[go: up one dir, main page]

DE60303644T2 - Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxycyclohexanon - Google Patents

Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxycyclohexanon Download PDF

Info

Publication number
DE60303644T2
DE60303644T2 DE60303644T DE60303644T DE60303644T2 DE 60303644 T2 DE60303644 T2 DE 60303644T2 DE 60303644 T DE60303644 T DE 60303644T DE 60303644 T DE60303644 T DE 60303644T DE 60303644 T2 DE60303644 T2 DE 60303644T2
Authority
DE
Germany
Prior art keywords
enzyme
seq
nucleotide sequence
amino acid
hydroxycyclohexanone
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Lifetime
Application number
DE60303644T
Other languages
English (en)
Other versions
DE60303644D1 (de
Inventor
Nobuya Toyama-shi Itoh
Ryuhei Toyonaka-shi Wakita
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sumitomo Chemical Co Ltd
Original Assignee
Sumitomo Chemical Co Ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sumitomo Chemical Co Ltd filed Critical Sumitomo Chemical Co Ltd
Publication of DE60303644D1 publication Critical patent/DE60303644D1/de
Application granted granted Critical
Publication of DE60303644T2 publication Critical patent/DE60303644T2/de
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Lifetime legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/24—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carbonyl group
    • C12P7/26—Ketones
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07C—ACYCLIC OR CARBOCYCLIC COMPOUNDS
    • C07C49/00—Ketones; Ketenes; Dimeric ketenes; Ketonic chelates
    • C07C49/385—Saturated compounds containing a keto group being part of a ring
    • C07C49/487—Saturated compounds containing a keto group being part of a ring containing hydroxy groups
    • C07C49/497—Saturated compounds containing a keto group being part of a ring containing hydroxy groups a keto group being part of a six-membered ring
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07B—GENERAL METHODS OF ORGANIC CHEMISTRY; APPARATUS THEREFOR
    • C07B2200/00—Indexing scheme relating to specific properties of organic compounds
    • C07B2200/07—Optical isomers

Landscapes

  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Description

  • 1. Gebiet der Erfindung
  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxycyclohexanon.
  • 3-Hydroxycyclohexanon ist eine Verbindung, die zur Herstellung von substituierten Resorcinol-Derivaten verwendbar ist, die beispielsweise in JP-A-2001-294549 beschrieben ist.
  • Wei et al. beschreiben in Tetrahydron: Asymmetry, 2001, Jg. 12, S. 229–233, die durch Bäckerhefe vermittelte Monoreduktion von 1,3-Cyclohexandionen mit zwei identischen C(2)-Substituenten.
  • Erfindungsgemäß wird ein Verfahren zur effizienten und problemlosen Herstellung von 3-Hydroxycyclohexanon durch Reagieren von 1,3-Cyclohexandion mit einem Enzym, das 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon reduzieren kann, einem das Enzym produzierenden Mikroorganismus oder einem behandelten Material des Mikroorganismus und durch Rückgewinnen des resultierenden 3-Hydroxycyclohexanons zur Verfügung gestellt.
  • Das heißt, die vorliegende Erfindung stellt Folgendes zur Verfügung:
    • 1. ein Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem 3-Hydroxycyclohexanon mit den Schritten: (a) Reagieren von 1,3-Cyclohexandion mit (I) einem Enzym mit der Fähigkeit, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon zu reduzieren, (II) einem Mikroorganismus, der das in (I) definierte Enzym produziert, oder (III) einem behandelten Material des in (I) definierten Enzyms oder des in (II) definierten Mikroorganismus; und (b) Rückgewinnen des resultierenden 3-Hydroxycyclohexanons, bei dem I) das Enzym mit der Fähigkeit, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon zu reduzieren, ein Enzym ist, das von einem Mikroorganismus abstammt, der zu der Gattung Arthrobacter, Rhodotorula, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Candida, Corynebacterium oder Penicillium gehört, oder das eine der folgenden Aminosäuresequenzen hat: die bei SEQ ID NO: 1 oder 3 angegebene Aminosäuresequenz, eine Aminosäuresequenz mit einer Deletion, Substitution oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 oder 3, eine Aminosäuresequenz, die von der bei SEQ ID NO: 2 oder 4 angegebenen Nucleotidsequenz codiert ist, und eine Aminosäuresequenz, die von einer Nucleotidsequenz einer DNA codiert ist, die eine Sequenz-Identität von 90 oder mehr mit der DNA der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 oder 4 hat, oder II) der Mikroorganismus, der das Enzym produziert, eine Transformante mit einem integrierten Plasmid ist, das eine Nucleotidsequenz der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 oder 4 oder eine Nucleotidsequenz einer DNA mit einer Sequenz-Identität von 90 % oder mehr mit der DNA der SEQ ID NO: 2 oder 4 enthält, oder III) das behandelte Material des Mikroorganismus, der das Enzym mit der Fähigkeit, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon zu reduzieren, produziert, tote Mikrobenzellen des unter II) definierten Mikroorganismus umfasst;
    • 2. ein Verfahren nach Punkt 1, bei dem die Transformante Escherichia coli ist;
    • 3. ein Verfahren nach Punkt 1, bei dem das Enzym die bei SEQ ID NO: 1 angegebene Aminosäuresequenz hat;
    • 4. ein Verfahren nach Punkt 1, bei dem das Enzym die bei SEQ ID NO: 3 angegebene Aminosäuresequenz hat;
    • 5. ein Verfahren nach Punkt 1, bei dem das Enzym eine Aminosäuresequenz hat, die von der bei SEQ ID NO: 2 angegebenen Nucleotidsequenz codiert ist;
    • 6. ein Verfahren nach Punkt 1, bei dem das Enzym eine Aminosäuresequenz hat, die von der bei SEQ ID NO: 4 angegebenen Nucleotidsequenz codiert ist;
    • 7. ein Verfahren nach Punkt 1, bei dem die Transformante eine Transformante ist, die durch Integrieren des Plasmids, das eine unter II) definierte Nucleotidsequenz, die das Enzym codiert, enthält, und wahlweise eines Plasmids, das eine Nucleotidsequenz enthält, die ein Enzym codiert, das ein Coenzym regeneriert, von dem das Enzym mit der Fähigkeit, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon zu reduzieren, abhängt, produziert wird;
    • 8. ein Verfahren nach Punkt 7, bei dem das Coenzym NADH/NAD+ (Nicotinamid-adenindinucleotid) oder NADPH/NADP+ (Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat) ist;
    • 9. ein Verfahren nach Punkt 1, bei dem 1,3-Cyclohexandion mit der Transformanten oder deren toten Mikrobenzellen in Gegenwart eines Fettalkohols reagieren gelassen wird;
    • 10. ein Verfahren nach Punkt 9, bei dem der Fettalkohol ein Alkohol mit einem Siedepunkt von 200 °C oder weniger ist;
    • 11. ein Verfahren nach Punkt 9, bei dem der Fettalkohol 2-Propanol ist;
    • 12. ein Verfahren nach Punkt 1, bei dem 1,3-Cyclohexandion mit der Transformanten oder deren toten Mikrobenzellen in Gegenwart von Glucose reagieren gelassen wird; und
    • 13. optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon.
  • DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Nachstehend wird diese Erfindung näher beschrieben.
  • In dieser Erfindung ist „1,3-Cyclohexandion" eine Verbindung der Formel (1):
    Figure 00040001
  • In dieser Erfindung ist „ 3-Hydroxycyclohexanon" eine Verbindung der Formel (2):
    Figure 00040002
  • In dieser Erfindung bedeutet „optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon" eine Zusammensetzung, die ein optisches Isomer des 3-Hydroxycyclohexanons, das auf dem asymmetrischen Kohlenstoffatom basiert, mit dem die Hydroxylgruppe in Formel (2) verbunden ist, in einer Menge von mehr als 50 % enthält (rechts- oder linksdrehende Verbindung), oder ein im Wesentlichen reines optisches Isomer davon, das ein optisches Isomer in einer Menge von beispielsweise 95 bis 100 %, vorzugsweise 98 bis 100 %, enthält.
  • Das Enzym, das in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, ist ein Enzym, das 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon (vorzugsweise optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon) reduzieren kann (nachstehend wird das Enzym auch als „die vorliegende Reductase" bezeichnet). Mit üblichen biochemischen oder genetischen Verfahren kann dieses Enzym z. B. aus einem Mikroorganismus hergestellt werden, der die vorliegende Reductase produziert. Wenn der Mikroorganismus, der die vorliegende Reductase produziert, beispielsweise eine Transformante ist, umfasst die Transformante eine Transformante, die durch Integrieren mindestens eines Plasmids entstanden ist, das die DNA mit einer Nucleotidsequenz enthält, die eine Aminosäuresequenz eines Enzyms codiert, das 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon (vorzugsweise optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon) reduzieren kann (nachstehend wird die Transformante auch als „die vorliegende Transformante" bezeichnet). Wenn der Mikroorganismus, der die vorliegende Reductase produziert, eine Nichttransformante ist (das heißt, ein Mikroorganismus, der keine künstlich verliehene Fähigkeit hat, sondern dem diese Fähigkeit innewohnt), umfasst die Nichttransformante einen Mikroorganismus, der unter Verwendung der vorgenannten Fähigkeit als Indikator durch Screenen aus kommerziellen Mikroorganismen oder aus Boden isoliert worden ist, wie später in einem Beispiel beschrieben wird. Beispiele für diese Mikroorganismen sind unter anderem Mikroorganismen, die zu der Gattung Arthrobacter, Rhodotorula, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Candida, Corynebacterium oder Penicillium gehören. Außerdem kann das Enzym, das in dem erfindungsgemäßen Verfahren gewonnen wird, ein kommerzielles Enzym sein, das durch Screenen mit der vorgenannten Fähigkeit als Indikator ausgewählt wird. Beispiele für die Enzyme, die verwendet werden können, sind unter anderem kommerzielle Enzyme, wie etwa KRED1001, KRED1002, KRED1003, KRED1004, KRED1005, KRED1006, KRED1007 und KRED1008, die alle Produkte der Biokatalyse sind.
  • Wenn die Transformante, die in dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet werden kann, eine Transformante ist, der die Fähigkeit, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon (vorzugsweise optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon) zu reduzieren, und die Fähigkeit, ein Coenzym zu regenerieren, von dem das Enzym mit der vorgenannten Fähigkeit abhängt, künstlich verliehen worden ist (nachstehend wird die Transformante auch als „die vorliegende Transformante" bezeichnet), ist die Transformante eine Transformante mit einem einzigen integrierten Plasmid oder mit zwei integrierten Plasmiden, die jeweils Folgendes umfassen:
    ein einziges Plasmid, das eine DNA enthält, die aus einer Nucleotidsequenz besteht, die ein Enzym mit den beiden nachstehend unter (I) und (II) definierten Fähigkeiten codiert, die künstlich verliehen werden können, und
    zwei Plasmide, und zwar:
    ein Plasmid, das eine DNA enthält, die aus einer Nucleotidsequenz besteht, die eine Aminosäuresequenz eines Enzyms mit der nachstehend unter (I) definierten Fähigkeit codiert, die künstlich verliehen werden kann, und
    ein Plasmid, das eine DNA enthält, die aus einer Nucleotidsequenz besteht, die eine Aminosäuresequenz eines Enzyms mit der nachstehend unter (II) definierten Fähigkeit codiert, die künstlich verliehen werden kann, wobei die Fähigkeiten wie folgt definiert sind:
    (I) die Fähigkeit, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon (vorzugsweise optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon) zu reduzieren, und
    (II) die Fähigkeit, ein Coenzym zu regenerieren, von dem ein Enzym mit der Fähigkeit (I) abhängt.
