DE69019366T2

DE69019366T2 - Methode und zusammensetzung zur behandlung solider tumoren.

Info

Publication number: DE69019366T2
Application number: DE69019366T
Authority: DE
Inventors: Francis Martin; Carl Redemann; Martin Woodle; Annie Yau-Young
Original assignee: Liposome Technology Inc
Current assignee: Alza Corp
Priority date: 1989-10-20
Filing date: 1990-10-19
Publication date: 1995-10-05
Anticipated expiration: 2010-10-20
Also published as: IL96070A; WO1991005545A1; CA2067178A1; NO304637B1; JP2889549B2; NO1999003I1; GR3017060T3; KR920703013A; FI105151B; AU642679B2; JP3921050B2; US5013556A; FI921763A7; CA2067133C; US5213804A; HK14097A; CA2067133A1; DE69015207D1; DE19675048I2; FI921763A0

Description

1. Gebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft eine Liposomen-Zusammensetzung und ein Verfahren, insbesondere die Verwendung in Tumordiagnostika und/oder -therapeutika.

2. Literaturverzeichnis

T.M. Allen (1981), Biochem. Biophys. Acta, Bd. 640, S. 385-397. T.M. Allen und J. Everest (1983), J. Pharmacol. Exp. Therap., Bd. 226, S. 539-544.
B.M. Altura (1980), Adv. Microcirc., Bd. 9, S. 252-294.
C.R. Alving (1984), Biochem. Soc. Trans., Bd. 12, S. 342-344.
G. Ashwell und A.G. Morell (1974), Adv. Enzymology, Bd. 41, S. 99- 128.
J.K. Czop (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75, S. 3831.
J.P. Durocher et al. (1975), Blood, Bd. 45, S. 11.
H. Ellens et al. (1981), Biochim. Biophys. Acta, Bd. 674, S. 10-18.
A. Gabizon, R. Shiota und D. Papahadjopoulos (1989), J. Natl. Cancer Inst., Bd. 81, S. 1484-1488.
A. Gabizon, J. Huberty, R.M. Straubinger, D.C. Price und D. Papahadjopoulos (1988-1989), J. Liposome Resh., Bd. 1, S. 123-135.
G. Gregoriadis und B.E. Ryman (1972), Eur. J. Biochem., Bd. 24, S. 485-491.
G. Gregoriadis und D. Neerunjun (1974), Eur. J. Biochem., Bd. 47, S. 179-185.
G. Gregoriadis und J. Senior (1980), FEBS Lett., Bd. 119, S. 43-46.
J.P. Greenberg et al. (1979), Blood, Bd. 53, S. 916.
S. Hakomori (1981), Ann. Rev. Biochem., Bd. 50, S. 733-764.
K. Hong, D. Friend, C. Glabe und Papahjadjopoulos (1984), Biochem. Biophys. Acta, Bd. 732, S. 320-323.
K.J. Hwang et al. (1980), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 77, S. 4030.
K.J. Jain (1989), J. Natl. Can. Inst., Bd. 81, S. 570-576.
M.M. Jonah et al. (1975), Biochem. Biophys. Acta, Bd. 401, S. 336- 348.
R.L. Juliano und D. Stamp (1975), Biochem. Biophys. Res. Commun., Bd. 63, S. 651-658.
K.A. Karlsson (1982), in: Biological Membranes, Bd. 4, D. Chapman (Hrsg.), Academic Press, N.Y., S. 1-74.
K.H. Kimelberg et al. (1976), Cancer Res., Bd. 36, S. 2949-2957.
C.J. Kirby und Gregoriadis (1984), in: Liposome Technology, Bd. 3, G. Gregporoiados (Hrsg.), CRC Press, Boca Raton, FL., S. 19.
K.C. Lee et al., J. Immunology, Bd. 125 (1980), S. 86.
G. Lopez-Berestein et al. (1984), Cancer Res., Bd. 44, S. 375-378.
F.J. Martin (1990), In: Specialized Drug Delivery Systems - Manufacturing and Production Technology, P. Tyle (Hrsg.), Marcel Dekker, New York, S. 267-316.
N. Okada (1982), Nature, Bd. 299, S. 261.
G. Poste et al., in: "Liposome Technology", Bd. 3, S. 1, G. Gregoriadis et al. (Hrsg.), CRC Press, Boca Raton (1984).
M.J. Poznansky und R.L. Juliano (1984), Pharmacol. Rev., Bd. 36, S. 277-336.
V.J. Richardson et al. (1979), Br. J. Cancer, Bd. 40, S. 3543.
T.M. Saba (1970), Arch. Intern. Med., Bd. 126, S. 1031-1052.
R. Schaver (1982), Adv. Carbohydrate Chem. Biochem., Bd. 40, S. 131.
T. Scherphof et al. (1978), Biochim. Biophys. Acta, Bd. 542, S. 296-307
J. Senior und G. Gregoriadis (1982), FEBS Lett., Bd. 145, S. 109- 114.
J. Senior et al. (1985), Biochim. Biophys. Acta, Bd. 839, S. 1-8.
F. Szoka Jr. et al. (1978), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 75, S. 4194.
F. Szoka Jr. et al. (1980), Ann. Rev. Biophys. Bioeng., Bd. 9, S. 467.
J.W. Weinstein et al. (1984), Pharmac. Ther., Bd. 24, S. 207.
J.J. Woodruff et al. (1969), J. Exp. Med., Bd. 129, S. 551.

3. Hintergrund der Erfindung

Es wäre wünschenswert, für die extravaskuläre Tumordiagnose und -therapie eine abbildende oder therapeutische Verbindung selektiv auf den Tumor als Ziel über den Blutstrom zu richten. Bei der Diagnose könnte ein derartiges Zielen angewandt werden, um für eine größere Konzentration eines abbildenden Mittels an der Stelle des Tumors zu sorgen sowie um die Hintergrundkonzentrationen des Mittels in anderen Teilen des Körpers zu verringern. Das ortsspezifische Zielen wäre auch nützlich bei der therapeutischen Behandlung von Tumoren, um die toxischen Nebenwirkungen zu verringern und die Arzneimitteldosis zu erhöhen, die in sicherer Weise am Ort des Tumors abgegeben werden kann.
Liposomen sind als Arzneimittelträger für intravenös (IV) verabreichte Verbindungen unter Einschluß sowohl abbildender als auch therapeutischer Verbindungen vorgeschlagen worden. Die Verwendung von Liposomen für das ortsspezifische Zielen über den Blutstrom wird jedoch stark durch die rasche Entfernung der Liposomen durch Zellen des reticuloendothelialen Systems (RES) begrenzt. Typischerweise entfernt das RES 80 bis 95 % einer Dosis an IV injizierten Liposomen innerhalb einer Stunde, wobei die ausgewählte Zielstelle für die Aufnahme der Liposomen als Konkurrenz in wirksamer Weise ausgeschaltet wird.
Die europäische Patentanmeldung 0 354 855 beschreibt eine liposomale Zusammensetzung, die sich für den Transport von Hämoglobin eignet und ein Lipid umfaßt, das mit Polyethylenglykol derivatisiert ist.
Es ist über eine Reihe von Faktoren berichtet worden, die die Geschwindigkeit der RES-Aufnahme von Liposomen beeinflussen (z.B. Gregoriadis, 1974; Jonah; Gregoriadis, 1972; Juliano; Allen, 1983; Kimelberg, 1976; Richardson; Lopez-Berestein; Allen, 1981; Scherphof; Gregoriadis, 1980; Hwang; Patel, 1983; Senior, 1985; Allen, 1983; Ellens; Senior, 1982; Hwang; Ashwell; Hakomori; Karlsson; Schauer; Durocher; Greenberg; Woodruff; Czop; und Okada). Kurz gesagt wird angenommen, daß Liposomengröße, Ladung, Grad der Lipidsättigung und Oberflächengruppen für die Liposomenentfernung durch das RES von Bedeutung sind. Keiner der bis heute identifizierten einzelnen Faktoren ist jedoch wirksam, um für eine lange Halbwertszeit im Blut und insbesondere für einen vergleichsweise hohen Prozentsatz an Liposomen im Blutstrom 24 Stunden nach der Injektion zu sorgen.
Zusätzlich zu einer langen Halbwertszeit im Blut erfordert die wirksame Arzneistoffabgabe am Ort eines Tumors, daß die Liposomen imstande sind, in die kontinuierliche endotheliale Zellschicht und die darunter liegende Basismembran zu durchdringen, die die Gefäße umgeben, die den Tumor mit Blut versorgen. Tumoren können zwar ein beschädigtes, löcheriges Endothel aufweisen, es ist jedoch allgemein festgestellt worden, daß die Liposomen, um die Tumorzellen in wirksamen Mengen zu erreichen, über Mechanismen verfügen müssen, die ihren Durchgang durch die endothelialen Zellbarrieren und benachbarten Basismembranen erleichtern, und zwar insbesondere im Hinblick auf den geringen Blutstrom zu Tumoren und das damit begrenzte Ausgesetztsein gegenüber den im Kreislauf befindlichen Liposomen (Weinstein). Höhere als normale Zwischenraumdrucke, die in den meisten Tumoren festgestellt werden, führen ebenfalls zu einer Verringerung der Möglichkeit für eine Extravasation von Liposomen, indem sie eine auswärts gerichtete transvaskuläre Bewegung von Flüssigkeit aus dem Tumor erzeugen (Jain). Wie betont worden ist, ist es unwahrscheinlich, ein Liposom zu entwickeln, das diese Barrieren durch Extravasation in Tumoren überwinden und gleichzeitig der RES-Erkennung und -Aufnahme entgehen kann (Poznanski).
In der Tat zeigen bis heute durchgeführte Studien, daß selbst bei einem Anstieg der Durchlässigkeit der Blutgefäße die Extravasation von herkömmlichen Liposomen durch die Gefäße nicht wesentlich zunimmt (Poste). Auf der Basis dieser Befunde wurde geschlossen, daß das therapeutische Potential minimal ist, obwohl eine Extravasation von Liposomen aus Kapillaren, die durch eine Erkrankung geschädigt sind, in einem begrenzten Maßstab unterhalb der Nachweisgrenze stattfindet (Poste).

4. Zusammenfassende Darstellung der Erfindung

Eine allgemeine Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht darin, eine Liposomen-Zusammensetzung und ein Verfahren bereitzustellen, die wirksam für das Zielen auf Tumoren und für die selektive Lokalisierung eines abbildenden Mittels oder eines Antitumormittels in therapeutischen Dosen in systemischen, extravaskulären Tumoren sind.
Die Erfindung umfaßt gemäß einem Aspekt eine Liposomen-Zusammensetzung zur Verwendung bei der Lokalisierung eines tumorabbildenden Mittels oder eines Antitumormittels in einem festen Tumor, wie es im nachstehenden Abschnitt IV definiert wird, über den Blutstrom, wobei die Zusammensetzung folgendes enthält: Liposomen, die aus bläschenbildenden Lipiden und 1 bis 20 Mol-% eines amphipathischen bläschenbildenden Lipids zusammengesetzt sind, das mit einem unter Polyethylenglykol, Polymilchsäure, Polyglykolsäure und Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Copolymeren ausgewählten hydrophilen Polymeren mit einem Molekulargewicht von 1000 bis 5000 Dalton derivatisiert ist, die eine durchschnittliche Liposomengröße von etwa 0,07 bis 0,12 um aufweisen, und
ein tumorabbildendes Mittel oder ein Antitumormittel in einer in Liposomen eingeschlossenen Form.
Das Mittel ist in den Liposomen in eingeschlossener Form enthalten (d.h. mit der Liposomenmembran assoziiert oder im Inneren wäßrigen Kompartiment der Liposomen eingekapselt). In diesem Zusammenhang ist ein bläschenbildendes Lipid als ein beliebiges Lipid definiert, das selbst oder in Kombination mit anderen Lipiden Doppelschichtstrukturen bildet.
Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei dem hydrophilen Polymeren um Polyethylenglykol mit einem Molekulargewicht zwischen etwa 1000 und 5000 Dalton, das zu einem Phospholipid derivatisiert ist.
Für die Verwendung bei der Tumorbehandlung ist die Verbindung gemäß einer Ausführungsform ein Anthracyclin-Antibiotikum oder ein Pflanzenalkaloid, wobei mindestens etwa 80 % der Verbindung in einer in Liposomen eingeschlossenen Form vorliegt und der Arzneistoff in den Liposomen in einer Konzentration von mindestens etwa 20 ug Mittel/uMol Liposomenlipid im fall der Anthracyclin-Antibiotika und 1 ug/uMol Lipid im fall der Pflanzenalkaloide vorliegt.
Die Zusammensetzung aus Liposomen ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß sie eine Lebenszeit im Blut aufweist, wie sie durch den Prozentsatz eines liposomalen Markers, der im Blut 24 Stunden nach der IV erfolgten Verabreichung vorhanden ist, gemessen wird, die um ein Mehrfaches größer ist als die der Liposomen in Abwesenheit der derivatisierten Lipide.
Es wird auch ein Verfahren zur Herstellung eines tumorabbildenden Mittels oder eines Antitumormittels zur Lokalisierung in einem festen Tumor über den Blutstrom, z.B. wenn das Mittel durch IV erfolgende Injektion verabreicht wird, bereitgestellt.
Das Verfahren umfaßt das Einschließen des tumorabbildenden Mittels oder Antitumormittels in Liposomen, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie aus bläschenbildenden Lipiden und zwischen 1 bis 20 Mol-% eines amphipatischen bläschenbildenden Lipids zusammengesetzt sind, das mit einem hydrophilen Polymeren derivatisiert ist, das unter Polyethylenglykol, Polymilchsäure, Polyglykolsäure und Polymilchsäure/Polyglykolsäure-Copolymeren ausgewählt ist, und eine mittlere Liposomengröße von etwa 0,07 bis 0,12 um aufweisen, und
ein tumorabbildendes Mittel oder ein Antitumormittel in einer in Liposomen eingeschlossenen form.
In diesem Fall wird das Mittel nach der IV erfolgenden Verabreichung durch den Blutstrom in einer in Liposomen eingeschlossenen Form bei einem geringen Austreten von Arzneistoff während der ersten 48 Stunden nach der Injektion getragen. Aufgrund der geringen Rate der RES-Aufnahme während dieser Zeitspanne haben die Liposomen die Möglichkeit, sich zu verteilen und in den Tumor einzudringen. Wenn diese sich einmal in den Zwischenräumen des Tumors befinden, dann ist es nicht erforderlich, daß die Tumorzellen die Liposomen tatsächlich aufnehmen. Das eingeschlossene Mittel wird aus dem Liposom in enger Nachbarschaft zu den Tumorzellen über eine Zeitspanne von Tagen bis Wochen freigesetzt und kann weiter in die Tumormasse (durch einen Diffusionsprozeß) eindringen und in die Tumorzellen direkt eintreten, wobei es seine anti-proliferative Aktivität entfaltet. Eine Liposomen-Zusammensetzung, die für den Transport eines Antitumormittels aus einem Anthracyclin-Antibiotikum oder einem Pflanzenalkaloid zu systemischen festen Tumoren bevorzugt wird, enthält Phospholipide mit hohem Phasenübergang und Cholesterin, da Liposomen dieser Art nicht dazu neigen, diese Arzneistoffe freizusetzen, während sie sich im Blutkreislauf während der ersten 24 bis 48 Stunden nach der Verabreichung befinden.
Die Erfindung erlaubt es, daß die Verbindungen in einem festen Tumor in einem Individuum lokalisiert werden. Die Liposomen-Zusammensetzung wird dem Individuum IV in einer ausreichenden Menge injiziert, um eine therapeutisch wirksame Dosis des Mittels in dem festen Tumor zu lokalisieren.
Diese und weitere Aufgaben und Merkmale der vorliegenden Erfindung sind vollständiger erkennbar, wenn die nachstehende ausführliche Beschreibung der Erfindung zusammen mit der beigefügten Zeichnung gelesen wird.

Kurze Beschreibung der Zeichnung

Fig. 1 erläutert ein allgemeines Reaktionsschema für die Derivatisierung eines bläschenbildenden Lipidamins mit einem Polyalkylether;
Fig. 2 ist ein Reaktionsschema für die Herstellung von Phosphatidylethanolamin (PE), das mit Polyethylenglykol über ein Cyanurchlorid- Verknüpfungsmittel derivatisiert ist;
Fig. 3 erläutert ein Reaktionsschema für die Herstellung von Phosphatidylethanolamin (PE), das mit Polyethylenglykol mittels eines Diimidazol-Aktivierungsreagenzes derivatisiert ist;
Fig. 4 erläutert ein Reaktionsschema für die Herstellung von Phosphatidylethanolamin (PE), das mit Polyethylenglykol mittels eines Trifluormethansulfonat-Reagenzes derivatisiert ist;
Fig. 5 erläutert ein bläschenbildendes Lipid, das mit Polyethylenglykol über eine Peptid- (A), eine Ester- (B) und eine Disulfid-Verknüpfung (C) derivatisiert ist;
Fig. 6 erläutert ein Reaktionsschema für die Herstellung von Phosphatidylethanolamin (PE), das mit Polymilchsäure oder Polyglykolsäure derivatisiert ist;
Fig. 7 ist eine graphische Darstellung der Liposomen-Verweilzeiten im Blut, ausgedrückt als Prozentsatz der injizierten Dosis, als Funktion der Stunden nach der IV erfolgten Injektion für PEG-PE-Liposomen, die verschiedene Mengen an Phosphatidylglycerin enthalten;
Fig. 8 ist eine graphische Darstellung ähnlich der in Fig. 7, die die Verweilzeiten von Liposomen, die vorwiegend aus ungesättigten Phospholipid-Komponenten bestehen, im Blut zeigt;
Fig. 9 ist eine graphische Darstellung ähnlich der in Fig. 7, die die Verweilzeiten von PEG-beschichteten Liposomen (ausgefüllte Dreiecke) und herkömmlichen, nicht beschichteten Liposomen (ausgefüllte Kreise) im Blut zeigt;
Fig. 10 ist eine graphische Darstellung, die die Kinetik der Doxorubicin-Entfernung aus dem Blut bei Beagle-Hunden zeigt, und zwar für in freier Form IV verabreichtes Arzneimittel (offene Kreise), für Arzneimittel in mit gesättigten Phospholipiden und hydriertem Phosphatidylinosit (HPI) formulierten Liposomen (offene Quadrate) und für Arzneimittel in Liposomen, die mit PEG beschichtet sind (offene Dreiecke);
Figuren 11A und 11B sind graphische Darstellungen des zeitlichen Verlaufs der Doxorubicin-Aufnahme aus dem Blutstrom durch Herz (ausgefüllte Rauten), Muskel (ausgefüllte Kreise) und Tumor (ausgefüllte Dreiecke), und zwar für IV in freier Form (11A) und in PEG-liposomaler Form (11B) verabreichtes Arzneimittel;
Fig. 12 ist eine graphische Darstellung des zeitlichen Verlaufs der Aufnahme von Doxorubicin aus dem Blutstrom durch J-6456-Tumorzellen, die interperitoneal (IP) in Mäuse implantiert wurden, und zwar gemessen als gesamtes Arzneimittel (ausgefüllte Rauten), als Arzneimittel, das mit Tumorzellen assoziiert ist (ausgefüllte Kreise), und als Arzneimittel in mit Liposomen assoziierte Form (ausgefüllte Dreiecke).
Figuren 13A bis 13D sind lichtmikroskopische Aufnahmen, die die Lokalisierung von Liposomen (kleine, dunkel angefärbte Partikel) in Kupfer-Zellen in normaler Leber (13A), in der Zwischenraumflüssigkeit von C-26- Colonkarzinomen, die in Leber implantiert wurden, im Bereich einer kapillaren Versorgung der Tumorzellen (13B) und im Bereich von aktiv sich teilenden C-26-Tumorzellen, die in Leber (13C) oder subkutan (13D) implantiert wurden, zeigen;
Figuren 14A bis 14C sind graphische Darstellungen, die das Wachstum der Tumorgröße in Tagen nach der subkutanen Implantation von C-26-Colonkarzinomen zeigen, und zwar für Mäuse, die mit Kochsalzlösung als Kontrolle (offene Kreise), Doxorubicin mit 6 mg/kg (ausgefüllte Kreise), Epirubicin mit 6 mg/kg (offene Dreiecke) oder in PEG-Liposomen eingeschlossenem Epirubicin in zwei Dosierungen, nämlich 6 mg/kg (ausgefüllte Dreiecke) oder 12 mg/kg (offene Quadrate) an den Tagen 1, 8 und 15 behandelt wurden (14A); für Mäuse, die mit Kochsalzlösung (durchgezogene Linie), 6 mg/kg Epirubicin (ausgefüllte Kreise), 6 mg/kg Epirubicin plus leeren Liposomen (offene Kreise) oder in PEG-Liposomen eingeschlossenem Epirubicin in zwei Dosierungen, nämlich 6 mg/kg (ausgefüllte Dreiecke) und 9 mg/kg (ausgefüllte Quadrate) an den Tagen 3 und 10 (14B) oder den Tagen 10 und 17 (14C) behandelt wurden;
Fig. 15 ist eine graphische Darstellung, die den prozentualen Anteil an überlebenden Tieren in Tagen nach der interperitonealen Implantation von J6456-Lymphomen für Tiere, die mit Doxorubicin in freier Form (ausgefüllte Kreise) oder in PEG-liposomaler Form (ausgefüllte Dreiecke) behandelt wurden, oder für unbehandelte Tiere (ausgefüllte Quadrate) zeigt; und
Fig. 16 ist eine graphische Darstellung ähnlich der in Fig. 14, die das Wachstum der Tumorgröße in Tagen nach der subkutanen Implantation von C-26-Colonkarzinomen zeigt, und zwar für Tiere, die mit einer Kochsalzlösung als Kontrolle behandelt wurden (durchgezogene Linie), oder für Tiere, die mit 10 mg/kg Doxorubicin in freier Form (ausgefüllte Kreise) oder in herkömmlichen Liposomen (ausgefüllte Dreiecke) behandelt wurden.

