DE10002895B4

DE10002895B4 - Koimmobilisierung mehrerer chemischer Spezies

Info

Publication number: DE10002895B4
Application number: DE2000102895
Authority: DE
Inventors: Frank Priv.Doz. Dr. Bier; Eva Dr. Ehrentreich-Förster
Original assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Current assignee: Fraunhofer Gesellschaft zur Foerderung der Angewandten Forschung eV
Priority date: 2000-01-17
Filing date: 2000-01-17
Publication date: 2006-02-09
Anticipated expiration: 2020-01-18
Also published as: DE10002895A1

Abstract

Definierte Koimmobilisierung von zwei oder mehr chemischen oder biochemischen Spezies an Trägern, wobei die Oberfläche jeweils passiviert wird und die unspezifische Adsorption weitgehend vollständig unterdrückt wird und mindestens eine der chemischen und biochemischen Spezies als Blocker (Passivierungsmittel) fungiert und mindestens eine der chemischen oder biochemischen Spezies den Analyten oder ein Derivat davon darstellt, dadurch gekennzeichnet, dass der Blocker aus der Gruppe von Lipophilen, Enzymen, Enzymkomplexen, Haptenen, Hormonen, Agonisten, Antagonisten, Antikörpern, Antikörperfragmenten, Antigenen, Oligonukleotiden, Peptid-Nucleinsäuren oder Derivaten davon, Polysacchariden, Lipiden, Enzymsubstraten, Enzyminhibitoren, Markern, Labeln ausgewählt ist.

Description

In der Affinitätschromatographie, der biochemischen Analytik und in der Biosensorik werden gleichermaßen Oberflächen benötigt, die einerseits hohe Affinität zu einer in Frage stehenden Substanz aufweisen und andererseits möglichst wenige, optimal keine, weiteren Substanzen binden. Dieses Problem wird häufig durch Zugabe von möglichen Interferenten, z. B. Proteinen, zu minimieren versucht. Denaturierte Proteinen, Rinderserumalbumin oder Casein oder Nukleinsäuren ohne spezifische Sequenz für die Fragestellung werden als Blocking-Reagenzien vor oder während der Reinigung bzw. dem Assay zugesetzt. Diese Substanzen sind aber wenig spezifisch und können in vielen Fällen nicht eingesetzt werden, z. B. bei der Reinigung oder Analyse von Haptenen nur begrenzt oder gar nicht eingesetzt werden.

Die Aufgabe der Erfindung betrifft die gleichzeitige, kovalente Kopplung zweier oder mehrerer unterschiedlicher chemischer oder biochemischer Spezies auf einem Träger, Immobilisierung genannt. Erfindungsgemäß wird die Oberfläche partiell passiviert, d. h. unspezifische Adsorption wird weitgehend vollständig unterdrückt. Anwendungsgebiete der Erfindung sind Aufreinigung und Defektion in der Biotechnologie, Bioanalytik, Biomedizin, klinischen Chemie und Diagnostik sowie der Sensorik.

Mindestens eine der an die Oberfläche gekoppelten Substanzen ist ein Bindungspartner einer chemischen oder biochemischen Erkennungsreaktion. Ist die Oberfläche, an die gekoppelt wurde, Teil eines Nachweissystems, bei mehr als zwei simultan gekoppelten Komponenten, sind mehrere Analysen an einer oder an verschiedenen Stellen möglich.

Die Erfindung betrifft die gleichzeitige, kovalente Kopplung mehrerer unterschiedlicher chemischer Spezies auf einem Träger(Immobilisierung), die so ausgelegt wird, daß die Oberfläche passiviert wird, d. h. unspezifische Adsorption wahlweise unterdrückt wird. Anwendungsgebiete der Erfindung sind die Biotechnologie, Bioanalytik, Biomedizin, klinische Chemie und Diagnostik sowie die Sensorik

Ist die Oberfläche ein Sensor, so kann eine der gekoppelten Substanzen ein Bindungspartner sein und z. B. in Form eines kompetitiven (Immun)Assays genutzt werden. Werden mehr als zwei Komponenten simultan gekoppelt, so sind mehrere Analysen an einer Stelle (sequentiell) oder verschiedenen Orten der Oberfläche (simultan) möglich.

