DE69724641T2

DE69724641T2 - Reinigung von fermentierter clavulansäure

Info

Publication number: DE69724641T2
Application number: DE69724641T
Authority: DE
Inventors: Harald Summer; Alois Renzl; Helmut Wagner
Original assignee: Biochemie GmbH
Current assignee: Sandoz AG
Priority date: 1996-11-27
Filing date: 1997-11-25
Publication date: 2004-08-05
Anticipated expiration: 2017-11-26
Also published as: AU5556298A; WO1998023622A1; AT404728B; EP0941229A1; CA2273021A1; ATA206296A; KR20000069057A; EP0941229B1; JP2001504508A; DE69724641D1; AR013876A1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Reinigung von fermentierten Produkten, d. h. bei der Produktion pharmazeutisch annehmbarer Clavulansäuresalze der
z. B. Kaliumclavulanat.
Pharmazeutisch annehmbare Clavulansäuresalze sowie verschiedene Herstellungsverfahren sind bekannt, beispielsweise mittels

a) der Fermentation eines Mikroorganismus, der fähig ist, Clavulansäure zu erzeugen
b) der Isolierung von Clavulansäure aus der Fermentationsbrühe
c) der Reinigung von Clavulansäure, z. B. mittels eines Salzes davon
d) die Umwandlung der gereinigten Clavulansäure aus Schritt c), z. B. eines Salzes davon, in ein pharmazeutisch annehmbares Clavulansäuresalz.

Die EP-A-0 385 552 beschreibt ein Verfahren zur Reinigung von durch die Fermentation mit Streptomyces-Stämmen gewonnene Fermentationsbrühen, bei dem man einen anorganischen Elektrolyten zusammen mit einem anorganischen Gerinnungsmittel bei einem pH-Wert von 5 bis 8 zugibt, dann ein organisches Flockungsmittel zugibt, um schließlich die Ausflockung abzutrennen. Aus der erhaltenen durchsichtigen Flüssigkeit kann einem weiteren Verarbeitungsschritt das Produkt, z. B. Clavulansäure, isoliert werden.
Die EP-A-0 387 178 betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Clavulansäure oder einem Salz davon, einschließlich der Schritte des Ausflockens der Fermentationsbrühe mit einem anorganischen Elektrolyten als Gerinnungsmittel zusammen mit einem organischen Polyelektrolyten, des Dekantierens der Ausflockung und des Reinigens der Clavulansäure, indem man ein Aminsalz von Clavulansäure bildet, des Isolieren dieser und des Umwandelns dieser in ein pharmazeutisch annehmbares Salz, z. B. ein Kaliumsalz von Clavulansäure.
Die WO95/23870 betrifft ein Verfahren zur Isolierung von Clavulansäure oder einem pharmazeutisch annehmbaren Salz davon, bei dem die Zellen, ein Hauptteil der Proteine und weitere suspendierte Feststoffteilchen durch Mikrofiltration bei einem pH-Wert von 5,8 bis 6,2 entfernt werden, die gereinigte wässrige Phase gegebenenfalls zusätzlich durch Ultrafiltration gereinigt und weiter durch Umkehrosmose aufkonzentriert wird. Im nächsten Schritt wird die Clavulansäure in ein mit Wasser unmischbares, organisches Lösungsmittel mit einem pH-Wert von 1 bis 3, welches getrocknet, entfärbt und beispielsweise durch Eindampfen aufkonzentriert wurde, extrahiert. Dann wird die in der organischen Phase vorliegende Clavulansäure isoliert und gereinigt, indem ein Salz mit einem Amin, insbesondere N,N'-Diisopropylethylendiamin, gebildet wird, welches isoliert und in ein pharmazeutisch annehmbares Kaliumsalz von Clavulansäure umgewandelt wird, wie das Kaliumsalz, das wiederum isoliert wird.
Die WO96/33197 betrifft eine Verbesserung des in der WO95/23870 offenbarten Verfahrens durch Zugeben eines weiteren Lösungsmittels, z. B. eines Alkohols, zu einer Lösung aus Clavulansäure in einem Wasser-unmischbaren Lösungsmittel, die man durch Extraktion aus einer vorkonzentrierten und vorgereinigten wässrigen Fermentationsbrühe gewonnen hat, was zu hohen Ausbeuten und Reinheitsgraden von Clavulansäure oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes oder Esters davon führt.
Es wurde jetzt gefunden, dass man die Produktion eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes von Clavulansäure, z. B. wie das Kaliumsalz, überraschend verbessern kann, wenn die wässrige Fermentationsbrühe vor der Isolierung der Clavulansäure mit einem Lösungsmittel extrahiert wird. Durch eine solche Extraktion vor der Isolierung kann Clavulansäure, z. B. in Form eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes, in überraschend reiner Form und in überraschend hohen Ausbeuten aus der Fermentationsbrühe gewonnen werden.
Ein Aspekt der vorliegenden Erfindung stellt ein Verfahren zur Herstellung von Clavulansäure und pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon bereit, und zwar durch

a) Fermentation eines Mikroorganismus, der fähig ist, Clavulansäure zu erzeugen, so dass eine Clavulansäure-haltige Fermentationsbrühe entsteht,
b) Extraktion der Clavulansäure-haltige Fermentationsbrühe mit einem organischen Lösungsmittels, das fähig ist, zusammen mit einer wässrigen Fermentationsbrühe ein Flüssigkeits/Flüssigphasen-System zu bilden und aus der Gruppe aus einem Ether, einem Keton, einem Ester, einem Alkohol und einem Gemisch davon ausgewählt ist, bei einem pH-Wert von 5,5 bis 7,5, so dass eine extrahierte, wässrige Fermentations brühe entsteht, wobei die Clavulansäure im wesentlichen in der wässrigen Fermentationsbrühe zurückbleibt,
c) Extraktion von Clavulansäure aus der extrahierten, wässrigen Fermentationsbrühe bei einem pH-Wet von 1,5 bis 2,5 mit einem Lösungsmittel, in dem Clavulansäure unter den Extraktionsbedingungen löslich ist und das fähig ist, zusammen mit der wässrigen Fermentationsbrühe ein Flüssigkeits/Flüssigphasen-System zu bilden und welches aus der Gruppe aus einem Ester, einem Keton, einem Alkohol und einem Gemisch davon ausgewählt ist,
d) Reinigung der in Schritt c) gewonnenen extrahieren Clavulansäure oder eines Salzes davon und
e) Umwandlung der gereinigten Clavulansäure aus Schritt d) oder eines Salzes davon in ein pharmazeutisch annehmbares Salz von Clavulansäure, z. B. Kaliumclavulanat.

Der Fermentationsschritt a) kann wie üblich durchgeführt werden, beispielsweise wie allgemein beschrieben in der GB 1508977 und der WO93/25557. Ein besonderes Fermentationsverfahren ist beispielsweise in der EP 182522 beschrieben, wobei eine Kohlenstoffquelle während der Fermentation fortlaufend oder mit Unterbrechungen zugeführt wird; wie z. B. in der WO96/18743, indem die Ammoniak- und Harnstoffmengen gering gehalten werden; z. B. in der WO97/19187, indem der lösliche Phosphatgehalt in dem Fermentationsmedium streng kontrolliert wird; z. B. in der EP 349 121 ; der WO95/03416; der CA 2108113; der WO94/18326; der WO94/12654 und der WO96/10084; durch Herstellen von Clavulansäure mit Hilfe eines Wirts, der mit einem Vektor transformiert wurde, welcher eine DNA oder ein DNA-Fragment enthält, die oder das für wenigstens ein an der Clavulansäureproduktion beteiligtes Enzym kodiert. Ein geeigneter Mikroorganismus ist beispielsweise ein Mikroorganismus der Gattung Streptomyces, wie S. clavuligerus, d. h. Stamm NRRL 3585, oder Streptomyces sp. P6621 FERM 2804 (japanisches Patent 55,162,993) oder andere Mutanten. Die Fermentation unter geeigneten Bedingungen ist ausführlicher aus verschiedenen Publikationen bekannt, z. B. aus hierin unter Schritt a) und unter den nachstehenden Schritten c), d) und e) beschrieben, deren Inhalt, einschließlich der darin zitierten früheren Veröffentlichungen, hierin durch die Bezugnahme enthalten ist.
