DE69637243T2

DE69637243T2 - Atelocollagen enthaltende gen-zusammensetzungen

Info

Publication number: DE69637243T2
Application number: DE69637243T
Authority: DE
Inventors: Masaaki Terada; Takahiro Ochiya; Teruo Miyata; Hiroshi Itoh
Original assignee: Koken Co Ltd; Sumitomo Dainippon Pharma Co Ltd
Current assignee: Koken Co Ltd; Sumitomo Pharma Co Ltd
Priority date: 1995-07-03
Filing date: 1996-07-02
Publication date: 2008-06-19
Anticipated expiration: 2016-07-03
Also published as: TW577747B; EP0844004A1; CA2225998A1; EP0844004A4; KR19990028522A; CN1230205C; IL122802A; NZ311175A; IL122802A0; ES2293648T3; AU6243696A; CN1193916A; ATE372787T1; DE69637243D1; AU704694B2; EP0844004B1; CA2225998C; WO1997002047A1; KR100431779B1

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet der Medizin, besonders der Gentherapie. Insbesonders betrifft die vorliegende Erfindung ein Präparat, das ein Gen enthält. Das Präparat beinhaltet stabil einen Gen-Vektor oder ein Gen, setzt es allmählich frei und behält die therapeutische Wirkung über einen langen Zeitraum bei, wenn es einem lebenden Organismus verabreicht wird. Das Präparat ermöglicht es, eine Behandlung in einem vorteilhaften Zeitraum zu stoppen.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die Gentherapie ist ein aktives Forschungsgebiet, und die Erwartungen für eine erfolgreiche Therapie sind extrem hoch. Bei gentherapeutischen Ansätzen, bei denen das Gen selbst das Arzneimittel ist, erfolgt die Therapie einer Krankheit durch die Übertragung eines Gens für ein bestimmtes Enzym, Cytokin und dergleichen in Zellen eines Patienten. Das eingeführte Gen produziert dann die bestimmte Substanz im Körper des Patienten. Diese Gentherapie kann in zwei Typen unterteilt werden. Der Zweck des ersten Typs ist die semipermanente Expression des bestimmten Gens durch Einfügen des Gens in das Genom eines Patienten. Der Zweck des anderen Typs ist die vorübergehende Expression eines Gens, ohne dass sein Einfügen in das Genom erwartet wird. Bei letzterem Typ einer Gentherapie wird oft ein Verfahren, das Adenovirus und dergleichen verwendet als ein Verfahren gewählt, um ein Gen, welches zum Beispiel ein Cytokin codiert, das die Immunstärke gegen Krebszellen erhöht, in den Patienten zu übertragen (Cardiovascular Research, 28, 445 (1994); Science, 256, 808 (1992); Gastroenterology, 106, 1076 (1994); TIBTECH, 11, 182 (1993); J. Biol. Chem., 266, 3361 (1991); Nature Medicine, 1, 583, (1995); und hierin genannte Referenzen).
Obwohl in dem Fall der Verwendung eines Virus-Vektors die Wirksamkeit der Genübertragung allgemein hoch ist, sind wiederholte Verabreichungen auf Grund von Immunantworten schwierig (J. Biol. Chem., 269, 13695 (1994), Am. J. Respir. Cell Mol., 10, 369 (1994)).
Ein Präparat, das Kollagen für die allmähliche Freisetzung von Arzneimitteln verwendet, die organische Bestandteile oder ein Proteinpräparat enthalten, wird in J. Controlled Release 33, 307–315 (1995) offenbart, usw. Die offenbarten und gewöhnlich verwendeten Arzneimittel (zum Beispiel Protein-Wirkstoff, chemisch synthetisierte Arznei usw.) sind jedoch in etwa 1–2 Tagen aufgelöst, wenn sie zum Beispiel in Kollagen-Gel eingelagert sind.
WO 94/23699 offenbart andere Träger-Moleküle, die die Aufnahme oder den Transport von Oligo-Desoxyribonukleotiden in die Zielzelle unterstützen, um Gen-Expression in Tieren oder Menschen zu steuern. Die Gruppe der vorgeschlagenen Trägerstoffe umschließt jedoch keine löslichen Kollagene (z. B. Atelokollagen).
In einem Verfahren, das zur Zeit in der Gentherapie verwendet wird und die direkte Verabreichung eines Gen-Vektors (ein Gen-inserierter Vektor) oder eines Gens umfasst, tritt der Gen-Vektor oder das Gen unmittelbar nach der Verabreichung mit den Zellen in Kontakt, und unmittelbar im Anschluss daran beginnt die Genübertragung, die sofort abgeschlossen ist. Darüber hinaus wird das Gen, das in die Zellen transduziert wird, mit der Zellteilung verdünnt (das heißt, die Anzahl seiner Kopien vermindert sich) oder wird durch Abbau in den Zellen reduziert. Daher kann die Expression des übertragenen Gens nur für mehrere Wochen aufrecht erhalten werden, was zu kurz ist, um eine ausreichende Behandlung auszuüben, und dies ist ein Mangel bei diesem Verfahren. Demzufolge sind wiederholte Verabreichungen eines Gen-Vektors oder eines Gens notwendig. Es ist daher ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung, diese Mängel zu überwinden und ein Präparat bereitzustellen, das einen Gen-Vektor oder ein Gen allmählich freisetzen und die therapeutische Wirkung über einen langen Zeitraum aufrecht erhalten kann.
