DE69832993T2

DE69832993T2 - Arginin deiminase aus mycoplasma arthirtidis und sie enthaltende polymerkonjugate

Info

Publication number: DE69832993T2
Application number: DE69832993T
Authority: DE
Inventors: Ray David FILPULA; Maoling Wang
Original assignee: Enzon Inc
Current assignee: Enzon Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1997-01-31
Filing date: 1998-01-27
Publication date: 2006-09-07
Anticipated expiration: 2018-01-28
Also published as: ES2255147T3; US5804183A; AU6047598A; US5916793A; EP1011717B1; WO1998033519A1; JP4126097B2; EP1011717A1; DE69832993D1; DK1011717T3; JP2001512965A; US6132713A; EP1011717A4; ATE314086T1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine neue Arginindeiminase und lang wirkende Arginindeiminase-enthaltende Zusammensetzungen. Insbesondere betrifft die Erfindung im Wesentlichen nicht antigene Polymerkonjugate, die die von Mycoplasma arthritidis abgeleitete Arginindeiminase enthalten und die hohe Werte an bewahrter Enzymaktivität zeigen.
Das Konjugieren biologisch aktiver Proteine oder Enzyme mit Polymeren legte nahe, dass eine oder mehrere der Eigenschaften der Lebensdauer, Wasserlöslichkeit oder Antigenizität in vivo verbessert werden. Zum Beispiel sind einige der Anfangskonzepte des Koppelns von Peptiden oder Polypeptiden an Polyethylenglycol (PEG) und ähnlichen wasserlöslichen Polymeren im U.S.-Patent Nr. 4,179,337 offenbart, auf deren Offenbarung hierin verwiesen wird. Die Konjugate werden durch Umsetzen eines biologisch aktiven Materials mit mehrfachem molaren Überschuss eines Polymers gebildet, das derart modifiziert wurde, dass es eine endständige Kopplungsgruppe enthält. Insulin und Hämoglobin befanden sich unter den ersten konjugierten therapeutischen Wirkstoffen. Diese verhältnismäßig großen Polypeptide enthalten etliche freie ε-Aminoanlagerungsstellen. Etliche Polymere konnten ohne wesentlichen Verlust der biologischen Aktivität angelagert werden.
Das Konjugationsverfahren verläuft jedoch nicht ohne Komplikationen. Die übermäßige Polymerkonjugation oder Reaktionen unter Verwendung molarer Überschüsse des Polymers über bestimmte Verhältniszahlen hinaus können zur Bildung von inaktiven Konjugaten und Konjugaten mit unzureichender Aktivität führen. Probleme können sich häufig ergeben, wenn die aktive Stelle (d.h. an welcher sich die mit der Bioaktivität verbundenen Gruppen befinden) in dem Protein oder Enzym aufgrund der kovalenten Polymeranlagerung blockiert wird. Es kann schwierig sein, dieses Problem zu vermeiden, da das Polymer und das Protein oder Enzym in Reaktionen auf Lösungsbasis typischerweise zusammengefügt werden. Es wurde die Vorblockierung der aktiven Stellen mit reversiblen Materialien, wie z.B. Pyridoxalphosphat nahe gelegt, jedoch waren die Ergebnisse widersprüchlich. Die Probleme sind mit Proteinen und Peptiden mit relativ niedrigerem Molekulargewicht besonders akut. Diese bioaktiven Materialien weisen häufig wenige Anlagerungsstellen auf, die nicht mit der Bioaktivität verbunden sind.
Die Arginindeiminase (ADI) ist ein Enzymtyp, auf den sich verbesserte Polymerkonjugationsverfahren positiv auswirken könnten. ADI ist ein Enzym, das Arginin hydrolysiert, und es wurde postuliert, dass die Verarmung an Arginin eine zerstörende Wirkung auf bestimmte Tumore hat. Insbesondere hydrolysiert das Enzym die Guanidiniumgruppe von L-Arginin zu L-Citrullin und Ammoniak. Das ADI-Enzym ist auch als Arginindihydrolase, Arginindesiminase oder Guanidinodesiminase bekannt. Obwohl die ADI von anderen Arten von Mycoplasma-Stämmen sowie anderen Mikroorganismusquellen, wie z.B. Pseudomonas und Streptococcus, erhalten wurde, gibt es eine Variabilität in dem erhaltenen Enzym. Insbesondere stellt jeder Wirtsstamm ein Enzym her, das eine unterschiedliche Anzahl von Lysinen sowie Variationen in der aktiven Stelle aufweist, um ein Enzym herzustellen, das eine unterschiedliche Primärsequenz und Anzahl und Lage von Lysinen aufweist.
Etliche Polymer-Arginindeiminase-Konjugate wurden bisher nahe gelegt. Siehe z.B. Jpn. J. Cancer Res. 84, 1195–1200, Nov. 1993, das unter anderem die mit Methoxypolyethylenglycol-4,6-dichlor-1,3,5-triazin konjugierte Arginindeiminase von Mycoplasma arginini beschreibt. Die vorigen, bis heute hergestellten Arginindeiminase-Polymer-Konjugate galten als inakzeptabel. Einer der hauptsächli chen Nachteile bestand darin, dass der Wert der bewahrten Arginindeiminaseaktivität, die durch hochgradig modifizierte Konjugate bereitgestellt wird, in Untersuchungen zur Wachstumshemmung zu gering war. Es wurde postuliert, dass bestimmte Lysinanlagerungspunkte auf dem Enzym eng mit der aktiven Stelle des Enzyms verknüpft sind. Deshalb waren hochgradig modifizierte Konjugate, die hohe Werte an bewahrter Aktivität zeigen, mit vernünftigen Aufwendungen an Zeit und Ressourcen nicht möglich.
Die vorliegende Erfindung behandelt diese Unzulänglichkeiten.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Eine Aufgabe der Erfindung besteht darin, eine neue gereinigte, von Mycoplasma arthritidis erhaltene Arginindeiminaseuntereinheit (nachstehend ADI) bereitzustellen, die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2 aufweist. Diesbezüglich schließt die Erfindung ein isoliertes Nukleinsäuremolekül ein, das eine ADI-kodierende Nukleotidsequenz enthält, die die in den Figuren und in SEQ ID NR: 1 und SEQ ID NR: 2 dargelegte Aminosäuresequenz sowie dazu komplementäre Nukleinsäuremoleküle umfasst.
Andere Ausführungsformen der Erfindung schließen einen Expressionsvektor, der ein kloniertes Gen für die von Mycoplasma arthritidis abgeleitete ADI enthält, (rekombinante) Wirtszellen, die zum Exprimieren der ADI der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, und im Wesentlichen nicht antigene, die ADI der vorliegenden Erfindung enthaltende Polymerkonjugate ein. Weitere Ausführungsformen der Erfindung schließen ein Verfahren zum Herstellen der gereinigten ADI, ein Verfahren zum Herstellen der vorstehend genannten Arginindeiminaseenthaltenden, im Wesentlichen nicht antigenen Zusammensetzungen auf Poly merbasis ein. Die Erfindung stellt des Weiteren die ADI und Konjugate gemäß der vorliegenden Erfindung zur Verwendung als Medikamente sowie die Verwendung dieser ADIs und Konjugate zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Behandeln der auf Arginindeiminase ansprechenden Zustände in Säugern bereit. Die Behandlungsverfahren schließen das Verabreichen einer wirksamen Menge der hierin beschriebenen Zusammensetzungen vorzugsweise als Teil eines Polymerkonjugats an derart therapiebedürftige Säuger ein.
Bei dem im Wesentlichen nicht antigenen Polymer handelt es sich vorzugsweise um ein Polyalkylenoxid, wie z.B. ein Polyethylenglycol, das ein Molekulargewicht von etwa 600 bis etwa 60.000 und vorzugsweise ein Molekulargewicht von etwa 12.000 aufweist. Andere im Wesentlichen nicht antigene Polymere können ebenfalls verwendet werden. Das im Wesentlichen nicht antigene Polymer ist in einer bevorzugten Ausführungsform mit der ADI über ein Urethan oder eine gleichermaßen hydrolysebeständige Bindung vorzugsweise kovalent konjugiert. Die Arginindeiminase-Polymer-Konjugat-enthaltenden Zusammensetzungen können als Teil einer pharmazeutisch verträglichen Lösung eingeschlossen sein.
Die erfindungsgemäße von M. arthritidis erhaltene ADI unterscheidet sich von derjenigen, über welche vorher in J. Biol. Chem. Bd. 253, Nr. 17, S. 6016–6020 (1978) und J. Biol. Chem. Bd. 252, Nr. 8, S. 2615–2620 (1977) berichtet wurde. Diese Dokumente beschrieben ADI-Enzyme, die als Enzyme des Typs I, II und III bezeichnet wurden, von denen die Autoren berichteten, dass es miteinander vertauschbare und verwandte Proteine seien. Obwohl die in J. Biol. Chem. berichteten ADI-Enzyme und die ADI der Erfindung von demselben Stamm 14152 der American Type Culture Collection („ATCC") erhalten wurden, ist die ADI der Erfindung von den vorher beschriebenen Enzymen des Typs I, II und III durch etliche grundlegende Eigenschaften vollkommen unterscheidbar. Erstens weist die hierin beschriebene ADI nur zwei Cysteine pro Untereinheitsequenz auf. Das vorher berichtete Protein beinhaltete achtzehn Cysteine pro Untereinheit. Zweitens weist die ADI der vorliegenden Erfindung einen pI-Wert von etwa 5,25 auf, während die vorher berichtete, von M. arthritidis erhaltene ADI einen pI-Wert von 7,0 aufwies. Darüber hinaus sagte die vorherige, vorstehend berichtete Arbeit auch voraus, dass die von M. arthritidis erhaltene ADI weniger Lysine pro Untereinheit als die ADI von M. arginini aufweisen würde. Die Erfinder entdeckten erstaunlicherweise jedoch, dass das Gegenteil der Fall war. Ein weiterer Unterschiedspunkt ist die Tatsache, dass es sich bei dem N-terminalen Rest der ADI der vorliegenden Erfindung um ein Serin handelt (das der posttranslationalen Entfernung des Methionins folgt), während die vorher berichtete ADI von M. arthritidis von Alanin als N-terminalen Rest berichtete. Diese Unterschiede sind tief greifend und legen nahe, dass eine Heterogenität in der von M. arthritidis erhaltenden ADI besteht. Eine weitere Möglichkeit ist, dass mehr als ein Gen für die mit M. arthritidis verbundenen ADI-Aktivität existiert.
Die Arginindeiminase-Polymer-Konjugate der vorliegenden Erfindung bieten auch Vorteile gegenüber jenen des Stands der Technik. Zum Beispiel schließt die ADI der vorliegenden Erfindung mehrere besser modifizierbare Lysinpositionen als die ADI des Stands der Technik ein, ohne auf die Herstellung von mutanten Lysinvarianten zurückzugreifen. Dies ermöglicht, dass wesentlich mehr Polymerstränge an wechselnde Oberflächenstellen kovalent angelagert werden können, ohne die Aktivität der Hemmung des Tumorzellwachstums zu verlieren. Darüber hinaus weisen die so gebildeten Konjugate eine wesentlich längere Lebensdauer in vivo auf als gemäß des Stands der Technik hergestellte Konjugate, die ähnliche Werte an bewahrter Aktivität aufweisen.
