DE60000014T2

DE60000014T2 - Linker-System zum Aktivieren von Oberflächen für die Biokonjugation und Verfahren zu ihrer Verwendung

Info

Publication number: DE60000014T2
Application number: DE60000014T
Authority: DE
Inventors: Holger Klapproth
Original assignee: Biochip Technologies GmbH
Current assignee: Biochip Technologies GmbH
Priority date: 2000-05-16
Filing date: 2000-05-16
Publication date: 2002-05-02
Anticipated expiration: 2020-05-17
Also published as: ES2164632T3; EP1132739A1; AU7404201A; DK1132739T3; US6921669B2; US20030022189A1; EP1132739B1; JP2003533697A; DE60000014D1; CA2375160A1; PT1132739E; WO2001088535A1; ATE206211T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein ein Linker-System zur Aktivierung von Oberflächen für die Biokonjugation und insbesondere ein Linker-System mit einer neuen hydrophilen Spacergruppe.
Durch die ständig zunehmende Bedeutung von Mikrotechniken für eine große Bandbreite wissenschaftlicher Anwendungen, bedeutet die Entwicklung von Systemen, die eine Wechselwirkung zwischen Molekülen mit Oberflächen ermöglichen, immer noch eine ernstzunehmende Herausforderung. Derartige Wechselwirkungen umfassen sowohl die Möglichkeit, spezielle Molekül aus einer Probe zu entfernen, z. B. zur Vereinfachung ihrer Analyse bzw. ihres Nachweises, als auch die Möglichkeit, Moleküle auf einer Oberfläche zu präsentieren und so nachfolgende Reaktionen stattfinden zu lassen. Diese Grundsätze für die Immobilisierung von Molekülen können in Sensor- oder chromatographischen Systemen oder für die Bereitstellung von modifizierten Oberflächen im allgemeinen angewendet werden.
In den vergangenen Jahren sind zahlreiche Versuche unternommen worden, um Sensorchips oder Biochips herzustellen, die auf sich eigenständig zusammenlagernden Monoschichten (self-assembled monolayers; SAM's) bifunktioneller Moleküle bestehen, welche direkt oder indirekt Probenmoleküle an die Sensoroberfläche binden. Typischerweise tragen diese bifunktionellen Moleküle z. B. einen Silan- oder Thiol/Disulfidrest, um eine Bindung mit der anorganischen Oberfläche zu erreichen und eine zusätzliche funktionelle Gruppe (z. B. Amino- oder Epoxygruppen), die mit Probenmolekülen wechselwirken, welche in biologischen Proben häufig in der Form von Oligonukleotiden, Proteinen oder Polysacchariden etc. enthalten sind.
Während die Ausbildung einer direkten Bindung zwischen der bifunktionellen Verbindung und dem Probenmolekül möglich ist, brauchen die Probenmoleküle nicht notwendigerweise direkt mit den die Monoschicht bildenden Linkem beziehungsweise Kopplungsgruppen zu wechselwirken. Alternativ können geeignete immobilisierte Biomoleküle selber als Sonden für den Nachweis von Probenrnolekülen dienen. Solche Sondenmoleküle können ebenso über eine Reaktion mit den freien funktionellen Gruppen der Monoschicht immobilisiert werden. Insbesondere im Falle der Verwendung von Biomolekülen als Sondenmoleküle, kann durch deren Anwesenheit die Spezifität der Wechselwirkung zwischen den Probenmolekülen und der modifizierten Oberfläche erheblich erhöht werden.
Obwohl diese Verfahren für diesen Zweck bereits etabliert sind, ist die Anwendung für Standardnachweisverfahren problematisch, insbesondere dann, wenn der für den Nachweis eines bestimmten Typs von Probenmolekülen verfügbare Oberflächenbereich beschränkt ist, z. B. wenn eine Vielzahl von Molekülen in einem parallelen Verfahren analysiert werden soll, da die Monoschichten in ihrer Pfropfdichte limitiert sind. Demgemäß müssen geeignete Detektoren sehr hohen Anforderungen in Bezug auf ihre Sensitivität genügen; ferner kann der minimale Oberflächenbereich auf einem Sensor, welcher für den Nachweis eines Typs von Probenmolekül notwendig ist, nicht ohne weiteres reduziert werden.
Hinzu kommt, dass die maximale Dichte, z. B. ein Proben- oder Sondenmolekül pro funktioneller Gruppe des Linkers beziehungsweise der Kopplungsgruppe kaum erreicht werden kann, da durch sterische Hinderung auf der zweidimensional ausgedehnten, Monoschicht lediglich ein Teil der funktionellen Gruppen in der Lage sein wird, mit dem Proben- oder Sondenmolekül zu reagieren. Infolgedessen ist die Pfropfdichte gering und normalerweise nicht genau definiert.
Für die Herstellung der oben erwähnten Sensorchips oder Biochips, die normalerweise in wässriger Umgebung benutzt werden, verwendet man häufig geeignete hydrophile Schichten, die für die Konjugation mit Proben- oder Sondenmolekülen funktionalisiert/aktiviert sind. Diese hydrophilen Schichten sind im Gegensatz zu hydrophoben Schichten benetzbar und verfügen deshalb über eine bessere Druckbarkeit für die Aufbringung auf eine entsprechende Oberfläche, z. B. in Form einer rasterartigen Anordnung.