  • Eine solche Transformante enthält normalerweise (1) ein Enzym mit zwei künstlich verliehenen Fähigkeiten, das heißt, die Fähigkeit, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon (vorzugsweise optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon) zu reduzieren, und die Fähigkeit, ein Coenzym zu regenerieren, von dem ein Enzym mit der vorgenannten Fähigkeit abhängt, oder (2) zwei Enzyme, das heißt, ein Enzym mit der Fähigkeit, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon (vorzugsweise optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon) zu reduzieren, und ein Enzym mit der Fähigkeit, ein Coenzym zu regenerieren, von dem das vorgenannte Enzym abhängt (nachstehend werden die Enzyme (1) und (2) auch gemeinsam als „das vorliegende Enzym" bezeichnet).
  • Die „Fähigkeit, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon (vorzugsweise optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon) zu reduzieren", ist beispielsweise eine Fähigkeit, die ein Enzym besitzt, das eine Aminosäuresequenz aus der Gruppe der folgenden Aminosäuresequenzen hat:
    • (a1) die bei SEQ ID NO: 1 angegebene Aminosäuresequenz,
    • (a2) die bei SEQ ID NO: 3 angegebene Aminosäuresequenz,
    • (b1) eine Aminosäuresequenz, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 mit einer oder mehreren Deletionen, Substitutionen oder Additionen von Aminosäuren aufweist und die Fähigkeit hat, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon (vorzugsweise optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon) zu reduzieren,
    • (b2) eine Aminosäuresequenz, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 3 mit einer Deletion, Substitution oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren aufweist und die Fähigkeit hat, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon (vorzugsweise optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon) zu reduzieren,
    • (c1) eine Aminosäuresequenz, die von der bei SEQ ID NO: 2 angegebenen Nucleotidsequenz codiert ist,
    • (c2) eine Aminosäuresequenz, die von der bei SED ID NO: 4 angegebenen Nucleotidsequenz codiert ist,
    • (d1) eine Aminosäuresequenz eines Enzyms mit einer Aminosäuresequenz, die von einer Nucleotidsequenz einer DNA codiert ist, die unter strengen Bedingungen mit einer DNA hybridisiert, die zu einer DNA komplementär ist, die aus der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 besteht, wobei das Enzym die Fähigkeit hat, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon (vorzugsweise optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon) zu reduzieren,
    • (d2) eine Aminosäuresequenz eines Enzyms mit einer Aminosäuresequenz, die von einer Nucleotidsequenz einer DNA codiert ist, die unter strengen Bedingungen mit einer DNA hybridisiert, die zu einer DNA komplementär ist, die aus der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 4 besteht, wobei das Enzym die Fähigkeit hat, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon (vorzugsweise optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon) zu reduzieren,
    • (e1) eine Aminosäuresequenz eines Enzyms, das von einem Mikroorganismus abstammt, der zu der Gattung Corynebacterium gehört, wobei das Enzym die Fähigkeit hat, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon (vorzugsweise optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon) zu reduzieren, und
    • (e2) eine Aminosäuresequenz eines Enzyms, das von einem Mikroorganismus abstammt, der zu der Gattung Penicillum gehört, wobei das Enzym die Fähigkeit hat, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon (vorzugsweise optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon) zu reduzieren.
  • Das Gen (das nachstehend auch als „das vorliegende Reductase-Gen" bezeichnet wird), das eine Nucleotidsequenz hat, die die Aminosäuresequenz des Enzyms (die vorliegende Reductase) codiert, das 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon (vorzugsweise optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon) reduzieren kann, das bei der Herstellung der vorliegenden Transformante verwendet wird, kann (1) ein Gen, das aus einem natürlich vorkommenden Gen geklont ist, (2) ein Gen, das aus einem natürlich vorkommenden Gen geklont ist, bei dem ein Teil der Nucleotidsequenz des geklonten Gens künstlich deletiert, substituiert oder addiert ist [das heißt, durch Mutation (ortsgerichtete Mutagenese oder Mutation) des natürlich vorkommenden Gens] oder (3) ein künstlich synthetisiertes Gen sein.
  • Die „Aminosäuresequenz mit einer Deletion, Substitution oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren" in (b), (b1) oder (b2) und die „Aminosäuresequenz, die von einer Nucleotidsequenz einer DNA codiert ist, die unter strengen Bedingungen mit einer DNA hybridisiert, die zu einer DNA komplementär ist," in (d), (d1) oder (d2) umfassen Aminosäuresequenzen mit natürlich vorkommenden Mutationen durch intrazelluläres Processing eines Enzyms mit der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 oder 3 oder mit einem Art-Unterschied, individuellen Unterschied und Gewebe-Unterschied eines lebenden Organismus, von dem das Enzym abstammt, oder mit künstlichen Mutationen von Aminosäuren.
  • Wenn die Mutationen durch „Deletion, Substitution oder Addition (von Aminosäuren)" (nachstehend auch als „Aminosäure-Modifikationen" bezeichnet) in (b), (b1) oder (b2) künstlich durchgeführt werden, umfassen die verwendeten Verfahren solche, bei denen eine DNA mit einer Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 oder 3 codiert, einer herkömmlichen ortsspezifischen Mutation unterzogen wird und dann in einer herkömmlichen Weise exprimiert wird. Die ortsspezifische Mutation umfasst beispielsweise ein Verfahren, bei dem eine Amber-Mutation verwendet wird (Gapped-Duplex-Verfahren, Nucleic Acids Res., 12, 9441–9456 (1984)), und ein PCR-Verfahren, bei dem Primer für die Mutation verwendet werden.
  • Auf diese Weise mutierte Aminosäuren bilden mindestens einen Rest, insbesondere einen bis ein paar oder mehr Reste. Die Anzahl der mutierten Aminosäuren kann in einem Bereich liegen, in dem die Fähigkeit, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon (vorzugsweise optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon) zu reduzieren, zu finden ist.
