DE69700903T2

DE69700903T2 - Verfahren zur Isolierung eines pharmazeutisch verträglichen Alkalimetallsalzes der Clavulansäure

Info

Publication number: DE69700903T2
Application number: DE69700903T
Authority: DE
Inventors: Jaoquim P. Cardoso
Original assignee: CIPAN COMP IND PROD; CIPAN Companhia Industrial Produtora de Antibioticos SA
Current assignee: CIPAN COMP IND PROD; CIPAN Companhia Industrial Produtora de Antibioticos SA
Priority date: 1997-03-24
Filing date: 1997-03-24
Publication date: 2000-07-06
Anticipated expiration: 2017-03-25
Also published as: PT867515E; EP0867515B1; AU7038998A; DK0867515T3; ATE187498T1; JP3474204B2; US6417352B1; ES2142641T3; ZA982437B; NZ337476A; DE69700903D1; GR3032882T3; JP2001521393A; EP0867515A1; AU740387B2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Isolierung eines pharmazeutisch verträglichen Alkalimetallsalzes der Clavulansäure aus einer Fermentationsnährlösung enthaltend unreine Clavulansäure umfassend die Schritte der Filtration der Fermentationsnährlösung, Extraktion der Clavulansäure in ein mit Wasser unvermischbares oder teilweise in Wasser unvermischbares Lösungsmittel bei einem pH-Wert von 1,2 bis 2, Ausfällung eines Alkalimetallsalzes A der Clavulansäure durch Zugabe einer Lösung eines Alkalimetallalkylalkanoats.
Clavulansäure und seine Alkalimetallsalze und Ester werden in der Arzneimittelherstellung verwendet, um die Inaktivierung von β-Lactamantibiotika zu verhindern. Kommerzielle Präparationen der Clavulansäure enthalten Kaliumclavulanat in Kombination mit Amoxycillintrihydrat. Clavulansäure ist ein unstabiles hygroskopisches Öl. Kaliumclavulanat ist stabiler als die freie Säure oder andere Salze und wird daher am häufigsten für kommerzielle Präparationen verwendet.
Clavulansäure und seine Derivate sind β-Lactamase-Hemmer. Die Resistenz gegen β-Lactamantibiotika ist mit der Inaktivierung der β-Lactamstruktur verbunden aufgrund der Öffnung des β-Lactamringes durch die β-Lactamase, die von Bakterien produziert wird. Daher werden die inaktivierenden Enzyme allgemein als β-Lactamasen bezeichnet, die in Penicillinase und Cephalosporinase weiter unterteilt werden.
Weiterhin wird angenommen, daß Clavulansäure selbst eine antibakterielle Aktivität besitzt.
Clavulansäure wird von verschiedenen Stämmen von Mikroorganismen durch einen Fermentationsprozeß produziert. Für dieses Verfahren werden beispielsweise Stämme, die zu der Gattung Streptomyces gehören, wie z. B. S. clavuligerus NRRL 3585 (USA Patent 4,110,165), S. jumonjinensis NRRL 5741 (Britisches Patent 1,563103), S. katsurahamanus IFO 13716 (Japanisches Patent 83,009579), und Streptomyces sp. P6621 FERM 2804 (Japanisches Patent 55,162,993). Für die Herstellung von Clavulansäure durch ein Fermentationsverfahren wird der Mikroorganismus Streptomyces clavuligerus bevorzugt.
Im Stand der Technik werden verschiedene Verfahren zur Herstellung und Reinigung der Clavulansäure enthaltenden Fermentationsnährlösung beschrieben.
Die GB 1 508 977 offenbart die Herstellung der Clavulansäure und ihrer Salze durch Filtration der Fermentationsnährlösung, indem diese über ein Anionenaustauscherharz geleitet wird.
Die GB 1 543 563 offenbart ein Fermentationsverfahren, wobei der pH-Wert des Mediums im Bereich von 6,3 bis 6,7 gehalten wird. Ein pharmazeutisch verträgliches Salz, solches wie Kaliumclavulanat wird mit einem Anionenaustauscherverfahren aus Lithiumclavulanat hergestellt. Lithiumclavulanat ist jedoch kein pharmazeutisch verträgliches Salz. Daher ist es notwendig, ein weiteres Ionenaustauscherverfahren als weiteren Schritt zur Herstellung einer pharmazeutisch verträglichen Form der Verbindung hinzuzufügen. Weiterhin ist das verbleibende Salz Lithiumchlorid in organischen Lösungsmitteln löslich und daher ist es schwierig, das Lithiumchlorid während des Extraktionsprozesses in die wäßrige Phase zu überführen.
Weitere Dokumente des Standes der Technik, wie die EP 0 647 229, beschreiben die Verwendung von Aminsalzen der Clavulansäure als Zwischenprodukte zur Herstellung und Reinigung der Clavulansäure und ihren Alkalimetallsalzen. Die EP 0 647 229 z. B. beschreibt ein Verfahren zur Herstellung einer aufgereinigten Clavulansäure oder eines Salzes oder eines Esters dieser Säure durch Herstellung eines Diaminsalzes der Clavulansäure und Umwandlung dieses Zwischenproduktes in Clavulansäure oder einem pharmazeutisch verträglichen Salz oder Ester. Die Umwandlung erfolgt durch Zugabe von z. B. Kalium-2-Ethylhexanoat und Ausfällung von Kaliumclavulanat. Viele solcher Amine sind entweder ungeeignet für die Herstellung eines Clavulansäuresalzes oder sie ergeben Aminsalze der Clavulansäure, die entweder hygroskopisch oder toxisch oder beides sind.