Der Begriff „auf Arginindeiminase ansprechender Zustand" ist so zu verstehen, dass alle Krankheitszustände, wie z.B. Tumorwachstum, Krebs und verwandte Zustände, die von exogener Arginindeiminase-Verabreichung therapeutisch profitieren, eingeschlossen sind. Derartige Zustände betreffende Details sind nachstehend in Kapitel 4 bereitgestellt.
Zum besseren Verständnis der vorliegenden Erfindung wird auf die folgende Beschreibung verwiesen und ihr Umfang in den anhängenden Patentansprüchen hervorgehoben.
KURZBESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 veranschaulicht die komplette ADI-kodierende DNA-Sequenz, die von M. arthritidis ATCC 14152 (1230 Basen) kloniert wurde. Bei den unterstrichenen G in den 5 Tryptophan-Codons wurde A gegen G durch ortsspezifische Mutagenese ausgetauscht.
2 veranschaulicht das Translationsprodukt (410 Aminosäuren) der Arginindeiminase-Untereinheit von M. arthritidis ATCC 14152.
3 veranschaulicht die Aminosäuresequenzanordnung von verschiedenen Arginindeiminasen; Zeile a: M. arthritidis ATCC 14152; Zeile b: M. arginini LBIF, siehe Ohno et al. Infection and Immunity 58: Nov. 1990, S. 3788–3795; Zeile c: M. hominis PG21; Zeile d: M. orale FERM BP-1970. M. hominis und M. orale erhalten gemäß R. Harasawa et al., Microbiol. Immunol. 36, S. 661–665, 1992.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
1. ARGININDEIMINASE
Dementsprechend schließt die vorliegende Erfindung ein neues Protein, das SEQ ID NR: 2 mit Arginindeiminase-Enzymaktivität umfasst, und ein dasselbe kodierende Nukleinsäuremolekül ein. Vorzugsweise wird die ADI durch ein neues Gen exprimiert, das die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 1 umfasst und von M. arthritidis isoliert wird. Die vorliegende Erfindung schließt auch Verfahren zum Herstellen und Verwenden derselben ein. Damit der Leser die nachzuvollziehende Beschreibung besser versteht, werden die folgenden Begriffe erläutert.
Die Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1 ist in Form einer Desoxyribonukleinsäure- oder DNA-Sequenz dargestellt. Der Fachmann wird jedoch verstehen, dass die Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1 nach Bedarf auch in Form eines RNA-Moleküls hergestellt werden kann. Des Weiteren können die das DNA- oder RNA-Molekül umfassenden Nukleotide auch in Form von Nukleotidderivaten oder -analoga vorliegen, wie z.B. jenen, die bei 37 C.F.R. § 1.822(p)(1) aufgelistet sind, auf dessen Offenbarung hierin in vollem Umfang verwiesen wird. Darüber hinaus umfasst die Erfindung auch das Komplement der erfindungsgemäßen Nukleotidsequenzen. Der Fachmann wird die Tatsache, dass der Umfang der Erfindung auch abwechselnde Codons einschließt, die dieselbe Aminosäure aufgrund der degenerierten Natur des genetischen Kodes kodieren können, verstehen.
Die „Transfektion" bezeichnet das Aufnehmen eines Expressionsvektors durch eine Wirtszelle, egal ob irgendwelche kodierenden Sequenzen tatsächlich exprimiert werden oder nicht. Zahlreiche Verfahren der Transfektion sind dem Durchschnittsfachmann bekannt. Zum Beispiel wird die Transfektion in Anwesenheit eines Expressionsvektors und hoher CaPO₄-Konzentrationen, durch Elektroporation, durch Verwendung eines Phagen- oder viralen Expressionsvektors zur Insertion in einer Wirtszelle, durch mechanische Insertion der Nukleinsäure und sogar durch Züchten der Wirtszellen in Anwesenheit unverpackter Nukleinsäurefragmente bewerkstelligt. Die erfolgreiche Transfektion wird im Allgemeinen erkannt, wenn ein beliebiges Anzeichen für die Funktion des Vektors von Interesse innerhalb der Wirtszelle auftritt.
Die „Transformation" beschreibt die Einführung einer Nukleinsäure in einen Organismus, so dass die Nukleinsäure replizierbar ist, entweder als ein extrachromosomales Element oder durch Integration in das Wirtschromosom. Abhängig von der verwendeten Wirtszelle wird die Transformation durch Verwenden von auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren bewerkstelligt, die für die jeweiligen Wirtszellen geeignet sind. Die Calcium-Behandlung durch Verwenden von Calciumchlorid, wie von Cohen, S. N. Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 69: 2110 (1972) und Mandel et al., J. Mol. Biol. 53: 154 (1970) beschrieben, wird im Allgemeinen für Prokaryoten oder andere Zellen verwendet, die innerhalb zellulärer Wände eingekapselt sind (z.B. viele bakterielle und/oder Pflanzenzellen). Für Säugerzellen ohne derartige Zellwände wird das Calciumphosphat-Fällungsverfahren von Graham, F. und van der Eb, A., Virology 52: 456–457 (1978) bevorzugt. Allgemeine Gesichtspunkte von Transformationen bei Säugerzellwirtssystemen wurden in der am 16. Aug. 1983 erteilten U.S.-Pat.-Nr. 4,399,216 beschrieben.
Die Transformationen in Hefe werden typischerweise gemäß dem Verfahren von Van Solingen, P., et al., J. Bact. 130: 946 (1977) und Hsiao, C. L., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 76: 3829 (1979) durchgeführt. Jedoch können auch beliebige andere, auf dem Fachgebiet gekannte Verfahren zum Einführen von Nukleinsäure, z.B. DNA in Zellen, wie z.B. durch Kerninjektion oder durch Protoplastenfusion, verwendet werden.
Wie hierin verwendet, bezeichnet der Begriff „komplementär" in Bezug auf eine Nukleinsäure (unter Verwendung der Watson-Crick-Basenpaarung) den Gegenstrang, der hergestellt wird, wenn ein erstes Nukleinsäuremolekül unter Verwendung dieses Moleküls als Matrize repliziert wird, um einen neuen zweiten, zum ersten komplementären Nukleinsäurestrang zu bilden. In einer Ausführungsform der Erfindung werden zwei Nukleinsäuremoleküle als jeweils zueinander komplementär betrachtet, wenn sie unter stringenten Bedingungen hybridisieren oder aneinander binden.
Der Ausdruck „unter stringenten Bedingungen hybridisieren" zum Beschreiben der Hybridisierung der im Umfang dieser Erfindung umfassten Nukleinsäuremoleküle bezeichnet das Hybridisieren unter Bedingungen hoher Hybridisierungsspezifität, z.B. niedriger Ionenstärke und hoher Temperatur zum Waschen. Derartige stringente Bedingungen schließen z.B. die Hybridisierung mit 0,15 M NaCl/0,015 M Natriumcitrat/0,1 % NaDodSO₄ bei 50°C oder alternativ in Anwesenheit denaturierender Mittel wie z.B. Formamid, z.B. 50%iges (V/V) Formamid mit 0,1 % Rinderserumalbumin/0,1 % Ficoll/0,1 % Polyvinylpyrrolidon/50 mM Natriumphosphatpuffer mit pH-Wert 6,5 mit 750 mM NaCl, 75 mM Natriumcitrat, bei 42°C zur Hybridisierung ein. „Unter niedriger Stringenz hybridisieren" bezeichnet das Hybridisieren unter Bedingungen verminderter Hybridisierungsspezifität. Derartige Bedingungen schließen nur als Beispiel das Hybridisieren bei 42°C in 20%igem Formamid, 5 × SSC, 50 mM Natriumphosphat, pH 6,8, 0,1 % Natriumpyrophosphat, 5 × Denhardts Lösung und 50 μg/ml Lachssperma-DNA und Waschen mit 2 × SSC, 0,1% SDS bei 42°C ein.
Zusätzlich können spezifische Mutationen in das Arginindeiminase-Gen der vorliegenden Erfindung unter Verwendung der „ortsspezifischen Mutagenese" eingeführt werden. Dabei handelt es sich um einen Technikstandard des Fachgebiets und wird z.B. durch Verwenden eines synthetischen Oligonukleotidprimers durchgeführt, der zu einer einzelsträngigen Phagen-DNA, die mutagenisiert werden soll, mit Ausnahme der begrenzten, die gewünschte Mutation repräsentierenden Fehlpaarung komplementär ist. Derartige Mutationen können z.B. die Deletion, Insertion oder den Austausch von Codons einschließen, die natürlich vorkommende Aminosäuren exprimieren. Derartige Mutationen können veränderte Proteineigenschaften verleihen, die z.B. die oxidative, thermische und/oder pH-Stabilität des Proteins verbessern und/oder ändern. In Kurzfassung wird bei diesem Verfahren das synthetische Oligonukleotid als Primer verwendet, um die Synthese eines zu dem Phagen komplementären Strangs zu leiten, und die so erhaltene doppelsträngige DNA in ein Phagen-unterstützendes Wirtsbakterium transformiert. Es werden Kulturen der transformierten Bakterien auf Agar ausplattiert, um die Plaquebildung aus einzelnen Zellen, die den Phagen beherbergen, zu ermöglichen. Üblicherweise werden etwa 50 bis etwa 90% der neuen Plaques den Phagen enthalten, der die mutierte Form als einen Einzelstrang aufweist. Die Plaques werden mit dem kinasierten synthetischen Primer bei einer Temperatur hybridisiert, die die Hybridisierung einer exakten Basenpaarung ermöglicht, bei der jedoch die Fehlpaarungen mit dem ursprünglichen Strang ausreichen, um die Hybridisierung zu verhindern. Die mit der Sonde hybridisierenden Plaques werden dann ausgewählt und gezüchtet und die DNA wird gewonnen. Der Fachmann wird daher verstehen, dass die Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1 der Mutagenese durch die auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren, z.B. durch Nukleotidaustausch, einfach unterzogen werden kann, um verwendbare Variantenallele herzustellen. Nur als Beispiel wurde die Nukleotidsequenz von SEQ ID NR: 1 verschiedenartig mit Austauschen hergestellt, die ein T an Nukleotid 39, ein C an Nukleotid 104, ein A an Nukleotid 206, ein G an Nukleotid 337, ein A an Nukleotid 729, ein C an Nukleotid 830, ein C an Nukleotid 1023, ein A an Nukleotid 6, ein T an Nukleotid 15, ein C an Nukleotid 18 und/oder Kombinationen davon bereitstellen. Insbesondere würde der spezifische Austausch an 337 das Threonin zu Alanin umwandeln.
