DE60107707T2

DE60107707T2 - Mikroben mit einer transkriptionsabbrecher enthaltender dämpfender mutation

Info

Publication number: DE60107707T2
Application number: DE60107707T
Authority: DE
Inventors: Iii Roy Curtiss; A. Steven TINGE
Original assignee: Tinge Steven A Lebanon; Megan Health Inc; St Louis University; Washington University in St Louis WUSTL
Current assignee: Tinge Steven A Lebanon; Megan Health Inc; St Louis University; Washington University in St Louis WUSTL
Priority date: 2000-10-12
Filing date: 2001-10-11
Publication date: 2005-12-08
Anticipated expiration: 2021-10-12
Also published as: AR030882A1; AU2002211582A1; ATE284440T1; WO2002030457A2; WO2002030457A9; DE60107707D1; EP1326960B1; EP1326960A2; CA2463482A1; WO2002030457A3

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
(1) Gebiet der Erfindung
Diese Erfindung betrifft im Allgemeinen attenuierte Mikroben und insbesondere Mikroben mit einer attenuierenden chromosomalen Mutation, umfassend einen rekombinanten Transkriptionsfaktor, zur Verwendung als Vakzine und Zufuhrvehikel für Gene und Genprodukte und davon abgeleitete Verfahren.
(2) Beschreibung des Standes der Technik
Die Verwendung von Vakzinen hat sich als erfolgreicher Ansatz zur Bekämpfung infektiöser Erkrankungen erwiesen. Von den verschiedenen Arten von Vakzinen haben sich die lebenden attenuierten Mikroorganismen bestens bewährt und stellen die aussichtsreichsten Kandidaten für zukünftige orale Vakzine und Zufuhrsysteme für heterologe Antigene dar (für einen Review-Artikel siehe Bumann of al., FEMS Immunol. Med. Microbiol. 27: 357–364, 1999d; Liljeqvist et al., J. Biotechnol. 73: 1–33, 1999).
Idealerweise müssen lebende attenuierte Vakzine ein Gleichgewicht zwischen Attenuierung und Immunogenität erreichen, um eine Immunantwort ohne Erzeugen einer Krankheitssymptomatologie oder anderer Nebeneffekte auszulösen (Curtiss in New Generation Vaccines, Voodrow and Levine, Eds., Marcel Dekker, Inc., New York, 1990, S. 161–168; Dorner et al., Ann. Med. 31: 51–60, 1999). Strategien zur Erzeugung von attenuierten Stämmen umfassen üblicherweise die Mutagenese von biosynthetischen Genen, Regulatorgenen und/oder die Virulenz nach sich ziehenden Genen (Dogget und Brown in Mucosal Vaccines, Kiyono et al., Eds., Academic Press, San Diego, 1996, S. 106–118). Die ausgelösten mutagenen Veränderungen umfassen Geninsertionen, -deletionen, Basenaustausche, Inversionen, Translokationen, Duplikationen und dgl. Diese mutagenen Veränderungen können jedoch auch andere Folgen nach sich ziehen als die vollständige Aufhebung der Funktion des beschädigten Gens. Eine Punktmutation kann beispielsweise ein aberrierendes Protein hervorrufen, das teilweise funktionsfähig ist. Ferner können Insertionen Fusionsproteine mit unvorhersehbaren und manchmal schädlichen Wirkungen für die Mikrobe hervorrufen. Eine Mutagenese kann auch zu Veränderungen nicht nur des Zielgens, sondern auch von benachbarten Genen führen. Beispielsweise wurde das mutierte galE-Derivat Ty21a von S. typhi Ty2 durch chemische Mutagenese, welche Mutationen in Genen zusätzlich zu dem gaIE-Gen erzeugte, hergestellt. Diese Mutationen führten zu einer Hyperattenuierung der Mikrobe und zu einer geringeren Vakzinwirksamkeit für den Ty21a-Stamm (Forrest, in C.R.C. Press, Inc., 1994, S. 59-90). Ein weiteres Beispiel für die Unvorhersehbarkeit einer Mutagenese wurde für die Transposon-induzierte Deletionsmutation des crp-Gens berichtet. In einigen Fällen wurde eine Attenuierung erzeugt, welche durch das Wild-Typ crp-Gen nicht komplementiert werden konnte, um die Wild-Typ-Virulenz wiederherzustellen. Solche Deletionsmutationen dehnten sich bis in benachbarte Gene aus, wodurch die Fähigkeit der Salmonella, verborgene Gewebe zu besiedeln, verringert wurde, während die Fähigkeit, Darm-assoziiertes Lymphgewebe zu besiedeln, nicht beeinträchtigt wurde (siehe U.S. Patent Nr. 5,387,744).
Ein Ansatz, die Unvorhersehbarkeit einer Mutagenese zu verringern, betrifft die Entwicklung von Verfahren, die definierte Deletionen verursachen (siehe beispielsweise Ling et al., Anal. Biochem. 254: 157–178, 1997; U.S. Patent Nr. 6,024,961, Beispiele 2 und 3). Dennoch können definierte Deletionen, wie beispielsweise andere Deletionsmutationen, möglicherweise unerwünschte Veränderungen in der Funktion des beschädigten Gens hervorrufen. Beispielsweise kann eine definierte Deletionsmutation ein aberrierendes Proteinprodukt erzeugen, das aufgrund eines durch die Deletion verursachten Frameshifts entweder trunkiert ist oder eine abnormale C-terminate Aminosäuresequenz aufweist. Ferner könnte die vollständige Deletion der codierenden Sequenz eines Gens, wobei der Promotor intakt bleibt, möglicherweise zu einer Kompensation der Bakterienzelle durch eine Steigerung der RNA-Polymerasererkennung des Promotors und der Transkription des benachbarten Gens führen. Wird das benachbarte Gen in entgegengesetzter Richtung transkribiert, dann würde die synthetisierte mRNA eine Antisense-mRNA darstellen, die die normale Expression des benachbarten Gens stören oder verhindern würde. Die Erzeugung eines aberrierenden Proteinprodukts oder entweder die Überexpression oder die Inhibierung eines zu der Deletion benachbarten Genes kann die Attenuierung oder Immunogenität verändern.
Weitere Probleme können entstehen, wenn ein Promotor von einer Insertionssequenz umfasst wird. Dies kann beispielsweise vorkommen, wenn die insertierte Sequenz ein heterologes Reportergen oder einige andere Gene enthält, die unabhängig von der Expression des mutierten Gens exprimiert werden sollen (siehe beispielsweise Sousa et al., Microbiol. 143: 2071–2078, 1997; Vagner et al., Microbiol. 144: 3097–3104, 1998). In einigen Fällen kann der insertierte Promotor möglicherweise eine Expression von benachbarten Genen verursachen, was unvorhersehbare Auswirkungen auf die Attenuierung und die Immunogenität der Mikrobe haben könnte. Es besteht demzufolge ein anhaltendes Bedürfnis für neue Ansätze zur Erzeugung von Vakzinstämmen, welche einzelne Auswirkungen auf spezifische Zielgene und als Ergebnis davon vorhersehbare Auswirkungen auf die Attenuierung und die Immunogenität der Mikrobe haben.
In den letzten Jahren hat es sich abgezeichnet, dass die Transkriptionstermination eine wichtige Rolle bei der Regulation der Genexpression spielt (für einen Review-Artikel siehe Henkin, Current Opin. Microbiol. 3: 1490–153, 2000; Henkin, Ann. Rev. Genet. 30: 35–57, 1996). Eine Transkriptionstermination tritt auf, wenn die RNA-Polymerase auf ein Terminationssignal trifft. Sie stoppt das Anfügen von Nukleotiden an die neu synthetisierte RNA, trennt das DNA-RNA-Hybrid auf, setzt das neu synthetisierte Transkript frei und dissoziiert von dem DNA-Template (für einen Review-Artikel siehe Mooney et al., J. Bacteriol. 180: 3265–3275, 1998; Henkin, supra; Weisberg et al., J. Bacteriol. 181: 359–367, 1999). Bakterien verwenden mindestens drei Arten von Terminationssignalen: (1) intrinsische Terminatoren oder Rhounabhängige Terminatoren, die aus einem G-C-reichen Stem-Loop-Anteil gefolgt von einer Reihe von U-Nukleotiden bestehen (für einen Review-Artikel siehe Record et al., in Escherichia coli and Salmonella: Cellular and Molecular Biology, 2nd Ed., Neidhardt et al., Eds., ASM Press, Washington, D.C., 792–821, 1996), (2) Rho-abhängige Terminatoren, die über eine Bindungsstelle für das Rho-Protein auf dem naszierenden Transkript fungieren (für einen Review-Artikel siehe Richardson, J. Biol. Chem. 271: 1251–1254, 1996) und (3) persistente RNA-DNA-Hybridterminatoren, bei denen die Paarung der naszierenden RNA und des Templates unmittelbar stromaufwärts des Transkriptionselongationskomplexes zu einer Dissoziation eines Komplexes, der 3'-proximale U-reiche RNA enthält, führt (Tomizawa et al., Cell 51: 623–630, 1987). Obwohl bekannt ist, dass Transkriptionsterminatoren die Genexpression regulieren und einige Insertionskassetten Transkriptionsterminatoren in bakterielle Chromosomen eingegliedert haben, wurden Transkriptionsterminatoren zuvor noch nie verwendet, um attenuierte Mikroben für eine Verwendung als Vakzinpräparate zu erzeugen.
Eine Forschungsgruppe berichtet von einer natürlich vorkommenden Insertion von Transkriptionsterminatoren in Yersinia pestis, die die Expression eines funktionellen inv-Genprodukts verhindern (Simonet et al., Infect. Immun. 64: 375–379, 1996; Odaert et al., J. Bacteriol. 180: 178–181). Obwohl andere Yersinia Spezies durch Invasin in eukaryotische Zellen eindringen, ist Yersinia pestis, welcher der ursächliche Erreger für Pest ist, aufgrund der mehrfachen Insertion eines Transkriptionsterminators in das inv-Gen dazu nicht fähig. Die Wild-Typ Mikrobe eignet sich jedoch nicht als attenuierter Vakzinstamm, da Yersinia pestis selbst bei Abwesenheit eines funktionsfähigen inv-Genprodukts höchst ansteckend ist.
Andere Gruppen berichteten von der Verwendung von Transkriptionsterminatoren als Teil einer chromosomalen Insertionskassette. Reeves et al. (J. Bacteriol. 181: 7098-7106, 1999) untersuchten beispielsweise die Transkriptionsorganisation des Erythromycin-Biosynthese-Genclusters ery von S. erythraea durch insertionelle Inaktivierung von Erythromycin-Biosynthese-Genen unter Verwendung von Mutanten, die an bestimmten Stellen einen rrn-Terminator enthielten. Diese Gruppe konstruierte jedoch weder Vakzinstämme noch wiesen die von dieser Gruppe hergestellten Mikroben attenuierende Mutationen, umfassend einen Transkriptionsterminator, auf.
Reeve et al. (Microbiol. 145: 1307–1316, 1999) berichteten von der Entwicklung von Kassetten, die einen Antibiotikaresistenzmarker zusammen mit dem tac-Promotor und dem trpA-Terminator enthielten, zur Überwachung der Transkriptionsaktivität vor unterschiedlichen genetischen Hintergründen in Wurzelknöllchen-Bakterien. Diese Gruppe offenbart oder suggeriert jedoch weder die Verwendung der Kassette zur Erzeugung einer attenuierenden Mutation in einer Mikrobe noch die Verwendung dieser Kassette zur Herstellung eines Vakzinstammes.
Curtiss et al. (WO1996/US/09774) beschreiben die Herstellung von Mikroben mit einem von Umweltbedingungen abhängigen Lebensfähigkeitssystem. Die offenbarten mutierten Organismen wiesen eine Deletion in dem chromosomalen asd-Gen und eine Insertion einer Kassette, die Promotoren und Transkriptionsterminatoren enthielt, an dieser Genstelle auf. Die letztendlich hergestellten Mikroben enthielten auch ein Plasmid mit einem asd-Gen (siehe beispielsweise WO1996/US/09774, 4, 8, 11 und 13). Dieses asd-Gen in dem Plasmid ersetzte das deletierte chromosomale asd-Gen, sodass die Mikroben durch die Mutation des chromosomalen asd-Gens nicht attenuiert waren. Diese Veröffentlichung offenbart oder suggeriert demnach weder die Konstruktion einer attenuierenden chromosomalen asd-Genmutation, enthaltend einen Transkriptionsterminator, noch die Verwendung von Transkriptionsterminatoren im Allgemeinen als Attenuierungsstrategie zur Herstellung von Vakzinstämmen.
Frühere Arbeiten mit Transkriptionsterminatoren beschreiben demzufolge nicht die Verwendung von Transkriptionsterminatoren zur Herstellung von attenuierten Mikroben oder als Teil einer Attenuierungsstrategie zur Herstellung neuer Vakzinpräparate. Ungeachtet der Verwendung von Transkriptionsterminatoren bei der Untersuchung der Struktur und Funktion von Genen besteht demzufolge ein anhaltendes Bedürfnis für neue Ansätze betreffend attenuierende Mikroben und die Herstellung von Vakzinen auf eine Art und Weise, die sowohl die Immunogenität der Mikrobe attenuiert als auch aufrechterhält.
KURZE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die Erfinder haben vorliegend herausgefunden, dass Transkriptionsterminatoren in einem neuen Ansatz zur Attenuierung von Bakterien in bakterielle Gene insertiert werden können. Die in das Gen oder die Genstelle insertierte Transkriptionsterminatorsequenz erzeugt eine Transkriptionstermination, sodass die codierende Sequenz des Gens nicht vollständig transkribiert wird und ein funktionelles Genprodukt nicht exprimiert wird. Eine solche Insertion in einem Operon kann die Transkription und Expression von Genen stromabwärts der Insertion verhindern. Der Ansatz kann bei der Konstruktion von attenuierten Mikroben, die als Vakzine und als Träger-Mikroben zur Expression eines gewünschten Genproduktes verwendet werden können, angewendet werden.
Eine Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft demzufolge eine Zusammensetzung, umfassend eine Mikrobe mit einer attenuierenden Mutation, die eine Sequenz, umfassend einen in ein chromosomales Gen oder eine chromosomale Genstelle insertierten Transkriptionsterminator, umfasst. Die Bezeichnung „Genstelle" bedeutet, dass in Fällen, in denen ein Zielgen teilweise oder vollständig deletiert wurde, ein Transkriptionsterminator an der chromosomalen Stelle insertiert wird, die von dem Gen belegt wäre, wenn es nicht deletiert worden wäre. Die Zusammensetzung liegt als pharmazeutisch verträgliche Zubereitung vor. Die den insertierten Transkriptionsterminatorumfassende Sequenz kann in einigen Fällen auch einen rekombinanten Promotor enthalten. Der Promotor kann zur Expression eines rekombinanten Gens vorliegen, das auch von der Insertionssequenz umfasst ist. Die Expression des rekombinanten Gens ist demzufolge unabhängig von dem Promotor des Gens, in welches der Promotor, das rekombinante Gen und der Transkriptionsterminator insertiert wurden. In diesen Fällen dient der Transkriptionsterminator dazu, dass der insertierte Promotor die Expression von zu dem mutierten Gen benachbarten Genen nicht verändert. Alternativ dazu kann der Transkriptionsterminator ohne die Insertion eines rekombinanten Promotors insertiert werden.
Beliebige Gene können das Ziel einer Insertion der Transkriptionsterminatorsequenz zur Attenuierung der Mikrobe sein. Insbesondere können solche Gene biosynthetische Gene, Regulatorgene und/oder die Virulenz nach sich ziehende Gene sein.
In einem besonders bevorzugten Aspekt dieser Ausführungsform enthält die Mikrobe ferner ein rekombinantes Gen, das für ein zu exprimierendes, gewünschtes Genprodukt eines Pathogens, wie eines Virus, eines Bakteriums, eines Protozoon, eines Parasiten oder eines Pilzes, codiert. Das rekombinante Gen kann auch für ein Produkt codieren, das zur Suppression, Modulation oder Verstärkung einer Immunantwort in einem Individuum fähig ist. Überdies kann das rekombinante Gen für ein Autoantigen, wie ein gametspezifisches Antigen, oder ein Allergen eines Individuums codieren.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Vakzin. Das Vakzin umfasst eine Mikrobe mit einer attenuierenden Insertion, umfassend einen in ein chromosomales Gen insertierten rekombinanten Transkriptionsterminator, in einer pharmazeutisch verträglichen Zubereitung. In einem Aspekt dieser Ausführungsform kann die Vakzinmikrobe ferner ein rekombinantes Gen enthalten, das für ein zu exprimierendes, gewünschtes Genprodukt, umfassend ein Epitop eines Pathogens, wie eines Virus, eines Bakteriums, eines Protozoon, eines Parasiten oder eines Pilzes, codiert. Das rekombinante Gen kann auch für ein Autoantigen, wie ein gametspezifisches Antigen, oder ein Allergen eines Individuums codieren.
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung betrifft ein Verfahren zur Immunisierung eines Individuums gegen ein Pathogen. Das Verfahren umfasst die Verabreichung einer Zusammensetzung, umfassend ein Derivat einer pathogenen Mikrobe, an das Individuum. Die Bezeichnung „Derivat" bedeutet, dass die pathogene Mikrobe durch die Insertion eines rekombinanten Transkriptionsterminators in ein chromosomales Gen verändert wurde, um die Pathogenität zu attenuieren. In einem Aspekt dieser Ausführungsform kann die Mikrobe ferner ein für ein Epitop des Pathogens codierendes rekombinantes Gen umfassen. Das Pathogen kann ein Virus, ein Bakterium, ein Protozoon, ein Parasit oder ein Pilz sein.
