DE69637317T2

DE69637317T2 - Molekulare ausrichtung von makromolekuelen mit hilfe eines fluessigkeitsmeniskus auf einer hochspezifischen oberflaeche

Info

Publication number: DE69637317T2
Application number: DE69637317T
Authority: DE
Inventors: Adam J Simon
Original assignee: Individual
Current assignee: Centre National de la Recherche Scientifique CNRS; Institut Pasteur
Priority date: 1995-08-09
Filing date: 1996-08-09
Publication date: 2008-10-16
Anticipated expiration: 2016-08-10
Also published as: ES2296297T3; WO1997006278A1; EP0843739A4; DE69637317D1; EP0843739B1; EP0843739A1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft eine oder mehrere hochgradig spezifische Oberfläche(n), die in der Biologie verwendet werden kann bzw. können, und Substrate, Konstrukte und Vorrichtungen, die diese Oberfläche(n) verwenden, wie auch deren Anwendungen und Verfahren zu deren Herstellung. Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Ausdehnung von Makromolekülen, wie Polymeren oder biologisch aktiven Makromolekülen, insbesondere DNA oder Proteinen.
Hintergrund der Erfindung
Die hohe Spezifität und Selektivität von bestimmten biologisch aktiven Reaktionen ist seit langem bekannt. Speziell sind die Antikörper-Antigen-Reaktionen, die DNA- oder RNA-Hybridisierungen, die Reaktionen zwischen Proteinen des Typs Avidin/Streptavidin-Biotin wie auch die Reaktionen zwischen Liganden und deren Rezeptoren wohlbekannt. Es ist jetzt möglich, einen Vorteil aus diesen spezifischen Reaktionen zu ziehen, insbesondere um das Vorhandensein oder Fehlen von einem der Elemente der gekoppelten Reaktion in einer Probe zu zeigen oder um gegebenenfalls eines der Elemente des Paars aus einem komplexeren Medium abzutrennen. Wenn jedoch gewünscht wird, das Vorhandensein eines Moleküls in sehr geringen Konzentrationen in einem komplexen Medium nachzuweisen, liefern die gegenwärtig verfügbaren Verfahren oftmals zufällige Ergebnisse, insbesondere aufgrund des Hintergrundrauschens, mit welchem man während der Trenn- oder Nachweisschritte konfrontiert wird. Dies ist der Grund dafür, dass das, was im Folgenden als „molekulares Fischen" bezeichnet werden wird, d. h. die Möglichkeit, jedes der Moleküle, nach welchen gesucht wird, sogar in sehr geringen Konzentrationen nachzuweisen, noch nicht möglich gewesen ist. Beispielsweise erfordert die Analyse einer DNA-Probe die Verwendung einer Hybridisierungssonde, welche der komplementären Sequenz der zu identifizierenden Sequenz entspricht. Unter diesen Bedingungen besteht das Problem darin, das Hybrid aus dem Medium zu isolieren, dann es mit einem guten Signal-Rausch-Verhältnis (SRV) nachzuweisen und schließlich sogar eine geringe Anzahl von positiven Reaktionen zu bestimmen. Dies ist der Grund dafür, warum in vielen Fällen ein zwischengeschalteter Schritt, um die nachzuweisende Sequenz zu amplifizieren, beispielsweise durch Verwendung von PCR oder Amplifizierungsmethoden, welche zu den gleichen Ergebnissen führen, verwendet wird. Unter diesen Bedingungen wird die Konzentration der zu analysierenden Sequenz in der Probe erhöht und ihr Nachweis wird viel leichter gemacht. Jedoch ist dieser Amplifizierungsschritt anfällig für Verunreinigungen, die möglicherweise zu Nachweisfehlern führen. Es wäre dementsprechend wünschenswert, in der Lage zu sein, das Vorhandensein der Nukleinsäuresequenz ohne Amplifizierungsschritt nachzuweisen. Es ist vorgeschlagen worden, einen zwischengeschalteten Verankerungsschritt des Hybridisierungsprodukts auf einer festen Oberfläche, welche bestimmte Bindungsspezifitäten aufweist, zu verwenden, um die Hybridisierungsreaktion hervorzuheben. Es ist beispielsweise möglich, bestimmte vorbehandelte Oberflächen zu verwenden, die das Binden von bestimmten Proteinen oder DNA unabhängig davon, ob diese DNA modifiziert worden ist oder nicht, erlauben. Solche Oberflächen sind kommerziell erhältlich (beispielsweise Covalink^®, CoStar^®, Estapor^®, Bangs^® und Dynal^®) in Form von Körnchen („beads") oder Vertiefungen, welche auf der Oberfläche beispielsweise Gruppen vom Typ -COOH, -NH₂ oder -OH aufweisen. Die DNA kann dementsprechend mit einer reaktiven Gruppe, beispielsweise einem Amin, funktionalisiert werden und die Reaktion kann mit diesen Oberflächen stattfinden. Jedoch erfordern diese Verfahren eine bestimmte Vorbehandlung oder Funktionalisierung der zu bindenden DNA.
Techniken, die eine Verankerung ohne Vorbehandlung der DNA erlauben, sind auch beschrieben worden. Eine der Techniken besteht darin, die freie Phosphatgruppe des 5'-Endes des Moleküls mit einem sekundären Amin umzusetzen. Es ist auch möglich, die DNA an eine Gruppe eines Proteins anzuheften, um dieses mit einer Oberfläche, die mit einer Gruppe eines zweiten Proteins, welches in der Lage ist, spezifisch mit dem ersten Protein zu reagieren, bedeckt ist, reagieren zu lassen. Der gebundene Komplex (erstes Protein-zweites Protein) kann vom Typ Biotin-Streptavidin, Anti-Digoxigenin-Antikörper (anti-DIG), der gegen das Digoxigenin-Antigen (DIG) gerichtet ist, sein. Solche Oberflächen sind jedoch in den meisten Fällen nicht ausreichend spezifisch. Dementsprechend kann das Vorhandensein von störenden Wechselwirkungen, sogar von schwachen, vom Typ einer nicht-spezifischen Adsorption für ein langes Molekül zu einer Absorption an dem Feststoff an einer großen Anzahl von schwachen Wechselwirkungsstellen führen (V. Lund et al., Nucl. Acids Res. 16, 1861 (1988)). Diese Oberflächen führen zu potentiellen Anwendungen, denen Empfindlichkeit fehlt, und/oder mit einer hohen Rate von Hintergrundrauschen in dem Falle einer kleinen Anzahl von Molekülen, nach welchen „gefischt" werden soll. Darüber hinaus weisen einige von diesen Oberflächen eine hohe Rate von störender Fluoreszenz auf, die potentiell während der Nachweisphase (wenn Photonen beim Nachweis verwendet werden) schädlich ist. Wie für den Nachweis selbst, insbesondere für das Hervorheben des Vorhandenseins von DNA, beschreibt das Französische Patent 78 10975 ein Verfahren zum Koppeln einer Sonde an ein Enzym, welches es einem erlaubt, die Freisetzung eines chromatischen Substrats, das ein Farbstoff ist, der, wenn er freigesetzt wird, seine optischen Eigenschaften (entweder Emissions- oder Absorptionseigenschaften) verändert, zu beobachten. Es ist darüber hinaus möglich, die Reaktion durch eine Messung der optischen Dichte, eine spektrale oder kalorimetrische Messung zu quantifizieren. Eine Technik dieser Art ist jedoch für den Nachweis von Spurenmengen nicht direkt angepasst. Dementsprechend muss auch dieser Technik in den meisten Fällen ein Amplifizierungsverfahren der Menge von Nukleinsäuren, nach denen gesucht wird, beispielsweise durch die PCR-Methode, vorausgehen. Das als „kalte Sondentechnik” („cold probe technique") beschriebene Nachweisverfahren ist entwickelt worden, um die Verwendung von radioaktiven Markern zu vermeiden, welche Ergebnisse liefern, die hinsichtlich der Empfindlichkeit nahe kommen, aber Manipulationsprobleme aufwerfen, berücksichtigt man das Vorhandensein von Radioaktivität und die langen Entwicklungszeiten, die für eine gute Empfindlichkeit erforderlich sind. Für bestimmte besondere Anwendungen, wie Verfahren, die ausgehend von einer ex vivo-Bildgebung ersonnen worden sind, sind direkte Verfahren zum Beobachten der Reaktion vorgeschlagen worden, indem das Hybridisierungsprodukt an Mikrokörnchen, insbesondere an PMMA, die an ihrer Oberfläche in geeigneter Weise chemisch behandelt worden sind, gekoppelt wird. Das Verfahren beruht auf der direkten Identifizierung des Vorhandenseins von diesen Mikrokörnchen (mit einem typischen Durchmesser von 60 Nanometern) unter einem Elektronenmikroskop und beruht auch auf bekannten festen Verankerungstechniken, die nicht ausreichend spezifisch sind.
Die oben beschriebenen Techniken sind offensichtlich nicht auf den Nachweis von Nukleinsäuren beschränkt. Der Nachweis von Antikörpern unter Verwendung derselben Systeme ist vorgeschlagen worden. In diesen Situationen sind die Tests Tests vom ELISA-Typ, die hier nicht beschrieben werden und die zur Zusammenfassung das Koppeln eines Antikörpers an eine Ankerstelle, die mit einem Antigenmolekül auf einem Feststoff assoziiert ist, erlaubt. In dieser Situation sind die Spezifitätsprobleme und die Probleme aufgrund von störenden Reaktionen nach wie vor vorhanden. Das Nachweisverfahren kann auf einem Koppeln an ein chromatisches Substrat, welches seine eigenen Empfindlichkeitsprobleme aufweist, basieren.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung betrifft ein reproduzierbares Verfahren zum Kämmen, Orientieren, Ausrichten, Geraderichten oder Ausdehnen eines Makromoleküls auf einer Oberfläche, welches umfasst, ein Makromolekül in Kontakt mit einer Oberfläche S und einem Medium A zu bringen, so dass eine Stelle des Makromoleküls an S gebunden wird und ein Abschnitt davon in A angeordnet ist, und die Bestandteile von A bezogen auf S mechanisch zu versetzen unter Bedingungen, die wirksam sind, um das Makromolekül zu kämmen, zu orientieren, auszurichten, geradezurichten oder auszudehnen.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zum Erhalten einer Oberfläche S, welche eine konsistente, homogene und reproduzierbare Orientierung, Ausrichtung, Geraderichtung oder Ausdehnung von Makromolekülen ermöglicht, welches umfasst, eine Oberfläche S eines Substrats zu reinigen unter Bedingungen, welche wirksam sind, um eine von organischen Molekülen freie und staubfreie Oberfläche S zu erhalten, S zu hydratisieren und S mit einem gewünschten Material, welches freiliegende Reste umfasst, die selektiv Makromoleküle binden können, zu beschichten, wobei die Stufen der Reinigung, Hydratisierung und Beschichtung in einer einzelnen Kammer ausgeführt werden.
Auch Teil dieser Erfindung ist eine Oberfläche, die durch das oben beschriebene Verfahren hergestellt wird, welche für eine Verwendung bei der Orientierung, Ausrichtung, Geraderichtung oder Ausdehnung von Makromolekülen in einer konsistenten, homogenen und reproduzierbaren Weise geeignet ist. In diesem Patent wird auch ein Substrat, Konstrukt oder eine Vorrichtung, umfassend die Oberfläche der Erfindung, und Kits, welche die Oberfläche, das Substrat, Konstrukt und/oder die Vorrichtung und andere Bestandteile und Anweisungen für dessen Verwendung umfassen, die für verschiedene Anwendungen, die nachfolgend beschrieben werden, geeignet sind, bereitgestellt.
Die Oberfläche dieser Erfindung wird in vorteilhafter Weise angewendet, um ein gewünschtes Ausmaß an Orientierung, Ausrichtung, Geraderichtung oder Ausdehnung eines Makromoleküls, das an eine Oberfläche S gebunden ist, zu erzielen, indem das Makromolekül mit der Oberfläche der Erfindung und einem Medium A in Kontakt gebracht wird, so dass eine Stelle des Makromoleküls an die Oberfläche gebunden wird und ein Abschnitt davon in A angeordnet ist, wobei das hydrophobe/hydrophile Charakteristikum von entweder der Oberfläche oder A in einer Weise modifiziert wird, welche wirksam ist, um ein gewünschtes Ausmaß an Ausdehnung des Makromoleküls zu erzeugen, A verdampft wird oder die Bestandteile von A relativ zur Oberfläche versetzt werden, um das Makromolekül zu orientieren, auszurichten, geradezurichten oder auszudehnen, und die Länge des ausgedehnten Makromoleküls durch Vergleichen mit einem Standard oder einer Kontrolle bestimmt wird.
Das Dokument WO-A-92/08788 offenbart ein beschichtetes Substrat mit der Fähigkeit, Makromoleküle in einer orientierten Position zu binden, und welches gereinigt wird, um jegliche organischen Moleküle und Staub davon zu entfernen, dann hydratisiert und mit einem Reagens beschichtet wird. Das Substrat kann nach UV-Bestrahlung erhalten werden. Makromoleküle können durch eine Rakel- oder Abstreifmesser-Technik orientiert werden. Es offenbart nicht ein Verfahren zum Erhalten einer Oberfläche, welches Schritte umfasst, die allesamt in einer einzelnen Kammer ausgeführt werden, und auch keinen Versetzungsschritt, in welchem zwei Oberflächen parallel bewegt werden, um eine Grenzfläche zu versetzen.
Die Erfindung betrifft ein Verfahren zum Erhalten einer Oberfläche S, welche eine konsistente, homogene und reproduzierbare Orientierung, Ausrichtung, Geraderichtung oder Ausdehnung von Makromolekülen ermöglicht, gemäß Anspruch 1 oder gemäß dem abhängigen Anspruch 2. Die Erfindung betrifft auch ein reproduzierbares Verfahren zum Orientieren, Ausrichten, Geraderichten oder Ausdehnen eines Makromoleküls auf einer Oberfläche gemäß dem unabhängigen Anspruch 4 oder gemäß dem abhängigen Anspruch 3 oder 5 bis 9. Die Erfindung betrifft auch eine Oberfläche S, die durch das vorangegangene Verfahren erhalten wird.
Eine andere Anwendung der Oberfläche der Erfindung erfolgt beispielsweise in einem empfindlichen Verfahren zum Identifizieren einer bestimmten Art von Makromolekül, die in einer Probe vorhanden ist, indem das Makromolekül mit der Oberfläche und dem Medium in Kontakt gebracht wird und das Makromolekül orientiert wird, wie oben beschrieben, und das Vorhandensein des ausgedehnten Makromoleküls in einer quantitativen und reproduzierbaren Weise nachgewiesen wird und die Art des orientierten Makromoleküls spezifisch identifiziert wird.
Noch eine andere Anwendung besteht in der Bestimmung der Anzahl einer speziellen Art von Makromolekül, die in einem bekannten Volumen von Probe vorhanden ist, indem ein Makromolekül mit der Oberfläche und dem Medium in Kontakt gebracht wird, das Makromolekül orientiert wird und das Vorhandensein des orientierten Makromoleküls, wie oben beschrieben, nachgewiesen wird und die Anzahl von orientierten Makromolekülen, die vorhanden ist, in einer reproduzierbaren und quantitativen Weise bestimmt wird.
Noch eine andere Verwendung der Oberfläche besteht in der Abtrennung einer speziellen Art von anderen Arten von Makromolekülen, indem ein Makromolekül mit der Oberfläche und dem Medium A in Kontakt gebracht wird, A verdampft wird oder die Bestandteile von A relativ zu der Oberfläche versetzt werden, um A und andere Probenbestandteile zu verdrängen, während das oder die Makromolekül(e) der speziellen Art an die Oberfläche gebunden bleibt bzw. bleiben und orientiert wird (werden), und das Vorhandensein von jeglichem(n) orientiertem(n) Makromolekül(en) der speziellen Art in einer reproduzierbaren und quantitativen Weise nachgewiesen wird.
Noch eine andere Anwendung der Oberfläche der Erfindung besteht in dem Messen der Länge eines Makromoleküls einer speziellen Art, indem das Makromolekül, welches einen Marker an einer Position von bekannter Länge aufweist, in Kontakt mit der Oberfläche der Erfindung und einem Medium A gebracht wird, A verdampft wird oder dessen Bestandteile relativ zu der Oberfläche versetzt werden, während das Makromolekül an die Oberfläche gebunden bleibt, um das Makromolekül zu orientieren, und die Länge eines jeglichen Fragments des orientierten Makromoleküls, welches sich zwischen dem Molekül und dem in A angeordneten Abschnitt des Makromoleküls erstreckt, durch Vergleich mit einem Standard oder einer Kontrolle bestimmt wird.