Erfindungsgemäß wird die Fermentationsbrühe in Schritt b) vor dem Isolieren der Clavulansäure extrahiert. Die Extraktion einer wässrigen Fermentationsbrühe in Schritt b) kann beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:
Die Extraktion kann wie üblich durchgeführt werden, z. B. gemäß einem beliebigen Verfahren, wie beschrieben in einer der oben unter Schritt a) oder nachstehend unter Schritt c), d) und e) zitierten Referenzen.
Die gesamte unfiltrierte Fermentationsbrühe oder eine Fermentationsbrühe, aus der wenigstens ein Teil der suspendierten Feststoffe entfernt wurden, beispielsweise durch Ausflockung, z. B. durch Anpassen des pH-Wertes oder durch Zugabe ein oder mehrerer Flockungsmittel; durch Filtration, z. B. durch Anschwemmfiltration auf einem Vakuumrotationsfilter, z. B. unterstützt durch eine Filtrierhilfe, beispielsweise auf Mineral- oder Zellulosebasis; durch Querstromfiltration mit oder ohne vorheriges Absieben grober Partikel; durch Mikrofiltration; oder durch Zentrifugation, können mit einem Lösungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Ether, einem Keton, einem Ester, einem Alkohol und einem Gemisch davon, das fähig ist, zusammen mit einer wässrigen Fermentationsbrühe ein Flüssigkeits/Flüssigphasensystem zu bilden, das z. B. mit der Brühe unmischbar ist, extrahiert werden.
Die wässrige, Clavulansäure-haltige Flüssigkeit kann vor der Extraktion vorkonzentriert werden, um spezifische Konzentrationsbereiche zu erlangen, z. B. durch Anionenaustausch oder osmotische Verfahren, so dass eine Clavulansäurekonzentration von 20 bis 80 g/kg, wie 10 bis 50 g/kg, z. B. 10 bis 40 g/kg, beispielsweise 10 bis 30 g/kg erreicht wird.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein wie oben beschriebenes Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass wenigstens ein Teil der in der Fermentationsbrühe suspendierten Feststoffe vor der Extraktion entfernt werden; sowie ein wie oben definiertes Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass die Fermentationsbrühe vor der Extraktion aufkonzentriert wird.
Ein Lösungsmittel für die Extraktion, welches fähig ist, mit einer wässrigen Fermentationsbrühe ein Flüssigkeits/Flüssigphasen-System zu bilden, umfasst Ether, Ketone, z. B. Methylisobutylketon, Diethylketon, Methylethylketon; Ester, z. B. Ethylacetat, ein Propylacetat; oder Alkohole, wie Butanol, beispielsweise n-Butanol oder Isobutanol, vorzugsweise Ethylacetat, Diethylketon, Methylisobutylketon, wie Ethylacetat; wobei Clavulansäure unter den Extraktionsbedingungen vorzugsweise nicht oder nur in geringem Maß löslich sein sollte, z. B. je nach pH-Wert der Fermentationsbrühe.
Mischungen der einzelnen Lösungsmittel, z. B. wie oben beschrieben, können verwendet werden.
Das Verhältnis, z. B. das Volumenverhältnis von Lösungsmittel und Fermentationsbrühe ist nicht entscheidend; es kann beispielsweise ein Verhältnis von 0,5 : 1 bis 3 : 1 verwendet werden. Es können ein oder mehrere Extraktionen durchgeführt werden. Es kann eine Lösungsmittelmenge verwendet werden, die ausreicht, so dass zwei flüssige Phasen in Verbindung mit der Fermentationsbrühe entstehen.
Die Extraktion kann bei oder um einen negativen pH-Wert durchgeführt werden, z. B. bei einem pH-Wert von 5,5 bis 7,5.
Die Phasentrennung der wässrigen und der organischen Phase kann beispielsweise durch Zentrifugationsverfahren erleichtert werden, z. B. mit Hilfe einer Separatorzentrifuge oder einer Dekantierzentrifuge.
Verunreinigungen, wie Farbstoffe oder andere, z. B. Biomassenrückstände der Clavulansäure-haltigen Flüssigkeit können entfernt werden, entweder vor oder nach der Extraktion, z. B. auf übliche Weise, z. B. durch Adsorption, z. B. durch die Verwendung von pulverförmigem Aktivkohle, z. B. in einer Menge von etwa 0,5% bis 5% (bezogen auf das Gewicht der Clavulansäure-haltigen Flüssigkeit); oder durch die Verwendung von Aktivkohle in Granulatform, die, wenn man sie in eine Säule füllt, beispielsweise eine durchlaufende vorkonzentrierte Clavulansäure-haltige Flüssigkeit reinigen kann; oder durch die Verwendung eines Adsorptions- oder Ionenaustauscherharzes, das, beispielsweise geeignet ist, um Farbstoffe und andere Verunreinigungen selektiv aus Lösungsmitteln zu entfernen, z. B. durch die Verwendung solcher Harze in einem Chargenverfahren oder in Säulenfiltrationsverfahren; oder zum Beispiel durch andere Verfahren, wie ein Querstromverfahren, z. B. das Durchdringen von Clavulansäure-haltiger Flüssigkeit, beispielsweise durch eine Membran mit beispielsweise geringer Porengröße, wie einer Porengröße von beispielsweise 1 bis 3 kD.
Schritt c) kann mittels der Extraktion aus einer wässrigen Lösung von Clavulansäure durchgeführt werden, beispielsweise durch Anpassen des pH-Werts einer Fermentationsbrühe auf einen pH-Wert von etwa 1,5 bis 2,5, wie 1,5 bis 2,5, bei dem Clavulansäure in freier saurer Form vorliegt; nach der erfindungsgemäßen Extraktion; und Extraktion der pH-eingestellten, z. B. angesäuerten Fermentationsbrühe mit einem Lösungsmittel, in dem Clavulansäure unter den Extraktionsbedingungen löslich ist, und welche fähig ist, mit einer wässrigen Fermentationsbrühe ein Flüssigkeits/Flüssigphasen-System zu bilden, ausgewählt aus der Gruppe aus einem Ester, einem Keton, einem Alkohol und einem Gemisch davon, z. B. durch Die direkte Extraktion aus einer beispielsweise angesäuerten Fermentationsbrühe oder nach Entfernen wenigstens einen Teils der in der beispielsweise angesäuerten Fermentationsbrühe suspendierten Feststoffe, z. B. gemäß einem üblichen Extraktionsverfahren, beispielsweise wie oben beschrieben. Feststoffe können beispielsweise durch Ausflockung, Filtration, beispielsweise durch Mikrofiltration, oder durch Zentrifugation entfernt werden.
Ein Wasser-mischbares Lösungsmittel kann zu einer Fermentationsbrühe zugegeben werden, um die Filtrierbarkeit der Fermentationsbrühe vor der Entfernung der Feststoffe zu verbessern.