In einer anderen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Träger-Mikrobe zur Verabreichung eines gewünschten Genprodukts an ein Individuum. Das Verfahren umfasst das Erzeugen eines attenuierten Derivats einer pathogenen Mikrobe mit einem rekombinanten, für das gewünschte Genprodukt codierenden Gen und einer attenuierenden Mutation, umfassend einen in ein chromosomales Gen insertierten Transkriptionsterminator.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einer weiteren Ausführungsform ein Verfahren zur Verabreichung eines gewünschten Genprodukts an ein Individuum. Das Verfahren umfasst das Verabreichen einer Zusammensetzung, umfassend eine Mikrobe mit einer attenuierenden Mutation, umfassend einen in ein chromosomales Gen insertierten rekombinanten Transkriptionsterminator, an ein Individuum. Die Mikrobe kann ferner ein für das gewünschte Genprodukt codierendes rekombinantes Gen umfassen. Das für das rekombinante Gen codierende Genprodukt kann von einem Pathogen, wie einem Virus, einem Bakterium, einem Protozoon, einem Parasiten oder einem Pilz, stammen. Das rekombinante Gen kann auch für ein Produkt codieren, das zur Suppression, Modulation oder Verstärkung einer Immunantwort in dem Individuum fähig ist. Überdies kann das rekombinante Gen für ein Autoantigen, wie ein gametspezifisches Antigen, oder ein Allergen eines Individuums codieren.
In jeder der obigen Ausführungsformen kann der Transkriptionsterminator ein Rhoabhängiger oder vorzugsweise ein Rho-unabhängiger Terminator sein, was rrnB 5s rRNA T1T2, trpA, T4 Gen 32, T4 iplll Gen oder rrfG 5S rRNA umfasst, jedoch nicht darauf beschränkt ist. Die Gene, in die der Transkriptionsterminator insertiert werden kann, um die Mikrobe zu attenuieren, umfassen ein pab-Gen, ein pur-Gen, ein aro-Gen, asd, ein dap-Gen, nadA, pncB, galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, rfc, poxR oder galU, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Attenuierte Mikroben sind vorzugsweise enteropathogene Mikrobenspezies, umfassend Salmonella, Shigella, Escherichia oder Hybride davon, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Zudem kann die Insertion des Transkriptionsterminators in einem Gen erfolgen, das eine definierte Deletion aufweist, die die gesamte oder einen Teil des codierenden Bereichs dieses Gens, die Promotorregion dieses Gens oder sowohl den codierenden Bereich als auch die Promotorregion dieses Gens umfasst. Besondere Beispiele von erfindungsgemäßen Mikroben sind MGN-1362, _X8298 und _X8429.
Von den vielen Vorteilen, die mithilfe der vorliegenden Erfindung erzielt werden können, sind die Bereitstellung von Mikroben mit einer einzelnen attenuierenden Mutation, welche eine vorhersehbare Attenuierung und Immunogenität der Mikrobe hervorruft, die Bereitstellung von Mikroben mit attenuierenden Mutationen in Zielgenen, in welchen die Mutationen die benachbarten Gene nicht beeinflussen, wodurch unerwartete Nebeneffekte ausgehend von der Mutation vermieden werden, die Bereitstellung von Vakzinzusammensetzungen, Zufuhrvehikeln und Verfahren zur nutzbringenden Verabreichung dieser Zusammensetzungen und Zufuhrvehikel zur Immunisierung oder zur Verabreichung eines gewünschten Genprodukts, und die Bereitstellung von Verfahren zur Herstellung von attenuierten Mikroben zu nennen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht die Sequenz der folgenden Transkriptionsterminatoren: (A) E. coli rrnB 5S rRNA T1 T2 (SEQ ID NO: 1) zusammen mit der RNA-Stem-Loop-Struktur von rrnB T1, umfassend die Nukleotide 160–218 (SEQ ID NO: 2), einer zweiten RNA-Stem-Loop-Struktur zwischen rrnB T1 und rrnB T2, umfassend die Nukleotide 238–273 (SEQ ID NO: 3) und der RNA-Stem-Loop-Struktur von rrnB T2, umfassend die Nukleotide 332–377 (SEQ ID NO: 4); (B) trpA TT (SEQ ID NO: 5) zusammen mit den RNA-Stem-Loop-Strukturen jeder der entsprechenden komplementären einzelsträngigen Sequenzen (SEQ ID NO: 6 und SEQ ID NO: 7); (C) T4 Gen 32 TT (SEQ ID NO: 8) zusammen mit den RNA-Stem-Loop-Strukturen jeder der komplementären einzelsträngigen Sequenzen, umfassend die Nukleotide 11–54 (SEQ ID NO: 9 und SEQ ID NO: 10); (D) T4 iplll Gen TT (SEQ ID NO: 11) zusammen mit den RNA-Stem-Loop-Strukturen jeder der komplementären einzelsträngigen Sequenzen, umfassend die Nukleotide 13–69 (SEQ ID NO: 12 und SEQ ID NO: 13); und (E) E.coli rrfG 5S rRNA TT (SEQ ID NO: 14) zusammen mit den RNA-Stem-Loop-Strukturen jeder der komplementären einzelsträngigen Sequenzen, umfassend die Nukleotide 1–45 (SEQ ID NO: 15 und SEQ ID NO: 16).
2 veranschaulicht pMEG-443.
3 veranschaulicht pMEG-105.
4 veranschaulicht pMEG-096.
5 veranschaulicht pMEG-611.
6 veranschaulicht die Konstruktion von ΔphoPQ23.
7 veranschaulicht pMEG-685.
8 veranschaulicht pMEG-549.
9 veranschaulicht pMEG-375.
10 veranschaulicht pMEG-550.
11 veranschaulicht die Insertion des trpA-Terminators in die ΔphoP24-Deletion, die eine Sequenz, umfassend die Nukleotide 0–40, die sich 5' zu der codierenden Sequenz des phoP-Gens befindet (TCGACGAACTTAAATAATGCCTGCCTCACCCT CTTTTCTTA, SEQ ID NO: 17), eine Sequenz, umfassend die dazu komplementären Nukleotide 20–40 (GATCTAAGAAAAGAGGGTGAGGCAGG, SEQ ID NO: 18), eine Sequenz, umfassend den trpA-Transkriptionsterminator (GATCGCGGCCGCCCGC CTAATGAGCGGGCTTTTTTTGCC, SEQ ID NO: 19 und AATTGGCAAAAAAAG CCCGCTCATTAGGCGGGCGGCCGC, SEQ ID NO: 20) und einen Teil der phoQcodierenden Sequenz (AATTCATGAATAAA, SEQ ID NO: 21 und den dazu komplementären Bereich TTTATTCATG, SEQ ID NO: 22) zusammen mit den ersten drei codierten Aminosäuren des phoQ-Gens, aufweist.
12 veranschaulicht pMEG-359.
13 veranschaulicht pMEG-368.
14 veranschaulicht die Wachstumskurven der S. typhimurium SL1344 Wild-Typ und _X8297, _X8298, _X8299 und _X3339 Mutantenstämme.
15 veranschaulicht die Wachstumskurven der S. typhimurium SL1344 Wild-Typ und _X8430, _X8432 und _X3339 Mutantenstämme.
16 veranschaulicht die Wachstumskurven der S. typhimurium UK-1 Wild-Typ und _X8087297, _X8429, _X8431 und _X3761 Mutantenstämme.
17 veranschaulicht die Ausbreitung in den Peyer'schen Plaques an den Tagen 3 und 7 durch S. typhimurium SL1344 Wild-Typ und _X3339, _X8297, _X8298 und _X8299 Mutantenstämme.
18 veranschaulicht pMEG-063.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Diese Erfindung basiert auf der Feststellung, dass Transkriptionsterminatoren im Rahmen einer Attenuierungsstrategie in ein bakterielles Gen insertiert werden können, wobei die Strategie nicht nur die Virulenz der Bakterien attenuiert, sondern auch dazu dient, die Wirkungen der attenuierenden Mutation auf das Zielgen oder -operon der Bakterien einzuschränken. Dieser neue Ansatz verhindert nicht nur die häufig unvorhersehbaren Auswirkungen anderer Attenuierungsstrategien auf benachbarte Gene, welche die Immunogenität der Bakterien abschwächen können oder sich auf andere Weise schädlich auf die Bakterien auswirken können, sondern ermöglicht auch eine ausgewogene Auswirkung auf die gesamten Gene eines Operons. Dies ist darauf zurückzuführen, dass die attenuierende und/oder einschränkende Auswirkung funktionell auf der Transkriptionsebene auftritt und nicht unmittelbar, wie andere Attenuierungsstrategien, von der Veränderung der codierenden Sequenz abhängt.
Die Transkriptionstermination reguliert die Genexpression auf der Transkriptionsebene, indem der RNA-Polymerase signalisiert wird, das Anfügen von Nukleotiden an das neu synthetisierte Transkript zu stoppen, welches dann freigesetzt wird und nachfolgend von der DNA dissoziiert. Die Bezeichnung "Transkriptionsterminator", wie sie hierin verwendet wird, kann definiert werden als eine Stelle entlang der DNA-Matrize, an der die Freisetzungsrate eines RNA-Transkripts größer ist, als die Anfügungsrate des nächsten Nukleotids. In Bakterien werden mindestens drei Typen von Terminationssignalen verwendet: (1) intrinsische Terminatoren oder Rho-unabhängige Terminatoren, (2) Rho-abhängige Terminatoren und (3) persistente RNA-DNA-Hybridterminatoren (Mooney et al., 1998, supra). Solche Transkriptionsterminatoren sind vom Umfang der vorliegenden Erfindung eingeschlossen. Die Bezeichnung „Transkriptionsterminator" umfasst gemäß vorliegender Erfindung auch jede eine Transkriptionstermination auslösende Sequenz, egal ob die Sequenz normalerweise in den Wild-Typ Mikroben auftritt oder nicht, solange diese Sequenzen die Funktion aufweisen, die RNA-Polymeraseaktivität zum Stillstand zu bringen und die Freisetzung eines naszierenden RNA-Transkripts zu verursachen.
Intrinsische Transkriptionsterminatoren sind durch eine etwa 20 bp lange G-C-reiche Sequenz, die eine Stem-Loop- oder Hairpin-Struktur bildet, gekennzeichnet. Diese wird unmittelbar von einem Poly-U-Bereich von wenigstens 3 und üblicherweise etwa 7 bis 9 U-Resten in Richtung des 3'-Endes der terminierten RNA gefolgt (für einen Review-Artikel siehe Richardson et al., in Escherichia coli and Salmonella Cellular and Molecular Biology, Band 1, 2. Ed., Neidhardt et al., Eds., ASM Press, Washington, D.C., 1996, S. 822–848). Eine Vielzahl von intrinsischen, Rho-unabhängigen Transkriptionsterminatoren wurde bislang identifiziert (siehe beispielsweise Carafa et al., J. Mol. Biol. 216: 835–858, 1990; Brendel et al, J. Biomol. Struct. Dynam. 3: 705-723, 1986).
Eine Rho-abhängige Transkriptionstermination erfolgt aufgrund des Bindens des Rho-Proteins an die Rho-Stelle („Rho utilization site") auf dem naszierenden Transkript. Rho-abhängige Terminatoren bestehen aus zwei getrennten sich überlappenden Sequenzen, welche zusammen etwa 150 bis 200 bp der DNA überspannen (Richardson et al., supra). Eine Sequenz bildet die Transkriptionsinitiationsregion, während die andere Sequenz stromaufwärts davon liegt und als Rho-Stelle bezeichnet wird. Die Rho-Stelle scheint die Bindungsstelle für das Rho-Protein zu sein (Id.; Richardson, Biochim. Biophys. Acta 1048: 127–138, 1990). Bislang wurde eine Vielzahl von Rho-abhängigen Transkriptionsterminatoren identifiziert (siehe beispielsweise Brendel et al., supra; Zalatan et al., J. Biol. Chem. 268: 17051–17056, 1993).
Bevorzugte Transkriptionsterminatoren sind intrinsische, Rho-unabhängige Terminatoren, umfassend rrnB 5s rRNA T1T2, trpA, T4 Gen 32, T4 iplll Gen und rrfG 5S rRNA.
In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, mehr als einen Transkriptionsterminator zu verwenden. Da ein Transkriptionsterminator lediglich vorzugsweise zu einer Freisetzung des RNA-Transkripts anstelle des Anfügens des nächsten Nukleotids führt, werden einige Transkriptionsterminatoren als schwache Transkriptionsterminatoren bezeichnet, da die RNA-Polymerase über die Transkriptionsterminationsstelle hinweg lesen kann. Bei der Verwendung solcher Transkriptionsterminatoren kann es vorteilhaft sein, mehr als einen solchen Terminator hintereinander in die Insertionskassette einzubauen. In anderen Fällen kann es manchmal auch vorteilhaft sein, wenn wenigstens ein Transkriptionsterminator an jedem Ende einer Insertionskassette vorliegt, da die Transkription manchmal von einer bestimmten Promotorstelle ausgehend in jede Richtung erfolgen kann.
Die Bezeichnung "Gen", wie hierin verwendet, bezeichnet die vollständige (in Bezug auf ihre Länge) Nukleinsäuresequenz, was die codierende Sequenz, die wiederum jede beliebige Leitsequenz umfassen kann, und jede beliebige, mit dem Gen assoziierte Regulatorsequenz umfasst. Transkriptionsterminatoren und Kassetten umfassend Transkriptionsterminatoren können an jeder Stelle eines Zielgens insertiert werden.
In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, wenn der Transkriptionsterminator in einer Kassette enthalten ist, die einen codierenden Bereich, wie für einen Reporter und einen Promotor, enthält. Die Promotorinsertion kann jedoch eventuell zu einer Transkription der dem 3'-Ende des Zielgens benachbarten Sequenz führen, was unvorhersehbare Auswirkungen auf die Mikrobe haben kann. In solchen Fällen kann die Kassette einen Transkriptionsterminator beinhalten, wodurch verhindert wird, dass der Promotor die Expression von Genen auf der 3'-Seite der Insertionsstelle auslöst. Solche Insertionskassetten können beispielsweise ein für ein gewünschtes Genprodukt codierendes heterologes Gen enthalten. Häufig ist es vorteilhaft, dass Fremdantigene durch Sequenzen in Plasmidvektoren, die in hohen Kopiezahlen vorliegen können, codiert werden, sodass eine große Menge des Fremdantigens exprimiert wird und eine größere Immunantwort in dem geimpften Individuum ausgelöst wird. Dennoch ist es manchmal bevorzugt, ein ein Fremdantigen codierendes Gen in das bakterielles Chromosom zu insertieren. Einige Fremdantigene repräsentieren beispielsweise Anhängsel, wie Fimbrien, die als Adhäsine dienen und einem Pathogen ermöglichen, sich an einen bestimmten Rezeptor oder an einen bestimmten Zelltyp innerhalb eines Tierwirtes anzulagern. Die Immunantworten gegen solche Fimbrien-Adhäsine sind wirksam, wenn die Antikörper gegen das Fimbrien-Adhäsin die Fähigkeit eines dieses Fimbrien-Adhäsin aufweisenden Mikroorganismus zur Anlagerung an einen Rezeptor auf einer gegebenen Zielzelle blockieren können. So dient die Schutzimmunität gegen Adhäsine als eine sehr wichtige Schutzmaßnahme, wodurch die Fähigkeit der Pathogene, sich an einen Tierwirt anzulagern, in ihn einzudringen und/oder sich in ihm auszubreiten, zerstört wird. Fimbrien-Adhäsine sind jedoch komplexe Strukturen und das Einbringen von Genen, welche für dieselben codieren, in Vektoren mit hoher Kopienzahl führt üblicherweise zur Toxizität und zur Unfähigkeit des rekombinanten Vakzinstammes, gut zu wachsen oder sogar sich in dem Tierwirt auszubreiten. Vielmehr sind solche Vakzinkonstrukte in Bezug auf die Induzierung der gewünschten Immunantwort folglich nicht immunogen. Im Gegensatz dazu tritt eine ausgeprägte Immunantwort jedoch häufig auf, da Fimbrien-Adhäsine hoch immunogen sind, wenn sie durch in dem Chromosom gelegene, codierende Sequenzen erzeugt werden.
In anderen Fällen kann das heterologe Gen für ein Genprodukt codieren, das zur Regulation anderer Gene innerhalb der Mikrobe dient. Solch ein Konstrukt wurde durch Curtiss et al. (WO1996/US/09774) zur Verwendung für die Herstellung von Mikroben mit einem von Umweltbedingungen abhängigen Lebensfähigkeitssystem offenbart. Die offenbarten mutierten Mikroorganismen wurden mit einer Deletion in dem chromosomalen asd-Gen und einer Insertionssequenz im Bereich des chromosomalen asd-Gens hergestellt. Die insertierte Sequenz enthielt die codierende Sequenz für Regulatorgene, die als Aktivatoren oder Repressoren anderer Gene dienten, welche die Synthese von essenziellen Genprodukten oder letalen Genprodukten, die durch ein innerhalb der Mikrobe vorliegendes Plasmid codiert werden, steuern. In solchen von Umweltbedingungen abhängigen Lebensfähigkeitssystemen überlebt der Stamm unter toleranten Bedingungen durch Expression von essenziellen Genen und Nichtexpression von letalen Genen. Unter nicht toleranten Bedingungen erfolgt das Einstellen der Expression von essenziellen Genen und/oder das Anschalten der Expression von letalen Genen. Als Ergebnis davon stirbt der Stamm in der nicht toleranten Umgebung, wie beispielsweise außerhalb des Wirtstieres in ausgeschiedenem Kot. Solche Mikroben weisen demzufolge ein von Umweltbedingungen abhängiges Lebensfähigkeitssystem auf. Die in das chromosomale asd-Gen insertierte Sequenz enthielt Promotoren, die unidirektional oder bidirektional sein konnten, als auch Transkriptionsterminatoren (siehe beispielsweise WO1996/US/09774, 4, 8, 11 und 13). Für bidirektionale Promotoren ist es auch vorteilhaft, Transkriptionsterminatoren auf beiden Seiten der insertierten Promotorsequenz, welche mit einem codierenden Bereich verknüpft ist, einzubringen, um einer Transkription in beide Richtungen außerhalb der Grenzen des Inserts vorzubeugen. Dies verhindert eine Transkription auf beiden Seiten des Promotors.
