DE69519463T2

DE69519463T2 - N-morpholino-n-nitrosaminoacetonitril-cyclodextrin-einschlussverbindungen

Info

Publication number: DE69519463T2
Application number: DE69519463T
Authority: DE
Inventors: Joseph Geczy; Jetazsef Szejtli; Julianna Szeman; Lajos Szente; Andrasne Vikmon
Original assignee: Therabel Industries SA
Current assignee: Therabel Industries SA
Priority date: 1994-04-26
Filing date: 1995-04-25
Publication date: 2001-06-28
Anticipated expiration: 2015-04-26
Also published as: IL113491A0; LT4167B; EP0705255B1; EP0705255A1; AU694219B2; DE69519463D1; GR3035356T3; PT705255E; LV11543B; RU2136698C1; LT95133A; SI0705255T1; CA2163539A1; SK155195A3; IL113491A; RO114449B1; FI956156A0; MD950440A; BG61974B1; HU9401183D0

Description

Die Erfindung betrifft physiologisch aktive Stickoxid-freisetzende Mittel, Verfahren zu deren Herstellung und Zusammensetzungen, die dieselben enthalten.
Insbesondere betrifft die Erfindung neue SIN-1A-Einschlussverbindungen, die in ihrem festen Zustand stabil sind, die mit Cyclodextrinen oder Cyclodextrinderivaten gebildet sind, die bei Raumtemperatur auf ein Auflösen in Wasser oder wässerigen Systemen hin Stickoxid freisetzen und die auch Ionen als Katalysator oder Stabilisator enthalten. Die Erfindung betrifft auch Verfahren zu ihrer Herstellung und Zusammensetzungen, die sie enthalten. Nachstehende Abkürzungen werden in dieser Beschreibung verwendet:
SIN-1 3-Morpholinosydnonimin
SIN-1A N-Morpholino-N-nitrosaminoacetonitril
SIN-1C Cyanomethylenaminomorpholin
CDPSI ionisches lösliches β-Cyclodextrinpolymer
DIMEB Heptakis-2,6-di-O-methyl- -cyclodextrin
EDRF Endothel-abgeleiteter Entspannungsfaktor
HPßCD Hydroxypropyl43-cyclodextrin
2,8 Hydroxypropylgruppen pro CD-Einheit (Mittel)
Molsidomin N-Ethoxycarbonyl-3-morpholinosydnonimin
RAMEB statistisch methyliertes ßCD, 12 Methoxylgruppen
pro CD-Einheit (Mittel)
TRIMEB Heptakis-2,3,6-tri-O-methyl-β-cyclodextrin.
Es ist bekannt, dass Stickstoffmonoxid eine reduzierte Form (NO·) aufweisen kann, die als Stickoxidbezeichnet wird, sowie eine oxidierte Form (NO&spplus;), die Nitrosoniumion genannt wird. Stickoxid (NO·) ist in zahlreiche bedeutende Bioregulationsvorgänge involviert. Die Nützlichkeit eines NO-freisetzenden Spenders hängt sowohl vom Ausmaß als auch der Dauer der den mittleren Arteriendruck senkenden Wirkung ab. Es werden längerwirkende NO-Spender benötigt, die das NO ohne Stoffwechselveränderungen der Spender freisetzen, d. h., die nicht von den Leberfunktionen abhängig sind. Des Weiteren sollte ein NO-Spender einen gewissen lipophilen Charakter aufweisen, um Zellmembranen durchqueren zu können, um seine Wirkung auch in den Zielorganen und -geweben auszuüben. Daher sind verhältnismäßig einfache, anorganische Verbindungen für diesen Zweck nicht geeignet. Die Produktgestaltung kann auf drei unterschiedlichen Wegen erfolgen:
a. Die NO-Spender-Vor-Wirkstoffe enthalten die -NO-Gruppe, die entweder direkt durch einen Stoffwechselvorgang oder nach dem Entfernen einer Schutzgruppe - durch enzymatische Hydrolyse - freigesetzt wird. Diese Vorgänge sind in hohem Ausmaß an die Leber gebunden (z. B. Molsidomin).
Die Vor-Wirkstoffe des Sydnonimin-Typs (z. B. Molsidomin) sind von der Leber abhängig, um die schützende Ethoxy-Carbonyl-Gruppe aus dem Molekül zu entfernen, um zunächst SIN-1 zu erzeugen; und anschließend wird (in einem zweiten, pH-abhängigen Vorgang, der durch OLE-Ionen katalysiert wird) das sehr instabile SIN-1A gebildet, das sich unabhängig vom pH mit dem Freisetzen von NO spontan zersetzt.
b. Herstellung von Stickoxid-Addukten oder -Komplexen mit verschiedenen Nucleophilen Im Allgemeinen erfolgt die Synthese der sekundäres Amin-NO-Komplexe wie folgt: Das sekundäre Amin, z. B. wasserfreies Diethylamin, wird in wasserfreiem Ether aufgelöst, Sauerstoff wird unter Verwendung eines Aceton-Trockeneis-Bads aus dem System entfernt und trockenes NO wird 3 Stunden lang bei -78ºC durch die Etherlösung durchgeperlt, und zwar vorzugsweise bei hohem Druck (100 psi).
Die Halbwertszeit des Diethylamin-Stickoxid-Addukts im Stand der Technik Et&sub2;-N-NH- (ONa)-N=O (DEANO) beträgt etwa 2 Minuten, während das Stickoxid-Additionsprodukt von Polyaminspermin (SPNO) eine Halbwertszeit von 39 Minuten besitzt.
c. Der Vor-Wirkstoff wird durch eine Cyclodextrin-Einschlussverbindungsbildung stabilisiert, während NO spontan unter physiologischen Bedingungen freigesetzt wird. Der bekannte Cyclodextrin-komplexierte Vor-Wirkstoff ist im festen Zustand stabil.
Es ist bekannt, dass SIN-1 im festen Zustand eine stabile Verbindung ist; allerdings ist seine offenkettige tautomere Form SIN-1A äußerst instabil. Es ist sehr schwierig, das gelbe kristalline Produkt in reiner Form zu isolieren, und es kann nur bei -80ºC gelagert werden, und zwar unter Stickstoff. Die SIN-1A-Form setzt rasch ein Mol NO im festen Zustand durch Photolyse frei, und in einer wässerigen Lösung wird sie selbst bei Dunkelheit in Cyanomethylenaminomorpholin (SIN-1C) umgewandelt.
SIN-1 wird somit als Vor-Wirkstoff angesehen, und SIN-1C als biologisch inaktives Abbauprodukt. Das Gleichgewicht zwischen dem stabilen SIN-1 und dem aktiven SIN-1A (das der wirkliche Wirkstoff ist) hängt von äußeren Faktoren (pH, Temperatur) ab. Allerdings ist SIN-1A infolge seiner extremen Instabilität - insbesondere gegenüber Sauerstoff - in der Praxis ein Kurzzeit-Zwischenprodukt im Abbauvorgang von SIM-1.