„Funktionell verknüpft" bezeichnet eine Nebeneinanderstellung von Komponenten, z.B. einen regulatorischer Bereich und einen offenen Leserahmen, so dass die normale Funktion der Komponenten ausgeübt werden kann. So bezeichnet ein offener Leserahmen, der mit Regulationssequenzen „funktionell verknüpft" ist, eine Anordnung, bei der die kodierende Sequenz unter der Regulation dieser Se quenzen exprimiert werden kann und bei der die DNA-Sequenzen, die verknüpft werden, benachbart und im Falle einer sekretorischen Leadersequenz benachbart und im Leseraster sind. Zum Beispiel ist die DNA für eine Präsequenz oder sekretorische Leadersequenz mit der DNA für ein Polypeptid funktionell verknüpft, wenn sie als ein Präprotein, das bei der Sekretion des Polypeptids beteiligt ist, exprimiert wird; ein Promoter oder Enhancer ist mit einer kodierenden Sequenz funktionell verknüpft, wenn er die Transkription der Sequenz beeinflusst; oder eine Ribosomenbindungsstelle ist mit einer kodierenden Sequenz funktionell verknüpft, wenn sie positioniert ist, um die Translation zu fördern. Das Verknüpfen wird durch Ligation an günstigen Restriktionsschnittstellen bewerkstelligt. Wenn derartige Stellen nicht vorhanden sind, werden dann z.B. synthetische Oligonukleotid-Adaptoren oder -Linker gemäß dem herkömmlichen Verfahren verwendet.
Die „Regulationssequenzen" bezeichnen Nukleinsäuresequenzen, die für die Expression einer funktionell verknüpften kodierenden Sequenz in einem bestimmten Wirtsorganismus notwendig sind. Die für Prokaryoten geeigneten Regulationssequenzen z.B. schließen einen Promoter, gegebenenfalls eine Operatorsequenz, eine Ribosomenbindungsstelle und eventuell andere, bisher wenig verstandene Sequenzen ein. Bei eukaryotischen Zellen ist bekannt, dass sie z.B. solche Regulationssequenzen wie Promotoren, Polyadenylierungssignale und Enhancer verwenden, um nur einige zu nennen.
Das „Expressionssystem" oder der „Expressionsvektor" bezeichnet Nukleinsäuresequenzen, die eine gewünschte kodierende Sequenz und Regulationssequenzen in funktioneller Verknüpfung enthalten, so dass die mit diesen Sequenzen transformierten Wirte die kodierten Proteine herstellen können. Um die Transformation zu bewerkstelligen, kann das Expressionssystem auf einem Vektor eingeschlossen sein; jedoch kann das entsprechende Nukleinsäuremolekül dann auch in das Wirtschromosom integriert sein.
Wie hierin verwendet, werden „Zelle", „Zelllinie" und „Zellkultur" untereinander austauschbar verwendet, und alle derartigen Bezeichnungen schließen die Vermehrung ein. Somit schließen „Transformanten" oder „transformierte Zellen" die primär betroffene Zelle und die davon abgeleiteten Kulturen ohne Berücksichtigung der Anzahl an Übertragungen ein. Es ist auch selbstverständlich, dass alle Abkömmlinge bezüglich des genomischen Inhalts aufgrund beabsichtigter oder versehentlicher Mutationen nicht genau identisch sein können. Die Mutantenabkömmlinge, die dieselbe Funktionalität aufweisen, wie die, nach der in der ursprünglichen transformierten Zelle durchgemustert wurde, sind eingeschlossen. Wo eindeutige Bezeichnungen beabsichtigt sind, wird es aus dem Zusammenhang deutlich werden.
Die hierin offenbarten Vektoren sind zur Verwendung in Wirtszellen aus einer großen Auswahl an prokaryotischen und eukaryotischen Organismen geeignet. Im Allgemeinen sind Prokaryoten für die anfängliche Klonierung von DNA-Sequenzen und Konstruktion der für die Erfindung verwendbaren Vektoren bevorzugt. Zum Beispiel ist insbesondere der Stamm MM 294 von E. coli K12 (ATCC-Nr. 31,446) verwendbar. Nur beispielsweise schließen andere Mikrobenstämme, die verwendet werden können, Stämme von E. coli, wie z.B. E. coli B und E. coli X1776 (ATCC-Nr. 31,537) ein. Prokaryoten können für die Expression auch verwendet werden. Die vorstehend erwähnten Stämme sowie z.B. die Stämme W3110 (F-, Lambda-, prototroph, ATCC-Nr. 27,325), K5772 (ATCC-Nr. 53,635) und SR101 von E. coli, die Bazillen wie z.B. Bacillus subtilis und andere Enterobacteriaceae wie z.B. Salmonella typhimurium oder Serratia marcesans und verschiedene Pseudomonas-Arten können verwendet werden.
Im Allgemeinen werden Plasmidvektoren, die das Replikon und Regulationssequenzen enthalten, die von den mit der Wirtszelle verträglichen Arten abgeleitet sind, in Verbindung mit diesen Wirten verwendet. Der Vektor trägt gewöhnlich eine Replikationsstelle sowie Markierungssequenzen, die eine phänotypische Selektion in transformierten Zellen bereitstellen können. Zum Beispiel wird E. coli typischerweise durch Verwenden von pBR322, ein Plasmid, das von einer Spezies von E. coli abgeleitet ist (siehe z.B. Bolivar et al., 1977, Gene 2: 95), transformiert. pBR322 enthält Gene für die Ampicillin- und Tetracyclin-Resistenz und stellt daher einfache Mittel zum Identifizieren transformierter Zellen bereit. In gleicher Weise stellen die pUC-Plasmide einfache Klonierungsvektoren mit DNA-Molekülen zur Selektion und Replikation bereit (Yanisch-Perron et al., 1985, Gene 33: 103–119, auf dessen Offenbarung hierin in vollem Umfang verwiesen wird). Das pBR322-Plasmid und andere mikrobielle Plasmide oder Phagen müssen auch Promotoren, die von den Mikroorganismen zur Expression ihrer eigenen Proteine verwendet werden können, enthalten oder müssen modifiziert werden, damit sie diese enthalten.
Die „Plasmide" werden durch ein kleines, vorangestelltes und/oder von Großbuchstaben und/oder Zahlen gefolgtes „p" bezeichnet. Die Ausgangsplasmide hierin sind im Handel erhältlich, sind öffentlich auf unbeschränkter Basis erhältlich oder können aus derartigen erhältlichen Plasmiden gemäß veröffentlichter Verfahren konstruiert werden. Darüber hinaus sind gleichwertige Plasmide auf dem Fachgebiet bekannt und werden für den Durchschnittsfachmann offensichtlich sein.
Jene, für die Konstruktion rekombinanter DNA am häufigsten verwendeten Promotoren schließen die Promotersysteme für die beta-Lactamase (Penicillinase) und Lactose (Chang et al., 1978, Nature 375: 615; Itakura et al., 1977, Science 198: 1056; Goeddel et al., 1979, Nature 281: 544) und ein Promotersystem für Tryptophan (trp) (Goeddel et al., 1980, Nucleic Acids Res. 8: 4057; EPO Appl. Publ.-Nr. 0036,776) ein. Obwohl diese am häufigsten verwendet werden, wurden andere mikrobielle Promotoren entdeckt und verwendet und ihre Nukleotidse quenzen betreffenden Details veröffentlicht, die es einem Fachmann ermöglichen, sie funktionell mit den auf dem Fachgebiet bekannten Vektoren, z.B. Plasmidvektoren, zu ligieren.
Nur als Beispiel kann die Transkriptionsregulation in E. coli mit einem beliebigen der folgenden, induzierbaren Promotoren erzielt werden: lac, trp, phoA, araBAD, T7 und Derivate der P_L- und P_R-Promotoren von Lambda sowie andere, die auf dem Fachgebiet bekannt sind (z.B. Makrides, 1996, Microbiol. Rev. 60: 512–538, auf dessen Offenbarung hierin in vollem Umfang verwiesen wird). Vorzugsweise wird als Promoter der O_L/P_R-Hybridpromoter verwendet, der von Scandella et al. im im Miteigentum befindlichen U.S.-Patent Nr. 5,162,216 beschrieben wurde, auf dessen Offenbarung hierin in vollem Umfang verwiesen wird.
Neben den Prokaryoten können auch eukaryotische Mikroben, wie z.B. Hefekulturen, verwendet werden. Saccharomyces cerevisiae oder die gewöhnliche Bäckerhefe wird unter den eukaryotischen Mikroorganismen am häufigsten verwendet, obwohl etliche andere Stämme üblicherweise erhältlich sind. Zur Expression in Saccharomyces wird z.B. das Plasmid YRp7 (Stinchcomb et al., 1979, Nature 282: 39; Kingsman et al., 1979, Gene 7: 141; Tschemper et al., 1980, Gene 10: 157) häufig verwendet. Dieses Plasmid enthält bereits das trp1-Gen, das einen Selektionsmarker für einen Hefemutantenstamm bereitstellt, dem die Fähigkeit fehlt, in Tryptophan zu wachsen, z.B. ATCC Nr. 44,076 oder PEP4-1 (Jones, 1977, Genetics 85: 12). Die Anwesenheit der trp1-Läsion als ein Kennzeichen des Hefewirtszellgenoms stellt dann eine wirksame Ausstattung bereit, um die Transformation durch Wachstum in Abwesenheit von Tryptophan nachzuweisen.
Es wurde gezeigt, dass das Expressionssystem von Pichia pastoris die Herstellung von mehreren Proteinen in hohen Mengen erzielt (Cregg, J. M. et al., 1993, Bio/Technology 11: 905–910, auf dessen Offenbarung hierin in vollem Umfang verwiesen wird) und verwendet werden kann, um die ADI als lösliches Protein im Cytoplasma von Pichia pastoris zu exprimieren.
Geeignete Promotersequenzen in Hefevektoren schließen die Promotoren für die 3-Phosphoglyceratkinase (Hitzeman et al., 1980, J. Biol. Chem. 255: 2073) oder andere glycolytische Enzyme (Hess et al., 1968, J. Adv. Enzyme Reg. 7: 149; Holland et al., 1978, Biochemistry 17: 4900), wie z.B. Enolase, Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase, Hexokinase, Pyruvatdecarboxylase, Phosphofructokinase, Glucose-6-phosphat-Isomerase, 3-Phosphoglycerat-Mutase, Pyruvatkinase, Triosephosphat-Isomerase, Phosphoglucose-Isomerase und Glucokinase, ein. Beim Konstruieren geeigneter Expressionsplasmide werden die mit diesen Genen verbundenen Terminationssequenzen auch in den Expressionsvektor 3' der Sequenz, die zu exprimieren gewünscht wird, ligiert, um die Polyadenylierung der mRNA und die Transkriptionstermination bereitzustellen. Bei den anderen Promotoren, die den zusätzlichen Vorteil der Transkriptionsregulation durch Wachstumsbedingungen aufweisen, handelt es sich um den Promotorbereich für die Alkoholdehydrogenase 2, das Isocytochrom C, die saure Phosphatase, die mit dem Stickstoff-Metabolismus verbundenen abbauenden Enzyme und die vorstehend erwähnte Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase und Enzyme, die für die Maltose- und Galactose-Verwendung verantwortlich sind. Ein beliebiger Plasmidvektor, der einen mit Hefe verträglichen Promoter, einen Replikationsursprungspunkt und Terminationssequenzen enthält, ist geeignet.
Ein Replikationsursprungspunkt kann entweder durch Konstruktion des Vektors bereitgestellt werden, um einen exogenen Ursprungspunkt einzuschließen, wie z.B. einen, der vom SV40 oder anderen viralen (z.B. Polyoma, Adeno, VSV, BPV) Quellen abgeleitet sein kann, oder kann durch den chromosomalen Replikationsmechanismus der Wirtszelle bereitgestellt werden. Wenn der Vektor in das Wirtszellchromosom integriert wird, ist Letzteres oft ausreichend.
