１）を得た。得られた粒子（Ａ−１）を５重量％のゼラチン［「商品名：スーパーゼラチン ＢＰＧ−１６０」、（株）ニッピ製］、１０重量％のスクロース［和光純薬工業（株）製］、０．８５重量％の塩化ナトリウム及び０．０１％アジ化ナトリウムを含む０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７．８）を用いて、粒子（Ａ−１）の濃度として０．２ｍｇ／ｍＬの濃度となるように希釈し、表面にＨＣＶ抗原のＮＳ３領域を固定化した磁性シリカ粒子（Ａ−１）を含有する粒子含有組成物を調製し、冷蔵（２〜１０℃）で保存した。これをＮＳ３結合磁性シリカ粒子試薬（Ｔ−１）として用いた。

免疫反応緩衝液の作製：
スキムミルク粉末［和光純薬工業（株）製］を０．３重量％、エマルミンＬ−９０−Ｓ［三洋化成工業（株）製］を１重量％、塩化ナトリウム［和光純薬工業（株）製］を０．８５重量％及びマウス血清［コスモ・バイオ（株）製］を１重量％含有した０．０２Ｍリン酸緩衝液（ｐＨ７）を調製し、冷蔵（２〜１０℃）で保管した。

標識試薬の作製：
抗ヒトＩｇＧポリクローナル抗体［ダコジャパン（株）製］、西洋ワサビ由来ＰＯＤ［東洋紡（株）製］を用い、文献（エス・ヨシタケ、エム・イマガワ、イー・イシカワ、エトール；ジェイ．バイオケム，Ｖｏｌ．９２，１９８２，１４１３−１４２４）に記載の方法でＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧ抗体を調製した。これを０．５重量％のカゼイン加水分解物含有の０．０２Ｍリン酸緩衝液で、ＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧ抗体濃度として０．５ｎＭの濃度に希釈し、標識試薬を調製し、冷蔵（２〜１０℃）で保存した。

ルミノール試薬の調製：
ルミノールのナトリウム塩［シグマ アルドリッチ ジャパン（株）製］０．７ｇ及び４−（シアノメチルチオ）フェノール０．１ｇを１，０００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。３−［４−（２−ヒドロキシエチル）−１−ピペラジニル］プロパンスルホン酸／水酸化ナトリウム緩衝液（１０ｍＭ、ｐＨ８．６）を溶液の容量が１，０００ｍＬになるように仕込み、２５℃で均一混合してルミノール発光試薬を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。

過酸化水素水の調製：
過酸化水素［和光純薬工業（株）製、試薬特級、濃度３０重量％］６．６ｇを１，０００ｍＬメスフラスコに仕込んだ。脱イオン水を溶液の容量が１，０００ｍＬになるように仕込み、２５℃で均一混合して過酸化水素水を調製した。測定に用いるまで冷蔵（２〜１０℃）保存した。

＜実施例２〜２１＞
実施例１の「ＮＳ３結合磁性シリカ粒子試薬の作製」において、ゼラチン（Ｂ）の濃度、糖類（Ｃ）の種類及び濃度、無機塩（Ｄ）の種類及び濃度並びにｐＨを表１に記載のものとする以外は実施例１と同様にしてＮＳ３結合磁性シリカ粒子試薬（Ｔ−２）〜（Ｔ−２１）を作製し、実施例１と同じ免疫反応緩衝液、標識試薬（ＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧ抗体試薬）、ルミノール発光試薬及び過酸化水素水と組み合わせて免疫測定用試薬（Ｓ−２）〜（Ｓ−２１）とした。

＜比較例１〜４＞
実施例１の「ＮＳ３結合磁性シリカ粒子試薬の作製」において、ゼラチン（Ｂ）の濃度、糖類（Ｃ）の種類及び濃度、無機塩（Ｄ）の種類及び濃度並びにｐＨを表１に記載のものとする以外は実施例１と同様にして比較用のＮＳ３結合磁性シリカ粒子試薬（Ｔ’−１）〜（Ｔ’−４）を作製し、実施例１と同じ免疫反応緩衝液、標識試薬（ＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧ抗体試薬）、ルミノール発光試薬及び過酸化水素水と組み合わせて免疫測定用試薬（Ｓ’−１）〜（Ｓ’−４）とした。

以下の方法により免疫測定用試薬（Ｓ−１）〜（Ｓ−２１）及び（Ｓ’−１）〜（Ｓ’−４）を用いて、下記免疫測定を行い、粒子含有組成物（免疫測定用試薬）の安定性を評価した。安定性の結果を表１に示す。

＜免疫測定方法＞
実施例及び比較例で得たＮＳ３結合磁性シリカ粒子試薬（Ｔ−１）〜（Ｔ−２１）及び（Ｔ’−１）〜（Ｔ’−４）をそれぞれ０．０２５ｍＬ、試験管に入れ、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、免疫反応緩衝液０．２ｍＬとＨＣＶ陽性血清０．０２５ｍＬを試験管に入れて混合、試験管中で３７℃３分間反応させ、ＮＳ３結合磁性シリカ粒子／ＨＣＶ抗体の複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を３回行った。

