DE102004038163A1

DE102004038163A1 - Fluoreszenz-basierte Assays zur schnellen, quantitativen Analyse von Biomolekülen (Proteine und Nukleinsäuren) durch Anreicherung auf Zellen oder Beads

Info

Publication number: DE102004038163A1
Application number: DE200410038163
Authority: DE
Inventors: Marina Sauer
Original assignee: DIACDEM CHIP TECHNOLOGIES GmbH
Current assignee: DIACDEM CHIP TECHNOLOGIES GmbH
Priority date: 2004-08-06
Filing date: 2004-08-06
Publication date: 2006-03-16
Also published as: WO2006015810A3; WO2006015810A2; WO2006015810B1

Abstract

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Detektion mindestens eines Moleküls (212) in einer Lösung in einem Reaktionsreservoir eines Mikrofluidik-Chips mit einem Boden, wobei DOLLAR A a) das zu detektierende Molekül mit mit geeigneten Antikörpern beschichteten Kügelchen (210) und mit farbstoffmarkierten Sekundärantikörpern (214) in Kontakt gebracht wird, DOLLAR A b) wobei sich das zu detektierende Molekül mit den genannten Substanzen bindet, DOLLAR A c) wobei sich ein Komplex (216) aus zu detektierendem Molekül, Kügelchen und farbstoffmarkierten Sekundärantikörpern bildet und DOLLAR A d) wobei dieser Komplex sedimentiert und am Boden nachgewiesen wird.

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur schnellen, quantitativen Detektion mindestens eines Moleküls, insbesondere eines Biomoleküls, in Lösung, wobei das Molekül mit mindestens zwei weiteren modifizierten Substanzen in Kontakt gebracht wird und der sich daraus bildende Komplex durch Anreicherung auf Zellen oder Beads nachgewiesen wird.

Zum Nachweis bestimmter Antigene oder Antikörper wird hauptsächlich der ELISA (Enzyme-Linked-Immuno-Sorbent-Assay) eingesetzt. Hierbei wird im allgemeinen ein Fängermolekül (Antigen oder Antikörper) unspezifisch am Boden einer Mikrotiterplatte immobilisiert (meist Adsorption auf Glassoberflächen). Nach Zugabe der zu untersuchenden Probe (Inkubationszeit bis zu Stunden) wird die Oberfläche mindestens einmal gewaschen um unspezifisch adsorbierte Moleküle zu entfernen. Im nächsten Schritt folgt die Inkubation mit einem sogenannten „Detektormolekül" (üblicherweise Sekundärantikörper, die mit einem Enzym, z. B. Meerrettichperoxidase, markiert sind), das ebenso spezifisch an das gesuchte Molekül in einer Sandwich-Konfiguration bindet. Nach weiteren Waschschritten wird die Probe mit einer farbgebenden Substanz inkubiert. Diese Substanz wird durch das Enzym am Detektormolekül z. B. durch Oxidation in eine farbige Verbindung überführt. Letztendlich wird die Farbigkeit im Überstand der Probe gemessen, die direkt mit der Gegenwart der nachzuweisenden Substanz korreliert ist. Aufgrund des Amplifizierungsschrittes (jedes Enzym bildet viele farbige Moleküle) erreichen ELISA's eine hohe Empfindlichkeit im Bereich von 10^-9 bis 10^-11 M Zielmolekül. Nachteile sind die vielen Waschschritte, die lange Dauer (mehrere Stunden) und die unspezifische Adsorption an den Glassoberflächen.

Zum Nachweis spezifischer DNA-Sequenzen gibt es verschiedene Standardverfahren, die alle auf der Hybridisierung eines komplementären, farbstoffmarkierten Oligonukleotids beruhen. Bei DNA-Chips wird die Probe in der Regel ebenfalls mehrmals gewaschen, um unspezifisch adsorbierte Nukleinsäuren und den Überschuss an farbstoffmarkiertem Oligonukleotid zu entfernen.

Die bisher eingesetzten Verfahren sind somit nicht für einen Einsatz bspw. in einem Mikrofluidik-Chip geeignet, bei dem Waschschritte nur schwer zu realisieren sind.

Die Erfindung stellt sich daher die Aufgabe, ein Verfahren zur Detektion von mindestens einem Molekül bereitzustellen, was spezifisch und sensitiv genug ist, einen schnellen, quantitati ven Nachweis des Moleküls auf unterschiedlichsten Trägerflächen zu gewährleisten.

Lösung

Diese Aufgabe wird durch die Erfindungen mit den Merkmalen der unabhängigen Ansprüche gelöst. Vorteilhafte Weiterbildungen der Erfindungen sind in den Unteransprüchen gekennzeichnet. Der Wortlaut sämtlicher Ansprüche wird hiermit durch Bezugnahme zum Inhalt dieser Beschreibung gemacht.

Die spezifische Erkennung und Aktivität von Biomolekülen (Nukleinsäuren, Antikörpern, Enzyme etc.) kann gekoppelt werden mit der Aufkonzentrierung der nachzuweisenden Moleküle auf z. B. Kügelchen in einem Beobachtungsvolumen, und dass diese Koppelung eine schnelle, quantitative Analyse eines z. B. positiven Fluoreszenzsignals ermöglicht.