Ausreichende Mengen an Protein werden durch Zellkulturen hergestellt, jedoch dienen Verbesserungen unter Verwendung einer sekundären kodierenden Sequenz dazu, die Herstellungsmengen noch weiter zu steigern. Eine sekundäre kodierende Sequenz umfasst die Dihydrofolat-Reduktase (DHFR), die von einem extern regulierten Parameter, wie z.B. Methotrexat (MTX) beeinflusst wird und somit die Regulation der Expression durch Regulation der Methotrexat-Konzentration ermöglicht.
Obwohl ein beliebiger geeigneter Stamm von M. arthritidis als Quelle des neuen Gens gemäß der Erfindung verwendet werden kann, handelt es sich bei dem verwendeten Stamm von M. arthritidis vorzugsweise um den Stamm, der bei der American Type Culture Collection („ATCC") als Zugangsnummer 14152 hinterlegt ist.
Ein Gen, das das Exprimieren des neuen erfindungsgemäßen Arginindeiminase-Enzyms ermöglicht, wird vorzugsweise von dem Genom von M. arthritidis durch Primer-gesteuerte Nukleinsäureamplifikation isoliert und danach in einen/ein beliebigen/s geeigneten/s Vektor für die Durchmusterung und Expressionssystem kloniert (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, zweite Auflage, J. Sambrook, E. F. Fritsch und T. Maniatis, Hrsg. Cold Spring Harbor Press, 1989). Der Fachmann wird verstehen, dass ein beliebiges geeignetes, auf dem Fachgebiet bekanntes Nukleinsäureamplifikationsverfahren durch Verwenden geeigneter Primer eingesetzt werden kann. Vorzugsweise handelt es sich bei dem Amplifikationsverfahren um die Polymerase-Kettenreaktion, wie nur als Beispiel von Mullis im U.S.-Patent Nr. 4,683,195, 4,683,202 und 4,800,159 beschrieben, auf dessen Offenbarung hierin in vollem Umfang verwiesen wird.
Der Fachmann wird auch verstehen, dass ein beliebiger, in die entsprechende Wirtszelle eingeführter Plasmid-, Phagen- oder Cosmid-Expressionsvektor verwendet werden kann, um ein amplifiziertes, die Arginindeiminase der Erfindung kodierendes Nukleinsäurefragment zu exprimieren, durchzumustern und zu identifizieren. Vorzugsweise wird ein Expressionssystem von Escherichia coli verwendet. Stärker bevorzugt wird ein GX6712/pGX9401-Expressionssystem von Escherichia coli verwendet.
Bei den Primern, die zur Amplifikation des ADI-Gens gemäß der hierin nachstehend bereitgestellten Beispiele verwendet wurden, handelte es sich um Oligonukleotide, die die Sequenzen von SEQ ID NR: 3 bzw. 4 aufwiesen. Diese Primer amplifizierten das gesamte Gen erfolgreich. Wie in den nachstehenden Beispielen angedeutet, unterschied sich der Primer von SEQ ID NR: 3 von dem entsprechenden N-terminalen kodierenden Bereich des isolierten Gens (SEQ ID NR: 1) durch drei Basenaustausche, die die kodierte Peptidsequenz nicht änderten. Bei den drei Basenaustauschen, deren Nummerierung auf der Nummerierung von SEQ ID NR: 1 basiert, handelt es sich um folgende: an Base 6 ist A gegen T, an Base 15 ist T gegen C und an Base 18 ist C gegen T ausgetauscht.
Somit war die erfolgreiche Amplifikation des gesamten Gens, das die SEQ ID NR: 1 umfassende Sequenz aufweist, überraschend, da aufgrund der vorstehend erwähnten Basenfehlpaarungen bezüglich der natürlich vorkommenden N-terminalen Sequenz des isolierten ADI-Gens der Primer von SEQ ID NR: 3 schlecht an das Zielfragment hybridisierte und somit eine Erklärung für das sehr schwache PCR-Signal liefert, das aus der Amplifikation durch Verwenden des Primers von SEQ ID NR: 3 resultierte.
Der Fachmann wird auch verstehen, dass ein Primer, der auf der exakt natürlich vorkommenden N-terminalen Sequenz von SEQ ID NR: 1 basiert, auch leicht, sogar mit besserer Wirksamkeit, bei der Amplifikation des erfindungsgemäßen ADI-Gens dienen wird.
Die Klone, die gemäß den hierin nachstehenden Beispielen bereitgestellt werden, schließen das Plasmid pEN232 ein, das das ADI-Gen im Expressionsvektor pGX 9401 umfasst. Die anfänglichen zwei PCR-Isolate des ADI-Gens von M. arthritidis wurden auch in das Plasmid pBluescript II SK(–) (Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA) kloniert und als pEN241 und pEN242 bezeichnet. Die Klonierung des N-terminalen Fragments eines ADI-Genabschnitts in pBluescript II SK(–), die in Beispiel 1B beschrieben ist, schließt zwei unabhängig analysierte Klone ein, die als pEN245 und pEN246 bezeichnet wurden. Unabhängige Transformationen von E. coli DH5-alpha (GIBCO BRL, Gaithersburg, MD) mit den Plasmiden pEN241, pEN242, pEN245 und pEN246 stellten Klone von E. coli her, die als EN243, EN244, EN247 bzw. EN248 bezeichnet wurden.
Sobald eine transfizierte oder transformierte Wirtszelle erhalten wird, wird ein Nukleinsäuremolekül, das eine Sequenz gemäß SEQ ID NR: 1 einschließt, durch Züchten der Wirtszelle und Extrahieren und Isolieren der Nukleinsäure durch die auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren, wie gewünscht leicht hergestellt. Abhängig von dem gewünschten Reinheitsgrad kann die extrahierte Nukleinsäure isoliert oder soweit gewünscht durch die auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren im Wesentlichen isoliert werden, damit sie von verunreinigenden Proteinen und Nukleinsäuren der Wirtszelle frei oder im Wesentlichen frei ist. Ebenso werden die Wirtszellen, die das durch die erfindungsgemäßen Expressionsvektoren kodierte Arginindeiminase-Protein exprimieren, durch Verfahren gezüchtet, die für die ausgewählte Wirtszelle geeignet sind.
Zum Beispiel werden die Wirtszellen gezüchtet, bis die gewünschten Zelldichten erreicht sind, und dann werden die Zellen vom Wachstumsmedium abgetrennt, und das Protein wird extrahiert und danach gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren renaturiert. Insbesondere werden die Zellen vom Kulturmedium abgetrennt, um eine Zellpaste zu bilden. Die Zellpaste wird dann resuspendiert und dann durch Standardverfahren, z.B. mechanisch, durch Ultraschall und/oder chemischen Aufschluss aufgeschlossen. Vorzugsweise werden die Zellen durch Verarbeiten in einem „Microfluidizer" (Mikroverflüssiger) (Microfluidics Corp. Newton, MA) mit darauf folgendem Waschen mit einem geeigneten oberflächenaktiven Mittel, wie z.B. Triton X-100, aufgeschlossen.
Das so erhaltene Homogenat wird mit Guanidinium-HCl, 6 M, denaturiert und dann in einem Puffer zur Neufaltung (z.B. 10 mM K₂PO₄, pH 7,0) verdünnt, teilchenförmiges Material (Schwebstoffe) entfernt, z.B. durch Zentrifugation mit darauf folgender Reinigung des Überstands durch Standardverfahren, z.B. durch Säulenchromatographie an Q-Sepharose, um im Wesentlichen gereinigte Arginindeiminase, z.B. mit einer Reinheit von etwa 60% und einer spezifischen Aktivität, die sich von etwa 3 bis etwa 25 IU/mg und mehr und vorzugsweise von etwa 5 bis etwa 20 IU/mg erstreckt, bereitzustellen. Eine zusätzliche Konzentrierung der ADI kann durch Verwenden einer Centriprep-10, Amicon, Inc., Beverly, MA, erzielt werden. Andere ähnlich funktionierende Säulen können auch verwendet werden, sofern gewünscht.
2. NICHT ANTIGENE POLYMERE
Um die Polymer-Arginindeiminase-Konjugate der vorliegenden Erfindung zu bilden, werden die Polymere, wie z.B. Poly(alkylenoxide) (PAOs), in aktivierte Formen umgewandelt, die als derartiger Begriff einem Durchschnittsfachmann bekannt sind. Daher werden eine oder beide der endständigen Hydroxyl-Endgruppen des Polymers (d.h. die alpha- und omega-terminalen Hydroxylgruppen) in reaktive funktionelle Gruppen umgewandelt, die eine kovalente Konjuga tion ermöglichen. Dieser Vorgang wird häufig als „Aktivierung" bezeichnet und das Produkt ein „aktiviertes Poly(alkylenoxid)" genannt. Die Polymere, die sowohl alpha- als auch omega-Verknüpfungsgruppen enthalten, werden als bis-aktivierte Polyalklyenoxide bezeichnet. Andere im Wesentlichen nicht antigene Polymere sind gleichermaßen „aktiviert" oder funktionalisiert. Unter den im Wesentlichen nicht antigenen Polymeren sind die monoaktivierten Polyalkylenoxide (PAOs), wie z.B. Monomethoxypolyethylenglycole bevorzugt. In alternativen Ausführungsformen sind die homobifunktionellen bis-aktivierten Polymere, wie z.B. Bissuccinimidylcarbonat-aktiviertes PEG bevorzugt.
Die aktivierten Polymere sind daher für die Umsetzung mit Arginindeiminase und Bildung von ADI-Polymer-Konjugaten geeignet, wobei die Anlagerung vorzugsweise entweder an der aminoterminalen α-Aminogruppe oder an den ε-Aminogruppen von den auf der ADI vorkommenden Lysinen erfolgt.
In einer bevorzugten Ausführungsform der Erfindung werden Carbamat- (Urethan-) Bindungen durch Verwenden der ε-Aminogruppen von ADI und der aktivierten Polyalkylenoxide gebildet. Vorzugsweise wird die Carbamat-Bindung gebildet, wie im sich im Gemeineigentum befindlichen U.S.-Patent Nr. 5,122,614 beschrieben, auf dessen Offenbarung hierin verwiesen wird. Dieses Patent offenbart die Bildung von Mono- und Bis-N-succinimidylcarbonat-Derivaten von Polyalkylenoxiden (SC-PEG). Varianten schließen para-Nitrophenylcarbonat- und Carbonylimidazol-aktivierte Polymere ein.
In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden Polymere verwendet, die mit Amid-bildenden Verknüpfern, wie z.B. Cycloimidthion-aktivierten Polyalkylenoxiden, Succinimidylestern und dergleichen aktiviert sind, um die Verknüpfung zwischen der Arginindeiminase und den endständigen Gruppen des Polymers zu bewirken, siehe z.B. U.S.-Patent Nr. 5,349,001 an Greenwald et al., auf dessen Offenbarung hierin verwiesen wird. Andere Ausführungsformen der Erfindung schließen die Verwendung anderer aktivierter Polymere ein, um kovalente Verknüpfungen des Polymers mit der Arginindeiminase über ε-Amino- oder andere Gruppen zu bilden. Zum Beispiel können Isocyanat- oder Isothiocyanat-Formen der endständig aktivierten Polymere verwendet werden, um Verknüpfungen auf Harnstoff- oder Thioharnstoff-Basis mit den Lysin-Aminogruppen zu bilden. Das PEG-Dialdehyd kann auch mit der Arginindeiminase umgesetzt werden, gefolgt von der Reduktion mit NaCNBH₃, um eine sekundäre Aminobindung zu bilden.
