DE60319083T2

DE60319083T2 - Pharmazeutische verbindung und methoden zur behandlung von menschlichen karzinomen mittels arginin-entzug

Info

Publication number: DE60319083T2
Application number: DE60319083T
Authority: DE
Inventors: Ning Man Cheng; Yun Chung Hung Hom Leung; Wai Hung Ma On Shan N.T. Lo
Original assignee: Bio Cancer Treatment Int Ltd; Bio Cancer Treatment International Ltd
Current assignee: Bio Cancer Treatment Int Ltd; Bio Cancer Treatment International Ltd
Priority date: 2002-06-20
Filing date: 2003-06-20
Publication date: 2009-02-05
Anticipated expiration: 2023-06-21
Also published as: CN1918298A; HK1109876A1; DE60331871D1; HK1053577A2; JP5307042B2; JP2010148509A; EP1517699B1; US20050244398A1; WO2004001048A1; IL165858A0; EP1517699A1; NZ537774A; US8679810B2; AU2002325782A1; CN101433714A; US20080248018A1; CN1918298B; US20090123450A1; US20080226617A1; ATE385807T1

Description

Gebiet der Erfindung
Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die Arginase enthalten, und ihre Verwendung für solche Zusammensetzungen. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf pharmazeutische Zusammensetzungen, die die Kapazität haben, das Argininniveau in Patienten mit Tumoren zu vermindern, und ihre Verwendung zur Behandlung von bösartigen Tumoren in Menschen. Die vorliegende Erfindung bezieht sich auch auf ein Verfahren zum Herstellen eines rekombinanten Proteins.
Hintergrund der Erfindung
Ariginase I (EC 3.5.3.1; L-Arginin-amidinohydrolase) ist ein Schlüsselleberenzym bei Säugern, das den letzten Schritt bei der Harnstoffbildung im Harnstoffzyklus katalysiert, bei dem Arginin in Ornithin und Harnstoff umgewandelt wird. Bei Rattenleberextrakten, die einen hohen Gehalt an Arginase besitzen, wurde entdeckt, dass sie Anti-Tumoreigenschaften in vitro besitzen, wenn sie zufällig zu Tumorzell-Kulturmedium hinzugefügt wurden (Burton et al., 1967, Cytolytic action of eorticosteroids an thymus and lymphoma cells in vitro. Can J. Biochem. 45, 289–297). Nachfolgende Experimente zeigten, dass die Anti-Tumoreigenschaften des Enzyms auf die Depletion des Arginins zurückzuführen waren, das im Kulturmedium eine essentielle Aminosäure ist. Bei Niveaus von unter 8 μM Arginin trat irreparabler Zelltod bei den Krebszellen auf (Storr & Burton, 1974, The effects of arginine deficiency an lymphoma cells. Br. J. Cancer 30, 50–59).
Ein neuerer Aspekt des Arginins konzentriert sich auf seine Rolle als direkter Vorläufer für die Synthese des potenten Signalmoleküls Stickstoffoxid (NO), das als ein Neurotransmitter, Relaxans von glattem Muskel und Gefäßweitungsmittel funktioniert. Die Biosynthese von NO involviert ein Ca⁺⁺, NADPH abhängige Reaktion, die durch Stickstoffoxidsynthase (NOS) katalysiert wird. Eine andere bekannte Rolle des Arginins ist, dass es als ein Precursor über Ornithin der Polyamine Spermidin und Spermin wirkt, das in diversen physiologischen Prozessen teilnimmt, was Zellproliferation und -wachstum einschließt (Wu & Morris, 1998, Arginine metabolism: nitric Oxide and beyond. Biochem. J. 336, 1–17).
Arginin dient auch als ein Substrat für zahlreiche wichtige Enzyme, was Stickstoffoxidsynthase (NOS) einschließt. Es gibt drei Typen von NOSs, nNOS, eNOS und iNOS, die alle Arginin in Stickoxid und Citrullin umwandeln. Die Gesichtserrötungen, die durch NO induziert werden, werden zum Beispiel durch nNOS vermittelt, dem neuronalen Typ der NOS. iNOS, die induzierbare NO, wird durch Macrophagen produziert, und das so aus Arginin während der Septicaemia produzierte NO verursacht während endotoxischem Schock Gefäßweitung. eNOS, die endothele NOS, wird durch Endothelzellen in Blutgefäßen produziert. Sie wandelt Arginin in NO um, das dann Deaggregation der Blutplättchen in den endothelen Oberflächen über einen cGMP Mechanismus verursacht. Das durch eNOS in der lokalen Endothelschicht produzierte No besitzt eine Halbwertszeit von ungefähr 5 Sekunden und einen Diffusionsabstand von ungefähr 2 Micron.
Die Herstellung dieser Enzyme wird durch verschiedene NOS Gene (NOS 1, NOS2, NOS3) kontrolliert, die in den Chromosomen 12, 17 bzw. 7 kodiert werden. Diese Gene zeigen erstaunlich ähnliche genomische Strukturen in Hinsicht auf die Größe der Exons und den Ort der Spleißstellen auf.
Die in vitro Anti-Tumoraktivitäten der Arginindepletion wurde kürzlich durch eine Gruppe in Schottland, UK bestätigt (Scott et al., 2000, Single amino acid (arginine) deprivation: rapid and selective death of cultured transformed and malignanat cells. Br. J. Cancer 83, 800–810; Wheatley et al., 2000, Single amino acid (arginine) restriction: Growth and Death of cultured HeLa and Human Diploid Fibroblasts. Cellular Physiol. Biochem. 10, 37–55). Von den 24 verschiedenen getesteten Tumorzelllinien, die gewöhnliche Krebsarten wie Brust-, Kolorektal-, Lungen-, Prostata- und Eierstockkrebs einschließen, starben alle innerhalb von 5 Tagen Arginindepletion. Mit Flusszytometriestudien war die Gruppe in der Lage zu zeigen, dass normale Zelllinien für bis zu einige Wochen in einen Ruhezustand in die G0 Phase des Zellzyklus ohne jeden erkennbaren Schaden eintreten würden. Tumorzellen jedoch würden über den „R" Punkt in der G1 Phase schreiten und in die S-Phase bei einem Mangel an Arginin eintreten. Ohne Arginin, das eine nicht ersetzbare Aminosäure ist, ist die Proteinsynthese gestört. Bei einigen Zelllinien wurde gezeigt, dass sie an Apoptose starben. Noch aufregender war, dass wiederholte Depletionen Tumortötung bewirken können, ohne dass „Resistenz" entwickelt wird (Lamb et al., 2000, Single amino acid (arginine) deprivation induces G1 arrest associated with inhibition of Cdk4 expression in cultured human diploid fibroblasts. Experimental Cell Research 225, 238–249).
Trotz der vielversprechenden in vitro Daten waren Versuche, Krebs in vivo mit Ariginindepletion zu behandeln, nicht erfolgreich. Die ursprüngliche Storr-Gruppe versuchte, Tumor tragende Ratten mit intraperitonealen Leberextrakten zu behandeln und hatte keinen Erfolg (Storr & Burton, 1974, The effects of arginine deficiency an lymphoma cells. Br. J. Cancer 30, 50–59). Es ist nun allgemein anerkannt, dass unter normalen physiologischen Bedingungen der Arginin-Spiegel des Blutplasmas und in der Tat der anderer Aminosäuren auch in dem normalen Bereich (100–120 μM) gehalten wird, wobei der Muskel der Hauptregulator ist. Angesichts der Aminosäuredefizienz werden intrazelluläre Proteinabbau-Pathways aktiviert (proteasomale und lysosomale), die Aminosäuren in den Blutkreislauf freisetzen (Malumbres & Barbacid, 2001, To cycle or not to cycle: a critical decision in cancer. Nature Reviews, 1, 222–231). Der homeostatische Aminosäuremechanismus hält die verschiedenen Aminosäureniveaus in konstanten Bereichen. Somit schlugen die vorherigen Versuche, Arginin mit verschiedenen physikalischen Verfahren oder Arginin abbauenden Enzymen zu vermindern, wegen des homeostatischen Aminosäuremechanismus des Körpers fehl.
Um das Problem der natürlichen homeostatischen Tendenzen des Körpers zu überwinden, beschrieben Tepic et al. in US Patent 6,261,557 eine therapeutische Zusammensetzung und ein Verfahren zur Behandlung von Krebs, in dem ein Arginin zersetzendes Enzym in Kombination mit einem Proteinabbauinhibitor, wie Insulin, verwendet wird, um die Muskeln des Körpers daran zu hindern, das depletierte Arginin wieder aufzufüllen.
Obgleich Insulin als ein Proteinabbauinhibitor funktionieren kann, hat es auch weit reichende physiologische Wirkungen auf den menschlichen Körper, die fatale Probleme verursachen können, wenn die Blutglukoselevels des Patienten nicht strikt innerhalb des normalen engen Bereichs gehalten werden können. Es ist daher eine Ziel der vorliegenden Erfindung, ein verbessertes Verfahren zur Behandlung und Zusammensetzungen für die Behandlung von Krebs zu finden.
Zusammenfassung der Erfindung
Entsprechend stellt die vorliegende Erfindung in einem Aspekt eine isolierte und im Wesentlichen gereinigte rekombinante humane Arginase I (hiernach zur Vereinfachung der Beschreibung als „Arginase" bezeichnet, falls nichts anderes angemerkt ist) mit einer Reinheit von 80–100% bereit. In der bevorzugten Ausführungsform hat die Arginase eine Reinheit von zwischen 90–100%. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Arginase mindestens zu 99% rein. In dem unten beschriebenen Beispiel ist die Arginase mehr als 99.9% rein, basierend auf densitometrischer Messung nach SDS-PAGE Auftrennung.
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform ist die erfindungsgemäße Arginase modifiziert, um eine genügend hohe enzymatische Aktivität und Stabilität zu haben, um eine „adäquate Argininverarmung" (hiernach als „RAD" bezeichnet) in einem Patienten für mindestens 3 Tage zu erhalten. Ein bevorzugtes Modifikationsverfahren ist ein aminoterminaler Tag von sechs Histidine. Eine andere bevorzugte Modifikation ist Pegylierung, um die Stabilität des Enzyms zu erhöhen und die Immunreaktivität zu minimieren, die durch den Patienten dagegen ausgelöst wird. In dem unten beschrieben Beispiel hat die Arginase eine Plasma-Halbwertszeit von wenigstens drei Tagen und eine spezifische Enzymaktivität von wenigstens 250 I. U./mg.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren bereitgestellt, um ein rekombinantes Protein herzustellen, umfassend die Schritte (a) Klonieren eines Gens, das für das Protein kodiert; (b) Konstruieren eines rekombinanten Bacillus subtilis Stammes zur Expression des Proteins, (c) Fermentieren des rekombinanten Bacillus subtilis Stammes mit einem Zulauf-Verfahren; (d) Hitze-Schocken der rekombinanten B. subtilis Zellen, um die Expression des rekombinanten Proteins zu stimulieren; und (e) Aufreinigen des rekombinanten Proteins aus dem Produkt der Fermentation. In der bevorzugten Ausführungsform wird eine Prophage als rekombinanter Stamm verwendet. Mit dem Zulauf-Verfahren der Fermentation und dem oben beschriebenen Prophagen zum Klonieren und Expremieren der humanen rekombinanten Arginase wird eine mehr als vierfache Steigerung der maximalen optischen Dichte bei der Wellenlänge 600 nm (OD) erreicht und eine mehr als fünffache Verbesserung sowohl der Ausbeute als auch der Produktivität der Arginase, wie in Beispiel 3 im nächsten Abschnitt gezeigt wird. In einer weiteren Ausführungsform kann der Maßstab des Fermentierungsschritts erhöht werden, um das rekombinante Protein herzustellen. In einer weiteren Ausführungsform wird der Fermentierungsschritt mit einem genau definierten Nährmedium mit 180–320 g/L Glukose, 2–4 g/L MgSO₄·7H₂O, 45–80 g/L, Trypton, 7–12 g/L K₂HPO₄ and 3–6 g/L KH₂PO₄ durchgeführt. Die Verwendung von genau definiertem Medium verhindert, dass unerwünschtes Material zusammen mit dem rekombinanten Protein aufgereinigt wird, was das Verfahren sicher und effizient für die Produktion von rekombinantem Material mit pharmazeutischer Qualität macht.
In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das humane Arginasegen mit einer zusätzlichen kodierenden Region bereitgestellt, die sechs zusätzliche Histidine an dessen aminoterminalem Ende kodiert, und der Aufreinigungsschritt umfasst einen Säulenchromatographieschritt mit einem Komplexbildner. In einer weiteren bevorzugten Ausführungsform wird das Arginase-Enzym weiter durch Pegylierung modifiziert, um die Stabilität zu verbessern.
In einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung werden weitere pharmazeutische Zusammensetzungen, die Arginase umfassen, bereitgestellt. In der bevorzugten Ausführungsform besitzt die Arginase eine genügend hohe enzymatische Aktivität und Stabilität, um AAD in einem Patienten für mindestens 3 Tage beizubehalten. In der am meisten bevorzugten Ausführungsform wird die Arginase weiter durch Pegylierung modifiziert, um die Stabilität zu verbessern und die Immunoreaktivität zu minimieren. Gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung wird eine pharmazeutische Zusammensetzung mit Arginase formuliert.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung wird ein Verfahren zur Behandlung einer Krankheit bereitgestellt, das das Verabreichen einer formulierten pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung an einen Patienten umfasst, um das Argininlevel in so einem Patienten unter 10 μM für mindestens 3 Tage ohne Notwendigkeit für andere Proteinabbauinhibitoren zu halten. In einer der bevorzugten Ausführungsformen wird exogen kein Insulin an Nicht-Diabetes-Patienten verabreicht.
Weiterhin involviert das am meisten bevorzugte Behandlungsverfahren der vorliegenden Erfindung das Überwachen des Patientenblutes in Hinsicht auf die Plättchenzahl (die vorzugsweise auf über 50,000 × 10⁹ gehalten wird) und die Prothrombinzeit (die auf nicht mehr als dem Zweifachen des Normalen gehalten wird). Kein Stickoxiderzeuger wird exogen zugegeben, falls diese Levels der Plättchenzahl und Prothrombinzeit nicht erreicht werden. In einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieses Aspektes der vorliegenden Erfindung wird pegylierte Arginase als kurze Infusion von über 30 Minuten bei 3,000–5,000 I. U./kg gegeben. Argininlevels und Arginaseaktivität werden vor Arginaseinfusion und danach täglich bestimmt. Wenn AAD an Tag 2 nicht erreicht wird, wird die Dosis der nächsten Arginase-Infusion im Ermessen des behandelnden Arztes sein. Die maximal tolerierte Länge von AAD wird durch die Zeitdauer definiert, während der der Blutdruck unter Kontrolle (mit oder ohne Medikation, wie es der behandelnde Arzt für geeignet hält) ist, die Plättchenzahl über 50,000 × 10⁹ und die Prothrombinzeit niedriger als das Zweifache des Normalen ist. Wie bei den Argininlevels werden die vollständigen Blutzählungen (CBC) und Prothrombingzeit (PT) täglich bestimmt. Die Leberchemie wird mindestens zwei Mal pro Wochen während der Behandlung kontrolliert.