Im Falle der Kopplung an ein Siliziumdioxidsubstrat oder Derivat davon, z. B. eine Glassoberfläche etc., werden in einem ersten Modifizierungsschritt (Silanisierung) der Oberfläche gewöhnlich Aminosilane, wie z. B. Trimethoxysilylpropylamin (APTF) benutzt. In einem zweiten Schritt der Aktivierung dieser Oberfläche werden die freien Aminogruppen der Aminosilane mit einem heterobifünktionellen Vernetzungsmittel funktionalisiert, das in der Lage ist, kovalent an das gewünschte Proben- oder Sondenmolekül zu binden, wie z. B. Succinimidyl-4-[maleimidophenyl]butyrat (SMPB) im Falle von mittels Thiol modifizierten DNA-Oligomeren (s. Chrisey, Lee und O'Ferrel, Nucleic Acids Research, 1996, Vol. 24, Nr. 15, Seiten 3031-3039).
Die oben erwähnte auf Aminosilan basierende Methode weist jedoch die Nachteile auf, dass die der Silanisierung folgenden Reaktionsschritte, zu einer geringeren maximalen Pfropfdichte führen, und dass diese Methode arbeitsaufwendig und schwer zu kontrollieren ist. Ferner sind die entstehenden hydrophilen Schichten im biologisch geeigneten pH-Bereich positiv geladen. Es ist nicht möglich, negativ geladene oder ungeladene Schichten zu erhalten. Eine stark positive Ladung würde eine starke unspezifische Absorption von negativ geladenen Molekülen und eine starke Abstoßung von positiv geladenen Molekülen verursachen.
Obgleich zahlreiche Versuche unternommen worden sind, um die Probleme bei der oben erwähnten auf Aminosilan basierenden Methode zu lösen, besteht weiterhin ein Bedarf an alternativen hydrophilen Schichten, und insbesondere an negativ geladenen oder ungeladenen Schichten. Mit diesen verschiedenen Schichttypen kann die Oberfläche leicht an die jeweilige analytische Anforderung angepasst werden.
Demgemäß liegt ein Teil der vorliegenden Erfindung in der Bereitstellung alternativer positiv geladener hydrophiler Schichten und insbesondere in der Bereitstellung negativ geladener oder ungeladener hydrophiler Schichten.
Diese und andere Aspekte und Eigenschaften der Erfindung ergeben sich für den Fachmann aus der Beschreibung und den nachfolgenden Ansprüchen.
Erfindungsgemäß wird gemäß Anspruch 1 ein Linker-System zum Aktivieren von Oberflächen für die Biokonjugation mit der folgenden allgemeinen Formel (I) bereitgestellt:
X-[(Y1)i-Q-(Y2)j]k-Z (I)
in der X eine reaktive Gruppe bedeutet, die kovalent an eine Oberfläche binden kann, Z eine reaktive Gruppe bedeutet, die kovalent an ein Biomolekül binden kann, mit der Maßgabe, dass X nicht Z bedeutet, Y1 und Y2 unabhängig voneinander CR1R2 bedeuten, wobei R1 und R2 unabhängig voneinander H, C1-C4-Alkyl, C1-C4-Alkoxy oder C1-C4-Acyloxy bedeuten, i, j, k unabhängig voneinander eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 10 bedeuten, mit der Maßgabe, dass die Gesamtanzahl an C-Atomen in Y1 und Y2, die C-Atome von R1 und R2 nicht eingeschlossen, im Bereich von 2 bis 100 liegt, und Q ein(e) hydrophile(s) Atom oder Gruppe bedeutet, dass/die aus der aus O, NH, C=O, O-C=O und CR3R4 bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei R3 und R4 unabhängig voneinander aus der aus H, OH, C1-C4-Alkoxy und C1-C4-Acyloxy bestehenden Gruppe ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass R3 und R4 nicht gleichzeitig H bedeuten und dass für Q = NH Z nicht NH2 ist, und wobei im Fall von k > 1 die Q's für jedes [(Y1)i-Q-(Y2)j]k unabhängig voneinander ausgewählt sind.
Das erfindungsgemäße Linker-System ermöglicht die Herstellung von positiv oder negativ geladenen oder ungeladenen Schichten auf dem Substrat, wobei sich diese Schichten durch eine gute Benetzbarkeit auszeichnen. Nach der Kopplung an die Oberfläche, z. B. durch Silanisierung, sind keine weiteren Schritte erforderlich, wie z. B. eine Kopplung mit einem bifunktionellen Linker, um das endgültige Linker-System herzustellen, woraus eine bessere Pfropfdichte resultiert. Wenn z. B. Z eine Epoxygruppe ist, dessen reaktive Gruppe direkt eingeführt werden kann, dann kann das erfindungsgemäße Linker-System direkt an Biomoleküle wie DNA binden. Zusätzlich kann das erfindungsgemäße Linker-System leicht unter Anwendung herkömmlicher Drucktechniken auf eine Oberfläche gedruckt werden, wie z. B. nachfolgend detailliert beschrieben wird.
Weitere vorteilhafte oder bevorzugte Ausführungsformen sind Gegenstand der Unteransprüche.
Im obigen Linker-System ist die Auswahl der reaktiven Gruppe X nicht besonders eingeschränkt und kann entsprechend der jeweiligen Praxis erfolgen, d. h. entsprechend der Oberfläche, an der die Bindung stattfinden soll. Beispielsweise können Thiol- oder Disulfidgruppen an Goldoberflächen binden, und Alkoxy- oder Halogensilane können an Glas- und Keramikoberflächen binden, während Gruppen, die freie Radikale bilden können, wie z. B. durch Bestrahlung mit Licht wie UV-Licht, an Kunststoffoberflächen binden können, wobei diese auch organische Polymere umfassen.