Die Schwierigkeit der Kopplung biochemischer Einheiten an Trägern besteht nun darin, daß diese Kopplung definiert, reproduzierbar und stabil sein soll und für verschiedene Substanzgruppen geeignet sein muß.

Das Problem bei der Aufreinigung z. B. durch Affinitätschromatographie oder der Detektions mittels einer festen Phase besteht in der unspezifischen Adsorption an die jeweilige Trägeroberfläche, die mit der spezifischejn Kopplung konkurriert. Hierzu werden üblicheweise Maskierungsmittel eingesetzt, die die Oberfläche mit einer "abweisenden" Schicht benetzt. So werden z. B. in Immunoassays häufig denaturierte Proteine zur Unterdrückung unspezifischer Bindungen eingesetzt.

JP-04019561 A offenbart einen Immunoassay, bei dem neben dem Analyten Polyvinylalkohol (PVA) an eine Trägeroberfläche adsorbiert wird, um als Konservierungsmittel zu dienen und um eine unspezifische Adsorption von Antiseren zu verhindern.

Das Problem bei der empfindlichen Defektion verschiedener Substanzen nach erfolgter Kopplung an die Oberfläche besteht darin, daß herkömmliche Maskierungsmittel neben den unspezifischen häufig auch die spezifischen Bindungsstellen mit abdecken und somit die Meßgröße beeinflußt. Deshalb wurde die hier beschriebene Koimmobilisierung eingeführt.

Die erfindungsgemäße Behandlung der Oberfläche passiviert diese definiert und ermöglicht dadurch die Maskierung der den Analyten ähnlichen Substanzen aus den Meßlösungen, so daß die Probenvorbehandlung minimiert wird und eine Störung durch unspezifische Bindungen trotzdem aufgeschlossen werden kann.

Die Erfindung hat das Ziel, die Detektion einzelner Substanzen mittels eines (ober)flächensensitiven Verfahrens sensitiv zu gestalten.

Die Koimmobilisierung kann durch die Wahl des Koimmobilisats so gesteuert werden, daß sie für gezielte Oberflächenbehandlungen gemäß der jeweiligen gestellten Aufgabe genutzt werden kann.

Die Erfindung soll nachfolgend an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert werden.

Ausführungsbeispiel
Die Aufgabe bestand im Nachweis einer lipophilen Substanz im Blut mittels eines oberflächensensitiven Verfahrens. Die Sensitivität des Verfahrens machte einen kompetitiven Assay unter Verwendung von Antikörpern erforderlich. Ein Derivat des Analyten wurde kovalent an die Oberfläche gekoppelt und die Bindung des Antikörpers an die Oberfläche verfolgt. Dazu war es notwendig, die Oberfläche zwischen den spezifischen Bindungsstellen – hier den immobilisierten Analyt(derivat)molekülen – zu passivieren.
Die bei Immunoassays übliche Methode mit Casein oder Serumalbumin oder denaturierten Proteinen zu maskieren, konnte hier nicht angewandt werden, da die immobilisierten Derivate dadurch ebenfalls verdeckt würden. Daher wurde eine zweite Substanz, die ebenfalls lipophil ist, in hoher Dichte koimmobilisiert. Die gesamte Oberfläche wird damit weitgehend hydrophob und die Adsorption löslicher Proteine aus dem Blutplasma wirkungsvoll unterdrückt.
1: Koimmobilisierung durch Aktivierung und kovalente Anbindung zweier verschiedener Substrate (gemäß Anspruch 1-12), die je nach Aufgabenstellung als Analyt oder Blocker fungieren. Die Dichte der Blocker- bzw. Analytderivate kann eingestellt werden, um so Beladungskapazität oder Messbereich eines Sensors zu optimieren.
2: Besipiel eines Kompetitiven Immun-Hormonassays in Vollblut auf einem oberflächensensitiven Biosensor (optischer Gitterkoppler). Antikörper gegen den Anaylten wurde den Proben zugesetzt und durch Anwesenheit des freien Anaylten kompetitiert. Daten 1 zeigen den Assay mit passivierter Oberfläche, Daten 2 mit einfach im mobilisiertem Analytderivat. Das Signal/Rausch-Verhältnis um den Faktor 5 verbessert, die untere Nachweisgrenze konnte in diesem Beispiel damit um 2 Größenordnungen erniedrigt werden.