Gegenwärtig wird SIN-1 lediglich für die intravenöse Verabreichung in Pulverampullenflaschen auf den Markt gebracht und ist vor einer Injektion aufzulösen. Der oral verabreichte SIN-1-Vor-Wirkstoff ist unwirksam, weil der hydrolytische Schritt, der zur Bildung der NO-erzeugenden SIN-1 A-Form erforderlich ist, unter Bedingungen eines sauren pH nicht erfolgen kann, und vor einer Absorption wird er angesichts des höheren pH des Magen-Darm-Trakts rasch und vollständig zu SIN-1C abgebaut.
Es ist ebenfalls publik, dass SIN-1 durch eine CD-Komplexierung stabilisiert und das Gleichgewicht SIN-1 → SIN-1A → SIN-1C auf dem Wege einer Komplexierung mit Cyclodextrinderivaten (PCT-Veröffentlichung WO 91/14681) verschoben werden kann. Es wurde geoffenbart, dass eine Komplexierung mit bestimmten CD-Derivaten die SIN-1 C- Bildung hemmt. Somit wurden stabilere SIN-1/CDPSI-Komplexe einschließlich jener, die eine erhöhte Menge an SIN-1A enthielten (das eine biologische Aktivität beruhend auf einer stärkeren NO-Freisetzung zeigte), durch eine Kurzzeit-Wärmebehandlung des durch Gefriertrocknung erhaltenen SIN-1/CDPSI-Komplex-Produkts hergestellt. Ähnlich dazu wurde ein SIN-1/DIMEB-Komplex veranschaulicht. Es wurde vorgeschlagen, diese CD- Derivate in Arzneimitteln einzusetzen.
Dieses Dokument offenbarte SIN-1/CD-Komplexe oder eine SIN-1/Lactose-Mischung mit einem SIN-1-Gehalt von 4,5% (w/w), wobei der 5114-1 A-Gehalt in den erhaltenen Produkten wie folgt war:
im CDPSI-Komplex 1,27%
im ßCD-Komplex 0,08%
im DIMEB-Komplex 0,06%
im HPBCD-Komplex 0,1%
in der Mischung mit Lactose 0,00%
Ein Stattfinden einer praktisch vollständigen Umwandlung von SIN-1 in SIN-1 A wurde nicht geoffenbart, und zwar nicht einmal, wenn die Komplexierung mit CDPSI herbeigeführt wurde, von dem geoffenbart wurde, dass es das wirksamste Komplexierungsmittel für diesen Zweck sei.
Ferner sind CDPSI und DIMEB bis jetzt nicht für eine Verwendung in Arzneimitteln zugelassen. Somit ist die Herstellung einer stabilen, marktfähigen Form von reinem SIN-1A ein ungelöstes Problem.
Da SIN-1 nur intravenös angewendet werden kann, wird sein Vor-Wirkstoff Molsidomin zur oralen Behandlung von Herzinsuffizienz eingesetzt: Molsidomin wird in der Leber enzymatisch zu SIN-1 hydrolysiert.
Es war das oberste Ziel dieser Erfindung, den NO-Spender SIN-1A zu stabilisieren, um eine Formulierung zu sichern, die sowohl oral als auch parenteral verabreicht werden kann und deren Unschädlichkeit durch eine vollständige (sogar i.v.) toxikologische Dokumentation unterstützt wird. Gegenwärtig erfüllen zwei Arten von Cyclodextrinen diese grundsätzliche Anforderung: GammaCD und HPßCD.
Wenngleich die SIN-1A-stabilisierende Wirkung von CDPSI und DIMEB in wässerigen Lösungen bekannt ist, folgt indes nicht daraus, dass auch das nichtionische GammaCD in dieser Hinsicht wirksam ist, insbesondere wegen seines viel weiteren Hohlraumdurchmessers. Die hervorragende Stabilisierungswirkung von CDPSI ist seiner polymeren Struktur zugeschrieben worden, d. h., den gemeinsamen Wirkungen verschiedener in sterischer Nähe verankerter Cyclodextrinringe.
Gegenstand dieser Erfindung sind feste Einschlussverbindungen, die in ihrem festen Zustand stabil sind, gebildet aus N-Morpholino-N-nitrosaminoacetonitril mit den Cyclodextrinen ßCD, GammaCD, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin, Heptakis-2,6-di-O-methyl-β-cyclodextrin, statistisch methyliertem β-Cyclodextrin oder Heptakis-2,3,6-tri-O-methyl-β-cyclodextrin, ebenfalls enthaltend Ionen in Form von Salzen als Katalysator oder Stabilisator, wobei das Ion ausgewählt ist aus der Gruppe der Carbonsäureanionen der Gruppe Acetat, Formiat, Fropionat, Ascorbinat, Tartrat und Lactat, und Anionen anorganischer Säuren der Gruppe Phosphat, Phosphit, Borat, Sulfat, Sulfit und/oder Kationen wie z. B. Alkali und Ammonium, wobei die Verbindungen kein 3-Morpholinosydnonimin enthalten und höchstens 0,9% Cyanomethylenaminomorpholin enthalten. Es wurde gefunden, dass Acetat ein für diesen Zweck hervorragendes Anion ist. Die Kationen können vorzugsweise Ammonium- oder Alkalüonen sein; es können jedoch auch andere Kationen verwendet werden:
Die Einschlussverbindungen gemäß der Erfindung setzen bei Raumtemperatur auf ein Auflösen in Wasser oder wässerigen Systemen hin Stickoxid frei.
Als Cyclodextrinkomponenten enthalten sie ßCD oder GammaCD, insbesondere zur pharmazeutischen Verwendung. Sie können auch Cyclodextrinderivate enthalten, und zwar hydroxypropylierte oder methylierte Cyclodextrine wie z. B. HPßCD, DIMEB, RAMEB, TRIMEB oder CDPSI. Ein anderes Merkmal der Erfindung sind biologisch aktive Zusammensetzungen, die als aktiven Bestandteil die neuen SIN-1A/Cyclodextrin-Komplexe gemäß der Erfindung enthalten, und zwar zusammen mit Hilfs- und Zusatzbestandteilen, die ihre Verwendung erleichtern. Diese beinhalten - sind aber nicht darauf beschränkt - pharmazeutische Zusammensetzungen; die als aktiven Bestandteil SIN-1A- Einschlussverbindungen gemäß der Erfindung enthalten, und zwar mit üblichen Hilfs- und Zusatzmaterialien, die bei Arzneimitteln für eine orale, parenterale oder andere medizinische Verwendungen eingesetzt werden. Die Formulierungen sind vorzugsweise Pulver, die unmittelbar vor einer Medikation aufgelöst werden. So sind die parenteralen Formulierungen vorzugsweise Pulver, die vor der Injektion aufgelöst werden.
Bevorzugte pharmazeutische Zusammensetzungen sind jene, die als aktiven Bestandteil SIN- 1A-Einschlussverbindungen gemäß der Erfindung enthalten, die mit ßCD oder GammaCD gebildet sind. Ammoniumacetat ist ein bevorzugtes Salz zur Verwendung als Katalysator oder Stabilisator in den erfindungsgemäßen Einschlussverbindungen.