Die reaktive Gruppe X kann z. B. ausgewählt werden aus der Gruppe bestehend aus einer Disulfidgruppe (-SS-), einer Thiol- oder Mercaptogruppe (-SH), einer Silangruppe SiW3, wobei W ein(e) hydrolysierbare(s) Atom oder Gruppe bedeutet, und einer Gruppe, die freie Radikale bilden kann, z. B. durch Bestrahlung mit Licht, wie eine Anthrathiongruppe oder ein Derivat davon, eine Anthrachinongruppe oder ein Derivat davon und eine Benzophenongruppe oder ein Derivat davon.
Vorzugsweise wird das/die hydrolysierbare Atom oder Gruppe W ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Halogenen wie Cl, Br, I und F, C1-C4-Alkoxygruppen wie Methoxy-, Ethoxy-, Propoxy-, Isopropoxy-, n-Butoxy-, Isobutoxy- oder tertiäre Butoxygruppen, die C1- C4-Acyloxy- wie Formyl-, Acetyl-, Propionyl-, Isopropionyl-, n-Butyryl-, Isobutyryl- oder tertiäre Butyrylgruppen und Aminogruppen.
Weitere geeignete reaktive Gruppen sind bespielsweise im Textbuch "Bioconjugate Techniques" von G. T. Hermanson, Academic Press, 1996, beschrieben. Beispielhafte Originalveröffentlichungen hierüber sind Chrisey, Lee und O'Ferrel, Nucleic Acids Research, 1996, Vol. 24, Nr. 15, Seiten 3031-3039; oder Beier und Hoheisel, Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, Nr. 9, Seiten 1970-1977, die insbesondere die dort definierten und ebenfalls erfindungsgemäß geeigneten Vertreter ETA und PEDA offenbaren.
Wie bereits zuvor definiert, können Y1 und Y2 unabhängig voneinander CR1R2 sein, wobei R1 und R2 unabhängig voneinander H, C1-C4 Alkyl, z. B. Methyl, Ethyl, Propyl, Isopropyl, Butyl, Isobutyl, oder tertiäres Butyl, oder C1-C4-Alkoxy, z. B. Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, n-Butoxy, Isobutoxy oder tertiäres-Butoxy, oder C1-C4-Acyloxy bedeuten, wie Formyl, Acetyl, Propionyl, Isopropionyl, n-Butyryl, Isobutyryl oder tertiäres Butyryl.
Die Indices i, j, k bedeuten unabhängig voneinander eine gerade Zahl im Bereich von 1 bis 10, unter der Maßgabe, dass die Gesamtzahl an C-Atomen in Y1 und Y2, die C-Atome von R1 und R2 nicht mit eingeschlossen, im Bereich von 2 bis 100 liegt, z. B. 2 bis 80, oder 2 bis 60, oder 2 bis 40, oder 2 bis 20, insbesondere 2 bis 18, oder 2 bis 16, oder 2 bis 14, oder 2 bis 12, oder 2 bis 10, oder 2 bis 8.
In diesem Zusammenhang wird darauf hingewiesen, dass der einzige Grund für die oben genannte Maßgabe darin zu sehen ist, dass ein idealer Abstand zwischen einer DNA und einer hydrophoben Oberfläche bekanntlich etwar 100 Kohlenstoffatome beträgt. Das bedeutet, dass es eigentlich keine maximale Spacerlänge gibt, die durch chemische Gründe vorgegeben sein könnte, aber es gibt eine maximal geeignete oder nützliche Spacerlänge. Andererseits ist auch bekannt, dass die Pfropfdichte mit zunehmender Länge des Spacers abnimmt.
Spezielle Beispiele für Y1 und Y2, die gleich oder verschieden voneinander sein können, sind abhängig von den jeweiligen Werten für i und j Methylen, Ethylen, Tri-, Tetra-, Penta-, Hexa-, Hepta-, Octa-, Nona-, oder Decamethylengruppen, welche zusätzlich verzweigt oder substituiert sein können wie zuvor für R1 und R2 definiert. Es wird darauf hingewiesen, dass Y1 und Y2 keine Kettenlänge aufweist, die zu einer Verfestigung führt oder so umfangreich verzweigt ist, dass die Bildung von Monoschichten auf einer Oberfläche inhibiert oder verhindert wird. Dasselbe gilt für den Fall, dass k für jeden "sich wiederholenden Block" [(Y1)i-Q-(Y2)j] > 1 ist.
Die Auswahl von Q als ein(e) hydrophiles Atom oder Gruppe ist nicht besonders eingeschränkt, sofern seine Funktion, dem erfindungsgemäßen Linker-System Hydrophilie zu verleihen, nicht beeinträchtigt wird. Im allgemeinen kann eine Hydrophilie aus der Polarisierung eines Moleküls durch Elektronen anziehende Wirkung eines Atoms resultieren, das elektronegativer ist als ein Kohlenstoffatom. Beispielsweise sind hydrophile Atome oder Gruppen in der Lage in wässriger Umgebung Wasserstoffbindungen oder -brücken zu bilden, was zu einer Hydration führt, durch die die Zugänglichkeit für hydrophile Moleküle verbessert wird.
Für die Verwendung im erfindiungsgemäßen Linker-System geeignete hydrophile Atome oder Gruppen werden aus der Gruppe bestehend aus O, NH, C=O (Ketogruppe), O-C=O (Estergruppe) und CR3R4 ausgewählt, wobei R3 und R4 unabhängig voneinander aus der Gruppe bestehend aus H, OH, C1-C4-Alkoxy und C1-C4-Acyloxy ausgewählt werden, mit der Maßgabe, dass R3 und R4 nicht gleichzeitig H bedeuten, und dass für Q = NH Z (wie nachfolgend definiert) nicht NH2 ist.
Spezille Beispiele für C1-C4-Alkoxy sind Methoxy, Ethoxy, Propoxy, Isopropoxy, n- Butoxy, Isobutoxy oder tertiäres Butoxy. Besondere Beispiele für C1-C4-Acyloxy, wie z. B. Formyl, Acetyl, Propionyl, Isopropionyl, n-Butyryl, Isobutyryl oder tertiäres-Butyryl. Ferner wird darauf hingewiesen, dass CR3R4 als Q nicht so umfangreich verzweigt sein sollte, dass die Bildung von Monoschichten auf einer Oberfläche inhibiert oder verhindert wird.
Für Q können auch S (Schwefel) oder S-S (Disulfid) in Betracht gezogen werden, wobei diese jedoch nicht bevorzugt sind, da die resultierenden Verbindungen normalerweise übelriechend sind. Hinzu kommt, dass Disulfidbrücken leicht reduziert werden können, was zu einer Spaltung des Linker-System führt.