Ein Extraktionslösungsmittel, ausgewählt aus der Gruppe aus einem Ester, einem Keton, einem Alkohol und einem Gemisch davon, umfasst ein Lösungsmittel, in dem Clavulansäure unter den Extraktionsbedingungen löslich ist, z. B. Ketone, wie Methylisobutylketon, Diethylketon; Ester, wie Ethylacetat, Propyl- oder Butylacetat oder Alkohole, wie Butanol, beispielsweise n-Butanol oder Isobutanol, vorzugsweise Ethylacetat. Mischungen der einzelnen Lösungsmittel, beispielsweise wie oben beschrieben, können verwendet werden. Vorzugsweise wird das gleiche Lösungsmittel, das in Schritt b) für die Extraktion der Fermentationsbrühe vor der Isolierung von Clavulansäure verwendet wurde (z. B. bei oder um einen negativen pH-Wert von 5,5 bis 7,5) verwendet. Es sollte eine ausreichende Menge des Lösungsmittels verwendet werden, so dass zwei flüssige Phasen in Verbindung mit der Fermentationsbrühe gebildet werden. Pro Anteil Fermentationsbrühe sollten beispielsweise 1 : 1 bis 5 : 1 Teile Lösungsmittel verwendet werden.
Es können ein oder mehrere Extraktionen der beispielsweise angesäuerten Fermentationsbrühe durchgeführt werden.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein wie oben definiertes Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass als Lösungsmittel für die Extraktion von Clavulansäure aus einer wässrigen Lösung davon das gleiche Lösungsmittel wie in Schritt b) für die Extraktion der Ferinentationsbrühe, bevor man daraus Clavulansäure isoliert, verwendet wird.
Eine wässrige, Clavulansäure-haltige Flüssigkeit kann praktischerweise vor dem Ansäuern und dem Extrahieren von Clavulansäure vorkonzentriert werden, um einen spezifischen Konzentrationsbereich von Clavulansäure zu erlangen, und zwar durch ein übliches Verfahren, wie durch Feinvakuumverdampfung; oder ein Osmoseverfahren, wie Querstrom-Umkehrosmose, Querstrom-Nanofiltration, Anionenaustausch, so dass man eine Konzentration von beispielsweise 20 g bis 80 g Clavulansäure pro kg im Konzentrat erlang, wie 10 bis 50 g/kg, beispielsweise 10 bis 40 g/kg, z. B. 10 bis 30 g/kg.
Das Waschen des Clavulansäure-haltigen Lösungsmittels mit Wasser oder einem geeigneten Puffer kann beispielsweise nach der Extraktion der wässrigen, Clavulansäurehaltigen Flüssigkeit erfolgen. Die Menge Wasser oder Puffer ist nicht entscheidend; z. B. werden praktischerweise 5% bis 100% v/v, wie 5% bis 30% v/v Wasser oder Puffer in Bezug auf das organische Extrakt verwendet.
Die Phasentrennung von wässriger und organischer Phase kann beispielsweise durch Zentrifugationsverfahren erleichtert werden, z. B. mit einer Separatorzentrifuge oder einer Dekantierzentrifuge.
Die Lösung aus Clavulansäure in einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise erhältlich durch Extraktion, kann zur weiteren Reinigung beispielsweise in Wasser rückextrahiert werden.
Die Lösung von Clavulansäure in einem beispielsweise organischen Lösungsmittel kann getrocknet werden, so dass man vor der weiteren Verarbeitung einen spezifischen Wassergehalt erlangt und/oder kann aufkonzentriert werden, beispielsweise wie üblich, zum Beispiel durch Eindampfen, zum Beispiel durch ein heteroazeotrophes Destillationsverfahren oder beispielsweise durch Lösungsmittel-resistente Membranen (z. B. SELRO(R)^® oder CARBOSEP(R)^® mittels Nanofiltration oder Umkehrosmose, so dass man eine gewünschte Clavulansäurekonzentration erlangt, z. B. eine Konzentration von etwa 20 g bis 80 g, z. B. 10 g bis 40 g Clavulansäure pro kg in dem beispielsweise organischen Lösungsmittels, z. B. vor dem Reinigungsschritt d), der nachstehend beschrieben ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein wie oben definiertes Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass ein Clavulansäure-haltiges Lösungsmittel vor dem Reinigungsschritt d) aufkonzentriert wird.
Das Entfernen von Farbstoffen oder anderen Verunreinigungen, z. B. Biomasserückständen, aus der Clavulansäure-haltigen Flüssigkeit, z. B. einem organischen Lösungsmittel, kann beispielsweise wie üblich, z. B. gemäß einem oben beschriebenen Verfahren durchgeführt werden.
Isolierungsverfahren mit geeigneten Bedingungen sind ausführlicher aus zahlreichen Publikationen bekannt, z. B. aus der EP 387 178 ; der WO93/25557; der WO95/11295; der WO95/34194; der WO96/28452; der WO96/22296. Der Inhalt der unter Schritt a) und Schritt c) und den nachstehenden Schritten d) und e) zitierten Referenzen sowie darin enthaltenen Zitaten aus dem Stand der Technik sind hier durch die Bezugnahme enthalten.
Der Reinigungsschritt d) kann beispielsweise durch Chromatographie oder mittels Salzbildung, beispielsweise durch die Bildung eines Salzes von Clavulansäure, das aus dem verwendeten Lösungsmittel präzipitiert, beispielsweise kristallisieren kann, durchgeführt werden. Ein solches Salz kann beispielsweise das Natriumsalz oder das Lithiumsalz von Clavulansäure, z. B. wie beschrieben in der GB 1543563 oder der GB 1508977, oder ein Aminsalz sein. Erfolgt die Reinigung über ein Salz, z. B. durch Bilden eines Aminsalzes, kann ein weiteres Lösungsmittel für Clavulansäure, wie z. B. Aceton, Methylisobutylketon oder Diethylketon, vorzugsweise Aceton, zu der Clavulansäurehaltigen, beispielsweise vorkonzentrierten Flüssigkeit zugegeben werden, beispielsweise in einer Menge von 0 bis 200%, bezogen auf das Gewicht der Clavulansäure-haltigen, z. B. vorkonzentrierten Flüssigkeit. Geeignete Amine, die mit Clavulansäure ein Salz bilden, sind in zahlreichen Publikationen beschrieben, wie tert-Butylamin in der EP 26 044 ; N,N-(Di)Alkyl-alkylendiamine, wie Diisopropyl-ethylendiamin in der EP 562 583 ; N,N,N',N'-Tetramethyl-ethylendiamin in der EP 719 778 ; tert-Octylamin, beispielsweise in der GB 2264944 oder der EP 594 099 ; oder beispielsweise eine Klasse Amine in der WO 93/25557, in der Amine der Formel
beschrieben sind, worin R₁, R₂ und R₃ gemäß folgenden Möglichkeiten ausgewählt sind: da) R₁ ist gegebenenfalls eine substituierte cyclische Gruppe der allgemeinen Formel R-(CHR₄)_m- worin
m für 0 oder eine ganze Zahl 1 bis 5 steht;
R ein gegebenenfalls substituiertes aliphatisches Kohlenwasserstoff-Ringsystem mit
3 bis 8 Ring-Kohlenstoffatomen ist;
R₄ Wasserstoff oder Alkyl, Amino- oder Hydroxy-substituiertes Alkyl; oder mit einer substituierten Aminogruppe substituiertes Alkyl; oder eine Gruppe der gleichen allgemeinen obigen Formel R₁ ist;
R₂ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus den gleichen Gruppen, aus denen R₁ ausgewählt ist; oder aus Wasserstoff; Alkyl; Alkenyl; Amino- oder Hydroxy-substituiertem Alkyl oder Alkenyl; oder mit einer substituierten Aminogruppe substituiertem Alkyl oder Alkenyl; oder
db) R₁, R₂ und R₃ gleich oder verschieden sind und unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff; Alkyl; Alkenyl; Amino- oder Hydroxy- oder Alkoxysubstituiertem Alkyl oder Alkenyl; oder mit einer substituierten Aminogruppe substituiertem Alkyl oder Alkenyl; oder
dc) R₁ eine gegebenenfalls substituiertes Arylgruppe der allgemeinen Formel
ist, worin
R₄ Wasserstoff ist oder für ein oder mehrere Substituenten steht, und m für 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 steht;
R₂ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff; Alkyl; Amino- oder Hydroxy-substituiertem Alkyl; oder mit einer substituierten Aminogruppe substituiertem Alkyl; oder Gruppen der gleichen allgemeinen Formel, aus der R₁ ausgewählt ist; oder
dd) R₁ und R₂ und gegebenenfalls R₃ zusammen mit dem gezeigten Stickstoffatom eine Gruppe eines gegebenenfalls substituierten heterocyclischen Ringsystems sind, das das Stickstoffatom als Ringmitglied enthält und gegebenenfalls ein oder mehrere weitere Heteroatome im Ring aufweist; und, falls R₃ nicht Teil des Ringsystems ist, R₃ unabhängig ausgewählt ist aus Wasserstoff, Alkyl, Amino- oder Hydroxysubstituiertem Alkyl oder mit einer substituierten Aminogruppe substituiertem Alkyl; oder
de) R₁ eine Gruppe der allgemeinen Formel
ist, worin
R₄ und R₅ unabhängig voneinander Wasserstoff sind; Alkyl; Amino-substituiertes Alkyl; oder mit einer substituierten Aminogruppe substituiertes Alkyl sind; und
R₂ und R₃ unabhängig voneinander ausgewählt sind aus Wasserstoff; Alkyl, Amino- oder Hydroxy-substituiertes Alkyl; oder mit einer substituierten Aminogruppe substituiertes Alkyl; und
m für 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 5 steht; oder
df) eines oder beide aus R₁ oder R₂ für Wasserstoff stehen und R₃ für eine Gruppe einer Aminosäure steht, in der die Carboxylatgruppe der Aminosäure verestert oder in Form eines Amins sein kann.