Im folgenden werden einzelne Verfahrensschritte näher beschrieben. Die Schritte müssen nicht notwendigerweise in der angegebenen Reihenfolge durchgeführt werden, und das zu schildernde Verfahren kann auch weitere, nicht genannte Schritte aufweisen.

Es wird ein Verfahren zur Detektion mindestens eines Moleküls in einer Lösung in einem Gefäß mit einem Boden vorgeschlagen. Dazu wird das zu detektierende Molekül mit mindestens einer modifizierten ersten Substanz und mindestens einer farbstoffmarkierten zweiten Substanz in Kontakt gebracht. Das zu detektierende Molekül bindet an der modifizierten ersten Substanz und der farbstoffmarkierten zweiten Substanz. Dadurch entsteht ein Komplex aus zu detektierendem Molekül, modifizierter erster Substanz und farbstoffmarkierter zweiter Substanz. Dieser Kom plex sedimentiert mindestens zum Teil und kann am Boden nachgewiesen werden.

Dieses Verfahren eignet sich beispielsweise für den Einsatz in einem Mikrofluidik-Chip, der die zu analysierende Lösung (z. B. Blutserum, Sekret, etc.) mittels Kapillarkräften aufsaugt und in eine variable Anzahl von Reaktionsgefäße bzw. Reaktionsreservoirs (z. B. 96), in denen die spezifischen Nachweisreaktionen ablaufen, überführt. In den Reaktionsreservoirs befinden sich bereits vor dem Eintritt der zu analysierenden Lösung die modifizierte erste Substanz und die farbstoffmarkierte zweite Substanz, die das Vorhandensein des zu detektierenden Moleküls durch beispielsweise einen deutlichen Fluoreszenzanstieg anzeigen. Diese Substanzen liegen in der Regel getrocknet am Boden der Reaktionsreservoirs. Durch der Eintritt der zu untersuchenden Lösung werden sie von Boden gelöst.

Im Gegensatz zu den meisten bisher eingesetzten Mikrotiterplatten finden die spezifischen Nachweisreaktionen in Lösung, ohne Einsatz jeglicher Waschschritte, statt. Die Nachweisempfindlichkeiten des Verfahrens liegen in Abhängigkeit vom jeweiligen Assay im mikro- (10^-6 M) bis pikomolaren (10^-12 M) Bereich.

Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindungen handelt es sich bei dem zu detektierenden Molekül um ein Biomolekül, insbesondere um eine Nukleinsäure, ein Antigen, einen Antikörper und/oder ein Enzym. Weitere Biomoleküle, die unter Inanspruchnahme des erfindungsgemäßen Verfahrens nachgewiesen werden können, sind dem Fachmann geläufig, und sie können beispielsweise die Gruppe der Peptide, Proteine, Kohlenhydrate etc., aber auch komplexere Strukturen wie Viren, Viroide, Prionen etc. umfassen.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der modifizierten ersten Substanz um Kügelchen mit einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 50 μm, vorzugsweise ca. 1 bis 10 μm, insbesondere ca. 2 bis 3 μm. Diese Kügelchen können aus sämtlichen, für den Einsatz des erfindungsgemäßen Verfahrens vorteilhaften Materialien bestehen, sofern sie sich gemäß Ihrem geplanten Einsatzgebiet modifizieren lassen. Als besonders vorteilhaft haben sich Kügelchen aus Polystyrol erwiesen, die zusätzlich auch einen Eisenkern aufweisen können. Durch Einsatz solcher Kügelchen mit einem z. B. Eisenoxidkern können zusätzliche Aufkonzentriereffekte am Boden des Reservoirs vorgenommen werden, beispielsweise durch Zuhilfenahme eines Magneten.

In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird die Oberfläche der modifizierten ersten Substanz mit spezifischen Ankermolekülen modifiziert durch Beschichtung. Bei den spezifischen Ankermolekülen handelt es sich gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform um Antikörper, Antigene, Peptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren und/oder Zellen. Dies stellt keine abschließende Auflistung der möglichen Ankermoleküle dar und weitere, dem erfindungsgemäßen Verfahren zugängliche Ankermoleküle (z. B. Viren, Viroide, Prionen etc.) sind dem Fachmann geläufig und werden ebenfalls von der vorliegenden Erfindung umfasst.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der farbstoffmarkierten zweiten Substanz um farbstoffmarkierte Sekundärantikörper, Substanzen, die durch die Bindung an das zu detektierende Molekül fluoreszenzfähig werden, z. B. konformaktiv flexible smart probes, und/oder komplementäre Oligonukleotide. Die konformativ flexiblen, sogenannten „Smart Probes" (siehe z. B. WO 01/36668 A1) erhöhen das Signal zu Hintergrund Verhältnis und können beispielsweise als fluoreszenzmarkierte Sonden eingesetzt werden, die durch Anbinden an das Zielmolekül ihre Fluoreszenzintensität drastisch erhöhen. Damit lassen sich höhere Sonden-Konzentrationen, ohne Erhöhung der Hintergrundfluoreszenz, erzielen. Die bisher erfolgreich entwickelten „Smart Probes" erlauben die Detektion bestimmter DNA-Zielsequenzen und bestimmter tumorassoziierter Antikörper direkt in beispielsweise Blutproben von Patienten.