In einigen Fällen kann es vorteilhaft sein, wenn ein Transkriptionsterminator in einer Insertionskassette, die eine Reportergensequenz enthält, welche mit einer Promotorsequenz verknüpft ist, enthalten ist. Eine solche Verwendung eines Reportergeninserts im Bereich eines deletierten Gens kann eine einfache Unterscheidung zwischen den Vakzinstämmen und dem Wild-Typ Pathogen ermöglichen. Beispielsweise kann das xylE-Reportergen in ein mutiertes chromosomales Gen insertiert werden, um die Komplementierung spezieller mutationsbedingter Veränderungen zu bestimmen und die Existenz sowohl des auf einem Plasmid mit geringer Kopienzahl vorliegenden Wild-Typ Allels als auch des in dem Chromosom vorliegenden mutierten Allels zu bestätigen. Kolonien von Bakterien, die das xylE-Gen exprimieren, werden gelb, wenn sie mit einer Catechin-Lösung besprüht werden. Die Expression einer xylE-Kassette ohne einen Promotor kann in Abhängigkeit von der Art, auf welche das spezielle Gen, in das die xylE-Kassette insertiert wurde, infolge von Stimuli der Umgebung reguliert wird, variieren. Die Einbeziehung eines starken Promotors in die Kassette führt zu einer konstitutiven Expression des xylE-Gens. Aufgrund der Stärke des insertierten Promotors kann die RNA-Transkription jedoch möglicherweise bis über die Insertion hinaus reichen. Um dies zu verhindern, kann ein Transkriptionsterminator nach dem C-terminalen codierenden Bereich des Reportergens insertiert werden. So macht die Insertion einer Kassette, enthaltend einen Promotor in einem chromosomalen Gen, in diesem Fall auch die weitere Insertion eines Transkriptionsterminators erforderlich.
Es kann manchmal auch vorteilhaft sein, codierende Sequenzen, welche Regulatorsequenzen, die entweder als Aktivatoren oder Repressoren der Genexpression dienen, exprimieren können, in den Bereich einer Deletionsmutation zu insertieren, um die Eigenschaften der anderen Gene innerhalb der Zelle auf eine vorteilhafte Weise zu beeinflussen. Ein Transkriptionsterminator kann vorteilhafterweise in solche Insertionssequenzen eingebaut werden, um sicherzustellen, dass weder die deletierte noch die insertierte Sequenz die Expression benachbarter Gene beeinflusst.
In anderen Fällen kann die Einbeziehung eines Transkriptionsterminators in eine Insertionssequenz zur Regulation einer stromabwärts gelegenen Genexpression in einem Operon dienen. Dies stellt einen einmaligen Ansatz dar, um die Expression eines oder mehrerer Gene stromabwärts der Insertionsstelle zu verhindern und in den Fällen, in denen das stromabwärts gelegene Gen oder die stromabwärts gelegenen Gene für Genprodukte, die in die Biosynthese oder die Virulenz verwickelt sind, oder für Regulatorgenprodukte codieren, attenuieren solche Insertionen die Mikrobe, ohne die codierende Sequenz des stromabwärts gelegenen Genprodukts zu verändern.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind die Bakterienstämme attenuierte Derivate eines pathogenen Stammes. Mit der Bezeichnung "Derivat" oder "abgeleiteter Stamm" wird ein Stamm bezeichnet, der in Bezug auf seine Elternform, von der er abstammt, genetisch modifiziert wurde. Mit der Bezeichnung "pathogen" wird eine Mikrobe bezeichnet, die eine Erkrankung verursachen oder eine normale physiologische Funktion beeinträchtigen kann. Ein Verweis auf die Bezeichnung "Attenuierung" bedeutet, dass ein bestimmter Mikrobenstamm nicht die gesamte Folge der Symptome des Krankheitszustands, welche üblicherweise mit dem virulenten pathogenen Gegenstück verbunden sind, auslösen kann. Demzufolge umfasst der Begriff "Attenuierung" einen Zustand verminderter Virulenz oder verminderter Fähigkeit, die Krankheitssymptome zu entwickeln, und die attenuierten Mikroorganismen haben nicht jegliche Fähigkeit notwendigerweise vollständig verloren, die normalen physiologischen Funktionen des Wirts zu beeinträchtigen. Ferner ist eine attenuierte Mikrobe nicht notwendigerweise vollständig unfähig, jemals wieder als Pathogen zu wirken, jedoch ist die verwendete spezielle Mikrobe im Hinblick auf ein bestimmtes zu behandelndes Individuum attenuiert.
Die Bakterienstämme der vorliegenden Erfindung sind aufgrund des Vorhandenseins einer attenuierenden insertionellen Mutation, umfassend einen Transkriptionsterminator, in einem oder mehreren Genen, welche die Mikroorganismen attenuiert, attenuiert. In einer Ausführungsform weisen die Stämme wenigstens zwei attenuierende Mutationen, von denen wenigstens eine einen Transkriptionsterminator umfasst, auf. Jede der Mutationen führt zu einer Attenuierung der Mikroorganismen und in Kombination miteinander erhöhen sie die Wahrscheinlichkeit, dass die Mikroorganismen nicht zur Wild-Typ Virulenz zurückkehren, erheblich. Attenuierende Mutationen können in Biosynthesegenen, Regulatorgenen und/oder in die Virulenz nach sich ziehenden Genen vorliegen (siehe Doggett und Brown, in Mucosal Vaccines, Kiyono et al., Eds., Academic Press, San Diego, 1996, S. 105–118). Beispiele von Mutationen umfassen eine Mutation in einem pab-Gen, einem pur-Gen, einem aro-Gen, asd, einem dap-Gen, nadA, pncB, galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, rfc, poxR, galU und Kombinationen derselben, sind jedoch nicht darauf beschränkt. Der Fachmann wird leicht verstehen, dass jede geeignete Genmutation im Rahmen der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann, solange die Mutation des Gens zu einer Attenuierung der Mikroorganismen führt.
Die Transkriptionsterminatorinsertion kann durch zusätzliche mutagene Veränderungen in dem Zielgen begleitet sein. Demzufolge kann eine Transkriptionsterminatorinsertion in einem Gen, in dem ein oder mehrere Basenpaarveränderungen durchgeführt wurden, oder einem Gen, das einer Deletion, einem Frameshift oder dgl. ausgesetzt ist, erfolgen. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist in dem Gen eine definierte Deletion erfolgt, die eine Deletion des codierenden Bereichs, eine Deletion des Regulatorbereichs für dieses Gen oder eine Deletion des gesamten Gens, umfassend die Regulatorbereiche, sein kann. In solchen Fällen, in denen das Gen vollständig deletiert wurde, wird der Transkriptionsterminator an der Stelle des Gens insertiert, an der das Gen normalerweise vorliegen würde.
Definierte Deletionen sind spezifische Deletionen in Genen, die unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren erzeugt werden können. Diese Verfahren umfassen das anfängliche Auswählen eines Gens, in dem die Deletion erzeugt werden soll. Gemäß einem Ansatz kann das Gen aus einer kommerziell erhältlichen oder erzeugten Genbank unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren ausgewählt sein (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Ed., 1989, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N.Y.). Die das Gen enthaltenden Klone werden durch Komplementierung eines Stranges, der eine Mutation in demselben Gen enthält, aus der Genbank isoliert. Ist die DNA-Sequenz des Gens bekannt, können andererseits ausgewählte Primer für die Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendet werden , um das Gens häufig mit einigen flankierenden Sequenzbereichen aus einer Bakterienprobe oder aus einer Probe aufgereinigter genomischer DNA zu amplifizieren und das PCR-Produkt kann in einen Klonierungsvektor insertiert werden.
Eine spezifische Deletion in dem ausgewählten Gen kann durch zwei allgemeine Verfahren erzeugt werden. Das erste Verfahren erzeugt eine Mutation in einem Gen, das aus einer Population von Klonen aus einer genomischen DNA-Bank isoliert wurde, unter Verwendung von Restriktionsenzymen, und das zweite Verfahren erzeugt die Mutation in einem Gen bekannter Sequenz unter Verwendung von PCR.
Bei dem ersten Verfahren wird die Position des Gens auf einem Vektor unter Verwendung einer Transposonmarkierung identifiziert und eine Restriktionskarte der rekombinanten DNA in dem Vektor wird erzeugt. Die aus der Transposonmarkierung erhaltene Information ermöglicht, dass ein vollständiges Gen oder ein Teil eines Gens unter Verwendung von bekannten Restriktionsschnittstellen aus dem Vektor ausgeschnitten wird.
Das zweite Verfahren, welches auf der PCR-Technologie basiert, kann verwendet werden, wenn die DNA-Sequenz des Gens bekannt ist. Gemäß diesem Verfahren amplifizieren divergente PCR-Primer die stromaufwärts und stromabwärts gelegenen, ein bestimmtes aus dem Gen zu deletierendes DNA-Segment flankierenden Bereiche und erzeugen ein PCR-Produkt, welches aus dem Klonierungsvektor und flankierenden stromaufwärts und stromabwärts gelegenen Nukleotidsequenzen besteht (Innes et al., Eds., PCR Protocols, 1990, Academic Press, New York). Bei einer Variante dieses Verfahrens werden PCR-Produkte erzeugt, die Bereiche des Gens oder flankierende Sequenzen darstellen und in einem Klonierungsvektor miteinander verbunden werden.
Die das mutierte Gen enthaltende DNA kann durch Transformation mittels chemischer Mittel oder Elektroporation, durch rekombinante Phageninfektion oder durch Konjugation in den bakteriellen Wirt eingebracht werden. In bevorzugten Ausführungsformen wird das mutierte Gen in die Chromosomen der Bakterien eingebracht, was durch eine Vielzahl im Stand der Technik bekannter Verfahren erfolgen kann, wie beispielsweise Verfahren, die temperaturempfindliche Replikons verwenden (Hamilton of al., J. Bacteriol. 171: 4617–4622, 1989), Verfahren, die eine lineare Transformation von recBC-Mutanten verwenden (Jasin et al., J. Bacteriol. 159: 783–886, 1984) oder Verfahren, die Wirt-restriktierte Replikons, bekannt als Suizidvektoren, verwenden (Miller et al., J. Bacteriol. 170: 2575–2584, 1988). Das jeweilige verwendete Verfahren wird mit einem geeigneten Gegenselektionsverfahren, wie beispielsweise einer Fusarsäureresistenz oder Sucroseresistenz gekoppelt, das von einem nachfolgenden Screenen nach Klonen, die das mutierte Allel enthalten, basierend auf phenotypischen Merkmalen, oder dem Verwenden eines PCR-, Nukleinsäurehybridisierungs- oder immunologischen Verfahrens gefolgt ist.
Die mutierten attenuierten Mikroben der vorliegenden Erfindung können in der Form von Vakzinen verwendet werden, um rekombinante Antigene an Wirbeltierwirte zu liefern. Es ist damit offensichtlich, dass die vorliegende Erfindung eine breite Anwendbarkeit in Bezug auf die Entwicklung von wirksamen, rekombinanten Vakzinen gegenüber Bakterien-, Pilz-, Parasiten- oder Virenkrankheitserregern, bei denen eine lokale Immunität wichtig ist und eine erste Verteidigungslinie darstellt, besitzt. Einige Beispiele sind rekombinante Vakzine zur Bekämpfung von durch Yersinia pestis verursachte Beulenpest, durch Neisseria gonorrhea verursachte Gonorrhö, durch Treponema palladium verursachte Syphilis und durch Chlamydia trachomatis verursachte Geschlechtskrankheiten als auch Augeninfektionen. Die Spezies von Streptococcus der Gruppe A als auch der Gruppe B, wie beispielsweise diejenigen Spezies, die Halsschmerzen oder Herzkrankheiten verursachen, Neisseria meningitides, Mycoplasma pneumoniae, Haemophilus influenzae, Bordetella pertussis, Mycobacterium tuberculosis, Mycobacterium leprae, Streptococcus pneumoniae, Brucella abortus, Vibrio cholerae, Sphigella species, Legionella pneumophila, Borrelia burgdorferi, Rickettsia species, Pseudomonas aeruginosa und pathogene E. coli Stämme, wie APEC, ETEC, EPEC, UTEC, EHEC und EIEC, sind zusätzliche Beispiele von erfindungsgemäßen Mikroben, aus denen Gene erhalten werden können. Rekombinante antivirale Vakzine, wie beispielsweise diejenigen, die gegen Influenza-Viren erzeugt wurden, sind auch von der vorliegenden Erfindung umfasst. Rekombinante antivirale Vakzine können auch gegen Viren, umfassend RNA-Viren, wie Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae oder Retroviridae, oder DNA-Viren, wie Hepadnaviridae, Paroviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae oder Poxviridae, erzeugt werden. Rekombinante Vakzine, um gegen Infektionen durch pathogene Pilze, Protozoen oder Parasiten zu schützen, sind auch von dieser Erfindung umfasst.
Demzufolge kann die vorliegende Erfindung in einer Anzahl von Ausführungsformen als Vakzin zur Immunisierung eines Menschen, umfassend ein attenuiertes Lebendderivat einer pathogenen Mikrobe, beschrieben werden, wobei das Derivat eine Transkriptionsterminatorinsertion in einem Zielgen enthält, um die Expression dieses Gens abzuschwächen oder aufzuheben und die Mikrobe zu attenuieren, als auch die Expression von Sequenzen stromabwärts des Zielgens zu verhindern. Die attenuierte Mikrobe ist auch zur Expression eines rekombinanten, von einem Organismus abgeleiteten Gens fähig, das ein Pathogen für einen Menschen oder ein Tier darstellt oder ein Allergen bei einem Menschen oder einem Tier erzeugt. In Ausführungsformen, in denen die immunogene Komponente des Vakzins ein Allergen des Wirts ist, kann solch ein Vakzin in einer speziell für die Desensibilisierung eines allergischen Wirts entwickelten Expositionstherapie verwendet werden. In anderen Ausführungsformen exprimierte das rekombinante Gen ein gametspezifisches Antigen, das eine Immunantwort auslösen kann, welche dem immunisierten Individuum eine fruchtbarkeitshemmende Wirkung verleiht (siehe U.S. Patent Nr. 5,656,488).
Die erfindungsgemäßen attenuierten Mikroben können zusätzlich als Vektoren für die Synthese verschiedener Wirtsproteine verwendet werden. Da die erfindungsgemäßen nichtvirulenten Mikroben nach der Einbringung in den Wirt eine Vielzahl von immunokompetenten Strukturen durchdringen können, wie das Darm-assoziierte Lymphgewebe (GALT), die Mesenteriallymphdrüsen und die Milz, können solche Mikroben für eine Vielzahl immunoregulatorischer Produkte verwendet werden. Demzufolge können ein oder mehrere für immunoregulatorische Proteine oder Peptide codierende Gene rekombinant in die attenuierte Mikrobe eingebracht werden, sodass die Mikroben, wenn sie sich in dem entsprechenden immunokompetenten Gewebe niederlassen, zur Expression des rekombinanten Produkts fähig sind, um die Immunantwort in dem Wirt zu unterdrücken, zu steigern oder zu modifizieren. Beispiele von immunoregulatorischen Molekülen umfassen Kolonien-stimulierende Faktoren (Makrophagen, Granulocyten oder gemischt), Makrophagenchemotoxin, Makrophageninhibitionsfaktor, Leukozyteninhibitionsfaktor, Lymphotoxine, blastogener Faktor, Interferon, Interleukine, Tumornekrosefaktor, Cytokine und Lymphokine, sind jedoch nicht darauf beschränkt.
Die erfindungsgemäßen attenuierten Mikroben sind auch dazu gedacht, pharmakologisch wirksame Produkte, welche verschiedene physiologische Funktionen (d.h. Wachstumsrate, Blutdruck, etc.) stimulieren oder unterdrücken können, zu liefern oder zu erzeugen. In solchen Mikroben codiert das rekombinante Gen diese pharmakologisch wirksamen Produkte.
Das rekombinante Gen der erfindungsgemäßen Mikroben kann in ein "im Gleichgewicht befindliches letales" System eingebracht werden, das selektiv für Mikroorganismen ist, die das rekombinante Gen enthalten und zur Expression des rekombinanten Gens fähig sind, wobei das Überleben der Mikroorganismen an die Gegenwart des rekombinanten Gens geknüpft ist. "Im Gleichgewicht befindliche letale" Mutanten dieser Art sind durch das Fehlen eines funktionierenden nativen chromosomalen Gens, welches für ein Enzym codiert, das für das Überleben der Zellen wesentlich ist, vorzugsweise ein Enzym, das einen Schritt in der Diaminopimelinsäure (DAP)-Biosynthese katalysiert, und mehr bevorzugt ein Gen, das für die Beta-Aspartatsemialdehyddehydrogenase (Asd) codiert, gekennzeichnet. Die Enzyme des DAP-Signalwegs und Asd sind für die Zellwandsynthese erforderlich. Die Mutanten enthalten auch ein erstes rekombinantes Gen, das das nicht funktionierende chromosomale Gen ersetzen kann und dieses erste rekombinante Gen ist strukturell mit einem zweiten rekombinanten Gen, das für das gewünschte Produkt codiert, verbunden. Der Verlust der Komplementierung rekombinanter Gene veranlasst die Zelle, durch Lyse zu sterben, wenn sich die Zellen in einer Umgebung befinden, in der DAP fehlt. Diese Strategie ist besonders nützlich, da DAP in Eukaryoten nicht synthetisiert wird und daher in immunisiertem Wirtsgewebe nicht vorliegt. Verfahren zur Herstellung dieser Arten von "im Gleichgewicht befindlichen letalen" Mikroben sind in dem U.S. Patent Nr. 5,672,345 beschrieben.