Ausführliche Beschreibung der Erfindung

I. Herstellung von derivatisierten Lipiden

Fig. 1 zeigt ein allgemeines Reaktionsschema für die Herstellung eines bläschenbildenden Lipids, das mit einem biokompatiblen, hydrophilen Polymeren derivatisiert ist, wofür Polyethylenglykol (PEG), Polymilchsaure und Polyglykolsaure, die alle ohne weiteres in Wasser loslich sind, an blaschenbildende Lipide gekuppelt werden konnen und in vivo ohne toxische Wirkungen vertragen werden, Beispiele sind. Das hydrophile Polymere, das eingesetzt wird, z.B PEG, ist vorzugsweise mit einer Methoxygruppe, einer Ethoxygruppe oder einer anderen, nicht reaktiven Gruppe an einem Ende versehen oder weist alternativ eine chemische Gruppe an einem Ende auf, die stärker reaktiv ist als die Gruppe am anderen Ende. Das Polymere wird an einem seiner Enden durch Reaktion mit einem geeigneten Aktivierungsmittel, wie einem Cyanursäure-, Diimidazol- oder Anhydrid-Reagens oder dergl., aktiviert, wie es nachstehend beschrieben wird. Die aktivierte Verbindung wird anschließend mit einem bläschenbildenden Lipid, wie einem Diacylglycerin (unter Einschluß von Diacylphosphoglycerinen), umgesetzt, wobei die beiden Kohlenwasserstoffketten typischerweise eine Länge von 14 bis 22 Kohlenstoffatomen aufweisen und einen variierenden Sättigungsgrad zeigen, wobei ein derivatisiertes Lipid gebildet wird. Phosphatidylethanolamin (PE) ist ein Beispiel für ein Phospholipid, das für diesen Zweck bevorzugt wird, da es eine reaktive Aminogruppe enthält, die für die Kupplung an die aktivierten Polymeren geeignet ist. Alternativ kann die Lipidgruppe für die Reaktion mit dem Polymeren aktiviert werden, oder die beiden Gruppen können in einer konzertierten Kupplungsreaktion gemäß bekannter Kupplungsverfahren verknüpft werden. An einem Ende mit einer Methoxy- oder Ethoxygruppe versehenes PEG ist im Handel in einer Reihe von Polymergrößen, z.B. mit Molekulargewichten von 500 bis 20 000 Dalton, erhältlich.
Bei dem bläschenbildenden Lipid handelt es sich vorzugsweise um ein Lipid mit zwei Kohlenwasserstoffketten, typischerweise Acylketten, und einer polaren Kopfgruppe. Zu dieser Klasse gehören Phospholipide, wie Phosphatidylcholin (PC), PE, Phosphatidsäure (PA), Phosphatidylinosit (Pl) und Sphingomyelin (SM), wobei die beiden Kohlenwasserstoffketten typischerweise eine Länge von etwa 14 bis 22 Kohlenstoffatomen aufweisen und variierende Sättigungsgrade zeigen. Zu dieser Klasse gehören auch die Glykolipide, wie die Cerebroside und die Ganglioside.
Weitere bläschenbildende Lipide, die eingesetzt werden können, sind Cholesterin und verwandte Sterole. Im allgemeinen wird Cholesterin in der Lipiddoppelschichtmembran weniger fest verankert, insbesondere wenn es mit einem hochmolekularen Polymeren, wie Polyalkylether, derivatisiert ist, und daher fördert es weniger wirksam, daß Liposomen dem RES im Blutstrom entweichen.
Allgemeiner gesagt und entsprechend der hier herangezogenen Definition soll "bläschenbildendes Lipid" beliebige amphipathische Lipide mit hydrophoben Gruppen und polaren Kopfgruppen umfassen, die (a) selbst spontan Doppelschichtblaschen in Wasser bilden konnen, wie z.B. Phospholipide, oder (b) stabil Lipiddoppelschichten in Kombination mit Phospholipiden einverleibt werden können, wobei ihre hydrophobe Gruppe in Kontakt mit der inneren, hydrophoben Region der Doppelschichtmembran steht und ihre polare Kopfgruppe nach außen zur polaren Oberfläche der Membran orientiert ist. Beispiele für den letztgenannten Typ von bläschenbildenden Lipiden sind Cholesterin und Cholesterinderivate, wie Cholesterinsulfat und Cholesterinhemisuccinat.
Gemäß einem wichtigen Merkmal der Erfindung kann es sich bei dem bläschenbildenden Lipid um ein vergleichsweise fluides Lipid handeln, was typischerweise bedeutet, daß die Lipidphase eine vergleichsweise niedrige flüssige oder flüssigkristalline Schmelztemperatur aufweist, z.B. bei oder unterhalb Raumtemperatur, oder um ein vergleichsweise starres Lipid, was bedeutet, daß das Lipid eine vergleichsweise hohe Schmelztemperatur, z.B. bis zu 60ºC, aufweist. Als Regel tragen die starreren, d.h. stärker gesättigten Lipide zu einer größeren Steifigkeit der Membran in einer Lipiddoppelschichtstruktur bei, und sie tragen auch zu einer größeren Doppelschichtstabilität im Serum bei. Von anderen Lipidkomponenten, wie Cholesterin, ist ebenfalls bekannt, daß sie zur Membransteifigkeit und zur Stabilität in Lipiddoppelschichtstrukturen beitragen. Ein langkettiges (z.B. C-18) gesättigtes Lipid plus Cholesterin ist eine bevorzugte Zusammensetzung zur Abgabe von Antitumormitteln aus Anthracyclin-Antibiotika und Pflanzenalkaloiden an feste Tumoren, da diese Liposomen nicht dazu neigen, die Arzneistoffe im Plasma freizusetzen, wenn sie sich während der ersten 48 Stunden nach der Injektion im Blutstrom befinden und in den Tumor eindringen. Phospholipide, deren Acylketten verschiedene Sättigungsgrade aufweisen, sind im Handel erhältlich oder können gemäß veröffentlichter Verfahren hergestellt werden.
Fig. 2 zeigt ein Reaktionsschema zur Herstellung eines PE-PEG-Lipids, in dem das PEG an PE durch eine Cyanurchloridgruppe derivatisiert ist. Einzelheiten der Reaktion werden in Beispiel 1 vorgelegt. Kurz gesagt wird mit einer Methoxyendgruppe versehenes PEG mit Cyanurchlorid in Gegenwart von Natriumcarbonat unter Bedingungen aktiviert, die zur aktiven PEG-Verbindung, die in der Figur gezeigt ist, führen. Dieses Material wird gereinigt, um nicht umgesetzte Cyanursäure zu entfernen. Die aktivierte PEG-Verbindung wird mit PE in Gegenwart von Triethylamin umgesetzt, um die gewünschte, in der Figur gezeigte PE-PEG-Verbindung herzustellen. Die Ausbeute beträgt etwa 8 bis 10 % im Hinblick auf die eingesetzten Mengen an PEG.
Das gerade beschriebene Verfahren kann auf eine Reihe von Lipidaminen unter Einschluß von PE, Cholesterylamin und Glykolipiden mit Zucker- Amin-Gruppen angewandt werden.
Ein zweites Verfahren zur Kupplung eines Polyalkylethers, wie eines mit einer Endgruppe versehenen PEG, an ein Lipidamin wird in Fig. 3 erläutert. Hier wird das mit einer Endgruppe versehene PEG mit einem Carbonyldiimidazol-Kupplungsreagens aktiviert, um die aktivierte Imidazolverbindung zu bilden, die in Fig. 3 gezeigt ist. Die Reaktion mit einem Lipidamin, wie PE, führt zur PEG-Kupplung an das Lipid durch eine Amidverknüpfung, wie es durch die in der Figur gezeigte PEG-PE-Verbindung erläutert wird. Einzelheiten der Reaktion werden in Beispiel 2 vorgelegt.
Ein drittes Reaktionsverfahren zur Kupplung eines mit einer Endgruppe versehenen Polyalkylethers mit einem Lipidamin ist in Fig. 4 gezeigt. Hier wird das PEG zuerst an einem Ende durch eine Trimethylsilan- Gruppe geschützt. Die Reaktion zum Schützen des Endes ist in der Figur gezeigt und beinhaltet die Umsetzung von Trimethylsilylchlorid mit PEG in Gegenwart von Triethylamin. Das geschützte PEG wird dann mit dem Anhydrid von Trifluormethylsulfonat unter Bildung der PEG-Verbindung, die mit Trifluormethylsulfonat aktiviert ist, umgesetzt. Die Reaktion der aktivierten Verbindung mit einem Lipidamin, wie PE, in Gegenwart von Triethylamin führt zum gewünschten derivatisierten Lipidprodukt, wie der PEG-PE-Verbindung, in der die Lipidamingruppe an den Polyether über den endständigen Methylenkohlenstoff im Polyetherpolymeren gekuppelt ist. Die Trimethylsilyl-Schutzgruppe kann durch eine Säurebehandlung, wie es in der Figur gezeigt ist, oder alternativ durch Umsetzung mit einem quaternären Aminfluoridsalz, wie dem Fluoridsalz von Tetrabutylamin, freigesetzt werden.
Es ist darauf hinzuweisen, daß eine Reihe von bekannten Kupplungsreaktionen zusätzlich zu den gerade beschriebenen sich für die Herstellung von bläschenbildenden Lipiden, die mit hydrophilen Polymeren, wie PEG, derivatislert sind, eignet. Zum Beispiel kann das Sulfonatanhydrid- Kupplungsreagens, das in Fig. 4 erläutert ist, verwendet werden, um einen aktivierten Polyalkylether mit der Hydroxylgruppe eines amphipathischen Lipids, wie 5'-OH von Cholesterin, zu verknüpfen. Weitere reaktive Lipidgruppen, wie eine Säure- oder Ester-Lipidgruppe, können ebenfalls für die Kupplung gemäß bekannter Kupplungsverfahren genutzt werden. Zum Beispiel kann die Säuregruppe von Phosphatidsäure unter Bildung eines aktiven Lipidanhydrids durch Umsetzung mit einem geeigneten Anhydrid, wie Essigsäureanhydrid, aktiviert werden, und das reaktive Lipid kann mit einem geschützten Polyalkylamin durch Reaktion in Gegenwart eines Isothiocyanat- Reagenzes verknüpft werden.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform werden die derivatisierten Lipidkomponenten hergestellt, so daß sie eine labile Lipid-Polymer-Verknüpfung, wie eine Peptid-, Ester- oder Disulfid-Verknüpfung, enthalten, die unter ausgewählten physiologischen Bedingungen, wie in Gegenwart von Peptidase- oder Esterase-Enzymen oder Reduktionsmitteln, wie Glutathion, die im Blutstrom vorhanden sind, gespalten werden kann. Fig. 5 zeigt beispielhaft Lipide, die über (A) Peptid-, (B) Ester- und (C) Disulfid-haltige Verknüpfungen verknüpft sind. Die Peptid-verknüpfte Verbindung kann z.B. hergestellt werden, indem zuerst ein Polyalkylether mit dem N-terminalen Amin des gezeigten Tripeptids, z.B. über die in Fig. 3 gezeigte Reaktion, gekuppelt wird. Die Peptid-Carboxylgruppe kann anschließend an eine Lipidamingruppe auf herkömmliche Weise durch ein Carbodiimid-Kupplungsreagens gebunden werden. Die Ester-verknüpfte Verbindung kann z.B. durch Kupplung einer Lipidsäure, wie Phosphatidsäure, mit der endständigen Alkoholgruppe eines Polyalkylethers unter Verwendung von Alkohol über ein Anhydrid-Kupplungsmittel gekuppelt werden. Alternativ dazu kann ein kurzes verknüpfendes Fragment, das eine innere Esterbindung und geeignete Endgruppen, wie primäre Amingruppen, enthält, verwendet werden, um den Polyalkylether an das amphipathische Lipid über Amid- oder Carbamat-Verknüpfungen zu kuppeln. Entsprechend kann das verknüpfende Fragment eine innere Disulfidverknüpfung zur Verwendung bei der Bildung der Verbindung, die bei C in Fig. 5 gezeigt ist, enthalten. Polymere, die an Phospholipide über derartige reversible Verknüpfungen gekuppelt sind, eignen sich, um hohe Blutspiegel an Liposomen, die sie enthalten, für die ersten paar Stunden nach der Injektion bereitzustellen. Nach dieser Zeitspanne spalten Plasmakomponenten die reversiblen Bindungen, wobei die Polymeren freigesetzt werden, und die "ungeschützten" Liposomen werden rasch durch das RES aufgenommen.
Fig. 6 erläutert ein Verfahren zur Derivatisierung von Polymilchsäure mit PE. Die Polymilchsäure wird in Gegenwart von PE mit Dicyclohexylcarboimid (DCCI) umgesetzt, wie es ausführlich in Beispiel 4 dargestellt wird. Entsprechend kann ein bläschenbildendes Lipid, das mit Polyglykolsäure derivatisiert ist, durch Umsetzung von Polyglykolsäure oder Glykolsäure mit PE in Gegenwart eines geeigneten Kupplungsmittels, wie DCCI, gebildet werden, wie es ebenfalls ausführlich in Beispiel 4 dargestellt wird. Die bläschenbildenden Lipide, die mit Polymilchsäure oder Polyglykolsäure derivatisiert sind, bilden einen Teil der vorliegenden Erfindung. Einen Teil der Erfindung bilden auch Liposomen, die diese derivatisierten Lipide in einer Menge von 1 bis 20 Mol-% enthalten.

II. Herstellung von Liposomen-Zusammensetzungen

A. Lipidkomponenten

Die Lipidkomponenten, die zur Bildung der erfindungsgemäßen Liposomen verwendet werden, können aus einer Reihe von bläschenbildenden Lipiden, typischerweise unter Einschluß von Phospholipiden, Sphingolipiden und Sterolen, ausgewählt werden. Wie deutlich werden wird, ist eine Anforderung an die erfindungsgemäßen Liposomen eine lange Lebenszeit im Blutkreislauf. Es ist daher zweckmäßig, ein Standardmaß für die Lebensdauer im Blut einzuführen, das herangezogen werden kann, um die Wirkung von Lipidkomponenten auf die Halbwertszeit im Blut zu bewerten.
Ein Verfahren, das zur Bewertung der Verweilzeit von Liposomen im Kreislauf in vivo herangezogen wird, mißt die Verteilung von IV injizierten Liposomen im Blutstrom und den primären Organen des RES zu ausgewählten Zeitpunkten nach der Injektion. In dem standardisierten Modell, das hier herangezogen wird, wird die RES-Aufnahme durch das Verhältnis der gesamten Liposomen im Blutstrom zu den gesamten Liposomen in der Leber und der Milz, den hauptsächlichen Organen des RES, gemessen. In der Praxis wird hinsichtlich Alter und Geschlecht übereinstimmenden Mäusen IV über die Schwanzvene eine radioaktiv markierte Liposomen-Zusammensetzung injiziert, und Daten für jeden Zeitpunkt werden bestimmt, indem die gesamten Zählraten der radioaktiven Markierung von Blut und der Kombination Leber und Milz gemessen werden, wie es ausführlich in Beispiel 5 erläutert wird.
Da die Leber und die Milz für nahezu 100 % der anfänglichen Aufnahme der Liposomen durch das RES verantwortlich sind, ist das gerade beschriebene Blut/RES-Verhältnis eine gute Näherung für das Ausmaß der Aufnahme aus dem Blut in das RES in vivo. Zum Beispiel zeigt ein Verhältnis von etwa 1 oder mehr, daß die überwiegende Menge von injizierten Liposomen im Blutstrom bleibt, und ein Verhältnis unter etwa 1 zeigt eine überwiegende Menge an Liposomen im RES. Für die meisten Lipidzusammensetzungen von Interesse wurden Blut/RES-Verhältnisse 1, 2, 3, 4 und 24 Stunden nach der Injektion berechnet.
Die erfindungsgemäßen Liposomen umfassen 1 bis 20 Mol-% eines bläschenbildenden Lipids, das mit einem hydrophilen Polymeren derivatisiert ist, wie es in Abschnitt I beschrieben wird. Gemäß einem Aspekt der vorliegenden Erfindung wurde festgestellt, daß die Halbwertszeiten im Blutkreislauf dieser Liposomen stark vom Grad der Sättigung der Phospholipidkomponenten, die die Liposomen ausmachen, abhängen. Das heißt, die Phospholipidkomponenten können vorwiegend aus fluiden, vergleichsweise ungesättigten Acylketten oder aus mehr gesättigten, Steifigkeit verleihenden Acylketten-Komponenten bestehen. Dieses Merkmal der Erfindung ist in Beispiel 6 ersichtlich, bei dem Blut/RES-Verhältnisse für Liposomen, die mit PEG-PE, Cholesterin und PC mit variierenden Sättigungsgeraden gebildet wurden, untersucht wurden (Tabelle 4). Wie aus den Daten in Tabelle 5 in diesem Beispiel ersichtlich ist, wurden hohe Blut/RES-Verhältnissen in im wesentlichen allen Liposomenformulierungen unabhängig vom Ausmaß der ungesättigten Beschaffenheit der Lipide in der Hauptmenge an PC-Phospholipid erzielt, und es wurde kein systematischer Trend als eine Funktion des Grads der Lipidsättigung beobachtet.
Dementsprechend können die bläschenbildenden Lipide ausgewählt werden, um einen festgelegten Grad an Fluidität oder Steifigkeit zu erzielen, die Stabilität der Liposomen im Serum und die Geschwindigkeit der Freisetzung eines eingeschlossenen Arzneistoffes aus den Liposomen in den Blutstrom und/oder Tumor zu steuern. Die bläschenbildenden Lipide können hinsichtlich der Lipid-Sättigungseigenschaften auch ausgewählt werden, um gewünschte Eigenschaften des Liposomen-Präparats zu erzielen. Es ist im allgemeinen z.B. der Fall, daß stärker fluide Lipide einfacher zu formulieren und durch Extrusions- und Homogenisierungsverfahren leichter in ihrer Größe zu verringern sind als starrere Lipidzusammensetzungen.
Entsprechend ist festgestellt worden, daß der prozentuale Anteil von Cholesterin in den Liposomen über einen weiten Bereich ohne einen wesentlichen Einfluß auf die beobachteten Blut/RES-Verhältnisse variieren kann. Die in Beispiel 7A vorgelegten Studien zeigen mit Bezug auf die dortige Tabelle 6 praktisch keine Anderung in den Blut/RES-Verhältnissen im Bereich von Cholesterin zwischen 0 und 30 Mol-%.
In Studien, die zur Stützung der Erfindung durchgeführt wurden, ist auch festgestellt worden, daß die Blut/RES-Verhältnisse vergleichsweise unbeeinflußt vom Vorhandensein von geladenen Lipidkomponenten, wie Phosphatidylglycerin (PG), sind. Dies ist aus Fig. 7 ersichtlich, die graphisch den prozentualen Verlust von eingeschlossenem Marker für PEG-PE- Liposomen mit einem Gehalt an 4,7 Mol-% PG (Dreiecke) oder 14 Mol-% PG (Kreise) zeigt. Es wurde praktisch kein Unterschied in der Liposomenretention im Blutstrom über eine Zeitspanne von 24 Stunden beobachtet. Die Möglichkeit, den Liposomen negative Ladung einzuverleiben, ohne die RES- Aufnahme zu verschärfen, bietet eine Reihe möglicher Vorteile. Liposomensuspensionen, die negative Ladung enthalten, neigen dazu, weniger empfindlich gegenüber einer Aggregation in Puffern hoher Ionenstärke zu sein, und somit wird die physikalische Stabilität erhöht. Darüber hinaus kann eine negative Ladung, die in der Liposomenmembran vorhanden ist, auch als Formulierungshilfsmittel verwendet werden, um in wirksamer Weise große Mengen an kationischen Arzneistoffen zu binden.
Das bläschenbildende Lipid, das mit einem hydrophilen Polymeren derivatisiert ist, ist in einer Menge vorzugsweise zwischen etwa 1 und 20 Mol-% auf der Basis der Mole an derivatisiertem Lipid als Prozentsatz der gesamten Mole an bläschenbildenden Lipiden vorhanden. Es ist darauf hinzuweisen, daß ein geringeres Molverhältnis, wie weniger als 1,0 Mol-%, für ein Lipidderivat mit einem Polymeren mit hohem Molekulargewicht, wie einem Polymeren mit einem Molekulargewicht von 100 Kilodalton, geeignet sein kann. Wie in Abschnitt I festgestellt wird, weist das hydrophile Polymere im derivatisierten Lipid vorzugsweise ein Molekulargewicht zwischen etwa 200 und 20 000 Dalton und insbesondere zwischen etwa 500 und 5000 Dalton auf. Beispiel 7B, in dem der Einfluß von sehr kurzen Ethoxyethergruppen auf die Blut/RES-Verhältnisse untersucht wird, zeigt, daß Polyethergruppen größer als etwa 5 Kohlenstoffether erforderlich sind, um eine signifikante Erhöhung der Blut/RES-Verhältnisse zu erzielen.