  • Unter den Modifikationen durch Deletion, Substitution und Addition wird die Modifikation von Aminosäuren durch Substitution besonders bevorzugt. Die Substitution ist vorzugsweise eine Substitution von Aminosäuren durch Aminosäuren mit ähnlichen Eigenschaften, wie etwa Hydrophobie, Aufladung, pK und Stereostruktur. Diese Substitution umfasst beispielsweise die Substitution unter Aminosäuren innerhalb einer der folgenden Gruppen: <1> Glycin und Alanin, <2> Valin, Isoleucin und Leucin, <3> Asparaginsäure, Glutaminsäure, Asparagin und Glutamin, <4> Serin und Threonin, <5> Lysin und Arginin oder <6> Phenylalanin oder Tyrosin.
  • „Deletion, Substitution oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren" in einer Aminosäuresequenz in der vorliegenden Erfindung bedeutet normalerweise, dass eine hohe Sequenz-Identität zwischen einer Aminosäuresequenz und einer Aminosäuresequenz besteht, die aus dieser durch Deletion, Substitution oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren entsteht, und die Sequenz-Identität zwischen den Sequenzen beträgt normalerweise beispielsweise 80 % oder mehr, vorzugsweise 90 % oder mehr und besser 95 % oder mehr.
  • Bei zwei DNAs bedeutet „die unter strengen Bedingungen hybridisieren" normalerweise, dass eine hohe Sequenz-Identität zwischen ihren Nucleotidsequenzen besteht. Das bedeutet beispielsweise normalerweise eine Sequenz-Identität von 80 % oder mehr, vorzugsweise 90 % oder mehr und besser 95 % oder mehr.
  • Die „Sequenz-Identität" betrifft die Identität zwischen zwei DNAs oder zwei Proteinsequenzen. Die „Sequenz-Identität" wird durch Vergleich zwischen zwei im Optimalzustand angeglichenen Sequenzen als Vergleichsgegenstand bestimmt. Die DNAs oder Proteine als Vergleichsgegenstand können einer Addition oder Deletion (z. B. Gap usw.) bei der Optimal-Angleichung zwischen ihren beiden Sequenzen unterzogen worden sein. Diese Sequenz-Identität kann durch Angleichen unter Verwendung z. B. des Vector-NTI- und Clustal-W-Algorithmus berechnet werden [Nucleic Acid Res., 22 (22), 4673–4680 (1994)]. Die Sequenz-Identität wird normalerweise unter Verwendung von Sequenzanalysen-Software, insbesondere eines Analysen-Tools, das von Vector NTI, GENETYX-MAC oder einer öffentlichen Datenbank bereitgestellt wird, bestimmt. Die öffentliche Datenbank ist z. B. unter der Homepage-Adresse httpa/www.ddbj.nig.ac.jp allgemein zugänglich.
  • Die Hybridisierung, die bei einer „Hybridisierung unter strengen Bedingungen" in (d1) oder (d2) erfolgt, kann beispielsweise mit Verfahren durchgeführt werden, die von J. Sambrook, E. F. Frisch und T. Maniatis in „Molecular Cloning" (,,Molekulare Klonierung"), 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben werden, oder durch Southern-Hybridisierung, die in „Cloning and Sequence" („Klonierung und Sequenz") (auf Japanisch), unter Leitung von T. Watanabe, herausgegeben von M. Sugiura, erschienen bei Nohson Bunkasha 1989, beschrieben wird. Die „strengen Bedingungen" beziehen sich beispielsweise auf die Bedingungen, unter denen – nachdem ein Hybrid bei 65 °C in 6xSSC (eine Lösung, die 900 mM NaCl und 90 mM Trinatriumcitrat enthält; in diesem Fall wird eine Lösung, die durch Auflösen von 175,3 g NaCl und 88,2 g Trinatriumcitrat in 800 ml Wasser, Einstellen des pH mit 10 N NaCl und Einstellen der Gesamtmenge auf 1000 ml hergestellt wird, als 20xSSC bezeichnet) hergestellt worden ist – das Hybrid bei 50 °C mit 2xSSC gereinigt wird [„Molecular Biology" („Molekularbiologie"), 6.3.1.–6.3.6., John Wiley & Sons, New York (1989)]. Für die Salzkonzentration, die im Reinigungsschritt gewählt wird, können die Bedingungen beispielsweise von 2xSSC bei 50 °C (weniger strenge Bedingungen) bis zu 0,1xSSC bei 65 °C (sehr strenge Bedingungen) reichen. Die Temperatur im Reinigungsschritt kann von z. B. Raumtemperatur (weniger strenge Bedingungen) bis zu 65 °C (sehr strenge Bedingungen) gewählt werden. Außerdem können sowohl die Salzkonzentration als auch die Temperatur geändert werden.
  • Das vorliegende Reductase-Gen kann z. B. nach dem folgenden Herstellung verfahren hergestellt werden.
  • Bei üblichen gentechnischen Verfahren wird chromosomale DNA aus einem Mikroorganismus hergestellt, der zur Gattung Corynebacterium gehört, wie etwa Corynebacterium pseudodiphteriticum, und unter Verwendung der hergestellten chromosomalen DNA als Matrize zusammen mit geeigneten Primern wird die PCR durchgeführt, wodurch eine DNA, die aus einer Nucleotidsequenz besteht, die die Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 codiert, eine DNA, die aus einer Nucleotidsequenz besteht, die eine Aminosäuresequenz codiert, bei der eine oder mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 deletiert, substituiert oder addiert sind, oder eine DNA, die die Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 hat, amplifiziert wird, um das vorliegende Reductase-Gen herzustellen. Wenn die PCR unter Verwendung eines Oligonucleotids mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 5 und eines Oligonucleotids mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 6 als Primer zusammen mit der von dem Corynebacterium pseudodiphteriticum stammenden chromosomalen DNA als Matrize durchgeführt wird, wird die DNA, die aus der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 2 besteht, amplifiziert, um das vorliegende Reductase-Gen herzustellen.