Dabei können gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform verschiedene zu detektierende Moleküle mit verschiedenen farbstoffmarkierten Substanzen interagieren, vorzugsweise spezifisch mit diesen binden. Diese spezifische Interaktion kann dann zu mindestens zwei, vorzugsweise mehrerer Farbreaktionen führen, wobei diese dann nach Art der Farbe getrennt erfasst und ausgewertet werden können.

Es können für die Detektion unterschiedlicher zu detektierender Moleküle auch unterschiedliche, jeweils spezifisch bindende Substanzen verwendet werden, wobei die Substanzen jeweils mit spektroskopisch unterscheidbaren Farbstoffen markierten werden. Vorteilhafterweise handelt es sich bei den Farbstoffen um Fluoreszenzfarbstoffe, die spektroskopisch unterscheidbar sind. Spektroskopisch unterschieden werden können Farbstoffe beispielsweise aufgrund des Absorptionsspektrums, des Emissionsspektrums, der Fluoreszenz-Lebensdauer, der Triplett-Lebensdauer, etc.

Die Effizienz dieser Technik kann durch die Optimierung der verwendeten Fluoreszenzfarbstoffe noch weiter gesteigert werden. So ist es zum Beispiel möglich, mit Hilfe von verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffen beispielsweise Prionen und Viren auf oder in Zellen nachzuweisen. Man kann ferner bei dieser Möglichkeit auch durch Nutzung von Fluoreszenzfarbstoffen mit unterschiedlichen Absorptionswellenlängen Mehrfachmarkierungen durchführen. Zur Lösung des gestellten Problems kann ein gemischt homogen/heterogen basiertes Verfahren eingesetzt werden.

Für den Nachweis bestimmter proteolytischer Enzyme (Proteasen) können mit einem Tryptophanrest modifizierte und farbstoffmarkierte Protease-Substrate (kurze Peptide) auf den Kügelchen immobilisiert werden. Hierbei wird die Farbstofffluoreszenz durch die räumliche Nähe zum Tryptophanrestes effizient gelöscht. In Gegenwart der Protease wird die Aminosäurensequenz zwischen Farbstoff und Tryptophanrest hydrolisiert (geschnitten), wodurch die räumliche Nähe aufgehoben ist und ein starker Fluoreszenzanstieg resultiert. Bleibt derjenige Teil des Protease-Substrats, der den Farbstoff trägt, nach der Hydrolyse auf dem Kügelchen immobilisiert, so kann durch quantitatives Auslesen der Fluoreszenz auf der Kugeloberfläche die Proteasekonzentration bestimmt werden.

Ähnliche farbstoffmarkierte Peptide können ebenso für den spezifischen Nachweis bestimmter Antikörper direkt im Blutserum eingesetzt werden. Hierbei wird der fluoreszenzlöschende Einfluss des Tryptophanrestes, der durch Kontaktbildung zum Farbstoff ausgelöst wird, durch das Binden des Peptids an den Antikörper und der damit verbunden Konformationsänderung im Peptid verhindert, wodurch es zu einem Fluoreszenzanstieg kommt (siehe z. B WO 1003/014742 A2). Durch Bindung des geeigneten, farbstoffmarkierten Peptids auf der Oberfläche der Kügelchen kann der Antikörper durch einen Anstieg des Fluoreszenzsignals auf dem Kügelchen nachgewiesen werden.

Bestimmte Nukleinsäureabschnitte (die spezifisch für eine Antibiotikaresistenz oder eine virale Erkrankung sind) können im gleichen Assay-Format durch den Einsatz von DNA-Hairpins („Smart Probes", siehe z. B. WO 01/36668 A1) nachgewiesen wer den. Hierbei wird die zu untersuchende Probe mit Hilfe der PCR und einem biotinylierten Primer amplifiziert. Im Reaktionsreservoir befinden sich mit Streptavidin gecoatete Kügelchen und für die jeweilige DNA-Sequenz spezifische DNA-Hairpins. DNA-Hairpins sind einzelsträngige Oligonukleotide, die aufgrund der Komplementarität der DNA-Bausteine an beiden Enden eine Stamm/Schleife-Struktur einnehmen. Bei den zur Verwendung kommenden DNA-Hairpins wird ein geeigneter Fluoreszenzfarbstoff an einem Ende des Oligonukleotids angebracht, der durch Guanosin im komplementären anderen Ende im geschlossenen Zustand des DNA-Hairpins gelöscht wird. Findet der DNA-Hairpin die seiner Schleife komplementäre DNA-Sequenz auf dem Kügelchen, hybridisiert er spontan unter Ausbildung des thermodynamisch günstigeren Doppelstranges. Hierdurch wird die Stamm/Schleife-Struktur zerstört und gleichzeitig die durch den Kontakt mit dem Guanosinrest induzierte Fluoreszenzlöschung des Farbstoffs aufgehoben.