Weiterhin können die Q's, im Falle von k > 1 für jeden "sich wiederholenden Block" [(Y1)i-Q-(Y2)j]k unabhängig voneinander ausgewählt werden.
Im oben beschriebenen Linker-System ist die Auswahl der reaktiven Gruppe X nicht besonders eingeschränkt und kann entsprechend der jeweiligen Praxisanforderung erfolgen, d. h. entsprechend des Proben- oder Sondenmoleküls, an dem die Bindung stattfinden soll. Da die meisten Proben- oder Sondenmoleküle insbesondere in biologischen oder medizinischen Anwendungen, sterisch unbehinderte nukleophile Bereiche aufweisen, umfassen bevorzugte Reaktionen mit solchen Molekülen nukleophile Substitutions- oder nukleophile Additions- oder Diels-Alder-Reaktionen, die zu einer kovalenten Bindung zwischen der reaktiven Gruppe Z des erfindungsgemäßen Linker-Systems und den Proben- oder Sondenmolekülen führen. Ferner ist auch eine radikale Substitution möglich.
Es könnte gewünscht sein, dass die obige reaktive Gruppe Z diejenige Gruppe darstellt, die für die Interaktion mit dem Proben- oder Sondenmolekül nötig ist oder in einem weiteren Schritt in eine solche geeignete reaktive Gruppe überführt wird. Ferner kann die reaktive Gruppe Z per se hydrophob sein, solange das Linker-System als Ganzes seinen hydrophilen Charakter beibehält.
Zum Beispiel kann die reaktive Gruppe Z ausgewählt werden, aus der Gruppe bestehend aus einer reaktiven Doppelbindung wie in einem Acrylrest, einer Diengruppe wie in Butadien, einer dienophilen Gruppe wie in Maleinsäureanhydrid oder Maleinimid, einer Epoxygruppe wie in Glycidylderivaten, einer Aldehydgruppe, einer Hydroxylgruppe, einer Carbonsäuregruppe, einer aktiven oder reaktiven Estergruppe wie in N-hydroxysuccinimidyl (NHS)- Estern oder Imidoestern oder Azlacton, einer Aminogruppe (-NH2), einer Disulfidgruppe (- S-S-), einer Thiol- oder Mercaptogruppe (-SH), einer Aziridingruppe, einer Isocyanatgruppe (-N=C=O), einer Isothiocyanatgruppe (-N=C=S), einer Azid-Gruppe und einer reaktiven Austrittsgruppe wie NHS.
Weitere geeignete reaktive Gruppen sind beispielsweise im Textbuch "Bioconjugate Techniques" von G. T. Hermanson, Academic Press, 1996, beschrieben. Beispielhafte Originalveröffentlichungen hierzu sind Chrisey, Lee und O'Ferrel, Nucleic Acids Research, 1996, Vol. 24, Nr. 15, Seiten 3031-3039; oder Beier und Hoheisel, Nucleic Acids Research, 1999, Vol. 27, Nr. 9, Seiten 1970-1977, in der insbesondere PDITC, DSC, DSO, DM5, SMPB, MBS, SMCC, GMBS, MPS und STAB, welche ebenfalls für die vorliegende Erfindung geeignet sind, offenbart werden.
Ein typisches Beispiel eines erfindungsgemäßen Linker-Systems hat die folgende Formel:
Nach einem weiteren Aspekt der Erfindung wird eine Oberfläche bereitgestellt, die das erfindungsgemäße Linker-System trägt.
Die Auswahl der Form, Größe oder der chemischen Zusammensetzung der Oberfläche ist nicht besonders eingeschränkt: und kann entsprechend der Praxisanforderung erfolgen. Sie kann z. B. Teil eines Behälters sein oder kann Kügelchen, Körnchen, Folien, Schichten oder Beläge ausbilden, was beispielsweise auf einem geeigneten Substrat erfolgen kann. Hinsichtlich seiner chemischen Zusammensetzung kann die Oberfläche beispielsweise aus der Gruppe bestehend aus einer SiO2-Oberfläche (einschliesslich aufgedampfte oder gesputterte Si- Ox-Schichten), beispielsweise Siliziumwafers, Glas, Quarz, Quarzglas etc (diese SiO2- Oberflächen können auch andere Oxide enthalten wie B2O3, Al2O3 etc.), oder Gold und einem Polymer oder einem Kunststoff wie Cycloolefn-Copolymere (COCs), Poly(methylmethacrylat) (PMMA, Plexiglas), Polystyrol, Polyethylen und Polypropylen, ausgewählt werden. Ein geeignetes COC ist z. B. von Ticona unter dem Handelsnamen "Topaz" erhältlich.
Nach einer bevorzugten Ausführungsform bildet das erfindungsgemäße Linker-Systems auf einer Oberfläche, z. B. einer festen Oberfläche, ein Muster bzw. eine rasterartige Anordnung.
Die Schaffung eines gemusterten Bereiches bzw. einer rasterartigen Anordnung des erfindungsgemäßen Linker-Systems auf einer Oberfläche kann auf unterschiedliche Weise erreicht werden, z. B. unter Anwendung standardisierter photolitographischer Verfahren, Mikrokontaktdrucktechniken oder verwandten Methoden, durch Tintenstrahldruck oder andere Mikroplottermethoden. Durch Anwendung irgendeiner dieser Verfahren können Oberflächenstrukturen mit Abmessungen im Mikrometerbereich realisiert werden. Im Falle von Sensorchips oder Biochips unter Verwendung nachfolgend detailliert beschriebener geeigneter Marker sind der hochparallele Modus der Signalerzeugung sowie die signifikante Verbesserung der Integration der analytischen Daten, die herausragendsten Eigenschaften solcher Techniken durch welche demgemäss automatische Analyseverfahren optimiert werden können.