  • Die PCR wird unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Eine Reaktionslösung, die vier dNTPs in einer Konzentration von jeweils 20 μM, zwei Oligonucleotid-Primer in einer Konzentration von jeweils 15 pM, 1,3 E Taq-Polymerase und eine cDNA-Bank als Matrize enthält, wird auf 97 °C (2 Minuten) erwärmt und dann mit zehn Zyklen, die jeweils aus Reaktionen bei 97 °C (0,25 Minuten), 50 °C (0,5 Minuten) und 72 °C (1,5 Minuten) bestehen, und dann nochmals mit zwanzig Zyklen, die jeweils aus Reaktionen bei 97 °C (0,25 Minuten), 55 °C (0,5 Minuten) und 72 °C (2,5 Minuten) bestehen, behandelt, und die Reaktionslösung wird dann weitere 7 Minuten auf 72 °C gehalten.
  • An die 5'-Endstellung des bei der PCR verwendeten Primers kann eine Restriktionsenzym-Erkennungssequenz angelagert werden.
  • Die nach dem vorstehenden Verfahren amplifizierte DNA wird in einem Vektor nach Verfahren geklont, die in J. Sambrook, E. F. Frisch und T. Maniatis, „Molecular Cloning" („Molekulare Klonierung"), 2. Aufl. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, und „Current Protocols in Molecular Biology" („Aktuelle Protokolle in der Molekularbiologie") (1987), John Wiley & Sons, Inc., ISBN 471-50338-X, beschrieben sind, wodurch ein rekombinanter Vektor erhalten werden kann. Zu den verwendeten Vektoren gehören beispielsweise unter anderem pUC119 (Takara Shuzo Co., Ltd.), pTV118N (Takara Shuzo Co., Ltd.), pBluescriptll (Toyobo), pCR2.1-TOPO (Invitrogen), pTrc99A (Pharmacia), pKK223-3 (Pharmacia). Wenn das vorliegende Reductase-Gen durch Integration in den Vektor hergestellt wird, kann es später in gentechnischen Verfahren zweckmäßig eingesetzt werden.
  • Mit üblichen gentechnischen Verfahren [beispielsweise Verfahren, die in „Shin Saibo Kogaku Jikken Protocol" („Neues Versuchsprotokoll für die Zelltechnik"), herausgegeben von der Abteilung Onkologie des Instituts für Medizin der Universität Tokyo, erschienen bei Shujunsha (1993)], beschrieben sind, wird eine cDNA-Bank aus einem Mikroorganismus erstellt, der zur Gattung Penicillium gehört, wie etwa Penicillium citrinum, und die PCR wird unter Verwendung der erstellten cDNA-Bank als Matrize zusammen mit geeigneten Primern durchgeführt, wodurch eine DNA, die aus einer Nucleotidsequenz besteht, die die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 codiert, eine DNA, die aus einer Nucleotidsequenz besteht, die eine Aminosäuresequenz codiert, bei der eine oder mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 3 deletiert, substituiert oder addiert sind, oder eine DNA, die die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 4 hat, amplifiziert wird, um das vorliegende Reductase-Gen herzustellen.
  • Wenn die PCR unter Verwendung eines Oligonucleotids mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 7 und eines Oligonucleotids mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 8 als Primer zusammen mit der von Penicillium citrinum stammenden cDNA-Bank als Matrize durchgeführt wird, wird die DNA, die aus der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 4 besteht, amplifiziert, um das vorliegende Reductase-Gen herzustellen.
  • Wenn das Enzym, das ein Coenzym regenerieren kann, von dem das Enzym abhängt, das 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon (vorzugsweise optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon) reduzieren kann (nachstehend wird das Gen für das Enzym auch als „das vorliegende Coenzym-regenerierendes-Enzym-Gen" bezeichnet), ein anderes Enzym als das Enzym der vorliegende Reductase ist, kann das vorliegende Coenzym-regenerierendes-Enzym-Gen beispielsweise nach dem folgenden Herstellungsverfahren hergestellt werden.
  • Mit gentechnischen Verfahren wird chromosomale DNA aus einem Mikroorganismus hergestellt, der zur Gattung Bacillus gehört, wie etwa Bacillus megaterium, und die PCR wird unter Verwendung der hergestellten chromosomalen DNA als Matrize zusammen mit geeigneten Primern durchgeführt, wodurch die DNA, die aus einer Nucleotidsequenz besteht, die die Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 12 codiert, die DNA, die aus einer Nucleotidsequenz besteht, die eine Aminosäuresequenz codiert, bei der eine oder mehrere Aminosäuren in der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 12 deletiert, substituiert oder addiert sind, oder die DNA, die die Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 11 hat, amplifiziert wird, um das vorliegende Coenzymregenerierendes-Enzym-Gen herzustellen.
  • Wenn die PCR unter Verwendung eines Oligonucleotids mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 9 und eines Oligonucleotids mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 10 als Primer zusammen mit der von Bacillus megaterium stammenden chromosomalen DNA als Matrize durchgeführt wird, wird die DNA, die aus der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 11 besteht, amplifiziert, um das vorliegende Coenzym-regenerierendes-Enzym-Gen herzustellen.
  • Die PCR wird beispielsweise unter folgenden Bedingungen durchgeführt: Eine Reaktionslösung, die vier dNTPs in einer Konzentration von jeweils 20 μM, zwei Oligonucleotid-Primer in einer Konzentration von jeweils 15 pM, 1,3 E Taq-Polymerase und eine cDNA-Bank als Matrize enthält, wird auf 97 °C (2 Minuten) erwärmt und dann mit zehn Zyklen, die jeweils aus Reaktionen bei 97 °C (0,25 Minuten), 50 °C (0,5 Minuten) und 72 °C (1,5 Minuten) bestehen, und dann nochmals mit zwanzig Zyklen, die jeweils aus Reaktionen bei 97 °C (0,25 Minuten), 55 °C (0,5 Minuten) und 72 °C (2,5 Minuten) bestehen, behandelt, und die Reaktionslösung wird dann weitere 7 Minuten auf 72 °C gehalten.
  • An die 5'-Endstellung des bei der PCR verwendeten Primers kann eine Restriktionsenzym-Erkennungssequenz angelagert werden.