Mit der Bezeichnung "immunogenes Mittel" wird ein Mittel bezeichnet, das verwendet wird, um das Immunsystem eines Individuums zu stimulieren, sodass ein oder mehrere Funktionen des Immunsystems verstärkt werden und gegen das Immunogene Mittel gerichtet werden. Immunogene Mittel umfassen Vakzine. Immunogene Mittel können bei der Herstellung von Antikörpern, sowohl isolierten polyklonalen Antikörpern als auch monoklonalen Antikörpern, unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren verwendet werden.
Mit der Bezeichnung "Antigen" oder "Immunogen" wird ein Molekül bezeichnet, das ein oder mehrere Epitope enthält, die ein Wirtsimmunsystem stimulieren können, um eine für das Antigen spezifische sekretorische, humorale und/oder zelluläre Immunantwort auszulösen.
Ein Epitop kann eine Stelle auf einem Antigen sein, an welche ein Antikörper, der für diese Stelle spezifisch ist, bindet. Ein Epitop kann drei Aminosäuren in einer räumlichen Konformation, die einzigartig für das Epitop ist, umfassen. Im Allgemeinen besteht ein Epitop aus wenigstens 5 Aminosäuren und besonders bevorzugt wenigstens 8 bis 10 Aminosäuren. Die Bezeichnung "Epitop" ist mit der hierin verwendeten Bezeichnung "antigene Determinante" austauschbar. Die Bezeichnung "Epitop" umfasst auch T-Helferzellepitope, bei denen eine antigene Determinante durch Assoziation mit Haupt-Histokompatibilitäts-Komplex-Klasse II-Molekülen von T-Helferzellen erkannt wird. Ferner umfasst die Bezeichnung „Epitop" jedes Antigen, jedes Epitop oder jede antigene Determinante, welche(s), wenn sie (es) durch ein MHC-Klasse I-Molekül auf der Oberfläche einer Antigen-präsentierenden Zelle präsentiert wird, durch cytotoxische T-Zellen erkannt wird. Ein cytotoxisches T-Zellepitop kann eine Aminosäuresequenz von etwa 6 bis etwa 11 Aminosäuren und vorzugsweise eine Sequenz von 8 oder 9 Aminosäuren umfassen.
Die Bezeichnung "Vakzin" bezeichnet ein Mittel, das verwendet wird, um das Immunsystem eines Individuums zu stimulieren, sodass Schutz gegen ein Antigen, das nicht als Selbst-Antigen durch das Immunsystem erkannt wird, erzeugt wird. Die Bezeichnung "Immunisierung" betrifft den Vorgang des Induzierens einer fortwährend hohen Konzentration eines Antikörpers und/oder einer fortwährend zellulären Immunantwort, bei der T-Lymphozyten entweder das Pathogen in einem Individuum töten und/oder andere Zellen (z.B. Phagozyten) in dem Individuum aktivieren, um dies zu tun, wobei das Individuum einem Pathogen oder Antigen ausgesetzt wurde, gegenüber welchem der Organismus bereits früher ausgesetzt war. Obwohl die Bezeichnung "Immunsystem" die Antworten einzelliger Organismen auf die Gegenwart von Fremdkörpern umfassen kann, bezieht sich die Bezeichnung in der vorliegenden Anmeldung auf anatomische Merkmale und Mechanismen, durch welche ein Individuum Antikörper gegen antigenes Material, welches in die Zellen des Individuums oder in die extrazelluläre Flüssigkeit des Individuums eindringt, erzeugt und umfasst auch zelluläre Immunantworten. Im Falle einer Antikörperproduktion können die so produzierten Antikörper zu jeder immunologischen Klasse gehören, wie beispielsweise Immunoglobuline A, D, E, G oder M. Von besonderem Interesse sind Vakzine, die die Produktion von Immunoglobulin A (IgA) stimulieren, da dies das von dem sekretorischen System von Warmblütern produzierte Hauptimmunoglobulin ist, obwohl erfindungsgemäße Vakzine nicht auf solche begrenzt sind, welche die IgA-Produktion stimulieren. Vakzine der hier beschriebenen Art erzeugen beispielsweise zusätzlich zu der IgA-Bildung einen großen Bereich anderer Immunantworten, wie beispielsweise zelluläre und humorale Immunität. Immunantworten auf Antigene sind gut untersucht und es wurde viel darüber berichtet. Ein Überblick über die Immunologie befindet sich in Elgert, Klaus D., Immunology, Wiley Liss, Inc., (1996), Stites et al., Basic & Clinical Immunology, 7. Ed., Appleton & Lange, (1991), auf deren Gesamtinhalt hierin Bezug genommen wird.
Ein ein erfindungsgemäßes Vakzin oder eine erfindungsgemäße Träger-Mikrobe erhaltendes Individuum umfasst Wirbeltiere, wie Fische, Amphibien, Reptilien, Vögel und Säugetiere. Alle Wirbeltiere weisen ein funktionierendes Immunsystem auf und reagieren auf Antigene durch die Produktion von Antikörpern, sodass alle Wirbeltiere zu einer Antwort auf die Vakzine fähig sind. Besonders bevorzugte Individuen sind Säugetiere, wie Menschen, Hunde, Katzen, Schweine, Kühe und dgl. Fische und Vögel werden üblicherweise auch kommerziell gezüchtet und die Zusammensetzungen und Verfahren dieser Erfindung können auch vorteilhafterweise bei Fischen und Vögeln angewendet werden.
Die Bezeichnung "Mikroben", wie hierin verwendet, umfasst Bakterien, Protozoen und einzellige Pilze. Die Bezeichnung "Parasit", wie hierin verwendet, umfasst sowohl Endoparasiten als auch Ectoparasiten, was Protozoen, wie die Spezies von Plasmodium und Toxoplasma, die Spezies von Entamoeba, Leishmania und Trypanosoma, und Würmer, wie Trematoden, Cestoden und Nematoden, als auch Milben, Zecken und Flöhe einschließt. Die Bezeichnung "Viren", wie hierin verwendet, kann RNA-Viren, wie Picornaviridae, Caliciviridae, Togaviridae, Flaviviridae, Coronaviridae, Rhabdoviridae, Filoviridae, Paramyxoviridae, Orthomyxoviridae, Bunyaviridae, Arenaviridae, Reoviridae und Retroviridae, und DNA-Viren, wie Hepadnaviridae, Paroviridae, Papovaviridae, Adenoviridae, Herpesviridae und Poxviridae, umfassen.
Die Bezeichnung „rekombinantes Gen" soll genetisches Material umfassen, das von einem ersten Organismus in einen zweiten Organismus transferiert wird, welcher durch Reproduktion Abkömmlinge erzeugt, die das gleiche genetische Material enthalten. Im Allgemeinen findet der Austausch von genetischem Material zwischen dem ersten Organismus und dem zweiten Organismus in der Natur nicht statt. Die Bezeichnung "rekombinantes Gen", wie hierin verwendet, bezeichnet durch menschliches Eingreifen in eine Mikrobe inkorporiertes genetisches Material.
Die Bezeichnung "Gen", wie hierin verwendet, bezeichnet in ihrer breitesten Bedeutung jede vererbbare biologische Einheit. Es ist jedoch nicht erforderlich, dass das rekombinante Gen ein vollständiges Gen ist, das in dem elterlichen Organismus vorliegt, wo es zur Produktion oder Regulierung der Produktion eines Makromoleküls, wie beispielsweise eines funktionsfähigen Polypeptids, fähig ist. Das rekombinante Gen kann demzufolge für ein vollständiges antigenes Produkt oder ein Teil davon codieren. Ferner kann das rekombinante Gen auch DNA-Sequenzen, die als Promotoren, Enhancer oder Terminatoren dienen, und DNA-Sequenzen, die für Repressoren oder Aktivatoren codieren, welche die Expression eines rekombinanten Gens, das für ein vollständiges Antigen oder ein Teil davon codiert, regulieren, umfassen. Ein rekombinantes Gen kann auch Genfusionen umfassen, die für Polypeptidfusionsprodukte codieren. Das codierte Genprodukt kann demzufolge eines sein, das genau in dieser Form in dem elterlichen Organismus nicht vorliegt. Beispielsweise kann ein funktionelles Gen, das für ein Polypeptidantigen mit 100 Aminosäureresten codiert, teilweise in eine Träger-Mikrobe transferiert werden, sodass ein Peptid umfassend lediglich 75 oder sogar nur 10 Aminosäurereste durch die zellulären Mechanismen der Wirtszelle erzeugt wird. Dient dieses Genprodukt jedoch als Antigen, um Antikörper gegen ein ähnliches in dem elterlichen Organismus vorliegendes Antigen zu erzeugen, oder als T-Zellepitop, welches durch T-Helferzellen erkannt wird, so wird das Gen vom Umfang der in der vorliegenden Erfindung definierten Bezeichnung "Gen" umfasst. Ist andererseits die Aminosäuresequenz eines bestimmten Antigens oder Fragments davon bekannt, ist es möglich, das DNA-Fragment oder Analog davon durch automatisierte Gensynthesizer oder dgl. chemische zu synthetisieren und diese DNA-Sequenz in den entsprechenden Expressionsvektor einzubringen. Dies kann vorteilhaft sein, wenn Codons verwendet werden sollen, die bevorzugte Codons im Hinblick auf eine starke Expression in Salmonella darstellen. Ferner umfasst ist auch ein langer DNA-Abschnitt, der für mehrere Genprodukte codiert, von denen eines oder alle antigen sind. Solch ein langer DNA-Abschnitt kann beispielsweise für 5 bis 15 der für die Synthese von Fimbrien-Antigenen (Fimbriae) notwendigen Proteine codieren, welche die Adhäsion von Pathogenen an Wirtszellen vermitteln (Baumler et al., supra). Die Induktion einer Immunantwort gegen Fimbriae kann Schutz gegen das Pathogen vermitteln. Demzufolge ist ein hierin definiertes und beanspruchtes Gen jede vererbbare zur Erzeugung eines Antigens fähige Einheit. Das Gen kann von chromosomalem, von Plasmid- oder viralem Ursprung sein. Es ist selbstverständlich, dass die Bezeichnung "Gen", wie hierin verwendet, DNA-Moleküle ohne Introns, wie beispielsweise im Falle von cDNA-Molekülen, umfasst, solange die DNA-Sequenz das gewünschte Genprodukt codiert.
Damit das Gen wirksam eine Immunantwort auslösen kann, muss es exprimiert werden. Die Bezeichnung "Expression eines Gens" bedeutet, dass die in der Struktur des Gens (der Sequenz aus DNA-Basen) innewohnende Information durch die biochemischen Mechanismen der Zelle, in der das Gen vorliegt, in ein physikalisches Produkt in der Form eines RNA-Moleküls, Polypeptids oder eines anderen biologischen Moleküls umgewandelt wird. Das so erzeugte biologische Molekül wird als Genprodukt bezeichnet. Die Bezeichnung "Genprodukt", wie hierin verwendet, bezeichnet jedes biologische Produkt oder Produkte, welche als Ergebnis der unter der Kontrolle eines Gens auftretenden biochemischen Reaktionen erzeugt werden. Das Genprodukt kann beispielsweise ein RNA-Molekül, ein Peptid oder ein unter der Kontrolle eines Enzyms oder eines anderen Moleküls, das das anfängliche Produkt des Gens ist, d.h. eines metabolischen Produkts, erzeugtes Produkt sein. Ein Gen kann beispielsweise zunächst die Synthese eines RNA-Moleküls kontrollieren, das durch Ribozyme in ein Enzym translatiert wird, welches die Bildung von Glycanen in der Umgebung außerhalb der ursprünglichen Zelle, in der das Gen vorgefunden wurde, kontrolliert. Das RNA-Molekül, das Enzym und das Glycan sind Genprodukte gemäß der Definition der vorliegenden Erfindung. All diese als auch viele andere Arten von Genprodukten, wie Glycoproteine, Glycolipide oder Polysaccharide, können, wenn sie in das Immunsystem eines Individuums eingebracht werden, als Antigene wirken. Proteingenprodukte, umfassend Glycoproteine und Lipoproteine, sind im Hinblick auf die Verwendung als Antigene in Vakzinen bevorzugte Genprodukte.
Damit ein Vakzin eine zelluläre Immunität erzeugen oder Antikörper produzieren kann, muss das antigene Material freigesetzt und/oder auf eine Art und Weise präsentiert werden, die die Induktion einer zellulären Immunität und/oder die Induktion des Antikörper-produzierenden Mechanismus in dem geimpften Individuum auslöst. Daher muss die Träger-Mikrobe mit dem Genprodukt in das Individuum eingebracht werden. Um die bevorzugte Antwort des Darm-assoziierten Lymphgewebes (GALT) oder des Bronchien-assoziierten Lymphgewebes (BALT) zu stimulieren, ist es bevorzugt, dass das Einbringen der Mikrobe oder des Genprodukts direkt in den Darm oder die Bronchien erfolgt, wie beispielsweise durch orale Verabreichung, durch Magenintubation oder durch intranasale Verabreichung mittels Aerosolen, obwohl andere Verfahren zur Verabreichung des Vakzins, wie intravenöse, intraperitoneale, intramuskuläre und subkutane Injektion oder intramammäre oder intrapeniale oder vaginale oder rektale Verabreichung, möglich sind.
Die avirulente Mikrobe kann als Träger-Mikrobe, beispielsweise für ein Antigen, verwendet werden und wenn die Träger-Mikrobe in dem Individuum vorliegt, muss das Antigen für das Immunsystem des Individuums verfügbar gemacht werden. Dies kann erreicht werden, indem die Träger-Mikrobe stirbt, sodass die Antigenmoleküle freigelassen werden. Natürlich ist die Verwendung von "undichten" avirulenten Mutanten, welche den Inhalt des Periplasmas ohne Lyse freisetzen, ebenfalls möglich. Alternativ dazu kann ein Gen ausgewählt werden, das die Produktion eines Antigens kontrolliert, welches durch die Träger-Zelle vor dem Absterben der Zelle in der Umgebung außerhalb der Zelle verfügbar gemacht wird. Auf diese Art und Weise ist es möglich, eine lebensfähige Mikrobe zu verwenden, die in dem geimpften Individuum, beispielsweise in dessen Peyer'schen Plaques oder einen anderen GALT, fortbesteht und weiter Antigen produziert, wodurch die Antikörperbildung und/oder eine zelluläre Immunantwort kontinuierlich induziert wird. Ein bevorzugtes Genprodukt ist unter diesen Bedingungen ein Produkt, das durch die Zellmembran der avirulenten Träger-Mikrobe in die externe Umgebung transferiert wird, oder ein Produkt, das an die externe Membran angelagert oder in diese eingebettet wird, sodass das vollständige oder ein Teil des Genprodukts der Umgebung ausgesetzt ist. Typische Vertreter dieser letzten Art von Genprodukten sind Antigene, die üblicherweise auf der Oberfläche von Organismen, gegen welche ein Schutz gewünscht wird, vorgefunden werden. Werden diese Antigene auf eine herkömmliche Art und Weise zu der bakteriellen Zelloberfläche transportiert, wird die Antikörperbildung gegen diese Antigene verstärkt.
Die Verwendung von Pathogenen, um Antigene aus anderen Pathogenen dem GALT oder BALT zuzuführen, wäre unangebracht, wenn sie nicht dem Zweck dienen würde, solche Pathogene avirulent zu machen, während ihre Fähigkeit, sich in diesen Geweben auszubreiten, beibehalten wird.
Der Organismus, aus welchem das rekombinante Gen stammt, kann jedes Pathogen oder ein Organismus, der ein Allergen oder ein anderes Antigen produziert, gegen das ein Mensch oder ein Tier, wie ein Hund oder eine Katze, anfällig ist, sein. Allergene sind Substanzen, welche eine allergische Reaktion, gegenüber der das Individuum geimpft werden kann, hervorrufen. Viele verschiedene Materialien können Allergene darstellen, wie Tierhautschuppen und Pollen, und die allergene Reaktion der Individuen wird abhängig von dem speziellen Allergen variieren. Es ist möglich, in einem Individuum, das üblicherweise eine allergische Antwort zeigt, eine Toleranz gegenüber dem Allergen zu erzeugen. Die Verfahren zur Erzeugung einer Toleranz sind gut bekannt und umfassen üblicherweise das Verabreichen des Allergens an das Individuum in zunehmenden Dosen. Eine weitere Erörterung der Erzeugung einer Toleranz ist in dem zuvor zitierten Lehrbuch von Barrett enthalten. Schließlich kann das Wirtsindividuum selbst als Quelle für das genetische Material dienen, wenn immunoregulatorische Gene oder Gene für andere pharmakologisch wirksame Substanzen durch die Vektoren exprimiert werden.
Die Verabreichung eines Lebendvakzins vom oben beschriebenen Typ an ein Individuum kann durch jedes bekannte Verfahren oder durch Standardverfahren erfolgen. Diese umfassen die orale Aufnahme, die Magenintubation oder die Brocho-Nasal-Okular-Zerstäubung. All diese Verfahren ermöglichen, dass das Lebendvakzin die GALT- oder BALT-Zellen leicht erreichen kann und eine Antikörperbildung und Zell-vermittelte Immunität induzieren kann und sind die bevorzugten Verabreichungsmethoden. Andere Verabreichungsmethoden, wie beispielsweise die intravenöse Injektion, die es der Träger-Mikrobe ermöglichen, das Blutsystem des Individuums zu erreichen, sind auch akzeptabel. In anderen Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung, die später beschrieben werden, ist die intravenöse, intramuskuläre oder intramammäre Injektion auch akzeptabel.