Die Oberfläche der Erfindung ist auch geeignet zum Messen eines gewünschten Abstands zwischen zwei Stellen auf einer Oberfläche durch Anwenden der obigen Schritte und weiteres Bestimmen des gewünschten Abstands durch Vergleich mit einer bekannten Länge.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
Unterfigur 1A ist eine schematische Darstellung des Nachweises eines Pathogens in einem fluoreszierenden DNA-Molekül durch Hybridisierung mit einem Verankerungsmolekül.
Unterfigur 1B ist eine schematische Darstellung des Nachweises einer immunologischen Reaktion (ELISA) mit einem „Flag"-(Flaggen)-Molekül: hier wird fluoreszierende DNA als Reaktionsmarker verwendet. Unterfigur 1C ist eine schematische Darstellung der genetischen Kartographie oder physischen Kartierung unter Verwendung der Verlängerung von DNA und der Verwendung einer Marker-DNA.
Unterfigur 2A und Unterfigur 2B sind Fluoreszenzvideomikrophotographien, welche jeweils λ-DNA, welche an den kohäsiven Enden mit DIG markiert ist, auf einer mit anti-DIG beschichteten Oberfläche und durch den Meniskus ausgedehnt bzw. als eine Kontrolle nicht-endmarkierte λ-DNA auf einer anti-DIG-Oberfläche zeigen.
3 ist eine schematische Darstellung des Kämmens von DNA-Molekülen durch Passage eines sich bewegenden Meniskus.
4 repräsentiert ein Histogramm der gemessenen Längen einer Gesamtheit von λ-DNA-Molekülen und von dessen Multimeren nach Ligation.
5 zeigt ein Histogramm, welches die gemessenen Längen einer Gesamtheit von λ-DNA-Molekülen, erhalten durch mechanisches Versetzen einer Deckgläschen-Oberfläche S relativ zu der anderen S', repräsentiert.
BESCHREIBUNG DER BEVORZUGTEN AUSFÜHRUNGSFORMEN
Diese Erfindung entstand aus dem Wunsch des Erfinders, Verbesserungen an Oberflächen des Standes der Technik, die an hochgradig inkonsistenten Ergebnissen leiden, die durch äußerliche Wechselwirkungen zwischen deren chemischer Struktur und Substanzen, die in einem Medium, das in Kontakt mit den Oberflächen gebracht worden ist, vorhanden sind, erzeugt werden, vorzunehmen. Die Erfindung beruht auf der Herstellung und Verwendung von hochgradig spezifischen Oberflächen durch beispielsweise Eliminieren einer störenden Bindung und nicht-spezifischen Adsorption von Makromolekül(en) an die Oberfläche, die eingesetzt werden können, um Makromolekül(e) zu immobilisieren für deren Zählung, Längenmessung, Untersuchung von deren Merkmalen und deren Beziehung oder von Fragmenten davon zu vizinalen Segmenten und für eine Verwendung bei der Herstellung von „sequence ready"-Karten, einer genetischen Analyse von individuellen Molekülen, diagnostischen und prognostischen Tests. Die resultierenden Oberflächen führen zu verbesserten Oberflächen mit einem sehr begrenzten Hintergrundrauschen.
Insbesondere betrifft die Erfindung eine hochgradig spezifische Oberfläche, die für das Binden von Makromolekülen geeignet ist, beispielsweise für eine Verwendung in biologischen Reaktionen. Die Oberfläche der Erfindung umfasst vorzugsweise mindestens eine Schicht einer organischen Verbindung, welche eine freiliegende oder reaktive Gruppe mit einer Affinität für einen Abschnitt oder eine Stelle, insbesondere ein Ende oder einen Endabschnitt eines Makromoleküls, z. B. eines biologisch aktiven Moleküls aufweist. Die reaktive Gruppe der Oberfläche kann gegebenenfalls chemisch modifiziert sein, um eine jegliche reaktive Gruppe oder Gruppierung an dem Makromolekül zu binden. Die verbleibenden Elemente der Schicht bieten sehr wenig Möglichkeiten für das Binden einer jeglichen Art oder weisen unter Standardreaktionsbedingungen des bzw. der Makromolekül(e) mit der oder den freiliegenden oder reaktiven Gruppe(n) im Wesentlichen keine Affinität für die Makromoleküle auf.
Die folgenden Begriffe werden so definiert, wie sie im Kontext der Erfindung innerhalb dieser gesamten Patentschrift interpretiert werden. „Affinität" bezieht sich auf entweder chemische Reaktivität oder Absorption einer bestimmten Art für jegliche Moleküle oder Makromoleküle, die an die freiliegende Gruppe oder Gruppierung der Oberfläche, ob modifiziert oder nicht, gebunden werden. Die Begriffe „Fixierung", „Verankerung" und „Bindung" haben im Wesentlichen die gleiche Bedeutung und sollen so verstanden werden, dass sie die Anheftung eines Moleküls, Makromoleküls, eines Abschnitts davon oder einer Gruppe oder Gruppierung an eine andere Gruppe oder Gruppierung, ein anderes Molekül oder Makromolekül oder Fragment davon, eine Oberfläche, einen Träger oder ein Substrat bezeichnen. Die Begriffe „Kämmen, Ausrichten, Ausdehnen, Orientieren und Geraderichten" werden in vielen Fällen gegeneinander austauschbar verwendet und bezeichnen die Ausdehnung eines Makromoleküls oder Polymers von einer zufälligen oder gegebenen Konformation in Lösung zu einer ausgerichteten, linearen und räumlich orientierten Konformation. „Träger oder Substrat" bezeichnet entweder einen festen Träger oder ein festes Substrat oder einen/eines, der/das gebildet wird durch ein nicht-festes Element, wie eine Flüssigkeit oder ein Gasteilchen, welche eine kompakte Schicht aufweisen oder dadurch bedeckt werden. Eine „kompakte" Oberfläche ist eine, die im Wesentlichen verhindert, dass das Makromolekül Zugang erhält zu (einer) jeglichen inneren Schicht(en) und/oder dem Träger, um nicht-spezifische Wechselwirkungen zu minimieren. Selbstverständlich sollte diese Unzugänglichkeit die Bedingungen, unter welchen die Bindung des Makromoleküls auftritt, berücksichtigen. Unter den Oberflächen der Erfindung bevorzugt sind jene, welche eine oder mehrere freiliegende Gruppe(n), wie ungesättigte Bindungen, z. B. eine oder mehrere Doppelbindung(en) -CH=CH₂, aufweisen. Diese ungesättigten Bindungen können in andere Gruppierungen, wie -CHO, -COOH, -NH₂ und -OH, umgewandelt werden oder sie können als solche verwendet werden. Andere reaktive Gruppen, die für eine Verwendung hier geeignet sind, sind jene, die beispielsweise in verzweigten oder dendritischen Polymeren, Kohlenwasserstoffen und Fluorkohlenwasserstoffen gefunden werden. Jene werden nachfolgend detaillierter aufgeführt werden. Das Einbringen von anderen reaktiven Gruppen oder Gruppierungen, wie jene, welche Sauerstoff und Chlor umfassen, zusätzlich zu der reaktiven Gruppe oder Gruppierung(en) in die Oberflächenschicht muss im Allgemeinen vermieden werden, da sie unerwünschte nicht-spezifische Wechselwirkungen und eine störende Absorption einführen können. Die Oberflächen der Erfindung können durch verschiedene Verfahren erhalten werden. Beispiele sind Oberflächen, die aus einer Schicht eines karbonisierten Polymers, vorzugsweise verzweigt, welche mindestens etwa 10 Nanometer (nm) dick ist, welche eine Klasse von reaktiven Gruppen, wie jene, die nachfolgend definiert werden, aufweist, wobei der Rest der Schicht im Wesentlichen allesamt kohlenwasserstoffhaltige- oder fluorkohlenwasserstoffhaltige Gruppen umfasst, Oberflächen, die erhalten werden durch Ablagerung oder Verankerung von einer oder mehreren molekularen Schichten, die erhalten werden durch Bilden von aufeinanderfolgenden Schichten, die durch nicht-kovalente Bindungen aneinander gebunden sind, z. B. Langmuir-Blodgett(LB)-Filme, oder durch molekulare Selbstzusammenlagerung (SAMs). Die erste Art von Oberfläche kann erhalten werden durch Polymerisation von wenigstens einem Monomer, welches auf der Oberfläche des Polymers die gewünschte freiliegende Gruppe erzeugt, durch partielle Depolymerisation der Oberfläche eines Polymers, um die freiliegende Gruppe oder Gruppierung zu erzeugen, oder durch Abscheidung des Polymers. In diesem Verfahren ist eines der Monomere vorzugsweise eine C=C-Vinylgruppe, wobei das gebildete Polymer beispielsweise ein Polyolefin oder ein Polyen-Derivat ist. Beispiele sind Oberflächen des synthetischen Kautschuk-Typs, wie Polybutadien, Polyisopren oder Naturkautschuk. Die hochgradig spezifische Oberfläche des zweiten Typs, die z. B. für biologische Reaktionen eingesetzt wird, wird im Allgemeinen konstruiert, indem an einer länglichen Struktur oder einem länglichen Substrat eine im Wesentlichen monomolekulare und kompakte Schicht einer organischen Verbindung bereitgestellt wird, welche mindestens eine Fixierungs- oder Verankerungsgruppe oder -gruppierung mit einer Affinität für die Oberfläche oder den Träger oder das Substrat und eine freiliegende oder reaktive Gruppe oder Gruppierung mit im Wesentlichen keiner oder wenig Affinität für den Träger und die Fixierungsgruppe unter Bedingungen, die für eine Bindung des Moleküls an das Substrat effektiv sind, aufweist. Die freiliegende oder reaktive Gruppierung stellt für sich oder nach chemischer Modifizierung nach Fixierung Affinität bereit oder bindet das Makromolekül. Bevorzugte Schichten sind kompakte Schichten, die mit organischen Monomeren oder Verbindungen erhalten werden, die von der bzw. den freiliegenden oder reaktiven Gruppe (n) verschieden sind und zu einer seitlichen Reaktion miteinander unter Erzeugung von quer verlaufenden Bindungen oder Vernetzung in der Lage sind. Solche kompakten Schichten machen den Träger im Wesentlichen unzugänglich für Makromoleküle oder Moleküle in einem Medium, das auf die Oberfläche aufgetragen wird, und eliminieren dementsprechend im Wesentlichen störende Reaktionen. Die organischen Verbindungen weisen vorzugsweise eine Fixierungs- oder Verankerungsgruppe oder -gruppierung an einer Spitze oder einem Ende und eine freiliegende oder reaktive Gruppe oder Gruppierung an einer anderen Position des Moleküls, z. B. der anderen Spitze oder dem anderen Ende, auf. Andere vorhersehbare Ausführungsformen werden hier auch mit in Betracht gezogen, in welchen die Fixierungsgruppe beispielsweise in der Mitte der organischen Verbindung lokalisiert ist und an jedem Ende jeweils freiliegende Gruppen aufweist. Um störende Reaktionen mit den organischen Verbindungen anders als mit deren freiliegender oder reaktiver Gruppe oder Gruppierung zu vermeiden, ist es bevorzugt, organische Verbindungen mit relativ inerten freiliegenden und Fixierungsgruppen zu verwenden. Beispielsweise können gesättigte Ketten, wie Paraffine, verwendet werden.
Die Oberfläche(n) der Erfindung kann bzw. können gekennzeichnet sein gemäß (a) dem Träger oder Substrat, (b) dem an dem Träger bereitgestellten Molekül, welches freiliegende oder reaktive Gruppen und Fixierungs- oder Verankerungsgruppen aufweist, und (c) der Wechselwirkung zwischen dem Träger und dem Fixierungsgruppen-Molekül. In einer Ausführungsform ist die Bindung nicht-kovalent, insbesondere vom hydrophilen-hydrophilen oder hydrophoben-hydrophoben Typ, wie dies in den Langmuir-Blodgett(LB)-Filmen der Fall ist (K. B. Blodgett, J. Am. Chem. Soc. 57, 1007 (1935)). Bei diesen Typen von Oberfläche(n) ist die freiliegende oder Bindungsgruppe entweder hydrophil oder hydrophob, insbesondere eine Alkyloxy-, Alkyl- oder Halogenalkylgruppe, wie CH₃, CF₃, CHF₃, CH₂F, und die andere Gruppe (die Fixierungs- oder Verankerungsgruppe) ist hydrophil. Die Bindung kann auch kovalent sein, in welchem Falle die Bindungsgruppe im Allgemeinen chemisch mit dem Träger reagieren wird. Besonders bevorzugte Bindungsgruppen umfassen Silane, Chlorsilane, Silanole, Ethoxysilane, Methoxysilane, Silazane, Phosphate, Hydroxyle, Hydrazide, Hydrazine, Amine, Amide, Diazonione, Pyridine, Sulfate, Sulfone, Carboxylate, Borone, Halogene, Acylhalogenoide, Aldehyde, Thiole. Spezieller ist es bevorzugt, Bindungsgruppen zu verwenden, die in einer quer verlaufenden Weise mit einer äquivalenten Nachbargruppe reagieren können, um quer verlaufende Bindungen bereitzustellen, z. B. Silan und mehr bevorzugt Dichlorsilan, Trichlorsilan, Dimethoxysilan, Trimethoxysilan, Diethoxysilan und Triethoxysilan. Die quer verlaufende Bindung oder Vernetzung kann auch an verschiedenen Stellen quer durch die Dicke der Schicht erzielt werden, indem die Einzelschicht mit reaktiven Gruppen, die gegebenenfalls an der Kette zwischen der Bindungsstelle und der freiliegenden Gruppe vorhanden sind, polymerisiert wird. Dementsprechend ermöglichen die bifunktionellen und trifunktionellen Fixierungsgruppe-Moleküle eine eindimensionale und zweidimensionale Polymerisation der Schicht. Die Art von Bindungsgruppen, die eingesetzt wird, wird, wie dies im Stand der Technik bekannt ist, auch von der Natur des Trägers abhängen. Gruppen vom Silan-Typ sind für eine kovalente Bindung an Glas und Siliciumdioxid gut angepasst. Die freiliegenden Gruppen werden unabhängig von der Oberfläche vorzugsweise unter vinylischen oder aromatischen Radikalen, tertiären oder sekundären Aminen, Estern, Nitrilen, Aldehyden oder Halogenen ausgewählt. Besonders bevorzugt sind Vinylgruppen. Vinylgruppen können nach dem Binden chemisch modifiziert werden, um beispielsweise Methoxyl- oder Carboxylgruppen oder Derivate davon, wie Alkohole, Aldehyde, Ketone, Säuren, primäre und sekundäre oder tertiäre Amine zu ergeben. Die Ketten, welche die freiliegende Gruppe an die Fixierungsgruppe binden, sind vorzugsweise Ketten, welche wenigstens 1 Kohlenstoffatom, vorzugsweise mehr als etwa 6 und im Allgemeinen zwischen etwa 3 und etwa 30 Kohlenstoffatome tragen. Dementsprechend sind es, sogar wenn das Substrat nicht vollständig bedeckt wird, hauptsächlich inerte Gruppen, nicht das Substrat, die freiliegend präsentiert werden. Sowohl in diesem Falle als auch wenn es eine seitliche Kopplung oder Vernetzung innerhalb der Schicht, unabhängig davon, ob ionisch oder kovalent, gibt, werden durch selbsttätige Zusammenlagerung hochgradig organisierte Schichten erhalten, sogar wenn die anfängliche Oberfläche nur eine verringerte Anzahl von aktiven Verankerungsstellen verglichen zu der Anzahl von Molekülen, die in einer kompakten Schicht erhalten werden, aufweist.