Darüber hinaus wird ein Verfahren gewünscht, das wiederholte Verabreichungen ermöglicht, weil diese in Gentherapien, die einen Virus-Vektor und dergleichen verwenden, schwierig sind. Demzufolge ist ein zweiter Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Genpräparat bereitzustellen, das wiederholte Verabreichungen bei einer Gentherapie, die einen Virus-Vektor und dergleichen verwendet, ermöglicht.
Darüber hinaus ist es wünschenswert, dass die Gen-Expression in dem Körper zu jedem Zeitpunkt gestoppt werden kann, um Sicherheit zu gewährleisten, da ein Gen über mehrere Wochen exprimiert wird, was länger als der Zeitraum für eine Proteinherstellung ist. Demzufolge ist ein dritter Gegenstand der vorliegenden Erfindung, ein Genpräparat bereitzustellen, das ermöglichen kann, die Genübertragung schnell zu stoppen, wenn die Behandlung beendet werden soll.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die hier genannten Erfinder haben verschiedene Präparate zur allmählichen Freisetzung eines Gen-Vektors oder eines Gens untersucht und haben herausgefunden, dass das Gen unerwartet über viele Monate exprimiert wurde, wenn einem lebenden Körper ein Präparat verabreicht wurde, in dem ein Gen oder ein Vektor, in den ein Gen inseriert worden war, in einen Träger inkorporiert wurde, der aus bioverträglichem Material bestand. Die hier genannten Erfinder haben ebenfalls herausgefunden, dass das Präparat einem lebenden Körper wiederholt verabreicht werden kann, und auf diese Weise ist die vorliegende Erfindung vervollständigt worden.
Daher sind die kennzeichnenden Eigenschaften der vorliegenden Erfindung die folgenden.

(1) Ein Genpräparat mit verlängerter Freisetzung in einer Gelform, das ein Atelokollagen und ein vorgesehenes Gen oder einen Vektor, der das vorgesehene Gen enthält, umfasst.
(2) Das Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach Anspruch 1, wobei das Atelokollagen in einer Menge von 0,01–25 Gew./Gew.% des Präparates vorliegt.
(3) Das Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach Anspruch 1, wobei das Atelokollagen in einer Menge von 0,05–10 Gew./Gew.% des Präparates vorliegt.
(4) Das Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Präparat darüber hinaus einen Zusatz umfasst.
(5) Das Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach Anspruch 4, wobei das Atelokollagen in einer Menge von 2 Gew./Gew.% oder mehr des Präparates vorliegt, und der Zusatz in der Menge von 5–900 Gew./Gew.% des Atelokollagens vorliegt.
(6) Das Genpräparat mit verlängerter Freisetzung in Form eines Films, erhältlich durch das Trocknen eines Gels, das 0,2–30 Gew./Gew.% eines Atelokollagens und ein vorgesehenes Gen oder einen Vektor, der das vorgesehene Gen enthält, umfasst.
(7) Das Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach Anspruch 6, wobei das Atelokollagen 0,3–5 Gew./Gew.% des Gels umfasst.
(8) Das Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach Anspruch 6, wobei das Atelokollagen 0,4–2 Gew./Gew.% des Gels umfasst.
(9) Das Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das Gel darüber hinaus einen Zusatz umfasst.
(10) Das Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach Anspruch 9, wobei das Atelokollagen mit 1% oder mehr in dem Gel vorliegt, und der Zusatz mit 5–900 Gew./Gew.% des Atelokollagens, vorliegt.
(11) Ein Genpräparat mit verlängerter Freisetzung in Form eines festen Stabes, der durch das Trocknen eines Gels erhalten wird, das 10–30 Gew./Gew.% eines Atelokollagens und ein vorgesehenes Gen oder einen Vektor, der das vorgesehene Gen enthält, umfasst.
(12) Das Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach Anspruch 11, wobei das Gel darüber hinaus einen Zusatz umfasst.
(13) Das Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach Anspruch 12, wobei der Zusatz in der Menge von 5–100 Gew./Gew.% des Atelokollagens vorliegt.
(14) Ein Arzneimittel, das das Genpräparat nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und optional einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
(15) Ein Genpräparat mit verlängerter Freisetzung in Form eines Stabes, der durch das Verfahren erhalten wird, umfassend: Erhalten eines Schwamms durch Gefriertrocknung eines Gels, das 0,05 bis 5 Gew./Gew.% Atelokollagen und ein vorgesehenes Gen oder einen Vektor, der das vorgesehene Gen enthält, umfasst; Erhalten eines Gels, in dem die Konzentration an Atelokollagen 10 bis 30 Gew./Gew.% beträgt, indem dem Schwamm destilliertes Wasser zugegeben wird; Formen eines Stabes durch Pressformung des Gels; und Trocknung.
(16) Verwendung des Genpräparates nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 15 zur Herstellung eines Arzneimittels zur Bereitstellung eines Gens zur Aufnahme durch eine Zelle.
(17) Die Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Arzneimittel zur subkutanen, intramuskulären oder intraperitonealen Verabreichung an eine Person bestimmt ist.