Daher sind sie zur Verwendung als Zwischenprodukte zur Herstellung einer pharmazeutisch akzeptablen Verbindung ungeeignet.
Andere Reinigungsverfahren des Standes der Technik werden ohne Aminverbindungen durchgeführt. So beschreibt z. B. die WO 95/34194 A2 ein Verfahren zur Herstellung eines Alkalimetallsalzes der Clavulansäure, wobei unreine Clavulansäure in wäßriger Lösung mit einem Lösungsmittelgemisch aus Ketonen und Alkylacetat unter sauren Bedingungen extrahiert wird. Die Lösung wird dann in einer herkömmlichen Weise behandelt und die Lösung eines Alkalimetallsalzes einer Alkansäure wird hinzugefügt, die in einem Keton oder einem alkanolischen Lösungsmittel gelöst ist, um ein reines Alkalimetallsalz der Clavulansäure zu erhalten. Daher läßt das Verfahren gemäß diesem Stand der Technik den Schritt der Bildung von Aminsalzen aus. Dieses Verfahren hat den Vorteil, daß die Verwendung von meist giftigen Aminen nicht länger notwendig ist. In einer bevorzugten Ausführungsform werden als Alkalimetallsalz der Alkansäure Natrium- oder Kaliumsalze verwendet, insbesondere Kalium-2-Ethylhexanoat.
Ein ähnliches Verfahren wird auch in der WO 96/28452 A1 beschrieben. Dieses Verfahren umfaßt die Schritte der Entfernung von Feststoffen einer Clavulansäure enthaltenden Fermentationsnährlösung durch Mikrofiltration, Ansäuerung des Filtrates bis zu einem pH-Wert zwischen 1 und 3, Extraktion des angesäuerten Filtrates mit einem in Wasser unvermischbaren Lösungsmittel und Trennung des Clavulansäure enthaltenden Extraktes. Dieser Extrakt wird mit einem Metalldonor und mit mindestens einem zusätzlichen Lösungsmittel gemischt. Von dieser Lösung wird das Metallclavulanatsalz abgetrennt.
Als Metalldonorverbindungen können organische Salze, Carbonate, Bicarbonate oder Hydroxide von Kalium, Natrium, Lithium oder Magnesium verwendet werden. Die Verwendung von Carbonsäuresalzen wird bevorzugt. Weiterhin werden Metalldonoren einschließlich Kalium-2-Ethylhexanoat. Kaliumacetat, Lithium-2- Ethylhexanoat und Lithiumacetat bevorzugt.
Die EP 0 182 522 B1 beschreibt auch ein Verfahren zur Herstellung der Clavulansäure und ihren Salzen und ihrer Ester. In diesem Verfahren wird die Fermentationsnährlösung wie folgt aufgearbeitet. Die Feststoffe werden durch Filtration oder Zentrifugation entfernt. Die Nährlösung wird auf einen pH-Wert von 1 bis 3 angesäuert und Clavulansäure wird durch Zugabe eines in Wasser unlöslichen Lösungsmittels extrahiert, wobei zwei Phasen beispielsweise durch Zentrifugation getrennt werden. Dabei wird die Clavulansäure in der wasserunlöslichen Phase erhalten. Die Lösung wird durch Mischen mit einer Lithium-2-Ethylhexanoat- Lösung aufgereinigt, wobei Lithiumclavulanat isoliert wird und wobei wahlweise das Lithiumsalz in andere Salze oder in ein Ester umgewandelt wird. Die Umwandlung des Lithiumsalzes in andere Salze wird mittels Ionenaustauschverfahren unter Verwendung von Ionenaustauscherharzen in der Form des gewünschten Kations durchgeführt, vorzugsweise Natrium oder Kalium.
Die US 5,498,788 betrifft ein neues Verfahren zur Herstellung der Clavulansäure oder ihres Kaliumsalzes aus einem Konzentrat einer klaren wäßrigen Lösung der in Form eines Natriumsalzes vorliegenden Rohclavulansäure.
Die oben erwähnten Verfahren des Standes der Technik haben den Nachteil, daß die Alkalimetallsalze, die durch direkte Ausfällung hergestellt werden, nicht ausreichend rein für einen pharmazeutischen Gebrauch sind. Daher sind weitere Aufreinigungsschritte, wie Rekristallisation, Aufreinigung über eine Säule usw. notwendig.
Die Aufgabe der Erfindung war es daher, Clavulansäure und ihre pharmazeutisch verträglichen Alkalimetallsalze, solche wie Kaliumclavulanat, in einer neuen und einfachen Weise herzustellen, wobei die gewünschte Substanz in einer sehr hohen Ausbeute ohne irgendwelche zusätzlichen Reinigungsschritte erhalten wird und von hoher Reinheit ist, wobei die Verwendung von giftigen Aminen oder Lithiumverbindungen vermieden wird.
Diese technische Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren, das gekennzeichnet ist durch die folgenden Schritte:
- vor der Filtration der Fermentationsnährlösung wird die Fermentationsnährlösung enthaltend Clavulansäure mit Wasser verdünnt, wobei der Prozentsatz der Vorverdünnung mit Wasser von 10 bis 70% (v/v) beträgt, ein Fällungsmittel wird hinzugefügt und der pH-Wert auf einen Wert von 3 bis 5 eingestellt,