Der Träger oder das Substrat können aus jeglichen und allen Arten von festem Material hergestellt sein, bevorzugt sind aber Glas, Siliciumdioxid, andere Polymere (natürlich und synthetisch) und Gold, mit oder ohne Vorbehandlung der Oberfläche. Wenn Glas oder Siliciumdioxid verwendet werden, ist die Verwendung von bekannten Techniken zur Oberflächenfunktionalisierung mit Silan-Derivaten bevorzugt, wie beispielsweise eine, welche die folgende Reaktion umfasst: Si-OH + Cl₃-Si-R-CH=CH₂ ergibt Si-O-Si-R-CH=CH₂, worin R beispielsweise (CH₂)₄ ist. Die Reaktion kann mit reinen Lösemitteln ausgeführt werden und führt zu einer Anzahl von Molekülen mit einem C=C-Ende, welches auf der Außenseite der Oberfläche freiliegend präsentiert wird. Der Begriff Träger oder Substrat soll nicht nur einteilige feste Träger umfassen, sondern auch Teilchen, wie Siliciumdioxid-Pulver und polymere Körnchen, wie auch andere Substratformen, wie Fasern oder strukturierte Träger, die magnetisch, fluoreszierend oder gefärbt gemacht werden können, wie dies aufgrund von verschiedenen Messtechniken bekannt ist. Der Träger wird vorzugsweise so ausgewählt, dass er im Wesentlichen nicht fluoreszierend ist, wenn der Nachweis unter Verwendung von Fluoreszenz erfolgt. Die durch die oben beschriebenen Verfahren (A) und (B) erhaltenen Oberflächen zeigen eine bedeutende Spezifität, die erhalten wird aufgrund von (I) dem Vorhandensein von spezifischen reaktiven Stellen, die entweder ausgehend von freiliegenden Gruppen oder von dem fixierten Molekül erhalten werden, (ii) einer sehr geringen Rate von nicht-spezifischen Wechselwirkungen, die durch das Fehlen von störenden Bindungen (kovalente Bindung, schwache Bindung vom Absorptionstyp oder hydrophobe Bindung) bewirkt wird (im Handel erhältliche Oberflächen, wie Nunc^® und Costar^®, weisen zahlreiche nicht-spezifische Wechselwirkungsstellen auf; Makromoleküle, wie DNA, können in unerwünschter Weise an einer Mehrzahl von Stellen verankert werden, wohingegen an den erfindungsgemäßen Oberflächen die Makromoleküle nur durch deren Enden verankert werden), (iii) einer sehr geringen eigenen Fluoreszenzrate, wenn benötigt, und einem Fluoreszenz-Hintergrundrauschen, das schwächer als das Fluoreszenzsignal des einzelnen nachzuweisenden Moleküls ist, (iv) der Möglichkeit, isolierte Moleküle mit einem Signal-Rausch-Verhältnis (SRV) unabhängig von der Anzahl von Molekülen nachzuweisen unter Verwendung von verschiedenen Techniken, die nachfolgend beschrieben werden. Diese basieren zumeist auf der Identifizierung des Vorhandenseins eines makroskopischen Markers mit einer schwachen nicht-spezifischen Wechselwirkung mit der Oberfläche.
Die so erhaltenen Oberflächen sind vorzugsweise des Weiteren gebunden an oder beschichtet mit einem oder mehreren biologisch aktiven Molekül(en), wie Proteinen, Nukleinsäuren, Lipiden oder Polysacchariden und Derivaten davon. Beispiele von Proteinen sind Antigene, Antikörper, Liganden, Zellrezeptoren, Enzyme, Transmitter, Produkte, wie Avidin oder Streptavidin, und Derivate davon. Beispiele von Nukleinsäuren sind RNAs und DNAs wie auch die α-, β- und Thiol-Derivate von diesen Verbindungen und gemischte Verbindungen, wie die PNAs. Es ist auch möglich, gemischte Verbindungen, wie Glycopeptide und Liposaccharide oder andere Substanzen, wie Viren und Zellen, oder chemische Verbindungen, wie Biotin, zu binden. Die biologischen Moleküle können kovalent oder nicht-kovalent an die Oberfläche gebunden werden, wie durch Absorption, Ausbildung von Wasserstoffbrückenbindungen, hydrophobe Wechselwirkungen und/oder ionische Wechselwirkungen. Es ist möglich, die gebundenen Moleküle zu vernetzen, z. B. biologisch gepfropfte Moleküle, durch bekannte Techniken, um deren Kohäsion zu verstärken („Chemistry of Protein Conjugation and Cross-linking", S. C. Wong, CRC Press, 1991). Wie zuvor erwähnt, ist es möglich, eine freiliegende oder reaktive Gruppe an der Oberfläche zu haben, die direkt mit dem oder den Molekül(en) reagiert. Die freiliegende Gruppe kann jedoch auch behandelt werden, nachdem sie an das Substrat gebunden worden ist, und zu einem Hydroxyl, Amin, Alkohol, Thiol, Aldehyd, Keton oder -COOH umgewandelt werden, bevor das Molekül daran angeheftet wird. Ist die Oberfläche einmal mit einer oder mehreren derartigen freiliegenden Gruppe(n) versehen worden, können die Makromoleküle, z. B. Polymere allgemein, Proteine, RNA und/oder DNA, daran gebunden werden durch Techniken, die in diesem Fachgebiet bekannt sind. Diese Reaktionen werden im Allgemeinen an Oberflächen ausgeführt, die bereits für biologische Analysen verwendet werden, insbesondere Costar^®- oder Nunc^®-Oberflächen, oder Mikrokörnchen, wie beispielsweise Estapor^®, Bangs^® und Dynal^®, an welchen Makromoleküle, insbesondere biologisch nützliche Moleküle, wie DNA, RNA, PNA, Proteine und Antikörper, verankert werden.
Die Oberflächen der Erfindung sind reaktiv gegenüber nicht-ionisierten Säuren, wie Säuren, welche die COOH- und PO₃H₂-Gruppierungen enthalten, wohingegen sie gegenüber deren jeweiligen anionischen Spezies im Wesentlichen nicht reaktiv sind. Diese besondere Eigenschaft erlaubt die Verankerung von Nukleinsäuren oder Proteinen innerhalb eines definierten pH-Bereichs, wobei oftmals die Reaktionsgeschwindigkeit durch den pH zudem leicht gesteuert wird. Daher kann die Verankerungsreaktion beispielsweise innerhalb von Sekunden (wenn sie nicht durch Diffusion begrenzt wird) für ein Makromolekül, wie DNA, das in einem Medium A bei pH 5,5 vorhanden ist, vorgenommen werden. In einigen Fällen kann es jedoch zu bevorzugen sein, zuzulassen, dass die Reaktion für längere Zeitspannen (2 h) fortschreitet. In einem pH 8,0-Medium führt die gleiche Reaktion jedoch zu einer sehr schwachen Verankerung. Dieser pH-abhängige Verankerungseffekt stellt eine beträchtliche Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik dar, insbesondere verglichen mit anderen Oberflächen, die die Vorbehandlung oder Funktionalisierung des Makromoleküls für ein Binden an die Oberfläche erfordern. In dem Falle von DNA beispielsweise durch Addition von Biotin, DIG, NHS und dergleichen oder anderen spezifischeren Reaktanten, wie Carbodiimid, Dimethylpimelidat und dergleichen, die eine Peptid- oder Phosphorimid-Bindung zwischen -NH₂ und -COOH oder POOH erzeugen können.
Die Oberflächen, welche C=C und andere Moleküle und Makromoleküle bindende Einheiten umfassen, können für die direkte Verankerung von Molekülen, z. B. Proteinen, wie Protein A, anti-DIG, Antikörpern, Streptavidin u. s. w., verwendet werden. Die Aktivität des Moleküls kann bewahrt bleiben, während die Oberfläche, die ursprünglich C=C-Gruppen enthielt, so modifiziert wird, dass sie selektiv ein jegliches Makromolekül von Interesse bindet. Es ist dementsprechend möglich, von einer Oberfläche mit relativ breiter Reaktivität zu einer mit hochgradig spezifischer Reaktivität, die selektiv Makromoleküle mit einer Affinität für spezielle Stellen eines Proteins bindet, zu wechseln. Durch Aufpfropfen eines spezifischen Antikörpers, wie beispielsweise anti-DIG, auf die Oberfläche, weist eine Oberfläche, die ursprünglich eine begrenzte Reaktivität gegenüber dem Antigen (DIG) aufgewiesen hatte, jetzt eine selektive Affinität dafür auf, da die anfänglichen chemischen Gruppen durch die aufgepfropften Antikörper inaktiv gemacht worden sind. Es ist auch möglich, auf die ursprünglichen reaktiven Oberflächen entweder chemisch oder biochemisch andere biologische Moleküle, wie Viren, oder andere Komponenten, wie Membranen, Membranrezeptoren, Polysaccharide und PNAs, aufzupfropfen. Es ist auch möglich, das Produkt einer biologischen Reaktion (wie PCR) an die vorbereiteten Oberflächen zu binden und dadurch zu bestimmen, ob die Reaktion aufgetreten ist oder nicht, oder das Ausmaß, bis zu welchem sie erfolgt ist, zu bestimmen, wie durch Bestimmen der Anzahl von erzeugten Produktmolekülen.
Die Erfindung betrifft so hochgradig spezifische Oberflächen für Anwendungen für Kits und Assays, wie qualitative und quantitative Assays auf Makromoleküle, biologische Reaktionen und dergleichen. Die Oberfläche der Erfindung umfasst eine im Wesentlichen kompakte Schicht einer organischen Verbindung mit einer länglichen Struktur, die gegebenenfalls auf einem Träger angeheftet ist, wobei die Schicht mindestens eine Fixierungs- oder Verankerungsgruppe(n) für das Binden an einen Träger und eine freiliegende oder reaktive Gruppe oder Gruppierung mit einer geringen oder im Wesentlichen keiner Affinität für den Träger und die Bindungs- oder Verankerungsgruppe unter Bedingungen, die für das Binden der letztgenannten zwei an einander wirksam sind, aufweist, wobei die reaktive Gruppe in der Lage ist, insbesondere nach nachfolgender chemischer Modifizierung, Moleküle, wie biologische Moleküle oder Moleküle, welche selektiv Makromoleküle binden, zu binden.
Die Erfindung betrifft auch Anwendungen der Oberflächen der Erfindung für den Nachweis von isolierten Makromolekülen mit spezifischen Molekülen oder Reaktanten, insbesondere in Nachweisverfahren mit einem SRV, welches von der Anzahl von nachgewiesenen Molekülen unabhängig ist.
Die Erfindung betrifft auch ein reproduzierbares Verfahren zum Orientieren, Ausrichten, Geraderichten oder Ausdehnen eines Makromoleküls auf einer Oberfläche, welches umfasst, ein Makromolekül in Kontakt mit einer Oberfläche S und einem Medium A zu bringen, so dass eine Stelle des Makromoleküls an S gebunden wird und ein Abschnitt davon in A angeordnet ist; und die Bestandteile von A relativ zu S unter Bedingungen, die wirksam sind, das Makromolekül zu orientieren, auszurichten, geradezurichten oder auszudehnen, mechanisch zu versetzen. Das Verfahren der Erfindung ist einfach und neu und in einer von ihren Ausführungsformen bewegt sie das oder die Makromolekül(e) und eine dreifache Grenzflächenlinie S/A/B, welche aus dem Kontakt von Medium oder Lösungsmittel A mit einer Oberfläche S und einem Medium B resultiert, entlang der Oberfläche S in Form eines Meniskus. Obwohl das Makromolekül in dem Medium A nicht vollständig löslich sein muss, ist in einer speziellen Ausführungsform das Makromolekül in dem Medium löslich.
Gemäß der Erfindung hat der Erfinder beobachtet, dass die einfache Passage des Meniskus über Makromoleküle, die z. B. an einem Ende auf einem Substrat verankert sind, eine Ausrichtung erlaubt, die im Wesentlichen gleichförmig ist, und in einer Richtung, die im Wesentlichen rechtwinklig zu der Bewegungsrichtung des Meniskus ist, was die Moleküle hinter dem Meniskus „gekämmt", getrocknet und an die Oberfläche absorbiert zurücklässt. Als eine Fluoreszenzvideomikrographie aufgenommen wurde, zeigte sie die Ausdehnung von Phage λ-DNA durch die Bewegung des Meniskus (Bild nicht gezeigt). Links sah man DNA-Moleküle noch in Lösung, bevor sie durch den Meniskus gekämmt und ausgedehnt wurden, und rechts wurden DNA-Moleküle nach Passage des Meniskus beobachtet (siehe 1, Bensimon et al., Science 265: 2096 (1994). Insbesondere findet das Ausdehnen des freien Endes des Makromoleküls (des in dem Medium A angeordneten Abschnitts) statt, während sich die dreifache Grenzflächenlinie S/A/B entlang der Oberfläche S an der Grenzfläche der Medien A und B, welches ein Gas, wie Luft und dergleichen, oder ein anderes diskontinuierliches Medium, einschließlich eines Lösemittels, sein kann, bewegt. In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung umfasst der Meniskus eine Luft/Wasser-Grenzfläche, in welcher beispielsweise das Medium A eine wässrige Lösung umfasst und das Medium B Luft umfasst. Andere Kombinationen werden selbstverständlich ebenfalls in Betracht gezogen. Es ist darüber hinaus möglich, die Verwendung des Luft/Wasser-Meniskus auf andere Systeme, wie Wasser/Öl, Wasser/grenzflächenaktives Mittel/Luft, Wasser/amphiphile Substanz/Öl und viele andere auszudehnen. Die Verlagerung des Meniskus kann bewerkstelligt werden unter Verwendung von jeglichen Mitteln für die relative Verlagerung von Medien A und/oder B in Bezug auf die Oberfläche S. Dies umfasst alle Formen von zugeführter Energie, einschließlich, aber nicht beschränkt auf thermische, elektrische, mechanische, chemische und andere Formen, die die A/B-Grenzfläche entlang der Oberfläche S verlagern werden. Insbesondere kann der Meniskus verlagert werden unter Verwendung von mechanischen Mitteln, insbesondere durch Saugen oder Blasen eines Gases oder durch Drücken oder Saugen des Mediums A und/oder B. Die Verlagerung des Meniskus kann auch durch fortschreitende Verdampfung des Mediums A erzielt werden. Wenn die Verlagerung des Meniskus durch mechanische Mittel vorgenommen wird, kann dies durch die Versetzung von entweder der A/B-Grenzfläche oder der Oberfläche S erzielt werden.
In einer besonderen Ausführungsform der Erfindung ist das Medium A zwischen zwei Oberflächen S und S', die Teil von Trägern oder Substraten sein können, angeordnet und der Meniskus kann entweder durch Verdampfen oder durch Bewegen von einer von diesen Oberflächen in Bezug auf die andere oder von beiden verlagert werden. Der Begriff Träger, wie hier verwendet, bezeichnet ein jegliches Substrat, das eine Kohäsion aufweist, die ausreichend oder wirksam ist, um der Passage des Meniskus zu widerstehen. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung können auch Spannungsveränderungen oder Veränderungen des elektrischen Potentials zu der Bewegung oder Steuerung eines Mediums, wie eines Fluids, führen. Dementsprechend ist ein elektrisches Mittel eine der am meisten bevorzugten Ausführungsformen für das Versetzen der Grenzfläche, beispielsweise auf einem „Biochip" oder in einem Mikroanalyselabor-Chip, wie einem, der aus Silicium hergestellt ist, oder einem vom Mikro- oder Nano-Typ. Es ist beobachtet worden, dass gemäß der Erfindung die Ausdehnungskraft örtlich in der unmittelbaren Nachbarschaft des Meniskus wirkt. Diese Kraft ist im Allgemeinen unabhängig von der Länge des Makromoleküls oder der Anzahl von verankerten Makromolekülen und in einem breiten Bereich von der Geschwindigkeit des Meniskus. Diese Merkmale sind besonders effektiv und wichtig und führen zu der Ausrichtung der Makromoleküle in einer homogenen, reproduzierbaren und quantitativen Weise. Die Erfindung ermöglicht die Herstellung von Oberflächen und Substraten, anderen Konstruktionen und Vorrichtungen, welche auf ihren Oberflächen orientierte Makromoleküle präsentieren. Ein(e) solche(s) Oberfläche, Substrat, Konstruktion oder Vorrichtung kann beispielsweise Anwendungen in der Elektronik oder Optik, als Biosensoren oder Biochips, die basierend auf ihren elektrischen oder Photonen-Eigenschaften für Messungen eingesetzt werden, finden. Eine uniaxiale Orientierung kann am besten durch einen uniaxialen Mechanismus, z. B. Versetzung, erzielt werden, wohingegen eine Verdampfung typischerweise zu einer breiteren oder weiteren und zufälligeren Verteilung von orientierten Molekülen führt.