KURZE BESCHREIBUNG DER ABBILDUNGEN
1 ist eine grafische Darstellung, die einen Zeitverlauf der Anzahl der Blutplättchen in Testbeispiel 1 und in dem Vergleichsbeispiel 1 zeigt.
2 ist eine grafische Darstellung, die einen Zeitverlauf von HST-1 in peripherem Blut in Testbeispiel 1 und in dem Vergleichsbeispiel 1 zeigt.
3 ist eine grafische Darstellung, die einen Zeitverlauf der Anzahl der Blutplättchen in Testbeispiel 4 und in dem Vergleichsbeispiel 1 zeigt.
4 ist eine grafische Darstellung, die einen Zeitverlauf der Anzahl der Blutplättchen in Testbeispiel 5 zeigt.
5 ist eine grafische Darstellung, die die Dosis-Abhängigkeit von Kollagen von der Menge an HST-1 in peripherem Blut im Testbeispiel 6 zeigt.
6 ist eine grafische Darstellung, die einen Zeitverlauf der Anzahl der Blutplättchen in Testbeispiel 7 und in dem Vergleichsbeispiel 2 zeigt.
GENAUE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung wird nachstehend genauer beschrieben.
„Ein Vektor zur Gen-Insertion" kann jeder beliebige Vektor sein, der ein Gen in Zellen übertragen kann, und umschließt zum Beispiel einen Virus-Vektor, einen Liposomen-Vektor, einen fusogenen Liposomen-Vektor, in dem ein Virus und ein Liposom fusioniert sind, oder dergleichen (Cardiovascular Research, 28, 445 (1994); Science, 256, 808 (1992); Gastroenterology, 106, 1076 (1994); TIBTECH, 11, 182 (1993); J. Biol. Chem., 266, 3361 (1991); Nature Medicine, 1, 583, (1995); und darin genannte Referenzen).
Ein Virus-Vektor kann jeder beliebige Vektor sein, der als ein gewöhnlicher Vektor in der Gentherapie verwendet werden kann, und schließt zum Beispiel ein Adenovirus, ein Adeno-assoziiertes Virus, ein Vaccinia-Virus, ein Retrovirus, ein HIV-Virus, ein Herpesvirus oder dergleichen ein. Der Gen-Vektor kann erhalten werden, indem ein Gen zur Übertragung nach einem herkömmlichen Verfahren, wie zum Beispiel in den vorstehenden Referenzen beschrieben, direkt in einen Virus-Vektor inseriert wird.
Ein Liposomen-Vektor kann jeder beliebige Vektor sein, der als ein gewöhnlicher Liposomen-Vektor in der Gentherapie verwendet werden kann, und schließt zum Beispiel einen Liposomen-Vektor ein, der durch das Mischen von DOTMA, DOPE, DOGS usw. erhalten wird. Wenn ein kationischer Liposomen-Vektor verwendet wird, ist die Wirksamkeit der Übertragung in Zellen hoch. Beispiele für den fusogenen Liposomen-Vektor, in dem ein Virus und ein Liposom fusioniert sind, umschließen einen fusogenen Liposomen-Vektor, in dem ein Sendai-Virus (HVJ: japanisches hämagglutinierendes Virus) und ein Liposom fusioniert sind, und dergleichen. Ein Gen-Vektor kann erhalten werden, indem ein Gen zur Übertragung in einen Liposomen-Vektor oder einen fusogenen Liposomen-Vektor nach einem herkömmlichen Verfahren, wie zum Beispiel in den vorstehend genannten Referenzen beschrieben, eingeschlossen wird. Das eingeschlossene Gen kann in jeder beliebigen Form vorliegen, in der das Gen in einem lebenden Körper exprimiert werden kann, und ist bevorzugt eine Form, die in einem lebenden Körper stabil ist, wie etwa ein Plasmid usw.
Ein Gen selbst kann in einem Genpräparat der vorliegenden Erfindung erhalten werden, ohne in „einen Vektor zur Gen-Insertion", der ein Gen in Zellen überträgt, inseriert zu werden. In diesem Fall kann eine Form eines Gens jede beliebige Form sein, in der das Gen in einem lebenden Körper exprimiert werden kann. Zum Beispiel kann ein Gen in einen sogenannten Expressionsvektor und dergleichen inseriert sein. Eine Form eines Gens ist bevorzugt eine Form, die in einem lebenden Körper stabil ist, wie etwa ein Plasmid usw.
„Ein Gen" zur Übertragung kann jedes beliebige Gen sein, das in der Gentherapie verwendet werden kann, und schließt zum Beispiel ein Adenosin-Desaminase-Gen, ein GM-CSF-Gen, ein Thymidin-Kinase-Gen oder dergleichen ein.
„Bioverträgliches Material" ist das Material, das hohe Bioverträglichkeit aufweist, und es kann einen Gen-Vektor oder ein Gen in einem lebenden Körper stabil erhalten.
Das zu verwendende bioverträgliche Material ist Atelokollagen.