Ein weiterer Gegenstand der vorliegenden Erfindung sind Ausstattungen zur Verwendung als NO-freisetzende Standards, um NO in einer vorhersagbaren Menge und mit einer vorhersagbaren Geschwindigkeit beim Auflösen in wässerigen Medien freizusetzen, die als aktiven Bestandteil SIN-1A-Einschlussverbindungen gemäß der vorliegenden Erfindung enthalten.
Dies ist möglich, weil die vorliegende Erfindung die Herstellung und Stabilisierung des extrem labilen SIN-1A betrifft, das, wenn es aus dem Cyclodextrinhohlraum freigesetzt wird - und zwar selbst nach einem einfachen Auflösen in destilliertem Wasser - sofort das NO in einer vorhersagbaren Menge und mit einer vorhersagbaren Geschwindigkeit erzeugt, ohne dass es irgendeines weiteren Enzyms oder Reaktanten bedarf.
Die vorliegende Erfindung schließt Verfahren zur Herstellung neuer SIN-1A- Einschlussverbindungen gemäß der Erfindung ein, bei denen SIN-1 bei einem geeigneten pH mit einem Salz als Katalysator umgesetzt wird, wobei das Salz Ionen enthält, die ausgewählt sind aus der Gruppe der Carbonsäureanionen der Gruppe Acetat, Formiat, Propionat, Ascorbinat, Tartrat und Lactat, und Anionen anorganischer Säuren der Gruppe Phosphat, Phosphit, Borat, Carbonat, Hydrocarbonat, Sulfat, Sulfit und/oder Kationen wie z. B. Alkali und Ammonium, um das Gleichgewicht hin zu einer Bildung von SIN-1A in der Gegenwart von ßCD- oder GammaCD-Cyclodextrinen oder ihrerhydroxypropylierten odermethylierten Derivate zu verschieben, wodurch das gebildete SIN-1A sofort komplexiert und stabilisiert wird, und zwar durch Bildung von SIN-1A/Cyclodextrin-Einschlussverbindungen. Das Verfahren schließt ein Isolieren der erhaltenen SIN-1A/CD-Verbindungen, die gegebenenfalls die als Katalysatoren in Form ihrer Salze verwendeten Ionen enthalten, im festen Zustand ein. Gemäß der Erfindung ist es ein bevorzugtes Verfahren, SIN-1 und ein ßCD oder GammaCD oder ihre hydroxypropylierten oder methylierten Derivate im festen Zustand in der Gegenwart von Ionen - vorzugsweise in Form ihrer Salze - als Katalysatoren umzusetzen, und zwar durch gründliches Vermischen oder Vermengen der Komponenten. Ein anderer erfindungsgemäßer Weg ist ein Gefriertrocknen einer wässerigen, sauerstofffreien, die Komponenten enthaltenden Lösung, vorzugsweise gefolgt von einem "zweiten Trocknen" im Vakuum.
Es wird bevorzugt, Ammonium- oder Alkalisalze zu verwenden, die mit Carbonsäureanionen wie z. B. Acetat, Formiat, Propionat, Ascorbinat, Tartrat und/oder Lactat und/oder Anionen anorganischer Säuren wie z. B. Borat, Carbonat, Hydrocarbonat, Phosphat, Phosphit, Sulfat und/oder Sulfit als Katalysator des Verfahrens gebildet sind. Die verwendeten Salze können flüchtige Anionen oder Kationen enthalten, die während des Verfahrens teilweise oder vollständig eliminiert werden, wie z. B. Ammonium- oder Carbonationen. Wenn das oben Gesagte vollzogen wird, ist es vorteilhaft, die Reaktion bei pH-Werten zwischen 6 und 10 und wenn Wasser als Reaktionsmedium verwendet wurde - unter Einsatz eines "zweiten Trocknens" bei 40 bis 100ºC, vorzugsweise bei 50-70ºC, durchzuführen.
Wie aus den NO-Freisetzungstests ersichtlich ist, erzeugen SIN-1A/Cyclodextrin-Komplexe nach einer Auflösung der festen Komplexe in wässerigen Systemen sofort Stickoxid. Somit besteht ein Weg, einen SIN-1 A-Cyclodextrin-Komplex mit gesteuerter Zusammensetzung (mit dem niedrigsten SIN-1C-Gehalt) zu erhalten, in der Tautomerisierung von SIN-1 und der gleichzeitigen Komplexierung des gebildeten SIN-1A im festen Zustand.
Die Situation ist ähnlich, wenn die Herstellung des Komplexes durch Gefriertrocknung erfolgt. In diesem Fall kann der zweite Trocknungsschritt (im Anschluss an die Gefriertrocknung) die Bedingungen für die katalytische Bildung des Komplexes im festen Zustand gewährleisten.
Die Einschlussverbindungen und pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß der Erfindung können für die Behandlung lebender Zellen mit Stickoxid eingesetzt werden. Dies beinhaltet - ist aber nicht darauf beschränkt - die Behandlung von Stickoxid-abhängigen Symptomen bei Menschen oder Tieren, wie anginöse und ischämische Herzinsuffizienzen, physiologische Steuerung des Blutdrucks, Plättchenverklumpung, Mediation einer Erschlaffung der Peristaltik, Peniserektion und andere. Dies wird dadurch erreicht, dass den Patienten, die eine solche Behandlung benötigen, vorzugsweise durch orale oder parenterale Anwendung eine wirksame Menge einer neuen SIN-1A-Einschlussverbindung gemäß der Erfindung verabreicht wird.
Vorzugsweise werden die SIN-JA-Komplexe verabreicht, die mit ßCD oder GammaCD gebildet sind und gegebenenfalls in Form ihrer Ammonium- oder Alkalisalze Carbonsäureanionen wie z. B. Acetat, Formiat, Propionat, Ascorbinat, Tartrat und/oder Lactat und/oder Anionen anorganischer Säuren wie z. B. Phosphat, Phosphit, Borat, Carbonat, Hydrocarbonat, Sulfat und/oder Sulfit enthalten.
Die größten Vorteile von SIN-1A/CD-Komplexen sind im Vergleich zu SIN-1 oder anderen bisher bekannten NO-Spendern somit folgende:
- langfristige Stabilität,
rasche Wirkung,
- erhöhte Halbwertszeit,
- Unabhängigkeit von der Leber,
- Unabhängigkeit vom pH,
- schließlich eine größere Tauglichkeit zum Erreichen ihrer Ziele (Gewebe).
Die stabile Zusammensetzung zur Verfügung zu haben ermöglicht es, eine neue Phase bei Behandlungen mit Stickoxid einzuleiten, das von manchen Autoren als "unverhoffter neuer Superstar der Biochemie" bezeichnet wird (Chem. Ing. News, Dez. 1993, Seiten 26-38). Die nachstehenden Beispiele dienen zur Veranschaulichung und nicht zur Einschränkung der Erfindung.