Die experimentellen Daten, die in der folgenden eingehenden Beschreibung dargestellt werden, zeigen, dass Arginase, wenn sie in genügend potenter Form bereitgestellt wird, für die Behandlung von bösartigen Tumoren nützlich ist. Obwohl die rekombinante humane Arginase I die spezifische Ausführungsform einer Arginase ist, ist es klar, dass andere Formen von Arginase und/oder Ariginase aus anderen Quellen gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden können.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Plasmidkarte von pAB101. Dieses Plasmid zeigt das Gen, das Arginase (arg) kodiert und nur in E. coli, aber nicht in B. subtilis repliziert.
2A, 2B und 2C zeigen die Nukleotidsequenz und ihre abgeleitete Aminosäuresequenz der humanen Arginase I. 2A zeigt die Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 1) von den EcRI/MunI zu den XbyI Stellen von Plasmid pAB101. Nukleotid (nt) 1–6, EcoRI/MunI Stelle; nt 481–486, –35 Stelle der Promoters 1; nt 504–509, –10 Region der Promoters 1; nt 544–549, –35 Region der Promoters 2; nt 566–571, –10 Region der Promoters 2; nt 600–605, Ribosombindungsstelle; nt 614–616, Startcodon; nt 632–637, NdeI Stelle; nt 1601–1603, Stopcodon; nt 1997–2002, XbaI Stelle.
2B zeigt die kodierende Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 2) und ihre korrespondierende kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 3) einer modifizierten humanen Arginase. Nukleotid 614–1603 aus 2A ist eine kodierende Region für die Aminosäuresequenz der modifizierten Arginase. Der 6×His (SEQ ID NO: 4) Tag an dem N-Terminus ist unterstrichen. Das Translationstopcodon ist durch ein Sternchen markiert.
2C zeigt die kodierende Nukleotidsequenz (SEQ ID NO: 8) und seine korrespondierende kodierte Aminosäuresequenz (SEQ ID NO: 9) der normalen humanen Arginase I.
3 ist eine schematische Zeichnung der Konstruktion eines B. subtilis Prophagen, der die Expression von Arginase ermöglicht.
4A und 4B zeigen den Zeitverlauf für eine Fermentation in einem 2-Liter Fermentor durch den rekombinanten Bacillus subtilis Stamm LLC101. 4A zeigt die Ergebnisse, die durch die Batchfermentation erhalten wurden. 4B zeigt die Ergebnisse, die durch die Zulauffermentation erhalten wurden.
5A und 5B zeigen die Verlaufsplots der Fermentation, die die Änderungen der Parameter wie Temperatur, Rührgeschwindigkeit und Werte für pH und gelösten Sauerstoff zeigen. 5A zeigt den Verlaufsplot der Batchfementation, 5B zeigt den Verlaufsplot der Zulauffermentation.
6A und 6B zeigen die Ergebnisse der biochemischen Aufreinigung von humaner Arginase bei 3 h nach Hitzeschock durch die erste 5-ml HiTrap Chelatierungssäule. 6A zeigt die FPLC Laufparameter und das Poteinelutionsprofil. 6B zeigt die SDS-PAGE (12%) Analyse jeweils von 5 μl der Fraktionen 11–31, die von der Säule gesammelt wurden. Das Proteingel wurde mit Coomassie Brilliantblau gefärbt und entfärbt, um die Proteinbanden darzustellen. Spur M: Niedrigbereich-Molekulargewichtsmarker (1 μg pro Bande; Bio-Rad), mit MW (Dalton): 97,400; 66,200; 45,000; 31,000; 21,500; 14,400.
7A und 7B zeigen die Ergebnisse der Aufreinigung der humanen Arginase 3 h nach Hitzeschock durch die zweite 5 ml HiTrap Chelatierungssäule. 7A zeigt die FPLC Laufparameter und das Proteinelutionsprofil. 7B zeigt die SDS-PAGE (12%) Analyse jeweils von 1 μl der Fraktionen 9–39, die von der Säule gesammelt wurden. Das Proteingel wurde mit Coomassie Brilliantblau gefärbt und entfärbt, um die Proteinbanden darzustellen. Spur M: Niedrigbereich-Molekulargewichtsmarker (1 μg pro Bande; Bio-Rad), mit MW (Dalton): 97,400; 66,200; 45,000; 31,000; 21,500; 14,400.
8A und 8B zeigen die Ergebnisse der Aufreinigung der humanen Arginase 6 h nach Hitzeschock durch die erste 5 ml HiTrap Chelatierungssäule. 8A zeigt die FPLC Laufparameter und das Proteinelutionsprofil. 8B zeigt die SDS-PAGE (12%) Analyse jeweils von 2.5 μl der Fraktionen 10–32, die von der Säule gesammelt wurden. Das Proteingel wurde mit Coomassie Brilliantblau gefärbt und entfärbt, um die Proteinbanden darzustellen. Spur M: Niedrigbereich-Molekulargewichtsmarker (1 μg pro Bande; Bio-Rad), mit MW (Dalton): 97,400; 66,200; 45,000; 31,000; 21,500; 14,400.
9A und 9B zeigen die Ergebnisse der Aufreinigung der humanen Arginase 6 h nach Hitzeschock durch die zweite 5 ml HiTrap Chelatierungssäule. 9A zeigt die FPLC Laufparameter und das Proteinelutionsprofil. 9B zeigt die SDS-PAGE (12%) Analyse jeweils von 2 μl der Fraktionen 8–36, die von der Säule gesammelt wurden. Das Proteingel wurde mit Coomassie Brilliantblau gefärbt und entfärbt, um die Proteinbanden darzustellen. Spur M: Niedrigbereich-Molekulargewichtsmarker (1 μg pro Bande; Bio-Rad), mit MW (Dalton): 97,400; 66,200; 45,000; 31,000; 21,500; 14,400.
10 zeigt den Zeitverlauf des Bakterienzellwachstums, wenn Hitzeschock bei einer höheren Zelldichte durchgeführt wird. Hitzeschock wird bei 8 h durchgeführt, wenn die Kulturdichte (OD_600nm) ungefähr 25 ist.
11 ist der Verlaufsplot der Zulauffermentation, wenn Hitzeschock bei einer höheren Zelldichte durchgeführt wird. Dieser Plot zeigt die Veränderungen der Parameterwerte wie Temperatur, Rührgeschwindigkeit, pH und gelöstem Sauerstoff.
12A und 12B zeigen die Ergebnisse der Aufreinigung der humanen Arginase 6 h nach Hitzeschock (bei einer höheren Zelldichte von OD 25) durch die erste 5 ml HiTrap Chelatierungssäule. 12A zeigt die FPLC Laufparameter und das Proteinelutionsprofil.
12B zeigt die SDS-PAGE (12%) Analyse jeweils von 5 μl der Fraktionen 16–46, die von der Säule gesammelt wurden. Das Proteingel wurde mit Coomassie Brilliantblau gefärbt und entfärbt, um die Proteinbanden darzustellen. Spur M: Niedrigbereich-Molekulargewichtsmarker (1 μg pro Bande; Bio-Rad), mit MW (Dalton): 97,400; 66,200; 45,000; 31,000; 21,500; 14,400. Spur „Roh": 5 μl der Rohzellextraktes, bevor er auf die Säule geladen wurde.
13A und 13B zeigen die Ergebnisse der Aufreinigung der humanen Arginase 6 h nach Hitzeschock (bei einer höheren Zelldichte von OD 25) durch die zweite 5 ml HiTrap Chelatierungssäule. 13A zeigt die FPLC Laufparameter und das Proteinelutionsprofil. 13B zeigt die SDS-PAGE (12%) Analyse jeweils von 5 μl der Fraktionen 7–34, die von der Säule gesammelt wurden. Das Proteingel wurde mit Coomassie Brilliantblau gefärbt und entfärbt, um die Proteinbanden darzustellen. Spur M: Niedrigbereich- Molekulargewichtsmarker (1 μg pro Bande; Bio-Rad), mit MW (Dalton): 97,400; 66,200; 45,000; 31,000; 21,500; 14,400.
14A und 14B zeigen die Ergebnisse der Aufreinigung der humanen Arginase 6 h nach Hitzeschock (bei einer höheren Zelldichte von OD 25) durch die erste 1 ml HiTrap SP FF Säule. 14A zeigt die FPLC Laufparameter und das Proteinelutionsprofil. 14B zeigt die SDS-PAGE (12%) Analyse jeweils von 5 μl der Fraktionen A11-B7, die von der Säule gesammelt wurden. Das Proteingel wurde mit Coomassie Brilliantblau gefärbt und entfärbt, um die Proteinbanden darzustellen. Spur M: Niedrigbereich-Molekulargewichtsmarker (1 μg pro Bande; Bio-Rad), mit MW (Dalton): 97,400; 66,200; 45,000; 31,000; 21,500; 14,400.
15A und 15B zeigen die Aufreinigung der humanen Arginase 6 h nach Hitzeschock (bei einer höheren Zelldichte von OD 25) durch die zweite 1 ml HiTrap SP FF Säule. 15A zeigt die FPLC Laufparameter und das Proteinelutionsprofil. 15B zeigt die SDS-PAGE (12%) Analyse jeweils von 5 μl der Fraktionen A6-B12, die von der Säule gesammelt wurden. Das Proteingel wurde mit Coomassie Brilliantblau gefärbt und entfärbt, um die Proteinbanden darzustellen. Spur M: Niedrigbereich-Molekulargewichtsmarker (1 μg pro Bande; Bio-Rad), mit MW (Dalton): 97,400; 66,200; 45,000; 31,000; 21,500; 14,400.
16A und 16B sind die SDS-PAGE (15%) Analysen der humanen Arginase, die mit mPEG-SPA (MW 5,000) bei Verwendung des molaren Verhältnisses von Arginase:PEG von 1:50 modifiziert wurde. 16A zeigt die Ergebnisse, wenn die Reaktionen auf Eis durchgeführt werden. Spur 1: Niedrigbereich-Molekulargewichtsmarker; Spur 2: Arginase (5.35 μg) ohne zusätzliches PEG (Kontrolle); Spur 3: 1 h nach Reaktion; Spur 4: 0.5 h nach Reaktion; Spur 5: 2 h nach Reaktion; Spur 6; 3 h nach Reaktion; Spur 7: 4 h nach Reaktion; Spur 8: 5 h nach Reaktion; Spur 9; 23 h nach Reaktion; 16B zeigt die Ergebnisse, wenn Reaktionen bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Spur 1: Niedrigbereich-Molekulargewichtsmarker; Spur 2: Arginase (5.35 μg) ohne zusätzliches PEG (Kontrolle); Spur 3: 1 h nach Reaktion; Spur 4: 0.5 h nach Reaktion; Spur 5: 2 h nach Reaktion; Spur 6; 3 h nach Reaktion; Spur 7: 4 h nach Reaktion; Spur 8: 5 h nach Reaktion; Spur 9; 23 h nach Reaktion.
17A und 17B sind die SDS-PAGE (15%) Analysen der humanen Arginase, die mit mPEG-SPA (MW 5,000) bei Verwendung eines molaren Verhältnisses von Arginase:PEG von 1:20 modifiziert wurde. 17A zeigt die Ergebnisse, wenn die Reaktionen auf Eis durchgeführt werden. Spur 1: Niedrigbereich-Molekulargewichtsmarker; Spur 2: Arginase (5.35 μg) ohne zusätzliches PEG (Kontrolle); Spur 3: 1 h nach Reaktion; Spur 4: 0.5 h nach Reaktion; Spur 5: 2 h nach Reaktion; Spur 6; 3 h nach Reaktion; Spur 7: 4 h nach Reaktion; Spur 8: 5 h nach Reaktion; Spur 9; 23 h nach Reaktion; 17B zeigt die Ergebnisse, wenn Reaktionen bei Raumtemperatur durchgeführt werden. Spur 1: Niedrigbereich-Molekulargewichtsmarker; Spur 2: Arginase (5.35 μg) ohne zusätzliches PEG (Kontrolle); Spur 3: 1 h nach Reaktion; Spur 4: 0.5 h nach Reaktion; Spur 5: 2 h nach Reaktion; Spur 6; 3 h nach Reaktion; Spur 7: 4 h nach Reaktion; Spur 8: 5 h nach Reaktion; Spur 9; 23 h nach Reaktion.
18A ist die SDS-PAGE (15%) Analyse der humanen Arginase, die mit mPEG-CC (MW 5,000) modifiziert wurde. Die Reaktionen wurden auf Eis durchgeführt. Spur 1: Niedrigbereich-Molekulargewichtsmarker; Spur 2: Arginase (5.35 μg) ohne zusätzliches PEG (Kontrolle); Spur 3: 2 h nach Reaktion bei einem molaren Verhältnis Arginase:PEG 1:50; Spur 4: leer; Spur 5: 23 h nach Reaktion bei einem molaren Verhältnis Arginase:PEG 1:50; Spur 6; 2 h nach Reaktion bei einem molaren Verhältnis Arginase:PEG 1:20; Spur 7: 5 h nach Reaktion bei einem molaren Verhältnis Arginase:PEG 1:20; Spur 8: 23 h nach Reaktion bei einem molaren Verhältnis Arginase:PEG 1:20.
18B zeigt die SDS-PAGE (12%) Analyse von nativer und pegylierter Arginase, die hoch aktiv und stabil ist. Spur 1: Niedrigbereich-Molekulargewichtsmarker (BIORAD); Spur 2: Native Arginase (1) μg; Spur 3: Pegylierte Arginase (1 μg); Spur 4: Pegylierter Arginase nach Ultradialyse (1.5 μg).
19A und 19B zeigen die Messung der Reinheit der isolierten rekombinanten humanen Arginase. 19A zeigt die für Spur 1: 5 μg gereinigte, in E. coli exprimierte rekombinante humane Arginase, die durch die von Ikemoto et al. (Ikemoto et al., 1990, Biochem. J. 270, 697–703) beschriebenen Verfahren erhalten wurde. Spur 2: 5 μg gereinigte B. subtilis exprimierte rekombinante humane Arginase, die durch Verfahren erhalten wurde, die in diesem Bericht beschrieben wurden. 19B zeigt die Analyse von Proteinbandendichten, die in 19A gezeigt sind, mit dem Lumianalyst 32 Programm von Lumi-imager^TM (Roche Molecular Biochemicals). Oberes Panel: Ergebnisse von Spur 1 von 19A. Unteres Panel: Ergebnisse von Spur 2 von 19A.
20 ist ein Diagramm, das die Stabilität der pegylierten Arginase in vitro in humanem Blutplasma zeigt.
21 und 22 zeigen die Bestimmung der Halbwertszeit in vivo von pegylierter Arginase, die durch das in Beispiel 8A beschriebene Verfahren erhalten wurde. 21 zeigt die in vivo Aktivität der pegylierten Arginase, die erfindungsgemäß mit dem in Beispiel 9A beschriebenen Aktivitätstest hergestellt wurde.
22 ist ein Blot, aus dem die erste Halbwertszeit und die zweite Halbwertszeit der pegylierten Arginase bestimmt werden.
23 ist ein Vergleich der Arginindepletion in vier Gruppen von Laborratten, denen intraperitoneal veschiedenen Dosen von pegylierter rekombinanter humaner Arginase verabreicht wurden. (500 I. U., 1000 I. U., 1500 I. U. und 3000 I. U.).
24 zeigt den Vergleich der Überlebensrate, durchschnittlichen Tumorgröße und Tumorwachstumsrate von Tumoren zwischen 2 Gruppen von Nacktmäusen, die Tumore besitzen, die durch Implantation mit Hep3B Zellen induziert wurden. Eine Gruppe wurde mit Arginase mit einer Dosis von 500 I. U. intraperitoneal behandelt, während die andere Kontrollgruppe nicht mir Arginase behandelt wurde.
25A und 25B zeigen den Vergleich von durchschnittlicher Tumorgröße und durchschnittlichem Tumorgewicht zwischen 2 Gruppen von Nacktmäusen, die Tumore besitzen, die durch Implantation mit PLC/PRF/5 Zellen induziert wurden. Eine Gruppe wurde mit Arginase mit einer Dosis von 500 I. U. intraperitoneal behandelt, während die andere Kontrollgruppe nicht mir Arginase behandelt wurde.
26A und 26B zeigen den Vergleich von durchschnittlicher Tumorgröße und durchschnittlichem Tumorgewicht zwischen 2 Gruppen von Nacktmäusen, die Tumore besitzen, die durch Implantation mit HuH-7 Zellen induziert wurden. Eine Gruppe wurde mit Arginase mit einer Dosis von 500 I. U. intraperitoneal behandelt, während die andere Kontrollgruppe nicht mir Arginase behandelt wurde.