„Ein Zusatz" kann einem Präparat der vorliegenden Erfindung im Einklang mit der Notwendigkeit zur Stabilisierung eines Gen-Vektors und dergleichen, zur Beschleunigung der Genübertragung in Zellen oder Zellkerne oder zur Regulierung der Freisetzung eines Gen-Vektors und dergleichen zugesetzt werden. Ein Zusatz kann jeder beliebige Zusatz sein, der den Zweck erfüllen kann, und umschließt zum Beispiel Saccharose, Glycin, Chondroitinsulfat, Gelatine, Albumin, Cytokin, ein Gemisch aus High Mobility Group Proteins HGM-1 und HGM-2 (High Mobility Group-1, -2 Mixture; Experimental Medicine, 12, 184 (1994), BIOTHERAPY, 8, 1265 (1994)), Chloroquin, Polylysin (Hepatology, 22, 847 (1995)), Transfectam (Handelsmarke, Wako Pure Chemical Industries, Ltd.) oder dergleichen.
In dem Fall, in dem Atelokollagen mit einem anderen bioverträglichen Material oder einem Zusatz vermischt wird, kann der Gehalt an Kollagen mindestens 10 Gew./Gew.%, bevorzugt mindestens 30 Gew./Gew.%, mehr bevorzugt mindestens 50 Gew./Gew.% und am meisten bevorzugt mindestens 70 Gew./Gew.% umfassen.
Der Gehalt an bioverträglichem Material in dem Genpräparat variiert in Abhängigkeit von Größe, Art und dergleichen des Gen-Vektors oder des Gens und Art und dergleichen des bioverträglichen Materials.
Ein bevorzugter Gehalt an bioverträglichem Material in einem Genpräparat beträgt 0,01–30 Gew./Gew.% unter der Bedingung, dass sich das Genpräparat in einem lebenden Körper befindet, mehr bevorzugt 0,05–10 Gew./Gew.%, und am meisten bevorzugt 0,05–5 Gew./Gew.%.
Darüber hinaus variiert der Gehalt an bioverträglichem Material in dem Genpräparat in Abhängigkeit von der jeweiligen Zusammensetzung.
Wenn das Präparat in Gel-Form vorliegt, beträgt ein bevorzugter Gehalt an Atelokollagen 0,01–25 Gew./Gew.%, mehr bevorzugt 0,05–10 Gew./Gew.%, am meisten bevorzugt 0,05–5 Gew./Gew.%. Wenn jedoch der Gehalt an Atelokollagen 2 % oder mehr beträgt, ist es bevorzugt, dass ein Zusatz mit 5–900 Gew./Gew.% bezogen auf Atelokollagen zugegeben wird.
Wenn das Präparat in Form eines Films vorliegt, beträgt ein bevorzugter Gehalt an Atelokollagen 0,2–30 Gew./Gew.% als ein Gehalt vor der Trocknung, mehr bevorzugt 0,3–5 Gew./Gew.%, am meisten bevorzugt 0,4–2 Gew./Gew.%. Wenn jedoch ein Gehalt an Atelokollagen 1% oder mehr beträgt, ist es bevorzugt, dass ein Zusatz mit 5–900 Gew./Gew.% bezogen auf Atelokollagen zugegeben wird.
Wenn das Präparat in Form eines festen Stabes vorliegt, beträgt der bevorzugte Gehalt an Atelokollagen 10–30 Gew./Gew.%, und es ist vorteilhaft, dass ein Zusatz mit 5–100 Gew./Gew.% bezogen auf Kollagen zugegeben wird.
Ein Genpräparat der vorliegenden Erfindung ist nicht auf eine spezifische Form beschränkt. Das Präparat kann als Lösung, Suspension, Wasser enthaltendes Gel, Film oder Schwamm vorliegen. Feste Formen können als Stab, Kugel und dergleichen geformt werden. Eine bevorzugte Form ist jedoch allgemein eine Lösung, Suspension oder ein Wasser enthaltendes Gel, obgleich die Form des Präparates in Abhängigkeit von Art, Größe und dergleichen eines Vektors für die Geninsertion variiert.
Ein Genpräparat wird erhalten, indem unter der Bedingung, dass sich das Genpräparat in einem lebenden Körper befindet, ein Gehalt an Atelokollagen in dem Genpräparat innerhalb des vorstehend genannten, bevorzugten Bereiches gehalten wird.
Beispiele für Verfahren zur Herstellung eines Genpräparates in Form einer Lösung, Suspension oder eines Wasser enthaltenden Gels umschließen (1) ein Verfahren, das das Vermischen eines Pulvers, einer Lösung, Suspension oder eines Gels eines Gen-Vektors oder eines Gens (nachstehend als ein Gen-Vektor und dergleichen bezeichnet) mit einem Trägerstoff in Form einer Lösung oder eines Gels, dem je nach Notwendigkeit ein Zusatz zugegeben worden ist, umfasst, (2) ein Verfahren, welches das Eindringen einer Lösung, Suspension oder eines Gels eines Gen-Vektors und dergleichen in einen Trägerstoff, der in Pulverform vorliegt und dem je nach Notwendigkeit ein Zusatz zugegeben worden ist, ermöglicht, oder (3) ein Verfahren, welches das Eindringen einer Lösung, Suspension oder eines Gels eines Gen-Vektors und dergleichen in einen Trägerstoff ermöglicht, der als Schwamm vorliegt und dem je nach Notwendigkeit ein Zusatz zugegeben worden ist, und deren Zusammenkneten umfasst. Die Verfahren zur Herstellung eines Genpräparates der vorliegenden Erfindung sind nicht auf solche Verfahren begrenzt.