- zur weiteren Aufreinigung wird das Alkalimetallsalz A der Clavulansäure durch Zugabe einer anorganischen Säure in Clavulansäure überführt und die Clavulansäure wird in ein mit Wasser unvermischbares oder teilweise mit Wasser unvermischbares Lösungsmittel extrahiert,
- und zu der Lösung der Clavulansäure wird eine Lösung eines anderen Alkalimetallalkylalkanoats B hinzugefügt und das Alkalimetallsalz B der Clavulansäure ausgefällt.
Geeignete Salze gemäß der vorliegenden Erfindung sind pharmazeutisch verträgliche Alkalimetallsalze und Erdalkalimetallsalze wie Natrium-, Kalium-, Calcium- und Magnesiumsalze.
Von diesen Verbindungen ist Kaliumclavulanat die stabilste Verbindung, die normalerweise für Arzneimittel verwendet wird. Die Clavulansäure selbst ist ein instabiles hygroskopisches Öl, das nicht für die Herstellung von pharmazeutischen Verbindungen verwendet wird.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird die fermentierte Nährlösung enthaltend Clavulansäure vor der Filtration mit Wasser vorverdünnt, wobei der Prozentsatz der Vorverdünnung mit Wasser von 40 bis 60% (v/v) beträgt.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das Alkylalkanoat ein Alkylhexanoat, vorzugsweise 2-Ethylhexanoat. Das Alkalimetall A ist Natrium und das Alkalimetall B Kalium.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die filtrierte Nährlösung enthaltend Clavulansäure nach dem Filtrationsschritt durch Adsorption an eine ein Anionenaustauscherharz enthaltende Säule aufgereinigt und mit einer wäßrigen Lösung eines Alkalimetallsalzes eluiert. Als Anionenaustauscherharz wird beispielsweise DIAION® SA-11A verwendet. Nach dem Elutionsschritt wird Clavulansäure in ein mit Wasser unvermischbares oder teilweise in Wasser unvermischbares Lösungsmittel extrahiert und Natriumclavulanat wird durch Zugabe einer Natrium-2-Ethylhexanoat-Lösung ausgefällt. Dabei liegt das Natrium-2- Ethylhexanoat in einem geeigneten Lösungsmittel vor und wurde zuvor mit wasserfreien Natrium- oder Magnesiumsulfaten dehydratisiert und mit Aktivkohle gereinigt.
Als ein alternativer Verfahrensschritt ist es auch möglich, die direkte Extraktion der Clavulansäure, die in der filtrierten Nährlösung enthalten ist, in ein mit Wasser unvermischbares oder teilweise in Wasser unvermischbares Lösungsmittel bei einem geeigneten pH-Wert zwischen 1,2 bis 2,0 ohne Verwendung einer Säule durchzuführen. Vorzugsweise werden in diesem Schritt 3 bis 4 Volumen des Lösungsmittels im Verhältnis zu der filtrierten Nährlösung verwendet. Die Clavulansäure wird aus dem obigen Lösungsmittel unter Verwendung einer organischen Base, vorzugsweise Triethylamin oder Diethylamin, in eine wäßrige Lösung extrahiert. Bei dieser Vorgehensweise wird eine ungefähr 10 bis 15-fache Aufkonzentrierung erreicht. Das verbrauchte Lösungsmittel kann in dem Verfahren ohne Aufreinigungsschritt wieder verwendet werden. Die Clavulansäure wird in ein mit Wasser unvermischbares oder teilweise in Wasser unvermischbares Lösungsmittel zurückextrahiert. Aus der Lösung wird das Natriumclavulanat durch Zugabe einer Natrium-2-Ethylhexanoat-Lösung ausgefällt, die in einem geeigneten Lösungsmittel nach Dehydratisierung vorliegt.
Clavulansäure ist ein hygroskopisches Öl und ist nicht sehr stabil in wäßriger Lösung Daher wird diese Clavulansäurelösung in ein mit Wasser unvermischbares oder teilweise in Wasser unvermischbares Lösungsmittel, in bevorzugter Weise durch Zugabe von wasserfreiem Natrium- oder Magnesiumsulfat dehydratisiert und weiter durch Zugabe von Aktivkohle aufgereinigt. Bei der Verwendung der Aktivkohle werden die farbigen Verunreinigungen aus der Lösung entfernt.
In einer bevorzugten Ausführungsform wird als Lösungsmittel Ethylacetat, Butylacetat, Methylisobutylketon oder Gemische derselben verwendet. Weiterhin kann vor dem Filtrationsschritt ein Ausfällmittel verwendet werden. Als Ausfällmittel werden quarternäre Ammoniumsalze bevorzugt.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist die Verwendung von Kristallen des Natriumclavulanats als Zwischenprodukte zur Herstellung einer pharmazeutisch akzeptablen Kaliumclavulanats.
Die Filtration der Clavulansäure enthaltenden Fermentationsnährlösung ist normalerweise schwierig und die Verwendung eines Ausfällmittels wurde vorgeschlagen, um die Filtrierbarkeit der ganzen Nährlösung zu verbessern, wie dies in der EP-A-0 387 178 beschrieben wird. Die vorliegende Erfindung beschreibt eine neue, einfache und kostengünstige Methode, um nicht nur die Filtrierbarkeit der ganzen Nährlösung zu verbessern, sondern auch um die Ausbeute der Filtration zu erhöhen und die nachfolgenden Verfahrensschritte zu erleichtern.