B. Herstellung der Liposomen-Zusammensetzung

Die Liposomen können nach einer Reihe von Techniken, wie denen, die ausführlich von Szoka et al., 1980, beschrieben werden, hergestellt werden. Ein Verfahren zur Herstellung von Arzneimitteln enthaltenden Liposomen ist das Umkehrphasenverdampfungsverfahren, das von Szoka et al. und in U.S.-Patent 4 235 871 beschrieben wird. Die Umkehrphasenverdampfungsbläschen (REVs) weisen typischerweise durchschnittliche Größen zwischen etwa 2 und 4 um auf und sind vorwiegend oligolamellar, d.h. sie enthalten eine oder einige Lipiddoppelschichtschalen. Das Verfahren wird ausführlich in Beispiel 4A erläutert.
Multilamellare Bläschen (MLVs) können durch einfache Lipidfilm-Hydratisierungstechniken hergestellt werden. Bei diesen Verfahren wird ein Gemisch von Liposomen bildenden Lipiden der vorstehend angegebenen Art, das in einem geeigneten organischen Lösungsmittel gelöst ist, in einem Gefäß unter Bildung eines dünnen Films eingedampft, der dann mit einem wäßrigen Medium bedeckt wird, wie es ausführlich in Beispiel 4B beschrieben wird. Der Lipidfilm wird unter Bildung von MLVs typischerweise mit Größen zwischen etwa 0,1 bis 10 um hydratisiert.
Gemäß einem wichtigen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden die Liposomen so hergestellt, daß sie im wesentlichen homogene Größen in einem gewählten Bereich zwischen etwa 0,07 und 0,12 um aufweisen. Insbesondere ist festgestellt worden, daß Liposomen in diesem Größenbereich ohne weiteres zu einer Extravasation in feste Tumoren imstande sind, wie es im nachstehenden Abschnitt III erläutert wird, und daß sie gleichzeitig imstande sind, eine erhebliche Arzneimittelmenge zum Tumor zu tragen (im Gegensatz zu kleinen unilamellaren Bläschen, die hinsichtlich der Kapazität zur Beladung mit Arzneimitteln stark beschränkt sind).
Ein wirksames Verfahren zur Einstellung der Größe von REVs und MLVs beinhaltet das Extrudieren einer wäßrigen Suspension der Liposomen durch eine Reihe von Polycarbonatmembranen mit einer ausgewählten gleichförmigen Porengröße im Bereich von 0,03 bis 0,2 um und typischerweise 0,05, 0,08, 0,1 oder 0,2 um. Die Porengröße der Membran entspricht grob der größten Größe der Liposomen, die durch Extrusion durch diese Membran hergestellt werden, insbesondere, wenn das Präparat zweimal oder öfter durch die gleiche Membran extrudiert wird. Dieses Verfahren zur Größeneinstellung von Liposomen wird bei der Herstellung von REV- und MLV-Zusammensetzungen mit homogener Größe herangezogen, die in den nachstehenden Beispielen beschrieben werden. Ein neueres Verfahren beinhaltet die Extrusion durch einen asymmetrischen keramischen Filter. Dieses Verfahren wird ausführlich im US-Patent 4 737 323 (Liposome Extrusion, erteilt am 12. April 1988) beschrieben. Homogenisierungsverfahren eignen sich auch für die Verringerung der Größe von Liposomen auf Größen von 100 nm oder weniger (Martin).

C. Beladung mit Verbindungen

Gemäß einer Ausführungsform wird die erfindungsgemäße Zusammensetzung zur Lokalisierung eines abbildenden Mittels, wie eines Radioisotops unter Einschluß von 67Ga und 111In oder einer paramagnetischen Verbindung, am Ort des Tumors verwendet. Bei diese Anwendung, in der die radioaktive Markierung bei einer vergleichsweise niedrigen Konzentration nachgewiesen werden kann, ist es im allgemeinen ausreichend, das abbildende Mittel durch passive Beladung, z.B. während der Bildung der Liposomen, einzuschließen. Dies kann z.B. durch Hydratisierung von Lipiden mit einer wäßrigen Lösung des Mittels, das eingeschlossen werden soll, erfolgen.
Typischerweise sind radioaktive Markierungsmittel radioisotope Metalle in chelatisierter Form, wie &sup6;&sup7;Ga-Desferal, und sie werden in den Liposomen im wesentlichen in eingeschlossener Form aufgenommen. Nach der Liposomenbildung und Größeneinstellung kann nicht eingeschlossenes Material nach einem von einer Reihe von Verfahren, wie durch Ionenaustausch- oder Gelfiltrationschromatographie, entfernt werden. Die Konzentration an chelatisiertem Metall, die durch passive Beladung erzielt werden kann, ist durch die Konzentration des Mittels im hydratisierenden Medium begrenzt.
Eine aktive Beladung mit radioaktiv abbildenden Mitteln ist ebenfalls möglich, indem ein wasserlösliches chelatisierendes Mittel hoher Affinität (wie EDTA oder Desferoxamin) innerhalb des wäßrigen Kompartiments der Liposomen eingeschlossen wird, nicht eingeschlossenes chelatisierendes Mittel durch Dialyse oder Gelausschluß-Säulenchromatographie entfernt wird, und die Liposomen in Gegenwart des Metallradioisotops, das mit einem lipidlöslichen Chelatisierungsmittel geringerer Affinität, wie 8-Hydroxychinolin, chelatisiert ist, inkubiert werden. Das Metallradioisotop wird in das Liposom durch das lipidlösliche Chelatisierungsmittel getragen. Wenn es sich einmal im Liposom befindet, dann wird das Radioisotop durch das eingeschlossene, wasserlösliche Chelatisierungsmittel chelatisiert, was zum wirksamen Einfangen des Radioisotops im Innern des Liposoms führt (Gabizon).
Eine passive Beladung kann auch für die amphipathischen Antitumorverbindungen, wie die Alkaloide Vinblastin und Vincristin, erfolgen, die bei vergleichsweise geringen Arzneimitteldosen, z.B. etwa 1-15 mg/m², therapeutisch wirksam sind. Hier wird der Arzneistoff entweder in der wäßrigen Phasen, die zur Hydratisierung des Lipids verwendet wird, gelöst oder den Lipiden beim Liposomenbildungsverfahren einverleibt, und zwar abhängig von der Löslichkeit der Verbindung. Nach der Liposomenbildung und -größeneinstellung kann freier (ungebundener) Arzneistoff wie zuvor z.B. durch ionenaustausch- oder gelausschluß-chromatographische Verfahren entfernt werden.
Wenn die Antitumorverbindung einen Peptid- oder Proteinarzneistoff, wie Interleukin 2 (IL-2) oder Gewebenekrosefaktor (TNF), umfaßt, oder wenn die Liposomen so formuliert werden, daß sie einen Peptid-Immunmodulator, wie Muramyl di oder tripeptid Derivate, oder einen Protein-Immunmodulator, wie Makrophagen-Kolonie-stimulierenden Faktor (M-CSF), enthalten, dann werden die Liposomen vorzugsweise nach dem vorstehenden Um kehrphasen-Verfahren oder durch Rehydratisierung eines gefriergetrockneten Gemisches aus dem Protein und einer Suspension von kleinen unilamellaren Bläschen mit Wasser hergestellt (Kirby). Beide Verfahren kombinieren die passive Beladung mit einem vergleichsweise hohen Wirkungsgrad des Einschließens, z.B. einem Wirkungsgrad von bis zu 50 %. Nicht eingeschlossenes Material kann ohne weiteres aus der Liposomensuspension, z.B. durch Dialyse, Diafiltration oder Ausschlußchromatographie, entfernt werden.
Die Konzentration an hydrophobem Arzneistoff, der in den Liposomen aufgenommen werden kann, hängt von Arzneistoff/Lipid-Wechselwirkungen in der Membran ab, ist im allgemeinen jedoch auf eine Arzneistoffkonzentration von weniger als etwa 20 ug Arzneistoff/mg Lipid begrenzt. Genauer gesagt ist für eine Reihe von Anthracyclin-Antibiotika, wie Doxorubicin und Epirubicin, die höchste Konzentration an eingeschlossenem Material, die durch passive Beladung des wäßrigen Kompartiments des Liposoms erzielt werden kann, etwa 10 bis 20 ug/uMol Lipid (aufgrund der geringen innewohnenden Wasserlöslichkeit dieser Verbindungen). Wenn 20 bis 30 Mol-% eines anionischen Phospholipids, wie PG, der Membran einverleibt werden, dann kann der Beladungsfaktor auf etwa 40 ug/uMol Lipid erhöht werden, da die Anthracycline positiv geladen sind und einen "Ionenpaar"-Komplex mit dem negativ geladenen PG an der Membrangrenzfläche bilden. Derartige geladene komplexierte Anthracyclin-Formulierungen haben im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung (die es erfordert, daß der Arzneistoff durch den Blutstrom für die ersten 24 bis 48 Stunden nach IV erfolgter Verabreichung in einer in Liposomen eingeschlossenen Form getragen wird) jedoch nur eine begrenzte Brauchbarkeit, da eine Tendenz zur raschen Freisetzung von Arzneistoff aus der Liposomenmembran bei Einführung ins Plasma besteht.
Gemäß einem weiteren Aspekt der Erfindung ist als wesentlich für die Abgabe einer therapeutisch wirksamen Dosis einer Reihe von amphipathischen Antitumorarzneistoffen an Tumoren festgestellt worden, die Liposomen mit einer hohen Arzneistoffkonzentration durch Verfahren der aktiven Arzneistoffbeladung zu beladen. Zum Beispiel ist für antibiotische Anthracyclin-Arzneistoffe, wie Doxorubicin, Epirubicin, Daunorubicin, Carcinomycin, N-Acetyladriamycin, Rubidazon, 5-Imidodaunomycin und N-Acetyldaunomycin eine Endkonzentration an in Liposomen eingeschlossenem Arzneistoff von mehr als etwa 25 ug/uMol Lipid und vorzugsweise 50 ug/uMol Lipid günstig. Innere Arzneistoffkonzentrationen mit hohen Werten von 100 bis 200 ug/uMol Lipid werden in Betracht gezogen.
Ein Verfahren zur aktiven Beladung von Liposomen mit amphipathischen Arzneistoffen wird im US-Patent 5 192 549 der gleichen Inhaberin beschrieben. Bei diesem Verfahren werden Liposomen in Gegenwart von vergleichsweise hohen Konzentrationen an Ammoniumionen, wie 0,125 m Ammoniumsulfat, hergestellt. Nach der Einstellung der Liposomen auf die gewünschte Größe wird die Liposomensuspension behandelt, um einen von innen nach außen gerichteten Ammoniumionengradienten über die liposomalen Membranen zu erzeugen. Der Gradient kann durch Dialyse gegen ein Medium, das kein Ammonium enthält, wie ein isotones Glucosemedium, oder durch Gelfiltration, z.B. über eine Sephadex G-50-Säule, die mit 0,15 m NaCl oder KCl äquilibriert ist, wobei die Ammoniumionen in der äußeren Phase in wirksamer Weise durch Natrium- oder Kaliumionen ersetzt werden, erzeugt werden. Alternativ dazu kann die Liposomensuspension mit einer kein Ammonium enthaltenden Lösung verdünnt werden, wobei die Konzentration an Ammoniumionen in der äußeren Phase verringert wird. Die Ammoniumkonzentration im Innern der Liposomen beträgt vorzugsweise mindestens das 10-fache und insbesondere mindestens das 100- bis 1000-fache der Konzentration in der in bezug auf die Liposomen äußeren Phase.
Der Ammoniumionengradient über die Liposomen erzeugt wiederum einen pH-Gradienten, da Ammonium über die Liposomenmembran freigesetzt wird, und Protonen werden in der inneren wäßrigen Phase der Liposomen eingeschlossen. Um die Liposomen mit dem gewählten Arzneistoff zu beladen, wird eine Suspension der Liposomen, z.B. etwa 20 bis 200 mg/ml Lipid, mit einer wäßrigen Lösung des Arzneistoffs gemischt, und man erlaubt eine Aquilibrierung des Gemisches über eine Zeitspanne, z.B. mehrere Stunden, bei Temperaturen im Bereich von Raumtemperatur bis 60ºC, und zwar abhängig von der Phasenübergangstemperatur der Lipide, die zur Bildung der Liposomen verwendet werden. Bei einem typischen Verfahren wird eine Suspension von Liposomen mit einer Lipidkonzentration von 50 uMol/ml mit einem gleichen Volumen an Anthracyclin-Arzneistoff in einer Konzentration von etwa 5 bis 8 mg/ml gemischt. Am Ende der Inkubationszeit wird die Suspension behandelt, um freien (ungebundenen) Arzneistoff zu entfernen. Ein bevorzugtes Verfahren zur Entfernung von Arzneistoff ist für Anthracyclin-Arzneistoffe das Leiten über ein Ionenaustauschharz, wie Dowex 50 WX-4, das zur Bindung des Arzneistoffs imstande ist.
Obwohl, wie vorstehend festgestellt wurde, Pflanzenalkaloide, wie Vincristin, keine hohen Beladungsfaktoren in Liposomen aufgrund der ihnen innewohnenden hohen Antitumoraktivität erfordern und daher durch Techniken zum passiven Einschließen aufgeladen werden können, ist es möglich, diese Arzneistoffe durch aktive Verfahren aufzuladen. Da Vincristin amphipathisch und eine schwache Base ist, können Liposomen mit diesen und ähnlichen Molekülen unter Ausnutzung eines pH-Gradienten, der durch Einschließen von Ammoniumsulfat gebildet wird, wie es vorstehend für die Anthracyclin-Antibiotika beschrieben wurde, beladen werden.
Das gerade beschriebene Fernbeladungsverfahren wird in Beispiel 10 erläutert, das die Herstellung von MLVs mit 0,1 gin, die mit Doxorubicin bei einer Arzneistoffendkonzentration von etwa 80 bis 100 ug/uMol Lipid beladen sind, beschreibt. Die Liposomen zeigen eine sehr geringe Geschwindigkeit des Arzneistoffverlusts, wenn sie bei 4ºC gelagert werden.

III. Liposouien-Lokalisierung in festen Tumoren

A. Ausgedehnte Halbwertszeit im Blutstrom

Eine der Anforderungen für die erfindungsgemäße Liposomenlokalisierung in Zieltumoren ist eine verlängerte Halbwertszeit der Liposomen im Blutstrom nach der IV erfolgenden Liposomenverabreichung. Ein Maß für die Lebensdauer von Liposomen im Blutstrom ist das Blut/RES-Verhältnis, das zu einem ausgewählten Zeitpunkt nach der Liposomenverabreichung bestimmt wird, wie es vorstehend erörtert wurde. Blut/RES-Verhältnisse für eine Reihe von Liposomen-Zusammensetzungen sind in Tabelle 3 von Beispiel 5 angegeben. In Abwesenheit von PEG-derivatisierten Lipiden betrugen die Blut/RES-Verhältnisse 0,03 oder weniger. In Gegenwart von PEG-derivatisierten Lipiden lagen die Blut/RES-Verhältnisse im Bereich von 0,2 für niedermolekulares PEG bis zwischen 1,7 und 4 für mehrere Formulierungen, wobei eine der Formulierungen kein Cholesterin enthielt und drei der Formulierungen kein zugegebenes geladenes Phospholipid (z.B. PG) enthielten.
Die in Tabelle 5 von Beispiel 6 vorgelegten Daten zeigen Blut/RES- Verhältnisse (unter Ausschluß von zwei Punkten mit einer geringen prozentualen Wiederfindung) zwischen etwa 1,26 und 3,27, was konsistent mit den in Tabelle 3 angegebenen Daten ist. Wie im vorstehenden Abschnitt II festgestellt wurde, sind die Halbwertszeiten im Blut im wesentlichen unabhängig vom Sättigungsgrad der Liposomenlipide, vom Vorhandensein von Cholesterin und vom Vorhandensein von geladenen Lipiden.
Die Blut/RES-Werte, über die vorstehend berichtet wurde, können mit Blut/RES-Werten verglichen werden, über die im US-Patent 4 920 016 der gleichen Inhaberin berichtet wird, wobei Blut/RES-Meßverfahren angewandt wurden, die denen entsprechen, die zur Erzeugung der in den Tabellen 3 und 5 vorgelegten Daten herangezogen wurden. Die besten Blut/RES-Verhältnisse über 24 Stunden, über die im vorstehend angegebenen Patent berichtet wird, betragen 0,9 für eine Formulierung, die aus GM&sub1;, gesättigtem PC und Cholesterin besteht. Die nächstbesten Formulierungen ergeben 24 Stunden-Blut/RES-Werte von etwa 0,5. Die typischen Blut/RES-Verhältnisse über 24 Stunden, die bei einer Anzahl der vorliegenden Formulierungen erzielt wurden, waren also mehr als zweimal so hoch wie bei den besten Formulierungen, über die bisher berichtet wurde. Ferner war die Möglichkeit, hohe Blut/RES-Werte mit GM&sub1;- oder HPI-Lipiden zu erzielen, davon abhängig, daß vorwiegend gesättigte Lipide und Cholesterin in den Liposomen vorhanden waren.
Die Plasma-Pharmacokinetik eines liposomalen Markers im Blutstrom ergibt ein weiteres Maß für die erhöhte Lebenszeit der Liposomen, die für die erfindungsgemäßen Liposomenformulierungen erzielt wird. Die vorstehend erläuterten Figuren 7 und 8 zeigen den langsamen Verlust an liposomalem Marker aus dem Blutstrom über eine Zeitspanne von 24 Stunden bei typischen PEG-Liposomen-Formulierungen, und zwar im wesentlichen unabhängig davon, ob der Marker ein Lipid oder eine eingeschlossene wasserlösliche Verbindung ist (Figur 8). In beiden graphischen Darstellungen ist die Menge an liposomalem Marker, die 24 Stunden nach der Liposomeninjektion vorhanden ist, größer als 10 % des ursprünglich injizierten Materials.
Fig. 9 zeigt die Kinetik des Liposomenverlusts aus dem Blutstrom für eine typische PEG-Liposomen-Formulierung und die gleichen Liposomen in Abwesenheit eines PEG-derivatisierten Lipids. Nach 24 Stunden war der prozentuale Anteil an Marker, der in den PEG-Liposomen verblieb, größer als etwa 20 %, während die herkömmlichen Liposomen weniger als 5 % Retention im Blut nach 3 Stunden und praktisch keinen nachweisbaren Marker nach 24 Stunden zeigten.
Die in den Figuren 7 bis 9 dargestellten Ergebnisse sind konsistent mit 24 Stunden-Blut-Liposomen-Werten, die für eine Reihe von Liposomen-Formulierungen gemessen wurden und über die in den Tabellen 3 und 5 bis 7 der nachstehenden Beispiele 5 bis 8 berichtet wird. Wie aus Tabelle 3 von Beispiel 5 ersichtlich ist, betrug die nach 24 Stunden verbleibende Dosis weniger als 1 % bei herkömmlichen Liposomen, gegenüber mindestens 5 % bei PEG-Liposomen. Bei den besten Formulierungen wurden Werte zwischen etwa 20 bis 40 % erzielt. Ähnlich lagen in Tabelle 5 von Beispiel 6 die Liposomenkonzentrationen im Blut nach 24 Stunden (erneut unter Vernachlässigung von zwei Einträgen mit geringen Wiederfindungswerten) zwischen 12 und etwa 25 % der gesamten gegebenen Dosis. Über ähnliche Ergebnisse wird in den Tabellen 6 und 7 von Beispiel 7 berichtet.
Die Fähigkeit der Liposomen, einen amphipathischen Antitumorarzneistoff im Blutstrom über die Zeitspanne von 24 bis 48 Stunden zu halten, die erforderlich ist, um den Liposomen eine Möglichkeit zu verschaffen, einen systemischen Tumor zu erreichen und in ihn einzudringen, wurde ebenfalls untersucht. In der Studie, über die in Beispiel 11 berichtet wird, wurde die Plasma-Pharmacokinetik von Doxorubicin, mit dem PEG-Liposomen beladen waren, in freier Form gegebenem Doxorubicin und Doxorubicin, mit dem Liposomen beladen waren, die hydriertes Phosphatidylinosit (HPI) enthielten, bei Beagle-Hunden untersucht. Die HPI-Liposomen wurden mit einem überwiegend gesättigten PC-Lipid und Cholesterin formuliert und stellen eine der optimalen Formulierungen dar, die im vorstehenden US-Patent der gleichen Inhaberin beschrieben werden. Die Kinetik von Doxorubicin im Blut bis zu 72 Stunden nach der Arzneimittelverabreichung ist in Fig. 11 gezeigt. Beide liposomalen Formulierungen zeigten einen exponentiellen Verlust an Arzneistoff mit einer Mode, im Gegensatz zum freien Arzneistoff, der ein biexponentielles Muster zeigt. Die Menge an Arzneistoff, die im Blutstrom nach 72 Stunden gehalten wurde, war jedoch 8 bis 10 mal größer bei den PEG-Liposomen.
Sowohl für die Blut/RES-Verhältnisse als auch für die Zeit, für die die Liposomen im Blutstrom gehalten wurden, können die aus einem Tiermodellsystem erhaltenen Daten in vernünftiger Weise auf Menschen und für den Tierarzt interessante Tiere übertragen werden. Dies hat seinen Grund darin, daß festgestellt wurde, daß die Aufnahme von Liposomen durch Leber und Milz bei mehreren Säugerspezies unter Einschluß von Mäusen, Ratten, Affen und Menschen (Gregoriadis, 1974; Jonah; Kimelberg, 1976; Juliano; Richardson; Lopez-Berestein) mit ähnlicher Rate auftritt. Dieses Ergebnis spiegelt wahrscheinlich die Tatsache wieder, daß biochemische Faktoren, die für die Aufnahme von Liposomen durch das RES von besonderer Bedeutung zu sein scheinen - unter Einschluß der Opsonisation durch Serumlipoproteine, größenabhängiger Aufnahmeeffekte und der Zellabschirmung durch Oberf lächengruppen - gemeinsame Merkmale aller Säugerspezies sind, die untersucht worden sind.