Nach einer weiteren bevorzugten Ausführungsform ist das an die Oberfläche gebundene, erfindungsgemäße Linker-System kovalent an ein Biomolekül gebunden, welches z. B. als Sonde für einen Sensorchip oder Biochip eingesetzt werden soll.
Die Auswahl des erwähnten Biomoleküls ist nicht im besonderen eingeschränkt und kann entsprechend der Praxisanforderung erfolgen. Beispielsweise ist das Biomolekül ein Partner eines in spezifischer Weise wechselwirkendes Systems komplementärer Bindungspartner zur Steigerung der Bindungsselektivität in einer komplexen Mischung von Verbindungen, wie einer biologischen Flüssigkeit.
Der vorliegend verwendete Begriff "wechselwirken" schließt sowohl die Bildung von kovalenten Bindungen als auch ionische und van-der-Waals Anziehungskräfte sowie Wasserstoffbrückenbindungen ein.
Zum Beispiel beruht das spezifisch wechselwirkende System komplementärer Bindungspartner auf einer Nukleinsäure/Komplementämukleinsäure-, Peptidnukleinsäure (PNA)/ Nukleinsäure-, Enzym/Substrat-, Rezeptor/Effektor-, Lektin/Zucker-, Antikörper/Antigen-, Avidin/Biotin- oder Streptavidin/Biotin- Wechselwirkung.
Die erwähnten Nukleinsäuren können DNA oder RNA sein, z. B. ein Oligonukleotid oder ein Aptamer.
Der erwähnte Antikörper kann ein polyklonaler, monoklonaler, chimärer oder Single-Chain- Antikörper oder ein funktionelles Fragment oder Derivat derartiger Antikörper sein, ist aber nicht beschränkt auf diese Beispiele.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zum Nachweis eines Biomoleküls, welches Partner eines in spezifischer Weise wechselwirkendes Systems komplementärer Bindungspartner ist bei dem
a) eine Oberfläche, umfassend ein erfindungsgemäßes Linker-System mit einem kovalent daran gebundenen Partner eines spezifisch wechselwirkenden Systems komplementärer Bindungspartner, z. B. eine Nukleinsäure oder ein Antikörper, mit einer Probe in Kontakt gebracht wird, die vermutlich den komplementären Bindungspartner enthält, z. B. eine komplementäre Nukleinsäure oder ein Antigen,
b) unspezifisch gebundene Probenbestandteile in einem Waschschritt entfernt werden, und
c) die spezifisch gebundenen Probenbestandteile nachgewiesen werden.
Die Auswahl des Nachweisverfahrens ist nicht besonders eingeschränkt und kann entsprechend der Praxisanforderung erfolgen. Beispielsweise können Nachweisverfahren angewendet werden, die auf farbigen, fluoreszierenden, biolumineszierenden, chemolumineszierenden, phosporeszierenden oder radioaktiver Markierung oder auf einem enzymatischen (z. B. nach der ELISA-Methode), einem Antikörper oder einem funktionellen Fragment oder Derivat davon oder auf Protein A/Gold, oder Biotin/Avidin, oder Biotin/Strepatvidin, oder Enzymelektroden basieren.
Die erwähnten Nachweisverfahren sind im Stand der Technik bekannt, z. B. F. Lottspeich und H. Zorbas (Hrsg.) in "Bioanalytik", Spektrum Akademischer Verlag Heidelberg 1998. Insofern kann auf eine detaillierte Beschreibung an dieser Stelle verzichtet werden. Geeignete elektrochemische oder auf Enzymelektroden basierende Systeme sind beschrieben in Angewandte Chemie, 2000, Vol. 112, Nr. 7, Seiten 1230-1269.
In Abhängigkeit von der angewendeten Markierungsmethode kann der Nachweis mit bekannten Verfahren wie z. B. über Laserabtastung oder unter Verwendung von CCD-Kameras geführt werden.
Weiterhin können sogenannte indirekte Nachweisverfahren angewendet werden. Ein Beispiel eines solchen indirekten Nachweisverfahrens ist die Verwendung eines markierten sekundären Antikörpers (Anti-Antikörper), der gegen einen ersten, unmarkierten Antikörper gerichtet ist, welcher an das zu untersuchende Biomolekül (Probenmolekül) bindet.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Isolierung eines Biomoleküls, das ein Partner eines spezifisch wechselwirkenden Systems komplementärer Bindungspartner ist, bei dem
a) eine Oberfläche umfassend ein erfindungsgemäßes Linker-System, mit einem daran kovalent gebundenen Partner eines spezifisch wechselwirkenden Systems komplementärer Bindungspartner, z. B. ein Lektin oder ein Antikörper mit einer Probe in Kontakt gebracht wird, die vermutlich. den komplementären Bindungspartner enthält, z. B. ein Zucker oder ein Antigen,
b) unspezifisch gebundene Probenbestandteile in einem Waschschritt entfernt werden, und gegebenenfalls
c) die spezifisch gebundenen Probenbestandteile eluiert werden, zum Beispiel mit einem chaotropen Mittel.
Ferner umfasst die Erfindung die Verwendung einer wie zuvor definierten Oberfläche als Affinitätsmatrix, z. B. als stationäre Phase für chromatographische Zwecke, oder für die Bereitstellung eines Sensorchips oder Biochips. Dieser Sensorchip oder Biochip kann Teil eines medizinischen oder diagnostischen Instruments sein, welches zum Beispiel zum Nachweis von Bestandteilen in physiologischen Flüssigkeiten, wie Blut, Serum, Speichel etc. eingesetzt werden kann.