27 zeigt den Vergleich von durchschnittlicher Tumorgröße von 2 Gruppen von Nacktmäusen, die Tumore besitzen, die durch Implantation mit MCF-7 Zellen induziert wurden. Eine Gruppe wurde mit Arginase mit einer Dosis von 500 I. U. intraperitoneal behandelt, während die andere Kontrollgruppe nicht mir Arginase behandelt wurde.
28 und 29 zeigt die in vivo Ariginin- bzw. CEA-Levels des Patienten während der Behandlung, wie sie in Beispiel 12 beschrieben wird.
Eingehende Beschreibung
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "pegylierte Arginase" auf die Arginase 1 der vorliegenden Erfindung, die durch Pegylierung modifiziert wurde, um die Stabilität des Enzyms zu erhöhen und die Immunoreaktivität zu minimieren.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Ausdruck „im Wesentlichen das Gleiche", egal ob er in Bezug auf die Nukleotidsequenz von DNA, die Ribonukleotidsequenz von RNA oder die Aminosäuresequenz von Proteinen verwendet wird, auf Sequenzen, die geringe und auswirkungslose Sequenzvariationen von den hier offenbarten tatsächlichen Sequenzen besitzen. Spezies mit Sequenzen, die im Wesentlichen das gleiche sind, werden zu den offenbarten Sequenzen als äquivalent betrachtet und sind als solche innerhalb des Schutzumfanges der beigefügten Ansprüche. In dieser Hinsicht bedeuten "geringe und auswirkungslose Sequenzvariationen", dass Sequenzen, die im Wesentlichen das gleiche wie die hier offenbarten und/oder beanspruchten DNA, RNA oder Proteine sind, funktional äquivalent zu den hier offenbarten und/oder beanspruchten Sequenzen sind. Funktional äquivalente Sequenzen werden im Wesentlichen in der gleichen Weise funktionieren, um die im Wesentlichen gleichen Zusammensetzungen wie die hier offenbarten und beanspruchten Nukleinsäure- und Aminosäurezusammensetzungen herzustellen. Insbesondere kodieren funktional äquivalente DNAs Proteine, die die gleichen wie die hierin offenbarten sind, oder Proteine, die konservative Aminosäurevariationen besitzen, wie die Substitution eines nicht polaren Restes für einen anderen nicht polaren Rest oder eines geladenen Restes für einen ähnlich geladenen Rest. Diese Veränderungen schließen diejenigen ein, von denen dem Fachmann bekannt ist, dass sie im Wesentlichen nicht die Tertiärstruktur des Proteins ändern. Der Begriff „ausreichend hohe enzymatische Aktivität" bezieht sich auf die spezifische Enzymaktivität der rekombinanten humanen Arginase mit mindestens 250 I. U./mg, vorzugsweise mindestens 300–350 I. U./mg, noch bevorzugter mindestens 500 I. U./mg. In der bevorzugten Ausführungsform besitzt die Arginase eine spezifische Aktivität von 500–600 I. U./mg. Der Begriff „Stabilität" bezieht sich auf die in vitro Stabilität der Arginase. Bevorzugt bezieht sich die Stabilität auf die in vivo Stabilität. Die Abnahmerate der Enzymaktivität ist invers proportional zu der Plasmastabilität der isolierten aufgereinigten rekombinanten humanen Arginase. Die Halbwertszeit einer solchen humanen Arginase im Plasma ist berechnet.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff „adäquate Argininverarmung" (AAD) auf ein in vivo Argininlevel bei oder unter 10 μM. Der Begriff „Krankheit" bezieht sich auf jegliche pathologischen Zustände, was einschließt, aber nicht beschränkt ist auf Lebererkrankungen und Krebs.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Halbwertszeit" (1/2-Wertszeit) auf die Zeit, die benötigt wird, damit die Konzentration der Arginase in humanem Plasma in vitro um die Hälfte sinkt. Früh im Jahr 2001 wurden drei Fälle von spontaner transienter Remission von hepatozellulären Carcinoma (HCC) durch einen der Erfinder der vorliegenden Erfindung beobachtet. Alle drei Patienten hatten eine spontane Ruptur der HCC mit resultierendem Haemoperitoneum. In jedem Fall wurde gefunden, dass das Plasmaarginin so niedrig wie 3 μM war und das Argininlevel in der Ascitisflüssigkeit bei 7 μM. Diese Patienten hatten alle eine spontane Remission ihres Lebertumors bei Normalisierung des Alfa-Fetoproteins (AFP), nach Bruch der Leberläsionen ohne jede Behandlung mit irgendwelchen pharmazeutischen Wirkstoffen. Ein Patient hatte Remission dieser HCC für über 6 Monate. Erfindungsgemäß wird angenommen, dass eine solche lang andauernde Remission durch Arginindepletion wegen der spontanen und anhaltenden Freisetzung von endogener Ariginase in das Peritoneum aus der Ruptur der Leben verursacht wird. Somit leiteten die Erfinder ab, dass lang andauernde Arginindepletion der ursächliche Faktor war, der zur Remission der HCC führte.
Eine Serie von Experimenten wurde dann durch den Erfinder der vorliegenden Erfindung entworfen, um zu zeigen, dass endogene hepatische Arginase aus der Leber nach transhepatischer arterieller Embolierung die systemische Argininverarmung verursacht. Dies wurde nun in der provisorischen US Patentanmeldung Nr. 60/351816 eingereicht, die hier durch Bezugnahme aufgenommen wird. In den Experimenten, die durch den Erfinder entworfen wurden, wurde gefunden, dass moderate und messbare Menge an endogener hepatischer Arginase in den systemischen Blutkreislauf in Patienten bei unresektierter metastatischer HCC nach hepatischer arterieller Embolisierungsbehandlung mit Lipiodol und Gelschaum freigesetzt wurden, die einen temporären hepatischen Perfusionsdefekt verursachte. Hochdosisinsulininfusion wurde in das Behandlungsschema aufgenommen, um einen Zustand der Hypoaminoacidemie zu induzieren. In einer Serie von 6 Fällen von behandelter HCC hatten 4 eine extrahepatische Remission von Leberkrebs, was nahe legt, dass die Behandlungseffekte systemisch sind. Ein Patient hatte eine anhaltende vollständige Remission, sowohl radiologisch mit CT und PET in seiner Leber und der extrahepatischen Krankheit (abdominale Adenopathie). Sein AFP-Level fiel innerhalb von 3 Wochen auf Normal und blieb dort für über 4 Monate. Intervall CT bei 4 Monaten zeigte weder einen nachweisbaren hepatischen noch extrahepatischen Tumor. Die anderen 3 Patienten hatten alle Remission ihrer extrahepatischen Krankheit (eine pulmonale, eine mesenteriale/retroperitoneale/Knochen- und eine retroperitoneale Adenopathie) im PET Scan 4 Wochen nach Embolierung. Beim Testen auf ihre Arginaseaktivitäten und Argininlevels hatten alle adäquate Arginindepletion für eine Zeitdauer, die von 2 Stunden bis 2 Tage andauerte. Tatsächlich korrelierte die Länge der AAD gut mit dem Grad und der Länge der Remission sowohl des hepatischen als auch des extrahepatischen Tumors.
Obwohl die transhepatische arterielle Embolierungstechnik in Verbindung mit hohen Dosen von Insulininfusion durchgeführt wurde, realisierten die Erfinder in der Folge, dass in Einklang mit der vorliegenden Erfindung der Bedarf für die Verabreichung von Insulin auf die Tatsache zurückzuführen war, dass ungenügende Arginaseaktivitäten in das System des Patienten freigesetzt werden können, so dass jeglicher Proteinabbau aus dem Muskel einen kompensatorischen Effekt auf die Argininverarmung haben und die Behandlung ineffektiv machen könnte. Erfindungsgemäß bemerkten die Erfinder, dass, um die Behandlung zu verbessern und die Notwendigkeit, Insulin im Verbindung mit der Argininverarmungsbehandlung zu verabreichen, die Arginaseaktivität in genügend großen Mengen in dem System des Patienten vorliegen musste, um jeglichem Proteinabbau aus dem Muskel entgegenzuwirken. Erfindungsgemäß begannen die Erfinder daher, ein Arginaseenzym herzustellen, das ausreichend hohe enzymatische Aktivitäten und Stabilität besaß, um eine „adäquate Argininverarmung" (hiernach als „AAD" bezeichnet) von unter 10 μM in dem Patienten beizubehalten, ohne dass es notwendig ist, hohe Dosen von Insulin zu verabreichen. Zusätzlich zur Unterstützung der endogenen Arginase stellt die erfindungsgemäße hoch stabile und aktive Arginase den zusätzlichen Vorteil bereit, AAD zu erreichen, ohne einen Proteinabbauinhibitor zu verabreichen, der unerwünschte Nebenwirkungen auf den Patienten besitzt.
Systemische Depletion von Arginin kann andere unerwünschte Nebenwirkungen verursachen, die mit Stickoxiddefizienz in Verbindung stehen. Diese schließen Hypertension wegen des Fehles der Gefäßerweiterungseffekts von NO auf das vaskuläre Endothel, Plättchenaggregation und Thrombocytopenie sekundär zum Mangel von NO und die Depletion von frühen Gerinnungsfaktoren ein, die mit dem temporären Unterbrechen der Zellteilung in Verbindung stehen. Die Erfinder erkannten jedoch, dass in Stickoxid-Knockout-Mäusen die Tiere nicht hypertensiv sind und eine normale Lebenserwartung bei normalen Plättchenzahlen haben. Somit wird gemäß einem anderen Aspekt der vorliegenden Erfindung und in Patienten mit Thrombocytopenie keine offene hämorrhagische Tendenz gesehen, bis die Plättchenzahl gut unter 50,000 × 10⁹ ist. In Patienten mit Neigung zur Thrombose bedingt die Therapie eine Verlängern der Prothrombinzeit für bis zum Zweifachen des Normalen.
Die folgenden detaillierten Beispiele lehren, wie eine erfindungsgemäße hoch stabile und aktive Arginase herzustellen und zu verwenden ist. Beispiel 1 beschreibt die Konstruktion des rekombinanten Stammes Bacillus subtilis LLC101, der das humane Arginase I Gen enthält. Dem folgen zwei Beispiele von Fermentation des rekombinanten B. subtilis. In den anfänglichen Fermentationsexperimenten der rekombinanten LLC101 Zellen wurden Batch-Fermentation und Zulauffermentation in einem 2-L Fermentor durchgeführt. Es wurde herausgefunden, dass unter Batchbedingungen eine genügend hohe Zelldichte nicht erreicht werden konnte. Nur unter den Zulaufbedingungen, die erfindungsgemäß bereitgestellt wurden, wurde die Zelldichte über 10 OD erhöht (optische Dichte). Diese Experimente und Ergebnisse werden in Beispielen 2A und 2B gezeigt. Ein Vergleich der 2 Fermentationsverfahren wird in Beispiel 3 gezeigt. Zulauffermentationsbetrieb wurde daher für die Produktion von isolierter und gereinigter rekombinanter humaner Arginase gewählt. Die Zulauf-Fermentation wurde in einem größeren Maßstab in einen 100-L Fermentor übertragen. Die Experimente und Ergebnisse werden in Beispiel 2C gezeigt.
Der LLC101 Stamm ist ein hitzesensitiver Stamm, der die Expression der Arginase nach Hitzeschock bei 50°C bewirkt. In den anfänglichen Optimierungsexperimenten wurde die Hitzeschockbehandlung bei variierenden Zelldichten durchgeführt, um optimale Bedingungen zu erhalten, unter denen die maximale Menge an Arginase hergestellt würde. Beispiele 5 und 6 beschreiben den Aufreinigungsprozess und die Ausbeute von gereinigter Arginase, die auf diese Weise durch zwei verschiedene Zulauf-Fermentationsläufe mit Hitzeschock bei zwei verschiedenen ODs (optische Dichte bei 600 nm), 12.8 und 25, erhalten wurde. Die experimentellen Daten zeigten dass, obwohl alle Hitzeschocks während der exponentiellen Wachstumsphase der LLC101 eingesetzt wurden, eine Einführung eines Hitzeschocks bei einer geringeren Zelldichte, z. B. 12.8 OD, bessere Ergebnisse produzierte.
Die Bedingungen für die maximale Expression von Arginase nach Hitzeschock wurden optimiert, indem die Zeit der Ernte nach dem Hitzeschock variiert wurde. Beispiel 4 zeigt die Ergebnisse vom Ernten der Zellen drei Stunden nach Hitzeschock und bei Verwendung eines Zulauffermentationsprozesses.
Bespiel 5 beschreibt eine Aufreinigung von Arginase 6 Stunden nach Hitzeschock bei einer Zelldichte von 12.8 OD. Beispiel 6 beschreibt die Aufreinigung von Arginase 6 Stunden nach Hitzeschock bei einer höheren Zelldichte von 25 OD. Beispiel 7 zeigt einen Vergleich der Daten, um die Ausbeute der Arginase unter verschiedenen Ernte- und Aufreinigungsbedingungen zu vergleichen. Diese Daten zeigen, dass das Ernten der Zellen 6 h nach Hitzeschock bei einer niedrigeren Zelldichte von 12.8 eine höhere Arginaseausbeute von 162 mg/L produzierte. Die Arginase wurde modifiziert, um die Stabilität zu verbessern. Beispiel 8A zeigt ein Protokoll für die Pegylierung der Arginase mit Zyanurchlorid (cc) als Quervernetzer bei einem molaren Verhältnis von 1:140 (Arginase:PEG). Beispiel 8B beschreibt ein anderes Pegylierungsprotokoll, in dem ein wesentlich geringerer Anteil von Quervernetzern in die Reaktionsmischung mit dem Enzym hinzugegeben wird. Sowohl cc als auch das Succinimid der Propionsäure (SPA) wurden als Quervernetzer getestet. Experimentelle Ergebnisse zeigen, dass das hier in Beispiel 8B beschriebene Verfahren mit SPA eine pegylierter Arginase mit einer Halbwertszeit von 3 Tagen und einer spezifischen Aktivität von ungefähr 255 I. U./mg bereitstellt, wie es in den Beispielen 9 und 10 beschrieben wird. Beispiel 8C beschreibt ein Verfahren zur Herstellen einer hoch aktiven pegylierten Arginase, die eine spezifische Aktivität von ungefähr 592 I. U./mg besitzt.
Mit dem oben beschriebenen Verfahren wurde eine hoch stabile und aktive Arginase hergestellt. Sie besitzt ausreichend hohe Aktivität und Stabilität, um die Behandlung von Patienten zu erlauben, ohne signifikanten Einsatz eines Proteinabbauinhibitors, da jede Wiederbereitstellung von Arginin durch den Muskel durch die systemische Arginase schnell entfernt würde. Somit kann adäquate Argininverarmung unter 10 μM ohne hohe Dosen von exogen verabreichtem Insulin erreicht werden. Zahlreiche Behandlungsprotokolle mit der erfindungsgemäßen Arginase werden in Beispiel 11 beschrieben. Beispiel 12 veranschaulicht klinische Daten eines Patienten, dem Arginase verabreicht wurde, um das Behandlungsprotokoll, das in Beispiel 11 gezeigt wird, zu stützen.