Gemäß einer weiteren bevorzugten Ausführungsform zeichnet sich das erfindungsgemäße Verfahren dadurch aus, dass für den Nachweis des zu detektierenden Moleküls der Fluoreszenzfarbstoff mittels Laser und/oder Leuchtdioden mindestens einer geeigneten Wellenlänge angeregt wird. Das quantitative Auslesen der Fluoreszenzsignale kann dabei nach homogener Anregung der einzelnen Reaktionsgefäße erfolgen. Dabei kann eine räumlich begrenzte Anregungen des Fluoreszenzfarbstoffes in z-Richtung erfolgen, also in einer Richtung senkrecht zum Boden des Gefäßes, auf dem die Bindungskomplexe sedimentieren. Durch die zusätzliche räumlich begrenzte Anregung der Reaktionsgefäße in z-Richtung kann spezifisch nur die Fluoreszenz am Boden der Reaktionsreservoirs ausgelesen und damit eine noch bessere Diskriminierung erreicht werden.

In einer bevorzugten Ausführungsform wird der Nachweis des zu detektierenden Moleküls unter Einsatz einer CCD-Kamera und/oder einer optischen Pinzette erbracht. Dabei kann es sich bei der optischen Pinzette um einen gepulsten Infrarot-Laser handeln. Es ist möglich, die Kügelchen mit einer optischen Pinzette aufgrund des Strahlungsdrucks im Laserfokus zu fangen und selektiv nur die Fluoreszenz auf der Kugeloberfläche auszulesen. Dies kann durch die Verwendung eines gepulsten Infrarot-Lasers (mit einer Wellenlänge zwischen ca. 800 und ca. 1100 nm) realisiert werden, der einerseits die Kügelchen fängt und gleichzeitig die Fluoreszenz der Farbstoffe durch Zwei-Photonen-Anregung generiert. Die verwendete Optik wird durch die komplementäre Einsatzmöglichkeit der Ein- und Zwei-Photonen-Mikroskopie nicht beeinträchtigt.

Zur Parallelisierung der Technik können neue Multistrahlsysteme mit bspw. 8 × 8 Laserstrahlen vorteilhaft eingesetzt werden. Hierbei wird der Anregungslaserstrahl durch eine Kombination von Strahlteilern und Spiegeln in 64 Strahlen zerlegt. Die Strahlen können dann entweder mit Hilfe eines Piezo-Scanner-Spiegels schnell (d. h. im Bereich von Millisekunden) über den Boden des Reservoirs gescannt und ein fluoreszenzmikroskopisches Bild auf dem CCD-Chip erzeugt, oder stationär zum Einfangen von Kügelchen mit gleichzeitiger Auslesung der Fluoreszenz verwendet werden.

Das Detektionsprinzip erlaubt ebenso den Einsatz verschiedener Anregungswellenlängen zur simultanen Bestimmung verschiedener Zielmoleküle pro Reservoir („Multiplexing"). Hierbei können beispielhaft die Sonden mit zwei spektral unterschiedlichen Farbstoffen und die Kügelchen mit verschiedenen Fängermolekülen modifiziert werden. Bei gleichzeitiger Anregung mit zwei Laserwellenlängen für den Fall der Ein-Photonen-Anregung können die Signale der beiden Farbstoffe spektral separiert durch einen dichroitischen Strahlteiler gleichzeitig auf verschiedenen Bereichen des CCD-Chips ausgelesen werden. Für den Fall der Zwei-Photonen-Anregung können Farbstoffe selektiert werden, die mit der gleichen Laserwellenlänge effizient angeregt werden können, sich aber in ihrem Emissionsspektrum eindeutig unterscheiden. Der Einsatz der Ein- oder Zwei-Photonen-Anregung wird letztendlich durch die Anzahl der parallel nachzuweisenden Zielmoleküle und die dafür zur Verfügung stehenden Kosten kontrolliert.

In einer besonders bevorzugten Ausführungsform erfolgt der Nachweis des zu detektierenden Moleküls im roten Spektralbereich. Im roten Spektralbereich gibt es kaum natürliche Stoffe oder Moleküle, die Licht noch effizient absorbieren und auch noch fluoreszieren, so dass zur Reduzierung der Autofluoreszenz in biologischen Proben die Fluoreszenzanregung der Probe vorzugsweise im diesem Spektralbereich erfolgt.

Das geschilderte Verfahren lässt sich wie folgt charakterisieren:

(1) In der ersten Variante befinden sich bestimmte nicht fluoreszenzmarkierte Fängermoleküle auf den Kügelchen. Fängermoleküle sind Antikörper, Antigene, Peptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren etc. Alternativ können aber auch Zellen, die bestimmte antigene Oberflächenstrukturen besitzen, z. B. Erythrozyten zur Bestimmung der Blutgruppen, eingesetzt werden. Wichtig ist nur, dass die Kügelchen, bzw. Zellen, so groß sind, dass sie schnell (Sekunden bis Minuten) sedimentieren. Bei Verwendung von Polystyrolkügelchen kann zusätzlich ein Eisenkern verwendet werden, damit die Kügelchen mit magnetischen Kräften manipuliert werden können. Andererseits können die Kügelchen oder Zellen mittels optischen Kräften gefangen und bewegt werden. Zusätzlich werden Detektormoleküle (farbstoffmarkierte Sekundärantikörper oder komplementäre Oligonukleotide) benötigt, die ebenfalls bei Vorhandensein an die Zielmoleküle binden. Durch die Aufkonzentrierung des Fluoreszenzsignals auf der Kügelchenoberfläche und Sedimentation der Kügelchen kann eine einfache und quantitative Detektion bestimmter Zielmoleküle erreicht werden. Das Verfahren kann ohne große Umstände direkt für die meisten gängigen ELISA's und jede nachzuweisende DNA-Sequenz sofort eingesetzt werden.
(2) In der zweiten Variante können farbstoffgelöschte Proteasesubstrate oder Peptid-Epitope oder DNA-Hairpins auf der Kügelchenoberfläche immobilisiert werden. In Gegenwart des Zielmoleküls kommt es zur Anbindung an die Oberfläche und zu einem Signalanstieg, der quantitativ ausgelesen werden kann.
(3) In der dritten Variante kann für den Nachweis bestimmter DNA-Sequenzen die vorher immer durchgeführte PCR-Amplifizierung bspw. mit einem biotinylierten Primer durchgeführt werden. Nach Denaturierung der PCR-Produkte werden sie zu mit Streptavidin beschichteten Kügelchen und DNA-Hairpins (Smart Probes, Gen-Pins, siehe oben) oder normalen farbstoffmarkierten Oligonukleotiden gegeben. Die PCR-Produkte binden auf der Oberfläche der Kügelchen und die Sonden hybridisieren in Gegenwart der komplementären Zielsequenz. Somit kommt es ebenso zu einer Anreicherung der Fluoreszenzsignals auf der Oberfläche, die nach Sedimentation der Kügelchen leicht quantitativ ausgelesen werden kann.