Beispiele für Verfahren zur Herstellung eines Genpräparates in einer festen Form umschließen (1) ein Verfahren, welches das Vermischen eines Pulvers, einer Lösung, Suspension oder eines Gels eines Gen-Vektors und dergleichen mit einem Trägerstoff in Form einer Lösung oder eines Gels, der/dem je nach Notwendigkeit ein Zusatz zugegeben worden ist, und Trocknung des Gemisches umfasst, (2) ein Verfahren, das das Vermischen eines Pulvers, einer Lösung, Suspension oder eines Gels eines Gen-Vektors und dergleichen mit einem Trägerstoff in Pulverform, dem je nach Notwendigkeit ein Zusatz zugegeben worden ist, und die Trocknung des Gemisches umfasst, (3) ein Verfahren, das das Eindringen einer Lösung, Suspension oder eines Gels eines Gen-Vektors und dergleichen in einen Trägerstoff in Form eines Schwamms ermöglicht, dem je nach Notwendigkeit ein Zusatz zugegeben worden ist, und Trocknung des Schwamms umfasst, (4) ein Verfahren, dass das Eindringen einer Lösung, Suspension oder eines Gels eines Gen-Vektors und dergleichen in einen Trägerstoff in Form eines Schwamms ermöglicht, dem je nach Notwendigkeit ein Zusatz zugegeben worden ist, und die Trocknung des Schwamms als solchem oder Verkneten und Trocknen des Schwammes nach Zugabe von Wasser und dergleichen je nach Notwendigkeit umfasst, (5) ein Verfahren, das das Zerschlagen und Pressformen eines festen Produktes, welches durch ein Verfahren nach den Punkten (1) bis (4) erhalten worden ist, umfasst, oder (6) ein Verfahren, welches das Vermischen eines Pulvers eines Gen-Vektors und dergleichen mit einem Trägerstoff, welcher als Pulver vorliegt, dem je nach Notwendigkeit ein Zusatz zugegeben worden ist, und Pressformen des Gemisches umfasst. Die vorliegende Erfindung ist nicht auf solche Verfahren begrenzt. Das Trocknungsverfahren, Temperatur und Feuchtigkeit während der Trocknung, Mischverfahren, Temperatur und Feuchtigkeit während des Vermischens; Verfahren des Pressformens; Temperatur, Feuchtigkeit und Pressdruck während des Pressformens; Lösungsgeschwindigkeit der Trägerstoff-Lösung und der Gen-Vektor-Lösung und Lösungsgeschwindigkeit des Gemisches aus Trägerstoff- und Gen-Vektor-Lösung und der pH-Wert können genau wie jene in herkömmlichen Verfahren sein.
Ein Genpräparat der vorliegenden Erfindung kann im Einklang mit der zu behandelnden Krankheit, dem angezielten Organ und dergleichen durch zahlreiche Verfahren verabreicht werden. Zum Beispiel kann ein Genpräparat der vorliegenden Erfindung subkutan oder intramuskulär verabreicht werden, oder es kann direkt an angezielte Stellen der Erkrankung wie etwa Niere, Leber, Lunge, Gehirn und dergleichen verabreicht werden. Direkte Verabreichung an die Krankheitsstelle ermöglicht eine Organ-selektive Therapie.
Darüber hinaus sind wiederholte Verabreichungen möglich.
Wenn andererseits eine Unterbrechung des Gen-Transfers in Abhängigkeit von der Art oder dem Zustand der Krankheit erforderlich ist, kann ein Genpräparat sofort herausgenommen werden, und der Gen-Transfer kann gestoppt werden. Wenn zum Beispiel ein Genpräparat ein Feststoff ist, kann es durch eine Operation oder dergleichen entfernt werden. Wenn eine Gentherapie durchgeführt wird, indem ein Genpräparat verwendet wird, in dem ein Gen-Vektor und dergleichen in einem Gefäß oder dergleichen zurückgehalten wird, welches Poren besitzt, durch die ein Virus frei passieren kann, kann das Gefäß oder dergleichen nach Beendigung der Behandlung entfernt werden. Zum Beispiel kann eine Gen-Therapie durchgeführt werden, indem ein Gefäß (Schlauch) verwendet wird, wie in der Japanischen Patentanmeldung Nr. 3(1991)-120115 (Internationale Veröffentlichungsnummer WO92/20400 ) beschrieben wird.
Ein Genpräparat der vorliegenden Erfindung kann einen Gen-Vektor und dergleichen allmählich freisetzen und kann gleichzeitig einen geninserierten Vektor und dergleichen während der verlängerten Freisetzung stabil in einem lebenden Körper erhalten. Auf diese Weise kann die Zeit der wirksamen Gen-Expression nach einer einmaligen Verabreichung verlängert werden, indem der Zeitraum des Gen-Transfers in die Zellen hinein durch Verlängerung des Kontaktes zwischen Zellen und Vektoren gesteuert wird.
Ein Genpräparat der vorliegenden Erfindung ermöglicht auch wiederholte Verabreichungen eines Gen-Vektors wie etwa eines Virus-Vektors und dergleichen, dessen wiederholte Verabreichung ansonsten auf Grund des Auftretens von neutralisierenden Antikörpern in einem Körper schwierig ist.