Jede herkömmlich verwendete rekombinante DNA-Technik kann zur Herstellung der erfindungsgemäßen attenuierten Mikroben, die zur Expression eines rekombinanten Gens fähig sind, verwendet werden. Nach der Ligation in ein Plasmid, einen Phagen- oder Cosmidvektor können die so erzeugten rekombinanten Moleküle durch verschiedene Mittel, wie Konjugation oder Transformation (Aufnahme nackter DNA aus der externen Umgebung, die durch die Gegenwart verschiedener chemischer Agenzien, wie Calciumionen, artifiziell induziert werden kann), was Elektroporation einschließt, in eine Wirtszelle transferiert werden. Andere Verfahren, wie die Transduktion, sind auch geeignet, bei denen die rekombinante DNA in einem Phagen, wie in transduzierenden Phagen- oder Cosmidvektoren, verpackt vorliegt. Liegt die rekombinante DNA einmal in der Träger-Zelle vor, kann sie als separates autonomes Replikon vorliegen oder kann in das Wirtszellchromosom insertiert werden und zusammen mit dem Chromosom während der Zellteilung reproduziert werden.
Wurde das genetische Material transferiert, werden die das transferierte genetische Material enthaltenden Mikroben ausgewählt.
Die benötigte Impfdosis wird in Abhängigkeit von der Antigenität des Genprodukts variieren und muss nur eine Menge darstellen, die ausreichend ist, um eine Immunantwort zu induzieren. Mithilfe von Routineexperimenten kann die benötigte Menge leicht ermittelt werden. Mehrere Dosen werden erforderlichenfalls benötigt, um das gewünschte Ausmaß des Schutzes zu erzeugen.
Der pharmazeutische Träger oder Arzneimittelträger, in dem das Vakzin suspendiert oder aufgelöst vorliegt, kann jedes Lösungsmittel oder jeder Feststoff oder jedes Einbettmaterial sein, wie beispielsweise ein Lösungsmittel, Feststoff oder Einbettmaterial geeignet zur Herstellung einer lyophilisierten Form des Vakzins. Der Träger ist nicht toxisch für das geimpfte Individuum und ist kompatibel mit dem Mikroorganismus oder dem antigenen Genprodukt. Geeignete pharmazeutische Träger sind im Stand der Technik bekannt und umfassen beispielsweise flüssige Träger, wie normale Kochsalzlösung und andere nicht-toxische Salze bei oder nahe der physiologischen Konzentration, und feste Träger, wie Talk oder Sucrose.
Gelatinekapseln können als Träger für lyophilisierte Vakzine dienen. Zusatzstoffe können zugegeben werden, um die Antigenität zu erhöhen, falls dies gewünscht ist. Erfolgt die Verabreichung über die Bronchien, so liegt das Vakzin vorzugsweise in der Form eines Aerosols vor. Geeignete pharmazeutische Träger- und Zusatzstoffe und die Herstellung von Verabreichungsformen sind beispielsweise in Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Edition (Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa., 1985) beschrieben.
Eine Immunisierung eines Individuums mit einem von einem Pathogen stammenden Genprodukt kann auch in Verbindung mit einer Vorimmunisierung mit dem avirulenten Derivat eines pathogenen Mikroorganismus, der als Träger dient, um das durch ein rekombinantes Gen eines Pathogens vorgegebene Genprodukt zu exprimieren, erfolgen. Solch eine parenterale Immunisierung kann als Wiederholungsimpfung dienen, um die Expression der sekretorischen Immunantwort zu verstärken, wenn das sekretorische Immunsystem bereits einmal durch Immunisierung mit der das aus dem Pathogen stammende Genprodukt exprimierenden Träger-Mikrobe, um die Lymphzellen des GALT oder BALT zu stimulieren, gegen das aus dem Pathogen stammende Genprodukt sensibilisiert wurde. Die verstärkte Antwort ist als zweite, Wiederholungsimpfungs- oder anamnestische Antwort bekannt und führt zu einem verlängerten Immunschutz des Wirts. Wiederholungsimpfungen können mit vorteilhaften Ergebnissen mehrere Male wiederholt werden.
Industrielle Anwendbarkeit
Die erfindungsgemäßen Mikroben enthalten attenuierende Mutationen, umfassend eine Insertion wenigstens eines Transkriptionsterminators in ein chromosomales Gen. Die attenuierten Mikroben können als Vakzine und/oder als Zufuhrvehikel für ein gewünschtes Genprodukt verwendet werden. Die Mikroben können demzufolge als attenuierte Lebendvakzine dienen, die eine Immunantwort und eine Schutzantwort in einem Individuum, an das sie verabreicht werden, auslösen können. Vakzinstämme können auch so konstruiert werden, dass sie ein rekombinantes Gen eines Pathogens, um ein Individuum gegen das Pathogen zu immunisieren, oder eines Allergens, um es zur Desensibilisierung eines Individuums zu verwenden, enthalten und exprimieren.
Die erfindungsgemäße attenuierte Mikrobe kann zusätzlich als Vektor zur Synthese verschiedener Wirtsproteine, wie immunoregulatorischer Substanzen, oder zur Zufuhr und Erzeugung pharmakologisch aktiver Produkte, welche verschiedene physiologische Funktionen (d.h. Wachstumsrate, Blutdruck etc.) stimulieren oder unterdrücken können, dienen. Überdies können die erfindungsgemäßen attenuierten Mikroben zur kommerziellen Herstellung von rekombinanten Proteinen verwendet werden.
Bevorzugte Ausführungsformen der vorliegenden Erfindung sind in den folgenden Beispielen beschrieben. Andere Ausführungsformen, welche vom Umfang der Ansprüche umfasst sind, werden dem Fachmann anhand der Beschreibung oder aufgrund der Durchführung der hierin offenbarten Erfindung deutlich werden. Die Beschreibung als auch die Beispiele sollen nur als beispielhaft und im Rahmen der in den den Beispielen folgenden Ansprüchen definierten Erfindung liegend betrachtet werden.
Die in den nachfolgenden Untersuchungen verwendeten Stämme und Plasmide sind in den Tabellen 1A und 1B aufgelistet.
TABELLE 1 A. Bakterienstämme
TABELLE 1 B. Plasmide
BEISPIEL 1
Dieses Beispiel beschreibt die Erzeugung von definierten Mutanten und die Insertion einer Kassette, enthaltend einen Transkriptionsterminator, in eine deletierte Genstelle. Diese Studien zeigen die Wichtigkeit des Einbringens eines Transkriptionsterminators in eine insertierte Sequenz, um Auswirkungen der Insertion auf benachbarte Gene zu verhindern.
Erzeugung einer definierten Deletion in dem asd-Gen
Der Ansatz zur Verwendung definierter Deletionen wurde durch unsere Beobachtungen in Komplementationsstudien veranlasst, die zeigten, dass eine Transposon-erzeugte Mutation manchmal in Gene außerhalb des Zielgens reichen und so die für die Immunogenität wichtigen Eigenschaften beeinflussen kann.
Um definierte Deletionen in dem asd-Gen zu erzeugen, wurde das S. typhimurium asd-Gen kloniert und sequenziert. Die so erhaltene 1735 bp lange Sequenz enthielt 313 Basenpaare einer stromaufwärts gelegenen 5'-Sequenz, eine codierende Sequenz mit 1104 Basenpaaren, die für ein 368 Aminosäure langes Protein codiert, gefolgt von einem 3 bp langen Stoppcodon und einer 315 bp langen stromabwärts gelegenen 3'-Sequenz. Unter Verwendung von inverser PCR, um die Basenpaare 287 bis 1421 der Sequenz zu deletieren und eine Bg/ll-Stelle zu insertieren, wurde ein Suizidvektor pMEG-443 (2) konstruiert, der im Allelaustausch für die ΔasdA16-Mutation verwendet wurde. Dieser Suizidvektor kann in attenuierte Salmonella Vakzinstämme entweder durch Elektroporation oder durch Konjugationstransfer aus dem Donorstamm MGN-617, der ein integriertes incP-Replikon enthält, das den Konjugationstransfer des Suizidvektors unterstützt, eingebracht werden. MGN-617 weist auch einen in das Chromosom integrierten Lambda-Prophagen auf, der die pir-Funktion festlegt, die für die vegetative Replikation von Plasmiden mit dem R6K-Replikationsstartpunkt notwendig ist. Wird pMEG-443 durch Konjugationstransfer oder durch Elektroporation in einen Salmonella Stamm transferiert, kann sich das Plasmid aufgrund der Abwesenheit des pir-Genprodukts nicht replizieren. Durch Selektion nach einer gleichzeitigen Resistenz gegenüber Ampicillin (Amp') und Chloramphenicol (Cam^r), deren Resistenzen durch das bla (amp)-Gen bzw. das cat-Gen auf pMEG-443 codiert werden, kann jedoch ein einzelner Crossovervorgang basierend auf der Verwendung der Sequenzhomologie der das deletierte asd-Gen flankierenden Bereiche nachgewiesen werden, der es ermöglicht, dass der Suizidvektor mit dem bakteriellen Chromosom assoziiert und in das bakterielle Chromosom rekombiniert. Einzelne Amp^r Cam^r-Kolonien können gepickt und aufgereinigt werden und kleine Kulturen können aufgezogen werden, um dann auf Agarmedium, das 5 % Sucrose und besonders wichtig DAP, jedoch kein Ampicillin und Chloramphenicol enthält, ausplattiert zu werden. Das sacB-Gen auf dem Suizidvektor codiert für eine Levansucrase, die Sucrose hydrolysiert, was unter Bedingungen niedriger Osmolarität zur Toxizität und zum bakteriellen Zelltod führt. Demzufolge können Bakterienzellen aufgrund des Verlustes des Plasmidvektors überleben, wenn ein zweiter Crossovervorgang auftritt, der den Suizidvektor aus dem Chromosom ausschneidet. In einigen Fällen tritt der Crossovervorgang bezogen auf die Stelle des ersten Crossovervorgangs auf der anderen Seite der asd-Deletion auf, was zu einem Allelaustausch führt, sodass die definierte Deletionsmutation ΔasdA16 das Wild-Typ asd-Gen in dem Chromosom ersetzt. Dieser Vorgang kann mit vielen verschiedenen Salmonella Stämmen mit unterschiedlichen Serotypen durchgeführt werden, um die ΔasdA16-Mutation mit ihrer 1135 bp langen Deletion, die die vollständige codierende Sequenz des strukturellen asd-Gens eliminiert und durch eine Bg/ll-Erkennungssequenz ersetzt, einzubringen. Solch eine Selektion führte zu dem S. typhimurium UK-1 Stamm MGN-023, der von seinem Elternstamm _X3761 abgeleitet ist. Wurden viele Asd⁺-Plasmide in MGN-023 eingebracht, zeigten die Asd⁺-Rekombinanten die gleiche Wachstumsrate, die gleiche Fähigkeit, sich im murinen Darmtrakt und inneren Lymphgewebe auszubreiten, und eine Pathogenität, was durch LD₅₀-Bestimmung bestimmt wurde, wie der elterliche Wild-Typ Asd⁺-Stamm _X3761.
Verwendung von Transkriptionsterminatoren in Insertionen in die deletierte chromosomale asd-Genstelle
Für die Entwicklung einer Strategie zur Regulation der Überlebensfähigkeit von Mikroben wurden asd-Deletionsmutanten mit einer temperaturempfindlichen Insertionskassette, die Gene enthält, welche Gene, die das Überleben der Mikrobe regulieren, regulieren, konstruiert. Die das Überleben der Mikrobe regulierenden Gene lagen auf einem Plasmid vor, das ein komplementierendes asd-Gen enthielt. Um die Auswirkungen der Insertionskassette einzuschränken, wurden jedoch auch Transkriptionsterminatoren in die Kassette eingebracht.
Das asd-Gen in dem Einschlussvektor pMEG-105 (3) ersetzt ein deletiertes chromosomales Gen. Die Expression des asd-Plasmidgens macht von dem linken λ-Promotor (P_L) Gebrauch, der nur dann funktionsfähig ist, wenn im Cytoplasma kein λ cl-Repressorprotein vorliegt. Der Vektor wurde so konstruiert, dass er auch die P22-Phagenlysegene lys-13 und lys-19 enthielt, die unter der Kontrolle des rechten P22-Promotors (P_R) exprimiert werden. Um die Expression dieser letalen Gene zu verhindern, war es notwendig, dass die bakteriellen Zellen große Mengen des P22 c2-Genprodukts, welches der Repressor für P_R ist, produzieren. ΔasdA17-Mutanten mit einer Insertionskassette in dem deletierten asd-Gen, bei denen die Insertionskassette entweder das λ cl-Repressorprotein oder das c1857-Genprodukt enthielt und exprimierte, wurden konstruiert. Der λ cl-Repressor blockierte die Expression des durch das Plasmid codierten asd-Gens. Diese Blockierwirkung war temperaturempfindlich, sodass das Produkt bei in der Umgebung vorliegenden Umgebungstemperaturen die asd-Genexpression auf dem pMEG-105-Plasmid abschaltete und bei den Körpertemperaturen eines immunisierten Tierwirts, welche das c1857-Genprodukt thermisch inaktivieren, die asd-Genexpression jedoch erlaubte. Das ΔasdA17-Deletions/Insertions-Konstrukt verursachte auch eine Expression des P22 c2-Gens in dem Tierkörper unter Bedingungen, bei denen das c1857-Genprodukt thermisch inaktiviert war, sodass das P22 C2-Protein synthetisiert wurde, um aufgrund der Repression des P22 P_R durch den C2-Repressor die Expression der pMEG-105 codierten lys13- und lys19-Gene zu unterdrücken. Das c1857 λP_RP22c2-Konstrukt wurde auch mit den rrnBT1T2-Transkriptionsterminatoren (1) am C-terminalen Ende des c1857-Genprodukts konstruiert, um eine Transkription über das Ende der asd-Deletion hinaus auszuschließen. Dieses Fragment wurde in und anstelle der Deletion in das asd-Gen insertiert und in einem Suizidvektor platziert, um pMEG-096 (4) zu erzeugen. pMEG-096 kann entweder durch Elektroporation oder durch Konjugation in den Suizidvektordonor MGN-617 eingebracht werden. Da pMEG-096 die Tetracyclinresistenzdeterminante enthält, kann der erste Rekombinationsvorgang zur Insertion des Suizidvektors in das Chromosom eines empfangenden Salmonella Stammes durch Selektion auf eine Tetracyclinresistenz hin erreicht werden. Eine Tetracyclinresistenz, wie oben erwähnt, legt die Empfindlichkeit gegenüber Fusarsäure fest und kann dann durch Selektion von Fusarsäure-resistenten Isolaten für einen zweiten Crossovervorgang selektionieren.
Der Stamm MGN-392 wurde durch Ersetzen des Wild-Typ asd⁺-Gens mit dem ΔasdA17::TTc1857λP_RP22c2-Konstrukt, bei dem TT den Transkriptionsterminator rrnBT1T2 bezeichnet (1), konstruiert. Dieser Stamm benötigt unbedingt DAP und exprimiert das C2-Repressorprotein aufgrund der thermischen Inaktivierung des temperaturempfindlichen cl857-Repressors, wenn er bei hohen Temperaturen wächst, kann jedoch das c2-Gen nicht exprimieren, wenn er bei niedrigen Temperaturen unter Bedingungen wächst, bei denen das c1857-Genprodukt ein funktioneller Repressor ist, der an λ P_R bindet, um eine Transkription des P22 c2-Gens auszuschließen.
Ein anderes Konstrukt wurde durch Insertion des P22 c2-Gens innerhalb der Δasd-Deletionsmutation hergestellt, sodass die c2-Genexpression durch ein von der Gegenwart oder Abwesenheit von Arabinose abhängiges araCP_BAD- Aktivator/Repressor-System kontrolliert wird. Durch Wachsen eines Stamms mit einem araCP_BADc2-Konstrukt in dem Chromosom in Gegenwart von Arabinose kommt es zur Akkumulation großer Mengen des C2-Proteins, was zur Repression von letalen Genen, wie lys-13 und lys-19, die unter der Kontrolle der P22 P_R-Promotorsequenz transkribiert werden, führt. Da Arabinose in Tiergewebe nicht vorliegt, würde die Synthese des C2-Proteins nachlassen, wenn der Vakzinstamm in vivo auftritt und eine allmähliche Derepression von Genen, wie durch das C2-Protein reprimierte letale Gene, würde stattfinden. Dies würde einen verzögerten Tod bedeuten, nachdem der Vakzinstamm in den immunisierten Tierwirt eingedrungen ist, der aufgrund der Abwesenheit von Arabinose eine nicht zulässige Umgebung darstellen würde, jedoch würde der Vakzinstamm lange genug überleben, um das Lymphgewebe zu erreichen und eine Immunantwort auszulösen. Es sollte erwähnt werden, dass Arabinose an das araC-Genprodukt bindet, welches dann als Aktivator der Transkription ausgehend von dem P_BAD-Promotor dient, um die Transkription von C2 zu ermöglichen. In der Abwesenheit von Arabinose dient das araC-Protein als Repressor, wodurch die Transkription von dem P_BAD-Promotor aus blockiert wird und C2 nicht synthetisiert wird. In diesem speziellen Konstrukt wurden Transkriptionsterminatoren auf beiden Seiten der Insertion innerhalb der definierten asd-Deletion platziert. Der Suizidvektor pMEG-611 mit der ΔasdA19::TTaraCP_BADc2TT-Deletions/Insertions-Mutation ist in 5 gezeigt. Der Suizidvektor kann in den Suizidvektordonor MGN-617 elektroporiert oder transformiert werden und dieser Stamm wurde für einen Konjugationstransfer mit einem geeigneten empfangenden Stamm, wie S. typhimurium UK-1 Wild-Typ _X3761, verwendet. In diesem Falle kann die Ampicillin- und Chloramphenicolresistenz verwendet werden, um einzelne Crossovervorgänge zu selektionieren, die aufgrund der Verwendung der die Δasd-Mutation flankierenden Sequenzen für eine homologe reziprokale Crossoverrekombination dazu führen, dass der Suizidvektor in das Chromosom integriert wird. Nach der Selektion auf Ampicillin- und Chloramphenicol-resistente Isolate hin können kleine Kulturen aufgezogen werden, die dann auf einem Medium mit 5 % Sucrose und DAP ausplattiert werden. In einigen Fällen tritt der zweite Crossover in Bezug auf die Stelle des ersten Crossovervorgangs auf der gegenüberliegenden Seite der asd-Deletion auf und führt zu einem Ersetzen des chromosomalen Wild-Typ asd⁺-Allels durch das ΔasdA19::TTaraCP_BADc2TT-Konstrukt. Der S. typhimurium UK-1-Stamm MGN-798 wurde auf diese Art und Weise konstruiert.