続いて、標識試薬０．１ｍＬを試験管に注入し、試験管中で３７℃３分間反応させ、ＮＳ３結合磁性シリカ粒子／ＨＣＶ抗体／ＰＯＤ標識抗ヒトＩｇＧ抗体複合体を形成させた。反応後、試験管の外側からネオジウム磁石で磁性シリカ粒子を１０秒間集め、試験管中の液をアスピレーターで除き、ネオジウム磁石を側面から十分に離し、生理食塩水０．５ｍＬを加えて磁性シリカ粒子を分散させて集磁後、アスピレーターで液を除く洗浄操作を２回行った。
最後に、ルミノール試薬０．１ｍＬと過酸化水素水０．１ｍＬとを同時に加え、３７℃で発光反応させ、ルミノール試薬及び過酸化水素水を添加後４０〜４５秒の一秒当たりの平均発光量をルミノメーター［ベルトールドジャパン社製「Ｌｕｍａｔ ＬＢ９５０７」］で測定した。

＜４℃での安定性評価＞
４℃で０．５年間保管した免疫測定用試薬を用いて上記免疫測定をして、得られた発光量ｃｐｓを一定期間保存後の活性（Ｘ１）とした。また、免疫測定用試薬を作製直後に免疫測定を行い、得られた発光量ｃｐｓを作製直後の活性（Ｘ２）とした。得られた活性測定値を用いて、以下の計算式で４℃での安定率を算出した。
４℃での安定率（％）＝（Ｘ１／Ｘ２）×１００

＜３７℃での安定性評価＞
３７℃で３日間保管した免疫測定用試薬を用いて上記免疫測定をして、得られた発光量ｃｐｓを一定期間保存後の活性（Ｘ３）とした。また、免疫測定用試薬を作製直後に免疫測定を行い、得られた発光量ｃｐｓを作製直後の活性（Ｘ２）とした。得られた活性測定値を用いて、以下の計算式で３７℃での安定率を算出した。
３７℃での安定率（％）＝（Ｘ３／Ｘ２）×１００

表１の実施例１７と比較例３との比較並びに実施例１、１５及び１６と比較例１及び２との比較から、ゼラチンを含有し、ｐＨが７〜９であることにより、４℃安定率が高くなり、粒子表面のＨＣＶ抗原のＮＳ３領域の安定性が高くなることがわかる。特に、ゼラチンに加えて、糖類及び無機塩を含有する実施例１〜１６及び１８〜２１の免疫測定用試薬は、４℃安定率及び３７℃安定率が共に８０％以上を示しており、幅広い温度で安定性が向上することがわかる。
したがって、本発明の免疫測定試薬は、長期保存後においても、高感度かつ正確性の高い臨床検査が可能であることがわかる。

本発明の粒子含有組成物、免疫測定用試薬、免疫測定方法及び粒子の保存方法は、免疫測定及び臨床検査分野に用いられるＨＣＶ抗原を用いた検査薬に有用である。

Claims (12)

1. 表面にＨＣＶ抗原のＮＳ３領域を固定化した粒子（Ａ）、ゼラチン（Ｂ）及び水を含有し、ｐＨが７〜９である粒子含有組成物。
2. 更に糖類（Ｃ）を含有する請求項１に記載の粒子含有組成物。
3. 粒子含有組成物中のゼラチン（Ｂ）の含有量が１〜８重量％であり、糖類（Ｃ）の含有量が１〜４０重量％である請求項２に記載の粒子含有組成物。
4. 糖類（Ｃ）に対するゼラチン（Ｂ）の重量比率［（Ｂ）／（Ｃ）］が０．０２５〜１．６である請求項２又は３に記載の粒子含有組成物。
5. 糖類（Ｃ）が二糖類（Ｃ２）である請求項２〜４のいずれか１項に記載の粒子含有組成物。
6. 更に無機塩（Ｄ）を含有する請求項１〜５のいずれか１項に記載の粒子含有組成物。
7. 無機塩（Ｄ）が塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化マグネシウム、硫酸ナトリウム、硫酸カリウム、硝酸ナトリウム及び硝酸カリウムからなる群から選ばれる少なくとも１種である請求項６に記載の粒子含有組成物。
8. 粒子（Ａ）が磁性シリカ粒子である請求項１〜７のいずれか１項に記載の粒子含有組成物。
9. 請求項１〜８のいずれか１項に記載の粒子含有組成物を含有する免疫測定用試薬。
10. 請求項９に記載の免疫測定用試薬を用いて、試料中の測定対象物質を測定する免疫測定方法。
11. 表面にＨＣＶ抗原のＮＳ３領域を固定化した粒子（Ａ）を、ゼラチン（Ｂ）を含有する水溶液中で保存する粒子（Ａ）の保存方法であって、水溶液のｐＨが７〜９である粒子（Ａ）の保存方法。
12. ２〜４５℃の温度で保存する請求項１１に記載の粒子（Ａ）の保存方法。