Darüber hinaus ermöglicht ein Genpräparat der vorliegenden Erfindung die Regulierung von Gen-Expression, weil das Genpräparat entfernt werden kann, wenn eine Beendigung der Behandlung gewünscht wird.
Beispiele
Beispiel 1
Ein Genpräparat wurde hergestellt, indem 0,9 ml Kulturmedium, das 10⁹ PbE (plaque-bildende Einheit) eines Adenovirus (Adex1 HST-1; Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Bd. 91., 12368 (1994)), dem ein den Fibroblasten-Zell-wachstumsfaktor HST-1 (FGF4) codierendes Gen inseriert worden war (hergestellt nach dem Verfahren, das in Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 2980–2984 (1987) beschreiben wird), mit 0,1 ml neutraler Atelokollagen-Lösung (Atelokollagen-Implantat, hergestellt von KOKEN: 2% Atelokollagen-Lösung) vermischt wurde. Das vorstehend genannte Adenovirus (Adex1 HST-1) kann gewonnen werden, indem ein Teil von E1A, E1B und E3 des Adenovirus Typ 5 (ATCC-Katalog Nr. VR-5) im Einklang mit einem Verfahren, das in J. Virol., 54, 711–719 (1985) oder Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 92, 1320 (1996) und Cell, 13, 181–188 (1978) beschrieben ist, deletiert wird; und ein Gen des Fibroblasten-Zellenwachstumsfaktors HST-1 in das Gen eines nicht proliferativen Typs von Adenovirus inseriert wird.
Beispiel 2
Ein Genpräparat in Gel-Form wird hergestellt, indem 0,1 ml der neutralen Lösung mit 2% Atelokollagen mit 0,9 ml Kulturmedium, das 10⁹ PbE Adex1 HST-1 enthält, vermischt wird, und das Gemisch dann bei 37°C gehalten wird.
Beispiel 3
Ein Genpräparat wird hergestellt, indem durch Lyophilisierung einer neutralen Atelokollagen-Lösung ein Schwamm gewonnen wird; der Schwamm in etwa 5 qmm große Teile zerschnitten wird; der zerschnittene Schwamm zu 1 ml Kulturmedium, das 10⁹ PbE Adex1 HST-1 enthält, gegeben wird; und der Schwamm über Nacht stehen gelassen wird.
Beispiel 4
Ein Genpräparat wird hergestellt, indem ein Genpräparat in Gel-Form, das in Beispiel 2 hergestellt worden ist, lyophilisiert wird.
Beispiel 5
Ein Genpräparat in Form von Pellets (ein komprimiertes Produkt in Form eines Stabes) wird hergestellt, indem das Genpräparat, das in Beispiel 3 gewonnen wird, wiederum lyophilisiert wird und der lyophilisierte Schwamm in die Form eines Stabes gepresst wird.
Beispiel 6
Ein Genpräparat wird hergestellt, indem ein Plasmid-Vektor, der erhalten wird, indem der Fibroblasten-Zellwachstumsfaktor HST-1 (FGF4) in einen Expressionsvektor, der einen Cytomegalievirus (CMV)-Promotor aufweist, inseriert wird (pRc/CMV), mit einem Liposom (DMRIE-C (hergestellt von GIBCO-BRL)) vermischt wird, und dann eine Lösung, die das Liposom enthält, mit dem gleichen Volumen an neutraler Atelokollagen-Lösung vermischt wird.
Beispiel 7
Ein Genpräparat wird hergestellt, indem das Genpräparat, das in Beispiel 1 gewonnen wurde, in eine aus Polyester hergestellte Tasche (hergestellt aus einem künstlichen Blutgefäß) (Micron (Handelsname, hergestellt von INTERVASCULAR) eingeschlossen wird.
Beispiel 8
Genau wie in Beispiel 1 wurde 1 ml eines Genpräparates hergestellt, indem Kulturmedium, das 10⁹ PbE Adex1 HST-1 enthielt, mit neutraler Atelokollagen-Lösung vermischt wurde, so dass 0,1, 0,2, 0,4, 1,0 oder 2,0 Gew./Gew.% als Endkonzentration an Atelokollagen erhalten werden.
Beispiel 9
Ein Genpräparat in Gel-Form wird hergestellt, indem 5 ml einer wässrigen Lösung, die ein Plasmid pOG44 (erworben von Stratagene) in einer Konzentration von 73,25 μg/ml enthält, mit 5 g saurer Atelokollagen-Lösung (2% Atelokollagen enthaltend, pH-Wert 3,5) vermischt werden; das Gemisch lyophilisiert wird, um einen Schwamm zu erhalten; destilliertes Wasser zu dem Schwamm zugegeben wird, um 0,4, 2, 5, 10 oder 20 Gew./Gew.% einer Atelokollagen-Konzentration zu bekommen.
Beispiel 10
Ein Genpräparat in Gel-Form wird hergestellt, indem 5 ml einer wässrigen Lösung, die ein Plasmid pOG44 in einer Konzentration von 73,25 μg/ml enthält, mit 5 g oder 2,5 g einer sauren Atelokollagen-Lösung vermischt werden; dem Gemisch 260 μl oder 640 μl einer wässrigen Lösung aus menschlichem Serumalbumin (80 mg/ml) zugegeben werden und vermischt werden; das Gemisch lyophilisiert wird, um einen Schwamm zu erhalten; destilliertes Wasser zu dem Schwamm zugegeben wird, um 10 Gew./Gew.% in der Gesamtkonzentration an Atelokollagen und menschlichem Serumalbumin zu erhalten.