B. Extravasation in Tumoren

Ein weiteres erforderliches Merkmal für erfindungsgemäße hochaktive Liposomen, die auf einen festen Tumor zielen, ist die Liposomenextravasation in den Tumor durch die endotheliale Zellbarriere und die darunter befindliche Basismembran, die eine Kapillare von den Tumorzellen, die von der Kapillare versorgt werden, trennt. Dieses Merkmal wird bei Liposomen mit Größen von 0,07 und 0,12 um optimiert.
Daß eine Liposomenabgabe an den Tumor erforderlich ist, um das Arzneimittel selektiv ans Ziel zu bringen, ist aus der in Beispiel 12 vorgelegten Studie ersichtlich. Hier wurden Mäusen subkutan J-6456-Lymphome überimpft, die eine feste Tumormasse von etwa 1 cm³ nach 1 bis 2 Wochen bildeten. Den Tieren wurden dann entweder freies Doxorubicin oder mit Doxorubicin beladene PEG-Liposomen in einer Dosis von 10 mg Arzneimittel pro kg Körpergewicht verabreicht. Die Gewebeverteilung (Herz, Muskel und Tumor) des Arzneistoffs wurde dann 4, 24 und 48 Stunden nach der Verabreichung des Arzneimittels bestimmt. Fig. 11A zeigt die Ergebnisse, die für das freie Arzneimittel erhalten wurden. Es trat keine selektive Anreicherung von Arzneimittel im Tumor auf, und in der Tat waren die höchsten anfänglichen Arzneimittelkonzentrationen im Herzen, wo die größte Toxizität hervorgerufen wird.
Im Gegensatz dazu zeigte die Arzneimittelabgabe aus PEG-Liposomen eine zunehmende Arzneimittelanreicherung im Tumor zwischen 4 und 24 Stunden und hohe selektive Tumorkonzentrationen zwischen 24 und 48 Stunden. Die Arzneimittelaufnahme sowohl durch Herz als auch durch Muskelgewebe war im Gegensatz dazu geringer als beim freien Arzneimittel. Wie aus den in Fig. 11B graphisch dargestellten Daten ersichtlich ist, enthielt der Tumor 8 mal mehr Arzneimittel im Vergleich mit gesundem Muskel und das 6- fache der Menge im Herz 24 Stunden nach der Injektion.
Um zu bestätigen, daß die PEG-Liposomen mehr Antitumorarzneimittel an einen intraperitonealen Tumor abgeben, wurden Gruppen von Mäusen IP 10&sup6; J-6456-Lymphom-Zellen injiziert. Nach 5 Tagen hatte sich der IP-Tumor gebildet, und die Tiere wurden IV mit 10 mg/kg Doxorubicin entweder in Form des freien Arzneistoffs oder eingeschlossen in PEG-haltigen Liposomen behandelt. Die Gewebeverteilung des Arzneimittels ist in Tabelle 9, Beispiel 12 angegeben. Wie gezeigt ist, war das Tumor/Herz-Verhältnis etwa 272 mal größer für die Liposomenabgabe als für den freien Arzneistoff nach 24 Stunden und etwa 47 mal größer nach 48 Stunden.
Um zu zeigen, daß die in Tabelle 9 vorgelegten Ergebnisse ihre Ursache im Eindringen von intakten Liposomen in die extravaskuläre Region eines Tumors haben, wurde das Tumorgewebe in eine zelluläre Fraktion und einen Überstand (interzelluläre Flüssigkeit) getrennt, und das Vorhandensein von Liposomen-assoziiertem und freiem Arzneimittel in beiden Fraktionen wurde untersucht. Fig. 12 zeigt die Gesamtmenge an Arzneimittel (ausgefüllte Rauten) und die Menge an Arzneimittel, die in Tumorzellen (ausgefüllte Kreise) und Überstand (ausgefüllte Dreiecke) über einen Zeitraum von 48 Stunden nach der Injektion vorhanden war. Um den mit Liposomen assoziierten Arzneistoff zu untersuchen, wurde der Überstand durch ein Ionenaustauschharz geleitet, um den freien Arzneistoff zu entfernen, und der Arzneistoff, der im Überstand verblieb, wurde untersucht (ausgefüllte Dreiecke). Es ist ersichtlich, daß der größte Teil des Arzneistoffs im Tumor mit Liposomen assoziiert ist.
Ein weiterer Beleg für die Liposomenextravasation in Tumorzellen wurde durch direkte mikroskopische Beobachtung der Liposomenverteilung in normalem Lebergewebe und in festen Tumoren erhalten, wie es ausführlich in Beispiel 14 beschrieben wird. Fig. 13A zeigt die Verteilung von Liposomen (kleine, dunkel angefärbte Körper) in normalem Lebergewebe 24 Stunden nach der IV erfolgten Injektion von PEG-Liposomen. Die Liposomen sind ausschließlich auf die Kupfer-Zellen beschränkt und finden sich weder in Hepatocyten noch in interzellulärer Flüssigkeit von normalem Lebergewebe.
Fig. 13B zeigt eine Region von C-26-Colonkarzinomen, die in die Leber von Mäusen implantiert wurden, und zwar 24 Stunden nach der Injektion von PEG-Liposomen. Konzentrationen von Liposomen sind klar im Bereich der Kapillaren in dieser Figur zu erkennen, und zwar auf der Tumorgewebeseite der endothelialen Barriere und der Basismembran. Liposomen sind auch häufig in der interzellulären Flüssigkeit der Tumorzellen, was weiter den Durchtritt aus dem Kapillarlumen in den Tumor belegt. Die mikroskopische Aufnahme von Fig. 13C zeigt eine weitere Region des Tumors, wo ein häufiges Antreffen von Liposomen in der interzellulären Flüssigkeit ebenfalls sichtbar ist. Ein ähnlicher Befund ergab sich bei der Liposomenextravasation in eine Region von C-26-Colonkarzinom-Zellen, die subkutan injiziert wurden, wie in Fig. 13D zu sehen ist.

IV. Tumor-Lokalisierungsverfahren

Wie vorstehend ausführlich beschrieben wurde, sind die erfindungsgemäßen Liposomen auch wirksam bei der spezifischen Lokalisierung einer Region eines festen Tumors, und zwar aufgrund der erweiterten Lebenszeit der Liposomen im Blutstrom und einer Liposomengröße, die eine Extravasation in Tumoren, eine vergleichsweise hohe Arzneimittelträgerkapazität und einen minimalen Verlust an eingeschlossenem Arzneimittel während der Zeit, die erforderlich ist, damit die Liposomen sich verteilen und in den Tumor eindringen (die ersten 24 bis 48 Stunden nach der Injektion), erlaubt. Die Liposomen stellen also ein wirksames Verfahren zur selektiven Lokalisierung einer Verbindung in einem festen Tumor bereit, indem die Verbindung in derartige Liposomen eingeschlossen wird und die Liposomen dem Individuum IV injiziert werden. In diesem Zusammenhang ist ein fester Tumor als ein Tumor definiert, der an einem anatomischen Ort außerhalb des Blutstroms wächst (im Gegensatz zum Beispiel zu Bluttumoren, wie Leukämie) und die Bildung von kleinen Blutgefäßen und Kapillaren zur Versorgung der wachsenden Tumormasse mit Nährstoffen und dergl. erfordert. In diesem Fall muß ein lV injiziertes Liposom (und sein eingeschlossenes Antitumorarzneimittel) den Blutstrom verlassen und in den Tumor eindringen, um den Ort des Tumors zu erreichen. Gemäß einer Ausführungsform wird das Verfahren zur Tumorbehandlung durch selektives Lokalisieren eines Antitumorarznelmittels im Tumor genutzt. Die Antitumorarzneimittel, die verwendet werden können, können beliebige Verbindungen sein, und zwar unter Einschluß der nachstehend angegebenen Verbindungen, die stabil in Liposomen mit einem geeigneten Beladungsfaktor eingeschlossen und in einer therapeutisch wirksamen Dosis (die nachstehend in Klammern nach jeder Verwendung angegeben ist) verabreicht werden können. Diese Verbindungen umfassen amphipathische Antitumormittel, wie die Pflanzenalkaloide Vincristin (1,4 mg/m²), Vinblastin (4 bis 18 mg/m²) und Etoposid (35 bis 100 mg/m²) sowie die Anthracyclin-Antibiotika unter Einschluß von Doxorubicin (60 bis 75 mg/m²), Epirubicin (60 bis 120 mg/m²) und Daunorubicin (25 bis 45 mg/m²). Die wasserlöslichen Anti-Metaboliten, wie Methotrexat (3 mg/m²), Cytosinarabinosid (100 mg/m²) und Fluoruracil (10 bis 15 mg/kg), die Antibiotika, wie Bleomycin (10 bis 20 Einheiten/m²), Mitomycin (20 mg/m²), Plicamycin (25 bis 30 ug/m²) und Dactinomycin (15 ug/m²) sowie die alkylierenden Mittel unter Einschluß von Cyclophosphamid (3 bis 25 mg/kg), Thiotepa (0,3 bis 0,4 mg/kg) und BCNU (150 bis 200 mg/m²) eignen sich in diesem Zusammenhang ebenfalls. Wie vorstehend festgestellt wurde, werden Liposomen mit den Pflanzenalkaloiden, für die Vincristin ein Beispiel ist, und den Anthracyclin-Antibiotika unter Einschluß von Doxorubicin, Daunorubicin und Epirubicin vorzugsweise aktiv beladen, um Arzneimittel-Lipid-Verhältnisse zu erzielen, die um ein mehrfaches größer sind als die, die durch passive Beladung erzielt werden. Wie vorstehend ebenfalls festgestellt wurde, können die Liposomen eingeschlossene tumortherapeutische Peptide und Proteinarzneimittel, wie IL-2 und/oder TNF und/oder Immunmodulatoren, wie M CSF, enthalten, die allein oder in Kom bination mit Antitumorarzneimitteln, wie einem antibiotischen Anthracyclin-Arzneimittel, vorliegen.
Die Fähigkeit, erfindungsgemäß in wirksamer Weise feste Tumoren zu behandeln, wurde in einer Reihe von in vivo-Systemen gezeigt. Das Verfahren, über das in Beispiel 15 berichtet wird, vergleicht die Geschwindigkeit des Tumorwachstums bei Tieren, denen subkutan ein C-26-Colonkarzinom implantiert wurde. Die Behandlung erfolgte mit Epirubicin entweder in freier Form oder eingeschlossen in PEG-Liposomen gemäß der vorliegenden Erfindung mit den in den Figuren 14A bis C gezeigten Ergebnissen. Wie ersichtlich ist und ausführlicher in Beispiel 15 beschrieben wird, führte die Behandlung mit PEG-Liposomen, die mit Epirubicin beladen waren, zu einer merklichen Suppression des Tumorwachstums und zu Langzeitüberlebenden bei den Gruppen von Tieren, denen normalerweise letale Dosen von Tumorzellen überimpft worden waren. Darüber hinaus führte die verzögerte Behandlung von Tieren mit PEG-Liposomen, die mit Epirubicin beladen waren, zu einer Regression von bereits etablierten subkutanen Tumoren, ein Ergebnis, das bei der Behandlung mit freiem Arzneistoff nicht beobachtet wurde.
Ähnliche Ergebnisse wurden bei der Behandlung von Lymphomen, die Mäusen intraperitoneal implantiert worden waren, erzielt, wie ausführlich in Beispiel 16 beschrieben wird. Hier wurden die Tiere mit Doxorubicin in freier Form oder eingeschlossen in PEG-Liposomen behandelt. Der Prozentsatz der Überlebenden über eine Zeitspanne von 100 Tagen nach der Tumorimplantation und der Arzneimittelbehandlung ist in Fig. 16 gezeigt. Die Ergebnisse sind ähnlich zu denen, die vorstehend erhalten wurden, und zeigen einen merklichen Anstieg des Mittelwerts der Überlebenszeit und des Prozentsatzes der Überlebenden mit PEG-Liposomen gegenüber der Behandlung mit freiem Arzneistoff.
Da eine verringerte Toxizität in Tiermodellsystemen und in der Klinik bei der Tumorbehandlung mit Doxorubicin, das in herkömmlichen Liposomen eingeschlossen worden war (wie es z.B. im US-Patent 4 898 735 berichtet wird), beobachtet wurde, ist es von Interesse den Grad des Schutzes vor Toxizität zu bestimmen, der vom erfindungsgemäßen Tumorbehandlungsverfahren bereitgestellt wird. In der Studie, über die in Beispiel 17 berichtet wird, wurden Tieren IV steigende Dosen an Doxorubicin oder Epirubicin in freier Form oder eingeschlossen in herkömmliche Liposomen oder in PEG-Liposomen injiziert. Die maximal verträgliche Dosis (MTD) für eine Reihe von Arzneimittelformulierungen ist in Tabelle 10 des Beispiels angegeben. Für beide Arzneimittel führte das Einschließen in PEG-Liposomen ungefähr zu einer Verdoppelung der MTD des Arzneimittels. Eine ähnliche Schutzwirkung wurde mit herkömmlichen Liposomen erzielt.
Die verringerte Toxizität kann zwar zu einem erhöhten Wirkungsgrad der Tumorbehandlung, über die vorstehend berichtet wurde, beitragen, eine selektive Lokalisierung des Arzneimittels durch liposomale Extravasation ist jedoch ebenfalls wichtig für die verbesserte Arzneimittelwirksamkeit. Dies wird durch das Arzneimittelbehandlungsverfahren gezeigt, das in Beispiel 18 beschrieben wird. Hier wurden herkömmliche Liposomen, die Doxorubicin enthielten (und die eine geringe oder keine Aufnahme in den Tumor durch Extravasation bei IV erfolgender Verabreichung zeigten), mit freiem Arzneimittel in der gleichen Dosis (10 mg/kg) verglichen, und zwar im Hinblick auf die Verringerung der Wachstumsgeschwindigkeit eines subkutan implantierten Tumors. In Fig. 16 ist die Tumorgröße in Abhängigkeit von der Zeit in Tagen nach der Tumorimplantation für eine Kontrolle mit Kochsalzlösung (durchgezogene Linie), freien Arzneistoff (ausgefüllte Kreise) und herkömmliche Liposomen (ausgefüllte Dreiecke) gezeigt. Wie ersichtlich ist, unterdrücken herkömmliche Liposomen des Tumorwachstums nicht in einem größeren Ausmaß als das freie Arzneimittel in der gleichen Dosis. Dieser Befund steht im starken Gegensatz zu den in dem Figuren 14A bis C und 15 gezeigten Ergebnissen, wo eine erhöhte Überlebenszeit und eine verstärkte Unterdrückung des Tumorwachstums im Vergleich mit dem freien Arzneistoff zu sehen sind, wenn Tumoren tragende Tiere mit Anthracyclin-Antitumorarzneimitteln, die in PEG-Liposomen eingeschlossen sind, behandelt wurden.
Das Tumorbehandlungsverfahren erlaubt also sowohl die Verabreichung höherer Konzentrationen an Arzneimittel aufgrund einer verringerten Arzneimitteltoxizität in Liposomen als auch eine größere Arzneimittelwirksamkeit aufgrund der selektiven Liposomenlokalisierung in der interzellulären Flüssigkeit des Tumors.
Es ist darauf hinzuweisen, daß die Fähigkeit, eine Verbindung selektiv in einem Tumor durch Liposomenextravasation zu lokalisieren, auch genutzt werden kann, um ein abbildendes Mittel für die Tumordiagnose besser zum Tumor als Ziel zu bringen. Hier wird das abbildende Mittel, typischerweise ein Radioisotop in chelatisierter Form oder ein paramagnetisches Molekül, in Liposomen eingeschlossen, die dann IV einem Individuum, das untersucht wird, verabreicht werden. Nach einer gewählten Zeitspanne, und zwar typischerweise 24 bis 48 Stunden, wird das Individuum z.B. durch Gamma-Scintillationsradiographie im Fall eines Radioisotops oder durch NMR im Fall eines paramagnetischen Mittels untersucht, um Regionen der lokalen Aufnahme des abbildenden Mittels festzustellen.
Die nachstehenden Beispiele erläutern Verfahren zur Herstellung von Liposomen mit erhöhter Verweilzeit im Kreislauf und zur Bewertung der Verweilzeiten im Kreislauf in vivo und in vitro. Die Beispiele sollen bestimmte Liposomen-Zusammensetzungen und Verfahren der Erfindung erläutern, sie sollen jedoch in keiner Weise den Schutzumfang der Erfindung beschränken.