1. CHEMISCHE BEISPIELE

Beispiel I.1

Herstellung eines SIN-1 A/GammaCD-Komplexes

2 g GammaCD und 0,8 g Ammoniumacetat wurden in 25 ml destilliertem Wasser durch Ultraschalleinsatz aufgelöst. Die Lösung wurde durch Durchblasen mit Heliumgas desoxidiert; anschließend wurden 200 mg SIN-1-Substanz aufgelöst. Die Lösung wurde sofort zur Isolierung des festen Komplexes gefriergetrocknet. Ein zweites Trocknen bei 40-50ºC wurde 2 Stunden lang durchgeführt, um den Wassergehalt des Komplexes fast vollständig zu eliminieren. Sowohl die Lösung als auch die Substanz wurden vor Licht geschützt.
Der Komplex ist ein leichtes gelbes Pulver. Ausbeute: 2,6 ± 0,1 g.
Der Verlust beim Trocknen beträgt weniger als 1%.
HPLC-Analyse: SIN-1-Gehalt: nicht detektierbar
SIN-1A-Gehalt: 11,7 ± 0,2%
SIN-1C-Gehalt: 0,36 ± 0,1%
Bei sämtlichen Beispielen dieses Dokuments wurde folgende Methode für eine gleichzeitige Bestimmung von SIN-1, SIN-1 A und SIN-1C durch HPLC verwendet:
Säule: Ultrasphären-IP-Analysesäule (Beckman-Astec)
4,6 ± 250 mm, Teilchengröße 5 um.
Mobile Phase: 0,01 M Phosphatpuffer pH = 6,0 800 ml
Tetrahydrofuran 200 ml
Natrium-1-dodecansulfonat 0,405 g/dm³
Ionenstärke: 0,05 glon/dm³ (korrigiert mit Natriumsulfat)
Durchflussgeschwindigkeit: 1 ml/min. p = 190 bar. Probengröße: 20 ul.
Detektionswellenlänge:
- 230 nm BW: 6 (bez. 350 nm BW: 80) für SIN-1A und SIN-1C zwischen 0-8 Minuten
- 292 nm BW: 6 (bez. 400 nm BW: 80) für SIN-1 nach 8 Minuten Retentionszeiten: SIN-1 9,6 min
SIN-1C 4,5 min
SIN-1A 4,8 min
Eine Kalibrierung erfolgte mit frisch hergestellten SIN-1- und SIN-1C-Lösungen; der SIN- 1A-Gehalt wurde in STN-1C-Äquivalent ausgedrückt.