Beispiele 13 bis 14 sind zwei Tierstudien in Ratten, die Dosisreaktionen und sichere Dosen der erfindungsgemäßen Arginase untersuchen. Beispiele 15 bis 18 sind eine andere Serie von Tierstudien mit Nacktmäusen, um die Reaktionen der Tumoren zu untersuchen, die durch verschiedene humane Krebszelllinien nach Arginindepletion induziert werden, die durch Verabreichung der modifizierten Arginase induziert werden.
Alle oben zitierten Fundstellen werden durch Bezugnahme aufgenommen. Die Ausübung der Erfindung wird in den folgenden nicht einschränkenden Beispielen exemplarisch dargestellt. Der Umfang der Erfindung wird allein durch die beigefügten Patentansprüche definiert, die in keiner Weise durch den Inhalt oder Umfang der Beispiele eingeschränkt sind.
BEISPIELE
Beispiel 1: Konstruktion des rekombinanten Stammes LLC101
(a) Isolierung des für humane Arginase I kodierenden Gens
Die Gensequenz von humaner Arginase I wurde 1987 veröffentlicht (Haraguchi, Y et al., 1987, Proc. NatI. Acad. Sci. 84, 412–415) und Primer wurde daraus entworfen. Polymerasekettenreaktion (PCR) wurde durchgeführt, um das Gen, das für eine humane Arginase kodiert, mit dem Expand High Fidelity PCR System Kit (Roche) zu isolieren. Primer Arg1 (5'-CCAAACCATATGAGCGCCAAGTCCAGAACCATA-3') (SEQ ID NO: 5) bzw. Arg2 (5'-CCAAACTCTAGAATCACATITTTTGAATGACATGGACAC-3') (SEQ ID NO: 6) wurden von Genset Singapore Biotechnology Pte Ltd erworben. Beide Primer haben die gleiche Schmelztemperatur (T_m) von 72 Grad C. Primer Arg 1 enthält eine NdeI Restriktionsenzym-Erkennungsstelle (unterstrichen) und Primer Arg2 enthält eine XbaI Stelle (unterstrichen). Diese zwei Primer (Endkonzentration jeweils 300 nM) wurden zu 5 μl der Humanleber „5'-stretch plus cDNA Bibliothek" (Clontech) in einer 0.2-ml Mikroröhre hinzugeben. DNA Polymerase (2.6 Einheiten, 0.75 μl), die vier Desoxyribonukleotide (4 μl von jedem; Endkonzentration jeweils 200 μM) und Reaktionspuffer (5 μl) und dH₂O (17.75 μl) wurden auch hinzugegeben. PCR wurde mit den folgenden Bedingungen durchgeführt: prä-PCR (94 Grad C, 5 min), 25 PCR Zyklen (94 Grad C, 1 min; 57 Grad C, 1 min; 72 Grad C, 1 min), post-PCR (72 Grad C, 7 min). PCR Produkt (5 μl) wurde auf einem 0.8% Agarosegel analysiert und eine einzelne Bande von 1.4 kb wurde beobachtet. Dieses DNA-Fragment enthält das Gen, das für Arginase kodiert.
(b) Isolierung von Plasmid pSG1113
Plasmid pSG1113, das ein Derivat von Plasmid pSG703 (Thornewell, S. J. et al., 1993, Gene, 133, 47–53) ist, wurde aus dem E. coli DH5α Klon, der das pSG1113 trägt, mit dem „Wizard Plus Minipreps DNA Purification System" (Promega) gemäß den Herstellerangaben isoliert. Das Plasmid, das nur in E. coli repliziert, aber nicht in B. subtilis wurde als Vektor für das Subklonieren des Arginase Gens verwendet.
(c) Subklonieren des 1.4 kb PCR Produkts in Plasmid pSG1113 um Plasmid pAB101 zu bilden
Das PCR Produkt, das mit dem obigen Protokoll hergestellt wurde, wurde mit den Restriktionsendonukleasen NdeI uand XbaI (Promega) in einem Reaktionsmedium zusammengesetzt aus 6 mM Tris-HCl (pH 7.9), 6 mM MgCl₂, 150 mM NaCl, 1 mM DTT bei 37 Grad C für 1.5 h behandelt. Nach Beendigung der Behandlung wurde die Reaktionsmischung der Agarosegelelektrophorese (0.8%) unterzogen und das 1.4 kb DNA-Fragment wurde aus dem Gel mit dem „Qiaex II Gel Extraction Kit" (Qiagen) gewonnen. Davon getrennt wurde das Plasmid pSG1113 mit den gleichen Restrikstionsendonukleasen in der gleichen Weise behandelt. Nach Beendigung der Behandlung wurde die Reaktionsmischung der Agarosegelelektrophorese (0.8%) unterzogen und ein 3.5 kb DNA-Fragment wurde aus dem Gel gewonnen. Dieses DNA Fragment wurde mit T4 DNA Ligase mit dem obigen 1.4 kb DNA Fragment verbunden. Die Ligationsmischung wurde verwendet, um E. coli XLI-Blue mit dem konventionellen Kalzium-Verfahren zu transformieren (Sambrook, J. et al., Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 2te Ausgabe, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) und auf Nähragarplatten, die 100 μg/ml Ampicillin enthielten, plattiert. Kolonien wurden auf ein Plasmid mit dem korrekten Insert durch Restriktionsanalyse gescreent. Das konstruierte Plasmid wurde als pAB101 (1) bezeichnet. ORI ist der E. coli Startpunkt der Replikation und bla ist das Ampizillinresistenzmarkergen. DNA Sequenzierung wurde mit den Primern Arg1 (SEQ ID NO: 5), Arg2 (SEQ ID NO: 6) und Arg6(5'-CTCTGGCCATGCCAGGGTCCACCC-3') (SEQ ID NO: 7) durchgeführt, um die Identität des Gens zu bestätigen, das Arginase kodiert (2).
(d) Konstruktion des neuen rekombinanten B. subtilis Prophagenstammes LLC101
Das Plasmid pAB101 wurde extrahiert und aus dem Klon mit dem „Wizard Plus Minipreps DNA Purification System" (Promega) gereinigt, der pAB101 trägt. In dem Plasmid pAB101 (1) war das Arginase Gen (arg) durch das 0.6 kb MunI-NdeI φ105 Phagen DNA Fragment (als "φ105" bezeichnet) und das cat Gen (1 und 3) flankiert. Dieses Plasmid DNA (1 μg) wurde verwendet, um kompetente B. subtilis 1A304 (φ105MU331) gemäß dem bekannten Verfahren (Anagnostopoulos C. und Spizizen J., 1961, J. Bacteriol. 81, 741–746) zu transformieren. Der B. subtilis Stamm 1A304 (φ105MU331 wurde von J. Errington (Thornewell, S. et al., 1993, Gene 133, 47–53) erhalten. Der Stamm wurde gemäß den Veröffentlichungen durch Thornewell, S. et al., 1993, Gene 133, 47–53 und durch Baillie, L. W. J. et al., 1998, FEMS Microbiol. Letters 163, 43–47 hergestellt, die hier durch Bezugnahme in ihrer Gesamtheit aufgenommen werden. Plasmid pAB101 (in 3 linearisiert gezeigt) wurde in B. subtilis Stamm 1A304 (φ105MU331) bei Selektion auf den Cm^R Marker transformiert, und die Transformanten wurden auf einen Er^S Phänotyp gescreent. Solche Transformanten sollten von einem Doppelkreuzungsereignis, wie in 3 gezeigt, herrühren, wodurch die Transkription des Arginasegens (arg) unter die Kontrolle des starken Phagenpromoters gesetzt wird (Leung und Erington, 1995, Gene 154, 1–6). Die dicken Linien stellen das Prophagengenom dar, unterbrochene Linien das B. subtilis Chromosom, und dünne Linien Plasmid DNA. Die Gene werden in 3 als schattierte Pfeile gezeigt, die in die Richtung der Transkription und Translation deuten. Regionen von Homologie sind durch gebrochene vertikale Linien verbunden und homologe Rekombinationsereignisse durch „X".
Zweiundfünfzig Chloramphenicol-resistente (Cm^R) Kolonien wurden durch Ausplattieren von 600 μl transformierten Zellen auf einer Agarplatte erhalten, die Chloramphenicol (5 μg/ ml) enthielt. Zehn dieser Kolonien wurde zufällig ausgewählt und auf eine Agarplatte gestrichen, die Erythromycin (20 μg/ml) enthielt und eine dieser Kolonien wuchs nicht, was darauf hinwies, dass sie Erythromycin sensitiv war (Er^S). Diese Chloramphenicol-resistente, aber Erythromycin-sensitive Kolonie wurde somit isoliert und als LLC101 bezeichnet. In dem Chromosom dieses neu konstruierten Prophagenstammes wurde das Erythromycinresistenzgen (erm^C) durch das Arginasegen (arg) durch ein Doppelkreuzungsereignis in einem Prozess von homologer Rekombination ersetzt. Das 0.6 kb 0.6 kb MunI-NdeI φ105 Phagen DNA Fragment (als "φ105" bezeichnet) und das cat Gen stellte die homologen Sequenzen für die Rekombination bereit. Auf diese Weise wurde das Arginasegen auf die Expressionsstelle in der Prophagen DNA von B. subtilis 1A304 (φ105MU331) gerichtet und das Arginasegen wurde unter die Kontrolle des starken thermoinduzierbaren Promoters gesetzt (Leung, Y C. and Errington, J., 1995, Gene 154, 1–6).
Fermentation von B. subtilis LLC101 Zellen
Beispiel 2A: Batchfermention in einem 2 Liter Fermentor
Der B. subtilis LLC101 Stamm wird auf einer Nähragarplatte (Rinderextrakt 1 g/L, Pepton 10 g/L, NaCl 5 g/L und Agar 20 g/L) gehalten, das mit 5 mg/L Chloramphenicol supplementiert ist. Um das Inokulum für die Batch- und Zulauffermentation herzustellen, wurden einige wenige Kolonien des zuvor erwähnten Stammes aus einer frisch hergestellten Nähragarplatte in zwei 1-I-Flaschen transferiert, die jeweils 80 ml Fermentationsmedium enthaltend Glukose 5 g/L, Trypton 10 g/L, Hefeextrakt 3 g/L, Natriumzitrat 1 g/L, KH₂PO₄ 1.5 g/L, K₂HPO₄ 1.5 g/L, und (NH₄)₂SO₄ 3 g/L enthielten. Die bakterielle Zellkultur wurde bei 37°C und pH 7.0 auf einem Rotationsschüttler bei 250 rpm kultiviert. Die Kultivierung wurde beendet, wenn die OD600 nm 5.5–6.0 bei ungefähr 9–11 h Wachstumszeit erreichte. Dann wurde die 160 ml Kulturbrühe in den 2 L Fermentor enthaltend 1440 ml Fermentationsmedium eingeführt (Glukose 5 g/L, Trypton 10 g/L, Hefeextrakt 3 g/L, Natriumzitrat 1 g/L, KH₂PO₄ 1.5 g/L, K₂HPO₄ 1.5 g/L, und (NH₄)₂SO₄ 3 g/L). Die Batchfermentation wurde bei einer Temperatur von 37°C durchgeführt. Der pH wurde bei 7.0 durch Zugabe von Natriumhydroxid und Salzsäure kontrolliert. Die Konzentration des gelösten Sauerstoffs wurde bei 20% Luftsättigung unter Anpassung der Rührgeschwindigkeit kontrolliert. Hitzeschock wurde bei 3.25 h durchgeführt, wenn die Kulturdichte (OD_{600 nm}) ungefähr 3.9 war. Während des Hitzeschocks wurde die Temperatur des Fermentors von 37 Grad C auf 50 Grad C erhöht und dann sofort auf 37 Grad C abgekühlt. Der vollständige Erwärmungs- und Abkühlungszyklus betrug ungefähr 0.5 h. Die OD der Kultur erreichte ungefähr 6.4 bei 3.5 h nach Hitzeschock. Die Zellen wurden zur Abtrennung und Aufreinigung der Arginase bei 6 h nach Hitzeschock geerntet. Der zuvor erwähnte Stamm produzierte aktive humane Arginase in einer Menge von ungefähr 30 mg/L des Fermentationsmediums bei 6 h nach Hitzeschock. Der Zeitverlauf der Fermentation ist in 4A geplottet. Der Verlaufsplot dieser Batchfermentation, der die Veränderungen der Parameterwerte wie Temperatur, Rührgeschwindigkeit, pH und gelöstem Sauerstoff zeigt, wird in 5A dargestellt.
Beispiel 2B: Zulauffermentation in einem 2 Liter Fermentor
Die Zulauffermentation wurde bei 37 Grad C, pH 7.0 und 20% Luftsättigung mit gelöstem Sauerstoff durchgeführt. Die Inokulierungsprozedur war der Batchfermentation, die in Beispiel 2A beschrieben wurde, ähnlich. Anfänglich war das Wachstumsmedium dem, das in der Batchfermentation in Beispiel 2A beschrieben wurde, identisch. Das Wachstumsmedium enthielt 200 g/L Glukose, 2.5 g/L MgSO4·7H₂O, 50 g/L Trypton, 7.5 g/L K₂HPO₄ und 3.75 g/L KH₂PO₄. Die Mediumzulaufrate wurde mit der ph-Stat-Kontrollstrategie kontrolliert. Bei dieser Strategie wird die Zulaufrate angepasst, um den pH-Anstieg zu kompensieren, der durch Glukosedepletion verursacht wird. Diese Kontrollstrategie wurde zuerst implementiert, als die Glukosekonzentration zu einem sehr geringen Level ungefähr bei 4.5 h Fermentationszeit absank. Wen der pH > 7.1 war, wurden 4 ml Zulaufmedium in den Fermentor eingeführt. Unmittelbar nach der Zugabe der Glukose fiel der pH-Wert schnell unter 7.1. Nach ungefähr 10 Min, wenn die zugegebene Glukose vollständig durch die Bakterienzellen aufgebraucht war, stieg der pH-Wert auf einen Wert höher als 7.1 ein, was anzeigte, dass weitere 4 ml des Zulaufmediums in den Fermentor hinzugefügt werden sollte. Der Hitzeschock wurde bei 5–6 h durchgeführt, wenn die Kulturdichte (OD 600 nm) zwischen 12.0 und 13.0 war. Während des Hitzeschocks wurde die Temperatur des Fermentors von 37 Grad C auf 50 Grad C erhöht und dann sofort auf 37 Grad C abgekühlt. Der vollständige Erhitzungs- und Abkühlungszyklus betrug ungefähr 0.5 h. Die Zellen wurden für die Abtrennung und Aufreinigung der Arginase bei 3 h und 6 h nach Hitzeschock geerntet. Der zuvor erwähnte Stamm produzierte aktive humane Arginase in einer Menge von mindestens ungefähr 162 mg pro L des Fermentationsmediums bei 6 h nach Hitzeschock. Der Zeitverlauf der Fermentation ist in 4B geplottet. Der Verlaufsplot dieser Zulaufsfermentation, der die Veränderungen der Parameterwerte wie Temperatur, Rührgeschwindigkeit, pH und gelöstem Sauerstoff zeigt, wird in 5B gezeigt.
Beispiel 2C: Zulaufsfermentation in einem 100 Liter Fermentor
Die Zulaufsfermentation wurde in einen größeren Maßstab in einen 100 L Fermentor überführt. Die Fermentation wurde bei 37 Grad C, pH 7.0 und 20% Luftsättigung mit gelöstem Sauerstoff durchgeführt. Ein 10% Inokulum wurde verwendet. Anfänglich war das Wachstumsmedium mit dem, das in der Batchfermentation in Beispiel 2A beschrieben wurde, identisch. Das Wachstumsmedium enthielt 300 g/L Glukose, 3.75 g/L MgSO4·7H₂O, 75 g/L Trypton, 11.25 g/L K₂HPO₄ und 5.625 g/L KH₂PO₄. Die Mediumzulaufrate wurde mit der ph-Stat-Kontrollstrategie kontrolliert, die der Zulaufsfermentation, die in Beispiel 26 beschrieben wurde, ähnlich war. Der Hitzeschock wurde bei ungefähr 7.5 h durchgeführt, wenn die Kulturdichte (OD_{600 nm}) zwischen 11.5 und 12.5 war. Während des Hitzeschocks wurde die Temperatur des Fermentors von 37 Grad C auf 50 Grad C erhöht, für 7 s auf 50 Grad C gehalten und dann sofort auf 37 Grad C abgekühlt. Der vollständige Erhitzungs- und Abkühlungszyklus betrug ungefähr 0.5 h. Die Zellen wurden für die Abtrennung und Aufreinigung der Arginase bei 2 h und 4 h nach Hitzeschock geerntet. Der zuvor erwähnte Stamm produzierte aktive humane Arginase in einer Menge von mindestens ungefähr 74 mg und 124 mg pro L des Fermentationsmediums bei 2 h bzw. 4 h nach Hitzeschock. Diese Daten zeigen, dass das Ernten der Zellen 4 h nach Hitzeschock eine höhere Arginaseausbeute lieferte als 2 h nach Hitzeschock in einem 100 L Fermentor.
Beispiel 3: Vergleich von Batch- und Zulaufsfermentation
Tabelle 1 unten vergleicht die Ergebnisse von Batch- und Zulaufsfermentation. Der Vergleich zeigt, dass die Zulaufsfermentation dem Batchbetrieb hinsichtlich Kultur OD, Arginaseausbeute und Produktivität überlegen war. Tabelle 1