Das Amin kann beispielsweise weiter wie in der WO94/22873 beschrieben sein, z. B. ein Amin der Formel
worin
R₆ und R₇ jeweils für C_1-8-Alkyl; C_3-8-Cycloalkyl; oder C_3-8-Cycloalkyl-C_1-8-Alkyl stehen; gegebenenfalls durch ein oder mehrere inerte Substituenten substituiert; oder miteinander zu einem Ring mit 4 bis 7 Ringatomen verknüpft sind,
R₈ und R₉ jeweils für C_1-8-Alkyl; C_3-8-Cycloalkyl; oder C_3-8-Cycloalkyl-C_1-8-Alkyl stehen; gegebenenfalls durch ein oder mehrere inerte Substituenten substituiert; oder miteinander zu einem Ring mit 4 bis 7 Ringatomen verknüpft sind,
X für Wasserstoff oder eine Wasserstoffbrücken-bildende Gruppe steht, und
m' und n' unabhängig für eine ganze Zahl von 0 bis 5 stehen.
Besonders erwähnt seien die Amine N,N,N',N'-Tetramethyl-1,2-diaminoethan und 1,3-Bis(dimethylamino)-2-propanol.
Das Amin kann ferner beispielsweise wie in der WO96/20199 sein, wie ein Amin der
worin R₁₀ für eine Alkylengruppe, gegebenenfalls durch ein oder mehrere inerte Substituenten substituiert, steht; und
R₁₁ und R₁₂ unabhängig voneinander für Wasserstoff oder Alkyl stehen, gegebenenfalls durch ein oder mehrere inerte Substituenten substituiert; oder
R₁₁ und R₁₂ zusammen mit dem Stickstoffatom einen heterocyclischen Ring mit 4 bis 7 Kohlenstoffatomen bilden, gegebenenfalls durch ein oder mehrere inerte Substituenten substituiert,
insbesondere Bis(2-dimethylaminoethyl)ether.
Das Amin kann ferner beispielsweise wie in der EP 729 961 beschrieben sein, wie ein Amin der Formel
worin
R₁₃ und R₁₄ unabhängig voneinander für ein Wasserstoffatom oder einen pharmazeutisch annehmbaren Substituenten stehen.
Das Amin kann ferner beispielsweise wie in der WO94/21647 sein, wie ein Amin der Formel
worin
R₁₅, R₁₆, R₁₇ und R₁₈ für ein Wasserstoffatom; eine gerade oder verzweigte C_1-8-Alkylgruppe; eine Aralkylgruppe, worin die Alkylgruppe eine Methyl- oder Ethylgruppe und die Arylgruppe eine Phenylgruppe ist, die gegebenenfalls durch eine N-Alkyl- oder N,N-dialkylgruppe substituiert ist, worin die Alkylgruppen C_1-4-Alkyl sind; stehen, oder R₁₅ R₁₆, R₁₇ und R₁₈ gemeinsam unabhängig für einen cyclischen Alkylenring mit 3 bis 6 Methylengruppen stehen, wobei eine dieser Gruppen gegebenenfalls durch ein Sauerstoff- oder ein Schwefelatom oder eine Aminogruppe substituiert ist; und
R₁₉ für ein Wasserstoffatom oder eine Methylgruppe steht; und
p für eine ganze Zahl von 1 bis 3 steht.
Besonders geeignete Amine sind beispielsweise tert-Butylamin, tert-Octylamin, Diisopropyl-ethylendiamin, N,N,N',N'-Tetramethyl-ethylendiamin, 1,3-Bis(dimethylamino)-2-propanol und Bis(2-dimethylaminoethyl)ether, wie tert-Butylamin, tert-Octylamin, Diisopropyl-ethylendiamin, N,N,N',N'-Tetramethyl-ethylendiamin und Bis(2-dimethylaminoethyl)ether, beispielsweise tert-Butylamin, tert-Octylamin.
Ein weiterer erfindungsgemäßer Aspekt betrifft ein wie oben definiertes Verfahren, dadurch gekennzeichnet, dass die Reinigung von Clavulansäure über ein Salz von Clavulansäure mit tert-Butylamin, tert-Octylamin, Diisopropyl-ethylendiamin, N,N,N',N'-Tetramethyl-ethylendiamin, 1,3-Bis(dimethylamino)-2-propanol oder Bis(2-dimethylaminoethyl)ether erfolgt.
Die Reinigung unter geeigneten Bedingungen ist ausführlicher aus zahlreichen Veröffentlichungen bekannt, beispielsweise aus unter Schritt a), c) und d) sowie unter nachstehendem Schritt e) zitierten Referenzen, deren Inhalt, einschließlich der darin enthaltenen Zitate, hier durch die Bezugnahme enthalten ist.
Für die Salzbildung kann das Amin mit der Clavulansäure in Lösung, in einem organischen Lösungsmittel oder einem Lösungsmittelsystem zusammengebracht werden. Praktischerweise sollte das gleiche Lösungsmittel wie für die Extraktion der Clavulansäure aus der wässrigen Phase verwendet werden, beispielsweise wie für die gegebenenfalls extrahierte und gegebenenfalls vorbehandelte Fermentationsbrühe, z. B. Ethylacetat.
Bevor man die Clavulansäure-haltige organische Lösung mit einem Amin zusammenbringt, sollte die Lösung vorkonzentriert werden, z. B. wie oben beschrieben.
Das Zusammenbringen der Clavulansäure mit dem Amin kann durch jedes geeignete Verfahren durchgeführt werden, beispielsweise kann das Amin zu einer Lösung aus Clavulansäure in einem organischen Lösungsmittel, beispielsweise durch die einfache Zugabe zu der Lösung aus Clavulansäure in einem Lösungsmittel, oder beispielsweise durch Einmischen eines Amins in einen Strom einer Lösung aus Clavulansäure in einem Lösungsmittel, zugegeben werden.
Das gewünschte Salz von Clavulansäure mit einem Amin kann aus dem organischen Lösungsmittel wie üblich isoliert werden, beispielsweise durch Filtration oder Zentrifugation, z. B. wenn das Salz einen Feststoff bildet, beispielsweise wenn das Salz kristallisiert.