Beispiel I.2

Herstellung eines SIN-1A/ßCD-Komplexes

16 g ßCD (Wassergehalt 14%) und 7 g Ammoniumacetat wurden in 1000 ml destilliertem Wasser durch Ultraschalleinsatz aufgelöst. Die Lösung wurde durch Durchblasen mit Heliumgas desoxidiert; anschließend wurden 3 g SIN-1-Substanz aufgelöst. Der feste Komplex wurde durch sofortiges Gefriertrocknen isoliert, und der Wassergehalt wurde bei 40-50ºC eliminiert. Sowohl die Lösung als auch die Substanz wurden vor Licht geschützt. Der Komplex ist ein gelbliches, sehr leichtes Pulver. Ausbeute: 20 ± 1 g. Verlust beim Trocknen < 1%.
HPLC-Analyse: SIN-1-Gehalt: nicht detektierbar
SIN-1A-Gehalt: 12 ± 1%
SIN-1C-Gehalt: 0,30 ± 0,2%

Beispiel I.3

Herstellung eines SIN-1A/HPBCD-Komplexes

2 g HPBCD (DS = 2,8) und 0,8 g Ammoniumacetat wurden in 25 ml destilliertem Wasser durch Ultraschalleinsatz aufgelöst. Auf eine Desoxidierung durch Durchblasen mit Heliumgas hin wurden 200 mg SIN-1 aufgelöst. Der feste Komplex wurde durch sofortiges Gefriertrocknen isoliert. Der Wassergehalt wurde bei 40-50ºC eliminiert: Sowohl die Lösung als auch die. Substanz wurden vorLicht geschützt. 2,8 ± 0,1 g eines SIN-1A/HPBCD- Komplexes wurden als leichtes gelbes Pulver erhalten. Verlust beim Trocknen < 1%.
HPLC-Analyse: SiN-1: nicht detektierbar
SIN-1A: 11,6 ± 0,2%
SIN-1C: 0,36 ± 0,1%

Beispiel I.4

Herstellung eines SIN-1A/RAMEB-Komplexes

2 g RAMEB (DS = 1,8) und 0,8 g Ammoniumacetat wurden in 25 ml destilliertem Wasser durch Ultraschalleinsatz aufgelöst. Auf eine Desoxidierung durch Durchblasen mit Heliumgas hin wurden 200 mg S14- 1-Substanz aufgelöst, die Lösung wurde gefriergetrocknet, und der isolierte feste Komplex wurde bei 40-50ºC 2 Stunden lang getrocknet. Die Lösung und die Substanz wurden vor Licht geschützt.
2,8 ± 0,1 g eines SIN-1A-RAMEB-Komplexes wurden als leichtes gelbes Pulver erhalten. Verlust beim Trocknen < 1%.
HPLC-Analyse: SIN-1: nicht detektierbar
SIN-1A: 12,0 ± 0,2%
SIN-1C: 0,6 ± 0,1%

Beispiel I.5

Herstellung eines SIN-1A-ßCD-Komplexes in einer Phosphatpufferlösung

1 g ßCD (Wassergehalt: 14%) wurde in 55 ml einer pH = 8,0-Phosphatpufferlösung gemäß USP XXII durch Ultraschalleinsatz aufgelöst. Auf eine Desoxidierung mit Heliumgas hin wurden 100 mg 514-1 aufgelöst. Die Lösung wurde sofort gefriergetrocknet. Die Lösung und die Substanz wurden vor Licht geschützt.
1 ± 0,1 g SIN-1A/ßCD wurden als gelbliches, sehr leichtes Pulver erhalten. Verlust beim Trocknen < 1%.
HPLC-Analyse: SIN-1-Gehalt: nicht detektierbar
SIN-1A-Gehalt: 8,3%
SIN-1C-Gehalt: 0,24%

Beispiel L6

1 g ßCD (Wassergehalt 14%), 100 mg SIN-1-Hydrochlorid und 100 mg Ammoniumacetat wurden in einem Mörser 15 Minuten lang gründlich gemischt. Nach einer kurzen Reibezeit wurde die Mischung sichtbar gelb. Nach einer 2-tägigen Lagerung in einem geschlossenen, lichtgeschützen Behälter wurde eine HPLC-Analyse nach Beispiel I.1 vorgenommen und ergab nachstehende Ergebnisse:
SIN-1-Gehalt: nicht detektierbar
SIN-1A-Gehalt: 7,9 ± 0,2%
SIN-1C-Gehalt: 0,41 ± 0,1%

Beispiel L7

Unter Einsatz des Verfahrens nach Beispiel L6, allerdings unter Verwendung von 50 mg Ammoniumacetat, ist die sichtbare Bildung von SIN-1A (gelbe Färbung) langsamer; sie dauerte mehrere Stunden.
HPLC-Analyse des SIN-1A/ßCD nach 2-tägiger Lagerung:
SIN-1 : 0,5 ± 0,1%
SIN-1A: 6,9 ± 02%
SIN-1C: 0,6 l%

Beispiel I.8

Nach dem Verfahren, wie es in Beispiel L6 beschrieben ist, allerdings unter Verwendung von 300 mg Ammoniumacetat, kommt es praktisch sofort nach dem Mischen der Komponenten zur gelben Färbung der Mischung.
HPLC-Analyse des ßCD-Komplexes am gleichen Tag nach der Herstellung:
SIN-1: nicht detektierbar
SIN-1A: 6,9 ± 02%
SIN-1C: 0,5 ± 0,1%