  • Die nach dem vorstehenden Verfahren amplifizierte DNA wird in einem Vektor nach Verfahren geklont, die unter anderem in J. Sambrook, E. F. Frisch und T. Maniatis, „Molecular Cloning" („Molekulare Klonierung"), 2. Aufl. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, und „Current Protocols in Molecular Biology" („Aktuelle Protokolle in der Molekularbiologie") (1987), John Wiley & Sons, Inc., ISBN 471-50338-X, beschrieben sind, wodurch ein rekombinanter Vektor erhalten werden kann. Zu den verwendeten Vektoren gehören beispielsweise unter anderem pUC119 (Takara Shuzo Co., Ltd.), pTV118N (Takara Shuzo Co., Ltd.), pBluescriptll (Toyobo), pCR2.1-TOPO (Invitrogen), pTrc99A (Pharmacia), pKK223-3 (Pharmacia). Wenn das vorliegende Reductase-Gen durch Integration in den Vektor hergestellt wird, kann es später in gentechnischen Verfahren zweckmäßig eingesetzt werden.
  • Zu den Verfahren zur Herstellung der vorliegenden Transformanten gehören beispielsweise (1) das Verfahren, bei dem ein rekombinantes Plasmid hergestellt wird, das das vorliegende Reductase-Gen in Wirtszellen exprimieren kann, wie etwa eine DNA, bei der das vorliegende Reductase-Gen und ein Promotor, der in Wirtszellen wirken kann, in einer funktionsfähigen Form gekoppelt werden (beispielsweise ein rekombinantes Plasmid, das durch Ligieren einer Region, die an der Expressionsregulierung beteiligt ist, wie etwa ein Promotor und ein Terminator, mit dem vorliegenden Reductase-Gen entstanden ist, oder ein rekombinantes Plasmid, das das Gen als Operon exprimiert, das eine Vielzahl von Cistronen enthält, wie etwa das Lactose-Operon), und das rekombinante Plasmid anschließend in die Wirtszellen integriert wird, (2) das Verfahren, bei dem ein einzelnes rekombinantes Plasmid, das das Gen in Wirtszellen exprimieren kann, wie etwa eine DNA, bei der zwei Gene, und zwar das Reductase-Gen und das Coenzym-regenerierendes-Enzym-Gen, und ein Promotor, der in Wirtszellen wirken kann, in einer funktionsfähigen Form ligiert werden und das einzelne rekombinante Plasmid anschließend in die Wirtszellen integriert wird, und (3) das Verfahren, bei dem zwei rekombinante Plasmide hergestellt werden, die jeweils die beiden Gene exprimieren können, wie etwa DNAs, bei denen eines der beiden Gene, und zwar das Reductase-Gen oder das Coenzym-regenerierendes-Enzym-Gen, und ein Promotor, der in Wirtszellen wirken kann, in einer funktionsfähigen Form ligiert werden, und bei dem die beiden Plasmide, die jeweils das Reductase-Gen und das Coenzym-regenerierendes-Enzym-Gen haben, anschließend in die Wirtszellen integriert werden. Außerdem kann das Verfahren genutzt werden, bei dem eines der beiden Gene oder beide Gene in das Wirtszellen-Chromosom integriert werden.
  • Zu den Verfahren zur Herstellung der Transformanten durch Integrieren des einzelnen rekombinanten Plasmids in Wirtszellen gehören beispielsweise das Verfahren, bei dem das rekombinante Plasmid durch Ligieren z. B. von Regionen, die an der Expressionsregulierung beteiligt sind, wie etwa ein Promotor und ein Terminator, mit beiden Genen hergestellt wird, und das Verfahren, bei dem das rekombinante Plasmid hergestellt wird, das das Gen als Operon exprimiert, das eine Vielzahl von Cistronen enthält, wie etwa das Lactose-Operon.
  • Vorzugsweise ist das rekombinante Plasmid beispielsweise ein Plasmid, das in Wirtszellen replizierbare genetische Informationen enthält, das sich autonom vermehren kann, das leicht aus den Wirtszellen isoliert und reindargestellt werden kann und das das Gen hat, das die vorliegende Reductase codiert, die in einer funktionsfähigen Form in einen Expressionsvektor mit einem nachweisbaren Marker und einem Promotor, der in den Wirtszellen wirken kann, integriert wird. Als Expressionsvektoren sind verschiedene Arten von Vektoren im Handel erhältlich.
  • Der Begriff „funktionsfähige Form" bedeutet, dass nach der Transformation des rekombinanten Plasmids in die Wirtszellen das vorliegende Reductase-Gen mit einem Promotor gekoppelt wird, um unter der Kontrolle des Promotors exprimiert zu werden. Zu den Promotoren gehören der Lactose-Operon-Promotor aus E. coli, der Tryptophan-Operon-Promotor aus E. coli und synthetische Promotoren, die in E. coli wirken können, wie etwa der Tac-Promotor und der Trc-Promotor. Es kann auch ein Promotor verwendet werden, der die Expression des vorliegenden Reductase-Gens bei Corynebacterium pseudodiphteriticum, Penicillium citrinum oder Bacillus megaterium reguliert.
  • Wenn der verwendete Expressionsvektor ein Vektor ist, der ein selektives Markergen (beispielsweise ein Antibiotika-Resistenzgen, wie etwa das Kanamycin-Resistenzgen oder Neomycin-Resistenzgen) enthält, kann die Transformante, in die der Vektor integriert worden ist, problemlos unter Verwendung z. B. des Phänotyps des selektiven Markergens als Indikator gewählt werden.
  • Wenn eine Integration mit einer höheren Expression erforderlich ist, kann eine Ribosomen-Bindungsstelle mit einer Region stromaufwärts des Gens mit der Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz der vorliegenden Reductase codiert, ligiert werden. Zu den Ribosomen-Bindungsstellen gehören diejenigen, die von L. Guarente et al. in Cell, 20, S. 543, und Taniguchi et al. in „Genetics of Industrial Microorganisms" („Genetik von Mikroorganismen für biotechnologische Prozesse"), S. 202, erschienen bei Kodansha, beschrieben werden.