Für die Detektion mindestens eines Moleküls in einer Lösung eignet sich ein Kit mit Kügelchen mit einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 50 μm, vorzugsweise ca. 1 bis 10 μm, insbesondere ca. 2 bis 3 μm, deren Oberfläche mit spezifischen Ankermolekülen für das zu detektierende Molekül modifiziert wurde. Ferner enthält der Kit

a) farbstoffmarkierten Sekundärantikörper, und/oder
b) Substanzen, die durch die Bindung an das zu detektierende Molekül fluoreszenzfähig werden.

Für die Detektion kann ein Mikrofluidik-Chip mit Reaktionsreservoirs verwendet werden, die folgendes enthalten: Kügelchen mit einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 50 μm, vorzugsweise ca. 1 bis 10 μm, insbesondere ca. 2 bis 3 μm, deren Oberfläche mit spezifischen Ankermolekülen für das zu detektierende Molekül modifiziert wurde. Ferner enthalten die Reaktionsreservoirs

a) farbstoffmarkierte Sekundärantikörper, die das zu detektierende Molekül binden können; und/oder
b) Substanzen, die durch die Bindung an das zu detektierende Molekül fluoreszenzfähig werden.

Potentielle Anwendungsfelder sind z. B.:

(1) Immunhämatologie (z. B. Blutgruppenbestimmung)
(2) Nachweis von Tumormarkern (Proteasen, p53, Antikörper)
(3) Bestimmung genetischer Dispositionen (Antibiotika-Resistenz, HIV, HCV)
(4) Bestimmung von Blutgerinnung und Kardiakmarkern.

Weitere Einzelheiten und Merkmale der Erfindung ergeben sich aus der nachfolgenden Beschreibung der Darstellung des erfindungsgemäßen Verfahrens und von bevorzugten Ausführungsformen in Verbindung mit den Unteransprüchen. Hierbei können die je weiligen Merkmale für sich alleine oder zu mehreren in Kombination miteinander verwirklicht sein.
In den Abbildungen zeigt:
1 eine schematische Darstellung des Mikrofluidik-Chips;
2 eine schematische Darstellung des Detektionsverfahrens;
3 ein beispielhaftes Messergebnis für die Detektion von Anti-Heparin/PF4-Antikörpern in Blutseren; und
4 eine schematische Darstellung eines farbstoffmarkierten Peptids mit Tryptophanrest; und
5 eine schematische Darstellung des Nachweises einer Protease.
Beispiel 1
Das grundlegende Prinzip des Nachweisverfahrens ist in der 1 für den Nachweis bestimmter Antigene in einem Mikrofluidik-Chip 110 schematisch zusammengefasst.
In den Reaktionsreservoirs 112 befinden sich (getrocknet) Kügelchen 210 (siehe 2) mit einem Durchmesser von 2-3 μm, deren Oberfläche mit spezifischen Ankermolekülen (z. B. Antikörper) so modifiziert wurde, dass die Zielmoleküle 212 (Antigene) bei Vorhandensein spezifisch binden. Zusätzlich befinden sich farbstoffmarkierte Sonden 214 (z. B. Sekundärantikörper) in jedem Reaktionsreservoir 112, die ebenfalls spezifisch an die Zielmoleküle 212 binden.
Die Mikrofluidik-Chips 110 weisen Befüllreservoirs 114 auf, in die die Probe bzw. zu untersuchende Lösung, z. B. Blutserum, getropft wird. Von den Befüllreservoirs 114 wird die Probe durch Kapillarkräfte durch Befüllungskapillaren 116 zu den Reaktionsreservoirs 112 geleitet. Die Luft im Reaktionsreservoirs 112 entweicht durch Entlüftungskapillare 118. Der Mikrofluidik-Chip ist durch eine Folie 120 abgedeckt.
Beim Befüllen der Reaktionsreservoirs 112 mit der Probe kommt es zu einer starken Durchmischung der Probe mit den vorgelegten Kügelchen 210 und Sonden 214 und bei Vorhandensein der Zielmoleküle 212 zur Anbindung an die Sonden 214 und die Kügelchen 210. Es bildet sich ein „Sandwich"-Komplex 216 aus.
Die Kügelchen 210 ebenso wie der Komplex 216 sedimentieren innerhalb weniger Minuten quantitativ auf den Boden des Reaktionsreservoirs, wo sie fluoreszenzmikroskopisch leicht abgebildet werden können (siehe 3 linke Hälfte). Bei einer negativen Probe (siehe 3 rechte Hälfte) zeigen die sedimentierten Kügelchen 210 keine Fluoreszenz. Die aufgrund der farbstoffmarkierten Sonden 214 resultierende Hintergrundfluoreszenz ist bei fluoreszenzmikroskopischer Abbildung der Bodenoberfläche des Reservoirs 112 sehr gering.
Das Verfahren nutzt