Dann wurden verschiedene Asd⁺-Vektoren in MGN-023 mit der ΔasdA16-Mutation, MGN-392 mit der ΔasdA17::TTc1857λP_RP22c2-Mutation und MGN-798 mit der ΔasdA19::TTaraCP_BADc2TT-Mutation eingebracht. In diesen Untersuchungen sollte das relative Wachstum der Stämme, ihre relative Fähigkeit, sich im Lymphgewebe von oral immunisierten Mäusen auszubreiten, und ihre Fähigkeit, eine Krankheit auszulösen, bestimmt werden. Diesbezüglich hätte man erwartet, dass die Expression des Wild-Typ asd-Gens auf einem Plasmid theoretischerweise zur Wiederherstellung der vollständigen Virulenz gegenüber einem Stamm führen würde, der nun unabhängig von der Gegenwart von DAP wuchs und mehr oder weniger ähnliche Eigenschaften wie der elterliche S. typhimurium UK-1 Wild-Typ Stamm _X3761 zeigte. Als Kontrolle wurde in diesen Experimenten MGN-392 unter Verwendung von in _X3761 vermehrtem Phagen P22 in Asd⁺ umgewandelt, wodurch der Stamm MGN-491 erhalten wurde. In diesem ersten Experiment, das einen ersten Überblick verschaffen sollte, wurde pMEG-086 (Tabelle 1B) sowohl in MGN-023 als auch in MNG-392 eingebracht. pMEG-098 weist einen pUC-Replikationsstartpunkt auf und es wurde beobachtet, dass eine Überexpression des asd-Genprodukts die Virulenz verringern kann. Daher wurde auch pYA810 (Tabelle 1B) in MGN-392 eingebracht, da pYA810 einen p15A-Replikationsstartpunkt besitzt, der zu einer geringeren Plasmidkopienzahl führt und demzufolge eine geringere, jedoch ausreichende Konzentration des asd-Enzyms erzeugt. Der Asd⁺-Einschlussvektor pMEG-105 wurde auch in MGN-392 eingebracht, der bei 37 °C oder bei Temperaturen darüber herangezogen wurde (Es ist anzumerken, dass die Gegenwart des Einschlussvektors pMEG-105 Bakterien abtötet, die das P22 c2-Gen nicht exprimieren können, sodass die Expression der Plasmid-codierten lys-1- und lys-19-Gene durch das C2-Protein unterdrückt wird). Alle diese Stämme wuchsen mit mehr oder weniger gleichwertigen Wachstumsraten in Luria-Kulturlösung in Abwesenheit von exogenem DAP. Wurde DAP zu dem Medium zugegeben und wurden die Stämme über einen Zeitraum von 50 Wachstumsgenerationen wiederholt transferiert, waren alle Isolate, ungefähr 100 Isolate pro Stamm, Asd⁺, was die stabile Erhaltung jedes Plasmids bei den verschiedenen genetischen Voraussetzungen anzeigte.
Die Stämme wurden dann bei 37 °C in Luria-Kulturlösung bis zu einer OD₆₀₀ von 0,8 herangezogen, mit Ausnahme einer Subkultur der MGN-392 (pMEG-105) Kultur, die zwei Stunden vor dem Ernten auf 42 °C gebracht wurde, um sie für eine orale Immunisierung von Mäusen zu verwenden. Acht Wochen alte weibliche BALB/c-Mäuse wurden eine Woche vor dem Beginn der Experimente unter Quarantäne gehalten und für etwa 4 Stunden vor der Verabreichung der Vakzindosis, die mithilfe einer Mikropipette in einem Volumen von 20 μl hinter die Schneidezähne verabreicht wurde, ohne Nahrungsmittel und Wasser gehalten. 30 Minuten nach der oralen Immunisierung wurden Futter und Wasser zurückgestellt und die Mäuse wurden über einen Zeitraum von 30 Tagen beobachtet.
Wie die Daten in Tabelle 2 zeigen, starben alle Mäuse, die mit MGN-491, der Asd⁺-Transduktante von MGN-392, geimpft wurden als auch beide Mäuse, die mit MGN-023, enthaltend pMEG-086, geimpft wurden. Im Gegensatz dazu erlitt keine der mit den Derivaten von MGN-392 infizierten Mäuse eine Infektion, was anzeigt, dass das Asd⁺-Gen auf dem Plasmidvektor die Wirkung der ΔasdA17::TTc1857λP_RP22c2-Deletions/Insertions-Mutation nicht ersetzen konnte. Da das Ausmaß der asd-Deletion identisch zu den ΔasdA16- und ΔasdA17-Mutationen ist, muss die erhöhte Avirulenz des MGN-392-Stammes mit verschiedenen Asd⁺-Vektorkonstrukten auf die Auswirkungen der Insertion zurückzuführen sein. Da das P22 c2-Gen von dem λP_R aus in eine Richtung aus dem deletierten asd-Gen hinaus transkribiert wird, muss davon ausgegangen werden, dass eine sehr starke Transkription die Expression von benachbart zu der deletierten asd-Mutation liegenden Genen stört und auf unbekannte Art und Weise zu der Attenuierung solcher Stränge beiträgt.
Um diese Hypothese und dieses Phänomen genauer zu untersuchen, wurden ausgedehntere Tierexperimente durchgeführt, jedoch wurde dieses Mal auch von der Verwendung des Stammes MGN-795 mit der ΔasdA19::TtaraCP_BADc2TT-Deletionsinsertion Gebrauch gemacht. In diesem Fall wurden Transkriptionsterminatoren am Ende des transkribierten araC-Gens und auch auf der 3'-Seite des transkribierten c2-Gens platziert, wodurch festgestellt werden sollte, ob dies die durch die Insertion verursachte Attenuierung eliminieren würde. In diesen Untersuchungen wurden pYA292 oder pYA810 (Tabelle 1B) verwendet, die Asd⁺-Vektoren mit dem p15A-Replikationsstartpunkt sind. Die Wild-Typ Stränge _X3761 hatten eine orale LD₅₀ von 5,8 × 10⁴ (Tabelle 3). Andererseits war MGN-023 in Abwesenheit eines Asd⁺-Vektors vollständig avirulent und hatte eine LD₅₀ von mehr als 6,8 × 10⁸ CFU. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen in Tabelle 3 tötete MGN-392, ausgestattet mit pYA810, keine Mäuse, selbst wenn es bei sehr hohen Dosen verabreicht wurde, und hatte demzufolge ein LD₅₀ von mehr als 7,6 × 10⁸ CFU. Im Gegensatz dazu zeigte MGN-023, egal ob mit dem Asd⁺-Vektor pYA292 oder pYA810 ausgestattet, eine LD₅₀, die nur geringfügig höher war als die des elterlichen Wild-Typs, ein Ergebnis, das analog zu dem Ergebnis des Stranges MGN-795 war, bei dem die ΔasdA19::TTaraCP_BADc2TT-Insertion durch pYA810 ersetzt war. Anhand dieser Daten ist es daher offensichtlich, dass der Einschluss von Transkriptionsterminatoren an beiden Enden einer Insertion innerhalb des asd-Gens die insertierten Sequenzen daran hindert, die Expression von benachbarten Genen zu stören, was zu einer Hyperattenuierung des Vakzinstamms führen kann und damit die Immunogenität reduzieren kann.
TABELLE 2
Mortalität von 8 Wochen alten BALB/c-Mäusen 30 Tage nach oralen Impfungen mit den S. typhimurium UK-1 Stämmen MGN-023 (mit ΔasdA16) und MGN-392 (mit ΔasdA17::TTc1857 P_R c2), enthaltend die Asd⁺-Vektoren pYA810 (p15A ori), pMEG-086 (pUC ori) oder den Einschlussvektor pMEG-105 (p15Aori), verglichen mit dem Asd⁺-transduzierten Stamm MGN-491 (abgeleitet von MGN-392).
TABELLE 3
Mortalität von 8 Wochen alten BALB/c-Mäusen 30 Tage nach einer oralen Impfung mit S. typhimurium UK-1 Wild-Typ _X3761 und MGN-023 (ΔasdA16), MGN-392 (ΔasdA17::TTc1857 P_R c2) und MGN-795 (ΔasdA19::TTaraCP_BADc2TT), enthaltend einen Asd⁺-Vektor (pYA292 oder pYA810) mit dem p15A Replikationsstartpunkt.
BEISPIEL 2
Dieses Beispiel veranschaulicht die Konstruktion von definierten Deletionen in dem phoP-Gen.
Einleitung
Salmonella Mutanten mit Mutationen in dem regulatorischen phoP-Locus sind attenuiert und immunogen und stellen eine Schutzimmunität zum Kampf gegen virulente Salmonella Stämme bereit (Galan und Curtiss, Microbioal Pathogeneses 6: 433–443, 1989; Miller et al., Proc. Natl. Acad. Sci 86: 5054–5058, 1989). Diese Mikroben können auch als wirksame Antigenzufuhrvektoren verwendet werden, um starke Immunantworten gegenüber exprimierten Fremdproteinen auszulösen (Wick et al., Mol. Microbiol. 16: 465–476, 1995). Kier et al. (J. Bacteriol. 138: 155–161, 1979) führten eine genetische Analyse betreffend die Fähigkeit von S. typhimurium, eine nicht spezifische saure Phosphatase zu erzeugen, durch und identifizierten Mutationen in zwei verschiedenen genetischen Loci, welche die Fähigkeit von Salmonella, saure Phosphatasen zu erzeugen, ausschalteten. Ein Gen, das als phoN bezeichnet wurde, wurde mit dem purA-Gen verknüpft und das andere, das als phoP bezeichnet wurde, wurde in einem unterschiedlichen Bereich des bakteriellen Chromosoms mit dem purB-Gen verknüpft. Aufgrund der Möglichkeit, temperaturempfindliche Allele, welche sich an dem phoN-Locus befinden und welche eine Temperaturempfindlichkeit der sauren Phosphataseaktivität hervorrufen, und der Möglichkeit, direkt mit dem phoP-Locus verbundene Mutationen, welche die Synthese von nicht spezifischer saurer Phosphatase konstitutiv machen, zu isolieren, glaubten sie, dass das phoN-Gen das Strukturgen der nicht spezifischen sauren Phosphatase darstelle und dass das phoP-Gen eine regulatorische Funktion, welche die phoN-Expression leitet, festlege.
1986 berichteten Fields et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. 83: 5189–5193) von der Isolation einer Vielzahl von S. typhimurium Mutanten mit Mutationen, welche Salmonella anfällig für das Abtöten durch murine Makrophagen machte. 1989 entdeckten Fields et al. (Science 243: 1069–1062), dass einige ihrer Makrophagen-sensitiven Mutanten Mutationen in dem phoP-Gen aufwiesen, wodurch die Fähigkeit, nicht spezifische saure Phosphatase zu bilden, ebenfalls inaktiviert wurde. Obwohl Fields et al. (supra, 1989) von der Avirulenz dieser Mutanten berichteten, fanden sie keinen Beweis für ihre Immunogenität und gingen in der Tat davon aus, dass sie nicht immunogen seien. Galan und Curtiss (supra) zeigten, dass Mäuse-virulente S. typhimurium Stämme, welche die phoQ12-Mutation (zuvor als phoP12-Mutation bezeichnet) aufwiesen und durch Kier et al. (supra) isoliert und sorgfältig charakterisiert wurden, vollständig avirulent waren, wenn sie verwendet wurden, um Mäuse mit hohen Dosen oral zu infizieren. Galan und Curtiss fanden jedoch im Gegensatz zu Fields et al., dass diese Mäuse eine Immunität aufwiesen, die diesen Mäusen einen hohen Schutz verlieh, wenn mit dem 10.000-fachen einer letalen Dosis des elterlichen virulenten Wild-Typ S. typhimurium Stammes angeregt wurde. Miller et al. (supra) und Groisman et al. (J. Bacteriol. 174: 486–491, 1989) zeigten, dass der phoP-Locus in Wirklichkeit ein Operon, enthaltend zwei Gene, welche ein Zweikomponentenregulatorsystem bildeten, war. Miller et al. bezeichneten die Gene als phoP und phoQ. Groisman bezeichnete sie anfänglich als phoP und phoZ, nannte phoZ jedoch in Übereinstimmung mit der Wahl von Miller et al. in einer Fußnote in seiner 1989 erschienenen Veröffentlichungen in phoQ um. Eine Karte des phoPQ-Operons mit verknüpften potA-, pepT- und purB-Genen ist in der Veröffentlichung von Miller et al. gezeigt. Das phoQ-Gen ist eine Sensorkinase, welche auf die Magnesium (Mg²⁺)-Konzentration und zu einem geringeren Ausmaß auf die Calcium (Ca²⁺)-Konzentration reagiert, um das phoP-Genprodukt zu phosphorylieren (Garcia Vescovia et al., J. Biol. Chem. 272: 1440-1443, 1997), das als DNA-Bindungsregulatorprotein dient, um die Expressionen der als phoP-aktivierte Gene (pag) bezeichneter Gene zu aktivieren oder als Repressor für phoP-reprimierte (prg) Gene zu dienen (Miller et al., 1989, supra; Miller, Mol. Microbiol. 5: 2073–2078, 1991). Es ist nun bekannt, dass das phoPQ-Zweikomponentenregulatorsystem viele Eigenschaften von Salmonella beeinflussen kann, was das Eindringen in den Darmtrakt, die Toleranz gegenüber saurer Belastung, die Resistenz gegenüber Polypeptiddefensinen, das Überleben in Makrophagen, die Struktur und Zusammensetzung der Lipopolysaccharid (LPS)-Komponenten, das Gesamteindringvermögen und die Virulenz von Salmonella in Tieren und Menschen einschließt.
Konstruktion der definierten phoP-Deletionen
Ein 2.110 bp langes BamHI-Clal-Fragment wurde aus dem S. typhimurium UK-1 Stamm _X3716 PCR-amplifiziert, wobei das Fragment das gesamte phoPQ-Operon, umfassend die 5'- und 3'-Regulatorsequenzen enthielt, und wurde in den SC101-Klonierungsvektor pWKS30 (Tabelle 1B) insertiert, der ebenfalls mit Clal und BamHl verdaut war. Dieses Plasmid komplementierte den PhoP^–-Phenotyp, wenn es in eine S. typhimurium phoP-Mutante, wie MGN-069 (Tabelle 1) eingebracht wurde, und ermöglichte dem Stamm, die durch phoN codierte, nicht spezifische saure Phosphatase zu synthetisieren und andere Eigenschaften eines PhoP⁺ S. typhimurium Stamms zu zeigen.
Viele der Mutanten mit Mutationen, welche zu dem PhoP^–-Phenotyp führen, zeigten, egal ob eine Induktion durch chemische Mutagene oder durch eine insertionelle Transposonmutagenese erfolgte, eine geringe oder kleine phoQ-Genaktivität, entweder weil die Mutation in dem phoQ-Gen vorlag oder weil die Mutation, obwohl sie in dem phoP-Gen vorlag, einen polaren Effekt auf die Verhinderung der phoQ-Genexpression hatte. Aus diesem Grund wurde die ΔphoP22-Deletion konstruiert, die eine definierte Deletionsmutation in dem phoP-Gen darstellt, welche die Wild-Typ Expression des phoQ-Gens verhindert. Dies wurde durch Verdau von pMEG-063 DNA (18), welche das phoPQ-Operon enthielt, mit EcoRV, wodurch 514 Basenpaare innerhalb des phoP-Gens entfernt werden, was nach der Religation zu pMEG-068 führt, bewerkstelligt. Die so erzeugte ΔphoP22-Deletion führte zu einer 514 bp langen Deletion, wobei eine 47 Aminosäure lange Sequenz aus dem N-terminalen Bereich von PhoP an eine außerhalb des Leserahmens liegende 8 Aminosäure lange Sequenz, deren codierende Sequenz mit fünf Basenpaaren mit dem N-terminalen Bereich der phoQ-Gensequenz überlappt, fusioniert ist. Asparaginsäure an Aminosäureposition 52 innerhalb der PhoP-Sequenz wurde entfernt. Es ist die Asparaginsäure, welche durch die Sensorkinase, die in dem durch das phoQ-Gen codierten Protein vorliegt, phosphoryliert wird. Das Konstrukt ist so hergestellt, dass, wenn sich in dem 3'-Ende des phoP-Gens eine ribosomale Bindungssequenz befindet, die den Start des phoQ-Gens vorgibt, die Sequenz in der Deletionsmutation immer noch erhalten bleibt.