  • Zu den Wirtszellen gehören Mikrobenzellen, wie etwa Prokaryonten (beispielsweise die Gattungen Escherichia, Bacillus, Corynebacterium, Staphylococcus und Streptomyces) und Eukaryonten (beispielsweise die Gattungen Saccharomyces, Kluyveromyces und Aspergillus), Insektenzellen und Säugerzellen. Unter dem Aspekt der einfachen Herstellung der Transformanten in großen Mengen ist Escherichia coli ein bevorzugtes Beispiel für Wirtszellen.
  • Wenn das Plasmid, das die vorliegende Reductase in Wirtszellen exprimieren kann, in die Wirtszellen integriert werden soll, kann in Abhängigkeit von den verwendeten Wirtszellen ein herkömmliches Verfahren genutzt werden, und zu den Verfahren gehören beispielsweise das Calciumchlorid-Verfahren, das unter anderem in „Molecular Cloning: A Laboratoy Manual" („Molekulare Klonierung – Ein Laborhandbuch"), 2. Aufl. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, und „Current Protocols in Molecular Biology" („Aktuelle Protokolle in der Molekularbiologie") (1987), John Wiley & Sons, Inc., ISBN 471-50338-X, beschrieben ist, und das Elektroporationsverfahren, das unter anderem in „Methods in Electroporation: Gene Pulser/E. coli Pulser System" („Verfahren bei der Elektroporation – Genpulsator-/E.coli-Pulsator-System"), Bio-Rad Laboratories (1993), beschrieben ist.
  • Die Transformante, die das Plasmid anlagert, das das Reductase-Gen und/oder das Coenzym-regenerierendes-Enzym-Gen in Wirtszellen exprimieren kann, kann aus den Wirtszellen unter Verwendung des Phänotyps des in dem Vektor enthaltenen selektiven Markergens als Indikator gewählt werden, wie vorstehend dargelegt.
  • Ob die Wirtszellen, in die das Plasmid integriert worden ist (das heißt, die Transformante), das Reductase-Gen und/oder das Coenzym-regenerierendes-Enzym-Gen tragen oder nicht, kann durch Prüfen des Restriktionsenzym-Orts oder durch Analysieren der Nucleotidsequenz oder durch Southern-Hybridisierung, Western-Hybridisierung usw. nach herkömmlichen Verfahren nachgewiesen werden, die unter anderem in „Molecular Cloning: A Laboratoy Manual" („Molekulare Klonierung – Ein Laborhandbuch"), 2. Aufl. (1989), Cold Spring Harbor Laboratory Press, beschrieben sind.
  • Die vorliegende Transformante kann mit einem herkömmlichen Verfahren kultiviert werden, das bei der Kultivierung von Mikroorganismen, Insektenzellen oder Säugerzellen verwendet wird. Escherichia coli beispielsweise wird in einem Medium kultiviert, das geeignete Kohlenstoff- und Stickstoffquellen und Spurennährstoffe, wie etwa Vitamine, enthält. Die Kultivierung kann auf einem festen Nährboden oder in einem flüssigen Medium, wie etwa durch Reagenzglas-Schüttelkultivierung, Reziprokschüttelkultivierung, Rüttelfermenterkultivierung oder Tankkultivierung, vorzugsweise durch Kultivierung in einem flüssigen Medium, wie etwa Schüttelkultivierung mit Belüftung, erfolgen.
  • Die Kultivierungstemperatur kann zwar in dem Bereich, in dem die Transformante größer werden kann, geändert werden, aber sie beträgt normalerweise etwa 10 bis 50 °C, vorzugsweise etwa 20 bis 40 °C.
  • Der pH-Wert des Mediums liegt vorzugsweise in dem Bereich von etwa 6 bis 8.
  • Die Kultivierungsdauer beträgt in Abhängigkeit von den Kultivierungsbedingungen normalerweise etwa 1 Tag bis etwa 5 Tage.
  • Als Medium zur Kultivierung der vorliegenden Transformanten können verschiedene Medien zum Einsatz kommen, die eine Kohlenstoffquelle, eine Stickstoffquelle, organische Salze und anorganische Salze enthalten, die normalerweise bei der Kultivierung von Wirtszellen, wie etwa Mikroorganismen, verwendet werden.
  • Zu den Kohlenstoffquellen gehören beispielsweise Glucose, Dextrin, Zucker, wie etwa Sucrose, Zuckeralkohole, wie etwa Glycerol, organische Säuren, wie etwa Fumarsäure, Citronensäure und Pyruvinsäure, tierische Öle, pflanzliche Öle und Melasse. Die Menge, in der diese Kohlenstoffquellen zu dem Medium gegeben werden, beträgt normalerweise etwa 0,1 bis 30 % (Masse/Volumen), bezogen auf die Kulturlösung.
  • Zu den Stickstoffquellen gehören beispielsweise natürlich vorkommende Stickstoffquellen, wie etwa Fleischextrakt, Pepton, Hefeextrakt, Malzextrakt, Sojabohnenmehl, Maisquellwasser, Baumwollsaatmehl, Trockenhefe und Caseinhydrolysat; Aminosäuren; Ammoniumsalze anorganischer Säuren, wie etwa Natriumnitrat; Ammoniumsalze anorganischer Säuren, wie etwa Ammoniumchlorid, Ammoniumsulfat und Ammoniumphosphat; Ammoniumsalze organischer Säuren, wie etwa Ammoniumfumarat und Ammoniumcitrat; sowie Harnstoff. Von diesen Stickstoffquellen können die Ammoniumsalze organischer Säuren, natürlich vorkommende organische Stickstoffquellen und Aminosäuren ebenfalls als Kohlenstoffquellen verwendet werden. Die zu dem Medium zuzugebende Menge dieser Stickstoffquellen beträgt normalerweise 0,1 bis 30 % (Masse/Volumen), bezogen auf die Kulturlösung.