(a) die Sedimentation der Kügelchen, d.h. die Möglichkeit der lokalen mikroskopischen Abbildung der Oberfläche und
(b) die Aufkonzentrierung des Fluoreszenzsignals auf der Kugeloberfläche zur eindeutigen Diskriminierung vom Hintergrundsignal.

3 zeigt als Beispiel das Fluoreszenzbild für die Detektion von Anti-Heparin/PF4-Antikörpern in Blutseren. Hierzu wurde Heparin/PF4 auf 2.7 μm großen Polystyrolkügelchen immobilisiert und ein Sekundärantikörper (goat-anti-human) mit einem im roten Spektralbereich absorbierender Farbstoff (Alexa 633) markiert.
Der Sekundärantikörper und die modifizierten Kügelchen wurden anschließend mit verschiedenen Blutseren gemischt und schließlich ein Tropfen der Mischung auf ein Mikroskop-Abdeckgläschen gegeben und mit Hilfe eines Standard-Fluoreszenzmikroskops – mit einer Quecksilber-Lampe als Anregungsquelle – mit einem geeigneten Filtersatz und einer CCD-Kamera die Fluoreszenz am Boden des Abdeckgläschens ohne Waschschritte ausgelesen. In 3 links ist das positiv Ergebnis gezeigt. Die rechte Hälfte von 3 zeigt eine negative Testlösung. Die Fluoreszenz der farbstoffmarkierten Sekundärantikörper im Überstand stört die Detektion nur geringfügig, da es zu einer Aufkonzentrierung des Signals an der Oberfläche der Kügelchen kommt und die Kügelchen in wenigen Minuten quantitativ auf den Boden des Abdeckgläschens fallen. Das Signal/Hintergrund-Verhältnis kann zudem leicht durch den Einsatz der bildgebenden (d.h. Scanning) konfokalen Fluoreszenzmikroskopie, die eine bessere z-Schärfe besitzt erhöht werden. Die gleichen Tests wurden ebenso erfolgreich für die Bestimmung von Blutgruppen und anderen Antigenen eingesetzt.
Beispiel 2
Unter den 20 natürlich vorkommenden Aminosäuren gibt es ähnlich wie bei den DNA-Basen nur eine Aminosäure, nämlich Tryptophan, die die Fluoreszenz ausgewählter Farbstoffe selektiv löscht. Dieses Löschprinzip kann ebenso zur Entwicklung von Sonden auf Peptidbasis zur Detektion von Antikörpern ausgenutzt werden.
Im folgenden wird auf 4 Bezug genommen. 4 zeigt im oberen Bereich eine Gleichgewichtsreaktion zwischen zwei Konformationen eines Peptids. Das Peptid hat einen ersten fluores zenzmarkierten Teilstrang 412 und einen zweiten Teilstrang 414, der einen Tryptophanrest enthält.
Bedingt durch die konformative Flexibilität des Peptides 410 kann der Tryptophanrest in Kontakt mit dem Farbstoff kommen. Dies ist die in 4 rechts oben gezeigte Konformation. In dieser Konformation ist die Fluoreszenzintensität der Peptid-Sonde 410 stark verringert.
Wenn die Aminosäurensequenz zwischen Farbstoff und Tryptophanrest ein Epitop für einen Antikörper darstellt, wird durch Anbindung des Antikörpers die konformative Flexibilität des Peptids 410 so stark eingeschränkt, dass es zu keiner Kontaktbildung zwischen Farbstoff und Tryptophan mehr kommt, d.h. die Anwesenheit des Antikörpers resultiert in einem Fluoreszenzanstieg. Diese Technik wurde erfolgreich zur Detektion von p53-Autoantikörpern, ein universeller Tumormarker, direkt in Patientenseren eingesetzt (siehe z. B. WO 2003/014742 A2). Werden die farbstoffmarkierten Epitope auf Kügelchen immobilisiert, resultiert das Anbinden der Antikörper an den Peptiden auf der Kügelchenoberfläche in einem starken Fluoreszenzanstieg, der für den Nachweis der Antikörper genutzt werden kann.
Beispiel 3
Die selektive Fluoreszenzlöschung einiger Farbstoffe in tryptophanhaltigen Peptiden 410 kann ebenso erfolgreich zur Detektion verschiedener Proteasen, z. B. tumorassoziierter Proteasen, eingesetzt werden, wenn die Aminosäurensequenz zwischen Farbstoff 412 und Tryptophanrest 414 eine Erkennungssequenz für die Protease enthält, die es der Protease ermöglicht, an dieser Erkennungssequenz das Peptid "durchzutrennen", also zu hydrolisieren. Dies ist in 5 verdeutlicht.
Experimente in homogener Lösung (siehe z. B. WO 02/081509 A2) erlauben die sichere Detektion geringster Proteasekonzentrationen (10^-12 – 10^-15 M) durch einfaches Auslesen der Fluoreszenzintensität.
In der für das hier vorgestellte Verfahren relevanten Variante werden die Peptide 410 so auf der Kugeloberfläche immobilisiert, dass nach dem Schnitt durch die Protease der den Farbstoff tragende Peptidrest 412 auf der Oberfläche verbleibt und somit die Kügelchen nach Sedimentation eine vergleichsweise starke Fluoreszenzintensität aufweisen.