Ein weiteres Lösungsmittel kann zu dem Gemisch zugegeben werden, z. B. einem Gemisch, das Clavulansäure, ein Lösungsmittel und ein Amin enthält, beispielsweise vor, während oder nach der Zugabe des Amins zu einem Gemisch aus Clavulansäure und einem Lösungsmittel, was zur Präzipitation des Aminsalzes von Clavulansäure führt. Das Aminsalz von Clavulansäure kann in Form eines Solvats, beispielsweise des Acetonsolvats, gewonnen werden. Das Aminsalz von Clavulansäure kann umkristallisiert werden. Ist das Lösungsmittel ganz oder teilweise unmischbar mit Wasser, kann das Aminsalz von Clavulansäure auch in Wasser extrahiert werden, so dass eine wässrige Lösung des Salzes entsteht, die sehr konzentriert sein kann, wie beispielsweise beschrieben in der WO95/21173. Bedingungen, wie Reaktionsbedingungen, spezifische Reaktionsbedingungen, Reagenzien, Mengenbereiche der Reagenzien, Konzentrationsbereiche, Temperaturen usw. für die Reinigung und/oder Isolierung eines Clavulansäureslazes, beispielsweise eines Aminsalzes, sind beispielsweise aus den unter den Punkten a), e) und c) und nachstehendem Punkt d) zitierten Referenzen bekannt, deren Inhalt, einschließlich der darin enthaltenen Zitate, hier durch die Bezugnahme enthalten ist.
Umwandlungsschritt e) kann nach bekannten Verfahren durchgeführt werden.
In einem Verfahren gemäß Schritt e) kann Clavulansäure als solche umgewandelt werden; oder in Form eines labilen Derivats davon, beispielsweise eines Salzes davon, zum Beispiel eines Lithiumsalzes oder eines Natriumsalzes davon; oder in Form eines Aminsalzes davon.
Ein pharmazeutisch annehmbares Salz von Clavulansäure kann beispielsweise ein Salz von Clavulansäure mit pharmazeutisch annehmbaren Alkali- oder Erdalkalimetallen, vorzugsweise ein Kaliumsalz, sein. Allgemein kann Clavulansäure oder ein Salz davon, beispielsweise ein Aminsalz davon, praktischerweise in Lösung, mit einer Kationenquelle zusammengebracht werden, die fähig ist, ein pharmazeutisch annehmbares Clavulansäuresalz zu bilden. Geeignete Kationenquellen sind beispielsweise in oben zitierten Referenzen beschrieben. Eine bevorzugte Kationenquelle kann ein Alkali- oder Erdalkalisalz einer Carbonsäure sein, beispielsweise 2-Ethylhexansäure, beispielsweise das Kaliumsalz davon, und beispielsweise ein Acetat, gegebenenfalls in Kombination mit Essigsäure. In der WO97/18216, veröffentlicht am 22.05.1997, ist ein Verfahren zur Herstellung eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes von Clavulansäure durch die Umwandlung von Clavulansäure in ein pharmazeutisch annehmbares Clavulansäuresalz in n-Butanol oder Isobutanol (2-Methyl-l-propanol) als Lösungsmittel beschrieben.
Bedingungen, wie Reaktionsbedingungen, spezifische Reaktionsbedingungen, Reagenzien, Mengenbereiche der Reagenzien, Konzentrationsbereiche, Temperaturen usw. für die Reinigung und/oder Isolierung eines Clavulansäuresalzes, beispielsweise eines Aminsalzes, sind beispielsweise aus den unter den Punkten a), c), d) und e) zitierten Referenzen bekannt, deren Inhalt, einschließlich der darin enthaltenen Zitate, hier durch die Bezugnahme enthalten ist.
Gemäß einem Aspekt kann ein erfindungsgemäßes Verfahren beispielsweise wie folgt durchgeführt werden:
Eine Clavulansäure-haltige Fermentationsbrühe mit einem pH-Wert von 5,5 bis 7,5, beispielsweise durch die Fermentation mit einem Clavulansäure-produzierenden Mikroorganismus gewonnen, kann in einem Volumenverhältnis von einem Teil Fermentationsbrühe zu 0,5 bis 3,0 Teilen, vorzugsweise 1,0 bis 1,5 Teilen, eines Lösungsmittels extrahiert werden, welches aus der Gruppe aus einem Ester, einem Keton, einem Ether, einem Alkohol oder einem Gemisch davon ausgewählt ist und welches fähig ist, ein Flüssigkeits/Flüssigphasen-System mit einer wässrigen Fermentationsbrühe zu bilden. Geeignete Lösungsmittel umfassen beispielsweise Ether, Ketone, wie Methylisobutylketon, Methylethylketon, Diethylketon; Ester, wie Ethylacetat, Propylacetat; und Alkohole, wie n-Butanol oder i-Butanol. Mischungen der einzelnen Lösungsmittel, beispielsweise wie oben beschrieben, können verwendet werden. Ein Lösungsmittel, das anschließend zur Extraktion der Clavulansäure aus dem wässrigen, Clavulansäurehaltigen Gemisch, beispielsweise nach der Ansäuerung, verwendet werden kann, wie ein Keton, ein Ester und ein Alkohol, z. B. Ethylacetat, Methylisobutylketon oder Diethylketon, z. B. Ethylacetat, wird bevorzugt verwendet.
Das Clavulansäure-haltige Gemisch kann beispielsweise durch die Verwendung eines sauren Mittels, wie einer Säure, angepasst werden, so dass ein pH-Wert von 1,5 bis 2,5 erreicht wird, und das pH-angepasste Gemsich kann mit einem Lösungsmittel extrahiert werden, welches ein Flüssigkeits/Flüssigphasen-System mit dem Gemisch bildet und aus der Gruppe aus einem Keton, einem Ester und einem Alkohol ausgewählt ist. Die Extraktion kann auch gleichzeitig mit dem Ansäuern erfolgen.
Clavulansäure kann in die organische Phase extrahiert werden. Die organische Phase mit der Clavulansäure kann beispielsweise aufkonzentriert, gereinigt, z. B. durch die Verwendung von Aktivkohle, z. B. wie oben beschrieben, mit einem Colösungsmittel, z. B. aus der Gruppe aus Aceton, Methylisobutylketon oder Diethylketon, z. B. Aceton, gemischt werden, und ein Aminsalz von Clavulansäure kann präzipitiert werden. Das Aminsalz von Clavulansäure kann isoliert und in ein pharmazeutisch annehmbares Salz von Clavulansäure, z. B. das Kaliumsalz, z. B. wie oben beschrieben, umgewandelt werden.
Geeignete Verfahren für solche Schritte sind oben beschrieben und beispielsweise in den unter obigen Punkten a) bis e) zitierten Referenzen beschrieben, deren Inhalt, einschließlich der darin enthaltenen Zitate, hierin durch die Bezugnahme enthalten ist.
Gemäß einem weiteren Aspekt kann ein erfindungsgemäßes Verfahren wie folgt durchgeführt werden:
wenigstens einige der Feststoffe in einer Clavulansäure-haltigen Fermentationsbrühe, z. B. gewonnen durch die Fermentation mit einem Clavulansäure-produzierenden Mikroorganismus, können entfernt werden, z. B. durch Filtration, wie Anschwemmfiltration und Querstromfiltration. Das gewonnene Filtrat kann auf eine Konzentration von beispielsweise 10 g bis 40 g Clavulansäure pro kg aufkonzentriert werden und kann mit Aktivkohle, z. B. in Pulverform, in einer Menge von beispielsweise 0,5% bis 5% der Gesamtmasse behandelt werden. Ein wässriges Konzentrat der gewonnenen Clavulansäure kann bei einem pH-Wert von 5,5 bis 7,5 in einem Volumenverhältnis von einem Teil Fermentationsbrühe zu 0,5 bis 3,0 Teilen, vorzugsweise 1,0 bis 1,5 Teilen, mit einem organischen Lösungsmittel extrahiert werden, das fähig ist, mit dem Konzentrat ein Flüssigkeits/Flüssigphasen-System zu bilden, beispielsweise einem wie oben beschriebenen Extraktionslösungsmittel. Die weitere Verarbeitung des Clavulansäurehaltigen Konzentrats, um ein pharmazeutisch annehmbares Salz von Clavulansäure zu gewinnen, kann gemäß einem wie oben beschriebenen Verfahren erfolgen.