Materialien

Cholesterin (Chol) wurde von Sigma (St. Louis, MO) bezogen. Sphingomyelin (SM), Ei-Phosphatidylcholin (Lecithin oder PC), teilweise hydriertes PC mit der Zusammensetzung IV40, IV30, IV20, IV10 und IV1, Phosphatidylglycerin (PG), Phosphatidylethanolamin (PE), Dipalmitoylphosphatidylglycerin (DPPG), Dipalmitoyl-PC (DPPC), Dioleyl-PC (DOPC) und Distearoyl-PC (DSPC) wurden von Avanti Polar Lipids (Birmingham, AL) oder Austin Chemical Company (Chicago, IL) bezogen.
[¹²&sup5;I]-Tyraminyl-inulin wurde gemäß veröffentlichter Verfahren hergestellt. 67Gallium-8-hydroxychinolin wurde von NEN Neoscan (Boston, MA) bezogen. Doxorubicin-HCl und Epirubicin-HCl wurden von Adria Laboratories (Columbus, OH) oder Farmitalia Carlo Erba (Mailand, Italien) bezogen.

Beispiel 1

Herstellung von PEG-PE, verknüpft durch Cyanurchlorid

A. Herstellung von aktiviertem PEG

2-O-Methoxypolyethylenglykol-1900-4,6-dichlor-1,3,5-triazin, das zuvor als aktiviertes PEG bezeichnet wurde, wurde hergestellt, wie es in J. Biol. Chem., Bd. 252 (1977), S. 3582 beschrieben ist, und zwar mit den folgenden Modifizierungen.
Cyanurchlorid (5,5 g; 0,03 Mol) wurde in 400 ml wasserfreiem Benzol mit einem Gehalt an 10 g wasserfreiem Natriumcarbonat gelöst, und PEG- 1900 (19 g; 0,01 Mol) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösung wurde filtriert, und 600 ml Petrolether (Siedebereich 35 bis 60a) wurde langsam unter Rühren zugegeben. Der feinverteilte Niederschlag wurde auf einem Filter gesammelt und erneut in 400 ml Benzol gelöst. Das Verfahren aus Ausfällen und Filtration wurde mehrere Male wiederholt, bis der Petrolether frei von restlichem Cyanurchlorid war, was durch Hochdruckflüssigkeitschromatographie über eine Säule (250 x 3,2 mm) mit 5-m "LiChrosorb" (E. Merck) bei Entwicklung mit Hexan und Nachweis mit einem Ultraviolettdetektor bestimmt wurde. Die Titration von aktiviertem PEG-1900 mit Silbernitrat nach einer Hydrolyse über Nacht in einem wäßrigen Puffer bei pH-Wert 10,0 und Raumtemperatur ergab einen Wert von 1,7 Mol freigesetztes Chlorid/Mol PEG.
Eine TLC-Analyse des Produkts wurde mit Umkehrphasen-TLC-Platten durchgeführt, die von Baker erhalten wurde, und zwar unter Verwendung von Methanol/Wasser 4:1 (Vol./Vol.) als Entwickler und Behandlung mit Ioddampf zur Visualisierung. Unter diesen Bedingungen erschien das als Ausgangsmaterial eingesetzte Methoxypolyglykol-1900 bei Rf = 0,54 bis 0,60. Das aktivierte PEG erschien bei Rf = 0,41. Nicht umgesetztes Cyanurchlorid erschien bei Rf = 0,88 und wurde entfernt.
Das aktivierte PEG wurde auf Stickstoff analysiert, und eine geeignete Korrektur wurde bei der Bestimmung der Menge an Reaktanten, die in den weiteren Synthesestufen verwendet wurde, angewandt. Wenn also das Produkt nur 20 % der theoretischen Menge an Stickstoff enthielt, dann wurde die Menge an Material, die in der nächsten Synthesestufe verwendet wurde, um 100/20 oder das 5-fache erhöht. Wenn das Produkt 50 % der theoretischen Menge an Stickstoff enthielt, dann war nur eine Erhöhung von 100/50 oder eine zweifache Erhöhung erforderlich.

B. Herstellung von N-(4-Chlor-polyglykol-1900)-1,3,5-triazinyl-eiphosphatidylethanolamin

In einem Teströhrchen mit Schraubverschluß wurden 0,74 ml einer 100 mg/ml (0,100 mMol) Stammlösung von Ei-Phosphatidylethanolamin in Chloroform unter einem Stickstoffstrom zur Trockene eingeengt und dann zu dem Rückstand des aktivierten PEG, das in Abschnitt A beschrieben wurde, in einer solchen Menge gegeben, daß 205 mg (0,100 mMol) bereitgestellt wurden. Zu diesem Gemisch wurden 5 ml wasserfreies Dimethylformamid gegeben. 27 ul (0,200 mMol) Triethylamin wurden zu dem Gemisch gegeben, und die Luft wurde durch Stickstoffgas ersetzt. Das Gemisch wurde über Nacht in einem Sandbad erwärmt, das bei 110ºC gehalten wurde.
Das Gemisch wurde dann unter Vakuum zur Trockene eingeengt, und es wurde eine pastenartige Masse aus kristallinem Feststoff erhalten. Dieser Feststoff wurde in 5 ml eines Gemisches auf 4 Volumenteilen Aceton und 1 Volumenteil Essigsäure gelöst. Das erhaltene Gemisch wurde auf eine chromatographische Absorptionssäule von 21 mm x 240 mm, die mit Siliciumdioxidgel (Merck Kieselgel 60, 70-230 mesh) gepackt war und zuerst mit einem Lösungsmittel, das aus Aceton:Essigsäure, 80:20 (Vol./Vol.) bestand, befeuchtet worden war, aufgegeben.
Die Säulenchromatographie wurde mit dem gleichen Lösungsmittelgemisch entwickelt, und getrennte Anteile von 20 bis 50 ml ausströmendes Medium wurden gesammelt. Jede Portion an ausströmendem Medium wurde durch TLC auf Siliciumdioxidgel-beschichteten Platten unter Verwendung von 2- Butanon:Essigsäure:Wasser 40:25:5 (Vol./Vol./Vol.) als Entwickler und einer Ioddampfbehandlung zur Visualisierung untersucht. Fraktionen, die nur Material mit einem Rf-Wert von etwa 0,79 enthielten, wurden vereinigt und unter Vakuum zur Trockene eingeengt. Ein Trocknen bis zu konstantem Gewicht unter Hochvakuum ergab 86 mg (31,2 uMol) an nahezu farblosem, festem N-(4-Chlor-polyglykol-1900)-1,3,5-triazinyl-ei-phosphatidylethanolamin mit einem Gehalt an Phosphor.
Die feste Verbindung wurde in 24 ml Ethanol/Chloroform; 50/50 Chloroform aufgenommen und zur Entfernung von unlöslichem Material zentrifugiert. Einengen der geklärten Lösung zur Trockene unter Vakuum ergab 21 mg (7,62 uMol) eines farblosen Feststoffs.

Beispiel 2

Herstellung von Carbonat- und Amid-verknüpften hydrophilen Polymeren mit PE

A. Herstellung des Imidazolcarbamats von Polyethylenglykolmethylether-1900

9,5 g (5 mMol) Polyethylenglykolmethylether-1900 (bezogen von Aldrich Chemical Co.) wurden in 45 ml Benzol gelöst, das über Molekularsieben getrocknet worden war. 0,89 g (5,5 mMol) reines Carbonyldiimidazol wurden zugegeben. Die Reinheit wurde durch ein Infrarotspektrum überprüft. Die Luft im Reaktionsgefäß wurde durch Stickstoff ersetzt. Das Gefäß wurde geschlossen und in einem Sandbad 16 Stunden auf 75ºC erwärmt.
Das Reaktionsgemisch wurde gekühlt, und bei Raumtemperatur bildete sich eine klare Lösung. Die Lösung wurde mit 50,0 ml trockenem Benzol verdünnt und in einem Kühlschrank als Stammlösung mit 100 uMol/ml Imidazolcarbamat von PEG-Ether-1900 gelagert.

B. Herstellung des Phosphatidylethanolamincarbamats von Polyethylenglykolmethylether-1900

10,0 ml (1 mMol) der Stammlösung von 100 mMol/ml des Imidazolcarbamats von Polyethylenglykolmethylether-1900 wurden in einen 10 ml fassenden birnenförmigen Kolben pipettiert. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum entfernt. 3,7 ml einer Lösung mit 100 mg/ml Ei-Phosphatidylethanolamin in Chloroform (0,5 mMol) wurde zugegeben. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum verdampft. 2 ml 1,1,2,2-Tetrachlorethylen und 139 41 (1,0 mMol) Triethylamin VI wurden zugegeben. Das Gefäß wurde geschlossen und 6 Stunden in einem bei 95ºC gehaltenen Sandbad erwärmt. Nach dieser Zeit wurde eine Dünnschichtchromatographie mit Fraktionen des vorstehenden Gemisches durchgeführt, um das Ausmaß der Konjugation auf SiO&sub2;-beschichteten TLC-Platten zu bestimmen, wobei Butanon/Essigsäure/Wasser 40/5/5 (Vol./Vol./Vol.) als Entwickler verwendet wurde. Die Visualisierung mit I&sub2;-Dampf ergab, daß der größte Teil des freien Phosphatidylethanolamins bei Rf = 0,68 reagiert hatte und durch ein phosphorhaltiges Lipid bei Rf = 0,78 bis 0,80 ersetzt worden war.
Das Lösungsmittel aus dem restlichen Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum verdampft. Der Rückstand wurde in 10 ml Methylenchlorid aufgenommen und auf eine chromatographische Absorptionssäule von 21 mm x 270 mm, die mit Merck-Kieselgel 60 (Siliciumdioxidgel mit 70 bis 230 mesh) gepackt war, das zunächst mit Methylenchlorid gespült worden war, gegeben. Das Gemisch wurde durch die Säule geleitet, wobei der Reihe nach die folgenden Lösungsmittel verwendet wurden: Tabelle 1 Vol.-% an Methylenchlorid Vol.-% an Methanol mit % Essigsäure
Portionen von 50 ml des ausströmenden Mediums wurden gesammelt, und jede Portion wurde durch TLC auf SiO&sub2;-beschichteten Platten unter Anwendung der 12-Dampfabsorption zur Visualisierung nach der Entwicklung mit Chloroform/Methanol/Wasser/konzentriertem Ammoniumhydroxid 130/70/8/0,5 % (Vol./Vol./Vol./Vol.) untersucht. Der größte Teil der Phosphate wurde in den Fraktionen 11, 12, 13 und 14 gefunden.
Diese Fraktionen wurden vereinigt, unter Vakuum zur Trockene eingeengt und im Hochvakuum bis zu konstantem Gewicht getrocknet. Sie ergaben 669 mg eines farblosen Wachses aus Phosphatidylethanolamincarbamat von Polyethylenglykolmethylether. Dies entspricht 263 uMol und einer Ausbeute von 52,6 %, bezogen auf das Phosphatidylethanolamin.
Ein NMR-Spektrum des Produkts, gelöst in Deuterochloroform, zeigte Peaks, die dem Spektrum für Ei-PE entsprachen, und zwar zusammen mit einem starken Singulett aufgrund der Methylengruppen der Ethylenoxidkette bei delta = 3,4 ppm. Das Verhältnis von Methylenprotonen aus dem Ethylenoxid zu den endständigen Methylprotonen aus den PE-Acylgruppen war groß genug, um ein Molekulargewicht von etwa 2000 für den Polyethylenoxidanteil des Moleküls des als Produkt gewünschten Polyethylenglykolkonjugierten Phosphatidylethanolamincarbamats (M.W. 2654) zu bestätigen.

C. Herstellung des Polymilchsäureamids von Phosphatidylethanolamin

200 mg (0,1 mMol) Poly-(milchsäure), Molekulargewicht: 2000 (ICN, Cleveland, Ohio) wurden in 2,0 ml Dimethylsulfoxid unter Erwärmen gelöst, während gerührt wurde, um das Material vollständig zu lösen. Anschließend wurde die Lösung sofort auf 65ºC gekühlt und in ein Gemisch aus 75 mg (0,1 mMol) Distearylphosphatidylethanolamin (Cal. Biochem, La Jolla) und 41 mg (0,2 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid gegossen. Anschließend wurden 28 ml (0,2 mMol) Triethylamin zugegeben, und die Luft wurde aus dem Röhrchen durch Stickstoffgas verdrängt. Das Röhrchen wurde verschlossen und 48 Stunden auf 65ºC erwärmt.
Nach dieser Zeit wurde das Röhrchen auf Raumtemperatur gekühlt, und 6 ml Chloroform wurden zugegeben. Die Chloroformlösung wurde dreimal nacheinander mit Volumina von 6 ml Wasser gewaschen und nach jedem Waschgang zentrifugiert. Die Phasen wurden mit einer Pasteur-Pipette getrennt. Die zurückbleibende Chloroformphase wurde mit Unterdruck filtriert, um suspendiertes Distearoylphosphatidylethanolamin zu entfernen. Das Filtrat wurde unter Vakuum getrocknet, wobei man 212 mg halbkristallinen Feststoff erhielt.
Dieser Feststoff wurde in 15 ml eines Gemisches aus 4 Volumenteilen Ethanol mit 1 Volumenteil Wasser gelöst und durch ein Bett mit einer Tiefe von 50 mm und einem Durchmesser von 21 mm aus H&spplus; Dowex 50-Kationenaustauschharz geleitet und mit 100 ml des gleichen Lösungsmittels gewaschen.
Das Filtrat wurde zur Trockene eingeengt, wobei man 131 mg farbloses Wachs erhielt.
291 mg eines derartigen Wachses wurden in 2,5 ml Chloroform gelöst und auf eine Säule von 21 mm x 280 mm, die mit Silicagel, das mit Chloroform benetzt worden war, gepackt war, aufgetragen. Das Chromatogramm wurde entwickelt, indem durch die Säule nacheinander jeweils 100 ml an:
100 % Chloroform, 0 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
90 % Chloroform, 10 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
85 % Chloroform, 15 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
80 % Chloroform, 20 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
70 % Chloroform, 30 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol) geleitet wurden.
Einzelne Portionen von 25 ml des ausströmenden Mediums wurden aufbewahrt und durch TLC auf SiO&sub2;-beschichteten Platten unter Verwendung von CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/H&sub2;O, konz. NH&sub4;OH 130/70/8/0,5 (Vol./Vol.) als Entwickler und 12-Dampf Absorption zur Visualisierung untersucht.
Die Portionen von 275 bis 325 ml des aus der Säule ausströmenden Mediums enthielten ein einziges Material, PO&sub4; +, mit einem Rf-Wert von 0,89.
Nach Vereinigen und Einengen zur Trockene ergaben diese Portionen 319 mg farbloses Wachs.
Die Phosphatanalyse stimmt mit einem Molekulargewicht von möglicherweise 115 000 überein.
Offensichtlich trat die Polymerisierung der Poly-(milchsäure) mit einer vergleichbaren Geschwindigkeit zu der, mit der es mit Phosphatidylethanolamin reagierte, auf.
Diese Nebenreaktion könnte wahrscheinlich minimiert werden, in dem mit stärker verdünnten Lösungen der Reaktanten gearbeitet wird.

D. Herstellung von Poly-(glykolsäure)-amid von DSPE

Ein Gemisch aus 266 mg (3,50 mMol) Glykolsäure, 745 mg (3,60 mMol) Dicyclohexylcarbodiimid, 75 mg (0,10 mMol) Distearoylphosphatidylethanolamin, 32 4l (0,23 mMol) Triethylamin und 5,0 ml trockenem Dimethylsulfoxid wurde auf 75ºC unter einer Stickstoffatmosphäre erwärmt, auf Raumtemperatur gekühlt, anschließend mit einem gleichen Volumen an Chloroform verdünnt und dann dreimal nacheinander mit gleichen Volumina an Wasser gewaschen, um das Dimethylsulfoxid zu entfernen. Es wurde jedesmal zentrifugiert, und die Phasen wurden mit einer Pasteur-Pipette getrennt.
Die Chloroformphase wurde unter Unterdruck filtriert, um eine kleine Menge an suspendiertem Material zu entfernen, und das Filtrat wurde unter Vakuum zur Trockene eingeengt, wobei man 572 mg eines blaßbernsteinfarbenen Wachses erhielt.
Dieses Material wurde erneut in 2,5 ml Chloroform gelöst und auf eine Säule von 21 mm x 270 mm mit Siliciumdioxidgel (Merck Kieselgel 60), das mit Chloroform benetzt worden war, aufgetragen.
Das Chromatogramm wurde entwickelt, in dem durch die Säule nacheinander jeweils 100 ml an
100 % Chloroform, 0 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
90 % Chloroform, 10 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
85 % Chloroform, 15 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
80 % Chloroform, 20 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol);
70 % Chloroform, 30 % (1 % NH&sub4;OH in Methanol) geleitet wurden.
Einzelne Portionen von 25 ml des ausströmenden Mediums wurden gesammelt und jeweils durch TLC auf SiO&sub2;-beschichteten Platten unter Verwendung von CHCl&sub3;/CH&sub3;OH/H&sub2;O/konz. NH&sub4;OH 130/70/8/0,5 (Vol./Vol.) als Entwickler untersucht.
Fast das gesamte (PO&sub4; +)-Material befand sich in der Portion von 275 bis 300 ml des ausströmenden Mediums. Ein Einengen davon zur Trockene unter Vakuum, gefolgt von Trocknen im Hochvakuum, ergab 281 mg eines farblosen Wachses.
Die Phosphatanalyse deutet auf ein Molekulargewicht von 924 000.
Die Veränderung des Lösungsmittelvolumens während der Reaktion und der molaren Verhältnisse von Glykolsäure und Dicyclohexylcarbodiimid führt wahrscheinlich zu Molekülen anderer Größe.

Beispiel 3

Herstellung von Ethylen-verknüpftem PEG-PE

A. Die Herstellung von I-Trimethylsilyloxy-polyethylenglykol wird im Reaktionsschema, das in Fig. 3 gezeigt ist, erläutert.

15,0 g (10 mMol) Polyethylenglykol (Molekulargewicht: 1500; Aldrich Chemical) wurden in 80 ml Benzol gelöst. 1,40 ml (11 mMol) Chlortrimethylsilan (Aldrich Chemical Co.) und 1,53 ml (1 mMol) Triethylamin wurden zugegeben. Das Gemisch wurde bei Raumtemperatur 5 Stunden unter einer inerten Atmosphäre gerührt.
Das Gemisch wurde mit Unterdruck filtriert, um Kristalle von Triethylammoniumchlorid abzutrennen, und die Kristalle wurden mit 5 ml Benzol gewaschen. Filtrat und Benzolwaschflüssigkeit wurden vereinigt. Diese Lösung wurde unter Vakuum zur Trockene eingeengt, wobei man 15,83 g farbloses Öl erhielt, das sich beim Stehen verfestigte.
TLC des Produkts auf Si-C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-Platten unter Verwendung eines Gemisches aus 4 Volumenteilen Ethanol mit 1 Volumenteil Wasser als Entwickler und Ioddampfvisualisierung zeigte, daß das gesamte Polyglykol-1500 (Rf = 0,93) verbraucht und durch ein Material mit Rf = 0,82 ersetzt worden war. Ein Infrarotspektrum zeigte Absorptionsmaxima, die nur für Polyglykole charakteristisch sind.
Die Ausbeute an I-Trimethylsilyloxy-Polyethylenglykol (Molekulargewicht: 1500) war nahezu quantitativ.
B. Herstellung des Trifluormethansulfonylesters von I-Trimethylsilyloxy-polyethylenglykol
15,74 g (10 mMol) kristallines I-Trimethylsilyloxy-polyethylenglykol, das vorstehend erhalten worden war, wurden in 40 ml wasserfreiem Benzol gelöst und in einem Bad von zerstoßenem Eis gekühlt. 1,53 ml (11 mMol) Triethylamin und 1,85 ml (11 mMol) Trifluormethansulfonsäureanhydrid, die von Aldrich Chemical Co. bezogen wurden, wurden zugegeben, und das Gemisch wurde über Nacht unter einer inerten Atmosphäre gerührt, bis das Reaktionsgemisch seine Farbe nach braun änderte.
Das Lösungsmittel wurde dann unter verringertem Druck verdampft, und die zurückbleibende sirupartige Paste wurde mit Methylenchlorid auf 100,0 ml verdünnt. Aufgrund der großen Reaktivität von Trifluormethansulfonsäureestern wurde keine weitere Reinigung des Trifluormethansulfonsäureesters vom I-Trimethylsilyloxy-polyethylenglykol unternommen.