Geeignete Polymere werden im Wesentlichen im Gewicht variieren, jedoch werden gewöhnlich Polymere, die Molekulargewichte im Bereich von etwa 200 bis etwa 60.000 aufweisen, für die Zwecke der vorliegenden Erfindung ausgewählt. Molekulargewichte von etwa 1.000 bis etwa 40.000 sind bevorzugt und 2.000 bis etwa 20.000 sind besonders bevorzugt.
Die eingeschlossenen polymeren Stoffe sind auch vorzugsweise wasserlöslich bei Raumtemperatur. Eine nicht beschränkende Liste von derartigen Polymeren schließt Polyalkylenoxid-Homopolymere, wie z.B. Polyethylenglycol (PEG) oder Polypropylenglycole, polyoxyethylenierte Polyole, Copolymere davon und Block-Copolymere davon, ein, mit der Maßgabe, dass die Wasserlöslichkeit der Block-Copolymere aufrechterhalten bleibt.
Als eine Alternative zu Polymeren auf PAO-Basis können tatsächlich nicht antigene Materialien, wie z.B. Dextran, Polyvinylpyrrolidone, Polyacrylamide, Polyvinylalkohole, Polymere auf Kohlehydrat-Basis und dergleichen, verwendet werden. Tatsächlich kann die Aktivierung der alpha- und omega-terminalen Gruppen dieser polymeren Stoffe in einer Art und Weise erfolgen, die der zur Umwandlung von Polyalkylenoxiden verwendeten ähnelt, und wird daher für einen Durch schnittsfachmann offensichtlich sein. Der Durchschnittsfachmann wird feststellen, dass die vorstehende Liste lediglich veranschaulichend ist und dass alle Polymermaterialien, die die hierin beschriebenen Qualitäten aufweisen, in Erwägung gezogen werden. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung bedeutet „tatsächlich nicht antigen", dass alle auf dem Fachgebiet selbstverständlichen Materialien untoxisch sind und keine nennenswerte immunogene Antwort in Säugern auslösen.
3. REAKTIONSBEDINGUNGEN
Die manchmal als Pegylierungsreaktionen bezeichneten Konjugationsreaktionen werden im Allgemeinen in Lösung mit einem etwa äquimolaren bis etwa mehrfach molaren Überschuss des aktivierten Polymers durchgeführt. Vorzugsweise ist der molare Überschuss des aktivierten Polymers etwa 50-fach oder höher. Eine Möglichkeit, die Arginindeiminase-Bioaktivität aufrechtzuerhalten, besteht darin, das Einschließen jener, mit der aktiven Stelle verbundenden Lysine der Arginindeiminase in den Polymerkopplungsvorgang im Wesentlichen zu vermeiden. Angesichts der gewöhnlich unspezifischen Natur der Kopplungsreaktion ist dieser theoretische Schritt in der Praxis oft schwer zu erzielen. Das Verfahren der vorliegenden Erfindung stellt jedoch Arginindeiminase-Konjugate bereit, die hohe Werte an bewahrter Aktivität aufweisen, indem die von M. arthritidis erhaltene Arginindeiminase, die eine wesentliche Erhöhung der Anzahl verfügbarer Lysine für die Polymeranlagerung aufweist, verwendet und das Einsetzen eines übermäßig hohen molaren Überschusses, z.B. mehr als etwa 100-fach, des aktivierten Polymers während der Konjugationsreaktionen vermieden wird.
Somit schließen die Konjugationsbedingungen das Umsetzen der von M. arthritidis erhaltenen Arginindeiminase mit einem geeignet aktivierten, im Wesentlichen nicht antigenem Polymer, wie z.B. SC-PEG, in einer geeigneten Pufferlösung in einem Verhältnis des aktivierten Polymers zu Arginindeiminase von etwa 50- bis etwa 100-fach ein.
Die Konjugationsreaktion wird unter relativ milden Bedingungen durchgeführt, um das Inaktivieren der Arginindeiminase zu vermeiden. Milde Bedingungen schließen das Aufrechterhalten des pH-Werts der Reaktionslösung in einem Bereich von 6–8 und der Reaktionstemperaturen innerhalb des Bereichs von etwa 0–30°C und vorzugsweise bei etwa 4°C für eine Dauer von etwa einer Stunde ein. Geeignete Puffer schließen Pufferlösungen ein, die den bevorzugten pH-Bereich von 6 – 8 aufrechterhalten können, ohne die Konjugationsreaktion zu stören. Eine nicht beschränkende Liste geeigneter Puffer schließt z.B. den Phosphatpuffer, den Citratpuffer, den Acetatpuffer ein.
Obwohl die hierin beschriebenen Reaktionsbedingungen zu etwas unmodifizierter Arginindeiminase führen können, kann die unmodifizierte Arginindeiminase leicht gewonnen und in zukünftigen Chargen für zusätzliche Konjugationsreaktionen wieder verwertet werden.
Die Konjugationsreaktionen der vorliegenden Erfindung stellen zunächst ein Reaktionsgemisch oder einen Pool bereit, das/der die Arginindeiminase-Konjugate, die etwa 16 bis etwa 22 Polymerstränge pro Enzymuntereinheit (insgesamt 31 Lysine) aufweisen, die nicht umgesetzte Arginindeiminase, wenn überhaupt, und das nicht umgesetzte Polymer enthält. Nachdem die nicht umgesetzten Spezies entfernt wurden, werden die Arginindeiminase-Polymer-Konjugate-enthaltenden Zusammensetzungen gewonnen. Diese Zusammensetzungen weisen mindestens etwa 20% der biologischen Aktivität auf, die mit der nativen oder anfänglichen Arginindeiminase verbunden ist, wie durch Verwenden eines Testverfahrens, wie z.B. das nachstehend in Beispiel 3 beschriebene, gemessen wurde. In bevorzugten Ausführungsformen der Erfindung weisen die Konjugate jedoch mindestens etwa 30% der biologischen Aktivität auf, die mit der anfänglichen Arginindeiminase verbunden ist, und am stärksten bevorzugt weisen die Konjugate mindestens 90% der biologischen Aktivität auf, die mit der anfänglichen Arginindeiminase verbunden ist.
Eine repräsentative Konjugationsreaktion ist nachstehend dargelegt:
Ein etwa 50-facher molarer Überschuss des aktivierten Polymers wird in „Wasser zur Injektion" (pH-Wert ungefähr 6,0) gelöst und zu einer Lösung der Arginindeiminase von M. arthritidis zugesetzt, die auf einen pH-Wert von etwa 8,0 mit einem geeigneten Puffer, wie z.B. einem Phosphat- oder Boratpuffer, eingestellt wurde. Die Reaktion wird bei etwa 4°C bei einem pH-Wert von etwa 8,0 eine geeignete Zeit, wie z.B. etwa 1 Stunde, unter kontinuierlichem leichtem Mischen inkubiert. Danach wird die Konjugationsreaktion gestoppt, z.B. mit einem mehrfachen molaren Überschuss an Arginin oder Glycin. Die unmodifizierte Arginindeiminase, die in dem Reaktionspool, wenn überhaupt vorliegt, nachdem die Konjugationsreaktion gestoppt wurde, kann zur Wiederverwendung in zukünftigen Reaktionen unter Verwenden von Ionenaustausch- oder Größenausschlusschromatographie oder ähnlichen Trennverfahren gewonnen werden. Vorzugsweise enthalten die Lösungen, die die Konjugate der vorliegenden Erfindung enthalten, weniger als etwa 5% der unmodifizierten Arginindeiminase.
Sofern gewünscht, werden die Arginindeiminase-Polymer-Konjugate von dem Reaktionsgemisch isoliert, um die Spezies mit hohem Molekulargewicht und die unmodifizierte Arginindeiminase zu entfernen. Der Trennvorgang wird begonnen, indem die gemischten Spezies in eine Pufferlösung, die etwa 1–10 mg/ml der Arginindeiminase-Polymer-Konjugate enthält, gegeben werden. Geeignete Lösungen weisen einen pH-Wert von etwa 6,0 bis etwa 9,0 und vorzugsweise von etwa 7,5 bis etwa 8,5 auf. Die Lösungen enthalten vorzugsweise ein oder mehrere Puf fersalze, ausgewählt aus KCl, NaCl, K₂HPO₄, KH₂PO₄, Na₂HPO₄, NaH₂PO₄, NaHCO₃, NaBO₄ und NaOH. Die Natriumphosphatpuffer sind bevorzugt.
Abhängig von dem Reaktionspuffer müsste die Arginindeiminase-Polymer-Konjugat-Lösung zuerst einem/r Pufferaustausch/Ultrafiltration unterzogen werden, um jegliches nicht umgesetztes Polymer zu entfernen. Zum Beispiel kann die PAO-Arginindeiminase-Konjugat-Lösung durch eine Membran mit geringer Molekulargewichtsausschlussgrenze (10.000 bis 30.000 Dalton) ultrafiltriert werden, um die meisten unerwünschten Materialien, wie z.B. nicht umgesetztes Polymer, oberflächenaktive Mittel, sofern anwesend, oder dergleichen, zu entfernen.
Die Fraktionierung der ADI-Polymer-Konjugate, sofern gewünscht, kann auch unter Verwendung eines Anionenaustauschchromatographiemediums durchgeführt werden. Derartige Medien können selektiv PAO-Arginindeiminase-Konjugate durch Unterschiede in der Ladung binden, die in einer einigermaßen vorhersagbaren Art und Weise variiert. Zum Beispiel werden die Oberflächenladungen von ADI durch die Anzahl der vorhandenen geladenen Aminosäuren auf der Oberfläche des Proteins bestimmt. Von diesen geladenen Aminosäuren dienen die Lysinreste als die Stelle für eine potenzielle Anlagerung von Polyalkylenoxid-Konjugaten. Deshalb werden Arginindeiminase-Konjugate eine von den anderen Spezies unterschiedliche Ladung aufweisen, um eine selektive Isolierung zu ermöglichen. Die Verwendung stark polarer Anionenaustauscherharze, wie z.B. Anionenaustauscherharze mit quaternärem Amin, sind für das Verfahren der vorliegenden Erfindung besonders bevorzugt. Unter den im Handel erhältlichen, zur Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeigneten quaternären Anionenaustauscherharzen eingeschlossen befinden sich Q-HD, QA TRISACRYL^® und QMA-SPHEROSIL^®, auf eine Polymermatrix beschichtete Harze mit quaternärem Amin, die von IBF in Garenne, Frankreich, für Sepracor in Marlborough, Massachusetts, hergestellt werden; TMAE650M^®, ein auf eine Polymermatrix beschichtetes Tetramethylaminoethyl-Harz, das von EM-Seperators in Gibbstown, New Jersey, hergestellt wird; QAE550C^® und SUPERQC^®, jeweils ein auf eine Polymermatrix beschichtetes Harz mit quaternärem Amin, das von TosoHaas in Montgomeryville, PA, hergestellt wird. QMA Accell, das von Millipore in Millford, MA, hergestellt wird, und PEI-Harze, die von JT Balcer in Phillipsburg, NJ, hergestellt werden, können auch verwendet werden. Andere geeignete Anionenaustauscherharze, z.B. DEAE-Harze, können auch verwendet werden.