Es ist möglich, die Qualität oder das Ausmaß der Ausdehnung oder des Kämmens der Makromoleküle zu steuern, indem beispielsweise mehr als ein unterschiedlicher Parameter, einschließlich (i) die Wechselwirkungen zwischen den Makromolekülen und der Oberfläche und (ii) die örtliche Wirkung des Meniskus auf die Makromoleküle, verwendet wird. Dementsprechend wird die Ausdehnungskraft im Allgemeinen erhöht, wenn die Wechselwirkungsenergie zwischen dem Makromolekül und der Oberfläche hoch ist. In dem Falle einer hydrophilen oder benetzende Oberfläche, z. B. einer, welche anti-DIG daran gebunden aufweist, ist diese Wechselwirkungsenergie im Allgemeinen gering und dementsprechend ist die Ausdehnungskraft an dem DNA-Molekül nicht hoch. In einer Ausführungsform der Erfindung wird die Stärke der Ausdehnungskraft freiwillig begrenzt, um das Brechen des Makromoleküls oder das Brechen von dessen Bindungen mit der Oberfläche zu vermeiden. Veränderungen in der Hydrophobizität/Hydrophilie der Oberfläche führen dementsprechend im Allgemeinen zu definierten Veränderungen bei dem Ausmaß des Kämmens oder Ausdehnens eines Makromoleküls. In einer Ausführungsform der Erfindung werden Modifizierungen an den Oberflächengruppierungen und/oder den daran gebundenen Molekülen vorgenommen, welche vorab festgelegte Veränderungen in dem Ausmaß des Ausdehnens für verschiedene Makromoleküle bewirken. Es ist auch möglich, eine ähnliche Wirkung gemäß der Erfindung zu erzielen, indem grenzflächenaktive Verbindungen, amphiphile Moleküle, Polymere und Copolymere, z. B. Blockcopolymere, und/oder andere asymmetrische Substanzen in das Medium A und/oder B hinzugegeben werden, um die Eigenschaften der Grenzfläche zu modifizieren, was wiederum auch das Ausmaß der Ausdehnung eines Makromoleküls modifizieren wird. Dementsprechend kann das Ausmaß der Ausdehnung eines Makromoleküls variiert werden entweder durch die Zugabe von amphiphilen Substanzen, z. B. grenzflächenaktiven Mitteln, zu dem Medium oder durch eine geeignete Oberflächenbehandlung. Dementsprechend führt das Ausdehnen von DNA in Wasser/Luft (Medien A/B) an einer hydrophoben (nicht-benetzenden Oberfläche), wie silanisiertem Glas, zu etwa 50% Ausdehnung, wohingegen ein ähnlicher Test, der an einer hydrophilen (benetzenden) Oberfläche (bedeckt mit Protein A und anti-DIG) ausgeführt wurde, zu nur 10% Ausdehnung führte (siehe Bensimon et al., Phys. Rev. Lett. 74: 4754 (1995). Eine übermäßige Oberfläche/Molekül-Anziehung (beispielsweise ein erhöhtes Adsorptionsniveau) kann für die Ausrichtung der Moleküle durch den Meniskus gemäß der Erfindung schädlich sein, da die Moleküle an die Oberfläche absorbiert bleiben könnten in einem Zustand, der nicht notwendigerweise ein länglich ausgerichteter oder gekämmter Zustand ist. Vorzugsweise weist die Oberfläche eine schwache Absorptionsrate für das Makromolekül auf, so dass nur die verankerten Moleküle gekämmt oder ausgerichtet werden, während die anderen Moleküle durch den Meniskus fortgetragen werden. Sind die Moleküle einmal ausgerichtet, haften sie stark an der Oberfläche. In dem Falle von DNA wurden sie beispielsweise mehrere Monate nach deren Ausrichtung beobachtet. Die Makromoleküle können an der Oberfläche verankert werden unter Verwendung der Techniken, die zuvor beschrieben worden sind. Ihre Bindung an die Oberfläche kann entweder kovalent oder nicht-kovalent sein abhängig davon, ob diese aus einer oder mehreren chemischen oder physikalisch-chemischen Wechselwirkung(en) resultiert. Es ist auch möglich, kommerziell erhältliche Oberflächen zu verwenden, obwohl diese im Allgemeinen eine Vorbehandlung oder Funktionalisierung der Makromoleküle, z. B. DNA, bevor diese verankert werden, erfordern. Das Verfahren der Erfindung erlaubt nicht nur, biologische Moleküle zu beobachten und/oder zu quantifizieren, sondern auch biologische Moleküle zu trennen, indem beispielsweise Kopplungstechniken, wie Antigen-Antikörper- oder DNA-RNA-Kopplung, verwendet werden. Insbesondere betrifft die Erfindung ein Verfahren zum Nachweis eines Makromoleküls, welches eine DNA-Sequenz oder ein Protein umfasst, in einer Probe, umfassend, ein Makromolekül mit einer Oberfläche S und einem Medium A in Kontakt zu bringen, so dass eine Stelle des Makromoleküls an S gebunden wird und ein Abschnitt davon in A angeordnet ist; und die Bestandteile von A relativ zu S mechanisch zu versetzen unter Bedingungen, die effektiv sind, um das Makromolekül zu orientieren, auszurichten, geradezurichten oder auszudehnen. In dem Falle von Nukleotiden kann es beispielsweise ausgeführt werden, indem eine Probe, welche dem Medium A, welches das Makromolekül umfasst, vorzugsweise in Lösung, entspricht, genommen wird und diese in Kontakt mit der Oberfläche gebracht wird unter Bedingungen, die die Bildung eines DNA-DNA-Hybrids, die Bildung eines DNA-RNA-Hybrids oder die Bildung eines Protein-Protein-Reaktionsprodukts begünstigen; das Hybrid oder Reaktionsprodukt wird dann in geeigneter Weise gefärbt, ausgedehnt oder gekämmt, z. B. durch Verlagerung eines Meniskus, der durch den Kontakt des Mediums mit der Oberfläche erzeugt wird, um den Makromolekülen eine bestimmte Orientierung zu verleihen, und die so orientierten Makromoleküle werden dann gemessen, beobachtet oder nachgewiesen.
Die Passage des Meniskus, der die Moleküle in Form von kleinen Stäbchen linear ausdehnt, macht diese leichter nachweisbar, wenn sie (beispielsweise fluoreszierend) gefärbt werden. Da die markierten Makromoleküle ein korrelierbares Signal, das durch ihre Ausdehnung eine gleichförmige Orientierung aufweist, aufweisen, sind sie vom Hintergrundrauschen effektiv unterscheidbar. Es ist dementsprechend leicht, das Vorhandensein von Staub und nicht-homogenen Elementen, die keine besondere räumliche Korrelation aufweisen, zu verwerfen. Die Fähigkeit, Makromoleküle ausrichten zu können, ist von extremer Bedeutung, da agglomerierte Moleküle, die in einem Medium angeordnet sind, im Allgemeinen von einem thermischen Blickpunkt aus gesehen fluktuieren, was zu signifikanten Variationen bei dem resultierenden Fluoreszenzsignal führt und deren Beobachtung und quantitative Bestimmung begrenzt. Die Erfindung ermöglicht die Beobachtung von isolierten Molekülen mit einem verbesserten SRV. Ausgedehnte Makromoleküle können durch verschiedene enzymatische Verfahren oder andere Verfahren, wie Fluoreszenz oder die Verwendung von „warmen" oder „kalten" Sonden, sichtbar gemacht werden. Ihr Nachweis kann erzielt werden, indem ein Gesamtsignal, z. B. gesamte Fluoreszenz, gemessen wird, oder durch individuelle Beobachtung der Makromoleküle durch optische Fluoreszenzmikroskopie, Elektronenmikroskopie oder Verfahren unter Verwendung von Abtast- oder Scanningsonden, wie Raster-Tunnel-Mikroskopie (RTM), Rasterkraftmikroskopie (AFM; „Atomic Force Microscopy") oder optische Nahfeld-Rastermikroskopie (NSOM; „Nearfield Scanning Optical Microscopy").
Allgemein erlaubt die Erfindung die Beobachtung, Trennung und/oder Messung einer Menge eines biologisch aktiven Makromoleküls in einer Probe durch ein Verfahren unter Verwendung einer Oberfläche, an welche ein Molekül, welches in der Lage ist, das Makromolekül der Probe zu erkennen, gebunden ist. Die Beobachtung, Trennung oder Mengenmessung kann ausgeführt werden unter Verwendung von fluoreszierenden oder nicht-fluoreszierenden Reaktanten, um das Vorhandensein von entweder dem gebundenen Molekül oder dem Makromolekül nachzuweisen. Es ist wichtig, zwischen den fluoreszierenden und den nicht-fluoreszierenden Reaktanten zu unterscheiden. Die fluoreszierenden Reaktanten enthalten fluoreszierende Moleküle, die oftmals mit einer Länge von etwa 0,1 μm oder mehr ausgewählt werden und entweder direkt oder indirekt spezifisch mit den vorbehandelten Oberflächen reagieren. Als ein nicht-einschränkendes Beispiel kann ein doppelsträngiges DNA-Molekül, das mit fluoreszierenden Sonden, wie Ethidiumbromid, YOYO-1 oder fluoreszierenden Nukleotiden gefärbt ist, direkt auf einer Oberfläche, welche C=C-Bindungen freiliegend präsentiert, oder durch Modifizierung des DNA-Moleküls (endmarkiert mit DIG, Biotin, u. s. w.) auf einer Oberfläche, welche komplementäre Proteine (anti-DIG, Streptavidin u. s. w.) daran gebunden aufweist, verankert werden. Die nicht-fluoreszierenden Reaktanten umfassen insbesondere Körnchen, die durch ein spezifisch entweder direkt oder indirekt an die vorbehandelte Oberfläche gebundenes Molekül verankert sind. Aufgrund der Behandlung der Oberflächen weisen jene Körnchen eine schwache nicht-spezifische Wechselwirkung mit der Oberfläche auf. Obwohl nicht-einschränkend, sind Beispiele Dynal^®-Körnchen, die mit Streptavidin beschichtet sind und an einem biotinylierten DNA-Molekül durch ein Ende und an einer Oberfläche, welche Stellen aufweist, die zu einer Reaktion mit dem anderen Ende des DNA-Moleküls in der Lage sind, verankert werden. Abhängig davon, ob das gesuchte Makromolekül direkt durch Fluoreszenz oder indirekt durch Verwendung der oben erwähnten Reaktanten nachgewiesen wird, kann entweder ein direkter Nachweis oder ein indirekter „Flag"-Nachweis eingesetzt werden.
Um die mit langsamen Reaktionszeiten verbundenen Probleme zu begrenzen, ist es möglich, die Diffusionszeit der Reaktanten in Richtung der Oberfläche durch Verwendung von kleinen Reaktionsvolumen zu verringern. Beispielsweise kann dies erfolgen, indem die Reaktion in einem Volumen von einigen wenigen Mikrolitern ausgeführt wird, was den Abstand zwischen zwei Oberflächen von festgelegter Fläche, von denen eine behandelt ist, so dass sie reaktive Stellen gemäß der Erfindung präsentiert, und die andere entweder inert oder behandelt ist, festlegt. Der Nachweis der Anzahl der spezifischen Reaktionen, die stattgefunden haben, kann ausgeführt werden an einer kleinen Anzahl von Molekülen, typischerweise 1 bis 100, durch einen ein geringes Grundrauschen bzw. geringe Störungen aufweisenden makroskopischen physikalischen Test, welcher weder Elektronenmikroskopie noch Radioaktivität noch eine Polymerasekettenreaktions (PCR)-Amplifizierung erfordert. Abhängig davon, welche Art von Reaktant verwendet wird, können zwei unterschiedliche Ausführungsformen der Erfindung (Ausführungsform X und Ausführungsform Y) für den ein geringes Grundrauschen bzw. geringe Störungen aufweisenden makroskopischen Nachweis der geringen Anzahl von Verankerungsreaktionen verwendet werden. In der Ausführungsform X wird ein Test der Anzahl von spezifischen Reaktionen, die stattgefunden haben, direkt erhalten durch eine Fluoreszenztechnik, die es für bestimmte Ausführungsformen der Erfindung erlaubt, individuell die Anzahl von Stellen, die reagiert haben, zu identifizieren. In diesem Falle wird die Oberfläche insbesondere so ausgewählt, dass sie eine sehr schwache Fluoreszenzrate aufweist. Insbesondere muss die Oberfläche oder der Träger eine schwache Fluoreszenz aufweisen. Hat die Verankerung des fluoreszierenden Reaktanten einmal stattgefunden, können der Nachweis und das Zählen der Anzahl von Verankerungsreaktionen erfolgen unter Verwendung eines optischen Fluoreszenzmikroskops mit einem Objektiv mit weiter numerischer Apertur, welches ermöglicht, entweder direkt mit dem bloßen Auge, oder nachdem das Signal durch einen verstärkten CCD erfasst worden ist, die Anzahl von verankerten fluoreszierenden Makromoleküle zu identifizieren, oder alternativ mit einem Photometriesystem. Insbesondere ist es möglich und bevorzugt das Beobachtungssehfeld zu bewegen, um die gesamte Oberfläche einer Probe, die oftmals größer als ein einzelnes Beobachtungssehfeld ist, auszuwerten. In der Ausführungsform Y der Erfindung wird ein makroskopischer Reaktant vom Körnchentyp nachgewiesen. Die Neuheit und fehlende Selbstverständlichkeit dieses Verfahrens steht in erster Linie in Zusammenhang mit der Verwendung von Körnchen mit einer spezifischen Reaktivität, der Verwendung von Körnchen mit einer Größe zwischen 0,1 und 200 μm, die durch eine makroskopische Technik nachgewiesen werden können, und dem Fehlen einer nicht-spezifischen Reaktion zwischen den Körnchen und der Oberfläche, das auf die Verwendung des Produkts gemäß der Erfindung zurückzuführen ist. Die Anzahl von diesen makroskopischen Körnchen, die jeweils eine Verankerung charakterisieren, kann dann durch ein makroskopsisches physikalisches Verfahren bestimmt werden, z. B. unter anderem Lichtstreuung an den Körnchen, optische Mikroskopie und/oder die Fluoreszenz der Körnchen.
Die Spezifität von bestimmten biologischen Reaktionen kann begrenzt sein. Dementsprechend können in einem Hybridisierungskontext die Hybride unperfekt sein, indem sie eine verringerte Anzahl von korrekten Paarungen und dementsprechend eine geringere Bindungsqualität aufweisen. Die Erfindung umfasst auch die mögliche Verwendung eines Testschritts, um die Qualität der erhaltenen Bindung nachzuweisen. Dieser Test ermöglicht die Dissoziation von Produkten, die in einer nicht-spezifischen Weise u. a. durch Absorption, durch hydrophobe Kräfte, durch unperfekte Wasserstoffbrückenbindungen und durch unperfekte Hybridisierung verknüpft sind. Die Erfindung erweitert auch die Anwendung eines Nachweis- oder Messverfahrens, wie desjenigen, das zuvor beschrieben worden ist, auf ein Verfahren, in welchem das Reaktionsprodukt zwischen dem Molekül und dem Makromolekül der Probe einem physischen Zwang unterworfen wird, um die schwachen Bindungen vor dem Nachweis zu zerstören. Dieses Verfahren bietet die Möglichkeit, die falsch gebundenen Paarungen zu zerstören, und die Möglichkeit, die Kopplungsprodukte zu orientieren. Dies vereinfacht die Messungen oder die Beobachtungen. In diesem Kontext ist es möglich, die Oberflächen nach dem Binden der komplementären Elemente einem Zwang, z. B. der einzelnen oder kombinierten Verwendung von entweder Zentrifugation, einem Magnetfeld, Bewegung, der Passage eines Meniskus, Elektrophorese und/oder Variation der Temperatur, zu unterwerfen, um unerwünschte Bindungen zu dissoziieren. Es ist wichtig, festzuhalten, dass aufgrund der Verwendung der Oberflächen der Erfindung es möglich ist, die Moleküle nach deren Bindung durch Passage eines Luft/Wasser-Meniskus, insbesondere auf DNA, zu orientieren.