Claims

Definierte Koimmobilisierung von zwei oder mehr chemischen oder biochemischen Spezies an Trägern, wobei die Oberfläche jeweils passiviert wird und die unspezifische Adsorption weitgehend vollständig unterdrückt wird und mindestens eine der chemischen und biochemischen Spezies als Blocker (Passivierungsmittel) fungiert und mindestens eine der chemischen oder biochemischen Spezies den Analyten oder ein Derivat davon darstellt, dadurch gekennzeichnet, dass der Blocker aus der Gruppe von Lipophilen, Enzymen, Enzymkomplexen, Haptenen, Hormonen, Agonisten, Antagonisten, Antikörpern, Antikörperfragmenten, Antigenen, Oligonukleotiden, Peptid-Nucleinsäuren oder Derivaten davon, Polysacchariden, Lipiden, Enzymsubstraten, Enzyminhibitoren, Markern, Labeln ausgewählt ist.
Definierte Koimmobilisierung nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß der Analyt oder das Analytderivat aus der Gruppe von Lipophilen, Enzymen, Enzymkomplexen, Haptenen, Hormonen, Agonisten, Antagonisten, Antikörpern, Antikörperfragmenten, Antigenen, Oligonukleotiden, Peptid-Nucleinsäuren oder Derivaten davon, Polysacchariden, Lipiden, Enzymsubstraten, Enzyminhibitoren, Markern, Labeln ausgewählt ist.
Definierte Koimmobilisierung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Marker oder Label Fluorochrome, Redoxlabel oder Spinlabel sind.
Definierte Koimmobilisierung nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass der Blocker und/oder der Analyt bzw. das Analytderivat als Gemisch eines der in Anspruch 1 oder 2 angegebenen Substanzen vorliegt.
Definierte Koimmobilisierung nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägeroberfläche durch einen festen oder löslichen anorganischen oder organischen (polymeren) Träger gegeben ist.
Definierte Koimmobilisierung nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägeroberfläche durch einen Silizium-Wafer, eine Glasoberfläche oder Sol/Gelmaterialien gegeben ist.
Definierte Koimmobilisierung nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägeroberfläche durch Kunststoffe in Form von Titerplatten, Reaktionsgefäßen (Eppendorfgefäßen), Durchflussreaktoren, darin enthaltenem Trägermaterial oder Schläuchen gegeben ist.
Definierte Koimmobilisierung nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägeroberfläche aus einem Edelmetall besteht.
Definierte Koimmobilisierung nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägeroberfläche die Ausformung einer Raster-Sonden-Mikroskopie-Spitze, insbesondere AFM-Spitze (Rasterkraft-Mikroskop, einer SNOM-Spitze (optisches Nahfeld-Mikroskop), einer SEM-Spitze (Raster-elektrochemisches Mikroskop) oder einer anderen Scanning Probe Microscopy-Spitze hat.
Definierte Koimmobilisierung nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Trägeroberfläche aus Latex oder Derivaten besteht oder aus gegebenenfalls beschichteten oder aktivierten magnetischen Partikeln, insbesondere für chromatografische oder reinigende Zwecke.
Definierte Koimmobilisierung nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche die Ausformung eines Transducers hat; das sind Elektroden aller Art oder optische Sensoren, Lichtwellenleiter oder beschichtete Wellenleiter (einfachen oder interferometrischen Aufbaus).
Definierte Koimmobilisierung nach einem der Ansprüche 1-4, dadurch gekennzeichnet, dass der Analyt photometrisch, fluorimetrisch oder mittels Chemilumineszenz detektiert wird.