110: Mikrofluidik-Chip
112: Reaktionsreservoirs
114: Befüllreservoir
116: Befüllungskapillare
118: Entlüftungskapillare
120: Folie
210: Kügelchen
212: Zielmoleküle
214: farbstoffmarkierte Sonde
216: „Sandwich"-Komplex
410: fluoreszenzmarkiertes Peptid
412: erster fluoreszenzmarkierten Teilstrang des fluoreszenz
: markierten Peptids 410
414: zweiter Teilstrang des fluoreszenzmarkierten Peptids 410,
: der einen Tryptophanrest enthält

Claims

Verfahren zur Detektion mindestens eines Moleküls (212) in einer Lösung in einem Gefäß (112) mit einem Boden, a) wobei das zu detektierende Molekül (212) mit mindestens einer modifizierten ersten Substanz (210) und mindestens einer farbstoffmarkierten zweiten Substanz (214) in Kontakt gebracht wird; b) wobei das zu detektierende Molekül (212) an der modifizierten ersten Substanz (210) und der farbstoffmarkierten zweiten Substanz (214) bindet; c) wobei sich ein Komplex (216) aus zu detektierendem Molekül (212), modifizierter erster Substanz (210) und farbstoffmarkierter zweiter Substanz (214) bildet; und d) wobei dieser Komplex (216) mindestens zum Teil sedimentiert und am Boden nachgewiesen wird.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem zu detektierenden Molekül (212) um ein Biomolekül, insbesondere um eine Nukleinsäure, ein Antigen, einen Antikörper und/oder ein Enzym handelt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der modifizierten ersten Substanz um Kügelchen (210) mit einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 50 μm, vorzugsweise ca. 1 bis 10 μm, insbesondere ca. 2 bis 3 μm, handelt.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den Kügelchen (210) um Polystyrolkügelchen handelt.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die Polystyrolkügelchen (210) einen Eisenkern aufweisen.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass die Oberfläche der modifizierten ersten Substanz (210) mit spezifischen Ankermolekülen modifiziert wurde.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei den spezifischen Ankermolekülen um Antikörper, Antigene, Peptide, Kohlenhydrate, Nukleinsäuren und/oder Zellen handelt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der farbstoffmarkierten zweiten Substanz (214) um a) farbstoffmarkierte Sekundärantikörper, und/oder b) um Substanzen, die durch die Bindung an das zu detektierende Molekül fluoreszenzfähig werden, und/oder c) komplementäre Oligonukleotide handelt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass für die Detektion unterschiedlicher zu detektierender Moleküle unterschiedliche, jeweils spezifisch bindende Substan zen verwendet werden, wobei die Substanzen jeweils mit spektroskopisch unterscheidbaren Farbstoffen markierten werden.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass die spezifischen Interaktionen zu mindestens zwei, vorzugsweise mehreren Farbreaktionen führt und diese nach Art der Farbe getrennt erfasst und ausgewertet werden.
Verfahren nach einem der 3 vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei dem Farbstoff um einen Fluoreszenzfarbstoff handelt; dass für den Nachweis des zu detektierenden Moleküls der Fluoreszenzfarbstoff mittels Laser und/oder Leuchtdioden mindestens einer geeigneten Wellenlänge angeregt wird; und dass eine räumlich begrenzte Anregung des Fluoreszenzfarbstoffes in Richtung senkrecht zum Boden erfolgt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis des zu detektierenden Moleküls unter Einsatz einer CCD-Kamera und/oder einer optischen Pinzette erfolgt.
Verfahren nach dem vorhergehenden Anspruch, dadurch gekennzeichnet, dass es sich bei der optischen Pinzette um einen gepulsten Infrarot-Laser handelt.
Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, dass der Nachweis des zu detektierenden Moleküls im roten Spektralbereich erfolgt.
Kit für die Detektion mindestens eines Moleküls (212) in einer Lösung mit Kügelchen (210) mit einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 50 μm, vorzugsweise ca. 1 bis 10 μm, insbesondere ca. 2 bis 3 μm, deren Oberfläche mit spezifischen Ankermolekülen für das zu detektierende Molekül modifiziert wurde; und mit a) farbstoffmarkierten Sekundärantikörper (214), und/oder mit b) Substanzen, die durch die Bindung an das zu detektierende Molekül fluoreszenzfähig werden.