Zum Beispiel wird das Anionenaustauscherharz vorzugsweise in eine Säule gepackt und mit herkömmlichen Mitteln äquilibriert. Es wird ein Puffer verwendet, der denselben/dieselbe pH-Wert und Osmolalität wie die Lösung mit der Polymerkonjugierten Arginindeiminase aufweist. Der Elutionspuffer enthält vorzugsweise ein oder mehrere Salze, ausgewählt aus KCl, NaCl, K₂HPO₄, KH₂PO₄, Na₂HPO₄, NaH₂PO₄, NaHCO₃, NaBO₄ und (NH₄)₂CO₃. Die Konjugat-enthaltende Lösung wird dann auf der Säule adsorbiert, wobei die Spezies mit hohem Molekulargewicht und das nicht umgesetzte Polymer nicht retardiert werden. Nach Beendigung der Beladung wird ein Gradientenfluss eines Elutionspuffers mit steigenden Salzkonzentrationen an die Säule angelegt, um die gewünschte Fraktion der Polyalkylenoxid-konjugierten Arginindeiminase zu eluieren. Die eluierten zusammengefassten Fraktionen werden vorzugsweise auf einheitliche Mono- und Bis-Arginindeiminase-Polymer-Konjugate nach dem Anionenaustauschtrennungsschritt beschränkt. Jede nicht konjugierte Arginindeiminase-Spezies kann dann von der Säule durch herkömmliche Verfahren herunter gewaschen werden. Sofern gewünscht kann die Arginindeiminase-Spezies auch durch eine zusätzliche Ionenaustauschchromatographie oder Größenausschlusschromatographie getrennt werden. Der Temperaturbereich für die Elution liegt zwischen etwa 4°C und etwa 25°C. Vorzugsweise wird die Elution bei einer Temperatur von etwa 6°C bis etwa 22°C durchgeführt. Die Fraktionssammlung kann durch einfache Zeitelutionsprofile erzielt werden.
4. MEDIKAMENTE
Eine andere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung stellt Medikamente bereit. Derartige Medikamente sind zur Verwendung in Verfahren zur Behandlung von verschiedenartigen medizinischen Zuständen in Säugern geeignet. Die Verfahren schließen das Verabreichen einer wirksamen Menge an Arginindeiminase-Polymer-Konjugaten, die wie hierin beschrieben hergestellt wurden, an einem derart behandlungsbedürftigen Säuger ein. Die Konjugate sind unter anderem zum Behandeln der auf Arginindeiminase ansprechenden Zustände oder von Zuständen, die positiv oder vorteilhaft antworten würden, wie diese Begriffe auf dem medizinischen Fachgebiet für die Therapie auf Arginindeiminase-Basis bekannt sind, verwendbar.
Obwohl es nicht erwünscht ist, an eine beliebige Hypothese oder Theorie gebunden zu sein, wird der Fachmann verstehen, dass es sich bei Arginin um eine natürlich vorkommende Aminosäure handelt, die als ein nicht lebenswichtiger Nährstoff in der menschlichen Diät angesehen wird. Ein Säuger, der einen Zustand, eine Krankheit oder Funktionsstörung aufweist, der/die von einer Abnahme der Arginin-Menge oder -Konzentration im Gewebe, in Zellen oder Körperflüssigkeiten eines Säugers profitiert, wird von einer derartigen Behandlung mit ADI-Polymer-Konjugaten gemäß der Erfindung profitieren. Die Arginindeiminase katalysiert die direkte Umwandlung von L-Arginin und H₂O zu L-Citrullin und NH₃.
Somit können Arginindeiminase-Konjugate ohne Beschränkung verwendet werden, um Zustände zu behandeln, einschließlich der Karzinome, die einen Mangel an dem Enzym Argininosuccinat-Synthetase aufweisen, z.B. das Melanom (Sugimura et al., 1992, Melanoma Res. 2: 191–196) und die mit Stickoxid (NO) in Beziehung stehenden Zustände, z.B. Zustände, die durch Regulierung der Stickoxid-Synthase behandelt oder verbessert werden können. Insbesondere wurde gezeigt, dass die zelluläre NO-Herstellung von der Verfügbarkeit von Arginin absolut abhängig ist (Nagasaki et al., 1996, J. Biol. Chem. 271: 2658–2662; Xia et al., 1996, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 93: 6770–6774). Die ADI findet auch gewisse Diätanwendungen, z.B. zur Regulierung negativer Auswirkungen von Diäten mit geringem Protein (Narita et al., 1995, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92: 4552–4556).
Die Menge des Arginindeiminase-Polymer-Konjugats, das verabreicht wird, um die vorstehend beschriebenen Zustände zu behandeln, basiert auf der Arginindeiminase-Aktivität des polymeren Konjugats. Es handelt sich um eine Menge, die ausreicht, um im Wesentlichen eine positive klinische Antwort zu bewirken. Die maximale Dosis für Säuger einschließlich der Menschen ist die höchste Dosis, die keine klinisch wichtigen Nebenwirkungen hervorruft. Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung handelt es sich bei derartigen, klinisch wichtigen Nebenwirkungen um jene, die eine Beendigung der Therapie erfordern würden, wie z.B. Überempfindlichkeitsreaktionen und/oder andere immunogene Reaktionen.
Naturgemäß werden die Dosierungen der Zusammensetzungen auf Arginindeiminase-Basis abhängig von dem Arginindeiminase-Anteil und dem ausgewählten Polymer etwas variieren. Im Allgemeinen wird das Konjugat jedoch in Mengen verabreicht, die sich von etwa 300 bis etwa 3000 IU/m² Arginindeiminase pro Tag auf der Basis des Zustands des Säugers erstrecken. Der vorstehend dargelegte Bereich ist veranschaulichend und ein Fachmann wird die optimale Dosierung des Konjugats, die auf der Basis der klinischen Erfahrung und der Behandlungsindikation ausgewählt ist, bestimmen.
Die ADI-Polymer-Konjugate der vorliegenden Erfindung können in einem oder mehreren geeigneten Arzneimitteln zur Verabreichung an Säugern eingeschlossen sein. Die Arzneimittel können in Form von einer Lösung, Suspension, Tabletten, Kapseln oder dergleichen vorliegen, die gemäß den auf dem Fachgebiet bekannten Verfahren hergestellt werden. Es ist auch vorgesehen, dass die Verabreichung derartiger Zusammensetzungen hauptsächlich auf dem parenteralen Weg erfolgt, obwohl die oralen Wege oder die Inhalationswege abhängig von den Erfordernissen des Fachmanns auch verwendet werden können.
BEISPIELE
Die folgenden Beispiele dienen dazu, um weiteres Verständnis der Erfindung bereitzustellen, sind jedoch in keiner Weise dafür bestimmt, den geltenden Umfang der Erfindung zu beschränken.
BEISPIEL 1
Expression des ADI-Gens von M. arthritidis in E. coli
A. Isolierung und Klonierung des ADI-Gens
Der Stamm 14152 von M. arthritidis wurde von der American Type Culture Collection erhalten. Das Arginindeiminase-Gen von M. arthritidis wurde durch eine Polymerase-Kettenreaktion (PCR) durch Verwenden des Primer-Paares 5'-GGCAATCGATGTCTGTATTTGACAGTA-3' (SEQ ID NR: 3) und 5'-TGAGGATCCTTACTACCACTTAACATCTTTACG-3' (SEQ ID NR: 4) amplifiziert, die von der veröffentlichten Sequenz von M. arginini LBIF (Ohno, T. et al., 1990, „Cloning and Nucleotide Sequence of the Gene Encoding Arginine Deiminase of Mycoplasma arginini", Infect. Immun. 58: 3788–3795, auf dessen Inhalt hierin verwiesen wird) abgeleitet wurden.
Die PCR-Amplifikation wurde mit Standardverfahren (wie von Saiki et al., 1989, PCR Technology, S. 7–16; Hrsg. Henry A. Erlich, Stockton Press, rezensiert wurde) mit den folgenden Parametern durchgeführt.
Die Reaktion wurde in einem Volumen von 100 Mikrolitern mit einem PCR-Puffer von 10 millimolar Tris-HCl, pH 8,3, 50 millimolar KCl, 2 millimolar MgCl₂ und jeweils 200 μM Desoxynukleotidtriphosphat (dATP, dCTP, dGTP und dTTP) und 2,5 Einheiten Taq-DNA-Polymerase (von Perkin Elmer) durchgeführt. Dreißig Amplifikationszyklen wurden in einem „PCR system 9600 thermal cycler" von Perkin Elmer durchgeführt, der zum Denaturieren bei 94 Grad C. 60 Sekunden, Hybridisieren bei 37°C 180 Sekunden und Verlängern bei 72 Grad C. 120 Sekunden eingestellt war.
Nach der PCR-Amplifikation wurden zwei ziemlich schwache Banden, die die amplifizierten Fragmente repräsentieren, durch Analyse auf einem Agarosegel bei 1,4 kB und 1,2 kB beobachtet. Es wurden Proben jeweils von jedem Fragment aus dem Gel ausgeschnitten, gereinigt und als ein ClaI-BamHI-Fragment direkt in das Expressionsplasmid pGX9401 in der Art und Weise kloniert, die von Filpula et al. in „Engineering of Immunoglobulin Fc and Single Chain Fv Protein in Escherichia coli" in Antibody Expression and Engineering (H. Y. Wang und T. Imanaka, Hrsg.) American Chemical Society, S 70–85, offenbart wurde, auf deren Inhalt hierin verwiesen wird. Beide Fragmente wurden sequenziert, und das 1,2-kB-Fragment wurde als ADI-kodierend aufgrund seiner teilweisen Homologie zu vorher bekannten Genen, die Enzyme mit ADI-Enzymaktivität kodieren, bestätigt.
Die fünf TGA-Codons im isolierten ADI-Gen, die Tryptophan in Mycoplasma kodieren, wurden gegen TGG-Codons durch Oligonukleotid-dirigierte Mutagenese gemäß dem Verfahren von Sayers et al., Biotechniques 13: 592–596 (1992), auf dessen Offenbarung hierin verwiesen wird, vor der Genexpression in E. coli aus getauscht. Bei dem verwendeten GX6712/pGX9401-Expressionssystem von E. coli handelte es sich um dasselbe, wie das in der vorstehend erwähnten Referenz von Filpula et al. beschriebene. Die rekombinante ADI wurde in Einschlusskörpern in Mengen von 10% des Gesamtzellproteins exprimiert.
B. Bestätigung der N-terminalen Sequenz des ADI-Gens
Um den N-terminalen Bereich des Gens von M. arthritidis entsprechend des PCR-Primers SEQ ID NR: 3 zu bestätigen, wurde eine unabhängige PCR-Amplifikation des N-terminalen Bereichs durch Verwenden der etablierten DNA-Sequenzdaten aus der ersten PCR durchgeführt. Bei dem verwendeten Verfahren handelte es sich um die „inverse PCR", wie sie von H. Ochman et al., 1990, (PCR PROTOCOLS: A GUIDE TO METHODS AND APPLICATIONS, Academic Press, Inc., Hrsg., M. A. Innis, D. H. Gelfand et al.) beschrieben wurde.