Beispiel 11
Ein Genpräparat in Form eines Filmes wird hergestellt, indem das Genpräparat in Gel-Form, das in Beispiel 9 erhalten wurde, auf Glas ausgebreitet und stufenweise getrocknet wird.
Beispiel 12
Ein Genpräparat in Form eines Stabes wird hergestellt, indem das Genpräparat in Gel-Form, das in Beispiel 9 oder 10 erhalten wurde, pressgeformt und stufenweise getrocknet wird.
Vergleichsbeispiel 1
1 ml Kulturmedium, das 10⁹ PbE Adex HST-1 enthielt, wurde einer Maus intraperitoneal verabreicht. Dann, etwa am 12. Tag nach der Verabreichung, stieg die Anzahl der Blutplättchen etwa um das zweifache, und diese Wirkung hielt bis zum 20.–30. Tag an. Darüber hinaus betrug die Konzentration an HST-1 im peripheren Blut 50 ng/ml und erreichte ihr Maximum am 20. Tag nach der Verabreichung. Die Konzentration an HST-1 konnte jedoch, anders als bei dem Präparat aus Beispiel 1, nachstehend, nicht auf einem konstanten Spiegel gehalten werden, und HST-1 konnte am 60. Tag nach der Verabreichung nicht im Blut nachgewiesen werden. Diese Ergebnisse werden in den 1 und 2 dargestellt.
Testbeispiel 1
1,0 ml eines Genpräparates, das in Beispiel 1 hergestellt worden ist, wurde einer Maus intraperitoneal verabreicht. Dann, etwa am 12. Tag nach der Verabreichung, erhöhte sich die Anzahl der Blutplättchen etwa um das Zweifache, und diese Wirkung hielt bis über den 50. Tag hinaus an. Darüber hinaus wurde die Konzentration von HST-1 im peripheren Blut auf 20 ng/ml bis über den 80. Tag nach der Verabreichung hinaus beibehalten. Diese Ergebnisse werden in den 1 und 2 dargestellt.
Testbeispiel 2
1,0 ml eines Genpräparates, hergestellt wie in Beispiel 2, wird einer Maus intraperitoneal verabreicht. Dann, etwa am 12. Tag nach der Verabreichung, erhöht sich die Anzahl der Blutplättchen etwa um das Zweifache, und diese Wirkung hält bis über den 60. Tag nach der Verabreichung hinaus an.
Testbeispiel 3
Ein Genpräparat, hergestellt wie in Beispiel 3, wird einer Maus intraperitoneal verabreicht. Dann, etwa am 12. Tag nach der Verabreichung, erhöht sich die Anzahl der Blutplättchen etwa um das Zweifache, und diese Wirkung hält bis über den 60. Tag nach der Verabreichung hinaus an.
Testbeispiel 4
Ein Genpräparat, das in Beispiel 1 hergestellt worden ist, wurde einer Maus intraperitoneal verabreicht, und das Genpräparat wurde am dritten Tag nach der Verabreichung entfernt. Als ein Ergebnis verdoppelte sich die Anzahl der Blutplättchen annähernd etwa am 12. Tag nach der Verabreichung, sank dann ab und kehrte etwa am 25. Tag nach der Verabreichung auf den normalen Spiegel zurück. Diese Ergebnisse werden in 3 dargestellt.
Testbeispiel 5
Ein Genpräparat, das in Beispiel 1 hergestellt worden ist, wurde einer Maus intraperitoneal verabreicht, und das Genpräparat wurde am dritten Tag nach der Verabreichung entfernt. Am 20. Tag nach der Verabreichung wurde ein Genpräparat, das in Beispiel 1 hergestellt worden ist, erneut verabreicht. Als ein Ergebnis verdoppelte sich die Anzahl der Blutplättchen annähernd etwa am 12. Tag nach der Verabreichung, sank dann ab und kehrte etwa am 20. Tag nach der Verabreichung auf den normalen Spiegel zurück. Unmittelbar nach der zweiten Verabreichung stieg die Anzahl der Blutplättchen etwa um das Zweifache, und diese Wirkung hielt bis über den 40. Tag nach der ersten Verabreichung hinaus an. Diese Ergebnisse werden in 4 dargestellt.
Testbeispiel 6
Jedes von 5 Genpräparaten, die in Beispiel 10 hergestellt worden sind, oder 1 ml Kulturmedium, das 10⁹ PbE Adex HST-1 enthielt und vollständig frei von Kollagen war, wurde einer Maus intraperitoneal verabreicht. Die Konzentration des HST-1-Proteins im peripheren Blut wurde am 5. Tag nach der Verabreichung bestimmt. Die Ergebnisse werden in 5 dargestellt. Die Daten zeigen, dass die Serumkonzentration des HST-1-Proteins mit der ansteigenden Konzentration an Kollagen in dem Präparat sank.