Die Konstruktion von ΔphoPQ23, welche die Konstruktion von definierten phoPQ-Deletionen veranschaulicht, ist in 6 gezeigt. Um die definierte ΔphoPQ23-Deletionsmutation zu erzeugen, wurde pMEG-068 an der Restriktionsschnittstelle, welche bei der Erzeugung der ΔphoP22-Deletion wieder hergestellt wurde, mit EcoRV und dem Restriktionsenzym Tth111I verdaut, wodurch ein zusätzliches 1.103 bp langes Fragment, das für den C-terminalen Bereich des phoP-Gens und für die letzten 90 Aminosäuren des phoQ-Gens codiert, entfernt wurde. Diese Deletion entfernte insbesondere den Histidinrest 259, der in dem PhoQ-Protein phosphoryliert wird und als Phosphatdonor für die Phosphorylierung des Aspartat 52 in dem phoP-Gen dient. pMEG-210, enthaltend die ΔphoPQ23-Deletion, wurde mit Bg/ll und Xbal verdaut und dieses Fragment wurde in die Suizidvektor pMEG-149 DNA, die ebenfalls mit BamHl und Xbal verdaut war, ligiert. Dies führte zu dem Suizidvektor pMEG-212, der in den Suizidvektordonorstamm MGN-617 elektroporiert wurde. Die Paarung von MGN-617 (pMEG-212) mit verschiedenen S. typhimurium Stämmen, wie oben beschrieben, konnte verwendet werden, um anfänglich einzelne Crossovervorgänge und dann doppelte Crossovervorgänge zu isolieren, bei denen die ΔphoPQ23-Mutation die Wild-Typ phoPQ-Allele ersetzt hatte, was zu einem Derivat führte, das aufgrund des Verdaus des in dem Agarmedium vorliegenden chromogenen Substrats BCIP mit nicht spezifischer saurer Phosphatase keine blaue Farbe zeigte.
Eine definierte Deletionsmutation innerhalb des phoQ-Gens wurde auf eine ähnliche Art und Weise erzeugt. Das Plasmid pMEG-198, das das phoQ-Gen und flankierende Sequenzen enthielt und durch Subklonierung von pMEG-063 erzeugt wurde, wurde mit Nael und Dral verdaut. Die DNA wurde mit dem Klenow-Fragment behandelt, um die Lücken aufzufüllen und wurde religiert. Dadurch wurde eine 716 bp lange Sequenz innerhalb des phoQ-Gens deletiert, welche die Sequenz enthielt, die das Histidin 259, welches üblicherweise phosphoryliert wird, enthielt, wodurch pMEG-202 erzeugt wurde. pMEG-202 wurde mit Xbal und Xhol verdaut und das Fragment, welches die ΔphoQ1-Mutation enthielt, wurde in den Suizidvektor pKNG-101 kloniert, der ebenfalls mit Xbal und Xhol verdaut war. Der resultierende Suizidvektor wurde in den Suizidvektordonorstamm MGN-617 elektroporiert. Wie oben beschrieben, konnte dieser Stamm mit verschiedenen S. typhimurium Stämmen gepaart werden, wodurch einzelne Crossover durch Streptomycinresistenzen selektioniert wurden und doppelte Crossover durch Resistenz gegenüber 5 % Sucrose selektioniert wurden. Der Erfolg des Doppelcrossovervorgangs wurde wiederum durch Einbau von BCIP in das Agarmedium und Suchen nach weißen Kolonien, welche zur Hydrolyse des Phosphatsubstrats nicht fähig waren, bestätigt.
Stämme wurden mit ΔphoP22-, ΔphoQ1- und ΔphoPQ23-Deletionsmutationen konstruiert. Stämme mit der ΔphoP22-Mutation wiesen eine Deletion von etwa 514 Basenpaaren, Stämme mit der ΔphoPQ23-Deletion eine Deletion von etwa 1.617 Basenpaaren und Stämme mit der ΔphoQ1-Mutation eine Deletion von etwa 716 Basenpaaren auf.
BEISPIEL 3
Dieses Beispiel veranschaulicht die Konstruktion von definierten Deletionen in dem phoPQ-Operon mit einer Insertion einer konstitutiv exprimierten Reportergenkassette, welche einen Transkriptionsterminator enthielt.
Sowohl für in vitro als auch für in vivo Untersuchungen zur Bewertung der Komplementierung bestimmter mutationeller Veränderungen und zur Verifikation der Existenz des auf dem Plasmid mit geringer Kopienzahl vorliegenden Wild-Typ Allels als auch des in dem Chromosom vorliegenden mutierten Allels wurde das xylE-Reportergen in das chromosomale mutierte Gen insertiert (Kanega et al., Molecular Microbiol. 13: 555–568, 1994). Kolonien mit Bakterien, die das xylE-Gen exprimierten, färbten sich innerhalb von fünf Minuten, nachdem sie mit einer 250 mM Catechol-Lösung besprüht wurden, gelb und das Besprühen war ohne Wirkung auf die Überlebensfähigkeit der Zellen innerhalb der Kolonie. Wenn wir eine xylE-Strukturgenkassette ohne einen Promotor verwendeten und wir von der Expression des Promotors, der für die Expression des Gens, in welches die xylE-Kassette insertiert wurde, verwendet wurde, abhängig waren, konnte die Expression stark als auch nicht existent sein, was davon abhing, wie das bestimmte Gen, in welches die xylE-Kassette insertiert wurde, als Antwort auf Umwelteinflüsse reguliert wurde. Daher wurde das xylE-Gen an den Bakteriophagen T4 Gen 32-Promotor fusioniert, der eine konstitutive Expression des xylE-Genprodukts unter einer Vielzahl von Bedingungen ermöglichte.
Aufgrund der Stärke des Gen 32-Promotors konnte die RNA-Transkription unglücklicherweise über die Grenzen der Insertion hinaus in einen Bereich erfolgen, der abhängig davon, ob die mRNA einen Sense- oder Antisensestrang darstellte, die Expression benachbarter Gene positiv oder negativ beeinflusste. Um dieses Problem zu umgehen, wurde ein starker Transkriptionsterminator nach dem C-terminalen Bereich des xylE-Gens platziert. 7 veranschaulicht das Plasmid pMEG-685, von dem aus das den Gen 32-Promotor enthaltende xylE-Gen mit dem Gen 32-Transkriptionsterminator unter Verwendung verschiedener Restriktionsenzyme als Kassette kloniert werden kann und anstelle eines deletierten Segments in jedes Gen insertiert werden kann.
Um einen Suizidvektor mit einer T4 Gen 32-Promotor/xylE/Transkriptionsterminator (P₃₂xylETT)-Kassette in dem phoQ-Gen herzustellen, wurden die folgenden Schritte durchgeführt. pMEG-063 (18), der das phoPQ-Operon enthielt, wurde mit Kpnl verdaut, mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase behandelt, um Blunt-Enden zu erzeugen, und dann mit Xbal verdaut, um ein 2,4 kb phoPQ-Fragment zu erzeugen, das in pMEG-197, verdaut mit Dral und Xbal, ligiert werden konnte. pMEG-197 ist ein Asd⁺-Vektor, der eine Deletion des trc-Promotors (P_TRC) aufweist und durch Deletion eines Bg/ll-BamHl-Fragments von pMEG-195 und Religation, um pMEG-197 zu erzeugen, erzeugt wurde. Die Abwesenheit von P_TRC erleichtert daher nachfolgende Klonierungsvorgänge, sodass eine Überexpression von phoQ-Genprodukten für die Bakterienzellen nicht toxisch ist. Das resultierende Plasmid pMEG-198 wurde mit Nael und Dral verdaut, wodurch ein 716 bp Segment des phoQ-Gens entfernt wurde. Zur gleichen Zeit wurde pMEG-685 mit EcoRI und HindIll verdaut und das Fragment wurde mit dem Klenow-Fragment der DNA-Polymerase verdaut, um Blunt-Enden zu erzeugen. Dieses so erzeugte 2,4 kb Fragment von pMEG-685 wurde dann in den Vektor pMEG-198 ligiert, der mit Nael und Dral verdaut war. Das nach der Ligation erzeugte, resultierende Plasmid wurde als pMEG-201 bezeichnet. pMEG-201 enthielt nun die T4P₃₂xylETT-Kassette innerhalb des phoQ-Gens anstelle der deletierten 716 Basenpaare des phoQ-Gens. pMEG-201 wurde nun mit Xbal und Xhol verdaut, um ein 4,0 kb Fragment zu erzeugen, das in den mit Xbal-Xhol verdauten Suizidvektor pKNG-101 insertiert wurde, um das rekombinante Suizidplasmid pMEG-205 zu erzeugen, das in den Suizidvektordonor MGN-617 eingebracht wurde. Der Stamm MGN-740 konnte verwendet werden, um den Suizidvektor in geeignete empfangende Salmonella, wie S. typhimurium UK-1 _X3761 oder S. typhimurium SL1344 _X3339, welche anfänglich durch Streptomycinresistenz für die einzelnen Crossover selektionieren und dann durch Sucroseresistenz für den Verlust des Suizidvektors und die gewünschten doppelten Crossover selektionieren, zu transferieren. Erfolg in Bezug auf den Allelaustausch kann durch weiße Kolonien nachgewiesen werden, wenn auf Agarmedium, das mit einer Softagarschicht überzogen ist, die das α-Naphthylphosphat BCIP-Substrat für die nicht spezifische saure Phosphatase in einem Acetatpuffer bei pH 5,5 enthält, ausplattiert wird, wie bei Kier et al. (1979, supra) beschrieben. Alle Kolonien, die keine saure Phosphataseaktivität zeigten, zeigten die Expression von xylE und hydrolysierten Catechol, wodurch ein gelber Farbstoff erzeugt wurde. Stämme, wie MGN-748 (Tabelle 1A), der die ΔphoQ2::T4P₃₂xylETT-Insertion enthielt, waren vollständig avirulent, wenn sie in Maus untersucht wurden. In Gegenwart eines Plasmids, wie pMEG-063, hydrolysiert MGN-748 nun BCIP, was die Fähigkeit zur Synthese von phoN-spezifischer saurer Phosphatase anzeigt, färbte sich jedoch auch gelb, wenn mit Catechol besprüht wurde, was die wiederhergestellte Gegenwart der xylE-Insertion innerhalb des deletierten phoQ-Gens anzeigte. Solche Stämme zeigten Wild-Typ Virulenz, wenn sie in Maus untersucht wurden, was anzeigte, dass die Komplementierung wirksam war. Diesbezüglich erzeugte die Wiedergewinnung von Bakterien aus infizierten Mäusen fünf bis sieben Tage nach der Infektion Bakterien, die immer noch pMEG-063 enthielten, die immer noch saure Phosphatase produzierten und die immer noch das xylE-Gen exprimierten. Demzufolge hatte der Einschluss des Promotor-gesteuerten xylE-Gens gefolgt von einem Transkriptionsterminator keine nachteiligen Auswirkungen in Bezug auf die Verhinderung der Komplementierung des Defekts durch ein Plasmid, das das phoPQ-Operon aufweist, oder ein anderes Testkonstrukt, das aufgrund der Deletion des phoP-Gens, wie sie in einem Plasmid, wie pMEG-068, das phoQ exprimiert, dem jedoch aufgrund der ΔphoP22-Mutation die phoP-Gensequenz fehlt, vorliegt, nur phoQ exprimiert. Dieses Experiment bestätigte auch, dass die ΔphoP22-Deletionsmutation nicht die normale Expression des stromabwärts gelegenen phoQ-Gens stört.
BEISPIEL 4
Dieses Beispiel veranschaulicht die Konstruktion der Deletionsmutation ΔphoP1918, in der der vollständige codierende Bereich des phoP-Gens zusammen mit dem Promotorbereich und dem terminalen Nukleotid des 5'-benachbarten Gens deletiert ist, ohne Insertion eines Transkriptionsterminators im Bereich der deletierten Genstelle.
Die definierte Deletion, die als ΔphoP1918 bezeichnet wird, wurde entwickelt, um das vollständige phoP-Gen und dessen Promotorregulatorsequenzen zu deletieren. Primer wurden in Bezug auf die veröffentlichte Sequenz des phoPQ-Gens (Miller et al., 1989, supra) wie folgt entwickelt: Der Vorwärtsprimer wurde von dem 5'-Ende des phoQ-Gens erhalten; der Rückwärtsprimer bestand aus stromaufwärts gelegenen phoP-Sequenzen oberhalb der –10 und –35 Bereiche; die Enden dieser Primer enthielten die Endonuklease Notl-Erkennungssequenz (GGCGCGCC) (SEQ ID NO: 23) zur Ligation und Klonierung. Der Vorwärtsprimer enthielt die Sequenz (5' nach 3') ttggcgcgcc TG AAT AAA TTT GCT CGC CAT TTT CTG (SEQ ID NO: 24) und der Rückwärtsprimer enthielt die Sequenz (5' nach 3') ttggcgcgcc TA AAC CAG ACA AAT AGT CAC CC (SEQ ID NO: 25). Die kleinen Buchstaben bezeichnen die nicht phoPQ-Sequenzen, was die Notl-Endonukleaseerkennungssequenz einschließt. Das Plasmid pEG-5381, das durch Groisman et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 7077–7081, 1989) beschrieben wurde, wurde als Basisplasmid verwendet, um die phoP1918-Deletion durch inverse Polymerasekettenreaktion (Inverse-PCR) und unter Verwendung der oben beschriebenen Vorwärts- und Rückwärtsprimer zu erzeugen. Es ist zu beachten, dass Groisman et al. das phoQ-Gen als phoZ bezeichnet haben, jedoch der nachfolgenden Verwendung der Q-Bezeichnung in einer Fußnote ihrer Veröffentlichung zustimmten. Das PCR-Produkt wurde mit der Restriktionsendonuklease Notl verdaut, ligiert und in den E. coli Stamm MGN-026 transformiert. Der resultierende Stamm MGN-2052 enthielt das Plasmid pMEG-549 (8) mit der oben beschriebenen phoP1918-Deletion. Das Plasmid pMEG-549 weist zwei Erkennungsstellen für die Endonuklease EcoRV auf und ein Verdau von pMEG-549 mit EcoRV entfernt ein DNA-Fragment mit der ΔphoP1918-Mutation. Dieses EcoRV-DNA-Fragment wurde in die Pmel-Stelle des Suizidplasmids pMEG- 375 (9) durch Ligation insertiert, wodurch pMEG-550 (10) erhalten wurde, das in den E. coli Suizidvektordonorstamm MGN-617 transformiert wurde. MGN-617 (pMEG-550) war resistent gegenüber Ampicillin und Chloramphenicol bei 100 μg/ml bzw. 25 μg/ml.
Der Stamm MGN-617 (pMEG-550) wurde verwendet, um mit den S. typhimurium Stämmen _X3761 (UK-1) und _X3339 (SL1344) (Tabelle 1A) zu konjugieren. Ex-Konjugate wurden auf Luria-Agar mit Chloramphenicol selektioniert. Einzelne Kolonien wurden auf Ampicillin- und Chloramphenicolresistenz hin überprüft und die Zellen einiger dieser Kolonien wurden gepickt und als kleine Kulturen herangezogen, die auf Luria-Agar (ohne Salz), der 5 % Sucrose enthielt, ausplattiert und bei 30 °C inkubiert wurden. Sucrose-resistente Kolonien wurden gesammelt und sowohl auf Ampicillin- als auch auf Chloramphenicolempfindlichkeiten hin gescreent. Diese Kolonien wurden ferner auf die Abwesenheit von saurer Phosphatase (weiße Kolonien im Gegensatz zu roten Wild-Typ Kolonien) unter Verwendung des sauren Phosphatase-Overlay-Tests (Kier et al., 1979) hin untersucht. Einige der weißen Kolonien, denen saure Phosphataseaktivität fehlte, wurden ferner einer Serotypisierung für die Gruppe von Salmonella und einem gleichmäßigen LPS-Profil auf SDS-Gelen unterzogen. Die ΔphoP1918-Mutationen in dem Chromosom dieser Salmonella Mutantenstämme wurden durch PCR überprüft. Die Mutantenstämme wurden als MGN-2083 bis MGN-2086 bezeichnet (Tabelle 1).
Die Sequenz der ΔphoP1918-Mutation ist wie folgt. Die ersten 70 bp sind identisch zu der Nukleotidsequenz des von Miller et al. (1989) sequenzierten phoPQ-Bereichs. Die nächsten 8 Basenpaare stellen die Notl-Erkennungssequenz GGCGCGCC (SEQ ID NO: 23) dar, wobei das C an Position 78 eine Basenpaarsubstitution für das A darstellt, mit dem die codierende Sequenz des pho-Gens in Wild-Typ S. typhimurium beginnt. Da das Startcodon für Proteine in 91 % der Fälle ATG und in 8 % der Fälle GTG und lediglich in 1 % der Fälle TTG und tatsächlich nie CTG ist, kann davon ausgegangen werden, dass das phoQ-Genprodukt in Stämmen mit der ΔphoP1918-Mutation selten synthetisiert wird. Es existieren jedoch mehrere innere Methionine, die durch ATG-Codons an den Positionen 1052, 1067, 1277, 1322, 1382 und 1526 (alle vor dem Histidincodon an Position 1643, welches das phosphorylierte Histidin kennzeichnet) codiert werden und die möglicherweise zu der Produktion eines Gentranslationsprodukts führen können.