Die inverse PCR wurde durch Verwenden der PCR-Primer 5'-CTAAAACGGTTTCTAGTTCACC-3' (SEQ ID NR: 5) und
5'-AGCGTGGAATTAATGTTGTTG-3' (SEQ ID NR: 6) durchgeführt. Zwei Mikrogramm der genomischen DNA von M. arthritidis wurde mit der Restriktionsendonuklease Sau3A verdaut, dann wurden die Fragmente durch Behandlung mit T4-DNA-Ligase zirkularisiert. Diese DNA-Präparation wurde dann einer PCR-Amplifikation durch Verwenden von SEQ ID NR: 5 und 6 unterzogen. Die amplifizierte DNA wurde kloniert und durch DNA-Sequenzierung analysiert. Die DNA-Sequenzanalyse bestätigte die Zuordnung von Serin als die Aminosäure, die dem Initiations-Methionin (von dem vorhergesagt wird, dass es posttranslational entfernt wird) folgt. Es wurden auch drei stille Basenaustausche bemerkt: Base 6 ist vielmehr A als T; Base 15 ist vielmehr T als C; Base 18 ist vielmehr C als T. Zusätzlich ist Base 39 vielmehr T als C in dieser klonierten Sequenz. Keine dieser Austausche ändert die translatierte Proteinsequenz.
Es wird vermutet, dass die drei Basenunterschiede zwischen dem N-terminalen kodierenden Bereich der bestätigten genomischen Sequenz und dem Primer SEQ ID NR: 3, der verwendet wurde, um das Gen zu isolieren, die ziemlich schwachen, vorstehend diskutierten Banden bedingen, die erzeugt wurden, als das PCR-Produkt durch Gelelektrophorese analysiert wurde. Es wird vermutet, dass die drei Basenunterschiede zu einer schwachen Hybridisierung zwischen dem Primer und dem N-terminalen kodierenden Bereich führten, die ein bei der Gelelektrophorese beobachtetes schwaches PCR-Signal zur Folge hatte. Angesichts dieses Unterschieds und des schwachen PCR-Signals erforderte die erfolgreiche Amplifikation des gesamten ADI-Gens durch PCR somit eine sorgfältige Auswahl der PCR-Bedingungen, und deshalb war die erfolgreiche Isolierung des Gens, das durch SEQ ID NR: 1 repräsentiert wird, unerwartet.
BEISPIEL 2
Renaturierung und Reinigung der rekombinanten ADI
In diesem Beispiel wird das als Ergebnis von Beispiel 1 erhaltene ADI-Protein gemäß den von Misawa et al. berichteten Verfahren mit geringfügigen Modifikationen renaturiert (Misawa et al., 1994, „High-Level Expression of Mycoplasma arginine deiminase in Escherichia coli and Its Efficient Renaturation As An Antitumor Enzyme" in J. Biotechnol. 36: 145–155, auf dessen Inhalt hierin in vollem Umfang verwiesen wird).
Zu Beginn werden 100 Gramm Zellpaste in 800 ml 10 mM K₂PO₄, pH 7,0, 1 mM EDTA (Puffer 1) resuspendiert und die Zellen durch zwei Durchläufe in einem „Microfluidizer" (Microfluidics Corp., Newton, MA) aufgeschlossen. Triton X- 100 wird zugesetzt, um eine Endkonzentration von 4% (v/v) zu erreichen. Das Homogenat wird 30 Minuten bei 4 Grad C. gerührt und dann 30 Minuten bei 13.000 g zentrifugiert. Der Niederschlag wird gesammelt und in einem Liter Puffer 1, der 0,5% Triton X-100 enthält, resuspendiert. Die Lösung wird gegen 5 Volumen Denaturierungspuffer (50 mM Tris-HCl, pH 8,5, 10 mM DTT) durch Verwenden von Hallow-Faser-Kartuschen mit einer Retentionsgröße von 100 kD (Microgon Inc., Laguna Hills, CA) diafiltriert. Guanidinium-HCl wird zugesetzt, um eine Endkonzentration von 6 M zu erreichen, und die Lösung 15 Minuten bei 4 Grad C. gerührt. Die Lösung wird dann 100-fach in dem Puffer zur Neufaltung (10 mM K₂PO₄, pH 7,0) verdünnt und 48 Stunden bei 15 Grad C. gerührt. Teilchenförmiges Material (Schwebstoffe) wird durch Zentrifugation bei 13.000 g entfernt. Der so erhaltene Überstand wird auf einer Säule mit Q-Sepharose Fast Flow (Pharmacia, Inc., Piscataway, NJ) konzentriert, die in dem Puffer zur Neufaltung voräquilibriert wurde. Die ADI wird durch Verwenden des Puffers zur Neufaltung, der 0,2 M NaCl enthält, eluiert. Das Reinigungsverfahren ergibt das ADI-Protein, das nach SDS-PAGE-Analyse >95% rein ist. Etwa acht Gramm des reinen renaturierten ADI-Proteins werden aus 1 Kilogramm Zellpaste hergestellt, das einer Ausbeute von 200 Milligramm ADI pro Liter der Fermentation entspricht.
BEISPIEL 3
Arginindeiminase-Testverfahren
Die ADI-Aktivität wurde durch eine geringfügige Modifikation des Verfahrens bestimmt, das von Oginsky et al. in „Isolation and Determination of Arginine and Citrulline", Methods Enzymology 3: 639–643 (1957), beschrieben wurde, auf dessen Offenbarung hierin verwiesen wird. Proben von zehn Mikrolitern in 0,1 M Na₂PO₄, pH 7,0 (BUN-Testverfahren-Puffer) wurden in eine 96-Loch- Mikrotiterplatte gegeben, 40 Mikroliter von 0,5 M Arginin in BUN-Testverfahren-Puffer wurden zugesetzt und die Platte wurde abgedeckt und bei 37°C 15 Minuten inkubiert. 200 Mikroliter des kompletten BUN-Reagens (Sigma Diagnostics) wurden zugesetzt und die abgedeckte Platte wurde 10 Minuten bei 100°C inkubiert. Die Platte wurde auf 22°C abgekühlt und bei 490 nm mit einem Microtiterplattenlesegerät (Molecular Devices, Inc.) analysiert. Eine IU ist die Enzymmenge, die 1 Mikromol L-Arginin zu L-Citrullin pro Minute umwandelt. Die Proteinkonzentrationen wurden durch Verwenden des Reagens „Coomassie Plus Protein Assay Reagent" von Pierce (Pierce Co., Rockford, IL) mit Rinderserumalbumin als Standard bestimmt. Die spezifische Enzymaktivität der gereinigten ADI-Präparationen wurde mit etwa 3 bis etwa 30 IU/mg bestimmt.
BEISPIEL 4
In diesem Beispiel wurde Succinimidylcarbonat-aktiviertes Monomethoxypolyethylenglycol, Molekulargewicht 12.000, verwendet, um die als Ergebnis von Beispiel 2 erhaltene Arginindeiminase zu modifizieren. Das Succinimidylcarbonataktivierte mPEG wurde gemäß dem Verfahren des vorstehend erwähnten U.S.-Patents Nr. 5,122,614 hergestellt.
Eine Arginindeiminase-Lösung (0,910 mg in einem Volumen von 1 ml) wurde auf einen pH-Wert von 8,0 mit 100 mM Borat-Puffer eingestellt. Ein 50-facher molarer Überschuss des aktivierten PEGs wurde in „Wasser zur Injektion" gelöst und dann der Arginindeiminase zugesetzt. Die Reaktion wurde bei 4°C etwa 1 Stunde unter kontinuierlichem leichtem Mischen inkubiert. Nach 1 Stunde wurde die Reaktion mit einem Überschuss an Arginin gestoppt. Die PEG-ADI-Konjugate wurden durch eine Centriprep-30 mit 15 Volumen an 0,1 molarem Natriumphosphat, pH 7,0 diafiltriert, was bei 220 nm auf Anwesenheit des Polymers bis <0,05 ver folgt wurde. Die Reaktionsprodukte wurden wie in Beispiel 3, vorstehend, analysiert und wiesen etwa 40% bewahrte ADI-Aktivität auf.
BEISPIEL 5
Der Vorgang von Beispiel 4 wird wiederholt mit der Ausnahme, dass mPEG mit einem Molekulargewicht von 12.000, das mit einem N-Acylthiazolidin aktiviert wurde, verwendet wird.
BEISPIEL 6
Der Vorgang von Beispiel 4 wird wiederholt mit der Ausnahme, dass Succinimidylcarbonat-aktiviertes Monomethoxypolyethylenglycol, Molekulargewicht 5.000, verwendet wird.
BEISPIEL 7
PEG_12.000-ADI-HEMMUNG DES SK-MEL-2-ZELLWACHSTUMS
In diesem Beispiel wurde die gemäß Beispiel 4 hergestellte PEG-ADI verglichen mit PEG-ADI-Konjugaten durch Verwenden der ADI hergestellt, die von M. arginini in einem Testverfahren zur Hemmung des Zellwachstums erhalten wurde. Die ADI von M. arginini wurde in ähnlicher Art und Weise erhalten wie die, die verwendet wurde, um die ADI von M. arthritidis zu erhalten, mit der Ausnahme, dass die ADI von M. arginini in höherem Maße gereinigt wurde als die ADI von M. arthritidis. Insbesondere wurde die ADI von M. arthritidis extrahiert und neu gefaltet mit etwa 60%iger Reinheit, jedoch nicht durch eine Anionenaustauschchromatographie verarbeitet. Es wird erwartet, dass die Verarbeitung durch die Anionenaustauschchromatographie mehr als eine 90%ige Reinheit des ADI-Enzyms von M. arthritidis liefert. Bei dem PEG-Konjugationsverfahren, das verwendet wurde, um die von M. arthritidis abgeleiteten ADI-Konjugate herzustellen, handelte es sich um dasselbe wie das in Beispiel 4 verwendete. In beiden Fällen wurde PEG mit MW 12.000 verwendet, um die Konjugate herzustellen.
Die Melanom-Zellen wurden in „Minimum Essential Medium" (Eagle) mit 0,1 mM nicht lebenswichtiger Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat und Earles Salze, fötales Rinderserum 10%, gezüchtet. Anschließend an die Trypsinisierung wurden die lebenden Zellen durch Trypan-Blau-Ausschluss gezählt. Die Zellen (10⁴) wurden in jedes Loch in insgesamt 100 Mikrolitern in 96-Loch-Mikrotiterplatten gegeben. Die PEG_12.000-ADI-Konjugate wurden durch eine serielle 2-fach-Verdünnung in komplettem Medium (0,1 ml) verdünnt und in jedes Loch gegeben. Die Platten wurden bei 37°C in einem Inkubator mit 5%igem CO₂ inkubiert. Das Zellwachstum am Tag 3 wurde durch Zugabe von einem 1/10-tel Volumen „alamar Blue"-Farbstoff (Alamar Biosciences, Inc., Sacramento, CA) gemessen. Nach fünf Stunden Inkubation wurden die Platten mit einem Plattenlesegerät von Molecular Devices bei 570 – 630 nm gelesen.