Ein Regenerieren der erfindungsgemäßen Oberflächen, nachdem die Bindung der daran gebundenen Sonde an das entsprechend nachzuweisende oder zu isolierende Probenmolekül stattgefunden hat, ist möglich, aber es werden Einmalverwendungen bevorzugt, um die Qualität der Ergebnisse insbesondere im Fall der Verwendung für Nachweiszwecke (Sensorchips oder Biochips) sicherzustellen.
Mit Sensorchips oder Biochips, die über eine erfindungsgemäße Oberfläche der zuvor definierten Art verfügen, können unterschiedliche Probentypen mit erhöhter Präzision und/oder vermindertem Raumbedarf in sowohl seriellen als auch parallelen Nachweisverfahren analysiert werden.
Ganz allgemein wird die Kopplungsreaktion zwischen dem erfindungsgemäßen Linker- System und den nachzuweisenden oder zu isolierenden Molekülen unter Bedingungen durchgeführt, die den Proben- oder Sondenmolekülen nicht schaden.
Zum Beispiel sollte die Reaktion im Rahmen einer Nukleinsäure-DNA-Sensoranwendung in wässriger Lösung bei einer Temperatur stattfinden, die 95ºC nicht übersteigen sollte. Vorzugsweise liegt die Temperatur im Bereich von 40-60ºC.
Ferner sollte die Kopplungsreaktion mit dem Proben- oder Sondenbiomolekül in einer angemessenen Geschwindigkeit voranschreiten, damit der Nachweis vorzugsweise innerhalb von weniger als 24 Stunden geführt werden kann, ohne dass extreme pH-Werte in der Lösung benötigt werden. Für die Immobilisierung von Einzelsträngen synthetischer Oligonukleotide als Sonde sollte der pH-Wert zwischen 7 und 11, vorzugsweise zwischen 7 und 10 liegen.
Während der Hybridisierungsreaktion der Nukleinsäure-Probenmoleküle mit den Sondenmolekülen sollten die Bindungen zwischen der funktionellen Gruppe und den einzelsträngigen, synthetischen Oligonukleotiden sowie die Bindungen des Linker-Systems zum Substrat Temperaturen von mehr als 65ºC und einem pH-Wert von 6-9 standhalten können. Im Falle von DNA als Probenmolekül können die Temperaturen bis zu etwa 95ºC erhöht werden, um die für eine Hybridisierung notwendig Trennung der DNA-Stränge zu herbeizuführen.
Geeignete Hybridisierungsbedingungen können nach konventionellen Protokollen etabliert werden, die zum Beispiel beschrieben sind in Sambrook, "Molecular Cloning, A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory, N.Y. (1989); Ausubel, "Current Protocols in Molecular Biology", Green Publishing Associates und Wiley Interscience, N. Y. (1989); oder Higgins und Hames (Hrsg.) "Nucleic Acid Hybridization, a practical approach", IRL Press Oxford, Washington DC, (1985). Die Wahl der Bedingungen ist dem Fachmann bekannt und wird gemäß der im Stand der Technik beschriebenen Protokolle bestimmt. So werden zum Nachweis von lediglich spezifisch hybridisierenden Sequenzen gewöhnlich stringente Hybridisierungs- und Waschbedingungen benötigt, wie z. B. 0.1xSSC, 0.1% SDS bei 65ºC. Beispielhafte nicht-stringente Bedingungen für den Nachweis von homologen oder nicht exakt komplementären Sequenzen können 6xSSC, 1% SDS bei 65ºC sein.
Bekannterweise stellen die Sondenlänge und die Zusammensetzung der zu bestimmenden Nukleinsäure weitere Parameter der Hybridisierungsbedingungen dar.
Die zu analysierenden Nukleinsäuren können aus einer DNA-Bibliothek oder einer genomischen Bibliothek stammen, wobei diese synthetische und semi-synthetische Nukleinsäurebibliotheken einschließen. So kann z. B. bei einer Proteinsensorchip-Anwendung ein wie zuvor definierter Antikörper an das erfindungsgemäße Linker-System angehängt werden.
Die allgemeine Methodik zur Herstellung von Antikörpern ist bekannt und wurde z. B. von Köhler und Milstein, Nature 256 (1975), Seite 494, und als Zusammenfassung in JG. R. Hurrel, (Hrsg.), "Monoclonal Hybridoma Antibodies: Techniques and Applications", CRC Press Inc., Boco Raron, FL (1982), beschrieben. Eine weitere Methodik ist die Lehre von L. T. Mimms et al., Virology 176 (1990), Seiten 604-619.
Wie schon erwähnt, bezieht sich der Ausdruck "Antikörper" auf monoklonale oder polyklonale Antikörper. Funktionelle Antikörperfragmente oder Derivate davon haben dieselbe Spezifität wie der ursprüngliche Antikörper und umfassen F(ab')2, Fab, Fv oder scFv Fragmente; siehe z. B. Harlow und Lane, "Antibodies, A Laboratory Manual", CSH Press 1988, Cold Spring Harbor, NY. Derivate eines Antikörpers können z. B. mittels Peptidomimetik hergestellt werden. Derartige Herstellungsverfahren sind im Stand der Technik bekannt und können vom Fachmann ohne weiteres Verfahren angewendet werden.
Im folgenden wird die Erfindung anhand von Beispielen detaillierter offenbart. Die offenbarten spezifischen Formen oder bevorzugten Ausführungsformen dienen lediglich als Veranschaulichung und nicht als Beschränkung. Der Schutzumfang der Erfindung ergibt sich aus den anhängenden Ansprüchen und nicht aus der folgenden Beschreibung, ebenso verstehen sich alle Modifikationen innerhalb des Äquivalenzbereichs der Ansprüche als hiermit umfasst.