Batchfermentation Zulaufsfermentation

Die OD zu Beginn des Hitzeschocks 3.9 12.8

Maximal erreichte OD 6.0 26.8

Arginaseausbeute (mg/L) 30 162

Arginaseproduktivität (mg/L-h) 2.5 13.5
Beispiel 4: Aufreinigung von Arginase 3 h nach Hitzeschock nach Zulaufsfermentation bei geringer Zelldichte
Zulaufsfermentation in einem 2 Liter Fermentor wurde wie in Beispiel 2B beschrieben durchgeführt. Die Zelldichte der Zulaufskultur wurde im 30 oder 60 min Intervall überwacht und die Temperatur der Kultur auf 50°C für den Hitzeschock 5.5 Stunden nach Starten der Fermentation erhöht, wenn die OD der Kultur 12.8 erreichte (siehe 4B und 5B).
Die Zellkultur (470 ml) gesammelt 3 h nach Hitzeschock wurde bei 5000 rpm für 20 min bei 4 Grad C zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Das Nassgewicht der Zellen war 15.1 g. Der flüssige Kulturüberstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde bei –80 Grad C aufbewahrt. Die Zellen sind bei dieser Temperatur für ein paar Tage stabil. Um intrazelluläre Proteine zu extrahieren, wurde das Zellpellet in 140 ml Solubilisierungspuffer resuspendiert [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 M NaCl, 5 mM MnSO₄, Lysozym (75 μg/ml)]. Nach Inkubation bei 30 Grad C für 15 min wurde die Mischung acht Mal, jedes Mal für 10 s (die Gesamtzeit war 80 s), in 2 min Intervallen mit dem Soniprer 150 Apparatus (MSE) Ultraschall ausgesetzt. Ungefähr 500 Einheiten Desoxyribonuclease I (Sigma D 4527) wurde zugegeben und die Mischung wurde bei 37 Grad C 10 min inkubiert, um die chromosomale DNA zu verdauen. Nach dem Zentrifugieren bei 10,000 rpm für 20 min bei 4 Grad C wurde der Überstand, der den rohen Proteinextrakt enthielt, auf das Vorliegen der Arginaseaktivität getestet und durch SDS-PAGE analysiert (Laemmli, 1970, Nature, 227, 680–685).
Eine 5 ml HiTrap Chelatierungssäule (Pharmazia) wurde mit 5 Säulenvolumen 0.1 M NiCl₂ in dH₂O äquilibriert. Der rohe Proteinextrakt (140 ml) wurde auf die Säule geladen. Elution wurde mit einem linearen Gradienten (0–100%) bei einer Flussrate von 5 ml/min für 15 Säulenvolumen unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Puffer A = Startpuffer [0.02 M Natriumphosphatpuffer (pH 7.4), 0.5 M NaCl]; Puffer B = Startpuffer enthaltend 0.5 M Imidazol. Das Elutionsprofil wird in 6A gezeigt und das Proteingel wird in 6B gezeigt. Fraktionen 13–20 wurden gepoolt (16 ml) und zehn Mal mit Startpuffer verdünnt [0.02 M Natriumphosphatpuffer (pH 7.4), 0.5 M NaCl]. Dieses wurde auf eine zweite 5 ml HiTrap Chelatierungssäule (Pharmazia) geladen, wodurch die gleiche Prozedur wie oben wiederholt wurde. Das Elutionsprofil wird in 7A gezeigt und das Proteingel wird in 7B gezeigt. Fraktionen 12–30 enthaltend Arginase wurden gepoolt (38 ml) und das Salz wurde mit einer 50 ml HiPrep 26/10 Entsalzungssäule (Pharmacia) unter den folgenden Bedingungen entfernt: Flussrate = 10 ml/min, Puffer = 10 ml Tris-HCl (pH 7.4) und Länge der Elution = 1.5 Säulenvolumen. Die Proteinkonzentration wurde durch das Bradfordverfahren gemessen (Bradford, M. M., 1976, Anal. Biochem., 72, 248–254). Eine Gesamtheit von 56.32 mg Arginase wurde aus einer 470 ml Zellkultur aufgereinigt. Die Ausbeute an gereinigter Arginase wurde auf 119.8 mg/l Zellkultur oder 3.73 mg/g Nasszellgewicht geschätzt.
Beispiel 5: Aufreinigung von Arginase bei 6 h nach Hitzeschock nach Zulaufsfermentation bei geringer Zelldichte
Zulaufsfermentation in einem 2 Liter Fermentor wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt. Die Zellkultur (650 ml) gesammelt 6 h nach Hitzeschock bei OD 12.8 wurde bei 5000 rpm für 20 min bei 4 Grad C zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Das Nassgewicht der Zellen war 24 g. Der flüssige Kulturüberstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde bei –80 Grad C aufbewahrt. Die Zellen sind bei dieser Temperatur für ein paar Tage stabil. Um intrazelluläre Proteine zu extrahieren, wurde das Zellpellet in 140 ml Solubilisierungspuffer resuspendiert [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 M NaCl, 5 mM MnSO₄, Lysozym (75 μg/ml)]. Nach Inkubation bei 30 Grad C für 15 min wurde die Mischung acht Mal, jedes Mal für 10 s (die Gesamtzeit war 80 s), in 2 min Intervallen mit dem Soniprep 150 Apparatus (MSE) Ultraschall ausgesetzt. Ungefähr 500 Einheiten Desoxyribonuclease 1 (Sigma D 4527) wurden zugegeben und die Mischung wurde bei 37 Grad C 10 min inkubiert, um die chromosomale DNA zu verdauen. Nach dem Zentrifugieren bei 10,000 rpm für 20 min bei 4 Grad C wurde der Überstand, der den rohen Proteinextrakt enthielt, auf das Vorliegen der Arginaseaktivität getestet und durch SDS-PAGE analysiert (Laemmli, 1970, Nature, 227, 680–685).
Eine 5 ml HiTrap Chelatierungssäule (Pharmazia) wurde mit 5 Säulenvolumen 0.1 M NiCl₂ in dH₂O äquilibriert. Der rohe Proteinextrakt (140 ml) wurde auf die Säule geladen. Elution wurde mit einem linearen Gradienten (0–100%) bei einer Flussrate von 5 ml/min für 15 Säulenvolumen unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Puffer A = Startpuffer [0.02 M Natriumphosphatpuffer (pH 7.4), 0.5 M NaCl]; Puffer B = Startpuffer enthaltend 0.5 M Imidazol. Das Elutionsprofil wird in 8A gezeigt und das Proteingel wird in 8B gezeigt. Fraktionen 13–24 wurden gepoolt (24 ml) und zehn Mal mit Startpuffer verdünnt [0.02 M Natriumphosphatpuffer (pH 7.4), 0.5 M NaCl]. Dieses wurde auf eine zweite 5 ml HiTrap Chelatierungssäule (Pharmazia) geladen, wodurch die gleiche Prozedur wie oben wiederholt wurde. Das Elutionsprofil wird in 9A gezeigt und das Proteingel wird in 9B gezeigt. Fraktionen 12–24 enthaltend Arginase wurden gepoolt (26 ml) und das Salz wurde mit einer 50 ml HiPrep 26/10 Entsalzungssäule (Pharmacia) unter den folgenden Bedingungen entfernt: Flussrate = 10 ml/min, Puffer = 10 ml Tris-HCl (pH 7.4) und Länge der Elution = 1.5 Säulenvolumen. Die Proteinkonzentration wurde durch das Bradfordverfahren gemessen (Bradford, M. M., 1976, Anal. Biochem., 72, 248–254). Eine Gesamtheit von 85.73 mg Arginase wurde aus einer 650 ml Zellkultur aufgereinigt. Die Ausbeute an gereinigter Arginase wurde auf 132 mg/l Zellkultur oder 3.57 mg/g Nasszellgewicht geschätzt.
Beispiel 6: Aufreinigung von Arginase bei 6 h nach Hitzeschock bei höherer Zelldichte
In dieser besonderen Zulaufsfermentation war der Prozess ähnlich dem aus dem obigen Beispiel, außer dass der Hitzeschock bei 8 h durchgeführt wurde, wenn die Kulturdichte (OD_{600 nm}) ungefähr 25 war. Während des Hitzeschocks wurde die Temperatur des Fermentors von 37 Grad C auf 50 Grad C erhöht und dann sofort auf 37 Grad C abgekühlt.
Der vollständige Erwärmungs- und Abkühlungszyklus betrug ungefähr 0.5 h. Ein Teil der Zellkultur (760 ml) wurde zur Abtrennung und Aufreinigung der Arginase 6 h nach Hitzeschock geerntet. Der Zeitverlauf des Bakterienzellwachstums in dieser Fermentation ist in 10 geplottet. Der Verlaufsplot dieser Zulauffermentation, der die Veränderungen der Parameterwerte wie Temperatur, Rührgeschwindigkeit, pH und Werte von gelöstem Sauerstoff zeigt, ist in 11 dargestellt.
Die Zellkultur (760 ml) gesammelt 6 h nach Hitzeschock wurde bei 5000 rpm für 20 min bei 4 Grad C zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Das Nassgewicht der Zellen war 32 g. Der flüssige Kulturüberstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde bei –80 Grad C aufbewahrt. Die Zellen sind bei dieser Temperatur für ein paar Tage stabil. Um intrazelluläre Proteine zu extrahieren, wurde das Zellpellet in 280 ml Solubilisierungspuffer resuspendiert [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 M NaCl, 5 mM MnSO₄, Lysozym (75 μg/ml)]. Nach Inkubation bei 30 Grad C für 15 min wurde die Mischung acht Mal, jedes Mal für 10 s (die Gesamtzeit war 80 s), in 2 min Intervallen mit dem Soniprep 150 Apparatus (MSE) Ultraschall ausgesetzt. Ungefähr 500 Einheiten Desoxyribonuclease I (Sigma D 4527) wurde zugegeben und die Mischung wurde bei 37 Grad C 10 min inkubiert, um die chromosomale DNA zu verdauen. Nach dem Zentrifugieren bei 10,000 rpm für 20 min bei 4 Grad C wurde der Überstand, der den rohen Proteinextrakt enthielt, auf das Vorliegen der Arginaseaktivität getestet und durch SDS-PAGE analysiert (Laemmli, 1970, Nature, 227, 680–685).
Eine 5 ml HiTrap Chelatierungssäule (Pharmazia) wurde mit 5 Säulenvolumen 0.1 M NiCl₂ in dH₂O äquilibriert. Der rohe Proteinextrakt (280 ml) wurde auf die Säule geladen. Elution wurde mit einem linearen Gradienten (0–100%) bei einer Flussrate von 5 ml/min für 15 Säulenvolumen unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Puffer A = Startpuffer [0.02 M Natriumphosphatpuffer (pH 7.4), 0.5 M NaCl]; Puffer B = Startpuffer enthaltend 0.5 M Imidazol. Das Elutionsprofil wird in 12A gezeigt und das Proteingel wird in 12B gezeigt. Fraktionen 17–31 wurden gepoolt (30 ml) und zehn Mal mit Startpuffer verdünnt [0.02 M Natriumphosphatpuffer (pH 7.4), 0.5 M NaCl]. Dieses wurde auf eine zweite 5 ml HiTrap Chelatierungssäule (Pharmazia) geladen, wodurch die gleiche Prozedur wie oben wiederholt wurde. Das Elutionsprofil wird in 13A und das Proteingel in 13B gezeigt. Fraktionen 10–20, die Arginase enthalten, wurden gepoolt (22 ml) und das Salz wurde mit einer 50 ml HiPrep 26/10 Entsalzungssäule (Pharmacia) unter den folgenden Bedingungen entfernt: Flussrate = 10 ml/min, Puffer = 10 ml Tris-HCl (pH 7.4) und Länge der Elution = 1.5 Säulenvolumen. Die Probe wurde dann auf eine 1 ml HiTrap SP FF Säule (Pharmacia) geladen. Elution wurde mit den folgenden Bedingungen durchgeführt: Flussrate = 1 ml/min, Puffer A = 10 mM Tris-HCl (pH 7.4), Puffer B = 10 mM Tris-HCl (pH 7.4) enthaltend 1 M NaCl, linearer Gradient (0–100%), Länge der Elution = 30 Säulenvolumen. Das Elutionsprofil wird in 14A gezeigt und das Proteingel wird in 14B gezeigt. Fraktionen A12-B7 wurden gepoolt (7 ml) und zehn Mal mit Startpuffer verdünnt [0.02 M Natriumphosphatpuffer (pH 7.4), 0.5 M NaCl]. Dieses wurde auf eine zweite 5 ml HiTrap Chelatierungssäule (Pharmazia) geladen, wodurch die gleiche Prozedur wie oben wiederholt wurde, abgesehen davon, dass die Elution mit einem segmentierten Gradienten durchgeführt wurde. Das Elutionsprofil wird in 15A gezeigt und das Proteingel wird in 15B gezeigt. Fraktionen A7-B12 wurden gepoolt (7 ml) und wie oben mit einer 50 ml HiPrep 26/10 Entsalzungssäule (Pharmacia) entsalzt. Die Proteinkonzentration wurde durch das Bradford-Verfahren gemessen (Bradford, M. M., 1976, Anal. Biochem., 72, 248–254). Eine Gesamtheit von 41.61 mg Arginase wurde aus einer 760 ml Zellkultur aufgereinigt. Die Ausbeute an gereinigter Arginase wurde auf 55.5 mg/l Zellkultur oder 1.3 mg/g Nasszellgewicht geschätzt.
Beispiel 7: Vergleich der Ausbeute an Arginase, die unter verschiedenen Bedingungen geerntet und aufgereinigt wurde
Tabelle 2 unten vergleicht die Ausbeute an Arginase, die unter verschiedenen Ernte- und Aufreinigungsbedingungen hergestellt wurde. Diese Daten zeigen, dass das Ernten der Zellen 6 Stunden nach Hitzeschock bei einer geringeren Zelldichte von 12.8 eine höhere Arginaseausbeute von 132 mg/L nach Aufreinigung lieferte. Tabelle 2

Zulauffermentation Arginaseausbeute (mg/L)