Geeignete Verfahren für solche Schritte sind oben beschrieben und beispielsweise beschrieben in den unter obigen Punkten a) bis e) zitierten Referenzen beschrieben, deren Inhalt, einschließlich der darin enthaltenen Zitate aus dem Stand der Technik hier durch die Bezugnahme enthalten sind.
Im allgemeinen kann die Filtration, Extraktion, das Entfernen von Verunreinigungen und das Aufkonzentrieren in jeder geeigneten Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens durchgeführt werden, z. B. nach einem Verfahren wie oben beschrieben oder einem Verfahren, auf das oben Bezug genommen wurde. Separator- oder Dekantierzentrifugen können für jede Phasentrennung in einem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden, z. B. insbesondere wenn das Verfahren in technischem Maßstab durchgeführt wird. Mehrstufige Gegenstromverfahren können verwendet werden. Geeignete Flockungsmittel oder Benetzungsmittel können zu dem Clavulansäure-haltigen Gemisch zugegeben werden, z. B. wie üblich, z. B. in einer Menge von 0,001 bis 1% w/w, falls gewünscht. Benetzungsmittel umfassen beispielsweise Armogard D-5411^®, Cetyltrimethylammoniumbromid, Dodigen^® und Demulso^®, und Flockungsmittel umfassen beispielsweise Bozefloc^®, Ferrocryl^® und Locron^®. Für die Querstromfiltration, z. B. zum Abtrennen von Biomasse aus der Fermentationsbrühe, gibt es eine Vielzahl gewerblicher Modulanordnungen, z. B. Platten-, Röhren- oder Spiralmodule; die Membranmaterialien können beispielsweise Polymere oder Keramikmaterialien sein. Die Trennfähigkeit der Membranen kann von etwa 10 bis 300 kD reichen oder von 0,005 bis 0,1 um (UF-Bereich) bis etwa 0,1 bis 2 um (MF-Bereich). Die Querstrompumpen sollten normalerweise eine Geschwindigkeit von 2 bis 7 m/s, vorzugsweise 4 bis 6 m/s haben.
Für das thermische Aufkonzentration einer beispielsweise wässrigen, Clavulansäurehaltigen Flüssigkeit können spezielle Vakuumverdampfer verwendet werden, z. B. solche, die bei sehr geringen Drücken und mit sehr kurzen Retentionszeiten arbeiten. Geeignete spezielle Vakuumverdampfer umfassen Dünnschichtverdampfer. Eine Alternative kann ein Membranverfahren, wie die Umkehrosmose oder Nanofiltration, sein. Geeignete Membranmaterialien umfassen beispielsweise Polymere und Keramiken und geeignete modulare Anordnungen, einschließlich beispielsweise Spiralen, Röhren, Platten, sind bekannt. Eine zusätzliche Reinigung von beispielsweise einem Konzentrat aus hochmolekularen Verbindungen, das z. B. durch Umkehrosmose oder Nanofiltration gewonnen wurde, kann z. B. wirksam durch enge Ultrafiltrationsmembranen erfolgen, die gewerblich erhältlich sind, z. B. als Spiralmoduli mit einer Trennfähigkeit von 1 bis 3 kD.
Verunreinigungen können in jeder Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens entfernt werden. Geeignete Verfahren zum Entfernen von Verunreinigungen sind oben beschrieben und sind beispielsweise in den unter obigen Punkten a) bis e) zitierten Referenzen beschrieben, deren Inhalt, einschließlich der darin enthaltenen Zitate aus dem Stand der Technik, hier durch die Bezugnahme enthalten ist.
Ein weiterer Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von Clavulansäure und seinen Alkalisalzen durch die Extraktion von Clavulansäure aus der durch mikrobielle Fermentation gewonnenen Kulturbrühe, die Reaktion mit einem Amin, so dass ein Aminsalz von Clavulansäure entsteht und die Reaktion zur Bildung von Clavulansäure-Alkalisalzen, dadurch gekennzeichnet, dass

a) die gesamte unfiltrierte, durch die Fermentation mit einem Clavulansäureproduzierenden Mikroorganismus gewonnene Fermentationsbrühe extrahiert wird, bei einem negativen pH-Wert (5,5 bis 7,5), mit einem Lösungsmittel, welches unmischbar mit Wasser ist und ausgewählt ist aus Ethern, Ketonen, Estern oder Alkoholen, so dass eine wässrige, Clavulansäure-haltige Fermentationsbrühe entsteht; oder
b) die durch die Fermentation mit einem Clavulansäure-produzierenden Mikroorganismus gewonnene Fermentationsbrühe durch Verwendung eines üblichen Filtrationsverfahrens filtriert wird; gegebenenfalls nach einer Vorbehandlung durch die Zugabe von Flockungsmitteln; das Kulturfiltrat aufkonzentriert und gegebenenfalls gereinigt wird und anschließend bei einem pH-Wert von 5,5 bis 7,5 mit einem Lösungsmittel extrahiert wird, das mit Wasser unmischbar ist und ausgewählt ist aus Ethern, Ketonen, Estern oder Alkoholen, so dass eine wässrige, Clavulansäure-haltige Fermentationsbrühe entsteht,

Ein Lösungsmittel, das mit Wasser unmischbar ist, wird hierin als ein Lösungsmittel betrachtet, das fähig ist, mit einem wässrigen Gemisch ein Flüssigkeits/Flüssigphasen-System, z. B. eine wässrige Fermentationsbrühe, zu bilden.
Aufgrund seiner hemmenden Wirkung auf β-Lactamasen ist Clavulansäure, eine Verbindung der Formel I, d. h. (2R,SR,Z)-3-(2-Hydroxyethyliden)-7-oxo-4-oxa-1-aza-bicyclo-[3,2,0]-heptan-2-carbonsäure, z. B. in Form eines Salzes, z. B. in Form eines Kaliumsalzes, geeignet als Additiv für β-Lactam-Antibiotikaformulierungen, z. B. in Kombination mit Amoxicillin, z. B. in Form eines Trihydrats; und das erfindungsgemäße Verfahren eignet sich für die Bereitstellung von Clavulansäure. Die vorliegende Erfindung kann als Alternative für andere gewerblich geeignete Verfahren zur Herstellung von Clavulansäure und/oder pharmazeutisch annehmbaren Salzen davon betrachtet werden. Sie kann als eine nicht-naheliegende Verbesserung für im Stand der Technik beschriebene Verfahren gesehen werden, einschließlich Verfahren der oben unter den Punkten a) bis e) zitierten Referenzen.
Die nachstehenden Beispiele beschreiben die Erfindung, ohne sie zu beschränken. Alle Temperaturen sind in Grad Celsius angegeben.