Obwohl die vollständige Deletion des phoP-Gens als auch die Basenpaarsubstitution der ersten Base des phoQ-Gens zu Stämmen führen sollten, die zur Expression des phoP-Genprodukts oder des phoQ-Genprodukts nicht fähig sind, entfernt die Deletion auch Sequenzen stromaufwärts des phoP-Gens, wodurch nicht nur die –35 und –10 Promotorsequenzen entfernt werden, sondern auch mit einer Störung der Transkriptionstermination am Ende des purB-Gens, das in die gleiche Richtung wie phoP und phoQ transkribiert wird, gerechnet werden muss. In einigen Fällen, in denen nur eine eingeschränkte Purinkonzentration vorhanden ist, was die Situation in vivo darstellt, würde das purB-Gen in einer großen Menge exprimiert werden. Es ist vorstellbar, dass das Transkript nach dem purB-Gen weitergeht, was zu einer Transkription über die Deletion hinaus und in die codierende Sequenz des benachbarten Gens pep T, welches eine Peptidase codiert, führt. Das pep T-Gen wird jedoch in die entgegengesetzte Richtung wie purB und phoPQ transkribiert, sodass jedes Transkript, das über die Mutation in dem phoPQ-Operon hinausgeht, eine Antisense-RNA erzeugen würde, die dann die Expression des pep T-Gens durch Hybridisierung mit der pep T-mRNA inhibieren und demzufolge dessen Translation blockieren könnte. Da nicht bekannt ist, ob diese Peptidase eine wichtige Rolle in vitro oder in vivo spielt, wäre ein verbesserter Weg zur Erzeugung einer Mutation, wie beispielsweise diejenige, die durch die ΔphoP1918-Mutation erzeugt wird, einen Transkriptionsterminator, wie rrnBT1T2 oder trpATT (1), welche einer Transkription über den Mutationsdefekt hinaus vorbeugen würden, in die Deletion zu insertieren.
BEISPIEL 5
Dieses Beispiel veranschaulicht die Konstruktion von Stämmen mit der ΔphoP24-Mutation und einer Insertionssequenz, enthaltend den trpA-Transkriptionsterminator.
Die definierte ΔphoP24-Mutation wurde so entwickelt, dass sie eine Insertion eines Transkriptionsterminators enthielt, und wurde in S. typhimurium SL1344 eingebracht, um den Stamm MGN-1362 zu erzeugen.
Die ΔphoP24-Deletion wurde unter Verwendung von inverser PCR mit den Primern phoP 40–20 und phoP 815–839, welche auf der von Miller et al. (1989, supra) beschriebenen Sequenz des phoPQ-Bereichs basieren, erhalten, wodurch der vollständige codierende Bereich von phoP und 100 bp der DNA stromaufwärts des phoPQ-Klons pEG-5381 (Groisman et al., Proc. Nat. Acad. Sci. USA 86: 7077–8081, 1989) entfernt wurde. Obwohl diese Deletion den gesamten phoP-codierenden Bereich entfernt, bleibt der phoQ-codierende Bereich intakt. Dieses PCR-Produkt wurde dann mit Bg/ll und EcoRI verdaut, um innerhalb der entwickelten Primer zu schneiden und kompatible Enden für eine Ligation an die annealten trpA-Transkriptionsterminatoroligos (11) zu erzeugen. Die beschriebene Ligation führte zu der Herstellung von pMEG-359 (12). Das 3,1 kb EcoRV-Fragment von pMEG-359 wurde dann in die Smal-Stelle des Suizidvektors pMEG-149 einkloniert, wodurch das ΔphoP24-Suizidplasmid pMEG-368 (13) erzeugt wurde. Die Deletion des phoP-Bereichs und die Insertion des trpA-Transkriptionsterminators wurde dann durch Sequenzanalyse bestätigt. Da pMEG-368 ein mobilisierbarer Suizidvektor ist, der für den auswählbaren Ampicillinresistenzmarker und den auswählbaren Gegenmarker Levansucrose, was zu einer Empfindlichkeit gegenüber Sucrose führt, codiert, kann das Plasmid in jeden gewünschten Stamm eingebracht werden, der für eine Ampicillinresistenz selektioniert und nachfolgend eine Gegenselektion für den Austausch des Wild-Typ phoP-Gens mit der ΔphoP24-Mutation in Gegenwart von Sucrose ermöglicht. Der Stamm, der für die Zufuhr von pMEG-368 verantwortlich war, wurde durch Elektroporation von pMEG-368 in den Pir⁺ Asd^–-Zufuhrwirt MGN-617, um MGN-617 (pMEG-368) zu erzeugen, erhalten. Das Suizidkonstrukt pMEG-368 wurde dann durch Konjugationstransfer in den S. typhimurium SL1344 Stamm _X3339 transferiert und nachfolgend wurde auf Ampicillin-resistente Isolate hin selektioniert, die ohne DAP (Diaminopimelinsäure) wachsen. Einer der Isolate aus diesem Konjugationstransfer, MGN-1361, weist eine einzelne Integration des ΔphoP24-Deletionsplasmids in das Chromosom auf, wodurch eine Duplikation des phoP-Bereichs sowohl mit dem Wild-Typ phoP-Gen als auch mit dem mutierten ΔphoP24- Allel erzeugt wird. MGN-1361 wurde dann auf Luria-Agar, der 5 % Sucrose enthielt, ausplattiert, um nach einem Verlust des Ampicillin-resistenten Suizidvektors hin zu selektionieren. Die durch diese Selektion erhaltenen Isolate wurden dann für eine saure Phosphataseaktivität unter Verwendung des Agar-Overlay-Verfahrens von Kier et al. (J. Bacteriol. 130: 399–410, 1977) gescreent. Die weißen Phosphatase-negativen Kolonien wurden dann als ΔphoP24-Phosphatase-minus-Phenotyps bestätigt und als MGN-1362 (Tabelle 1A) gelagert.
Ferner wurde der Stamm MGN-617 (pMEG-368) verwendet, um die ΔphoP24-Mutation in eine Vielzahl von S. typhimurium, S. paratyphi A und S. typhi Stämme einzubringen. In all diesen Fällen konnten die Stämme die nicht spezifische saure Phosphatase, die durch das phoN-Gen codiert wird, nicht exprimieren und durch PCR-Analyse wurde festgestellt, dass sie etwa 730 Basenpaare DNA weniger aufwiesen als der phoPQ Wild-Typ Stamm. Dies stellt eine Deletion von 775 bp des phoP-Gens und eine Insertion von 45 bp für den trpA-Transkriptionsterminator dar.
BEISPIEL 6
Dieses Beispiel veranschaulicht die Beurteilung der S. typhimurium Mutanten mit definierten Deletionsmutationen in dem phoPQ-Operon in Bezug auf ihre phenotypischen Eigenschaften, ihre Wachstumsrate, ihre Fähigkeit, sich in Mäusen auszubreiten, und ihre Avirulenz und Immunogenität in Mäusen.
Die oben beschriebenen S. typhimurium SL1344 (_X3339) und UK-1 (_X3761) Mutanten mit den definierten Deletionsmutationen in dem phoPQ-Operon sind in Tabelle 4 aufgelistet.
TABELLE 4 S. typhimurium SL1344 (_X3339) und UK-1 (_X3761) Mutanten mit definierten Deletionsmutationen in dem phoPQ-Operon.
All diese Stämme wurden einer Phenotypcharakterisierung unter Verwendung von API-Teststreifen unterzogen, auf ihre Empfindlichkeit gegenüber verschiedenen Antibiotika unter Verwendung von Inhibitionszonen hin untersucht, indem Antibiotikaimprägnierte Discs auf einem Softagar-Overlay, das jede der zehn Mutantenstämme und ihre zwei Elternstämme enthielt, auf einer Grundlage aus Penassay-Agar platziert wurden. Alle Stämme wiesen ein API-Profil ID von 6704552 auf, was eine sehr gute Identifikation für Salmonella enterica Serotypen ist. Alle Stämme waren empfindlich für alle untersuchten Antibiotika, außer für Rifampin (5 μg Dosis), mit der Ausnahme der _X3339 SL1344-Derivate, die alle eine Resistenz gegenüber Streptomycin zeigten, was für den SL1344-Elternstamm charakteristisch ist (Tabelle 1). Alle Stämme waren frei beweglich, exprimierten Typ 1-Fimbrien, was durch Hefehämagglutination angezeigt wurde und durch Mannose inhibierbar war, und wiesen einen gleichmäßigen LPS-Phenotyp auf. Unter Verwendung des Softagar-Overlay-Assays für nicht spezifische saure Phosphatase, der durch Kier et al. (1977, supra) beschrieben wurde, wurde festgestellt, dass keine der Mutanten die nicht spezifische saure Phosphatase synthetisierte. Mutierte Derivate der in Tabelle 4 aufgelisteten Stämme, welche nicht spezifische saure Phosphatase exprimierten, können mit Häufigkeiten von 10^–7 bis 10^–9, wobei diese Häufigkeiten durch mutagene Behandlung der Kulturen erhöht werden können, isoliert werden. Die Expression der sauren Phosphatase hatte keine Auswirkungen auf die Avirulenz und Immunogenität der phoP-Mutanten und phoN-Mutanten wiesen in Bezug auf Mäuse die Wild-Typ Virulenz auf. Es ist daher offensichtlich, dass diese phoN-exprimierenden Mutanten eine Mutation aufweisen, welche eine Transkription des phoN-Gens unabhängig von dem phosphorylierten phoP-Genprodukt verursacht. Es ist ferner anzumerken, dass diese in dem ΔphoP-Hintergrund isolierten phoN-exprimierenden Mutanten alle anderen mit der Mutation in dem phoPQ-Operon verbundenen Attribute, wie Empfindlichkeit der Stämme gegenüber Abtöten durch Makrophagen, Empfindlichkeit gegenüber Defensiven, veränderte Empfindlichkeit gegenüber Polymyxin und dgl., immer noch zeigen.
Wie in den 14 und 15 gezeigt, wachsen alle S. typhimurium SL1344 Mutanten mit Gendefekten in dem phoPQ-Operon bei mehr oder weniger denselben Raten wie der elterliche Wild-Typ SL1344-Stamm _X3339. Ähnliche Ergebnisse wurden für die Wachstumsraten von S. typhimurium UK-1 Wild-Typ und phoP-Mutantenstämme erhalten, was aus 16 ersichtlich ist.
Die Bewertung der Mutanten in Bezug auf ihre Avirulenz und Immunogenität wurde unter Verwendung von acht Wochen alten weiblichen BALB/c-Mäusen durchgeführt. Die Mäuse wurden gehalten und für sieben Tage vor ihrer Verwendung in den Experimenten in Quarantäne gehalten. Die Standardprotokolle umfassten die Entfernung von Wasser und Nahrungsmitteln vier bis sechs Stunden vor einer oralen Immunisierung oder Anregung. Die Bakterien wurden in Luria-Kulturlösung bis zu einer späten Log-Phase bei einer OD₆₀₀ von etwa 0,8 herangezogen, durch Zentrifugation sedimentiert, in gepufferter Kochsalzlösung mit Gelatine in konzentrierter Form resuspendiert, sodass 20 μl Proben, die die gewünschte Anzahl von Kolonie-bildenden Einheiten (CFU) enthielten, mit einer Mikropipette hinter die hinteren Schneidezähne der zu immunisierenden oder anzuregenden Mäuse verabreicht werden konnten. Futter und Wasser wurden 30 Minuten nach der Immunisierung und/oder Anregung zurück getan. Die Mäuse wurden für dreißig Tage nach der Immunisierung beobachtet und die Überlebenden wurden angeregt und dann wiederum für weitere dreißig Tage beobachtet. Jede beobachtete todgeweihte Maus wurde eingeschläfert. Die Ergebnisse für die S. typhimurium SL1344 Stämme sind in Tabelle 5 enthalten und die Ergebnisse für fünf S. typhimurium UK-1 Mutanten sind in Tabelle 6 enthalten.
TABELLE 5 Nichtvirulenz und Immunogenität von S. typhimurium SL1344 Mutanten nach oraler Immunisierung und oralem Immunitätstest
TABELLE 6 Nichtvirulenz und Immunogenität von S. typhimurium UK-1 Mutanten nach oraler Immunisierung und oralem Immunitätstest
Da die Anzahl der Tiere, die pro Gruppe in den Tabellen 5 und 6 verwendet wurden, klein ist, ist kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen den Stämmen in Bezug auf die Avirulenz und Immunogenität festzustellen. Dennoch konnte verschiedentlich beobachtet werden, dass Mäuse, die mit höheren Titern (10⁹ CFU) des ΔphoQ1 UK-1 Stammes _X8088 oral geimpft wurden, manchmal starben und auch dass die Mäuse, welche die Immunisierung überlebten, nicht so gut gegenüber einer Anregung mit dem elterlichen Wild-Typ Stamm geschützt waren, wie nach einer Immunisierung mit ΔphoP-Mutanten. Man sollte jedoch nicht überbewerten, dass die ΔphoQ23-Mutante SL1344 vollständig avirulent und hoch immunogen war (Tabelle 5), während der eine Test, der mit der S. typhimurium UK-1 ΔphoPQ23-Mutante _X8089 durchgeführt wurde, enttäuschende Ergebnisse in Bezug auf eine Schutzimmunogenität ergab. Da andere Experimente mit rekombinanten Stämmen, die das ΔphoQ23-Allel aufwiesen, mit ausgezeichneten Ergebnissen in Bezug auf die Immunogenität durchgeführt wurden, sind die in Tabelle 6 gezeigten mit _X8089 erhaltenen Ergebnisse eher die Ausnahme als die generelle Regel.
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In Bezug auf das oben Gesagte ist festzuhalten, dass die vorliegende Erfindung zahlreiche Vorteile aufweist und vorteilhafte Ergebnisse erzielt.
Da die oben beschriebenen Verfahren und Zusammensetzungen variiert werden können, ohne vom Umfang der Erfindung abzuweichen, soll der gesamte Inhalt der obigen Beschreibung und der begleitenden Zeichnungen lediglich der Veranschaulichung dienen und den Gegenstand der Erfindung nicht einschränken.

Claims

Zusammensetzung, umfassend eine pathogene Mikrobe mit einer attenuierenden Mutation in einem chromosomalen Gen, wobei die Mutation eine einen rekombinanten Transkriptionsterminator enthaltende Insertionssequenz umfasst, in einer pharmazeutisch verträglichen Zubereitung.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 ferner umfassend ein rekombinantes, ein gewünschtes Genprodukt codierendes Gen.
Zusammensetzung nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Transkriptionsterminator rrnB 5S rRNA T1T2, trpA, T4 Gen 32, T4 iplll Gen oder rrfG 5S rRNA ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das chromosomale Gen ein pab Gen, ein pur Gen, ein aro Gen, asd, ein dap Gen, nadA, pncB, galE, pmi, fur, rpsL, ompR, htrA, hemA, cdt, cya, crp, phoP, phoQ, rfc, poxR oder galU ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die Mikrobe eine Salmonella Mikrobe, Shigella Mikrobe, Escherichia Mikrobe oder ein Hybrid davon ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei der Transkriptionsterminator in dem phoP Gen insertiert vorliegt.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 6 ferner umfassend eine Deletionsmutation in dem codierenden Bereich des Gens, in dem Promotorbereich des Gens oder in dem codierenden Bereich und dem Promotorbereich des Gens.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 7, wobei das rekombinante Gen für ein Genprodukt eines Pathogens codiert.
Zusammensetzung nach Anspruch 8, wobei das Pathogen ein Virus, ein Bakterium, ein Protozoon, ein Parasit oder ein Pilz ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 9, wobei das rekombinante Gen für ein Produkt codiert, das zur Suppression, Modulation oder Verstärkung einer Immunantwort in einem Individuum fähig ist.
Zusammensetzung nach einem der Ansprüche 2 bis 10, wobei das rekombinante Gen für ein Autoantigen oder ein Allergen eines Individuums codiert.
Zusammensetzung nach Anspruch 11, wobei das Autoantigen ein gametspezifisches Antigen ist.
Vakzine, umfassend die Mikrobe nach einem der Ansprüche 1 bis 12.
Vakzine nach Anspruch 13, wobei die Insertionssequenz keinen rekombinanten Promotor enthält.
Verwendung einer pathogenen Mikrobe mit einer attenuierenden Mutation, umfassend eine einen rekombinanten Transkriptionsterminator enthaltende Insertionssequenz, in einem chromosomalen Gen und einem rekombinanten, für das gewünschte Genprodukt codierenden Gen zur Herstellung eines Medikaments zur Verabreichung eines gewünschten Genproduktes an ein Individuum.
Verwendung nach Anspruch 15, einschließlich der in einem der Ansprüche 2 bis 12 und 14 definierten Merkmale der Mikrobe.
Verwendung einer pathogenen Mikrobe mit einer attenuierenden Mutation, umfassend eine einen rekombinanten Transkriptionsterminator enthaltende Insertionssequenz, in einem chromosomalen Gen zur Herstellung eines Medikaments zur Immunisierung eines Individuums gegen ein Pathogen.
Verwendung nach Anspruch 17, einschließlich der in einem der Ansprüche 2 bis 12 definierten Merkmale der Mikrobe.
Verwendung nach Anspruch 18, wobei die Mikrobe ferner ein rekombinantes, für ein Epitop des Pathogen codierendes Gen umfasst.
Verfahren zur Herstellung einer Träger-Mikrobe zur Verabreichung eines gewünschten Genprodukts an ein Individuum, umfassend das Erzeugen einer pathogenen Mikrobe mit einem rekombinanten, für das gewünschte Genprodukt codierenden Gen und einer attenuierenden Mutation, umfassend eine einen Transkriptionsterminator enthaltende Insertionssequenz, in einem chromosomalen Gen.
Verfahren nach Anspruch 20, einschließlich der in einem der Ansprüche 2 bis 12 definierten Merkmale der Mikrobe.