Geerntet 3 h nach Hitzeschock Geerntet 6 h nach Hitzeschock

Hitzeschock bei OD 12.8 120 132

Hitzeschock bei OD 25 - 55.5
Beispiel 8A: Herstellung des pegylierten Enzyms mit Zyanurchlorid (CC) aktiviertem Methoxypolyethylenglykol
50 mg Arginase wurde in 20 ml PBS Pufferlösung (pH 7.4) auf eine Endkonzentration von 2.5 mg/ml aufgelöst. Hitzeaktivierung von Arginase wurde bei 60°C für 10 Minuten durchgeführt. Nach der Aktivierung wurde es der Temperatur des Enzyms ermöglicht, auf Raumtemperatur zurückzufallen. 1 g Zyanurchlorid aktiviertes Methoxypolyethylen-Glykol (mPEG-CC) (MW = 5000, Sigma) wurde in einem molaren Verhältnis von 1:140 (Arginase:PEG) hinzugefügt. Ein magnetischer Rührstab wurde verwendet, um die Mischung zu rühren, bis das gesamte Polyethylenglykol (PEG) aufgelöst war.
Wenn das gesamte PEG aufgelöst war, wurde der pH der PEG-Arginase-Mischung auf 9.0 mit 0.1 N NaOH angepasst, der pH wurde im Weiteren bei 9.0 für die nächsten 30 Minuten unter weiteren Zugaben mit NaOH gehalten. Die Pegylierung wurde gestoppt, indem der pH zurück auf 7.2 unter Zugabe von 0.1 N HCl angepasst wurde.
Die pegylierte Arginase wurde gegen 2–3 Liter PBS Pufferlösung, pH 7.4 bei 4°C, unter Verwendung eines Hemoflow F40S Kapillardialysegeräts (Fresenius Medical Care, Deutschland) dialysiert, um überschüssiges PEG zu entfernen. Nach der Dialyse wurde pegylierte Arginase gewonnen und die Endkonzentration wurde angepasst.
Die pegylierte Arginase wurde durch einen 0.2 μm Filter in einen sterilisierten Behälter gefiltert und bei 4°C aufbewahrt. Die in einem Humanpatienten getestete Halbwertszeit dieses Enzyms betrug ungefähr 6 Stunden (siehe 21).
Beispiel 86: Zubereitung von Arginase, die in B. subtilis exprimiert wurde, und unter Verwendung von entweder CC oder SPA bei einem geringeren PEG-Verhältnis
Die Pegylierung wurde zuerst durch Davis, Abuchowski und Kolllegen (Davis, F. F. et al., 1978, Enzyme Eng. 4, 169–173) in den 1970 ern entwickelt. Gegenüber dem Modifizieren der Formulierung eines Wirkstoffs stellt die chemischen Anbringung von Poly(ethylenglyklol) PEG-Einheiten an therapeutische Proteine (ein als „Pegylierung" bekannter Prozess) einen neuen Ansatz dar, der wichtige Wirkstoffeigenschaften verstärken kann (Harris, J. M. et al., 2001, Clin. Pharmacokinet. 40, 539–551).
1979 haben Savoca et al. Methoxypolyethylen-Glykol (mPEG) von 5,000 Dalton kovalent an bovine Leberarginase unter Verwendung von 2,4,6-Trichloro-s-triazin (Zyanurchlorid) als dem Kopplungsagenz gebunden (Savoca, K. V et al., 1979, Biochimica et Biophysica Acta 578, 47–53). Das Konjugat (PEG-Arginase) behielt nur 65% seiner ursprünglichen enzymatischen Aktivität bei. Sie berichteten, dass die Verweildauer im Blutkreislauf von PEG-Arginase in Mäusen über die von boviner Arginase verlängert wurde. Die Halbwertszeit von injizierter boviner Arginase war niedriger als 1 h, wobei die des PEG-Enzyms 12 h war. Ihre Daten zeigten auch, dass bovine mit PEG modifizierte Arginase weder immunogen noch antigen geworden war, wenn sie in Mäusen getestet wurde.
Rekombinante humane Arginase (1.068 mg) wurde in 125 mM Boratpufferlösung (pH 8.3) auf Eis oder bei Raumtemperatur aufgelöst. Aktiviertes mPEG, das Succinimid von mPEG-Propionsäure (mPEG-SPA; MW 5,000; Shearwater Corporation) oder mPEG aktiviert mit Zyanurchlorid (mPEG-CC; MW 5,000; Sigma) wurde zu der Lösung bei molaren Verhältnissen von Arginase:PEG von 1:50 oder 1:20 hinzugegeben. Dies wurde in zwei Stufen durchgeführt. In der ersten Stufe wurde die Hälfte des PEG in die Arginaselösung schrittweise hinzugegeben und für 30 min vorsichtig auf Eis gemischt, um zu verhindern, dass der pH den empfohlenen Bereich von 8.0–8.5 verlässt. Die andere Hälfte des PEG wurde zu dieser Lösung hinzugegeben und weiter vorsichtig für 0.5–23 h gemischt. Die Mischung wurde dann gegen dH₂O dialysiert, wobei dH₂O mindestens 3 Mal bei 4 Grad C unter Verwendung eine Dialysemembran mit einem Ausschlusswert von unter 10,000 gewechselt wurde. Sowohl mPEG-SPA als auch mPEG-CC verwenden die Aminogruppen der Lysine und den N-Terminus des Proteins als Modifikationsstellen.
Wenn Arginase auf Eis oder bei Raumtemperatur mit mPEG-SPA (MW 5,000) mit einem molaren Verhältnis von Arginase:PEG von 1:50 modifiziert wurde, waren die meisten der Enzymmoleküle nach 1 h Reaktion modifiziert (16). Die Probe erschien auch nach 23 h Reaktion gleich zu bleiben. Arginasemoleküle waren in verschiedenen Mengen mit PEG-Molekülen gebunden und erzeugten Moleküle mit verschiedenen Molekulargewichten. Wie erwartet wurde, wenn ein niedrigeres molares Verhältnis von 1:20 für die Pegylierungsreaktion verwendet wurde, wurde ein höherer Anteil der Arginase in der nicht pegylierten Form vorgefunden (17). Jedoch schien bei beiden verwendeten molaren Verhältnissen von Arginase:PEG eine längere Reaktionszeit und die Verwendung von Raumtemperatur statt Eis keine Effekt auf das Ausmaß der Pegylierung zu besitzen. Bei mPEG-SPA (MW 5,000), einem molaren Verhältnis von 1:50 und 1 h Reaktion behielt die Arginase 72–76% der ursprünglichen enzymatischen Aktivität bei (siehe Tabelle 3 unten), was höher ist als diejenige, die für bovine Arginase berichtet wurde (65%; Savoca, K. V. et al., 1979, Biochimica et Biophysica Acta 578, 47–53).
Wenn Arginase auf Eis mit mPEG-CC (MW 5,000) unter Verwendung eines molaren Verhältnisses von Arginase:PEG von 1:50 modifiziert wurde, war die Reaktion ziemlich langsam und es dauerte 23 h, um die Pegylierung zu vervollständigen (18A). Darüber hinaus wurde die Mehrzahl der Enzymmoleküle in eine enge Bandbreite von sehr hohen Molekulargewichten umgewandelt. Die Reaktion war wesentlich langsamer, wenn ein niedrigeres molares Verhältnis von 1:20 verwendet wurde, wie in 18A gezeigt ist.
Beispiel 8C: Zubereitung von hoch aktiver pegylierter Arginase
Zulauffermentation in einem 15 L Braun Biostat C rostfreiem Stahlfermentor wurde wie in Beispiel 4 beschrieben durchgeführt.
Die Zellkultur (8.4 L) gesammelt 4.5 h nach Hitzeschock bei OD 12.13 wurde bei 5000 rpm für 20 min bei 4 Grad C zentrifugiert, um die Zellen zu pelletieren. Der flüssige Kulturüberstand wurde verworfen und das Zellpellet wurde bei –80 Grad C aufbewahrt. Die Zellen sind bei dieser Temperatur für ein paar Tage stabil. Um intrazelluläre Proteine zu extrahieren, wurde das Zellpellet in 1250 ml ml Solubilisierungspuffer resuspendiert [50 mM Tris-HCl (pH 7.4), 0.1 M NaCl, 5 mM MnSO₄, Lysozym (75 μg/ml)]. Nach Inkubation bei 30 Grad C für 20 min wurde die Mischung in 300 ml Portionen in Bechergläsern aufgeteilt, und jede Portion wurde 12 Mal, jedes Mal für 10 s (die Gesamtzeit war 80 s), in 2 min Intervallen mit dem Soniprep 150 Apparatus (MSE) Ultraschall ausgesetzt. Ungefähr 5000 Einheiten Desoxyribonuclease I (Sigma D 4527) wurden zugegeben und die Mischung wurde bei 37 Grad C 15 min inkubiert, um die chromosomale DNA zu verdauen. Nach zweifachem Zentrifugieren, jeweils bei 9,000 rpm für 30 min bei 4 Grad C wurde der Überstand, der den rohen Proteinextrakt enthielt, auf das Vorliegen der Arginaseaktivität getestet und durch SDS-PAGE analysiert (Laemmli, 1970, Nature, 227, 680–685).
Der Rohproteinextrakt (1195 ml) wurde gefiltert und in 2 Portionen geteilt, von denen jede 597.5 ml enthielt. Jede Portion wurde dann auf eine 130-ml Ni-NTA Superflow (Qiagen) Säule (Pharmacia) geladen. Elution wurde mit einem linearen Gradienten (0–100%) bei einer Flussrate von 5 ml/min unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: Puffer A = Startpuffer [0.02 M Natriumphosphatpuffer (pH 7.4), 0.5 M NaCl]; Puffer B = Startpuffer enthaltend 0.5 M Imidazol. Fraktionen, die reine Arginase enthielten, wurden gepoolt und der Puffer bei 35 ml/min bei 4 Grad C gegen PBS Puffer, pH 7.4 mit dem Pellicon XL Gerät (Polyether-Sulphon Membran, Ausschlussgröße 8 kDa) und dem tangentialen Flussfiltrationssystem im Labormaßstab (Millipore) ausgetauscht. Die Proteinkonzentration wurde durch das Bradfordverfahren gemessen (Bradford, M. M., 1976, Anal. Biochem., 72, 248–254). Eine Gesamtheit von 788 mg Arginase wurde aus einer 8.4 I Zellkultur aufgereinigt. Die Ausbeute an gereinigter Arginase wurde auf 94 mg/l Zellkultur geschätzt. Die gemessene spezifische Aktivität war 518 I. U./mg hoch.

Pegylierte Arginase mit hoher spezifischer Aktivität wurde in PBS Puffer hergestellt. Die gereinigte Arginase (spezifische Aktivität = 518 I. U./mg) war vor Durchführen der Pegylierung in PBS Puffer. Die mPEG-SPA, MW 5,000 (5.82 g) wurde zu 555 ml gereinigter Arginaselösung (813.64 mg, 1.466 mg/ml) langsam in einem 1 L Becherglas hinzugegeben und dann für 2 h 40 min bei Raumtemperatur gerührt (molares Verhältnis von Arginase:mPEG-SPA = 1:50). Die Mischung wurde dann intensiv durch Ultra-Dialyse gegen 15 L PBS Puffer mit dem F50(S) Kapillardialysegerät (Fresenius Medical Care) dialysiert, um alles nicht aufgenommene PEG zu entfernen. Die mPEG-SPA verwendet Lysine und den N-Terminus des Proteins als Modifikationsstelle. Die gemessene spezifische Aktivität der pegylierten Arginase war 592 I. U./mg hoch. Die Ergebnisse aus der SDS-PAGE Analyse der nativen und pegylierten Arginase werden in 18B gezeigt. Die pegylierte Arginase erwies sich in Bezug auf Arginaseaktivität und Proteinkonzentration als hoch stabil, wenn sie in PBS Puffer bei 1 mg/ml für mindestens 3 Wochen bei Raumtemperatur aufbewahrt wird. Wenn sie in PBS Puffer bei 4 Grad C bei 1 mg/ml aufbewahrt wurde, war sie für mindestens 6 Monate ohne Abnahme der spezifischen Aktivität stabil. Tabelle 3. Aktivität (%) von Arginase, wenn sie mit verschiedenen aktivierten PEG bei verschiedenen molaren Verhältnissen und Temperaturen pegyliert wurde

für die Pegylierungsreaktion ermöglichte Zeit (h)	Aktivität (%) von Arginase (bei Raumtemperatur bei einem Arginase: mPEG-SPA Verhältnis von 1:20 pegyliert)	Aktivität (%) von Arginase (auf Eis bei einem Arginase : mPEG-SPA Verhältni s von 1:20 pegyliert)	Aktivität (%) von Arginase (bei Raumtemperatur bei einem Arginase: mPEG-SPA Verhältnis von 1:50 pegyliert)	Aktivität (%) von Arginase (auf Eis bei einem Arginase: mPEG-SPA Verhältnis von 1:50 pegyliert)	Aktivität (%) von Arginase (auf Eis bei einem Arginase: mPEG-CC Verhältnis von 1:20 pegyliert)	Aktivität (%) von Arginase (auf Eis bei einem Arginase: mPEG-CC Verhältnis von 1:50 pegyliert)
0	100	100	100	100	100	100
1	83	76	76	72	ND	ND
2	79	76	72	68	68	64
5	83	74	74	72	65	65
23	75	72	72	64	66	66
ND: nicht bestimmt. 100% Aktivität von Arginase ist äquivalent zu 336 I. U./mg