Beispiel 1
105 kg einer Clavulansäure-haltigen Fermentationsbrühe wurden mittels Querstrom-Ultra/Diafiltration behandelt, um die Biomasse zu entfernen. 200 kg eines Permeats wurden gewonnen, welches mittels Umkehrosmose und unter Kühlen aufkonzentriert wurde, so dass man einen Clavulansäuregehalt von etwa 15 g/kg erhielt. 34 kg des gewonnenen Konzentrats wurden bei neutralem pH-Wert unter Kühlen mit der dreifachen Menge Ethylacetat extrahiert. Das gewonnene extrahierte Konzentrat wurde unter Kühlen in mehreren Stufen mit Ethylacetat bei einem pH-Wert von 2 extrahiert. Die Extraktion lieferte eine Clavulansäureausbeute von 80%, bestimmt mittels HPLC. Das Clavulansäure-haltige Extrakt wurde durch Eindampfen im Vakuum aufkonzentriert, so dass man ein Konzentrat mit etwa 8 g Clavulansäure pro kg erhielt, und das erhaltene Konzentrat wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet. Aktivkohle wurde zu dem Gemisch aus Clavulansäure, Ethylacetat und Natriumsulfat zugegeben und das gewonnene Gemisch wurde klar filtriert. Das Filtrat wurde eingedampft, so dass ein Konzentrat mit etwa 30 g Clavulansäure pro kg entstand, und das Konzentrat wurde mit Aceton in einem Verhältnis von etwa 1 : 1 verdünnt. Eine 15%-ige Lösung tert-Butylamin in Aceton wurde bei etwa 20° zugegeben, bis ein pH-Wert von ca. 6,1 erreicht war. Die Kristallisation erfolgte und das Präzipitat wurde isoliert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Ein Acetonsolvat eines tert-Butylaminsalzes von Clavulansäure wurde gewonnen. Gehalt Clavulansäure-tert-Butylamin-Salz (HPLC): 95% auf Lösungsmittel-freier Basis.
Beispiel 2
900 kg einer Clavulansäure-haltigen Fermentationsbrühe (pH 7,0) wurden durch Querstrom-Ultrafiltration filtriert. Entionisiertes Wasser wurde zugegeben und das Gemisch wurde diafiltriert. 2700 kg eines Clavulansäure-haltigen Filtrats wurden gewonnen. 1200 kg des gewonnenen Filtrats wurden durch Umkehrosmose/Nanofiltraton bei 4° aufkonzentriert, so dass ein Konzentrat mit 9 g Clavulansäure pro kg entstand. Das Konzentrat wurde über eine Membran (2 bis 3 kD) ultrafiltriert. 62 kg des gewonnenen Permeats wurden bei neutralem pH-Wert mit der dreifachen Menge Ethylacetat extrahiert. Die wässrige Lösung wurde kontinuierlich mit der vierfachen Menge Ethylacetat unter Kühlen extrahiert, bei einem pH-Wert von 2,0, wobei ein zweistufiger Gegenstromextraktionsapparat (2 Separatorzentrifugen) verwendet wurde. 320 kg Ethylacetat wurden durch Eindampfen in einem Rührwerkskessel-Verdampfer eingedampft, so dass ein Konzentrat mit etwa 80 g Clavulansäure pro kg entstand. 1,9 kg des gewonnenen Konzentrats wurden mit der 0,3-fachen Menge Aktivkohle behandelt, bezogen auf die Clavulansäuremenge, und das Gemisch wurde klar filtriert. Der Kohlenstoff wurde mit Ethylacetat gewaschen, bis die Konzentration im Filtrat 30 g Clavulansäure pro kg betrug. Die gleiche Menge Aceton wurde zu dem Filtrat zugegeben. 1,2 Äquivalente einer 25%-igen Lösung ten-Octylamin in Aceton wurden bei 20° zugegeben und der pH-Wert auf 6,3 eingestellt. Nach dem Abkühlen auf 4° wurde ein ten-Octylaminsalz von Clavulansäure in kristalliner Form gewonnen, isoliert, mit Aceton gewaschen und getrocknet. Gehalt Clavulansäure-ten-Octylaminsalz (HPLC): 98% (absolut trocken).
Beispiel 3
1000 kg einer Clavulansäure-haltigen Fermentationsbrühe (pH 7,0) wurden filtrien, wobei man durch die Verwendung einer Querstrom-Ultrafiltration 750 kg eines Clavulansäure-haltigen Konzentrats erhielt. Das gewonnene Konzentrat wurde in Gegenwart von 2200 kg entionisienem Wasser diafiltriert. Etwa 1000 kg des gewonnenen Konzentrats wurden mittels Nanofiltration aufkonzentrien, so dass man ein Konzentrat mit 6 bis 10 g Clavulansäure pro kg erhielt. Etwa 140 g des gewonnenen Konzentrats wurden mit 340 kg Ethylacetat bei etwa neutralem pH-Wert extrahien. Das extrahiene Konzentrat wurde fortlaufend mit 700 kg Ethylacetat unter Kühlen bei einem pH-Wert von 2,0 mit Hilfe eines zweistufigen Gegenstromextraktionsapparats extrahien. Das Ethylacetatextrakt wurde im Vakuum eingedampft, wobei ein Konzentrat mit 37 g Clavulansäure pro kg entstand. Das gewonnene Konzentrat wurde mit der 0,5-fachen Menge Aktivkohle (Norite CG1^®, bezogen auf die Clavulansäuremenge, behandelt, und das gewonnene Gemisch wurde klar filtrien. Das gewonnene Filtrat wurde mit Aceton (etwa 1 : 1, v/v) verdünnt. Eine 25%-ige Lösung ten-Octylamin in Aceton wurde langsam bei 20° zugegeben, bis der pH-Wert 6,0 erreichte. Etwa 1,1 Äquivalente ten-Octylamin in Bezug auf die Clavulansäure wurden verwendet. Das Gemisch wurde auf 4° abgekühlt. Das ten-Octylaminsalz von Clavulansäure kristallisiene, wurde isoliert und getrocknet. Das ten-Octylaminsalz von Clavulanat wurde in einer Ausbeute von 65% und einer Reinheit von 98% (absolut trocken) gewonnen, was mittels HPLC bestimmt wurde.
Beispiel 4
Eine Clavulansäure-haltige Fermentationsbrühe wurde mit Hilfe einer Querstrom-Ultrafiltrationsvorrichtung filtriert und die Biomasse entfernt. Das Filtrat wurde durch Verwenden von Umkehrosmose aufkonzentrien, wobei ein Konzentrat mit einem Clavulansäuregehalt von etwa 10 g/l entstand. 500 ml des gewonnenen Konzentrats wurden mit 500 ml Ethylacetat bei einem pH-Wert von 5,5 behandelt und das Gemisch wurde etwa 10 Minuten gerührt. Das Gemisch wurde filtrien und die Phasen wurden getrennt. Die wässrige Phase wurde mit 500 ml Ethylacetat behandelt und es wurden 20% wässrige Schwefelsäure unter Rühren bei 5° zugegeben, bis ein pH-Wert von 2,0 erreicht war. Die Phasen wurden durch Zentrifugation getrennt und die wässrige Phase wurde wieder mit Ethylacetat extrahiert. Die gewonnenen Ethylacetatphasen wurden vereint und durch Eindampfen auf ein Volumen von etwa 150 ml aufkonzentriert. Aktivkohle wurde zugegeben, die gewonnene Suspension wurde gerührt und die Aktivkohle wurde abfiltriert. 120 ml Aceton wurden zu dem Filtrat zugegeben. 1,1 Äquivalente tert-Octylamin in Bezug auf Clavulansäure (HPLC-Bestimmung) wurden tropfenweise zu dem Gemisch zugegeben. Es bildete sich ein Präzipitat, das Gemisch wurde gerührt und das Präzipitat abfiltriert, mit Aceton gewaschen und im Vakuum getrocknet. Ein tert-Octylaminsalz von Clavulansäure wurde gewonnen. Gehalt Clavulansäure-tert-Octylaminsalz (HPLC): 98,4% (bezogen auf die trockene Verbindung).