Überraschenderweise wurde gefunden, daß es möglich ist, die Gewinnung der Clavulansäure aus einer wäßrigen Fermentationsnährlösung durch deren Vorverdünnung mit Wasser zu verbessern. Diese Vorverdünnung der Fermentionsnährlösung ist sogar noch effizienter hinsichtlich des Grades der Filtrierbarkeit und Ausbeute der Filtration und der nachfolgenden Arbeitsschritte, wenn sie mit der Verwendung eines Ausfällmittels und der Einstellung des pH-Wertes kombiniert wird. Die Vorverdünnung der Nährlösung mit Wasser verringert die Viskosität der Nährlösung und erleichtert die Filtration Die Ausbeute der Filtration wird auch verbessert, da ein ärmeres Filtrat im Filterrückstand zurückbleibt. Die Verwendung eines Ausfällmittels und die leichte Ansäuerung auf einen pH-Wert von 3 bis 5 führt zur Ausfällung von Proteinen, die im Filterrückstand zurückbleiben und die Filtrationsrate verbessern. Auf diese Weise wird ein reineres Filtrat erhalten, was besagt, daß die weiteren Schritte für die Gewinnung der Clavulansäure viel leichter sind. Gemäß der vorliegenden Erfindung kann hochqualitatives Kaliumclavulanat mit guten Ausbeuten aus der fermentierten Nährlösung der Clavulansäure produzierenden Mikroorganismen durch die Schritte hergestellt werden, die im kennzeichnenden Teil des Anspruches 1 beschrieben werden.
Nach Filtration der fermentierten Nährlösung kann die Lösung direkt mittels eines organischen Lösungsmittels bei einem geeigneten pH-Wert von 1,2 bis 2,0 extrahiert werden, vorzugsweise unter Verwendung von 3 bis 4 Volumen Lösungsmittel im Verhältnis zur filtrierten Nährlösung. Es ist auch möglich, die Lösung vor diesem Schritt an ein Anionenaustauscherharz zu absorbieren und Clavulansäure mit einer wäßrigen Lösung eines Alkalimetallsalzes zu eluieren. Der Extraktionsschritt führt zu einer organischen Phase, die Clavulansäure aus dem Fermentationsverfahren enthält. Die organische Phase wird mit wasserfreiem Natrium- oder Magnesiumsalz dehydratisiert und mit Aktivkohle gereinigt. Danach wird Natrium- 2-Ethylhexanoat in einer organischen Lösung hinzugefügt und nach der Kristallisation können Kristalle des Natriumclavulanats durch Filtration abgetrennt werden.
Die Umwandlung des Natriumclavulanats in Kaliumclavulanat wird durch Extraktion der Clavulansäure in ein geeignetes Lösungsmittel und die Kristallisation von Kaliumclavulanat nach Verdünnung der Säure mit einem geeigneten Lösungsmittel und nach Zugabe von Kalium-2-Ethylhexanoat oder Kaliumacetatlösung in einem geeigneten Lösungsmittel durchgeführt. Für diesen Prozeßschritt wird Natriumclavulanat in einer Mischung aus Methylisobutylketon oder Ethylacetat oder Butylacetat mit Wasser suspendiert. Zu dieser Lösung wird eine anorganische Säure hinzugefügt. Durch diese Zugabe wird das Salz der Clavulansäure in Clavulansäure umgewandelt. Die Säure wird mittels Rühren in die organische Phase extrahiert.
Danach wird die Mischung mit Isopropanol verdünnt und eine Lösung des Kalium- 2-Ethylhexanoats in Isopropanol wird hinzugefügt, um einen pH-Wert zwischen 6 und 7 zu erreichen. Nach einer Kristallisationszeit von 2 Stunden bei niedrigen Temperaturen können Kaliumclavulanatkristalle durch Filtration abgetrennt werden.
Wenn notwendig, kann Kaliumclavulanat rekristallisiert werden.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist es möglich, die Clavulansäure aus dem mit Wasser unvermischbaren oder teilweise mit Wasser unvermischbaren Lösungsmittel mittels einer organischen Phase, vorzugsweise Triethylamin oder Diethylamin, in eine wäßrige Lösung zu extrahieren. Durch diesen Arbeitsschritt kann eine etwa 10 bis 15-fache Aufkonzentrierung erreicht werden. Das verbrauchte Lösungsmittel kann in dem Verfahren ohne Reinigungsschritt wieder verwendet werden.
Ein weiterer alternativer Weg ist die Rückextraktion der Clavulansäure in das mit Wasser unvermischbare oder teilweise mit Wasser unvermischbare Lösungsmittel.
Durch das Verfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können Clavulansalze des Kaliums in hoher Reinheit und guten Ausbeuten hergestellt werden. Das Verfahren ist einfach und erlaubt es, ohne die Verwendung von toxischen Aminen zu arbeiten. Weiterhin ist die Reinheit des Kaliumclavulanats, das gemäß der vorliegenden Erfindung hergestellt wird, höher als die Reinheit dieser Verbindung, die durch Verfahren des Standes der Technik hergestellt werden, die direkt die Ausfällung durch die Reaktion mit Kalium-2-Ethylhexanoat verwenden.
Die folgenden Beispiele sollen die vorliegende Erfindung erläutern, aber diese nicht begrenzen.