So führt durch Anwenden des Verfahrens der Erfindung das Versetzen eines an eine Oberfläche gebundenen Makromoleküls, z. B. DNA, in Luft/Wasser-Medien zu einer regelmäßigen Ausdehnung der verankerten Moleküle. Diese bemerkenswerten und unerwarteten Beobachtungen zeigen, dass es gänzlich möglich ist, die Anzahl von Makromolekülen, wie DNA, die an einer Oberfläche verankert sind, zu zählen. Einerseits können die verwendeten Oberflächen nur geringfügig fluoreszierend sein, während ein relativ niedriges Signal-Rausch-Verhältnis (SRV) bereitgestellt wird. Andererseits ist es, da ein extrem korrelierbarer Gegenstand (in Form von Stäbchen) gesucht wird, sehr leicht, das SRV zu erhöhen. In anderen Worten ist es möglich, Staubteilchen und nicht-homogene Abschnitte, die keine besondere räumliche Korrelation aufweisen, zu ignorieren. Es ist bemerkenswert, dass das durch die Erfindung erzielte SRV unabhängig von der Anzahl von Verankerungsreaktionen ist. Das SRV bei dem Nachweis von 1 Molekül ist das gleiche, wie es dies für 10000 Moleküle ist. Darüber hinaus ermöglicht das Ausdehnungs- oder Kämmverfahren der Erfindung, leicht zwischen Molekülen mit unterschiedlichen Längen zu unterscheiden. Es ist zusätzlich möglich, Schritte, z. B. die folgenden Schritte, zu verwenden, um das Signal-Rausch-Verhältnis werter zu erhöhen: (I) da das Molekül fixiert ist, ist es möglich, sein Fluoreszenzsignal zu integrieren, (ii) die Beobachtung mit einem Mikroskop mit verringertem Feld (typischerweise 100 μm × 100 μm mit einer Flüssigkeitslinse mit N. A. 1,25). Für eine Probe von einem Quadratzentimeter ist es möglich, entweder durch Abtasten oder durch die Verwendung eines schwächeren Objektivs mit einem größeren Sehfeld vorzugehen, (iii) da die Stäbchen stets parallel sind, ist es möglich, eine räumliche Filtermethode zu verwenden, um das SRV weiter zu erhöhen, (iv) es können andere globale Fluoreszenzmethoden verwendet werden, z. B. EP-Anmeldung 103426 , (v) das Ausdehnen der Moleküle zu geraden Linien wird entweder im Kontext eines chemischen Pfropfens oder im Kontext einer immunologischen Bindung beobachtet, (vi) wird die Oberfläche einmal der Luft ausgesetzt, sind die DNA-Moleküle viele Wochen stabil und fluoreszierend. Es ist möglich, diese Eigenschaft zu verwenden, um den Verankerungsschritt von der Analyse der verankerten Moleküle zeitlich zu trennen, wenn dieser Nachweis durch Fluoreszenzmikroskopie erfolgt; (vii) es kann auch eine doppelte Fluoreszenztechnik verwendet werden, um das SRV zu verbessern oder um eine doppelte Funktionalität nachzuweisen.
Diese Erfindung stellt auch ein Instrument, ein Gerät, eine Leseapparatur oder eine speziell entworfene Vorrichtung zum Ausführen von Beobachtungen, Bestimmungen oder Messungen von orientierten Makromolekülen, die an eine Oberfläche gebunden sind, bereit. Das Instrument umfasst im Allgemeinen, ist aber nicht beschränkt auf eine oder mehrere Lichtquelle(n), Halter für eine oder mehrere Probe(n), eine optische Apparatur und einen oder mehrere Detektor(en).
Die Ausrichtungs- und Nachweistechniken, die gemäß der Erfindung beschrieben wurden, können für zahlreiche Anwendungen verwendet werden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf die Identifizierung von einem oder mehreren Sequenzierungselementen von DNA oder RNA, die in vorteilhafter Weise für die Diagnose von Pathogenen oder für die genetische Kartographie und physische Kartierung verwendet werden können; die Messung der Verteilung der Länge von ausgedehnten DNA-Fragmenten kann auch für eine genetische Kartographie und physische Kartierung, die Verbesserung der Empfindlichkeit der ELISA-Techniken mit der Möglichkeit, eine geringe Anzahl von immunologischen Reaktionen nachzuweisen, verwendet werden. Die Identifizierung von DNA/RNA-Sequenzen kann entweder (a) durch Reaktion mit komplementären Sonden (beispielsweise durch Hybridisierung) in dem Volumen der Lösung von DNA/RNA-Molekülen oder (b) durch für das gesuchte Segment spezifische Proteine erfolgen. Es sind dementsprechend zwei mögliche Vorgehensweisen oder Betriebsarten möglich.
Diese Erfindung betrifft auch einen Kit für den Nachweis des Vorhandenseins eines Moleküls von Interesse in einer Probe oder der Position eines Abschnitts eines Moleküls von Interesse innerhalb eines größeren Moleküls. Der Kit umfasst im Allgemeinen zusätzlich zu Anweisungen für dessen Verwendung eine Oberfläche, welche ein Makromolekül von Interesse durch wenigstens eine Verankerungsstelle bindet, Reagenzien, um das Molekül von Interesse entweder zu identifizieren, sichtbar zu machen oder zu verankern. Beispiele von Reagenzien sind entweder allein oder in Kombination Puffer, Sonden- oder Markermoleküle (DNA, RNA, Proteine...), fluoreszierende Färbemittel, die spezifischen Bindungsmoleküle, z. B. Komplemente zu den Makromolekülen, wie Ligand-Rezeptor, Biotin-Streptavidin, und optionale Mittel zum Ausführen einer nicht durch Verdampfung bewirkten Bewegung des Meniskus (beispielsweise mechanische Schermittel, wie eine zweite Oberfläche, die auf die in (i) beschriebene Oberfläche aufgebracht werden soll, wie zuvor beschrieben. Die Schermittel sind optional, da es möglich ist, die Probe (mit der Zeit) verdampfen zu lassen.
Angesichts der Tatsache, dass nur die an der Oberfläche verankerten Moleküle durch den Meniskus ausgedehnt werden und das Medium und die anderen Moleküle, die darin enthalten sind, durch den Meniskus fortgetragen werden, kann das Verfahren der Erfindung verwendet werden, um das Vorhandensein einer selektiven oder spezifischen Verankerung zwischen einem Molekül und der Oberfläche und folglich einer biologischen Reaktion, wie einer ELISA-Reaktion, nachzuweisen. Es ist dementsprechend möglich, fluoreszierende DNA oder andere Polymere als einen Reaktionsmarker (beispielsweise durch Koppeln der DNA an ein Element, welches eine immunologische Reaktion des ELISA-Typs erkennt) zu verwenden und um die Anzahl von Reaktionen abzuschätzen, indem die Anzahl von Molekülen, die an der Oberfläche ausgedehnt wurden, gezählt wird (die Nachweisschwelle liegt bei weniger als 1000 Reaktionen). Es ist auch möglich, die Erfindung für den Nachweis des Vorhandenseins eines Pathogens zu verwenden, beispielsweise durch die Hybridisierung von DNA an ein komplementäres Oligonukleotid, welches in der Lage ist, spezifisch an einer Oberfläche verankert zu werden, und dann Zählen der DNA-Moleküle, die an der Oberfläche ausgedehnt wurden. Wie für eine molekulare Kartographie oder physische Kartierung kann das Ausdehnen eines Moleküls auch verwendet werden, um ein gegebenes Muster entlang dieses Moleküls nachzuweisen, beispielsweise wie dies bei einer genetischen Kartographie erfolgt. Beispielsweise kann eine Marker-DNA, welche etwa 3000 Basenpaare und ein einzelsträngiges Ende, welches zu dem Gen, nach welchem entlang des Moleküls gesucht ist, komplementär ist, aufweist, mit einem fluoreszierenden Marker A gefärbt werden. Diese Marker-DNA kann dann mit einer einzelsträngigen DNA aus dem Molekül, von welchem eine Kartographie benötigt wird, hybridisiert werden und der erhaltene Komplex wird dann mit einer zweiten fluoreszierenden Substanz B gefärbt (nach einer „random priming"-Reaktion (Oligolabeling-Reaktion), um das Hybrid in doppelsträngige DNA umzuwandeln). Der Komplex kann dann durch eines seiner Enden verankert werden und durch die Wirkung des Meniskus ausgedehnt werden. Der Abstand zwischen dem Ende des Moleküls und der Position des Markers, der mittels doppelter Fluoreszenzmikroskopie (zwei Farben A und B) beobachtet werden kann, macht es möglich, die Position des Gens, nach welchem gesucht wird, mit einer Genauigkeit in der Größenordnung von 1000 bp zu ermitteln. Eine andere Möglichkeit besteht darin, die Techniken von FISH und DIRVISH (I. Parra und B. Windle, Nature Genetics 5: 17 (1993)) zu verwenden, um die physische Kartierung oder Kartographie an bereits ausgedehnten Molekülen auszuführen. Da jedoch die Kraft, die der Meniskus auf ein DNA-Molekül oder Polymer ausübt, ausreichend ist, um dieses über seine natürliche oder kristallographische Länge hinaus auszudehnen, ist es erforderlich, die an einer Oberfläche gemessenen Abstände zu kalibrieren (siehe beispielsweise 2 von A. Bensimon et al., Science 265: 2096 (1994). Wenn beispielsweise die natürliche Länge eines Moleküls l_o (3,3 Angstrom/bp) 16,1 μm im Falle von λ-DNA ist, ist dann, wenn der Peak des Histogramms von gemessenen Längen der Population von λ-DNA zu l_p = 24 μm gemessen wurde, die relative Ausdehnung aufgrund der Passage des Meniskus l_p/l_o = 24/16,1 = 1,49 oder eine relative Ausdehnung von 49%. Dementsprechend müssen alle Abstandsmessungen, die typischerweise über auf Fluoreszenz basierende Mikroskopie erfolgen, wie in den obigen und nachfolgenden Beispielen erwähnt, für diesen relativen Ausdehnungsfaktor korrigiert werden, bevor jegliche wahren oder genauen Abstands- oder Positionsbestimmungen gemacht werden können. Es ist oftmals wünschenswert, Durchschnittswerte von Messungen zu errechnen und Signale zu integrieren, um Beobachtungen genauer zu quantifizieren. Peaks von Histogrammen geben oftmals den Modus einer Verteilung, der bei Messungen und Quantifizierung nützlich ist, vor. Dies kann speziell bewerkstelligt werden durch direkte oder indirekte Kalibrierung. Bei dem indirekten Modus wird eine von einer Charge von äquivalenten Oberflächen für den relativen Ausdehnungsfaktor kalibriert und wird dann für alle Oberflächen der Charge verwendet und angewendet. Die Gefahr bei diesem Ansatz besteht darin, dass beobachtet worden ist, zumindest im Falle von silanisierten Oberflächen, dass es von Oberfläche zu Oberfläche Schwankungen in dem Ausdehnungsausmaß geben kann, was zu einer Fehlerquelle bei Abstands- oder Positionsbestimmungen werden würde. Bei dem direkten Modus kann eine geringe Menge eines bekannten gefärbten Moleküls von Standardlänge (z. B. λ-DNA, ein großes Fragment davon oder ein Marker) zu dem an einer Oberfläche zu testenden Aliquot hinzugegeben werden. Nach Kämmen wird die relative Ausdehnung der Population von Standardlängen-DNA gemessen, um den exakten relativen Ausdehnungsfaktor für diese Oberfläche und diese Bedingungen der Meniskuspassage zu bestimmen, und dieser Faktor wird nur für Abstands- oder Positionsbestimmungen an jener Oberfläche verwendet. Dies erhöht die Arbeitsbelastung, verringert aber die Fehlerquellen.
Diese Erfindung betrifft auch eine Oberfläche und ein Substrat, Konstrukt oder eine Vorrichtung, welche mit wenigstens einer Oberfläche ausgestattet sind, wobei die Oberfläche daran gebunden ein ausgerichtetes Makromolekül aufweist, das durch das oben beschriebene Ausdehnungsverfahren erhalten worden ist. Insbesondere ist es möglich, Oberflächen mit elektrischen oder optischen Eigenschaften zu erhalten, so wie sie in „Biochips", Biosensoren oder mikroanalytischen Laboratorien in Vorrichtungen vom Silicium-Typ von Nanoherstellung und Lithographie verwendet werden können. Die folgende Beschreibung erfolgt in Bezug auf die beigefügten Zeichnungen, in denen die Unterfigur 1A eine schematische Darstellung des Nachweises eines Pathogens in einem fluoreszierenden DNA-Molekül durch Hybridisierung mit einem verankerten Molekül ist. Diese Unterfigur zeigt eine fluoreszierende DNA 1, eine komplementäre Sequenz 2, ein verankertes Molekül 3, ein DIG-Antigen 4, einen anti-DIG- Antikörper 5, ein Substrat 6 und eine Oberfläche 12; die Unterfigur 1B ist eine schematische Darstellung des Nachweises einer immunologischen Reaktion (ELISA) mit einem „Flag"-Molekül: hier wird fluoreszierende DNA als Reaktionsmarker verwendet. Diese Unterfigur zeigt eine fluoreszierende DNA 1, ein Substrat 6, ein nachzuweisendes Makromolekül 7, einen Antikörper 8 und eine Oberfläche 12; und die Unterfigur 1C ist eine schematische Darstellung der genetischen Kartographie oder physischen Kartierung unter Verwendung der Ausdehnung von DNA und der Verwendung einer Marker-DNA. Diese Unterfigur zeigt eine komplementäre Sequenz 2, einen DNA-Marker (Farbe A) 8, eine verankerte DNA (Farbe B) 9, eine Position einer Überlappung 10 und eine Ausdehnungsrichtung 11. Unterfigur 2A ist ein Bild einer Fluoreszenzvideomikrophotographie, welche λ-DNA zeigt, deren kohäsive Enden mit DIG markiert sind, auf einer mit anti-DIG bedeckten Oberfläche und durch den Meniskus gestreckt, und die Unterfigur 2B ist auch ein Bild einer Fluoreszenzvideomikrophotographie, welche eine Kontrolle von nicht an den kohäsiven Enden markierter λ-DNA auf einer mit anti-DIG bedeckten Oberfläche zeigt. Die sehr enge Spezifität der Oberflächen und das Fehlen einer nicht-spezifischen Absorption kann festgehalten werden. 3 ist eine schematische Darstellung des Kämmens von DNA-Molekülen durch Passage eines sich bewegenden Meniskus. Diese Figur zeigt eine Oberfläche 12, an welcher ein Makromolekül (DNA) 14, welches in einem Medium A 13 angrenzend an das Medium B 15 angeordnet ist, angeheftet ist und gegenüber der Oberfläche befindet sich eine zweite Oberfläche 15 und Grenzflächen A/B 17, B/S 18 und A/2 19. Das ausgedehnte Molekül 20 ist auch an die Oberfläche 12 angeheftet gezeigt. Die DNA-Lösung wird mit einem kreisförmigen nicht-behandelten Deckgläschen bedeckt. 4 repräsentiert ein Histogramm der gemessenen Längen einer Gesamtheit von λ-DNA-Molekülen und deren Multimeren nach Ligation. Der Hauptpeak der Verteilung entspricht der Länge der Monomere 21 (16 μm), wohingegen man Peaks identifizieren kann, welche den Dimeren 22 (32 μm) und den Trimeren 23 (48 μm) entsprechen. Die anderen Peaks resultieren aus der Fraktionierung und dem mechanischen Scheren der fragilen DNA-Moleküle während deren Manipulation. Diese Figur zeigt den homogenen Charakter des Ausdehnens unabhängig von der Moleküllänge. 5 zeigt ein Histogramm, welches die gemessenen Längen einer Gesamtheit von ausgedehnten λ-DNA-Molekülen, erhalten durch mechanisches Versetzen von einem Deckgläschen (Oberfläche S) relativ zu der anderen S', repräsentiert. Ein Peak bei 21 μm weist auf eine Ausdehnung gegenüber der kristallographischen Länge von 16 μm hin. Diese Probe war identisch mit einer anderen Probe, welche die gleiche DNA gebunden eine silanisierte Oberfläche enthielt mit der Ausnahme, dass sie durch Verdampfen des Mediums A gekämmt oder ausgedehnt worden war. Dementsprechend kann diese direkt mit 2 von Bensimon et al., Science 265: 2096 (1994) verglichen werden. Dies ergibt eine relative Ausdehnung von über 30% und eine Anzahl von Fragmenten von N = 345.
Wenn sie in Anwendungen, wie zur Diagnose, verwendet werden, können die Sonden (die Anker) eine reaktive Gruppe, z. B. DIG, Biotin u. s. w., aufweisen, welche in der Lage ist, in einer spezifischen Weise an einer Oberfläche gemäß der Erfindung verankert zu werden (mit beispielsweise einem anti-DIG-Antikörper oder einem Streptavidin als eine Verankerungsstelle).
Der Nachweis der Verankerungsreaktion kann direkt durch Fluoreszenz des durch fluoreszierende Moleküle (Ethidiumbromid, YOYO, neue fluoreszierende Nukleotide) gefärbten DNA-Moleküls erfolgen (siehe Unterfigur 1A). Er kann auch indirekt durch den Nachweis eines „Flag"-Moleküls, z. B. eines Reaktanten gemäß der Erfindung, welcher in der Lage ist, an dem DNA- oder RNA-Molekül fixiert zu werden (beispielsweise durch Hybridisierung oder Protein-DNA-Wechselwirkung), aber im Wesentlichen keine Affinität für die Verankerungsstelle der Sonde aufweist, erfolgen.