Beispiel 9A: Halbwertszeitbestimmung in vivo von aus Beispiel 8A erhaltener Arginase
Die pegylierte Arginase wurde in einen Patienten injiziert. Eine 3 ml Blutprobe wurde in EDTA vom Patienten täglich entnommen. Das Röhrchen wurde auf 4°C auf schmelzendem Eis vorgekühlt, um enzymatische Reaktionen ex vivo zu vermeiden. Das Blut wurde dann sofort bei 14000 rpm für 2 Minuten herunterzentrifugiert, um rote Blutzellen zu entfernen. 1.5 ml Überstand (Plasma) wurden herauspipettiert und in ein neues Eppendorfröhrchen transferiert. Das Plasma wurde dann bei 37°C für 30 Minuten inkubiert. Nach dem Inkubieren wurde Arginin als ein Substrat in einer Konzentration von 100 μM hinzugegeben. Die Enzymreaktion wurde bei 37°C für 0, 10, 30, 60 Minuten durchgeführt. Zu jedem Zeitintervall wurde die Reaktion gestoppt, indem 300 μl Reaktionsprobe in ein neues Eppendorfröhrchen enthaltend 300 μl 10% Trichloressigsäure überführt wurde. Proben wurden entnommen und bei Maximalgeschwindigkeit (14000 rpm) für 10 Minuten zentrifugiert. Der Überstand wurde heraus- pipettiert und mit einem 0.45 μm Filter filtriert. Zum Schluss wurden die Proben der verschiedenen Zeitintervalle mit einem Aminosäureanalysegerät (Hitachi, 18800) analysiert. Die Ergebnisse sind in 21 gezeigt.
Zwei Chargen von pegylierter Arginase wurden, wie in Beispiel 8A beschrieben, während der Studien hergestellt. Die erste Charge von pegylierter Arginase wurde mit einem molaren Verhältnis von Arginase:PEG von 1:140 hergestellt. Die zweite Charge von pegylierter Arginase wurde mit einem molaren Verhältnis von Arginase:PEG von 1:70 hergestellt. Das Pegylierungsprotokoll und die Bedingungen, die für die Herstellung der zwei Chargen verwendet wurden, waren identisch (siehe Beispiel 8A).
Zum Zeitpunkt Null wurden 50 mg der ersten Charge von pegylierter Arginase infundiert. Nach 12 Stunden wurden weitere 50 mg der ersten Charge von pegylierter Arginase infundiert. Die dritte Arginaseinfusion wurde zum Zeitpunkt 24 vorgenommen, während dem weitere 50 mg der ersten Charge von pegylierter Arginase verwendet wurden.
Von Zeitpunkt 26 bis Zeitpunkt 72 wurde kontinuierliche Infusion der ersten Charge von pegylierter Arginase (100 mg/Tag) statt intermittierender Infusion (50 mg/Dosis) durchgeführt. Von Zeitpunkt 72 bis Zeitpunkt 144 wurde kontinuierliche Infusion der zweiten Charge von pegylierter Arginase bei einer Rate von 100 mg/Tag durchgeführt. Die kontinuierliche Arginaseinfusion wurde zum Zeitpunkt 144 gestoppt und die Messung der Halbwertszeit begann an diesem Punkt. Die Ergebnisse der Halbwertszeitbestimmung sind in 22 gezeigt. Die Nullstelle in 22 entspricht dem Zeitpunkt 144 in 21.
Die Ergebnisse legten nahe, dass die Halbwertszeit der Aktivität der Arginase in zwei Phasen eingeteilt werden konnte. Die erste Halbwertszeit des pegylierten Enzyms war ungefähr 6 Stunden. Es dauerte ungefähr 6 Stunden, um die relative Aktivität von 100% auf 50% zu vermindern (siehe 22). Jedoch betrug die zweite Halbwertszeit ungefähr 21 Tage. Es dauerte ungefähr 21 Tage, um die relative Aktivität von 50% auf 25% zu vermindern. Die zwei Halbwertszeiteffekte können auf eine Anzahl von Faktoren zurückzuführen sein, was die Verwendung einer höheren Menge von mPEG-CC in der Pegylierung und das spezifische verwendete Infusionsprotokoll einschließt.
Beispiel 96: Halbwertszeitbestimmung von pegylierter Arginase in vitro unter Verwendung des Verfahrens in humanem Blutplasma
Gereinigte Arginase (1 mg) wurde in 1 ml 125 mM Boratpufferlösung (pH 8.3) auf Eis gelöst. Aktiviertes PEG (mPEG-SPA, MW 5,000) (7.14 mg) wurde in die Proteinlösung langsam bei einem molaren Verhältnis von Arginase: PEG = 1:50 hinzugegeben. Die Mischung wurde auf Eis für 2.5 h entsprechend dem in Beispiel 8B beschriebenen Verfahren gerührt.
Pegylierte Arginase (305.6 μl) mit einer Konzentration von 1 mg/ml wurde in das humane Plasma (1 ml) hinzugegeben und die Endkonzentration der pegylierten Arginase war 0.24 mg/ml. Die Mischung wurde in 20 Aliquots in Eppendorfröhrchen (65 μl Mischung in jedem Eppendorfröhrchen) aufgeteilt und dann bei 37°C inkubiert. Eine 1–2 μl Portion der Mischung aus jedem Eppendorfröhrchen wurde verwendet, um die Arginaseaktivität zu testen. Die Ergebnisse sind in 20 gezeigt. Die ermittelte Halbwertszeit betrug ungefähr 3 Tage. Es dauerte ungefähr 3 Tage, um die relative Aktivität von 100% auf 50% zu reduzieren. Diese wird mit der Kurve in 20 bestimmt.
Beispiel 10: Charakterisierung von B. subtilis exprimierter humaner Arginase und pegylierter und isolierter gereinigter rekombinanter humaner Arginase
(a) Messung der Reinheit von Arginase durch SDS-PAGE und „Lumi-imaging"
Aufgereinigte E. coli exprimierte Arginase, die durch die Verfahren erhalten wurde, die durch Ikemoto et al. (Ikemoto et al., 1990, Biochem. J. 270, 697–703 Verfahren beschrieben wurden, wurde mit gereinigter B. subtilis exprimierter rekombinanter Arginase, die durch die Verfahren erhalten wurde, die in der vorliegenden Erfindung beschrieben wurden, verglichen (19A und 19B). Eine Analyse der Dichten der Gesamtproteinbanden, die in 19A gezeigt sind, durch das Lumianalyst 32 Programm von Lumi-imager^TM (Roche Molecular Biochemicals) ließ erkennen, dass das in der vorliegenden Erfindung entwickelte Verfahren eine Arginase herstellte, die zu mehr als 99.9% rein ist (19B). Jedoch kann ein Arginase, die zwischen 80–100% rein ist, auch als der aktive Inhaltsstoff dienen, um eine pharmazeutische Zusammensetzung herzustellen. In der bevorzugten Ausführungsform wird rekombinante Arginase mit 80–100% Reinheit verwendet. In einer noch bevorzugteren Ausführungsform ist die rekombinante Arginase gemäß der vorliegenden Erfindung laut SDS-PAGE gefolgt von „Lumi-imaging" zu 90–100% rein.
(b) Messung der spezifischen Aktivität durch gekoppelte Reaktionen
Die Rate der Freisetzung von Harnstoff aus L-Arginin durch Arginase wurde in einem System beobachtet, das Urease, L-glutamate Dehydrogenase und NADPH enthielt (Ozer, N., 1985, Biochem. Med. 33, 367–371). Um die Hauptmischung herzustellen, wurden 0.605 g Tris, 0.0731 g α-Ketoglutarat und 0.4355 g Arginin in 40 ml dH₂O gelöst. Der pH wurde auf 8.5 mit 1 M HCl eingestellt und dann wurden 0.067 g Uresse zu der Mischung hinzugegeben. Der pH wurde weiter auf 8.3 mit HCl eingestellt, bevor 0.0335 g Glutamat-Dehydrogenase und 0.0125 g NADPH hinzugefügt wurden. Das Endvolumen wurde auf 50 ml mit dH2O eingestellt, um die Hauptmischung zu bilden. Die Hauptmischung (1 ml) wurde in eine Quartzküvette pipettiert. Zur Messung der Arginaseaktivität wurden 1–5 μg Arginase hinzugefügt und die Abnahme der Absorption bei 340 nm (A340) folgte für 1–3 min bei 30 Grad C. Eine I. U. Arginase wurde definiert als die Menge von Enzym, die 1 μmol Harnstoff für 1 min unter den vorgegebenen Bedingungen freisetzte. Die spezifische Aktivität der gereinigten rekombinanten humanen Arginase der vorliegenden Erfindung wurde auf 518 I. U./mg errechnet, was signifikant höher war als die Werte, die für gereinigte humane Erythozyten-Arginase (204 I. U./mg Protein; Ikemoto et al., 1989, Ann. Clin. Biochem. 26, 547–553) und die E. coli exprimierte isolierte und gereinigte rekombinante humane Arginase berichtet wurden (389 I. U./mg Protein; Ikemoto et al., 1990, Biochem. J. 270, 697–703).
Mit mPEG-SPA (MW 5,000), einem molaren Verhältnis von 1:50 und 2 h 40 min Reaktion behielt die pegylierte Arginase 114% ihrer ursprünglichen enzymatischen Aktivität bei (siehe Beispiel 8C). Das bedeutet, dass die spezifische Aktivität der pegylierten humanen Arginase 592 I. U./mg war.
Mit mPEG-CC (MW 5,000) behielt die pegylierte humane Arginase 64–68% ihrer ursprünglichen enzymatischen Aktivität bei (Tabelle 3), ähnlich der pegylierten bovinen Arginase (Savoca, K. V. et al., 1979, Biochimica et Biophysica Acta 578, 47–53,).
(c) Strukturelle Charakterisierung der nativen Arginase durch Elektrospray LC/MS
Die B. subtilis exprimierte und gereinigte rekombinante humane Arginase enthält gemäß der Aminosäuresequenz, die in 2B gezeigt wird, 329 Aminosäurereste bei einem theoretischen Molekulargewicht von 35,647.7 Da. Es wurde gefunden, dass gleichzeitige HPLC/UV und Massenspektralanalyse der nativen Arginase ein Molekulargewicht von 35,634 Da bereitstellte. Es wurde gefunden, dass das beobachtete Molekulargewicht für die native Arginase gut dem theoretischem Molekulargewicht von 35,647.7 entsprach, das aus der erwarteten Aminosäuresequenz einer 6×His-getaggten humanen Arginase abgeleitet wurde (2B). Es wurde gefunden, dass die Reinheit 98% durch HPLC/UV basierend auf LC/MS war und 100% durch LC/MS basierend auf HPLC/UV Detektion bei 215 nm relativer Antwort war.
(d) Strukturelle Charakterisierung der nativen Arginase und der pegylierten Arginase durch Gelfiltrationschromatograhpie.
Nach Untersuchung durch Gelfiltrationschromatographie auf einer HiLoad 16/60 Superdex Gelfiltrationssäule (Pharmacia) bei einer Proteinkonzentration von ungefähr 2.8 mg/ml in PBS Puffer betrug das Molekulargewicht der nativen Arginase ungefähr 78 kDa und das der pegylierten Arginase (in Beispiel 8C hergestellt) ungefähr 688 kDa. Da das Molekulargewicht der monomeren Arginase ungefähr 36 kDa ist, legten die Ergebnisse nahe, dass die native Arginase als ein Dimer in PBS Buffer vorliegt.
(e) Studien zur Sekundärstruktur
Zirkulardichroismus (CD) wurde verwendet, um die Sekundärstrukturen der gereinigten Arginasen in einem JASCO Modell J810 CD Spektrometer zu analysieren. Es wurde festgestellt, das bei gleichen Proteinkonzentrationen in 10 mM Kaliumphosphatpuffer (pH 7.4) das CD Spektrum der nativen Arginase dem der pegylierten Arginase (in Beispiel 8C hergestellt) sehr ähnlich war, wenn das Spektrum im Bereich von 195 nm bis 240 nm aufgenommen wurde, was andeutet, dass die native Form und die pegylierte Form von Arginase fast identische sekundäre Strukturen besitzen.
(f) Bestimmung des pl Punktes
Es wurde mit einer Bio-Rad Model 111 Mini IEF Zelle gefunden, dass der isoelektrische Punkt (pl) der nativen Arginase (in Beispiel 8C hergestellt) 9.0 war, was konsistent ist mit dem in der Literatur veröffentlichten Wert von 9.1 (Christopher und Wayne, 1996, Comp. Biochem. Physiol. 1146, 107–132).
(g) Funktionale Charakterisierung und Bestimmung der kinetischen Eigenschaften
Unter Verwendung des von Ikemoto et al. (1990, Biochem. J. 270, 697–703) berichteten Verfahrens zum Messen von Arginaseaktivitäten ergab die native Arginase einen Km von 1.9 ± 0.7 mM, eine V_max of 518 μmol Harnstoff min^–1 mM^–1, einen of 2.0 ± 0.5 s^–1 und einen k_cat/K_m of 1.3 + 0.4 mM^–1 s^–1. Es wurde gefunden, dass der K_m Wert der gereinigten nativen Arginase dem veröffentlichten Wert (2.6 mM) der humanen Leberarginase in der Literatur ähnlich war (Carvajal, N. et al., 1999). Darüber hinaus sind ungefähr 1 mM Mn²⁺ Ionen und eine Temperatur von 30–50 Grad C notwendig, um die maximale Aktivität der nativen Arginase zu erreichen.
Die pegylierte Arginase ergab einen K_m von 2.9 ± 0.3 mM und eine V_max of 360 μmol Harnstoff min^–1 mM^–1. Der K_m Wert der pegylierten Arginase ist ähnlich dem der nativen Arginase, was nahe legt, dass die Bindungsaffinität nach Peglyierung beibehalten wird. Darüber hinaus sind ungefähr 1 mM Mn²⁺ Ionen, eine Temperatur von 40–50 Grad C und ein pH von 10 notwendig, um eine maximale Aktivität für die pegylierte Arginase zu erreichen. Die funktionalen Eigenschaften der Arginase vor und nach Pegylierung sind ähnlich, was anzeigt, dass die kovalente Anbringung von mPEG-SPA Moleküle an Arginase ihre Eigenschaft insgesamt verbessert.
Beispiel 11: Behandlungsprotokoll mit exogen verabreichter Arginase
Blutproben von Patienten werden täglich während der ganzen Behandlung für die Argininlevels, Arginaseaktivitäten, ein komplettes Blutbild und vollständiges Gerinnungsprofil genommen. Nieren- und Leberfunktionen werden mindestens an jedem anderen Tag, früher, wenn es notwendig erschien, bestimmt.
Die Vitalsignale (Blutdruck, Puls. Respirationsrate, Oximeterwerte) werden alle 15 Minuten für 1 Stunde nach Beginn der Arginaseinfusion, dann stündlich bis sie stabil sind, bestimmt. Danach liegt dies im Ermessen des behandelnden Arztes.
20 Minuten vor der Arginaseinfusion, wird als Vormedikation Dipheneramin 10 mg iv. und Hydrocortison 100 mg iv. vor jeder frischen Infusion mit Arginase gegeben oder nach dem Ermessen des behandelnden Arztes.
An Tag eins wird Arginase über 30 Minuten infundiert. Danach wird Arginase wöchentlich für mindestens 8 Wochen infundiert. Dies kann fortgeführt werden, wenn Anti-Tumoraktivität beobachtet wird.
Beispiel 12: Beispiel eines Behandlungsprotokolls mit exogen verabreichter Arginase
Eine 54 jährige chinesische Frau mit metastatischen rektalen Karzinoms mit ausgeprägten Lungenmetastasen, bei der alle Standardtherapien versagten, wurde mit pegylierter rekombinanter Arginase Anfang August 2001 behandelt. Ihre Hauptsymptome waren Husten, geringer Appetit und Verstopfung. Ihr Krebsmarker CEA betrug 1100 U/ml. Eine Einverständniserklärung zur Behandlung mit pegylierter rekombinanter Arginase wurde vor der Behandlung eingeholt.
Behandlungsmethodologie
850 mg lyophilisierter rekombinanter Arginase I wurde verabreicht. Der Wirkstoff war in PBS rekonstituiert und pegyliert worden. Das pegylierte Enzym erwies sich als voll aktiv.
Ergebnisse
Die Ergebnisse sind in 28 und 29 gezeigt. 28 zeigt eine zufriedenstellende Depletion von Arginin zwischen 1–5 μM für 5 Tage (siehe auch 21). 29 zeigt eine Abnahme der CEA Levels von 1100 auf 800 über 4 Wochen.

1) Im Gegensatz zur Chemotherapie führte diese Behandlung zu keinen supprimierenden Wirkungen des Marks oder zu Haarverlust.
2) Sie kann Arginin in einer kontrollierten Weise depletieren, wobei die Argininlevels innerhalb des therapeutischen Bereichs (1–8 μM) für die gewünschte Dauer von 5 Tagen gehalten wird, für die in vitro Daten nahe legen, dass sie optimale Tumorabtötung bewirkt.
3) Keine wesentlichen Nebenwirkungen und der Patient tolerierte die Behandlung bei nur geringen Kopfschmerzen, die vielleicht nicht direkt auf die Behandlung zurückzuführen sind.
4) Sowohl biochemische als auch radiologische Verbesserung der Krankheit wurde nach der Behandlung beobachtet, wobei CEA um 30% abfiel und eine obere Krankheitszone sich auf dem Bruströntgenbild aufklarte.