Mikrofluidik-Chip (110) mit Reaktionsreservoirs (112), die folgendes enthalten: Kügelchen (210) mit einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 50 μm, vorzugsweise ca. 1 bis 10 μm, insbesondere ca. 2 bis 3 μm, deren Oberfläche mit spezifischen Ankermolekülen für das zu detektierende Molekül modifiziert wurde; und a) farbstoffmarkierten Sekundärantikörper (214), die das zu detektierende Molekül binden können, und/oder b) Substanzen, die durch die Bindung an das zu detektierende Molekül fluoreszenzfähig werden.
Verfahren zum Nachweis eines Antikörpers in einer Lösung, in einem Gefäß (112) mit einem Boden, a) wobei mindestens ein Epitop eines Antigens derart gewählt wird, dass der nachzuweisende Antikörper und das Epitop aneinander binden können; b) wobei das Epitop und ein Fluorophor derart gewählt werden, dass das Epitop mindestens einen Tryptophanrest (Quencher) aufweist, der die Lumineszenz des Fluorophors bei hinreichender räumlicher Nähe zwischen dem Fluorophor und dem Tryptophanrest quenchen kann; c) wobei das Epitop mit dem Fluorophor markiert wird; d) wobei das Epitop auf einer ersten Substanz immobilisiert wird; e) wobei der Antikörper und das an die erste Substanz gebundene, markierte Epitop in der Lösung in Kontakt gebracht werden; f) wobei der zu detektierende Antikörper an das Epitop bindet; g) wobei sich ein Komplex aus zu detektierendem Antikörper, der erster Substanz und dem farbstoffmarkierten Epitop bildet; h) wobei dieser Komplex mindestens zum Teil sedimentiert und am Boden nachgewiesen wird.
Kit für die Detektion mindestens eines Antikörpers mit a) mindestens einem Epitop eines Antigens, das derart gewählt ist, dass der nachzuweisende Antikörper und das Epitop aneinander binden können; b) einem Fluorophor, wobei das Epitop und der Fluorophor derart gewählt sind, dass das Epitop mindestens einen Tryptophanrest (Quencher) aufweist, der die Lumineszenz des Fluorophors bei hinreichender räumlicher Nähe zwischen dem Fluorophor und dem Tryptophanrest quenchen kann, wobei das Epitop mit dem Fluorophor markiert wird; und mit c) Kügelchen mit einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 50 μm, vorzugsweise ca. 1 bis 10 μm, insbesondere ca. 2 bis 3 μm, deren Oberfläche mit dem farbstoffmarkierten Epitop modifiziert wurde.
Mikrofluidik-Chip (110) für die Detektion mindestens eines Antikörpers mit Reaktionsreservoirs (112), die den Kit gemäß dem vorhergehenden Anspruch enthalten.
Kit für die Detektion einer Endopeptidase (Enzym) mit I) einem farbstoffmarkierten Peptid mit den folgenden Eigenschaften: a) das Peptid enthält eine Erkennungssequenz der Endopeptidase (Enzym) und kann daher für das Enzym als Substrat fungieren, wobei sich eine Schnittstelle zwischen zwei Aminosäuren bei der Erkennungssequenz im Peptid ergibt; b) das Peptid enthält mindestens einen Quencher und mindestens einen Fluorophor; c) der Quencher ist die Aminosäure Tryptophan; d) der Fluorophor ist ein Fluoreszenzfarbstoff; e) der Fluoreszenzfarbstoff ist an Peptide oder Proteine kovalent koppelbar; f) die Fluoreszenz des Fluoreszenzfarbstoffs kann durch Tryptophan gelöscht werden; g) die Sequenz des Peptids ist wie folgt ausgebildet: h) der Quencher ist auf einer Seite der Schnittstelle angeordnet; i) der Fluorophor ist auf der anderen Seite der Schnittstelle angeordnet; j) eine hinreichende räumliche Nähe zwischen Quencher und Fluorophor ist gegeben, solange das Substrat noch nicht durch das Enzym an der Schnittstelle zwischen Quencher und Fluorophor geschnitten wurde, um die Möglichkeit einer mindestens teilweisen Löschung der Emission des Fluorophors zu gewährleisten; k) nach dem Schneiden des Substrats durch das Enzym an der Schnittstelle zwischen Quencher und Fluorophor ist ein deutlicher Anstieg der Emission des Fluorophors möglich; und mit II) Kügelchen mit einem Durchmesser von ca. 50 nm bis 50 μm, vorzugsweise ca. 1 bis 10 μm, insbesondere ca. 2 bis 3 μm, auf deren Oberfläche das Peptid derart immobilisiert ist, dass der Fluorophor nach einem Schnitt durch das nachzuweisende Enzym auf der Oberfläche immobilisiert bleibt, während der Quencher nicht mehr auf der Oberfläche immobilisiert ist.
Mikrofluidik-Chip (110) für die Detektion einer Endopeptidase mit Reaktionsreservoirs (112), die den Kit gemäß dem vorhergehenden Anspruch enthalten.
Verfahren zum Nachweis einer Endopeptidase (Enzym) mit folgenden Schritten: mische den Kit nach Anspruch 20 und das nachzuweisende Enzym in einer Lösung, wobei die Kügelchen mindestens zum Teil sedimentieren und die Stärke des Fluoreszenzsignals auf der Oberfläche der sedimentierten Kügelchen nachgewiesen wird.