In dem Kartographie-Modus werden die komplementären Sonden direkt an eine fluoreszierende Reaktion gemäß der Erfindung gekoppelt. Sie kann beispielsweise komplementäre einzelsträngige DNA sein, welche modifizierte fluoreszierende Nukleotide aufweist, oder eine lange einzelsträngige DNA, die mit Fluorophor A angefärbt wurde und durch ein zu der Sequenz, nach welcher gesucht wird, komplementäres einzelsträngiges Fragment beendet wird. Für verschiedene Sonden können Fluorphore mit unterschiedlichen Farben verwendet werden. Es ist auch in vorteilhafter Weise möglich, die DNA, an welche die Sonden hybridisieren, mit einem Fluorophor, welches eine andere Farbe aufweist, zu färben. Das DNA/Sonden-Hybrid wird durch eines von seinen Enden verankert und durch eines der zuvor beschriebenen Verfahren ausgedehnt. Der Abstand zwischen den Verankerungsstellen und den Hybridisierungsstellen oder zwischen den Hybridisierungsstellen wird bestimmt durch den Nachweis der Fluoreszenz der Sonde unter Verwendung der Verfahren der Erfindung, die zuvor beschrieben worden sind (siehe Unterfigur 1C). Beispielsweise wird, ohne darauf beschränkt zu werden, eine Marker-DNA, welche etwa 3000 Basenpaare aufweist und an einem Ende von dessen Enden ein einzelsträngiges Fragment aufweist, welches zu dem Gen, nach welchem gesucht wird, komplementär ist, mit Fluorophor A (z. B. YOYO-1) gefärbt. Diese DNA kann mit der einzelsträngigen DNA, für welche eine Kartographie gewünscht wird, hybridisiert und ligiert werden und diese später einzelsträngige DNA wird mit einem zweiten Fluorophor B (POPO-1) gefärbt (nach einer „random priming"-Reaktion (Oligolabelling-Reaktion), um die DNA in doppelsträngige DNA umzuwanden). Das Molekül wird dann durch eines von seinen Enden (beispielsweise durch eine DIG/anti-DIG-Reaktion) verankert und durch die Wirkung eines sich bewegenden Meniskus ausgedehnt. Der Abstand zwischen dem Ende des Moleküls und der Position des markierten Gens, der in doppelter Fluoreszenzmikroskopie (zwei Farben A und B) beobachtbar ist, erlaubt es einem, die Position des Gens, nach welchem gesucht wird, mit einer Genauigkeit in der Größenordnung von 1000 Basenpaaren (0,3 μm) zu ermitteln. Die Identifizierung von DNA/RNA-Sequenzen kann auch erfolgen durch eine Reaktion zwischen der Sequenz, nach welcher gesucht wird, und reaktiven Stellen einer Oberfläche gemäß der Erfindung (beispielsweise komplementäre Oligonukleotide oder die Reaktionsstelle eines für das Segment, nach welchem gesucht wird, spezifischen Proteins). Der Nachweis der Verankerungsreaktion kann dann direkt oder indirekt (mit Hilfe eines „Flag"-Moleküls") erfolgen, wie zuvor beschrieben. Es versteht sich, dass eine Identifizierung von Sequenzen von DNA/RNA gemäß der Erfindung verwendet werden kann entweder für diagnostische Zwecke (beispielsweise für den Nachweis des Vorhandenseins oder Fehlens eines viralen oder chromosomalen Pathogens) oder zu genetischen Kartographie- und physischen Kartierungszwecken. Es kann vorgegangen werden durch einen Amplifizierungsschritt unter Verwendung von verschiedenen Verfahren, insbesondere PCR. Eine genetische Kartographie und physische Kartierung können bewerkstelligt werden durch eine Messung der Größe von DNA-Fragmenten. Dies ist möglich, da die Bindung an Oberflächen und die Molekülausdehnungstechniken, die oben beschrieben worden sind (insbesondere und in vorteilhafter Weise die Ausdehnung durch den Meniskus), eine Messung der Länge von ausgedehnten Molekülen sogar für eine sehr geringe Menge oder Probe erlauben.
Es ist möglich, auf die folgende Weise vorzugehen, aber ohne auf dieses Verfahren beschränkt zu sein. Eine Probe von DNA kann fragmentiert werden, z. B. mit Restriktionsenzymen, mit einem Fluorophor gefärbt und an einer Oberfläche, welche reaktive Gruppen aufweist (z. B. Oberflächen mit C=C-Gruppen), verankert werden. Die Moleküle können dann durch den Meniskus ausgedehnt werden und die Größe der ausgedehnten Fragmente wird durch optische Fluoreszenzmikroskopie mit einer Auflösung und begrenzenden Größe in der Größenordnung von 1000 Basenpaare (0,3 μm) bestimmt. Die erhaltenen Ergebnisse können als ein Histogramm der gemessenen Längen von ausgedehnten DNA-Molekülen, inkubiert bei verschiedenen Fluorophor:Basenpaar-Verhältnissen (1:5 oder 1:10 oder 1:20 Fluorophor:Basenpaare), gezeigt werden. Das Histogramm zeigt, dass die Ausdehnung der Moleküle über ihre kristallographische Länge hinaus nicht auf die Interkalation des Fluorophors zurückzuführen ist, sondern stattdessen auf die Ausdehnungswirkung des Meniskus zurückzuführen ist (Histogramm nicht gezeigt). Die Oberfläche der Erfindung kann in bekannten Verfahren verwendet werden, was die Identifizierung und/oder Quantifizierung von Antigenen oder Antikörpern, insbesondere ELISA-Methoden unter Verwendung von enzymatischen Systemen oder Verfahren vom RIA-Typ unter Verwendung von radioaktiven Markern erlaubt. Diese Techniken sind wohlbekannt und müssen hier im Detail nicht beschrieben werden. Es ist auch möglich, die Oberfläche der Erfindung als einen Träger für immunologische Reaktionen eines ELISA-Verfahrens, welches einen Reaktant-Verankerungsschritt gemäß der Erfindung („Flag") an einem der ELISA-Reaktanten aufweist (Unterfigur 1B), zu verwenden. Der Nachweis kann global durch Messen der gesamten Fluoreszenz erfolgen. Es ist auch möglich, die Anzahl von Reaktionen lokal zu zählen. Dies kann erfolgen, indem die Nachweisverfahren der Erfindung verwendet werden, insbesondere nach der Meniskus-Ausdehnung. Dies ist möglich aufgrund der schwachen Fluoreszenzrate und der geringen Anzahl von nicht-spezifischen Wechselwirkungen des Produkts der Erfindung. Dies erlaubt auch den Nachweis einer sehr geringen Anzahl von Reaktionen (möglicherweise weniger als 100) mit einem hervorragenden SRV. Es ist dementsprechend möglich, geringfügige Modifizierungen von Sandwich-ELISA-Methoden (Antikörper-Antigen modifiziert, beispielsweise biotinyliert) zu verwenden, um auf die Oberfläche einen Reaktanten gemäß der Erfindung, beispielsweise fluoreszierende DNA verankert mit Streptavidin, aufzupfropfen. Alle diese Varianten der ELISA-Technik können mit einer verbesserten Empfindlichkeit angewendet werden. Fluoreszenzmesstechniken werden bereits verwendet, um die Qualität von ELISA-Reaktionen zu bestimmen. Jedoch erlaubt das Verfahren der Erfindung eine verbesserte Nachweisempfindlichkeit, da es für das Fluoreszenzsignal eines einzelnen Moleküls empfindlich ist.
Die Erfindung stellt auch ein neues Verfahren und eine neue Technik zum Blotten von Makromolekülen, z. B. Polynukleotiden, wie DNA, mit ultraniedrigem Fluoreszenz-Hintergrund, der zuvor unbekannt war, bereit. Diese Technik bietet eine Alternative zu herkömmlichen Southern/Northern-Blots, die in molekularbiologischen Anwendungen oftmals eingesetzt werden. Gegenwärtig kann ein DNA-Fingerprinting beschwerlich sein, insbesondere aufgrund der Notwendigkeit, die erhaltenen Materialien zu amplifizieren. Das Fingerprinting von DNA-Proben muss zuerst die Barrieren, die die minimalen DNA-Mengen, die oftmals durch die Größe von forensischen Proben begrenzt werden, darstellen, und die Probleme, die mit einer geringen Nachweisempfindlichkeit verbunden sind, überwinden. Gegenwärtig verfügbare Techniken sind zeitaufwändig, erfordern typischerweise mehrere Wochen und sind kompliziert, da sie eine mehrfache Exposition von radioaktiven geblotteten Membranen erfordern. Herkömmliche Techniken beruhen auf einem Restriktionsschneiden von DNA durch eine Gesamtheit von Enzym-Markern (typischerweise 5), jeder Restriktionsschnitt wird dann in eine separate Vertiefung auf einem hochauflösenden Standardgel eingebracht; DNA-Fragmente von verschiedenen Größen werden durch Gelelektrophorese in jeder Bahn aufgetrennt, was zu charakteristischen Mustern führt; und schließlich wird, um jedes Muster, d. h. den „genetischen Fingerprint" oder genetischen Fingerabdruck, zu bestimmen, jedes Gel auf eine adsorbierende und typischerweise fluoreszierende Membran geblottet, wobei die DNA auf die Membran in ihrer räumlichen Position transferiert wird, und jeder Marker wird durch nachfolgende radioaktive Markierungen, separate Langzeitexposition gegenüber einem empfindlichen Film (Wochen) und Abwaschen der alten radioaktiven Markierung, bevor die nächste Markierung auf der Autoradiographie ein Bild erzeugen kann, nachgewiesen kann. Das Verfahren des Standes der Technik benötigt typischerweise etwa 2 Wochen pro Marker oder etwa 10 Wochen für einen 5 Marker-Fingerprint.
Die Erfindung stellt ein neues und hochempfindliches Verfahren zum Nachweis und Fingerprinting von minimalen DNA-Mengen unter Verwendung von Fluoreszenzmikroskopie in einer relativ kurzen Zeitspanne bereit. Die Erfindung beruht auf der Verwendung eines festen, nicht-fluoreszierenden Substrats, gegebenenfalls eines Teils eines Substrats (z. B. ein Glas-Deckgläschen mit behandelter Silanbeschichtung), auf welches Makromoleküle (z. B. DNA oder Proteine) geblottet werden sollen. In einer Ausführungsform der Erfindung wird ein dünnes μm dickes Gel zwischen einer behandelten und einer nicht-behandelten Oberfläche angeordnet (z. B. einer Silan-Oberfläche mit freiliegenden C=C-Bindungen), wie jenen, die ausgehend von einem Deckgläschen erhalten werden können. Eine Makromoleküle, z. B. Polynukleotide und/oder Proteine, enthaltende Probe kann auf das Gel aufgeladen werden und eine Elektrophorese bei einem alkalischen pH, z. B. bei pH 8,0, wo es wenig oder im Wesentlichen keine Bindung des Makromoleküls an die C=C-Bindungen der Oberfläche gibt, ausgeführt werden. Die DNA/Proteine werden dann elektroporetisch aufgetrennt und der pH wird verringert, um die Bindung der reaktiven Gruppe in dem Makromolekül zu fördern, z. B. auf pH 5,5, unter Bedingungen, die effektiv sind, um die Bindung zu erhöhen, z. B. in einem 50 mM MES-Medium für eine Bindung von DNA an C=C-Bindungen. Die Proben können dann gefärbt und die Geltemperatur erhöht werden in einer Weise, die ausreicht, um das Gelmedium, z. B. Agarose mit niedrigem Schmelzpunkt, zu schmelzen, und das Medium in Bezug auf die Oberfläche, an welche das Makromolekül sich gebunden hat, versetzt werden. Dies führt durch Passage des Meniskus zu einer gekämmten oder ausgedehnten Probe. Der Zustand des Makromoleküls kann dann durch Fluoreszenzmikroskopie beobachtet werden, was zu einem direkten räumlichen Fingerprint der spezifischen Lage von allen DNA-Fragmenten in dem Gel zu dem Zeitpunkt, an dem sie sich an die Oberfläche gebunden haben, führt. Die vorliegende Technik bewerkstelligt das gesamte Verfahren in einer kurzen Zeitspanne, d. h. etwa 1 bis 2 Tage, ohne die Notwendigkeit, auf eine PCR-Amplifizierung zurückzugreifen. Die Erfindung ist ein extrem empfindliches Nachweisverfahren und liefert eine optische räumliche Auflösung von etwa 0,3 μm und in einigen Fallen sogar noch besser.
(In) einer anderen Ausführungsform der Erfindung kann das Verfahren auf unbehandelten Oberflächen, z. B. Oberflächen, denen C=C-Bindungen fehlen, ausgeführt werden, indem ein dünnes Gel als Schicht aufgebracht wird, wie es in diesem Fachgebiet bekannt ist, und dieses einer Elektrophorese unterzogen wird, wie oben beschrieben, und dann die zweite Oberfläche entfernt wird („Abschwemmen” des Deckgläschens), der pH des Gels auf einen pH-Wert, der wirksam ist, um die Bindung zu fördern, variiert wird und das Gel direkt, z. B. für Polynukleotide bei niedrigem pH, auf eine unterschiedliche Oberfläche mit freiliegenden C=C=-Gruppen, um eine Bindung zu fördern, geblottet wird.
Das Fingerprinting-Verfahren dieser Erfindung ist schnell, setzt mindestens eine nicht-fluoreszierende, aber reaktive Oberfläche, z. B. eine Oberfläche mit freiliegenden C=C-Bindungen oder anderen reaktiven Bindungen, ein, erzeugt einen optischen mikroskopische Fingerprint, ist keine makroskopische Größentechnologie und führt zu einer vorteilhaften hohen Auflösung unter Einsatz eines Mikroskops mit hoher Vergrößerung. Dieses Verfahren beruht auf einfachen Veränderungen, wie Veränderungen der Temperatur, des pH, und anderen Behandlungen des Gels nach dem Binden der Makromoleküle an die C=C-Gruppen oder anderen reaktiven Gruppen auf der Oberfläche oder Unterziehen der Makromoleküle einer Elektrophorese bei einem pH, wo im Wesentlichen keine Bindung auftritt, und dann Begünstigen der Bindung, indem der pH abgesenkt wird. Dies stellt eindeutig eine substantielle Verbesserung gegenüber dem Stand der Technik dar, die schnell ist, einfach anzuwenden ist und molekularbiologische Standardtechniken einsetzt und diese in einer neuen und nicht nahe liegenden Weise einsetzt.