Beispiel 13: In vivo Arginindepletion in Laborratten durch Arginase
In diesem Beispiel wurden vier Gruppen von Ratten (zwei in jeder Gruppe, eines männlich und eines weiblich) Dosierungen mit verschiedenen Mengen von Arginase verabreicht, die aus Beispiel 8C an Tag 0 erhalten wurden. Blutproben wurden aus ihren Schwanzvenen an Tag 0 vor der intraperitonealen Injektion der rekombinanten humanen Arginase genommen, an Tag 1 bis Tag 6, dann alle 2 Tage.
Wie in 23 gezeigt, wurden nicht detektierbare Argininlevel in allen Gruppen erreicht und erschienen mit 500 I. U. dosisabhängig zu sein, die nur einen Tag nach Arginasedepletion gegeben wurde. 1000 I. U. (500 I. U. am Morgen und weitere 500 I. U. am Nachmittag verabreicht) ergaben eine 4-tägige Periode mit vollständiger Arginindepletion. Bei Verabreichung einer einzelnen Dosis von 1500 I. U. gab es 6-tägige Arginindepletion. Bei Verdopplung dieser Dosis auf 3000 I. U. schien die Länge der vollständigen Arginindepletion nicht in irgendeiner Weise verlängert zu werden.
Daher schienen 1500 I. U. von intraperitoneal verabreichter Arginase die optimale Dosis für die Arginindepletion bei nicht nachweisbarem Argininlevel für 6 Tage zu sein.
Beispiel 14: Vergleich der Veränderungen der Niveaus der Blutbestandteile zwischen normalen Ratten und Ratten mit Argininniveau Null, das durch Arginase von Tag 1 bis Tag 5 induziert wurde.
Intrakardiale arterielle Blutproben wurden aus einer Gruppe von 5 Ratten an Tag 0 vor der Verabreichung von Arginase genommen. Die Tag 0 Proben dienten als unbehandelte Kontrolle. Das Level von Gesamtprotein, Albumin, Globulin, SGOT/AST, SGPT/ALT, Hämoglobin, Fibrinogen A. P T. T./zweit, Prothrombin/zweit, der Anzahl der weißen Blutzellen (WBC) und Plättchen wurde durch das Pathlab Medical Laboratory Ltd, 2ter Stock Henan Building, 90–92 Jaffe Road, Wanchai, Hong Kong gemessen. Den Ratten wurde eine einzelne Dosis 1500 I. U. Arginase intraperitoneal injiziert. Ein Argininlevel von Null wurde in allen Ratten erreicht. Von Tag 1 bis Tag 5 wurde eine Ratte jeden Tag getötet und eine intrakardiale arterielle Blutprobe wurde genommen und durch das PathLab Medical Laboratory gemessen. Die Ergebnisse zeigen, dass alle Proteine innerhalb der normalen Bereiche waren, wie sie das PathLab Medical Laboratory angegeben hatte.
Beispiel 15: Die Antwort auf Arginindepletion in Hep3B Tumor tragenden Nacktmäusen
Eine humane Hepatomazelllinie (Hep3B2.17) wurde subkutan in die rechte Seite von sechs BALG/c Nacktmäusen inokuliert, um das Tumorwachstum zu induzieren. Drei zufällig ausgewählten Mäusen wurde intraperitoneal einmal pro Woche 500 I. U. pegylierte Arginase, das nach dem in Beispiel 8C beschriebenen Verfahren erhalten wurde, verabreicht, während die anderen drei Mäuse keine Arginasebehandlung erhielten, um als Kontrolle zu dienen. Die implantierten Mäuse wurden alle zwei Tage auf das Wachstum des festen Tumors in situ durch Messungen mit einer digitalen Schieblehre untersucht, um die Tumorgröße zu bestimmen, die gemäß der folgenden Formel berechnet wird:

Tumorgröße (mm) = Durchschnitt von zwei rechtwinkligen Durchmessern und einem diagonalen Durchmesser

Die Anzahl der Mäuse, die in jeder Gruppe starb, wurde auch täglich aufgezeichnet. Wie in 24 gezeigt, war die Zunahmerate der Tumorgröße pro Tag in der Kontrollgruppe 6 Mal höher als die Rate in der Gruppe, die mit pegylierter Arginase für die ersten 20 Tage des Experiments behandelt wurde. 2 Mäuse in der Kontrollgruppe waren innerhalb von 24 Tagen tot, während die Mäuse, die mit pegylierter Arginase behandelt wurden, für mindestens 75 Tage überleben können.
Beispiel 16: Die Reaktion auf Arginindepletion in PLC/PRF/5 Tumor tragenden Nacktmäusen
In diesem Beispiel wurde ein solider Tumor von humanen Hepatomazellen (PLC/PRF/5) subkutan in den Rücken von zehn Balb/c Nacktmäusen implantiert, um Tumorwachstum zu induzieren. Fünf zufällig ausgewählten Mäusen wurde intraperitoneal einmal pro Woche 500 I. U. pegylierte Arginase verabreicht, die gemäß dem Verfahren, das in Beispiel 8C beschrieben wurde, erhalten wurde, während die anderen fünf Mäuse 200 μl Phosphatpuffersalzlösung (PBS) intraperitoneal erhielten, um als Kontrolle zu dienen. Die implantierten Mäuse wurden alle zwei Tage auf das Wachstum des festen Tumors in situ durch Messungen mit einer digitalen Schieblehre untersucht, um die Tumorgröße und – masse zu bestimmen. Die Tumorgröße wird, wie in Beispiel 15 beschrieben, gemessen, während die Tumormasse gemäß der folgenden Formel berechnet wird: Tumormasse (mg) = Länge × Breite2/2 (unter Annahme einer spezifischen Dichte von 1.0 g/cm3) (wobei die Länge der längste senkrechte Durchmesser und die Breiter der kürzeste senkrechte Durchmesser ist)
Wie in 25A gezeigt, war die Zunahmerate der Tumorgröße pro Tag ungefähr 6.5 mm/Tag in der Kontrollgruppe und die Zunahmerate der Tumorgröße in der Gruppe, die mit pegylierter Arginase behandelt wurde, ungefähr 5.3 mm/Tag für die ersten 39 Tage des Experimentes. Wie in 25B gezeigt, war die Zunahmerate der Tumormasse pro Tag in der Kontrollgruppe ungefähr 1.8 Mal höher als in der behandelten Gruppe.
Beispiel 17: Die Reaktion auf Arginindepletion in HuH-7 Tumor tragenden Nacktmäusen
In diesem Beispiel wurde ein solider Tumor von humanen Hepatomazellen (HuH-7) subkutan in den Rücken von zehn Balb/c Nacktmäusen implantiert, um Tumorwachstum zu induzieren. Fünf zufällig ausgewählten Mäusen wurde intraperitoneal einmal pro Woche 500 I. U. pegylierte Arginase verabreicht, die gemäß dem Verfahren, das in Beispiel 8C beschrieben wurde, erhalten wurde, während die anderen fünf Mäuse 200 μl Phosphatpuffersalzlösung (PBS) intraperitoneal erhielten, um als Kontrolle zu dienen. Die implantierten Mäuse wurden alle zwei Tage auf das Wachstum des festen Tumors in situ durch Messungen mit einer digitalen Schieblehre untersucht, um die Tumorgröße und -masse zu bestimmen, wie es in den Beispiel 15 und 16 beschrieben wurde.
Wie in 26A gezeigt, war die Zunahmerate der Tumorgröße pro Tag ungefähr 6.0 mm/Tag in der Kontrollgruppe und die Zunahmerate der Tumorgröße in der Gruppe, die mit pegylierter Arginase behandelt wurde, ungefähr 5.6 mm/Tag für die ersten 18 Tage des Experimentes. Wie in 26B gezeigt, war die Zunahmerate pro Tag der Tumormasse in der Kontrollgruppe ungefähr 1.4 Mal höher als die der behandelten Gruppe
Beispiel 18: Die Reaktion auf Arginindepletion in MCF-7 Tumor tragenden Nacktmäusen
In diesem Beispiel wurde eine humane Brustkrebszelllinie (MCF-7) subkutan in die rechte Seite von vier Balb/c Nacktmäusen implantiert, um Tumorwachstum zu induzieren. Drei zufällig ausgewählten Mäusen wurde intraperitoneal einmal pro Woche 500 I. U. pegylierte Arginase verabreicht, die gemäß dem Verfahren, das in Beispiel 8C beschrieben wurde, erhalten wurde, während die andere Maus keine Argininbehandlung erhielt, um als Kontrolle zu dienen. Die implantierten Mäuse wurden alle zwei Tage auf das Wachstum des festen Tumors in situ durch Messungen mit einer digitalen Schieblehre untersucht, um die Tumorgröße zu bestimmen, wie es in Beispiel 15 beschrieben wurde.
Wie in 27 gezeigt, verschwand der Tumor, der in die Mäuse inokuliert wurde, die mit pegylierter Arginase behandelt wurden, innerhalb von 20 Tagen des Experiments.
Es muss angemerkt werden, dass, wie hier und in den beigefügten Ansprüchen verwendet, die Einzahlformen „ein", „und" und „der" die Mehrzahlbezüge einschließen, falls der Kontext nicht klar etwas anderes vorschreibt. Somit schließt, zum Beispiel, ein Bezug auf „eine pharmazeutische Zubereitung" Mischungen von verschiedenen Zubereitungen ein, und Bezug auf „das Behandlungsverfahren" schließt den Bezug auf äquivalente Schritte und Verfahren ein, die den Fachleuten bekannt sind, und so weiter.
Falls nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Begriffe die gleiche Bedeutung, wie sie vom Fachmann im Gebiet der Technik verstanden wird, zu dem diese Erfindung gehört. Obgleich jegliche Verfahren und Materialien bei der Ausübung oder dem Testen dieser Erfindung verwendet werden können, die zu den hier beschriebenen ähnlich oder äquivalent ist, werden die hier bevorzugten Verfahren und Materialien nun beschrieben. Alle hier erwähnten Veröffentlichungen werden hier durch Bezugnahme aufgenommen und offenbaren die spezifische Information, in Verbindung mit der die Fundstelle zitiert wurde. Die Erfindung wurde vollständig beschrieben, Modifikationen innerhalb ihres Umfangs werden dem Fachmann offensichtlich sein. All solche Modifikationen sind innerhalb des Erfindungsumfanges.
Formulierungen der pharmazeutischen Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung können in der Form eines Feststoffes, einer Lösung, einer Emulsion, einer Dispersion, einer Mizelle, eines Liposoms und ähnlichem verwendet werden, wobei die resultierende Formulierung eine oder mehrere der modifizierten humanen Arginasen bei Ausübung der Erfindung als aktive Inhaltsstoffe in einer Mischung mit einem organischem oder anorganischem Träger oder Auszug enthält, der für die enterale oder parenterale Anwendungen geeignet ist. Der aktive Inhaltsstoff kann Arginase sein, zum Beispiel, zusammen mit den üblichen nicht toxischen, pharmazeutisch verträglichen Trägern für Tabletten, Pellets, Kapseln, Zäpfchen, Lösungen, Emulsionen, Suspensionen und jeder anderen Form, die für die Verwendung in Herstellungszubereitungen geeignet ist, in fester, semifester oder flüssiger Form. Zusätzlich können Hilfs-, stabilisierende, Verdickungs- und Kolorierungsagenzien und Parfüme verwendet werden. Die aktiven Inhaltsstoffe von einer oder mehr Arginase sind in den pharmazeutischen Formulierung in einer Menge eingeschlossen, die ausreicht, um den gewünschten Effekt auf den Zielprozess, -zustand oder -krankheit herbeizuführen.
Pharmazeutische Formulierungen, die die hier betrachteten aktiven Inhaltsstoffe enthalten, können in einer für die orale Anwendung geeigneten Form sein, zum Beispiel als Tabletten, Pastillen, Lutschtablette, wässrige oder ölige Suspension, dispergierbare Puder oder Granula, Emulsionen, harte oder weiche Kapseln oder Sirupe oder Elixiere. Formulierungen, die für die orale Anwendung hergestellt werden, können nach jedem beliebigen Verfahren zur Herstellung von pharmazeutischen Formulierungen des Stands der Technik hergestellt werden. Die Tabletten können ohne Beschichtung sein oder sie können durch bekannte Techniken beschichtet sein, um den Zerfall und die Absorption in dem gastrointestinalen Trakt zu verzögern, wodurch eine anhaltende Wirkung über eine längere Dauer erreicht wird. Sie können auch beschichtet sein, um osmotische therapeutische Tabletten für die kontrollierte Freisetzung zu bilden.
In einigen Fällen können die Formulierungen zur oralen Anwendung als harte Gelatinekapseln vorliegen, wobei die aktiven Inhaltsstoffe mit einem inerten festen Verdünnungsmittel gemischt sind, zum Beispiel, Kalzium-Karbonat, Kalzium-Phosphat, Kaolin und ähnliche. Sie können auch als weiche Gelatinekapseln vorliegen, wobei die aktiven Inhaltsstoffe mit Wasser oder einem Ölmedium gemischt sind, zum Beispiel Erdnussöl, flüssigem Paraffin oder Olivenöl.
Die pharmazeutischen Formulierungen können auch als sterile injizierbare Lösung oder Suspension vorliegen. Diese Suspension kann gemäß den bekannten Verfahren mit geeigneten Dispersions- oder Feuchthalteagenzien und unterstützenden Agenzien formuliert sein. Die sterile injizierbare Zubereitung kann auch eine sterile injizierbare Lösung oder Suspension in einem nicht toxischen perenteral verträglichem Verdünnungsmittel oder Lösungsmittel sein, zum Beispiel in einer Lösung in 1,4-Butandiol. Sterile, fixierte Öle werden gewöhnlich als Lösungsmittel oder unterstützendes Medium eingesetzt. Für diesen Zweck kann jedes angenehme fixierte Öl eingesetzt werden, was synthetische Mono- oder Diglyceride, Fettsäuren (Ölsäure einschließend), natürlich vorkommende Pflanzenöle wie Sesamöl, Kokusnussöl, Erdnussöl, Baumwollsamenöl oder synthetische fettige Träger, wie Ethyloleat oder ähnliche einschließt. Puffer, Dextroselösungen, Konservierungsstoffe, Antioxidantien und ähnliche können aufgenommen werden oder als Lösungsmittel verwendet werden, um das lösliche Enzym nach Bedarf aufzulösen.
Die pharmazeutischen Formulierungen können auch eine Zusatzbehandlung zusammen mit anderen chemotherapeutischen Agenzien darstellen.
In den Ansprüchen bedeutet eine Arginase, die eine Aminosäure im Wesentlichen gleich zu der Sequenz besitzt, die in SEQ ID No. 9 gezeigt ist, dass die Sequenz mindestens 30% identisch zu der ist, die in SEQ ID No. 9 gezeigt wird, oder dass, bei Verwendung des hier beschriebenen Arginaseaktivitätsassays, es keinen signifikanten Unterschied bei der Enzymaktivität zwischen dem Enzym von SEQ ID No. 9 und dem, das im Wesentlichen ähnlich ist, gibt. Die sechs Histidine werden zur Vereinfachung der Aufreinigung bereitgestellt, und die zusätzliche Methioningruppe, die am Aminoterminus davon bereitgestellt ist, hat die Aufgabe, die Initiierung der Translation zu ermöglichen. Es ist dem Fachmann klar, dass andere Formen der Aufreinigung auch verwendet werden können und daher muss eine „im Wesentlichen" ähnliche Arginase keinerlei Homologie mit der MHHHHHH Sequenz von SEQ ID No. 3 aufweisen. In einigen Bakterienstämmen kann eine Homologie von mindestens 40% mit SEQ ID No. 9 vorliegen. Einige Säuger-Arginasen können eine Homologie von 70% mit SEQ ID No. 9 aufweisen. Sequenzprotokoll
Sequenzprotokoll

Claims

Pharmazeutische Zusammensetzung, umfassend eine isolierte rekombinante humane Arginase I mit einer Reinheit von 80–100%, vermengt in einem pharmazeutisch verträglichen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die humane Arginase eine Modifikation umfasst, die zu einer in-vitro-Plasma-Halbwertszeit von wenigstens einem Tag führt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 2, wobei die humane Arginase eine Modifikation umfasst, die zu einer in-vitro-Plasma-Halbwertszeit von wenigstens drei Tagen führt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 1, wobei die humane Arginase eine Modifikation umfasst und eine spezifische Enzymaktivität von wenigstens 250 I. U./mg besitzt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 4, wobei die humane Arginase eine Modifikation umfasst und eine spezifische Enzymaktivität von 500 bis 600 I. U./mg besitzt.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 5, wobei es sich bei der Modifikation um eine Pegylierung handelt.
Isolierte rekombinante humane Arginase I mit einer Reinheit von 80 bis 100 % zur Verwendung als Arzneimittel.
Humane Arginase I nach Anspruch 7, welche pegyliert ist.
Humane Arginase I nach Anspruch 7, welche die in der 2C aufgeführte Aminosäuresequenz besitzt.
Humane Arginase I nach Anspruch 7, wobei das Arzneimittel zur Behandlung von humanen Malignomen verwendet wird.
Humane Arginase I nach Anspruch 10, wobei es sich bei den humanen Malignomen um einen Lebertumor oder Brustkrebs handelt.
Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 zur Verminderung des physiologischen Argininspiegels in einem Patienten auf unterhalb 10 μM für wenigstens drei Tage zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung humaner Malignome.