Beispiel I.9

1 g ßCD (Wassergehalt 14%), 100 mg SIN-1-Hydrochlorid und 100 mg Natriumacetat 3H&sub2;O wurden in einem Mörser 15 Minuten lang gründlich gemischt, gefolgt von einer 1-stündigen Wärmebehandlung der Mischung bei 70ºC.
HPLC-Analyse der wärmebehandelten Probe:
SIN-1: nicht detektierbar
SIN-1A: 7,1 ± 02%
STN-1C08+0,8%

II. VERGLEICHSBEISPIELE

Beispiel II.1

Versuchte Herstellung von SIN-1A/ßCD mit Essigsäure

Die Herstellung wurde wie in Beispiel I.2 durchgeführt, aber statt Wasser und Ammoniumacetat wurde das ßCD in einer 0,1-molaren Essigsäurelösung aufgelöst.
HPLC-Analyse des Produkts: SIN-1 : 8,4%
SIN-1A: 0,28%
SIN-1C: nicht detektierbar
Somit wurde der feste SIN-1A/ßCD-Komplex nicht isoliert.

Beispiel II.2

Versuchte Herstellung von SIN-1A/ßCD mit Natriumhydroxid

Die Komplexierung wurde wie in Beispiel L5 beschrieben durchgeführt, aber das ßCD wurde in 55 ml wässerigem Natriumhydroxid mit pH 8,4 aufgelöst, anstatt Ammoniumacetat zu verwenden. HPLC-Analyse des erhaltenen festen Produkts:
SIN-1 : 10,5%
SIN-1A: 0,40%
SIN-1C: nicht detektierbar
Kein SIN-1A/ßCD-Komplex wurde isoliert.

III. ANALYTISCHE UND BIOLOGISCHE BEISPIELE

Beispiel III.1

Die Wirksamkeit der Umwandlung und die Stabilität der SIN-1A-Komplexe werden in der Tabelle 1 veranschaulicht. Die Proben wurden bei Raumtemperatur 11 Monate lang in Glasbehältern unter Luftatmosphäre lichtgeschützt gelagert. Der SIN-1A-Gehalt wird in SIN- 1C-Äquivalent angegeben. Tabelle 1

Beispiel III.2

Eine SIN-1A/ßCD-Probe enthielt unmittelbar nach der Herstellung 11,47% SIN-1A. Wenn sie bei Raumtemperatur 12 Monate lang gelagert wurde, enthielt sie 8,36% SIN-1A, und nach 23 Monaten enthielt sie 6,59% SIN-1A. Der jeweilige SIN-1C-Gehalt betrug 0,18, 1,31 und 1,57%.
Die Komplexe enthielten ungefähr 5-8% Einschlusswasser, und zwar vorwiegend an den Cyclodextrinhohlraum gebunden.

Beispiel III.3

Die stabilitätsverstärkende Wirkung einer Wärmebehandlung ("zweites Trocknen") nach einem Gefriertrocknen wird in der Tabelle 2 veranschaulicht. Tabelle 2

Beispiel III.4

Geschwindigkeit und Ausmaß der NO-Freisetzung aus einem SIN-1A/ßCD-Komplex Die Freisetzung von NO in SIN-1A/CD-Lösungen wurde durch chemische und biologische Methoden untersucht.
250 mg eines Komplexes (entspricht ungefähr 25 mg SIN-1A) wurden in 100 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Unmittelbar nach der Auflösung wurde die Freisetzung von NO indirekt detektiert, und zwar durch ein gleichzeitiges Messen der Abnahme des SIN-1 A-Gehalts und der Bildung des SIN-1C-Metaboliten durch HPLC in Abhängigkeit von der Zeit. Die Messungen wurden in unterschiedlichen Zeitintervallen wiederholt, während ein Lichtschutz erfolgte.
Die Tabelle 3 veranschaulicht die Abbaukinetik von SIN-1A in destilliertem Wasser bei Raumtemperatur in der Gegenwart von ßCD, GammaCD und HPBCD. Tabelle 3
Die veranschlagte T1/2 (Halbwertszeit) der Komplexe, berechnet aus der Abnahme des SIN- 1A-Gehalts, ist 53 min für ßCD, 24 min für GammaCD und 70 min für HPBCD.

Beispiel III.5

Die Freisetzung von NO in einer stärker verdünnten SIN-1A/ßCD-Lösung (100 ug/ml des SIN-1A/ßCD-Komplexes entsprechen 10 ug/ml SIN-1A) wurde durch UV- Spektrophotometrie detektiert, indem die Bildung des SIN-1 C-Metaboliten in Abhängigkeit von der Zeit gemessen wurde. Der SIN-1A → SIN-1C-Übergang wird von einer sehr charakteristischen UV-Spektrum-Änderung begleitet, da SIN-1A ein UV-Maximum bei 230 ± 1 nm aufweist und keine Extinktion bei λmax SIN-1C bei 277 ± 1 nm zeigt.
10 mg des SIN-1A/ßCD-Komplexes (entspricht ungefähr 1 mg SIN-1A) wurden in 100 ml destilliertem Wasser aufgelöst. Das UV-Spektrum der Lösung wurde zwischen 200-350 nm ohne Verdünnung unmittelbar nach der Auflösung registriert, und die Registrierung wurde in verschiedenen Zeitintervallen wiederholt, und zwar unter Lichtschutz. Die gebildete SIN-1C- Menge wurde aus den Extinktionswerten bei 277 ± 1 nm berechnet, und zwar unter Verwendung der mit einem SIN-1C-Standard erhaltenen Kalibrierungskurve. Die SIN-1C- Konzentration betrug unmittelbar nach der Auflösung weniger als 0,7 ug/ml und nach 270 Minuten etwa 7,8 ug/ml. Vermutlich wurde die äquivalente Menge NO freigesetzt.
Veranschlagte Haltwertszeit des Komplexes: 90-100 Minuten.
Die Fig. 1 veranschaulicht, wie sich die UV-Spektren in Abhängigkeit von der Zeit ändern:
Es werden UV-Spektren eines SIN-1A/ßCD-Komplexes in 10-minütigen Zeitintervallen bis 160 Minuten nach einer Auflösung von 10 mg des Komplexes in 100 ml destilliertem Wasser gezeigt. Die Extinktion ist gegen die Wellenlänge aufgetragen.