Diese Erfindung erstreckt sich auch auf die Verwendung von minimalen Mengen eines „Markers" oder einer „Markierung" („Tag") als Mittel, um Proben, wie Fluide, zu authentifizieren. Jedoch können auch andere Proben verwendet werden, indem sie in ein Medium A eingebracht werden oder sie darin solubilisiert werden. Oftmals gibt es im Handel ein Problem bei der Authentifizierung eines gegebenen Materials, wie eines Fluids, ob dieses von der Ausführung ist, die auf dem Etikett angegeben ist. Ein Betrug erfolgt oftmals beim Vertrieb von beispielsweise nachgemachten Parfums, Weinen, Champagnern und anderen hochpreisigen Produkten. Dieser Aspekt der Erfindung beruht auf der Zugabe von minimalen Mengen von bekannten einzel- und doppelsträngigen (ds) Polynukleotiden, wie DNA, RNA und PNA, z. B. linearer einzel- oder ds-DNA, in Mengen, die so gering wie etwa 10³ bis 10⁶, vorzugsweise etwa 10⁴ bis 10⁵ Makromoleküle sind, zu einem Volumen von etwa 5 bis 1000 ml, beispielsweise in eine Parfum- oder Weinflasche, als ein inerter Zusatz, der extrem schwierig nachzuweisen und/oder nachzuahmen sein wird, um ein betrügerisches Produkt als einen Ersatz für das Original zu verkaufen. In einer Ausführungsform dieser Erfindung kann ein lineares ds-Polynukleotid in einer Menge von etwa 10³ bis etwa 10⁶ und in einigen Fallen sogar in noch geringeren Mengen mit (i) einer Länge von mindestens etwa mehreren Mikrometern (größer oder gleich etwa 10 kb) und (ii) einer oder mehreren bekannten oder spezifischen Basensequenz(en), die ein oder mehrere einzigartige(s) Restriktionsmuster oder Fingerprint(s) erzeugt bzw. erzeugen, wenn sie durch ein elektrisches Feld getrennt werden, z. B. durch Elektrophorese eines Fluids auf einem Gel oder nach „optischer Kartierung", wie von D. C. Schwartz (Meng, X., et al., Nature Genetics 9: 432 (1995)) beschrieben, zugegeben werden. Das Polynukleotid kann zu einer fluiden Probe zugegeben werden oder, wenn die Probe nicht in fluider Form vorliegt, zu einem Medium A, welches geeignet ist, die zu analysierende Probe, z. B. ein Parfum oder einen Wein, zu lösen und/oder zu suspendieren. Die Zugabe des „Markers" kann während des Herstellungsverfahren oder zu dem Zeitpunkt der Verpackung zum Versand an dem Ursprungsort bzw. der authentischen Stelle vorgenommen werden. Diese Moleküle einer inerten und unbekannten Konzentration und Basensequenz werden als ein „passives Siegel" oder „interner Marker" oder „Tracer-Markierung" dienen, um die Authentizität eines Produkts oder einer Flüssigkeit kundzutun. Es ist wohlbekannt, dass Polynukleotide, z. B. DNA, durch den Darm abgebaut und eliminiert werden können, nachdem sie über den Gastrointestinaltrakt verzehrt worden sind, und dementsprechend scheint ihre Zugabe keinerlei Gesundheitsrisiken für Menschen oder andere Säugetiere, die diese aufnehmen könnten, aufzuwerfen. Es ist ebenso unbekannt, dass ein Auftragen von minimalen Mengen von Polynukleotiden, z. B. DNA, auf die Haut oder andere Teile des Säugetiers, z. B. den menschlichen Körper, eine Gesundheitsgefährdung aufweisen könnte. Um ein Produkt zu authentifizieren oder seine Herkunft zu verifizieren, kann eine minimale Probe, z. B. weniger als etwa 1 ml, enthaltend mehrere hundert Makromoleküle, für eine Analyse extrahiert werden. Jede Probe zum Testen erfordert jedoch ein viel kleineres Volumen, z. B. typischerweise etwa 1 μl bis 50 μl. Dieses geringe Probenvolumen kann in ein Eppendorf-Reaktionsgefäß gegeben, zentrifugiert und aufkonzentriert werden, z. B. in einem Vakuumrotationsverdampfer, und für eine Analyse und einen Nachweis fertig gemacht werden. Verschiedene Mittel zum empfindlichen Nachweis können zu diesem Zweck eingesetzt werden, wie diejenigen, die nachfolgend beschrieben werden. Das ds-Polynukleotid kann in einem geeigneten inerten Medium, z. B. 50 mM MES, pH 5,5, für ein Gesamtvolumen von z. B. etwa 20 μl gelöst und auf eine Oberfläche, z. B. eine nicht-behandelte Oberfläche oder eine Oberfläche, welche C=C- oder andere Makromoleküle bindende Gruppen umfasst, wie diejenige, die oben beschrieben wurde, aufgetragen werden. Die Probe kann dann direkt einem makromolekularen Kämmen unterworfen werden, indem ein Abschnitt, vorzugsweise ein Ende davon, an die Oberfläche (z. B. eine Oberfläche mit C=C- oder anderen bindenden Gruppen) oder eine Oberfläche S', die auf der Probe platziert wird, gebunden wird und das Makromolekül versetzt wird, z. B. durch Elektrophorese, die Oberfläche S' entfernt wird und eine Oberfläche S'', welche C=C- oder andere reaktive Gruppen umfasst, als Ersatz aufgelegt wird und dann gemäß den Lehren dieses Patents gekämmt oder ausgedehnt wird, z. B. durch die Passage von Luft/Wasser oder einer anderen Kombination von Medien (Grenzfläche), durch Verdampfung oder mechanische Mittel, einschließlich Scheren. Die Makromoleküle können dann nach einem Anfärben z. B. durch Fluoreszenzmikroskopie, wie zuvor beschrieben, nachgewiesen werden. Sofern gewünscht, kann die Sequenz des Makromoleküls so gestaltet werden, dass sie spezifische Restriktionsstellen enthält, und in einer geeigneten Länge hergestellt werden, so dass die Makromoleküle zusätzlich einem Restriktionsverdau durch ein oder mehrere spezifische(s) bekannte(s) Schneidemittel, z. B. Restriktionsenzym(e), unterworfen werden können, und die resultierende physische Karte kann dann mit einer Kontrolle für das in ähnlicher Weise behandelte Makromolekül, z. B. dem erwarteten oder authentischen Fingerprint, verglichen werden. Diese Vorgehensweise kann ebenso in umgekehrter Reihenfolge ausgeführt werden, wobei das ds-Polynukleotid auch aufkonzentriert werden kann, dann in einem Eppendorf-Reaktionsgefäß restriktionsverdaut wird, dann in ein Medium, z. B. ein dünnes Gel mit einem pH, wo das Makromolekül nicht an die Oberfläche bindet, z. B. pH 8,0, gegeben wird und einer Elektrophorese unterzogen wird, um die Fragmente zu fraktionieren, der pH dann geändert wird, um die Bindung des Makromoleküls zu fördern, z. B. auf etwa pH 5,5 verringert wird, S'' in Kontakt z. B. mit dem Medium A gebracht wird, das Makromolekül auf eine Bindungsoberfläche mit einer C=C- oder andersartigen Bindungsgruppe, z. B. bindendes Filterpapier, geblottet und daran gebunden wird, die Temperatur dann erhöht werden kann, um das einen niedrigen Schmelzpunkt aufweisende Medium, z. B. ein Agarosegel, zu schmelzen, und das oder die Makromolekül/(e) oder Fragment(e) davon mechanisch geschert werden können, um sie zu kämmen oder auszudehnen. Alternativ kann das getrocknete und konzentrierte Makromolekül, z. B. DNA, rehydratisiert werden, z. B. mit einem geeigneten gepufferten Medium, und dann kann bzw. können das bzw. die Makromolekül(e) durch die Polymerasekettenreaktion amplifiziert werden, um normale oder „long range" PCR(LR-PCR)-Produkte herzustellen. Diese PCR-Produkte können dann detektiert, restriktionskartiert oder Shotgun-sequenziert und mit einer Kontrolle verglichen werden, um zu bestimmen, ob das makromolekulare Muster oder die Sequenz des Makromoleküls der Probe mit dem/der bekannten oder erwarteten Makromolekül-Muster oder -Sequenz übereinstimmt. Das folgende sind einige der nicht nahe liegenden Verbesserungen, die durch diese Erfindung gegenüber dem Stand der Technik ermöglicht werden. Diese Technik verwendet Makromoleküle einer extrem stabilen Natur, z. B. DNA, als ein Mittel, um die Herkunft von verschiedenen Produkten zu authentifizieren, und es werden sehr kleine Mengen der Makromoleküle eingesetzt und/oder benötigt, d. h. sehr geringe Konzentrationen. Zusätzlich ist die spezielle Natur des Makromoleküls schwierig nachzuweisen und nachzumachen angesichts der Tatsache, dass die genaue Sequenz des Makromoleküls bekannt sein muss, um dies zu tun, und die Sequenz des Makromoleküls kann leicht für jede und alle Chargen oder Lieferungen geändert werden, um mehr Variabilität und dementsprechend Schwierigkeiten für einen potentiellen Nachahmer einzuführen. Die Wahl des Mittels für einen empfindlichen Nachweis ist neu und nicht nahe liegend wie dies die Verwendung von Oberflächen, umfassend C=C und andere Bindungsgruppen für ein makromolekulares Kämmen, als ein Mittel für einen ultraempfindlichen Nachweis und die Verwendung von jetzt konventioneller PCR und „long range"-LR-PCR-Enzymen und Protokollen und/oder Kombinationen davon ist. Die vorliegende Technik ermöglicht Herstellern ein einfaches Mittel zur Abschreckung und Authentifizierung oder Verifizierung und/oder Verhütung von Nachahmungen von deren Produkten. Diese Technik ist am Herkunftsort einfach zu implementieren; unter Verwendung von molekularbiologischen Standardtechniken einfach zu verifizieren oder auszulesen; und schwierig zu fälschen, da eine genaue Nachbildung eines langen dsDNA-Fragments schwierig zu bewerkstelligen ist, da die genaue Sequenz des Makromoleküls zuerst bestimmt und dann kloniert und in einer ausreichenden Menge und mit einer ausreichenden Geschwindigkeit zusammengebaut werden muss, um weiterzumachen, bevor jene bestimmte Charge vom Markt verschwindet.
Noch eine andere Erfindung betraf die Verwendung der Oberflächen der Erfindung, umfassend C=C und andere reaktive Gruppen oder Gruppierungen, die hier beschrieben werden, für die Herstellung von strukturierten Substraten und Vorrichtungen. Die reaktiven Oberflächen der Erfindung können in Strukturen, wie „Biochips" oder „Microlabs", die ein „komplettes analytisches Mikrolaboratorium" für einen gewünschten Zweck auf einem Chip umfassen, eingefügt werden. Solche Chips umfassen ein vorderes Ende eines Probenvorbereitungsbereichs, einen Fraktionierungs- oder Auftrennungsbereich, auch typischerweise eine oder mehrere Reaktionskammer(n), wo verschiedene Reagenzien oder Produkte zugegeben werden, und dann typischerweise einen Nachweisbereich für die Anzeige der Eigenschaften des oder der Makromoleküle z. B. durch optische oder elektrische Mittel. Die Oberflächen sind nützlich für die Immobilisierung von Makromolekülen, wie u. a. Nukleinsäuren oder Proteinen, in einer Reaktionskammer eines solchen „Biochips" wie auch als ein Mittel, um Auftrennungen durch die Wirkung eines sich bewegenden Meniskus oder eines hydrodynamischen Flusses oder anderer Zwänge oder Kraftfelder zu bewirken. Die Oberflächen dieser Erfindung können auch für den Nachweis und die Quantifizierung von gewünschten Makromolekülen in der Auslesephase des Chips durch z. B. interne Photonik (Laserdiode/Photodiode), externe (Mikroskop) und dergleichen verwendet werden. Diese Erfindung findet eine von ihren Anwendungen als ein Mittel, um Makromoleküle zu immobilisieren, um eine Trennung oder Identifizierung eines gegebenen oder gewünschten Makromoleküls innerhalb einer Probe zu bewirken. Sie verwendet reaktive Oberflächen innerhalb einer strukturierten Vorrichtung wie auch ein Mittel, um ein oder mehrere Moleküle(e) oder Makromolekül(e) zu immobilisieren, um dann die gebundenen Makromoleküle einem Kämmen oder Ausdehnen, wie oben beschrieben, auszusetzen, um die Menge eines gewünschten Makromoleküls zu identifizieren, zu trennen und/oder zu messen.
Andere Vorteile und Merkmale können durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele erfasst werden.
BEISPIELE
Beispiel 1: Materialien und Methoden
Die λ-DNA und monoklonale Antikörper (anti-DIG) wurden von Boehringer-Mannheim erworben. Die Trichlorsilane wurden von Roth-Sochiel erworben. Fluoreszierende Nukleinsäure-Färbemittel (YOYO-1) wurden von Molecular Probes erworben. Vorgereinigte ESCO-Glasdeckgläschen (22 mm²) wurden von Erie Scientific erworben. Magnetische Körnchen wurden von Dynal Corp. erworben. Verwendete Mikroskope umfassten (i) ein umgekehrtes Nikon Diaphot^® mit einem 60 ×/1,4 N. A.-Objektiv, ausgerüstet mit einem Xenon-Brenner für Epifluoreszenz, mit einem Omega Optical-Filtersatz und einem ICCD-Bildverstärker von Hamamatsu für eine Videobeobachtung oder (ii) ein nach Maß angefertigtes umgekehrtes Mikroskop, umfassend einen Olympus^®- und Fokus-Mechanismus, ein 100 ×/1,3 N. A.-Objektiv von Zeiss^®, einen Argon-Laser (488 nm-Linie), um das Fluorophor zu stimulieren, einen Omega Optical-Filtersatz und einen hybriden DEP ICCD-Bildverstärker.
Beispiel 2: Oberflächenbehandlung
Vorgereinigte Glas-Deckgläschen wurden aus der Schachtel unter Verwendung von Pinzetten entnommen und in nach Maß angefertigte Teflon^®-Träger gelegt, die so gestaltet waren, dass jedes Deckgläschen vertikal mit einem minimalen Abstand von mindestens 2 mm unterstützt wurde. Diese Rahmen mit grob 20 Deckgläschen wurde dann in eine spezielle Reaktionskammer, die sowohl für Reinigung als auch Silanisierung gestaltet war, mit einem Volumen von etwa 2 l eingeführt und 10 min mit reinem O₂ mit einer Flussrate von 4 l/min gespült. Eine organische Reinigung der Oberflächen erfolgte durch Illuminieren einer UV-Quelle innerhalb der Kammer, was Ozon erzeugte, das mit den organischen Verbindungen auf der Oberfläche reagiert, für typischerweise minimal 4–6 h, wobei die besten Ergebnisse aufgrund von Reinigungszeiträumen erzielt wurden, die viel länger (12 bis 72 h) waren. Nach dem Ausblasen des Ozons (in einer Abzugshaube) für 5–10 min mit trockenem O₂ wurden die gereinigten Objektträger dann mit einer kontrollierten Feuchtigkeit von feuchtem O₂, im Allgemeinen von etwa 0,01% bis etwa 30% und manchmal sogar noch höher, typischerweise einer Atmosphäre mit 10% RH (relative Feuchtigkeit) 20 min bei einer verringerten Flussrate von 250 ml/min hydratisiert, um zu ermöglichen, dass Wassermoleküle an die Oberfläche binden. Die Wassermoleküle sind eine notwendige chemische Spezies bei der Silanisierungsreaktion für die hier verwendeten Trichlorsilane. Dann wurden 100–200 μl eines Trichlorsilans Cl₃-Si-(CH₂)N-CH=CH₂ in die Kammer durch eine winzige Öffnung hindurch durch eine Spritzennadel aus rostfreiem Stahl eingeführt, um die kontrollierten internen Reaktionsbedingungen nicht zu stören. Sofern gewünscht, kann dies erzielt werden, indem die Kammer abgepumpt wird, um Silan zu verdampfen, oder sie erwärmt wird, um die Diffusion des Beschichtungsmaterials zu erhöhen. Die Oberflächen wurden über Nacht (12 h) für N = 6 oder schnell (1 h) für N = 1 beschichtet. Nach dem Entfernen erschienen die Oberflächen oftmals geringfügig trübe und waren hydrophob (d. h. nicht-benetzend), was große Kontaktwinkel von grob 90° für einen Tropfen Wasser ergab. Oberflächen wurden eingeschlagen in Aluminiumfolientaschen in einer Laborschublade bis zur Verwendung aufbewahrt.
Die freiliegenden funktionalen Gruppen von diesen C=C-Oberflächen wurden in Carboxylgruppen -COOH umgewandelt, indem das behandelte Deckgläschen, wie oben beschrieben, für mindestens 15 min in einer Lösung von 25 mg KMnO₄, 750 mg NaIO₄ in 1 l H₂O eingeweicht, dann dreimal in ultrareinem entionisiertem H₂O gespült wurde. Die C=C-Oberflächen wurden in einigen Fällen mit Proteinen umgesetzt. Ein Volumen von 300 μl einer wässrigen Lösung (20 μg/ml) Protein (Protein A, Streptavidin u. s. w.) wurde auf die Oberfläche aufgetragen und mit der funktionellen Vinylgruppe C=C umgesetzt. Die Oberflächen wurden inkubiert, typischerweise 1–2 h bei Raumtemperatur, dann dreimal mit einer Phosphat-gepufferten Kochsalzlösung gespült. Unter diesen Bedingungen waren die Oberflächen sauber, waren aber dann hydrophil (sie benetzen sehr gut). Die in Protein A inkubierten Oberflächen wurden dann in Antikörper (anti-DIG)-Oberflächen umgewandelt, indem die Protein A-Oberfläche typischerweise 1–2 h bei Raumtemperatur mit einer Lösung eines Antikörpers (20 μg/ml) inkubiert wurde. Es wird angenommen, dass man nicht zu viel Protein A oder Antikörper auf die Oberfläche aufbringen sollte, ansonsten würden sterische Hinderungseffekte die Reaktivität der Oberflächen abträglich beeinflussen.