Testbeispiel 7
Als ein Ergebnis, dass 1 ml Kulturmedium, das 10⁹ PbE Adex HST-1 enthielt, einer Maus intraperitoneal verabreicht worden war, verdoppelte sich die Anzahl der Blutplättchen annähernd am 12. Tag nach der Verabreichung, sank dann ab und kehrte etwa am 35. Tag nach der Verabreichung auf den normalen Spiegel zurück. Am 37. Tag nach der ersten Verabreichung wurde 1 ml eines Atelokollagen enthaltenden Genpräparates, das in Beispiel 1 hergestellt worden war, erneut verabreicht. Unmittelbar darauf stieg die Anzahl der Blutplättchen etwa um das Zweifache, und diese Wirkung blieb während des gesamten noch verbleibenden Zeitraums des Experimentes bestehen. Diese Ergebnisse werden in 6 dargestellt.
Vergleichsbeispiel 2
1 ml Kulturmedium, das 10⁹ PbE Adex HST-1 enthielt, wurde einer Maus intraperitoneal verabreicht, und am 37. Tag nach der ersten Verabreichung noch einmal verabreicht. Als ein Ergebnis verdoppelte sich die Anzahl der Blutplättchen annähernd etwa am 12. Tag nach der ersten Verabreichung, sank dann ab und kehrte etwa am 35. Tag nach der ersten Verabreichung auf den normalen Spiegel zurück. Die Blutplättchen vermehrten sich nach der zweiten Verabreichung von Adex HST-1 nicht. Diese Ergebnisse werden in 6 dargestellt.
Die Ergebnisse im Testbeispiel 7 und im Vergleichsbeispiel 2 offenbaren, dass es möglich ist, ein Genpräparat, das in Beispiel 1 hergestellt worden ist, wiederholt zu verabreichen, im Gegensatz zu dem Ergebnis, das für wiederholte Verabreichungen eines Adenovirus-Vektors erhalten wird, der nicht im Einklang mit der vorliegenden Erfindung formuliert worden ist. Die Unmöglichkeit, eine wiederholte Verabreichung vorzunehmen, ist auf das Auftreten von neutralisierenden Antikörpern zurückzuführen.

Claims

Genpräparat mit verlängerter Freisetzung in Gelform, umfassend ein Atelokollagen und ein vorgesehenes Gen oder einen Vektor, der das vorgesehene Gen umfasst.
Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach Anspruch 1, wobei das Atelokollagen in einer Menge von 0,01–25 Gew./Gew.% des Präparats vorliegt.
Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach Anspruch 1, wobei das Atelokollagen in einer Menge von 0,05–10 Gew./Gew.% des Präparats vorliegt.
Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei das Präparat ferner einen Zusatz umfasst.
Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach Anspruch 4, wobei das Atelokollagen in einer Menge von 2 Gew./Gew.% oder mehr des Präparats vorliegt, und der Zusatz in einer Menge von 5–900 Gew./Gew.% des Atelokollagens vorliegt.
Genpräparat mit verlängerter Freisetzung in Form einer Folie, die erhältlich ist durch das Trocknen eines Gels, umfassend 0,2–30 Gew./Gew.% eines Atelokollagens und ein vorgesehenes Gen oder einen Vektor, der das vorgesehene Gen umfasst.
Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach Anspruch 6, wobei das Atelokollagen mit 0,3–5 Gew./Gew.% in dem Gel vorliegt.
Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach Anspruch 6, wobei das Atelokollagen mit 0,4–2 Gew./Gew.% in dem Gel vorliegt.
Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach einem der Ansprüche 6 bis 8, wobei das Gel ferner einen Zusatz umfasst.
Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach Anspruch 9, wobei das Atelokollagen mit 1% oder mehr in dem Gel vorliegt und der Zusatz mit 5–900 Gew./Gew.% des Atelokollagens vorliegt.
Genpräparat mit verlängerter Freisetzung in Form eines festen Stabes, erhältlich durch das Trocknen eines Gels, umfassend 10–30 Gew./Gew.% eines Atelokollagens und ein vorgesehenes Gen oder einen Vektor, der das vorgesehene Gen umfasst.
Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach Anspruch 11, wobei das Gel ferner einen Zusatz umfasst.
Genpräparat mit verlängerter Freisetzung nach Anspruch 12, wobei der Zusatz in der Menge von 5–100 Gew./Gew.% des Atelokollagens vorliegt.
Arzneimittel, das das Genpräparat nach einem der Ansprüche 1 bis 13 und gegebenenfalls einen pharmazeutisch verträglichen Träger umfasst.
Genpräparat mit verlängerter Freisetzung in Stabform, erhältlich durch das Verfahren, welches umfasst: Erhalten eines Schwammes durch Gefriertrocknung eines Gels, umfassend 0,05 bis 5 Gew./Gew.% eines Atelokollagens und ein vorgesehenes Gen oder einen Vektor, der das vorgesehene Gen umfasst; Erhalten eines Gels, in welchem die Konzentration von Atelokollagen 10 bis 30 Gew./Gew.% beträgt, durch Hinzufügen von destilliertem Wasser zu dem Schwamm; Formen eines Stabes durch Pressformen des Gels; und Trocknen.
Verwendung des Genpräparats nach einem der Ansprüche 1 bis 13 oder erhältlich durch das Verfahren nach Anspruch 15 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Bereitstellung eines Gens für die Aufnahme durch eine Zelle.
Verwendung nach Anspruch 16, wobei das Arzneimittel zur subkutanen, intramuskulären oder intraperitonealen Verabreichung an eine Person bestimmt ist.