A. Experimente zur Filtration einer fermentierten Nährlösung von Clavulansäure

Beispiel 1 Wirkung der Vorverdünnung einer fermentierten Nährlösung mit Wasser auf die Rate und Ausbeute der Filtration

Portionen von 200 ml der Clavulansäure enthaltenden fermentierten Nährlösung, zu der 4% (w/v) einer Filterhilfe (Dicalite 478) hinzugefügt wurde, wurden mit Wasser verdünnt und unter Vakuum in einem Buckner-Filter filtriert.
Die erhaltenen Raten und Ausbeuten der Filtration werden in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1

Beispiel 2 Kombinierte Wirkung der Vorverdünnung der fermentierten Nährlösung und Verwendung von Ausfällmitteln auf die Rate und Ausbeute der Filtration

Portionen von 200 ml einer Clavulansäure enthaltenden fermentierten Nährlösung wurden mit 4% (w/v) einer Filterhilfe (Dicalite 478) und mit 0,4% (v/v) von Rolquat CDM BC als Ausfällmittel behandelt. Jede der 200-ml-Portionen wurde mit Wasser verdünnt und wie in Beispiel 1 beschrieben filtriert.
Die erhaltenen Filtrationsraten waren die wie in Tabelle 2 gezeigt. Die Filtrationsausbeuten waren ähnlich zu jenen die in Beispiel 1 erhalten wurden. Tabelle 2

Beispiel 3 Kombinierte Wirkung der Vorverdünnung der fermentierten Nährlösung mit der Verwendung eines Ausfällmittels und Einstellung des pH-Wertes auf 4,5 auf die Rate und Ausbeute der Filtration

Portionen von 200 ml einer Clavulansäure enthaltenden fermentierten Nährlösung wurden mit 4% (w/v) einer Filterhilfe (Dicalite 478) und 0,4% (v/v) eines Ausfällmittels, das in Beispiel 2 verwendet wurde, behandelt. Danach wurde der pH-Wert jeder dieser 200-ml-Portionen der fermentierten Nährlösung mit 15-%iger (w/v) Schwefelsäure auf einen pH-Wert von 4,5 eingestellt. Jede Portion wurde mit Wasser verdünnt und wie in Beispiel 1 filtriert. Die erhaltenen Filtrationsraten werden in Tabelle 3 gezeigt. Die erhaltenen Filtrationsraten waren ähnlich zu jenen, die in Beispiel 1 erhalten wurden. Tabelle 3

B. Herstellung eines Salzes als Zwischenprodukt der Clavulansäure

Die folgenden Beispiele erläutern die Herstellung von Salzen als Zwischenprodukte der Clavulansäure (Natriumclavulanat).

Beispiel 4

750 l einer fermentierten Nährlösung von Streptomyces clavuligerus, die gemäß Messungen ungefähr 3800 ug/ml Clavulansäure enthielten, wurden mit 4% (w/v) einer Filterhilfe behandelt, auf 40% mit deionisiertem Wasser verdünnt, nach Zugabe von 0,4% (v/v) eines Ausfällmittels (Rolquat CDM BC) und nach Einstellung des pH-Wertes auf 4,5 mit 15-%iger Schwefelsäure (w/v) in einem Druckfilter filt riert. Nach der Filtration wurde der Rückstand mit 10% (v/v) Wasser gewaschen, was zu einem Endvolumen der filtrierten Nährlösung von ungefähr 1100 l führte, das nach Messung 2500 ug/ml enthält (Ausbeute der Filtration um 92%).
Das Filtrat enthaltend die Clavulansäure wurde in Säulen an ein Anionenaustauscherharz (DIAION SA-11A) absorbiert und die absorbierte Clavulansäure wurde mit einer 1,0 M Natriumchloridlösung eluiert. Die vereinigte Ausbeute der Adsorption/Elution war ungefähr 85% des theoretischen Wertes und die durchschnittliche Konzentration des erhaltenen gemischten angereicherten Eluats war etwa 10000 ug/ml. Dieses Eluat wurde mit 4 Volumen Ethylacetat bei einem pH-Wert von 1,4 (mit 25% (w/v) Schwefelsäure eingestellt) extrahiert, um ein Ethylacetatextrakt mit einer Konzentration von ungefähr 2000 ug/ml zu ergeben. Butylacetat oder Methylisobutylketon können ebenso verwendet werden. Der Ethylacetatextrakt wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat und Aktivkohle behandelt und unter Verwendung eines Buckner-Filters filtriert. Das erhaltene Filtrat wurde nochmals mit wasserfreiem Natriumsulfat behandelt und filtriert.
Aus dem dehydratisierten gereinigten Ethylacetatextrakt wurde das Zwischenprodukt Natriumclavulanat wie folgt erhalten:
Es wurde eine 0,3 M Lösung von Natrium-2-Ethylhexanoat in Ethylacetat hergestellt. Diese Lösung wurde mit wasserfreiem Natriumsulfat und Aktivkohle behandelt und filtriert. Danach wurde diese klare Lösung zu dem Ethylacetatextrakt hinzugefügt und für 1 Stunde belassen, um einen pH-Wert im Bereich von 6,0 bis 6,2 zu erhalten. Nach dieser Zugabe und nach einer Kristallisationszeit von etwa 1 Stunde bei niedriger Temperatur (5ºC) wurden die Natriumclavulanatkristalle durch Filtration aufgesammelt (eine Zentrifugation kann ebenso angewandt werden). Danach wurde 2-mal mit Aceton gewaschen und mit einem Stickstoffgasstrom unter Vakuum getrocknet. Die Analyse des Natriumclavulanats ergab 70% (als Clavulansäure), was einer Gesamtausbeute aus der gesamten Nährlösung von etwa 58% des theoretischen Wertes entspricht.