Beispiel III.6

Die Bildung von NO wurde direkt bestimmt, und zwar unter Einsatz einer NO-spezifischen Porphyrin-Mikrosensor-Detektion. Das Verfahren (Nature, Ausgabe 358, S. 675, 1992) ist imstande, die NO-Freisetzung bis 10&supmin;²&sup0; Mol zu überwachen, und zwar in einer einzelnen Zelle in biologischen Mikrosystemen im amperometrischen oder voltametrischen Modus.
In einem pH = 7,4-Phosphatpuffer bei 37ºC setzte 1 mM SIN-1A/ßCD NO mit einer Geschwindigkeit von 2,37 uM/min in den ersten 5 Minuten frei, und zwischen der 10 und der 30. Minute mit einer Geschwindigkeit von 0,17 uM/min. Bei einem Auflösen von 0,1 mM Substanz waren die relevanten Werte jeweils 0,42 uM und 0,07 uM.

Beispiel III.7

Hemmung der Plättchenverklumpung durch einen SIN-1A/ßCD-Komplex

Stickoxid war als natürliches Boten-Molekül bei der Hemmung der Plättchenverklumpung über das Guanylat-Cyclase/cyclisches GMP-System identifiziert worden (Blood, 57., 946, 1981). Wir untersuchten die biologischen Wirkungen von SIN-1 und eines SIN-1A/ßCD- Komplexes durch Vergleichen ihrer die Plättchenverklumpung hemmenden Wirkungen. Die Plättchenverklumpung wurde bei Blutplättchen-reichem Kaninchen- und Menschen-Plasma untersucht (J. Cardiovasc. Pharmacol 14, Ergänzungsband 11, Seite 120, 1989). Bei jeder Charge Blutplättchen-reichen Kaninchenplasmas wurden mit dem Thromboxan-mimetischen U-46619 (0,25-4,0 uM) in der Gegenwart von 0, 10&supmin;&sup7; 10&supmin;&sup6; oder 10&supmin;&sup5; Mol des SIN-1A/ßCD- Komplexes 8 Dosis-Reaktion-Kurven registriert. Die Dosis-Reaktion-Kurven wurden in einer zufälligen Folge erzielt. Danach wurde eine festgesetzte Konzentration von U46619 (4 uM) verwendet, um Konzentrations-Inhibitions-Vollkurven bezüglich SIN-1 und SIN-1A/ßCD zu erhalten. U46619 führte eine konzentrationsbezogene Verklumpung herbei. Die die Verklumpung hemmende Wirkung des SIN-1A/ßCD-Komplexes war bei identischer molarer Konzentration in sämtlichen Fällen wesentlich höher als die von SIN-1. Die pD2 (negativer Logarithmus der Konzentration, die eine 50%ige Hemmung hervorruft) -Werte betrugen 5,57 ± 0,11 (n = 7) für SIN-1 und 6,36 ± 0,07 (n = 7) für den SIN-1A/ßCD-Komplex, was anzeigt, dass bei diesem Test der Komplex etwa 6mal wirksamer als SIN-1 war.
Bei einigen ähnlichen Versuchen wurde gefunden, dass der SIN-1A/ßCD-Komplex etwa 10mal so wirksam wie 5114-1 war.

Beispiel III.8

Die in Beispiel IIL7 beschriebenen Versuche wurden unter Verwendung menschlichen Citrat- Blutplättchen-reichen Plasmas mit SIN-1, einem frisch hergestellten SIN-1A/ßCD-Komplex (SIN-1A-Gehalt 14,8%) und mit einem SIN-1A/ßCD-Komplex, der bei Raumtemperatur 23 Monate lang gelagert wurde (der SIN-1A-Gehalt war ursprünglich 11,47%, und nach 23 Monaten betrug er 6,59%), wiederholt. Die Tabelle 4 veranschaulicht die Ergebnisse, indem sie die negativen Logarithmen der Konzentration (pD2) von SIN-1 und des SIN-1A-ßCD- Komplexes zeigt, die eine 50%ige Hemmung der durch U46619 herbeigeführten Verklumpung in menschlichem Blutplättchen-reichen Plasma bewirkt.
Sowohl die Amplitude als auch die Steigung der Verlclumpungskurve wurde ausgewertet. Der Unterschied bei den pD2-Werten zeigt an, dass frisch hergestelltes SIN-1 A/ßCD etwa Bmal wirksamer als SIN-1 war. Es wurde gefunden, dass der 23 Monate lang gelagerte Komplex 3mal weniger aktiv als der frisch hergestellte Komplex war, aber 3mal wirksamer als SIN-1 selbst. Tabelle 4
Die Ergebnisse von in vivo-Tests legen nahe, dass die hier geoffenbarten SIN-1A/ßCD- Komplexe nützliche Hemmer einer Plättchenverklumpung in vivo sind.
Wie sich in den Halbwertszeiten widerspiegelt, sind SIN-1A/Cyclodextrin-Komplexe imstande, ständig die Stickoxiderzeugung mit einer eher beinahe konstanten Geschwindigkeit während einer viel längeren Zeitdauer nach einer Verabreichung hervorzurufen.

Beispiel III.