Vergleichsbeispiel
Eine wie in Beispiel 4 beschrieben gewonnene filtrierte, konzentrierte Fermentationsflüssigkeit mit einem Clavulansäuregehalt von ca. 10 g/l wurde mit 500 ml Ethylacetat behandelt und 20%-ige wässrige Schwefelsäure wurde unter Rühren bei 5° zugegeben, bis ein pH-Wert von 2,0 erreicht war. Die weitere Behandlung des gewonnenen Gemischs erfolgte wie in Beispiel 4 für das nach der Zugabe von Schwefelsäure gewonnene Gemisch beschrieben. Ein tert-Octylaminsalz von Clavulansäure wurde gewonnen. Gehalt Clavulansäure-tert-Octylaminsalz (HPLC): 95,2% (bezogen auf die trockene Verbindung).
Beispiel 5
720 kg einer Clavulansäure-haltigen Fermentationsbrühe wurden bei neutralem pH-Wert (6,8) mit 500 1 Ethylacetat extrahiert. Die wässrige Phase wurde auf 4° abgekühlt und der pH-Wert mit Hilfe von Schwefelsäure auf 2 eingestellt. Die angesäuerte wässrige Phase wurde in mehreren Schritten mit Ethylacetat extrahiert. Die Ethylacetatphase wurde aufkonzentriert, so dass man ein Konzentrat mit etwa 40 g Clavulansäure pro kg erhielt. Das gewonnene Konzentrat wurde mit der etwa 1,0-fachen Menge Aktivkohle, bezogen auf die Clavulansäuremenge, behandelt und das Gemisch wurde filtriert. Das gewonnene Filtrat wurde mit Aceton (etwa 1 : 1 v/v) verdünnt und eine Lösung aus tert-Octylamin (25% in Aceton) wurde zugegeben, bis ein pH-Wert von etwa 6,0 erreicht war. Die gewonnene Suspension wurde abgekühlt und das präzipitierte Clavulansäure-tert-Octylaminsalz wurde isoliert und getrocknet.
Ausbeute des Clavulansäure-tert-Octylaminsalzes: 60%
Reinheit des Clavulansäure-tert-Octylaminsalzes: 99,1% (bezogen auf die trockene Verbindung, HPLC)
In jedem der obigen Beispiele kann das genannte Amin durch jedes Amin ersetzt werden, das oben als nützlich bei der Isolierung von Clavulansäure genannt ist. Gleichwertige Ergebnisse erhält man vorzugsweise durch die Verwendung von tert-Butylamin, tert-Octylamin, Diisopropyl-ethylendiamin, N,N,N',N'-Tetramethyl-ethylendiamin, 1,3-Bis(dimethylamino)-2-propanol und Bis(2-dimethylaminoethyl)ether, wie tert-Butylamin, tert-Octylamin, Diisopropyl-Ethylendiamin, N,N,N',N'-Tetramethyl-ethylendiamin und Bis(2-dimethylaminoethyl)ether.

Claims

Verfahren zur Herstellung von Clavulansäure und pharmazeutisch annehmbarer Salze davon, umfassend a) die Fermentation eines Mikroorganismus, der fähig ist, Clavulansäure zu erzeugen, so dass eine Clavulansäure-haltige Fermentationsbrühe entsteht, b) die Extraktion der Clavulansäure-haltigen Fermentationsbrühe mit einem organischen Lösungsmittel, das fähig ist, im Kontakt mit einer wässrigen Fermentationsbrühe ein Flüssigkeits/Flüssigphasen-System zu bilden, ausgewählt aus der Gruppe aus einem Ether, einem Keton, einem Ester, einem Alkohol und einem Gemisch davon, bei einem pH-Wert von 5,5 bis 7,5, so dass eine extrahierte, wässrige Fermentationsbrühe entsteht, wobei die Clavulansäure im wesentlichen in der wässrigen Fermentationsbrühe zurückbleibt, c) die Extraktion von Clavulansäure aus der extrahierten, wässrigen Fermentationsbrühe bei einem pH-Wert von 1,5 bis 2,5 mit einem Lösungsmittel, in dem Clavulansäure unter den Extraktionsbedingungen löslich ist und welches fähig ist, im Kontakt mit der wässrigen Fermentationsbrühe ein Flüssigkeits/Flüssigphasen-System zu bilden, und welches ausgewählt ist aus der Gruppe aus einem Ester, einem Keton, einem Alkohol und einem Gemisch davon, d) die Reinigung der in Schritt c) gewonnenen, extrahierten Clavulansäure oder eines Salzes davon und e) die Umwandlung der in Schritt d) gewonnenen, gereinigten Clavulansäure oder eines Salzes davon in ein pharmazeutisch annehmbares Clavulansäuresalz.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei wenigstens ein Teil der in der Clavulansäurehaltigen Fermentationsbrühe aus Schritt a) suspendierten Feststoffe vor der Extraktion entfernt werden.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Clavulansäure-haltige Fermentationsbrühe aus Schritt a) vor der Extraktion aufkonzentriert wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, worin die Extraktion von Clavulansäure aus Schritt c) mit Hilfe des gleichen Lösungsmittels durchgeführt wird, das für die Extraktion der Clavulansäure-haltigen Fermentationsbrühe aus Schritt b) verwendet wurde.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Clavulansäurelösung in dem zweiten Lösungsmittel vor dem Reinigungsschritt d) aufkonzentriert wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die Reinigung der isolierten Clavulansäure aus Schritt d) durch ein Salz von Clavulansäure mit tert-Butylamin, tert-Octylamin, Diisopropyl-ethylendiamin, N,N,N',N'-Tetramethyl-ethylendiamin, 1,3-Bis(dimethylamino)-2-propanol oder Bis(2-dimethylaminoethyl)ether durchgeführt wird.
Verfahren nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei das pharmazeutisch annehmbare Clavulansäuresalz das Kaliumsalz von Clavulansäure ist.
Verfahren zur Herstellung von Clavulansäure und seiner alkalischen Salze gemäß Anspruch 1, umfassend die Schritte A) Isolierung von Clavulansäure durch Extraktion einer Kulturnährlösung, die mittels mikrobieller Fermentation gewonnen wurde, B) Umsetzen der Clavulansäure mit einem Amin, so dass ein Aminsalz von Clavulansäure entsteht, und C) Umwandeln des Aminsalzes von Clavulansäure in ein Clavulansäurealkalisalz, dadurch gekennzeichnet, dass i) a) die durch Fermentation mit einem Clavulansäure-produzierenden Mikroorganismus gewonnene Kulturnährlösung bei einem nativen pH-Wert von 5,5 bis 7,5 mit einem Lösungsmittel extrahiert wird, das unmischbar mit Wasser ist und aus Ethern, Ketonen, Estern oder Alkoholen ausgewählt ist, so dass eine Clavulansäure-haltige wässrige Fermentationsbrühe bereitgestellt wird, oder b) die durch Fermentation mit einem Clavulansäure-produzierenden Mikroorganismus gewonnene Kulturnährlösung, gegebenenfalls nach einer Vorbehandlung durch Zugeben von Flockungsmitteln, durch bekannte Verfahren filtriert wird, so dass ein Filtrat entsteht, das Filtrat aufkonzentriert, gegebenenfalls gereinigt und anschließend bei einem pH-Wert von 5,5 bis 7,5 mit einem Lösungsmittel extrahiert wird, welches unmischbar mit Wasser ist und ausgewählt ist aus Ethern, Ketonen, Estern oder Alkoholen, so dass eine wässrige, Clavulansäurehaltige Fermentationsbrühe entsteht, ii) Clavulansäure aus der nach der Extraktion in Schritt i) gewonnenen wässrigen, Clavulansäure-haltigen Fermentationsbrühe in mehreren Stufen bei einem sauren pH-Wert von 1,5 bis 2,5 in ein Lösungsmittel extrahiert wird, welches mit Wasser unmischbar ist und ausgewählt ist aus Ketonen, Estern oder Alkoholen, und durch bekannte Verfahren in ein Aminsalz von Clavulansäure umgewandelt wird, und iii) das Aminsalz von Calvulansäure durch bekannte Verfahren in ein pharmazeutisch annehmbares Clavulansäuresalz umgewandelt wird.