Beispiel 5

Das Salz des Zwischenproduktes wurde wie in Beispiel 1 mit folgenden Abänderungen hergestellt:
Das Lösungsmittel, das verwendete wurde, um die Clavulansäure aus dem gemischten angereicherten Eluat zu extrahieren, war Butylacetat, das mit wasserfreiem Natriumsulfat dehydratisiert wurde und mit Aktivkohle gereinigt wurde. Nach der Entfernung von Feststoffen wurde das gereinigte Butylacetat mit einer 0,3 M Lösung von Natrium-2-Ethylhexanoat in Ethylacetat behandelt. Die Kristallisation des Natriumclavulanats wurde innerhalb von 1,5 Stunden bei 5ºC erreicht. Die Analyse des Natriumclavulanats ergab etwa 70% als Clavulansäure und die Ausbeute aus der gesamten Nährlösung war etwa 45% des theoretischen Wertes.

Beispiel 6

Das Salz des Zwischenproduktes wurde wie in Beispiel 1 mit den folgenden Abänderungen erhalten:
Das Lösungsmittel, das verwendet wurde, um Clavulansäure aus dem angereicherten Eluat zu extrahieren, war Methylisobutylketon, das nach der Extraktion mit wasserfreiem Natriumsulfat dehydratisiert wurde und mit Aktivkohle gereinigt wurde. Nach der Entfernung von Feststoffen wurde das gereinigte Methylisobutylketon enthaltend Clavulansäure mit einer Lösung aus 0,3 M Natrium-2- Ethylhexanoat in Methylisobutylketon behandelt. Die Kristallisation des Natriumclavulanats wurde innerhalb von 1,5 Stunden bei 5ºC erreicht. Die Analyse des Natriumclavulanats ergab etwa 70% als Clavulansäure und die Endausbeute aus der gesamten Nährlösung war etwa 50% des theoretischen Wertes.

Beispiel 7

Das Salz des Zwischenproduktes wurde wie in Beispiel 1 mit den folgenden Abänderungen erhalten.
Die filtrierte Nährlösung wurde direkt in Ethylacetat extrahiert. Danach wurde die Clavulansäure in eine wäßrige Lösung unter Verwendung von Triethylamin extrahiert. Die Clavulansäure in der wäßrigen Lösung wurde in das gleiche Lösungsmittel zurückextrahiert und die Kristallisation von Natriumclavulanat wurde unter Verwendung einer 0,3 M Lösung aus Natrium-2-Ethylhexanoat in Ethylacetat durchgeführt.
Die Analyse des erhaltenen Natriumclavulanats ergab 72% (als Clavulansäure) und die erhaltene Gesamtausbeute aus der gesamten Nährlösung war ungefähr 50% des theoretischen Wertes.