Handelsübliches SIN-1 (CORVASAL) wurde mit dem SIN-1A/ßCD-Komplex an der Halsschlagader von Kaninchen verglichen. Die Halsschlagader von mit Nembutal anästhesierten Kaninchen wurde freigelegt, 3 mm lange Ringe wurden in einer Klammer immobilisiert und in die Organbäder gegeben. Die Kontraktion wurde mit Phenylephrin 3 · 10&supmin;&sup7; M 3 Mal mit einem darauf folgenden Spülen herbeigeführt. Die Dosis-Reaktion-Kurven wurden für 3 · 10&supmin;&sup9; M bis 3 · 10&supmin;&sup5; M CORVASAL (bezogen auf den SIN-1-Gehalt) und für 3 x 10&supmin;&sup9; bis 3 · 10&supmin;&sup5; Mol SIN-1A/ßCD (bezogen auf den SIN-1A-Gehalt) registriert.
Die Fig. 2 zeigt die Kontraktion-gegen-Arzneimittelkonzentration-Kurve. Wie zu sehen ist, war das ßCD-komplexierte SIN-1A-Arzneimittel etwa 6mal wirksamer als freies SIN-1. Die veranschaulichten Punkte stellen das Mittel aus 6 Messungen dar.

Claims

1. Feste Einschlussverbindungen, die in ihrem festen Zustand stabil sind, gebildet aus N- Morpholino-N-nitrosaminoacetonitril mit den Cyclodextrinen ßCD, GammaCD, Hydroxypropyl-β-cyclodextrin, Heptakis-2,6-di-O-methyl-β-cyclodextrin, statistisch methyliertem β-Cyclodextrin oder Heptakis-2,3, 6-tri-O-methyl-β-cyclodextrin, ebenfalls enthaltend Ionen in Form von Salzen als Katalysator oder Stabilisator, wobei das Ion ausgewählt ist aus der Gruppe der Carbonsäureanionen der Gruppe Acetat, Formiat, Propionat, Ascorbinat, Tartrat und Lactat, und Anionen anorganischer Säuren der Gruppe Phosphat, Phosphit, Borat, Sulfat, Sulfit und/oder Kationen wie z. B. Alkali und Ammonium, wobei die Verbindungen kein 3-Morpholinosydnonimin enthalten und höchstens 0,9% Cyanomethylenaminomorpholin enthalten.

2. Pharmazeutische Zusammensetzungen, die als aktiven Bestandteil feste Einschlussverbindungen nach Anspruch 1 enthalten, mit üblichen Hilfs- und Zusatzmaterialien, die bei Arzneimitteln für eine orale, parenterale oder andere medizinische Verwendungen eingesetzt werden, wobei die Formulierungen vorzugsweise Pulver sind, die unmittelbar vor einer Medikation aufgelöst werden.

3. Pharmazeutische Zusammensetzungen nach Anspruch 2, die als aktiven Bestandteil feste, mit ßCD oder GammaCD gebildete N-Morpholino-N-nitrosaminoacetonitril- Einschlussverbindungen enthalten.

4. Ausstattungen zur Verwendung als NO-freisetzende Standards, um NO in einer vorhersagbaren Menge und mit einer vorhersagbaren Geschwindigkeit beim Auflösen in wässerigen Medien freizusetzen, die als aktiven Bestandteil feste N-Morpholino-N- nitrosaminoacetonitril-Einschlussverbindungen nach Anspruch 1 enthalten.

5. Verfahren zur Herstellung fester N-Morpholino-N-nitrosaminoacetonitril- Einschlussverbindungen nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass 3- Morpholinosydnonimin bei einem geeigneten pH mit einem Salz als Katalysator umgesetzt wird, wobei das Salz Ionen enthält, die ausgewählt sind aus der Gruppe der Carbonsäureanionen der Gruppe Acetat, Formiat, Propionat, Ascorbinat, Tartrat und Lactat, und Anionen anorganischer Säuren der Gruppe Phosphat, Phosphit, Borat, Carbonat, Hydrocarbonat, Sulfat, Sulfit und/oder Kationen wie z. B. Alkali und Ammonium, um das Gleichgewicht hin zu einer Bildung von N-Morpholino-Nnitrosaminoacetonitril in der Gegenwart von ßCD- oder GammaCD-Cyclodextrinen oder ihrer hydroxypropylierten oder methylierten Derivate zu verschieben, wodurch das gebildete N-Morpholino-N-nitrosaminoacetonitri1 sofort komplexiert und stabilisiert wird, und zwar durch Bildung von N-Morpholino-N-nitrosaminoacetonitril- /Cyclodextrin-Einschlussverbindungen, und dass die erhaltenen N-Morpholino-Nnitrosaminoacetonitril-ICD-Verbindungen, die gegebenenfalls die als Katalysatoren in Form ihrer Salze verwendeten Ionen enthalten, im festen Zustand isoliert werden.

6. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichet, dass 3-Morpholinosydnonimin und ßCD oder GammaCD oder ihre hydroxypropylierten oder methylierten Derivate im festen Zustand in der Gegenwart von Ionen in Form ihrer Salze als Katalysatoren umgesetzt werden, und zwar durch gründliches Vermischen oder Vermengen der Komponenten oder durch Gefriertrocknen einer wässerigen, sauerstofffreien, die Komponenten enthaltenden Lösung, gegebenenfalls gefolgt von einem "zweiten Trocknen" im Vakuum.

7. Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass als Katalysatoren oder Stabilisatoren Ammonium- oder Alkalisalze verwendet werden, die mit Carbonsäureanionen Acetat, Formiat, Propionat, Ascorbinat, Tartrat und Lactat und Anionen anorganischer Säuren der Gruppe Borat, Carbonat, Hydrocarbonat,. Phosphat, Phosphit, Sulfat und Sulfit gebildet sind.

8. Verfahren nach Anspruch 5. dadurch gekennzeichnet, dass die Reaktion bei einem pH- Wert zwischen 6 und 10 und - wenn Wasser als Reaktionsmedium verwendet wurde - unter Einsatz eines "zweiten Trocknens" bei 40 bis 100ºC, vorzugsweise bei 50 bis 70ºC, durchgeführt wird.