Beispiele

Synthese von {1-[2-{Glycidyl)-ethoxy]-ethoxy}-trimethoxysilan (GEETS)

Die Synthese von Silanen gehört zum Stand der Technik. Das obige Silan wird durch Zugabe von 1,7-Bromdiethylenglycol zu Glycidol hergestellt, z. B. durch Zugabe von 1 Mol Glycidol zu einer 1,5 molaren Lösung von 1,7-Diethylenglycol in Toluol. Nach Reinigung des Produktes mittels Vakuumdestillation wird das Produkt wieder in Toluol gelöst, und 1 Mol Allylalkohol wird zugegeben, bevor 2 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt wird. Das Produkt wird wieder destilliert und dann in bekannter Weise zu dem Trimethoxysilan hydrosiliert.
Oberflächen-aktivierte Objektträger werden silanisiert durch Inkubation für eine Zeitdauer von 2 Stunden in einer 1g/l Lösung des Silans in Toluol. Nachfolgend werden die Objektträger dreimal in Toluol gewaschen und dann einer Hitzebehandlung von 2 Stunden bei 130ºC unterzogen. Derartige Objektträger werden mit aminomodifizierten Oligonukleotiden bedruckt und in einer Feuchtekammer bei 50ºC für 2 Stunden fixiert. Die GEETS-Objektträger sind vergleichbar mit Objekttritgern, die mit Epoxypropyltrimethoxysilan behandelt werden. Die gesteigerte Benetzbarkeit der mit GEETS behandelten Objektträger ist signifikant höher, was zu einer verbesserten Kopplung der Oligonukleotide and die Oberfläche und zu einem größeren Tropfendurchmesser führt. Eine Hybridisierung mit komplementären Oligonukleotiden innerhalb derartiger Spots auf den mit GEETS behandelten Objektträgern resultiert in einem stärkeren Hybridisierungssignal.

Claims

1. Linker-System zur Aktivierung von Oberflächen für die Biokonjugation mit der allgemeinen Formel (1):

X-[(Y1)i-Q-(Y2)j]k-Z (I)

in der X eine reaktive Gruppe bedeutet, die kovalent an eine Oberfläche binden kann, Z eine reaktive Gruppe bedeutet, die kovalent an ein Biomolekül binden kann, mit der Maßgabe, dass X nicht Z bedeutet, Y1 und Y2 unabhängig voneinander CR1R2 bedeuten, wobei R1 und R2 unabhängig voneinander H, C1-C4-Alkyl, C1-C4- Alkoxy oder C1-C4-Acyloxy bedeuten, i, j, k unabhängig voneinander eine ganze Zahl im Bereich von 1 bis 10 bedeuten, mit der Maßgabe, dass die Gesamtanzahl an C-Atomen in Y1 und Y2, die C-Atome von R1 und R2 nicht eingeschlossen, im Bereich von 2 bis 100 liegt, und Q ein(e) hydrophile(s) Atom oder Gruppe bedeutet, dass/die aus der aus 0, NH, C=O, O-C=O und CR3R4 bestehenden Gruppe ausgewählt ist, wobei R3 und R4 unabhängig voneinander aus der aus H, OH, C1-C4-Alkoxy und C1-C4-Acyloxy bestehenden Gruppe ausgewählt sind, mit der Maßgabe, dass R3 und R4 nicht gleichzeitig H bedeuten und dass für Q = NH Z nicht NH2 ist, und wobei im Fall von k> 1 die Q's für jedes [(Y1)i-Q-(Y2)j]k unabhängig voneinander ausgewählt sind.