C. Herstellung von N-1-Trimethylsilyloxy-polyethylenglykol 1500-PE

10 ml der Methylenchlorid-Stammlösung des Trifluormethansulfonylesters von 1-Trimethylsilyloxy-polyethylenglykol wurden unter Vakuum zur Trockene eingeengt, wobei man 1,2 g Rückstand (ungefähr 0,7 mMol) erhielt. Zu diesem Rückstand wurden 3,72 ml einer Chloroformlösung, die 372 mg (0,5 mMol) Ei-PE enthielt, gegeben. Zu der erhaltenen Lösung wurden 139 ul (1,0 mMol) Triethylamin gegeben, und das Lösungsmittel wurde unter Vakuum verdampft. Zu dem erhaltenen Rückstand wurden 5 ml trockenes Dimethylformamid und 70 ul (0,50 mMol) Triethylamin (VI) gegeben. Die Luft aus dem Reaktionsgefäß wurde durch Stickstoff ersetzt. Das Gefäß wurde verschlossen und in einem Sandbad 22 Stunden auf 110ºC erwärmt. Das Lösungsmittel wurde unter Vakuum verdampft, wobei man 1,58 g eines bräunlich gefärbten Öls erhielt.
Eine chromatographische Absorptionssäule von 21 x 260 mm, die mit Kieselgel 60-Siliciumdioxid von 70 bis 230 mesh gefüllt war, wurde vorbereitet und mit einem Lösungsmittel gespült, das aus 40 Volumenteilen Butanon, 25 Volumenteilen Essigsäure und 5 Volumenteilen Wasser bestand. Das Rohprodukt wurde in 3 ml des gleichen Lösungsmittels gelöst und auf die chromatographische Säule übertragen. Das Chromatogramm wurde mit dem gleichen Lösungsmittel entwickelt, und aufeinanderfolgende Portionen von 30 ml des ausströmenden Mediums wurden jeweils durch TLC untersucht.
Bei dem TLC Assaysystem wurden Siliciumdioxidgel beschichtete Glas p latten mit der Losungsmittelkombination Butanon/Essi gsaure/Wasser 40/25/5 (Vol./Vol./Vol.) verwendet. Eine Ioddampfabsorption diente der Visualisierung. In diesem Losungsmittelsystem erschien das N-1-Trimethylsilyloxy-polyethylenglykol 1500-PE bei einem Rf-Wert von 0,78. Unverändertes PE erschien bei Rf = 0,68.
Das gewünschte N-1-Trimethylsilyloxy-polyethylenglykol 1500-PE war der Hauptbestandteil der Portionen von 170 bis 300 ml des aus der Säule ausströmenden Mediums. Bei Eindampfen zur Trockene unter Vakuum ergaben diese Portionen 111 mg eines blaßgelben Öls der Verbindung.

D. Herstellung von N-Polyethylenglykol 1500: Entfernung der Schutzgruppe von Phosphatidylethanolamin mit Essigsäure

Nach der Chromatographie wurde die PE-Verbindung in 2 ml Tetrahydrofuran gelöst. Dazu wurden 6 ml Essigsäure und 2 ml Wasser gegeben. Die erhaltene Lösung wurde 3 Tage bei 23ºC stehengelassen. Das Lösungsmittel aus dem Reaktionsgemisch wurde unter Vakuum entfernt, und der Rückstand wurde bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet, wobei man 75 mg eines blaßgelben Wachses erhielt. TLC auf Si-C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-Platten, die mit einem Gemisch aus 4 Volumenteilen Ethanol und 1 Volumenteil Wasser entwickelt wurden, zeigte, daß eine gewisse Menge an freiem PE und eine gewisse Menge an Polyglykol-ähnlichem Material sich während der Hydrolyse gebildet hatten.
Der Rückstand wurde in 0,5 ml Tetrahydrofuran gelöst und mit 3 ml einer Lösung aus Ethanol:Wasser 80:20 (Vol./Vol.) verdünnt. Das Gemisch wurde auf eine chromatographische Absorptionssäule von 10 mm x 250 mm aufgetragen, die mit Siliciumdioxidgel mit Octadecyl-gebundener Phase gepackt worden war, und die Säule wurde mit Ethanol:Wasser 80:20 (Vol.-%) entwickelt, wobei aufeinanderfolgende Portionen von 20 ml des ausströmenden Mediums gesammelt wurden. Das ausströmende Medium wurde durch Umkehrphasen-TLC untersucht. Fraktionen, die nur das Produkt mit Rf = 0,08 bis 0,15 enthielten, wurden vereinigt. Dies waren typischerweise die Portionen von 20 bis 100 ml des ausströmenden Mediums. Bei Eindampfen zur Trockene unter verringertem Druck ergaben diese Portionen 33 mg eines farblosen Wachses PEG-PE, was einer Ausbeute von nur 3 %, bezogen auf das als Ausgangsmaterial verwendete Phosphatidylethanolamin, entspricht.
Die NMR-Analyse zeigte, daß dem Produkt sowohl PE-Reste als auch Polyethylenglykol-Reste einverleibt waren, daß jedoch ungeachtet der günstig erscheinenden Elementaranalyse die Kettenlänge der Polyglykolkette auf etwa 3 bis 4 Ethylenoxidreste verringert worden war.
Das hergestellte Produkt wurde zur Herstellung von PEG-PE-Liposomen verwendet.

E. Herstellung von N-Polyethylenglykol 1500-P.E. durch Entfernung der Schutzgruppe mit Fluorid

500 mg rohes N-1-Trimethylsilyloxy-polyethylenglykol-PE wurden in 5 ml Tetrahydrofuran gelöst, und 189 mg (0,600 mMol) Tetrabutylammoniumfluorid wurden zugegeben, und es wurde gerührt, bis sich das Material gelöst hatte. Die Reaktanten wurden über Nacht bei Raumtemperatur (20ºC) stehengelassen.
Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck verdampft, und der Rückstand wurde in 10 ml Chloroform gelöst, zweimal nacheinander mit Portionen von 10 ml Wasser gewaschen und zentrifugiert, um die Chloroformphase und die Wasserphase zu trennen. Die Chloroformphase wurde unter verringertem Druck eingeengt, wobei man 390 mg eines orangebraunen Wachses erhielt, von dem festgestellt wurde, daß es sich um eine unreine N- Polyethylenglykol 1500-PE-Verbindung handelt.
Dieses Wachs wurde erneut in 5 ml Chloroform gelöst und auf eine Säule von 21 x 270 mm mit Siliciumdioxidgel, das mit Chloroform befeuchtet worden war, aufgetragen. Die Säule wurde entwickelt, indem 100 ml Lösungsmittel durch die Säule geleitet wurden. Die Lösungsmittel aus Tabelle 2 wurden nacheinander verwendet: Tabelle 2 Vol.-% Chloroform Vol.-% Methanol mit einen Gehalt an % konz. Ammoniumhydroxid/Methanol
Getrennte Fraktionen von 50 ml des aus der Säule ausströmenden Mediums wurden aufbewahrt. Die Fraktionen der Säule wurden durch TLC auf Si-C&sub1;&sub8;-Umkehrphasen-Platten getrennt. Die TLC-Platten wurden mit 4 Volumenteilen Ethanol, gemischt mit 1 Volumenteil Wasser, entwickelt. Die Visualisierung erfolgte durch Behandlung mit Ioddampf.
Nur diejenigen Fraktionen, die Iod absorbierendes Lipid mit einem Rf-Wert von etwa 0,20 enthielten, wurden vereinigt und unter Vakuum zur Trockene eingeengt und unter Hochvakuum bis zu einem konstanten Gewicht getrocknet. Auf diese Weise erhielt man 94 mg wachsartigen kristallinen Feststoff mit einem Molekulargewicht von 2226. Ein Protonen-NMR-Spektrum dieses Materials, gelöst in Deuterochloroform, zeigte die erwarteten Peaks aufgrund des Phosphatidylethanolaminanteils des Moleküls zusammen mit wenigen Methylenprotonen, die Polyethylenglykol zugeschrieben werden können (delta = 3,7).

Beispiel 4

Herstellung von REVs und MLVs

A. REVs mit eingestellter Größe

Insgesamt 15 uMol der ausgewählten Lipidkomponenten in den in den nachstehenden Beispielen angegebenen Molverhältnissen wurden in Chloroform gelöst und als dünner Film durch Rotationsverdampfung getrocknet. Dieser Lipidfilm wurde in 1 ml mit destilliertem Wasser gewaschenem Diethylether gelöst. Zu dieser Lipidlösung wurden 0,34 ml einer wäßrigen Pufferlösung mit einem Gehalt an 5 millimolar Tris, 100 millimolar NaCl, 0,1 millimolar EDTA, pH-Wert: 7,4, gegeben, und das Gemisch wurde durch Beschallung für 1 Minute emulgiert, wobei die Temperatur der Lösung bei oder unterhalb Raumtemperatur gehalten wurde. Wenn die Liposomen so hergestellt wurden, daß sie eingeschlossenes [¹²&sup5;I]-Tyraminyl-inulin enthielten, dann wurde diese Substanz dem Phosphatpuffer in einer Konzentration von etwa 4 uCi/ml Puffer einverleibt.
Das Etherlösungsmittel wurde unter verringertem Druck bei Raumtemperatur entfernt, und das erhaltene Gel wurde in 0,1 ml des vorstehenden Puffers aufgenommen und anschließend kräftig geschüttelt. Die erhaltene REF-Suspension wies Teilchengrößen, die durch mikroskopische Untersuchung bestimmt wurden, zwischen etwa 0,1 bis 20 um auf und bestand vorwiegend aus relativ großen Bläschen (größer als 1 um) mit nur einer oder nur wenigen Doppelschicht-Lamellen.
Die Liposomen wurden zweimal durch einen Polycarbonatfilter (Szoka, 1978) mit einer ausgewählten Porengröße von 0,4 um oder 0,2 um extrudiert. Die Liposomen, die durch den Filter mit 0,4 um extrudiert worden waren, wiesen im Mittel Durchmesser von 0,17 ± (0,05) um auf, und die, die durch den Filter mit 0,2 um extrudiert worden waren, wiesen im Mittel Durchmesser von 0,16 ± (0,05) um auf. Nicht eingeschlossenes [¹²&sup5;I]-Tyraminyl-inulin wurde entfernt, indem die extrudierten Liposomen durch Sephadex G-50 (Pharmacia) geleitet wurden. B. Hinsichtlich der Größe eingestellte MLVs Multilamellare Bläschen-Liposomen (MLV-Liposomen) wurden gemäß Standardverfahren hergestellt, indem ein Gemisch der Lipide in einem organischen Lösungsmittel, das vorwiegend CHCl&sub3; enthielt, gelöst wurde und die Lipide als dünner Film durch Rotation unter verringertem Druck getrocknet wurden. In einigen Fällen wurde eine radioaktive Markierung für die Lipidphase zu der Lipidlösung vor dem Trocknen gegeben. Der Lipidfilm wurde durch Zugabe der gewünschten wäßrigen Phase und von Glaskügelchen von 3 mm, gefolgt von einem Bewegen mit einer Vortex-Vorrichtung und Schütteln oberhalb der Phasenübergangstemperatur der Phospholipidkomponente für mindestens 1 Stunde, hydratisiert. In einigen fällen wurde dem Puffer eine radioaktive Markierung für die wäßrige Phase einverleibt. In einigen Fällen wurde das hydratisierte Lipid wiederholt dreimal gefroren und aufgetaut, um die nachfolgende Extrusionsstufe zu erleichtern.
Die Größe der Liposomenproben wurde durch Extrusion durch Polycarbonatfilter definierter Porengröße unter Verwendung von unter Druck stehendem Stickstoffgas gesteuert. Bei einem Verfahren wurden die Liposomen einmal durch ein Filter mit Poren von 0,4 um und dann 10 mal durch ein Filter mit Poren von 0,1 um extrudiert. In einem anderen Verfahren wurden die Liposomen dreimal durch ein Filter mit Poren von 0,2 um, gefolgt von einer wiederholten Extrusion durch einen Filter mit Poren von 0,05 um, extrudiert, bis der mittlere Durchmesser der Teilchen unter 100 nm lag, wie es durch DLS bestimmt wurde. Nicht eingeschlossene wäßrige Komponenten wurden entfernt, indem die extrudierte Probe durch eine Gelpermeationssäule geleitet wurde, wobei die Liposomen im Zwischenraumvolumen von den kleinen Molekülen im eingeschlossenen Volumen getrennt wurden.

C. Beladung von DF enthaltenden Liposomen mit &sup6;&sup7;Ga

Die Versuchsanleitung für die Herstellung von &sup6;&sup7;Ga-DF-markierten Liposomen wurde auf der Grundlage bekannter Verfahren (Gabizon, 1989) angepaßt. Kurz gesagt wurden Liposomen mit dem Ionenchelator Desferalmesylat, der in der inneren wäßrigen Phase zur irreversiblen Bindung von Ga, das durch die Doppelschicht mittels Hydroxychinolin (Oxin) transportiert wurde, eingeschlossen war, hergestellt.

D. Dynamische Lichtstreuung

Die Messungen der Teilchengrößenverteilung der Liposomen wurden mittels DLS unter Verwendung einer Vorrichtung NICOMP Modell 200 mit einem angeschlossenen Brookhaven Instruments BI-2030AT Autokorrelator erhalten. Die Instrumente wurden gemäß den Anleitungen des Herstellers betrieben. Die NICOMP-Ergebnisse werden als mittlerer Durchmesser und Standardabweichung einer Gaußschen Verteilung der Bläschen nach dem relativen Volumen ausgedrückt.

Beispiel 5

Messung der Lebenszeit von Liposomen im Blut

A. Messung der Zeit im Blutkreislauf und der Blut/RES-Verhältnisse

Studien von Liposomen in vivo wurden in zwei verschiedenen Tiermodellen durchgeführt, nämlich Swiss-Webster-Mäusen von jeweils 25 g und Laborratten von jeweils 200 bis 300 g. Die Studien in Mäusen beinhalteten die Injektion von Liposomenproben in die Schwanzvene bei 1 mikromolar Phospholipid/Maus, gefolgt vom Töten des Tiers nach einer festgelegten Zeitspanne und der Entfernung von Gewebe zur quantitativen Bestimmung der Markierung durch Bestimmung der Gamma-Zählraten. Das Gewicht und der Prozentsatz der injizierten Dosis in jedem Gewebe wurden bestimmt. Die Studien in Ratten beinhalteten die Einrichtung eines permanenten Katheters in einer Oberschenkelvene zur Entnahme von Blutproben zu definierten Zeitpunkten nach der Injektion von Liposomenproben in einem Katheter der anderen Oberflächenarterie bei 3 bis 4 mikromolar Phospholipid/Ratte. Der Prozentsatz der injizierten Dosis, der im Blut verblieb, wurde zu verschiedenen Zeitpunkten bis zu 24 Stunden bestimmt.

B. Zeitlicher Verlauf der Liposomenretention im Blutstrom

PEG-PE, das aus Methoxy-PEG mit einem Molekulargewicht von 1900 und 1-Palmitoyl-2-oleyl-PE (POPE) bestand, wurde wie in Beispiel 2 hergestellt. PEG-POPE-Lipid wurde mit partiell hydriertem Ei-PC (PHEPC) bei einem molaren Verhältnis Lipid:Lipid von etwa 0,1:2 kombiniert, und das Lipidgemisch wurde hydratisiert und durch eine Polycarbonatmembran mit 0,1 um extrudiert, wie es in Beispiel 4 beschrieben ist, um MLVs mit einem mittleren Durchmesser von etwa 0,1 4m herzustellen. Die MLV-Lipide umfaßten eine kleine Menge an radioaktiv markiertem Lipidmarker ¹&sup4;C-Cholesteryloleat und den eingeschlossenen Marker ³H-Inulin.
Die Liposomen-Zusammensetzung wurde injiziert, und der Prozentsatz der anfänglich injizierten Dosis bei Mäusen wurde 1, 2, 3, 4 und 24 Stunden nach der Injektion bestimmt, wie es in Beispiel 4 beschrieben ist. Sowohl Lipid als auch eingeschlossene Marker zeigten mehr als 10 % der ursprünglich injizierten Dosis nach 24 Stunden.

C. Liposomenspiegel im Blut nach 24 Stunden

Studien zur Bestimmung der prozentualen injizierten Dosis im Blut und der Blut/RES-Verhältnisse von liposomalem Marker 24 Stunden nach der intravenösen Liposomeninjektion wurden durchgeführt, wie es vorstehend beschrieben wurde. Liposomenformulierungen mit den auf der linken Seite in der nachstehenden Tabelle 3 angegebenen Zusammensetzungen wurden hergestellt, wie es vorstehend beschrieben wurde. Sofern nichts anderes angegeben ist, handelte es sich bei dem Lipid-derivatisierten PEG um PEG- 1900, und die Liposomengröße betrug 0,1 um. Die prozentuale Dosis, die im Blut 24 Stunden nach der intravenösen Verabreichung verblieb, und die Blut/RES-Verhältnisse nach 24 Stunden, die gemessen wurden, sind in der mittleren bzw. rechten Spalte der Tabelle gezeigt. Tabelle 3 Lipid-Zusammensetzung* 24 Std. nach IV Dosis % der injizierten Dosis im Blut Blut/RES * Alle Formulierungen enthielten 33 % Cholesterin und 7,5 % geladene Komponenten und wiesen einen mittleren Durchmesser von 100 nm auf, sofern nichts anderes angegeben ist. PEG-DSPE bestand aus PEG&sub1;&sub9;&sub0;&sub0;, sofern nichts anderes angegeben ist.
Wie ersichtlich ist, lag die prozentuale Dosis, die im Blut 24 Stunden nach der Injektion verblieb, im Bereich zwischen 5 bis 40 % für Liposomen, die PEG-derivatisierte Lipide enthielten. Im Gegensatz dazu blieb bei beiden Liposomenformulierungen, denen PEG-derivatisierte Lipide fehlten, weniger als 1 % Liposomenmarker nach 24 Stunden zurück. Wie ebenfalls aus Tabelle 3 ersichtlich ist, stiegen die Blut/RES-Verhältnisse von 0,01 bis 0,03 bei Kontroll-Liposomen auf mindestens 0,2 und auf hohe Werte von 4,0 bei Liposomen, die PEG-derivatisierte Lipide enthielten.

C. Messungen der Lebenszeit im Blut von Polymilchsäure-derivatisiertem PE

Studien zur Bestimmung der prozentualen injizierten Dosis im Blut zu mehreren Zeitpunkten nach der intravenösen Liposomeninjektion wurden durchgeführt, wie es vorstehend beschrieben wurde. MLV-Liposomen-Formulierungen mit der Zusammensetzung Polymilchsäure-PE:HSPC:Chol mit 2:3,5:1 oder 1:3,5:1 (Gew.-%) wurden hergestellt.
Diese Daten zeigen, daß die Entfernung der mit Polymilchsäure beschichteten Liposomen um ein Mehrfaches langsamer ist als die ähnlicher Formulierungen ohne mit Polymilchsäure derivatisiertes PE.

D. Messungen der Lebenszeit im Blut von Polyglykolsäure-derivatisiertem PE

Studien zur Bestimmung der prozentualen injizierten Dosis im Blut zu mehreren Zeitpunkten nach der intravenösen Liposomeninjektion wurden durchgeführt, wie es vorstehend beschrieben wurde. MLV-Liposomen-Formulierungen mit der Zusammensetzung Polymilchsäure-PE:HSPC:Chol mit 2:3,5:1 (Gew.-%) wurden hergestellt.
Diese Daten zeigen, daß die Entfernung der Polyglykolsäure-beschichteten Liposomen um ein Mehrfaches langsamer ist als die ähnlicher Formulierungen ohne mit Polymilchsäure derivatisiertes PE.