Die von M. arginini abgeleiteten PEG-ADI-Konjugate wiesen einen IC₅₀-Wert von 0,00015 IU/ml auf, während die von M. arthritidis abgeleitete PEG-ADI einen IC₅₀-Wert von 0,00010 IU/ml aufwies. Somit wird bei Normalisierung in IU/ml-Einheiten ersichtlich, dass die von M. arthritidis abgeleitete PEG-ADI 150% der Wirksamkeit der von M. arginini abgeleiteten PEG-ADI aufweist.
BEISPIEL 8
SDS-PAGE-Analyse
Eine SDS-PAGE-Analyse wurde durchgeführt, um die PEG_12.000-ADI-Konjugate zu vergleichen, die entweder mit der von M. arginini abgeleiteten ADI oder gemäß der vorliegenden Erfindung mit der von M. arthritidis abgeleiteten ADI hergestellt wurden. Die Ergebnisse zeigen, dass die von M. arthritidis abgeleiteten Konjugate eine einheitlichere Verteilung der Größe und ein höheres mittleres Molekulargewicht aufwiesen (und deshalb mehr angelagerte PEG-Moleküle pro ADI-Untereinheit aufwiesen). Obwohl die Anmelder nicht an eine Theorie gebunden sind, wird vermutet, dass die von M. arthritidis abgeleitete ADI eine größere Anzahl von Lysinen einschloss, an die sich das PEG kovalent anlagern konnte und vielleicht wichtiger, dass es eine ausreichende Anzahl von Lysinen auf dieser speziellen ADI gibt, die nicht mit der aktiven Stelle verbunden sind.
BEISPIEL 9
Sequenzvergleiche
In diesem Beispiel wurden die Aminosäuresequenzen und die Sequenzanordnung von verschiedenartigen Arginindeiminasen untersucht. Zurückkehrend zur 3 ist zu bemerken, dass die Zeile „a" die ADI von M. arthritidis ATCC 14152 repräsentiert, die gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet wurde. Die Zeile „b" repräsentiert die ADI von M. arginini LBIF. Die Zeile „c" repräsentiert die ADI von M. hominis PG21 und die Zeile „d" die ADI von M. orale FERM BP-1970. Die Striche kennzeichnen Aminosäuren, die mit jenen in Zeile „a" gefundenen identisch sind. Die Punkte kennzeichnen Lücken. Der Prozentsatz der Aminosäuresequenzidentität zu der ADI von M. arthritidis ist:
M. arthritidis- 87%
M. hominis- 81 %
M. orale- 83 %.
Dieser Wert der Nicht-Homologie zwischen den kodierten Aminosäuresequenzen der jeweiligen Gene deutet wesentliche Unterschiede zwischen den kodierten Proteinen der jeweiligen Mycoplasma-Spezies an. Die Stellen von Lysin-Austauschen sind verstreut und ausgedehnt und zeigen die große Vielfalt an potenziellen Polymer-Konjugationsstellen an.
SEQUENZLISTE

Claims

Isoliertes Nukleinsäuremolekül, kodierend ein Arginindeiminaseenzym, umfassend eine Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, umfassend eine Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 1.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 2, wobei die Nukleinsäuresequenz von SEQ ID NR: 1 durch Nukleotidsubstitutionen, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem T an Nukleotid 39, einem C an Nukleotid 104, einem A an Nukleotid 206, einem A an Nukleotid 729, einem G an Nukleotid 337, einem C an Nukleotid 830, einem C an Nukleotid 1023, einem A an Nukleotid 6, einem T an Nukleotid 15 und einem C an Nukleotid 18, mutiert ist.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem RNA-Molekül und einem DNA-Molekül.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül, das zu dem Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1 komplementär ist.
Expressionsvektor, umfassend das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, das funktionsfähig an eine Steuersequenz gebunden ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 6, wobei die Steuersequenz einen Promoter umfasst.
Expressionsvektor nach Anspruch 7, wobei der Promoter induzierbar ist.
Expressionsvektor nach Anspruch 6, wobei der Promoter ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus einem beta-Lactamase-Promoter, einem lac-Promoter, einem trp-Promoter, einem phoA-Promoter, einem araBAD-Promoter, einem T7-Promoter, Derivaten des lambda-PL-Promoters und PR-Promoters und einem O_L/P_R-Hybridpromoter.
Expressionsvektor nach Anspruch 6, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Plasmid, einem Phagen und einem Cosmid.
Rekombinante Wirtszelle, umfassend das Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1.
Wirtszelle nach Anspruch 11, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einer prokaryotischen Wirtszelle und einer eukaryotischen Wirtszelle.
Wirtszelle nach Anspruch 11, ausgewählt aus der Gruppe, bestehend aus einem Bakterium und einer Hefe.
Wirtszelle nach Anspruch 13, bei welcher es sich um Escherichia coli handelt.
Isolierte Arginindeiminase, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2.
Isolierte Arginindeiminase nach Anspruch 15 mit einer spezifischen Aktivität von etwa 3 bis etwa 30 IU/mg.
Verfahren zur Herstellung von Arginindeiminase, umfassend: a) Transformieren oder Transfizieren einer Wirtszelle mit dem Vektor nach Anspruch 6, b) Züchten der transformierten oder transfizierten Wirtszelle und c) Exprimieren von Arginindeiminase in der gezüchteten Wirtszelle.
Verfahren nach Anspruch 17, des Weiteren umfassend das Gewinnen der exprimierten Arginindeiminase.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die Arginindeiminase durch ein Verfahren gewonnen wird, das das Extrahieren der exprimierten Arginindeiminase aus der Wirtszelle und Renaturieren der exprimierten Arginindeiminase umfasst.
Isoliertes Nukleinsäuremolekül nach Anspruch 1, amplifiziert aus einem Genom von Mycoplasma athriditis durch eine Polymerase-Kettenreaktion unter Verwendung eines Primer-Paars, umfassend SEQ ID NR: 3 und SEQ ID NR: 4, wobei SEQ ID NR: 3 unmodifiziert oder an Base 6 derart, dass A mit T ersetzt ist, an Base 15 derart, dass T mit C ersetzt ist, an Base 18 derart, dass C mit T ersetzt ist oder Kombinationen davon, modifiziert ist.
Nicht antigenes Polymer-Arginindeiminase-Kojugat, umfassend gereinigte von Mycoplasma athritidis erhaltene Arginindeiminase (ADI), die mit einem nicht antigenen Polymer kovalent konjugiert ist, wobei die ADI Aminosäure SEQ ID NR: 2 umfasst.
Nicht antigenes Polymer-Arginindeiminase-Konjugat nach Anspruch 21, wobei das nicht antigene Polymer ein Polyalkylenoxid umfasst.
Nicht antigenes Polymer-Arginindeiminase-Konjugat nach Anspruch 22, wobei das Polyalkylenoxid einen Alkyl-Terminus umfasst.
Nicht antigenes Polymer-Arginindeiminase-Konjugat nach Anspruch 22, wobei das Polyalkylenoxid ein Polyethylenglycol ist.
Nicht antigenes Polymer-Arginindeiminase-Konjugat nach Anspruch 23, wobei das Alkyl-terminierte Polyalkylenoxid ein Monomethyl-terminiertes Polyethylenglycol (nPEG) ist.
Nicht antigenes Polymer-Arginindeiminase-Konjugat nach Anspruch 21, wobei das nicht antigene Polymer ein Molekulargewicht von etwa 200 bis etwa 60.000 aufweist.
Nicht antigenes Polymer-Arginindeiminase-Konjugat nach Anspruch 26, wobei das nicht antigene Polymer ein Molekulargewicht von etwa 1.000 bis etwa 40.000 aufweist.
Nicht antigenes Polymer-Arginindeiminase-Konjugat nach Anspruch 27, wobei das nicht antigene Polymer ein Molekulargewicht von etwa 2.000 bis etwa 12.500 aufweist.
Nicht antigenes Polymer-Arginindeiminase-Konjugat nach Anspruch 21, wobei das nicht antigene Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Dextran, Polyvinylpyrrolidonen, Polyacrylamiden, Polyvinylalkoholen und Polymeren auf Kohlenhydrat-Basis.
Nicht antigenes Polymer-Arginindeiminase-Konjugat nach Anspruch 21, des Weiteren umfassend eine Carbamatbindung zwischen der Arginindeiminase und dem nicht antigenen Polymer.
Nicht antigenes Polymer-Arginindeiminase-Konjugat nach Anspruch 21, des Weiteren umfassend eine Amidbindung zwischen der Arginindeiminase und dem nicht antigenen Polymer.
Ariginindeiminase, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2, zur Verwendung als Medikament.
Nicht antigenes Polymer-Arginindeiminase-Konjugat, umfassend eine Arginindeiminase, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2, die mit einem nicht antigenen Polymer kovalent konjugiert ist, zur Verwendung als Medikament.
Verwendung einer Arginindeiminase, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung eines auf Arginindeiminase ansprechenden Zustands in einem Säuger.
Verwendung eines nicht antigenen Polymer-Arginindeiminase-Konjugats, umfassend eine Arginindeiminase, umfassend die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2, die an ein nicht antigenes Polynmer kovalent gebunden ist, zur Herstellung einer Zusammensetzung zur Behandlung eines für gegenüber Arginindeiminase empfindlichen Zustands in einem Säuger.
Verfahren zur Herstellung eines nicht antigenen Polymer-Arginindeiminase-Konjugats, umfassend das Inkontaktbringen von gereinigter von Mycoplasma athritidis erhaltener Arginindeiminase (ADI), die die Aminosäuresequenz von SEQ ID NR: 2 umfasst, mit einem nicht antigenen Polymer unter Bedingungen, die zum Bewirken einer Konjugation der gereinigten Arginindeiminase und des nicht antigenen Polymers ausreichend sind.
Verwendung nach Anspruch 34 oder Anspruch 35, wobei der gegenüber Arginindeiminase empfindliche Zustand ein auf Arginindeiminase ansprechender Tumor oder Krebs ist.
Verwendung nach Anspruch 34 oder Anspruch 35, wobei der Säuger ein menschlicher Patient ist.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei das nicht antigene Polymer ein Polyalkylenoxid umfasst.
Verwendung nach Anspruch 39, wobei das Polyalkylenoxid einen Alkyl-Terminus umfasst.
Verwendung nach Anspruch 39, wobei das Polyalkylenoxid ein Polyethylenglycol ist.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei das nicht antigene Polymer ein Molekulargewicht von etwa 200 bis etwa 35.000 aufweist.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei das nicht antigene Polymer ein Molekulargewicht von etwa 1.000 bis etwa 15.000 aufweist.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei das nicht antigene Polymer ein Molekulargewicht von etwa 2.000 bis etwa 12.500 aufweist.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei das nicht antigene Polymer ausgewählt ist aus der Gruppe, bestehend aus Dextran, Polyvinylpyrrolidonen, Polyacrylamiden, Polyvinylalkoholen und Polymeren auf Kohlenhydrat-Basis.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei das Konjugat des Weiteren eine Carbamatbindung zwischen der Arginindeiminase und dem nicht antigenen Polymer umfasst.
Verwendung nach Anspruch 35, wobei das Konjugat des Weiteren eine Amidbindung zwischen der Arginindeiminase und dem nicht antigenen Polymer umfasst.