2. Linker-System nach Anspruch 1, wobei die reaktive Gruppe X ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer Disulfidgruppe, einer Thiolgruppe, einer SiW3-Gruppe, wobei W ein(e) hydrolysierbare(s) Atom oder Gruppe bedeutet, und einer Gruppe, die freie Radikale bilden kann, wie z. B. eine Anthrathiongruppe oder ein Derivat davon, eine Anthrachinongruppe oder ein Derivat davon, eine Benzophenongruppe oder ein Derivat davon.

3. Linker-System nach Anspruch 2, wobei das/die hydrolysierbare Atom oder Gruppe W aus der aus Halogenen, C1-C4-Alkoxy-, C1-C4-Acyloxy- und Aminogruppen bestehenden Gruppe ausgewählt ist.

4. Linker-System nach einem der vorstehenden Ansprüche, wobei die reaktive Gruppe Z nukleophile Substitutionsreaktionen, nukleophile Additionsreaktionen, Diels-Alder- Reaktionen oder radikalische Substitutionen eingehen kann.

5. Linker-System nach Anspruch 4, wobei die reaktive Gruppe Z ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer reaktiven Doppelbindung, einer Diengruppe, einer dienophilen Gruppe, einer Epoxygruppe, einer Aldehydgruppe, einer Hydroxylgruppe, einer Carbonsäuregruppe, einer Aktivestergruppe, einer Aminogruppe, einer Disulfidgruppe, einer Thiolgruppe, einer Aziridingruppe, einer Isocyanatgruppe, einer Isothiocyanatgruppe, einer Azidgruppe und einer reaktiven Austrittsgruppe.

6. Oberfläche, die ein Linker-System nach einem der Ansprüche 1 bis 5 trägt.

7. Oberfläche nach Anspruch 6, wobei das Linker-System in einem Bereich ein Muster bildet.

8. Oberfläche nach Anspruch 6 oder 7, wobei die Oberfläche ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einer SiO2-Oberfläche eines Siliziumwafers, Glas, Quarz, Quarzglas, Gold und einem Polymer bestehenden Gruppe.

9. Oberfläche nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das Linker-System kovalent an ein Biomolekül gebunden ist.

10. Oberfläche nach Anspruch 9, wobei das Biomolekül ein Partner eines spezifisch wechselwirkenden Systems komplementärer Bindungspartner ist.

11. Oberfläche nach Anspruch 10, wobei das spezifisch wechselwirkende System komplementärer Bindungspartner auf einer Nukleinsäure/Komplementär-nukleinsäure-, Peptidnukleinsäure/Nukleinsäure-, Enzym/Substrat-, Rezeptor/Effektor-, Lektin/Zucker-, Antikörper/Antigen-, Avidin/Biotin- oder Streptavidin/Biotin- Wechselwirkung beruht.

12. Oberfläche nach Anspruch 11, wobei die Nukleinsäure eine DNA oder RNA ist.

13. Oberfläche nach Anspruch 12, wobei die DNA oder RNA ein Oligonukleotid oder ein Aptamer ist.

14. Oberfläche nach Anspruch 11, wobei der Antikörper ein polyklonaler, monoklonaler, chimärer oder Single-Chain-Antikörper oder ein funktionelles Fragment oder Derivat derartiger Antikörper ist.

15. Verfahren zum Nachweis eines Biomoleküls, welches ein Partner eines spezifisch wechselwirkenden Systems komplementärer Bindungspartner ist, bei dem

a) eine Oberfläche nach einem der Ansprüche 10 bis 14 mit einer Probe in Kontakt gebracht wird, die vermutlich den komplementären Bindungspartner enthält,

b) unspezifisch gebundene Probenbestandteile in einem Waschschritt entfernt werden und

c) die spezifisch gebundenen Probenbestandteile nachgewiesen werden.

16. Verfahren nach Anspruch 15, wobei für den Nachweis eine farbige, fluoreszierende, biolumineszierende, chemolumineszierende, phosphoreszierende oder radioaktive Markierung, ein Enzym, ein Antikörper oder ein funktionelles Fragment oder Derivat davon, ein auf Protein A/Gold basierendes System, ein auf Biotin/Avidin/Streptavidin basierendes System oder ein auf einer Enzymelektrode basierendes System verwendet wird.

17. Verfahren zur Isolierung eines Biomoleküls, das ein Partner eines spezifisch wechselwirkenden Systems komplementärer Bindungspartner ist, bei dem

b) unspezifisch gebundene Probenbestandteile in einem Waschschritt entfernt werden, und, gegebenenfalls,

c) die spezifisch gebundenen Probenbestandteile eluiert werden.

18. Verwendung eine Oberfläche nach einem der Ansprüche 10 bis 14 als Affinitätsmatrix.

19. Verwendung einer Oberfläche nach einem der Ansprüche 10 bis 14 als Sensorchip oder Biochip.

20. Medizinisches oder diagnostisches Instrument, das eine Oberfläche nach einem der Ansprüche 10 bis 14 aufweist.