C. Herstellung von reinem Kaliumclavulanat

Beispiel 8

1,5 kg (als Clavulansäure) des Zwischenproduktes Natriumclavulanat wurde gemäß den in Teil B, Beispiele 4 bis 7 beschriebenen Verfahren hergestellt und in einer Mischung aus Methylisobutylketon und deionisiertem Wasser (97/3, v/v) bei einer Temperatur von 5ºC suspendiert. Es wurde eine verdünnte reine Salzsäure hinzugefügt, um einen pH-Wert von 1,3 zu erreichen und die Clavulansäure wurde unter Rühren in die organische Phase extrahiert. Nach Trennung der Phasen durch die Schwerkraft wurde das angereicherte Methylisobutylketon mit wasserfreiem Natriumsulfat (80 g/l) bei niedrigen Temperaturen dehydratisiert. Das Natriumsulfat wurde durch Filtration entfernt und das erhaltene Filtrat wurde nochmals mit wasserfreiem Natriumsulfat (20 g/l) behandelt und mit Aktivkohle entfärbt. Nach Filtration unter Verwendung von Diatomit als Filterhilfe wurde das erhaltene angereicherte Lösungsmittel mit Isopropanol verdünnt.
Zu der so erhaltenen Mischung wurde eine 0,3 M Lösung Kalium-2-Ethylhexanoat in Isopropanol hinzugefügt und für 1,5 Stunden belassen, um einen pH-Wert von etwa 6,5 zu erreichen. Nach Zugabe der Kalium-2-Ethylhexanoat-Lösung und einer Kristallisationszeit von 2 Stunden bei niedriger Temperatur wurden die Kaliumclavulanatkristalle durch Filtration in einem geschlossenen Filter gesammelt, mit Aceton gewaschen und mit einem Stickstoffgasstrom gespült. Anschließend wurde das Produkt bei Raumtemperatur unter Vakuum getrocknet bis ein Feuchtigkeitsgehalt von unter 0,5% erreicht wurde. Die Messung des erhaltenen Produktes ergab 82% (als Clavulansäure). Die Umwandlungsausbeute aus Natriumclavulanat war 80% des theoretischen Wertes.

Beispiel 9

1,5 kg (als Clavulansäure) des Zwischenproduktes Natriumclavulanat wurde in einer Mischung aus Butanol/Wasser (90/10, v/v) suspendiert und verdünnte reine Salzsäure wurde hinzugefügt, bis ein pH-Wert von 1,3 erreicht wurde, wobei die Temperatur unter 5ºC gehalten wurde. Das Natriumsalz der Clavulansäure wurde in Clavulansäure umgewandelt und in das Lösungsmittel extrahiert. Die wäßrige Phase wurde mittels Schwerkraft abgetrennt. Nach der Phasentrennung wurde das Wasser in dem Lösungsmittel durch azeotrope Destillation unter verringertem Druck entfernt und die angereicherte konzentrierte Lösung wurde mit Aktivkohle behandelt und filtriert. Zu der aufgereinigten angereicherten filtrierten Lösung wurde eine 0,3 M Lösung Kalium-2-Ethylhexanoat in Butanol hinzugefügt und für 1,5 Stunden bei Raumtemperatur belassen.
Nach Zugabe der Kalium-2-Ethylhexanoat-Lösung wurde die Reaktionsmischung auf 5ºC gekühlt und nach einer Kristallisationszeit von 1,5 Stunden wurden die Kaliumclavulanatkristalle durch Filtration in einem geschlossenen Filter gesammelt, mit Aceton gewaschen und mit einem Stickstoffstrom gespült. Anschließend wurde das Produkt bei Raumtemperatur unter Vakuum getrocknet bis ein Feuchtigkeitsgehalt von unter 0,5% erreicht wurde.
Die Messung des erhaltenen Produktes ergab 81% (als Clavularsäure). Die Umwandlungsausbeute des Natriumclavulanats war 75% des theoretischen Wertes.

Beispiel 10

1,5 kg (als Clavulansäure) des Zwischenproduktes Natriumclavulanat wurde gemäß den in Teil B, Beispiele 4 bis 7 beschriebenen Verfahren hergestellt in einer Mischung aus Butylacetat/Wasser (97/3, v/v) suspendiert und verdünnte reine Salzsäure wurde hinzugefügt, bis ein pH-Wert von 1,3 erreicht wurde. Die Temperatur wurde unter 5ºC gehalten. Das Natriumsalz der Clavulansäure wurde in Clavulansäure umgewandelt und in das Lösungsmittel extrahiert. Nach der Extraktion und Phasentrennung wurde die angereicherte Butylacetatphase mit wasserfreiem Natriumsulfat und Aktivkohle behandelt und filtriert. Die erhaltene angereicherte filtrierte Lösung wurde mit Isopropanol verdünnt. Zu der erhaltenen gemischten Lösung wurde eine 0,3 M Lösung Kalium-2-Ethylhexanoat in Isopropanol hinzugefügt, bei 1,5 Stunden belassen, um einen pH-Wert von etwa 6,5 zu erhalten. Nach einer Kristallisationszeit von 2 Stunden bei 5ºC wurden die Kaliumclavulanatkristalle durch Filtration in einem geschlossenen Filter gewonnen, mit Aceton gewaschen und mit einem Stickstoffgasstrom gespült. Anschließend wurde das Produkt bei Raumtemperatur unter Vakuum getrocknet bis ein Feuchtigkeitsgehalt von unter 0,5% erreicht wurde. Die Umwandlungsausbeute aus Natriumclavulanat war 78% des theoretischen Wertes.