Beispiel 6

Einfluß der Sättigung der Phospholipid-Acyl-Ketten auf die Blut/RES- Verhältnisse bei PEG-PE-Liposomen

PEG-PE, das aus Methoxy-PEG mit einem Molekulargewicht von 1900 und Distearyl-PE (DSPE) bestand, wurde wie in Beispiel 2 hergestellt. Die PEG-PE-Lipide wurden mit Lipiden, die unter Sphingomyelin (SM), vollständig hydriertem Soja-PC (PC), Cholesterin (Chol), partiell hydriertem Soja-PC (PHSPC) und partiell hydrierten PC-Lipiden, die in Tabelle 4 als PC IVI, IV10, IV20, IV30 und IV40 bezeichnet werden, ausgewählt waren, formuliert. Die Lipidkomponenten wurden in den molaren Verhältnissen, die links in Tabelle 5 gezeigt sind, gemischt und zur Bildung von MLVs, deren Größe auf 0,1 um eingestellt wurde, wie es in Beispiel 4 beschrieben wurde, verwendet. Tabelle 4 EI-PC-Form Bereich der Phasenübergangstemp. º13C Fettsäurezusammensetzung (Mol-%) Tabelle 5 Blut RES Blut/RES Rest (%)
24 Stunden nach der Injektion wurde der Prozentsatz des injizierten Materials (gemessen als Prozentsatz an ¹&sup4;C-Cholesteryloleat), der im Blut, in der Leber (L) und in der Milz (S) verblieb, bestimmt. Die Werte für Blut und L+S (RES) wurden herangezogen, um den Wert Blut/RES für jede Zusammensetzung zu berechnen. Die beiden Werte mit geringer Wiederfindung in der Tabelle zeigen eine anomale Entfernung.
Die Ergebnisse aus der Tabelle zeigen, daß die Blut/RES-Verhältnisse weitgehend unabhängig von der Fluidität oder dem Sättigungsgrad der Phospholipid-Komponenten, die die Liposomen bilden, sind. Insbesondere wurde keine systematische Änderung der Blut/RES-Verhältnisse bei Liposomen, die größtenteils gesättigte PC-Komponenten (z.B. IVI- und IV10-PC), größtenteils ungesättigte PC-Komponenten (IV40) und Komponenten mit dazwischen liegendem Sättigungsgrad (z.B. IV20) enthielten, beobachtet.
Darüber hinaus zeigt ein Vergleich der Blut/RES-Verhältnisse, die unter Verwendung der vergleichsweise stark gesättigten PEG-DSPE-Verbindung und der vergleichsweise stark ungesättigten PEG-POPE-Verbindung (Beispiel 5) erhalten wurden, daß der Sättigungsgrad des derivatisierten Lipids selbst nicht kritisch für die Fähigkeit von Liposomen ist, der Aufnahme durch das RES zu entgehen.

Beispiel 7

Einfluß von Cholesterin und ethoxyliertem Cholesterin auf die Blut/RES- Verhältnisse bei PEG-PE-Liposomen

A. Einfluß von zugegebenem Cholesterin

PEG-PE, das aus Methoxy-PEG mit einem Molekulargewicht von 1900 und DSPE bestand, wurde hergestellt, wie es in Beispiel 2 beschrieben ist. Die PEG-PE-Lipide wurden mit unter Sphingomyelin (SM), vollständig hydriertem Soja-PC (PC) und Cholesterin (Chol) ausgewählten Lipiden formuliert, wie es in der linken Spalte der nachstehenden Tabelle 5 angegeben ist. Die drei Formulierungen, die in der Tabelle gezeigt sind, enthalten etwa 30, 15 und 0 Mol-% Cholesterin. Es wurden sowohl REVs (mit einer Größe von 0,3 um) als auch MLVs (mit einer Größe von 0,1 um) hergestellt, und zwar im wesentlichen wie in Beispiel 4 (mit eingeschlossenem Tritiummarkiertem Inulin).
Der Prozentsatz von eingeschlossenem Inulin, das im Blut 2 und 24 Stunden nach der Verabreichung verblieb, ist auf der rechten Seite der nachstehenden Tabelle 6 angegeben und zeigt keinen meßbaren Einfluß von Cholesterin im Bereich von 0 bis 30 Mol-%. Tabelle 6 ³H-Inulin % der injizierten Dosis im Blut

B. Einfluß von ethoxyliertem Cholesterin

Methoxyethoxycholesterin wurde durch Kupplung von Methoxyethanol an Cholesterin nach dem Trifluorsulfonat-Kupplungsverfahren, das in Abschnitt I beschrieben wurde, hergestellt. PEG-PE, das aus Methoxy-PEG mit einem Molekulargewicht von 1900 und DSPE bestand, wurde hergestellt, wie es in Beispiel 2 beschrieben wurde. Die PEG-PE-Lipide wurden mit unter Distearyl-PC (DSPC), partiell hydriertem Soja-PC (PHSPC), Cholesterin und ethoxyliertem Cholesterin ausgewählten Lipiden, wie es auf der rechten Seite in Tabelle 7 angegeben ist, hergestellt. Die Daten zeigen, daß (a) ethoxyliertes Cholesterin in Kombination mit PEG-PE ungefähr den gleichen Grad der Erhöhung der Lebenszeit von Liposomen im Blut wie PEG-PE allein ergibt. Das ethoxylierte Cholesterin selbst sorgt für einen mäßigen Grad der Erhöhung der Lebenszeit von Liposomen, der jedoch erheblich geringer als der ist, für den PEG-PE sorgt. Tabelle 7 Formulierung % der injizierten Dosis im Blut

Beispiel 8

Wirkung von geladenen Lipidkomponenten auf die Blut/RES-Verhältnisse bei PEG-PE-Liposomen

PEG-PE, das aus Methoxy-PEG mit einem Molekulargewicht von 1900 und DSPE bestand, wurde hergestellt, wie es in Beispiel 2 beschrieben wurde. Die PEG-PE-Lipide, wurden mit Lipiden, die unter Ei-PG (PG), partiell hydriertem Ei-PC (PHEPC) und Cholesterin (Chol) ausgewählt waren, formuliert, wie es in Fig. 7 angegeben ist. Die beiden Formulierungen, die in der Figur gezeigt sind, enthielten etwa 4,7 Mol-% (Dreiecke) oder 14 Mol- % (Kreise) PG. Die Lipide wurden als MLVs hergestellt, deren Größe wie in Beispiel 4 auf 0,1 um eingestellt wurde.
Der Prozentsatz der injizierten Liposomen-Dosis, der 0,25, 1, 2, 4 und 24 Stunden nach der Injektion vorhanden war, ist graphisch für beide Formulierungen in Fig. 7 aufgetragen. Wie ersichtlich ist, hatte der Prozentsatz an PG in der Zusammensetzung einen geringen oder keinen Einfluß auf die Liposomenretention im Blutstrom. Die Geschwindigkeit des Verlusts von eingeschlossenem Marker, die festgestellt wird, ist ebenfalls ähnlich zu der, die für Liposomen beobachtet wird, die auf ähnliche Weise hergestellt wurden und kein PG enthalten.

Beispiel 9

Plasmakinetik von PEG-beschichteten und unbeschichteten Liposomen

PEG-PE, das aus Methoxy-PEG mit einem Molekulargewicht von 1900 und Distearyl-PE (DSPE) bestand, wurde wie in Beispiel 2 hergestellt. Die PEG-PE-Lipide wurden mit PHEPC und Cholesterin in einem Molverhältnis von 0,15:1,85:1 formuliert. Ein zweites Lipidgemisch enthielt die gleichen Lipide, jedoch ohne PEG-PE. Liposomen wurden aus den beiden Lipidgemischen hergestellt, wie es in Beispiel 5 beschrieben wurde, und zwar durch Lipidhydratisierung in Gegenwart von Desferalmesylat, gefolgt von einer Größeneinstellung auf 0,1 um und der Entfernung von nicht eingeschlossenem Desferal durch Gelfiltration mit anschließender Beladung der Liposomen mit &sup6;&sup7;Ga-Oxin. Das nicht eingeschlossene &sup6;&sup7;Ga wurde während des Durchtritts durch eine Sephadex G-50-Gelausschlußsäule entfernt. Beide Zusammensetzungen enthielten 10 uMol/ml in 0,15 m NaCl, 0,5 millimolar Desferal.
Die beiden Liposomen-Zusammensetzungen (0,4 ml) wurden IV Tieren injiziert, wie es in Beispiel 6 beschrieben ist. Zu Zeitpunkten 0,25, 1, 3 oder 5 und 24 Stunden nach der Injektion wurden Blutproben entnommen und auf die Menge an Inulin, die im Blut verblieb, ausgedrückt als Prozentsatz der Menge, die unmittelbar nach der Injektion gemessen wurde, untersucht. Die Ergebnisse sind in Fig. 9 gezeigt. Wie ersichtlich ist, weisen PEG-beschichtete Liposomen eine Halbwertszeit im Blut von etwa 11 Stunden auf, und nahezu 30 % des injizierten Materials ist im Blut nach 24 Stunden vorhanden. Im Gegensatz dazu zeigten unbeschichtete Liposomen eine Halbwertszeit im Blut von weniger als 1 Stunde. Nach 24 Stunden war die Menge an injiziertem Material nicht mehr nachweisbar.

Beispiel 10

Herstellung von Doxorubicin-Liposomen

Bläschenbildende Lipide, die PEG-PE, PG, PHEPC und Cholesterin in einem Molverhältnis von 0,3: 0,3: 1,4: 1 enthielten, wurden in Chloroform mit einer Lipidendkonzentration von 25 uMol Phospholipid/ml gelöst. α-Tocopherol (α-TC) in Form der freien Base wurde als Lösung in Chloroform:Methanol (2:1) bis zu einem Molendverhältnis von 0,5 % zugegeben. Die Lipidlösung wurde zu einem dünnen Lipidfilm getrocknet und anschließend mit einer warmen (60º C) Lösung von 125 millimolar Ammoniumsulfat mit einem Gehalt an 1 millimolar Desferal hydratisiert. Die Hydratation wurde mit 1 ml wäßriger Lösung pro 50 uMol Phospholipid durchgeführt. Das Lipidmaterial wurde mit 10 Gefrier/Auftau-Zyklen unter Verwendung von flüssigem Stickstoff und einem warmen Wasserbad hydratisiert.
Die Größeneinstellung der Liposomen wurde durch Extrusion durch zwei Nuclepore-Polycarbonatmembranen durchgeführt, und zwar 3 Zyklen durch Filter mit 0,2 um und 10 Zyklen durch Filter mit 0,05 um. Die schließliche Liposomengröße betrug 100 nm. Die hinsichtlich der Größe eingestellten Liposomen wurden dann gegen 50 bis 100 Volumenteile 5-%ige Glucose dreimal während einer Zeitspanne von 24 Stunden dialysiert. Ein vierter Zyklus wurde gegen 5 % Glucose, die auf einen pH-Wert von 6,5 bis 7,0 eingestellt war, für 1 Stunde durchgeführt.
Eine Lösung von Doxorubicin (10 mg/ml in 0,9 % NaCl und 1 millimolar Desferal) wurde hergestellt und mit einem gleichen Volumen des dialysierten Liposomen-Präparats gemischt. Die Konzentration an Arzneimittel im Gemisch betrug etwa 5 mg/ml Arzneimittel 50 uMol/ml Phospholipid. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei 60ºC in einem Wasserbad unter Schütteln inkubiert. Nicht eingeschlossenes Arzneimittel wurde entfernt, indem das Gemisch über Dowex 50 WX-Harz, das in eine kleine Säule gepackt war, geleitet wurde. Die Säule wurde 5 Minuten in einer Arbeitsplatzzentrifuge zentrifugiert, um die Liposomensuspension vollständig zu eluieren. Die Sterilisierung des Gemisches erfolgte durch Durchleiten durch eine Membran mit 0,45 um, und die Liposomen wurden bei 5ºC gelagert.

Beispiel 11

Plasmakinetik von freiem und liposomalem Doxorubicin

PEG-PE, das aus Methoxy-PEG mit einem Molekulargewicht von 1900 und Distearyl-PE (DSPE) bestand, wurde wie in Beispiel 2 hergestellt. Die PEG-PE-Lipide wurden mit hydriertem Sojabohnen-PC (HSPC) und Cholesterin in einem Molverhältnis von 0,15:1,85:1 formuliert (PEG-Dox). Ein zweites Lipidgemisch enthielt hydratisiertes Phosphatidylinosit (HPI), HSPC-Cholesterin in einem Molverhältnis von 1:10:5 (HPI-Dow). Jede Lipidformulierung wurde zur Herstellung von hinsichtlich der Größe eingestellten MLVs, die einen Ammoniumionengradienten enthielten, wie in Beispiel 10 verwendet.
Die Liposomen wurden mit Doxorubicin beladen, indem sie mit einem gleichen Volumen an Doxorubicinlösung (10 mg/ml + 1 millimolar Desferal) wie in Beispiel 15 gemischt wurden. Die beiden Zusammensetzungen werden in Fig. 11 und der nachstehenden Tabelle 7 als PEG-DOX bzw. HPI-DOX-Liposomen bezeichnet. Eine Doxorubicin-HCl-Lösung (vermarktetes Produkt, freies Dox) wurde aus der Krankenhaus-Apotheke erhalten. freies Dox, PEG- Dox und HPI-Dox wurden auf die gleiche Konzentration (1,8 mg/ml) unter Verwendung von ungepufferter 5 %-iger Glucose am Tag der Injektion verdünnt. Hunde wurden zufällig in drei Gruppen (2 weibliche und ein männlicher) eingeteilt und gewogen. Ein Venflon IV-Katheter mit einer Stärke von "18 gauge" wurde in die Oberflächengliedvene jedes Tiers eingeführt. Die Arzneimittel- und Liposomensuspensionen wurden durch einen raschen Bolus (15 Sekunden) injiziert. Blutproben von 4 ml wurden vor der Injektion und 5, 10, 15, 30, 45 min, 1, 2, 4, 6, 8, 10, 12, 24, 48 und 72 Stunden nach der Injektion entnommen. In den Gruppen, die Liposomen erhalten hatten, wurde Blut auch nach 96, 120, 144 und 168 Stunden entnommen. Plasma wurde von den geformten Elementen des Vollbluts durch Zentrifugation abgetrennt, und die Doxorubicin-Konzentrationen wurden durch eine Standardfluoreszenztechnik bestimmt. Die Menge an Doxorubicin, die im Blut verblieb, wurde als Prozentsatz der maximalen Konzentration an markiertem Arzneistoff, gemessen unmittelbar nach der Injektion, ausgedrückt. Die Ergebnisse sind graphisch in Fig. 10 dargestellt, die zeigt, daß sowohl die PEG-DOX als auch die HPI-DOX-Zusammensetzungen lineare logarithmische Darstellungen (exponentiell mit einer Mode) ergaben und daß das freie Arzneimittel eine bimodale exponentielle Kurve ergab, wie es in der nachstehenden Tabelle 8 angegeben ist. Halbwertszeiten für die beiden Liposomenformulierungen, die aus diesen Kurven bestimmt wurden, sind in Tabelle 8 angegeben.
In Tabelle 8 ist auch die Fläche unter der Kurve (AUC) angegeben, die durch Integration der Plasmakinetik-Kurve über den Testzeitraum von 72 Stunden bestimmt wurde. Die AUC-Ergebnisse zeigen, daß die gesamte Verfügbarkeit an Arzneimittel aus PEG-DOX-Liposomen für die 72-stündige Zeitspanne nach der Injektion nahezu doppelt so hoch war wie bei HPI-DOX- Liposomen. Dies stimmt überein mit der ungefähr 2-fach größeren Halbwertszeit von PEG-DOX-Liposomen. Der Eintrag "CL" in Tabelle 9 bedeutet Tabelle 8 freies DOX HPI-DOX PEG-DOX

Beispiel 12

Gwebeverteilung von Doxorubicin

A. Subkutaner Tumor

PEG-Liposomen, die mit Doxorubicin beladen waren, wurden wie in Beispiel 11 hergestellt (PEG-DOX-Liposomen). Bei dem freien Arzneimittel handelte es sich um klinisches Material, das aus der Krankenhaus-Apotheke erhalten wurde.
Zwei Gruppen von 12 Mäusen wurden subkutan 10&sup6; J-6456-Tumorzellen injiziert. Nach 14 Tagen waren die Tumoren auf eine Größe von etwa 1 cm³ im subkutanen Raum gewachsen, und den Tieren wurde IV (Schwanzvene) 10 mg/kg Doxorubicin als freies Arzneimittel (Gruppe 1) oder eingeschlossen in PEG-Liposomen (Gruppe 2) injiziert. 4, 24 und 48 Stunden nach der Arzneimittelinjektion wurden 4 Tiere in jeder Gruppe getötet, und es wurden Schnitte von Tumor, Herz und Muskelgewebe angefertigt. Jedes Gewebe wurde gewogen, dann homogenisiert und zur Bestimmung der Doxorubicin-Konzentration unter Anwendung eines Standard-Fluoreszenz-Assayverfahrens (Gabizon, 1989) extrahiert. Die Gesamtmenge an Arzneimittel, die in jedem Homogenisat gemessen wurde, wurde als ug Arzneimittel pro g Gewebe ausgedrückt.
Die Daten für die Arzneimittelverteilung in Herz, Muskel und Leber sind graphisch in den Figuren 11A und 11B für freies bzw. Liposomen-assoziiertes Doxorubicin aufgetragen. In Fig. 11A ist ersichtlich, daß alle drei Gewebetypen etwa die gleiche Menge an Arzneimittel pro g Gewebe aufnehmen, wobei jedoch zu Anfang das Arzneimittel vorzugsweise im Herzen aufgenommen wird. Im Gegensatz dazu zeigt das Arzneimittel, wenn es in PEG-Liposomen eingeschlossen ist, eine starke selektive Lokalisierung im Tumor bei verringerten Konzentrationen in Herz und Muskelgewebe.

B. Ascites-Tumor

Zwei Gruppen von 15 Mäusen wurden interperitoneal 10&sup6; J-6456-Lymphom-Zellen injiziert. Man ließ den Tumor für 1 bis 2 Wochen wachsen, wonach sich 5 ml Ascites-Flüssigkeit angesammelt hatten. Den Mäusen wurden dann IV 10 mg/kg Doxorubicin entweder in Form des freien Arzneimittels (Gruppe 1) oder eingeschlossen in PEG-Liposomen (Gruppe 2), wie es in Beispiel 11 beschrieben wurde, injiziert. Ascites-Flüssigkeit wurde aus drei Tieren in jeder Gruppe 1, 4, 15, 24 und 48 Stunden nach der Behandlung entnommen. Der Ascites-Tumor wurde weiter durch Zentrifugation (15 min bei 5000 U/min) in zelluläre und flüssige Komponenten fraktioniert. Freies und an Liposomen gebundenes Arzneimittel im Oberstand wurde bestimmt, indem die Flüssigkeit wie vorstehend über Dowex WX-Harz zur Entfernung von freiem Arzneimittel geleitet wurde. Die Doxorubicin-Konzentrationen in Ascites-Flüssigkeit, Tumorzellen, Überstand und mit Harz behandeltem Überstand wurden anschließend bestimmt, und aus diesem Werten wurde ug Doxorubicin/g Gewebe berechnet. Die Werte für den gesamten Ascites-Flüssigkeits-Überstand (ausgefüllte Rauten), (iberstand nach Entfernung von freiem Arzneimittel (ausgefüllte Dreiecke) und isolierte Tumorzellen (ausgefüllte Kreise) sind graphisch in Fig. 12 dargestellt. Wie ersichtlich ist, nahm die Gesamtmenge an Doxorubicin in der Ascites-Flüssigkeit stetig bis etwa 24 Stunden zu, und dann fiel sie geringfügig über die nächsten 24 Stunden. Der größte Teil des Doxorubicins im Tumor liegt in in Liposomen eingeschlossener Form vor, was zeigt, daß die Liposomen zu einer Extravasation in feste Tumoren in intakter Form imstande sind.
In einem ähnlichen Versuch wurden zwei Gruppen von 12 Mäusen IP J- 6456-Lymphome implantiert, und man ließ den Tumor wachsen, wie es vorstehend beschrieben wurde. Sobald der Ascites-Tumor etwa 5 ml erreicht hatte, wurde einer Gruppe von Tieren 10 mg/kg freies Doxorubicin injiziert, und der anderen Gruppe 10 mg/kg Doxorubicin, eingeschlossen in PEG-Liposomen. 4, 24 und 48 Stunden nach der Behandlung wurden Ascites- Flüssigkeit und Blutproben aus vier Tieren in jeder Gruppe entnommen, und die Tiere wurden getötet. Schnitte von Leber- und Herzgewebe wurden aus jedem Tier entnommen, homogenisiert, und die Arzneimittelkonzentration wurde untersucht, wie es vorstehend beschrieben wurde. Plasma wurde aus dem Vollblut durch Zentrifugation abgetrennt, und die Arzneimittelkonzentration wurde untersucht, wie es vorstehend angegeben wurde. Die Doxorubicin-Konzentration in der Ascites-Flüssigkeit wurde ebenfalls gemessen. Die Ergebnisse werden in Tabelle 9 vorgelegt. Konzentrationen in Plasma und Ascites-Flüssigkeit sind als ug Doxorubicin pro ml ausgedrückt, und Leber- und Herzgewebewerte sind als ug Doxorubicin pro g Gewebe ausgedrückt. Die Standardabweichung für jede Messung ist in Klammern gezeigt. Wie gezeigt ist, befindet sich erheblich mehr Doxorubicin im Plasma bei der Gruppe, die den Arzneistoff in einer in PEG-Liposomen eingeschlossenen Form erhielt, und zwar zu allen Zeitpunkten. Die Ascites-Tumor-Konzentrationen sind in der Liposomengruppe ebenfalls höher, insbesondere bei den späteren Zeitpunkten (24 und 48 Stunden). Diese Daten bestätigen die selektive Abgabe von Arzneimittel an den Tumor durch die PEG-Liposomen. Tabelle 9 Plasma (ug/ml) (SD)

Beispiel 13

Tumoraufnahme von PEG-Liposomen im Vergleich mit herkömmlichen Liposomen

Zwei Gruppen von 6 Mäusen wurden subkutan 10&sup5; bis 10&sup6; C-26-Colonkarzinom-Zellen injiziert, und man ließ den Tumor im subkutanen Raum wachsen, bis er eine Größe von etwa 1 cm³ erreichte (etwa 2 Wochen nach der Injektion). Jeder Gruppe von Tieren wurde dann 0,5 mg entweder an herkömmlichen Liposomen (100 nm DSPC/Chol, 1:1) oder PEG-Liposomen (100 nm DSPC/Chol/PEG-DSPE, 10:3:1), die mit radioaktivem Gallium, wie es im Beispiel 4 beschrieben wurde, beladen worden waren, injiziert. Drei Mäuse aus jeder Gruppe wurden 2, 24 und 48 Stunden nach der Behandlung getötet, die Tumoren wurden ausgeschnitten und gewogen, und die Menge an Radioaktivität wurde mit einem Gamma-Zähler quantitativ bestimmt. Die Ergebnisse werden in der nachstehenden Tabelle vorgelegt und sind als Prozentsatz der injizierten Dosis pro g Gewebe ausgedrückt. Tabelle 10 PEG herkömmlich Verhältnis im Tumor* * Ausgedrückt als Menge an PEG-Liposomen, geteilt durch die Menge an herkömmlichen Liposomen, die im Tumor lokalisiert sind.