Beispiel 3: Verankern von nativer DNA an einer C=C-Oberfläche
Unter Verwendung einer Pipettenspitze mit einer vergrößerten Öffnung (hergestellt, indem die Spitze abgeschnitten wurde), um ein Scheren der DNA zu verhindern, wurde ein 5–10 μl-Aliquot einer 10⁷ Moleküle/μl-Lösung (10^–16 Mole) λ-DNA auf eine frisch mit fließendem ultrareinem Wasser gespülte, behandelte Oberfläche aufgetragen. Für auf Fluoreszenz basierende Beobachtungen wurde die λ-DNA frisch mit YOYO-1 oder anderen Fluorophoren angefärbt. Dann wurde ein sauberes und frisch gespültes rundes 18 mm-Deckgläschen, typischerweise unbehandelt, sanft auf den Flüssigkeitstropfen herabgesenkt in einer solchen Weise, dass vermieden wurde, dass Scherkräfte die Moleküle aufbrechen. Es wurde typischerweise eine sehr langsame Ausbreitung des Tropfens beobachtet, oftmals 10 s, bevor die sich bewegende Kontaktlinie die Kante des runden oberen Deckgläschens erreichte.
Es gab mindestens zwei Schlüssel-Kontrollparameter, die Inkubationsdauer und das Verfahren zum Bewegen des Meniskus. Die Lösung wurde irgendwo von 10 s bis mehrere Stunden in einer entweder trockenen oder feuchten (100% RH) Atmosphäre inkubiert, abhängig von dem gewünschten Effekt. Einige Proben wurden 10–30 s inkubiert und dann mechanisch geschert, indem die oberen und unteren Deckgläschen über einen Zeitraum von 5–10 s seitlich aneinander entlang gezogen wurden unter Verwendung von Pinzetten, um jede äußere Kante von beiden Oberflächen zu halten. Die Inkubationszeit beeinflusst den Prozentsatz von DNA, der bindet, da der Bindungsprozess diffusionslimitiert ist und die Wahrscheinlichkeit einer Bindung, ist der Kontakt mit der Oberfläche einmal hergestellt, konstant ist. Dementsprechend gibt es umso mehr Bindung, je länger die Inkubationszeit ist. Wenn man jedoch zu lange wartet, beispielsweise über Nacht, dann ist es wahrscheinlich, dass beide Enden eines gegebenen DNA-Moleküls eine Bindung ausgebildet haben werden unter Bildung einer U-Form oder eines „Loops" (einer Schleife) nach Passage des Meniskus anstelle von geraden linearen Segmenten. Die Nützlichkeit eines mechanischen Scherens, wie beschrieben, ist, dass es die Zeit, die notwendig ist, um zu warten, um das Ergebnis zu sehen, verringert, da ein Scheren schnell ist (maximal eine Minute) und ein Verdampfen beispielsweise Stunden benötigen kann.
In einem Puffer von 50 mM MES, pH 5,5, wurde die Bindung homogen quer durch gut behandelte Oberflächen beobachtet. Im Vergleich dazu gibt es in einem Puffer von 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 8,0, praktisch keine Bindung (weniger als 1 von 10⁶). Diese Abhängigkeit kann die Kontrolle oder Aktivierung der Oberflächen bezogen auf die DNA-Bindung durch die Verwendung eines dazwischenliegenden pH ermöglichen.
Beispiel 4: Ausrichtung und Nachweis von verankerter DNA durch die Wirkung des Meniskus
Entweder durch Transferieren der inkubierten Probe zu einer trockenen Umgebung und Verdampfenlassen des Lösungsmittels oder durch mechanisches Scheren der Probe, wie oben beschrieben, dehnt die Passage des Meniskus die DNA-Moleküle, die an der Oberfläche durch ein oder beide Enden verankert sind, rechtwinklig zu dem Meniskus aus (siehe 5). Die Kraft, von welcher vermutet wird, dass sie kapillarer Natur ist, an den DNA-Molekülen (typischerweise einige 10 pN) ist in der Tat ausreichend, um das Molekül vollständig auszudehnen (das ist höher als die elastische entropische Kraft des fluktuierenden Braunschen Knäuels), ist aber zu schwach, um die Bindung zu brechen, die vielleicht kovalenter Natur ist, zwischen der DNA und der silanisierten/behandelten Oberfläche. Die DNA, wenn sie zuvor mit einem Fluorophor (YOYO-1) angefärbt worden ist, wird unverzüglich beobachtet und es kann festgestellt werden, dass sie gestreckt ist, mit einer Gesamtlänge von 20–25 μm. Die Verankerung zwischen der Oberfläche und der DNA ist auf die Enden, vielleicht das 5'-Phosphat, begrenzt, und ist auch mit DNA des Phagen λ, von YAC oder von E. coli (mit einer Länge über 450 μm) beobachtet worden. Diese Präparation und Fixierung der DNA, die ausgedehnt wurde, fluoresziert und an der Luft getrocknet wurde, ist mehrere Tage stabil, manchmal sogar Wochen und Monate (wenn sie korrekt entfernt vom Umgebungslicht aufbewahrt wird) und kann durch Fluoreszenz-Auflichtmikroskopie, typischerweise an einem umgekehrten Mikroskop mit einer hohen Vergrößerung/hohen numerischen Apertur, Flüssigkeitslinse (beispielsweise eine 100 ×/1,4 N. A.) beobachtet werden.
Beispiel 5: Spezifische Verankerung und Nachweis
Nach Oberflächenbehandlung, wie oben beschrieben, mit einem spezifischen monoklonalen Antikörper kann man sehr genau die Oberflächenspezifität steuern. Dementsprechend wurde die Spezifität von mit anti-DIG behandelten Oberflächen gegenüber DNA, die mit einem komplementären Oligonukleotid zu einem der kohäsiven oder „klebrigen" Enden und enthaltend ein Digoxigenin (DIG) hybridisiert war, gegenüber nicht-hybridisierter DNA getestet. In dem ersten Falle wurde eine homogene Ausdehnung von jenen verankerten Molekülen durch die Wirkung des Meniskus beobachtet. In dem zweiten Falle wurde beobachtet, dass weniger als 10 DNA-Moleküle in der gesamten Probe verankert wurden. Es wird geschätzt, dass die Spezifität des Verfahrens der Erfindung besser als 1:10⁶ ist (siehe Unterfigur 2A und Unterfigur 2B) (Siehe Unterfiguren 2A und 2B).
Beispiel 6: Empfindlicher Nachweis
Um die Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens durch die Ausdehnung aufgrund der Passage eines Meniskus zu bestimmen, wurden 2,5 μl-Aliquots einer Lösung von λ-DNA in 50 mM MES, pH 5,5, enthaltend 10⁵, 10⁴, 10³ Moleküle, auf eine Oberfläche aufgetragen. Die Bindung wurde ausgeführt ähnlich zu dem, was zuvor beschrieben worden ist. Die unterschiedlichen Oberflächen wurde dann unter dem Fluoreszenz-Auflichtmikroskop beobachtet, um die Dichte der verankerten Moleküle zu bestimmen. Für die geringste Verdünnung (10³ Moleküle) beobachtete man mehr als 10 DNA-Moleküle (nach Durchsuchen von 125 Sehfeldern), die durch die Wirkung des Meniskus ausdehnt worden waren. Diese Anzahl wird im Wesentlichen durch die große Anzahl von Sehfeldern, die notwendig ist, um die gesamte Probe abzudecken (grob 20000), begrenzt. Dies macht eine manuelle Suche schwierig, kann aber in vorteilhafter Weise entweder automatisch durch Computersteuerung der Phasen- und Bildverarbeitung oder mit einem schwachen Objektiv bewerkstelligt werden. Als Schlussfolgerung hat die Empfindlichkeit des Nachweisverfahrens der Erfindung bereits das Vorhandensein von 1 in 100 DNA-Molekülen nachgewiesen und es wird erwartet, dass es eine sogar noch höhere Empfindlichkeit aufweist (eine sogar noch niedrigere Nachweisgrenze ermöglicht), um den Nachweis eines einzelnen Moleküls zu erlauben.
Beispiel 7: Abhängigkeit der Ausdehnung von der Oberflächenbehandlung
Das Histogramm der gemessenen Längen von ausgedehnter λ-DNA, welche auf eine silanisierte Oberfläche aufgepfropft worden sind, nach der Einwirkung eines sich bewegenden Meniskus zeigt einen gut definierten Peak bei 24 μm, wohingegen auf einer mit Protein A und dann anti-DIG erneut beschichteten Oberfläche das Histogramm von Längen von ausgedehnter λ-DNA (cos-endmarkiert mit einem DIG-Molekül, wie oben beschrieben) nur einen klaren Peak bei 16 μm (oftmals bis zu 18 μm) zeigt. Die Ausdehnung hängt dementsprechend von der Oberflächenbehandlung und Oberflächenherstellung ab. Die Ergebnisse können als ein Histogramm der gemessenen Längen von N Fragmenten von λ-DNA-Molekülen gezeigt werden und ein typisches Bild (Einschub) nach (A) Ausdehnen durch die Passage des Meniskus auf einer hydrophoben Oberfläche (Silan-behandelt) oder (B) einer, die behandelt worden ist, um hydrophil zu werden (mit Protein A/anti-DIG). Die Figur zeigt die Abhängigkeit der Qualität oder des Ausmaßes der Ausdehnung von der Oberflächenbehandlung und der Hydrophobizität (siehe 1, Bensimon et al., Phys. Rev. Lett. 74: 4754 (1995)).
Beispiel 8: Homogene Ausdehnung
Um zu bestimmen, ob die Ausdehnung homogen (unabhängig von der Länge des Moleküls) ist, wurde eine Lösung von Multimeren von λ-DNA durch Ligation unter Verwendung von E. coli-T4-Ligase hergestellt. Diese Lösung wurde auf einige silanisierte Oberflächen aufgepfropft und dann durch die Wirkung des passierenden Meniskus ausgedehnt. Das Histogramm von Längen von ausgedehnten Molekülen zeigt 3 Peaks in gleichem Abstand entsprechend den Längen von Monomeren, Dimeren und Trimeren. Die Ausdehnung durch den Meniskus ist dementsprechend relativ homogen (4).

Claims

Verfahren zum Erhalten einer Oberfläche S, die eine konsistente, homogene und reproduzierbare Orientierung, Ausrichtung, Geraderichtung oder Ausdehnung von Makromolekülen ermöglicht, wobei das Verfahren folgendes umfaßt: Reinigen einer Oberfläche S eines Substrats unter Bedingungen, die effektiv sind, um eine von organischen Molekülen freie und staubfreie Oberfläche S zu erhalten, Hydratisieren von S und Beschichten von S mit einem gewünschten Material, weiches freiliegende Reste umfaßt, die selektiv Makromoleküle binden können, wobei die Stufen der Reinigung, Hydratisierung und Be schichtung in einer einzelnen Kammer ausgeführt werden und die Oberfläche S eine konsistente, homogene und reproduzierbare Orientierung eines daran gebundenen Makromoleküls ermöglicht.
Verfahren nach Anspruch 1, welches die weiteren Stufen umfaßt, bei denen man S in einer oxidierenden Atmosphäre mit UV-Licht bestrahlt, die Atmosphäre befeuchtet und S mit einem Polymer beschichtet, welches einen freiliegenden reaktiven Rest umfaßt.
Reproduzierbares Verfahren zum Orientieren, Ausrichten, Geraderichten oder Ausdehnen eines Makromoleküls auf einer Oberfläche, welches folgendes umfaßt: Inkontaktbringen eines Makromoleküls mit einer Oberfläche S, erhalten durch das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, und einem Medium A, so daß eine Stelle des Makromoleküls an S gebunden wird und ein Abschnitt davon in A angeordnet ist, und Aufbringen einer zufälligen oder nicht-zufälligen Kraft, wie z. B. einer durch Gravitation, magnetisch, elektroforetisch oder durch Temperatur induzierten Kraft, auf das mit dem Medium A in Kontakt stehende Makromolekül unter Bedingungen, die effektiv sind, um das Makromolekül zu orientieren, auszurichten, geradezurichten oder auszudehnen.
Reproduzierbares Verfahren zum Orientieren, Ausrichten, Geraderichten oder Ausdehnen eines Makromoleküls auf einer Oberfläche, welches folgendes umfaßt: Inkontaktbringen eines Makromoleküls mit einer Oberfläche S, erhalten durch das Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, und einem Medium A, so daß eine Stelle des Makromoleküls an S gebunden wird und ein Abschnitt davon in A angeordnet ist, und mechanisches Versetzen der Bestandteile von A relativ zu S unter Bedingungen, die effektiv sind, um das Makromolekül zu orientieren, auszurichten, geradezurichten oder auszudehnen.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Stufe des mechanischen Versetzens dadurch ausgeführt wird, daß eine ebene Oberfläche S' gegenüber von S mit A in Kontakt gebracht wird und S oder S' jeweils relativ zueinander bewegt werden.
Reproduzierbares Verfahren zum Orientieren, Ausrichten, Geraderichten oder Ausdehnen eines Makromoleküls auf einer Oberfläche, welches folgendes umfaßt: Inkontaktbringen eines Makromoleküls mit einer Oberfläche S erhalten durch ein Verfahren nach Anspruch 1 oder 2 und einem Medium A, so daß eine Stelle des Makromoleküls an S gebunden wird und ein Abschnitt davon in A angeordnet ist, und mechanisches Versetzen der Bestandteile von A relativ zu S unter Bedingungen, die effektiv sind, um das Makromolekül zu orientieren, auszurichten, geradezurichten oder auszudehnen, wobei die Stufe des mechanischen Versetzens dadurch ausgeführt wird, daß eine ebene Oberfläche S' gegenüber von S mit A in Kontakt gebracht wird und S oder S' jeweils relativ zueinander bewegt werden.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 6, welches die weitere Stufe umfaßt, bei der man vor der Stufe des Versetzens ein oberflächenaktives Mittel zu A oder zu einem Medium, welches Berührungsflächen mit A und S aufweist, zugibt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 4 bis 7, welches vor der Stufe des Versetzens weiterhin das Modifizieren von S durch Verankern von Molekülen, die selektiv eine spezifische Art von Makromolekülen oder einen Teil davon binden, auf S umfaßt.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, angewandt auf einen der nachstehenden Verwendungszwecke: Messen eines gewünschten Ausmaßes der Orientierung, Ausrichtung, Geraderichtung oder Ausdehnung einer spezifischen Art von Makromolekülen, die an die Oberfläche S gebunden sind, wobei das Verfahren das Vergleichen, Identifizieren, Bestimmen und/oder Trennen des Makromoleküls oder eines Fragments davon in Bezug auf andere Moleküle beinhaltet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, angewandt auf einen der nachstehenden Verwendungszwecke: Identifizieren einer spezifischen Art von Makromolekülen, die in einer Probe vorliegen, wobei das Verfahren das Vergleichen, Identifizieren, Bestimmen und/oder Trennen des Makromoleküls oder eines Fragments davon in Bezug auf andere Moleküle beinhaltet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, angewandt auf einen der nachstehenden Verwendungszwecke: Bestimmen der Anzahl einer spezifischen Art von Makromolekülen, die in einer bekannten Menge einer Probe vorliegen, wobei das Verfahren das Vergleichen, Identifizieren, Bestimmen und/oder Trennen des Makromoleküls oder eines Fragments davon in Bezug auf andere Moleküle beinhaltet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, angewandt auf einen der nachstehenden Verwendungszwecke: Trennen einer spezifischen Art von Makromolekülen von anderen Arten von Makromolekülen, die in einer Probe vorliegen, wobei das Verfahren das Vergleichen, Identifizieren, Bestimmen und/oder Trennen des Makromoleküls oder eines Fragments davon in Bezug auf andere Moleküle beinhaltet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 7, angewandt auf einen der nachstehenden Verwendungszwecke: Messen der Länge einer spezifischen Art von Makromolekülen oder eines Fragments davon, wobei das Verfahren das Vergleichen, Identifizieren, Bestimmen und/oder Trennen des Makromoleküls oder eines Fragments davon in Bezug auf andere Moleküle beinhaltet.
Verfahren nach einem der Ansprüche 3 bis 13, wobei die Bindung der spezifischen Art von Makromolekülen an die Moleküle mittels einer magnetischen, farbigen oder fluoreszenten Markierung detektiert wird,
Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 14, angewandt auf das Messen der Länge einer spezifischen Art von Makromolekülen oder eines Fragments davon, wobei das Verfahren das Bestimmen eines gewünschten Abstands durch Vergleichen mit einer bestimmten Länge oder Referenzlänge beinhaltet.
Oberfläche S, erhalten durch ein Verfahren nach Anspruch 1, welche hydrophob ist.