Beispiel 11 Rekristallisation von Kaliumclavulanat

Das erforderliche Kaliumclavulanat kann wie in dem obigen Beispiel beschrieben, aufgereinigt werden. Es wurde eine Mischung aus Methylisobutylketon und Wasser (98/2, v/v) hergestellt. Kaliumclavulanat wurde in der zuvor hergestellten Mischung suspendiert und verdünnte reine Salzsäure wurde hinzugefügt, bis ein pH-Wert von 1,3 erreicht wurde. Die Temperatur wurde unter 5ºC gehalten. Das Kaliumclavulanat wurde in Clavulansäure umgewandelt und in das Lösungsmittel extrahiert. Nach Extraktion und Phasentrennung wurde das angereicherte Methylisobutylketon mit wasserfreiem Natriumsulfat und Aktivkohle behandelt und filtriert. Isopropanol wurde zu dem Methylisobutylketon hinzugefügt und eine 0,3 M Lösung Kalium-2-Ethylhexanoat in Isopropanol wurde hinzugefügt und bei Raumtemperatur belassen. Nach einer Kristallisationszeit von 3 Stunden bei 5ºC wurden die Kaliumclavulanatkristalle durch Filtration in einem geschlossenen Filter gewonnen, mit wasserfreiem Aceton gewaschen und mit einem Stickstoffgasstrom gespült. Anschließend wurde das Produkt bei Raumtemperatur unter Vakuum getrocknet bis ein Feuchtigkeitsgehalt von unter 0,5% erreicht wurde. Die Ausbeute der Rekristallisation war etwa 80% des theoretischen Wertes.

Claims

1. Verfahren zur Isolierung eines pharmazeutisch verträglichen Alkalimetallsalzes der Clavulansäure aus einer Fermentationsnährlösung enthaltend unreine Clavulansäure umfassend die Schritte der Filtration der Fermentationsnährlösung, Extraktion der Clavulansäure in ein mit Wasser unvermischbares oder teilweise in Wasser unvermischbares Lösungsmittel bei einem pH-Wert von 1,2 bis 2, Ausfällung eines Alkalimetallsalzes A der Clavulansäure durch Zugabe einer Lösung eines Alkalimetallalkylalkanoats, gekennzeichnet durch die folgenden Schritte:

vor der Filtration wird die Fermentationsnährlösung enthaltend Clavulansäure mit Wasser vorverdünnt, wobei der Prozentsatz der Verdünnung mit Wasser von 10 bis 70% (v/v) beträgt;

zur weiteren Aufreinigung wird das Alkalimetallsalz A der Clavulansäure durch Zugabe einer anorganischen Säure in Clavulansäure überführt und die Clavulansäure wird in ein mit Wasser unvermischbares oder teilweise mit Wasser unvermischbares Lösungsmittel extrahiert;

eine Lösung eines anderen Alkalimetall B Alkylalkanoats wird hinzugefügt und das Alkalimetallsalz B der Clavulansäure wird ausgefällt.

2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei die Fermentationsnährlösung enthaltend Clavulansäure mit Wasser vorverdünnt wird, wobei der Prozentsatz der Vorverdünnung mit Wasser 40 bis 60% (v/v) beträgt.

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Alkylalkanoat ein Alkylhexanoat, insbesondere 2-Ethylhexanoat ist.

4. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 3, wobei das Alkalimetall A Natrium ist und das Alkalimetall B Kalium ist.

5 Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 4, wobei nach dem Filtrationsschritt die Clavularsäure-enthaltende, filtrierte Nährlösung durch Adsorption an eine Anionenaustauscherharz-enthaltende Säule gereinigt wird und mit einer wäßrigen Lösung eines Alkalimetallsalzes eluiert wird.

6. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 5, wobei die Clavulansäurelösung in dem mit Wasser unvermischbaren oder teilweise mit Wasser unvermischbaren Lösungsmittel durch Zugabe von wasserfreiem Natrium- oder Magnesiumsulfat dehydratisiert wird und weiter durch Zugabe von Aktivkohle gereinigt wird.

7. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 6, wobei 3 bis 4 Volumen eines in Wasser unvermischbaren oder teilweise in Wasser unvermischbaren Lösungsmittels im Verhältnis zu der Lösung der filtrierten Nährmittellösung enthaltend Clavulansäure verwendet werden.

8. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 7, wobei das Lösungsmittel ausgewählt ist aus der Gruppe Ethylacetat, Butylacetat, Methylisobutylketon und Gemischen derselben.

9. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 8, wobei als Ausfällmittel ein quarternäres Ammoniumsalz verwendet wird.

10. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 9, wobei nach dem Filtrationsschritt die Clavulansäure ohne Verwendung einer Säule in ein mit Wasser unvermischbares oder teilweise in Wasser unvermischbares Lösungsmittel bei einem pH-Wert von 1,2 bis 2 extrahiert wird.

11. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, wobei 3 bis 4 Volumen des Lösungsmittels im Verhältnis zu der filtrierten Nährlösung verwendet werden.

12. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 11, wobei die Clavulansäure aus dem mit Wasser unvermischbaren oder teilweise in Wasser unvermischbaren Lösungsmittel unter Verwendung einer organischen Base in eine wäßrige Lösung extrahiert wird und danach zurück in das mit Wasser unvermischbare oder teilweise in Wasser unvermischbare Lösungsmittel zurückextrahiert wird.

13. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, wobei die Vorverdünnung in Verbindung mit der Verwendung eines Fällungsmittels kombiniert wird.

14. Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 12, wobei die Vorverdünnung mit einer pH-Wert-Anpassung zu einem pH-Wert von 3 bis 5 und mit der Verwendung eines Fällungsmittels kombiniert wird.

15. Verwendung von Natriumclavulanatkristallen als Zwischenprodukt zur Herstellung eines pharmazeutisch verträglichen Kaliumclavulanats.