Beispiel 14

Liposomen-Extravasation in intakte Tumoren: direkte mikroskopische Visualisierung

PEG-PE, das aus Methoxy-PEG mit einem Molekulargewicht von 1900 und Distearyl-PE (DSPE) bestand, wurde wie in Beispiel 2 hergestellt. PEG-PE- Lipide wurden mit HSPC und Cholesterin in einem Molverhältnis von 0,15:1,85:1 formuliert. PEG-Liposomen wurden hergestellt, so daß sie kolloidale Goldteilchen enthielten (Hong). Die erhaltenen MLVs wurden wie vorstehend durch Extrusion auf eine mittlere Größe von 0,1 um eingestellt. Nicht eingeschlossenes Material wurde durch Gelfiltration entfernt. Die Endkonzentration an Liposomen in der Suspension betrug etwa 10 uMol/ml.
In einer ersten Studie wurden einer normalen Maus IV 0,4 ml der vorstehenden Liposomenformulierung injiziert. 24 Stunden nach der Injektion wurde das Tier getötet, und Schnitte der Leber wurden entfernt und in einem wasserlöslichen Standard-Kunstharz fixiert. Dicke Schnitte wurden mit einem Microtom geschnitten, und die Schnitte wurden mit einer Lösung von Silbernitrat gemäß den Anweisungen angefärbt, die mit dem "Intense 2"-System-Reagenssatz zur Verfügung gestellt werden, der von Jannsen Life Sciences, Inc. (Kingsbridge, Piscataway, N.J.) bezogen wurde. Die Schnitte wurden weiter mit Eosin und Hämotoxylin angefärbt.
Fig. 13A ist eine mikroskopische Aufnahme eines typischen Leberschnitts, der kleinere, unregelmäßig geformte Kupfer-Zellen, wie Zellen 20, unter größeren, regelmäßiger geformten Hepatocyten, wie Hepatocyten 22, zeigt. Die Kupfer-Zellen zeigen große Konzentrationen an intakten Liposomen, die als kleine, dunkel gefärbte Körperchen erkennbar sind, wie bei 24 in Fig. 13A. Die Hepatocyten sind größtenteils frei von Liposomen, wie es zu erwarten war.
In einer zweiten Studie wurde ein C-26-Colonkarzinom (etwa 10&sup6; Zellen) in eine Mausleber implantiert. 14 Tage nach der Implantation wurden dem Tier IV 0,5 mg der vorstehenden Liposomen injiziert. 24 Stunden später wurde das Tier getötet, und die Leber wurde wie vorstehend getränkt, eingebettet, geschnitten und angefärbt. Die Schnitte wurden auf eine vom Kapillaren versorgte Tumorregion untersucht. Eine beispielhafte Region ist in Fig. 13B zu sehen, die eine Kapillare 26 zeigt, die eine Region von Karzinom-Zellen, wie Zellen 28, versorgt. Die Zellen weisen charakteristische Anfärbemuster auf und umfassen oftmals dunkel angefärbte Kerne in verschiedenen Stadien der Mitose. Die Kapillare in der Figur ist mit einer endothelialen Barriere 30 und unmittelbar darunter mit einer Basismembran 32 ausgekleidet.
Es ist aus Fig. 13B ersichtlich, daß Liposomen, wie Liposomen 34, stark in der Tumorregion, die zur Kapillare auf der Tumorseite der endothelialen Barriere und der Basismembran benachbart ist, konzentriert sind, und viele Liposomen sind auch in der interzellulären Flüssigkeit, die die Tumorzellen umgibt, verteilt.
Fig. 13C zeigt eine weitere Region des Lebertumors aus dem vorstehenden Tier. Liposomen sind in der gesamten interzellulären Flüssigkeit, in denen sich die Karzinom-Zellen befinden, erkennbar.
In einer dritten Studie wurden C-26-Colonkarzinom-Zellen subkutan einem Tier injiziert, und man ließ sie 28 Tage in dem Tier wachsen. Anschließend wurden dem Tier IV 0,5 mg der vorstehenden Liposomen injiziert. 24 Stunden später wurde das Tier getötet, und die Tumormasse wurde ausgeschnitten. Nach Einbetten wurde die Tumormasse mit einem Microtom geschnitten und wie vorstehend angefärbt. Fig. 13D zeigt eine Region der Tumorzellen unter Einschluß einer Zelle 36 im Zentrum der Figur, die sich in einem späten Stadium der Mitose befindet. Kleine, dunkel angefärbte Liposomen sind in der gesamten interzellulären Flüssigkeit zu erkennen.

Beispiel 15

Tumorbehandlungsverfahren

Bläschenbildende Lipide, die PEG-PE, PG, PHEPC und Cholesterin sowie α-TC in einem Molverhältnis von 0,3: 0,3: 1,4: 1: 0,2 enthielten, wurden in Chloroform mit einer Lipidendkonzentration von 25 uMol Phospholipid/ml gelöst. Das Lipidgemisch wurde unter verringertem Druck zu einem dünnen Film getrocknet. Der Film wurde mit einer Lösung von 0,125 m Ammoniumsulfat unter Bildung von MLVs hydratisiert. Die MLV-Suspension wurde dreimal in einem Trockeneis-Aceton-Bad eingefroren und aufgetaut, und die Größe wurde auf 80 bis 100 nm eingestellt. Ein Ammoniumionengradient wurde im wesentlichen so erzeugt, wie es in Beispiel 10 beschrieben ist.
Die Liposomen wurden mit Epirubicin beladen, und freies (ungebundenes) Arzneimittel wurde entfernt, wie es ebenfalls in Beispiel 10 für Doxorubicin beschrieben ist. Die Endkonzentration an eingeschlossenem Arzneimittel betrug etwa 50 bis 100 ug Arzneimittel/uMol Lipid. Epirubicin-HCl und Doxorubicin-HCl, die handelsüblichen Produkte, wurden aus der Krankenhaus-Apotheke erhalten.
Etwa 10&sup6; C-26-Colonkarzinom-Zellen wurden subkutan drei Gruppen von 35 Mäusen injiziert. Die Gruppen wurden in 5 Untergruppen von 7 Tieren aufgeteilt.
Für das Tumor-Suppressionsexperiment, das in Fig. 14A gezeigt ist, wurden jeder Untergruppe IV 0,5 ml entweder Kochsalz-Trägerlösung als Kontrolle (offene Kreise), 6 mg/kg Epirubicin (offene Dreiecke), 6 mg/kg Doxorubicin (ausgefüllte Kreise) oder mit Arzneistoff beladene Liposomen (PEG-DOX-Liposomen) in zwei Dosen, nämlich 6 mg/kg (ausgefüllte Dreiecke) und 12 mg/kg (offene Quadrate), an den Tagen 1, 8 und 15 nach der Tumorzellimplantation injiziert. Jede Gruppe wurde 28 Tage überwacht. Die Tumorgröße wurde für-jedes Tier an den Tagen 5, 7, 12, 14, 17, 21, 24 und 28 gemessen. Das Tumorwachstum in jeder Untergruppe (ausgedrückt als mittlere Tumorgröße der einzelnen Tiere) zu jedem Zeitpunkt ist graphisch in Fig. 14A dargestellt.
Mit Bezug auf diese Figur supprimierten weder freies Doxorubicin noch freies Epirubicin bei 6 mg/kg in signifikanter Weise das Tumorwachstum im Vergleich mit der Kochsalzlösung als Kontrolle. Im Gegensatz dazu supprimierte in PEG-Liposomen eingeschlossenes Epirubicin bei beiden Dosen in signifikanter Weise das Tumorwachstum. Im Hinblick auf das Überleben der Tiere nach 120 Tagen nach der Tumorimplantation ist festzustellen, daß keines der Tiere in den Gruppen, die Kochsalzlösung, Epirubicin oder Doxorubicin erhielten, überlebte, während fünf von sieben und sieben von sieben in den Gruppen überlebten, die 6 mg/kg Liposomen-Epirubicin bzw. 12 mg/kg Liposomen-Epirubicin erhielten.
Die Ergebnisse von Versuchen zur verzögerten Behandlung unter Verwendung des gleichen Tumormodells sind in den Figuren 14B und 14C dargestellt. Der gleichen Anzahl an Tieren wurden die gleichen Anzahlen an Tumorzellen überimpft, wie es vorstehend beschrieben wurde. Die Behandlungsgruppen in den Figuren 14B und 14C bestanden aus Kochsalzlösung (durchgezogene Linie), 6 mg/kg Epirubicin (ausgefüllte Dreiecke), 6 mg/kg freies Epirubicin plus leere PEG-Liposomen (offene Kreise) und zwei Dosierungen von in PEG-Liposomen eingeschlossenem Epirubicin, nämlich 6 mg/kg (ausgefüllte Dreiecke) und 9 mg/kg (ausgefüllte Quadrate). Im Gegensatz zu den Ergebnissen, die in Fig. 14A dargestellt sind, erfolgten bei diesen Versuchen nur zwei Behandlungen: an den Tagen 3 und 10 für die Ergebnisse, die in Fig. 14B graphisch dargestellt sind; und an den Tagen 10 und 17 für die Ergebnisse, die in Fig. 14C graphisch dargestellt sind. Im Fall des in PEG-Liposomen eingeschlossenen Arzneimittels ist wichtig, daß beide verzögerte Behandlungspläne bei beiden Dosierungen zu einer Tumorregression führten, während die Behandlungsgruppen mit freiem Arzneimittel und freiem Arzneimittel plus leeren Liposomen nur eine mäßige Retardation der Geschwindigkeit des Tumorwachstums zeigten.

Beispiel 16

Tumorbehandlungsverfahren

PEG-DOX Liposomen wurden wie in Beispiel 15 hergestellt, mit der Ausnahme, daß die Liposomen mit Doxorubicin in einer Endkonzentration von 60 bis 80 ug/uMol Gesamtlipid beladen wurden. Eine Doxorubicin-HCl-Lösung, die als Kontrolle durch das freie Arzneimittel verwendet werden sollte, wurde aus einer Krankenhaus-Apotheke erhalten. Insgesamt 30 Mäusen wurden IP 10&sup6; J-6456-Lymphom-Zellen injiziert. Die Tiere wurden in drei Gruppen von je 10 Tieren aufgeteilt, denen jeweils IV 0,4 ml Kochsalz-Trägerlösung, 10 mg/kg Doxorubicin-Lösung oder die mit Doxorubicin beladenen Liposomen bei 10 mg/kg injiziert wurde. Jede Gruppe wurde 100 Tage im Hinblick auf die Anzahl der überlebenden Tiere überwacht. Der prozentuale Anteil der Überlebenden für jede Behandlungsgruppe ist in Fig. 15 graphisch dargestellt.
Wie ersichtlich ist, führte das freie Arzneimittel (ausgefüllte Kreise) zu einer geringen Verbesserung hinsichtlich des Überlebens gegenüber der Gruppe, die die Kochsalzlösung erhielt (ausgefüllte Quadrate). Bei den Tieren, die mit mit Doxorubicin beladenen PEG-Liposomen (ausgefüllte Dreiecke) behandelt worden waren, überlebten jedoch etwa 50 % der Tiere über 40 Tage, 20 % über 70 Tage und 10 % bis zum Ende des Versuchs nach 100 Tagen.

Beispiel 17

Verringerte Toxizität von PEG-Liposomen

Lösungen von freiem Doxorubicin-HCl und Epirubicin-HCl wurden wie vorstehend erhalten. PEG-Liposom-Formul ierungen, die entweder Doxorubicin oder Epirubicin bei einer Arzneimittelkonzentration von 70 bis 90 ug Verbindung pro uMol Liposomenlipid enthielten, wurden wie in Beispiel 16 hergestellt. Herkömmliche Liposomen (kein mit PEG derivatisiertes Lipid) wurden mit Doxorubicin bei einer Arzneimittelkonzentration von 40 ug/uMol Lipid unter Verwendung von Standardtechniken beladen.
Jede der fünf Formulierungen wurde an 35 Mäuse bei einer Dosis zwischen 10 und 40 mg Arzneimittel/kg Körpergewicht in Inkrementen von 5 mg/kg verabreicht, wobei 5 Mäuse jede Dosis erhielten. Die in der nachstehenden Tabelle 11 angegebene maximal tolerierte Dosis ist die höchste Dosis, die nicht zum Tod oder einem dramatischen Gewichtsverlust bei den Tieren, die die Injektionen erhalten hatten, innerhalb von 14 Tagen führte. Wie aus den Daten ersichtlich ist, führten sowohl DOX-Liposomen als auch PEG-DOX-Liposomen zu mehr als einer Verdoppelung der tolerierten Dosis von Doxorubicin gegenüber dem Arzneimittel in freier Form, wobei die PEG-DOX-Liposomen zu einer geringfügig höheren tolerierten Dosis führten. Ein ähnliches Ergebnis wurde für die Dosis an toleriertem Epirubicin in freier und PEG-liposomaler Form erhalten. Tabelle 11 Maximal tolerierte Dosis an DXN (mg/kg bei Mäusen

Beispiel 18

Tumorbehandlungsverfahren

Herkömmliche Doxorubicin-Liposomen (L-DOX) wurden gemäß veröffentlichter Verfahren hergestellt. Kurz gesagt wurde ein Gemisch aus Ei-PG. Ei-PC, Cholesterin und α-TC in einem Molverhältnis von 0,3:1,4:1:0,2 in Chloroform hergestellt. Das Lösungsmittel wurde unter verringertem Druck entfernt, und der trockene Lipidfilm wurde mit einer Lösung von 155 millimolar NaCl mit einem Gehalt an 2 bis 5 mg Doxorubicin-HCl hydratisiert. Das erhaltene MLV-Präparat wurde durch Extrusion durch eine Reihe von Polycarbonatmembranen hinsichtlich der Größe bis auf eine endgültige Größe von etwa 250 nm verringert. Freies (nicht eingeschlossenes) Arzneimittel wurde entfernt, indem die Suspension über ein Bett aus Dowex-Harz geleitet wurde. Die Endkonzentration an Doxorubicin betrug etwa 40 pro uMol Lipid.
Drei Gruppen von 7 Mäusen wurden subkutan 105 bis 10&sup6; C-26-Colonkarzinom-Zellen überimpft, wie es ausführlich in Beispiel 15 beschrieben wurde. Die Tiere wurden in drei Behandlungsgruppen mit je 7 Tieren eingeteilt, von denen eine 0,5 ml Kochsalz-Trägerlösung als Kontrolle erhielt. Die beiden anderen Gruppen wurden mit Doxorubicin entweder als freie Arzneimittellösung oder in Form von L-DOX-Liposomen mit einer Dosis von 10 mg/kg behandelt. Die Behandlungen erfolgten an den Tagen 8, 15 und 22 nach der Überimpfung der Tumorzellen. Die Tumorgröße wurde an den Tagen der Behandlung und am Tag 28 gemessen. Wie in Fig. 16 gezeigt ist, supprimierte das freie Arzneimittel (ausgefüllte Kreise) das Tumorwachstum in einem mäßigen Ausmaß im Vergleich mit der Kochsalzlösung als Kontrolle (durchgezogene Linie). Der Tumor in der L-Dox-behandelten Gruppe (ausgefüllte Dreiecke) wuchs geringfügig schneller als der in der mit freiem Arzneimittel behandelten Gruppe und geringfügig langsamer als in der unbehandelten Gruppe. Diese Ergebnisse zeigen, daß die Antitumor-Aktivität der L-DOX-Zubereitung etwa die gleiche ist und sicher nicht besser ist als die des freien Arzneimittels in der gleichen Dosierung. Dies steht in einem deutlichen Gegensatz zu den Ergebnissen, die in Beispiel 15 (und in den Figuren 14A-C) vorgelegt wurden, die zeigen, daß bei vergleichbaren Dosen Epirubicin, das in PEG-Liposomen eingeschlossen ist, eine dramatisch bessere Antitumoraktivität als das freie Arzneimittel bei diesem gleichen Tumormodell aufweist.

Claims

1. Liposomen-Zusammensetzung zur Verwendung bei der Lokalisierung eines tumorabbildenden Mittels oder eines Antitumormittels in einem festen Tumor über den Blutstrom, wobei die Zusammensetzung folgendes enthält:

Liposomen, zusammengesetzt aus bläschenbildenden Lipiden und 1-20 Mol-% eines amphipatischen bläschenbildenden Lipids, das mit einem unter Polyethylenglycol, Polymilchsäure, Polyglycolsäure und Polymilchsäure/Polyglycolsäure-Copolymeren ausgewählten hydrophilen Polymeren mit einem Molekulargewicht von 1000-5000 Dalton derivatisiert ist, die eine durchschnittliche Liposomengröße von etwa 0,07-0,12 um aufweisen, und

ein tumorabbildendes Mittel oder ein Antitumormittel in einer in Liposomen eingeschlossenen Form.

2. Liposomen-Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei es sich beim hydrophilen Polymeren um ein Polyethylenglycol mit einem Molekulargewicht von etwa 1000-5000 Dalton handelt.

3. Liposomen-Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei mindestens 80 % des Antitumormittels in einer in Liposomen eingeschlossenen Form vorliegen.

4. Liposomen-Zusammensetzung nach Anspruch 3, wobei es sich beim Antitumormittel um ein Anthracyclin-Antibiotikum handelt.

5. Liposomen-Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei es sich beim Anthracyclin um Doxorubicin, Epirubicin und Daunorubicin sowie um pharmakologisch verträgliche Salze und Säuren davon handelt.

6. Liposomen-Zusammensetzung nach Anspruch 4 oder 5, wobei die Konzentration des Antitumormittels, das in den Liposomen eingeschlossen ist, mehr als 50 ug Mittel/umol Liposomenlipid beträgt.

7. Verwendung einer Liposomen-Zusammensetzung mit einem Gehalt an Liposomen, die aus bläschenbildenden Lipiden und 1-20 Mol-% eines amphipathischen bläschenbildenden Lipids, das mit einem hydrophilen Polymeren derivatisiert ist, zusammengesetzt sind und eine durchschnittliche Liposomengröße von etwa 0,07-0,12 um aufweisen, und mit einem Gehalt an einem tumorabbildenden Mittel oder an einem Antitumormittel bei der Herstellung eines Arzneimittels zur Lokalisierung des Mittels in einem festen Tumor.

8. Verfahren zur Herstellung eines tumorabbildenden Mittels oder eines Antitumormittels für die Lokalisierung in einem festen Tumor über den Blutstrom, umfassend das Einschließen des tumorabbildenden Mittels oder Antitumormittels in Liposomen unter Bildung einer liposomalen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1-6.