  • Zu den organischen und anorganischen Salzen gehören beispielsweise Chloride, Sulfate, Acetate, Carbonate und Phosphate, wie etwa solche von Kalium, Natrium, Magnesium, Eisen, Mangan, Cobalt und Zink. Spezielle Beispiele sind unter anderem Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Magnesiumsulfat, Eisen(II)-sulfat, Mangansulfat, Cobaltchlorid, Zinksulfat, Kupfersulfat, Natriumacetat, Calciumcarbonat, Kaliumdihydrogenphosphat und Kaliumhydrogenphosphat. Die zu dem Medium zuzugebende Menge dieser Salze organischer und/oder anorganischer Säuren beträgt normalerweise etwa 0,0001 bis 5 % (Masse/Volumen), bezogen auf die Kulturlösung.
  • Für die Transformante, die beispielsweise durch Integrieren einer DNA hergestellt wird, bei der ein Promotor, der mit Allolactose induziert worden ist, wie etwa der Tac-Promotor, Trc-Promotor oder Lac-Promotor, und das Gen, das eine Nucleotidsequenz hat, die die Aminosäuresequenz des vorliegenden Enzyms codiert, in einer funktionsfähigen Form gekoppelt sind, kann außerdem eine geringe Menge Isopropyl-thio-β-D-galactosid (IPTG) als Induktor zum Induzieren der Herstellung des vorliegenden Enzyms zu dem Medium gegeben werden.
  • Die vorliegende Transformante kann in Form von Pellets durch Zentrifugieren ihrer durch Kultivierung erhaltenen Kultur rückgewonnen werden. Vor der Rückgewinnung kann die Transformante gegebenenfalls mit einem Puffer, wie etwa 100 mM Kaliumdihydrogenphosphat-Kaliumhydrogenphosphat-Puffer (pH 6,5), gereinigt werden.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird das Enzym, das 1,3-Cyclohexandion reduzieren kann, ein Mikroorganismus, der das Enzym produziert, oder dessen behandeltes Material als Katalysator zum Reduzieren des 1,3-Cyclohexandions zu 3-Hydroxycyclohexanon (vorzugsweise optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon) verwendet.
  • Wenn der Mikroorganismus, der das Enzym produziert, das 1,3-Cyclohexandion reduzieren kann, in der Reaktion bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, wird der Mikroorganismus in Form (1) der Kulturlösung und (2) des feuchten Mikroorganismus verwendet, der dadurch erhalten wird, das zur Gewinnung des Mikroorganismus beispielsweise die Kulturlösung zentrifugiert wird und dann der Mikroorganismus mit einem Puffer oder Wasser gereinigt wird.
  • Wenn das Enzym, das 1,3-Cyclohexandion reduzieren kann, oder das behandelte Material, das von dem das Enzym produzierenden Mikroorganismus stammt, in der Reaktion bei dem erfindungsgemäßen Verfahren verwendet wird, wird das verwendete Enzym oder behandelte Material dadurch erhalten, dass der feuchte Mikroorganismus, der dadurch erhalten wird, das zur Gewinnung des Mikroorganismus beispielsweise die Kulturlösung zentrifugiert wird und dann der Mikroorganismus mit einem Puffer oder Wasser gereinigt wird, (1) einer Behandlung mit einem organischen Lösungsmittel (Aceton, Ethanol usw.), (2) einer Lyophilisation, (3) einer Alkali-Behandlung und (4) einer physikalischen oder enzymatischen Spaltung unterzogen wird, oder das resultierende behandelte Material kann nach einem bekannten Verfahren weiter immobilisiert werden.
  • Von dem Enzym, das 1,3-Cyclohexandion reduzieren kann, dem Mikroorganismus, der das Enzym produziert, und dessen behandeltem Material werden die Transformante, der die Fähigkeit, 1,3-Cyclohexandion zu reduzieren, künstlich verliehen worden ist, oder ihre toten Zellen bevorzugt verwendet.
  • Aus der vorliegenden Transformanten können die toten Zellen nach den folgenden Verfahren gewonnen werden.
  • Zu den Verfahren zur Gewinnung von toten Zellen gehören beispielsweise physikalische Zelltötungsverfahren (Erwärmen, Trocknen, Gefrieren, Bestrahlung mit Licht, Beschallung, Filtration, Elektrisierung) und Tötungsverfahren, die Chemikalien verwenden (Alkalien, Säuren, Halogene, Oxidationsmittel, Schwefel, Bor, Arsen, Metalle, Alkohole, Phenole, Amine, Sulfide, Ether, Aldehyde, Ketone, Cyane, Antibiotika). Vorzugsweise wird in Abhängigkeit von verschiedenen Reaktionsbedingungen ein Behandlungsverfahren mit minimaler Hemmung der Aktivität der vorliegenden Reductase und mit einer geringen Kontamination und Verschmutzung in dem Reaktionssystem aus diesen Tötungsverfahren entsprechend gewählt.
  • Die Transformante oder ihre auf diese Weise hergestellten toten Zellen können beispielsweise in Form von lyophilisierten Zellen, mit einem organischen Lösungsmittel behandelten Zellen oder getrockneten Zellen oder in immobilisierter Form (immobilisiertes Produkt) verwendet werden.
  • Zu den Verfahren zur Gewinnung des immobilisierten Produkts gehören beispielsweise das Verfahren des Bindens an Träger (Verfahren, bei dem die vorliegende Transformante oder ihre toten Zellen an anorganische Träger, wie etwa Kieselgel und Keramik, oder an Cellulose und Ionenaustauschharz adsorptiv angelagert werden) und das Einschlussverfahren (Verfahren, bei dem die vorliegende Transformante oder ihre toten Zellen in Netzwerke von Polymeren, wie etwa Polyacrylamid, schwefelhaltiges Polysaccharidgel (z. B. Carrageenan-Gel), Alginsäure-Gel und Agargel, eingeschlossen werden).
  • Nachstehend wird die Reaktion des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren kommt die Reaktion zum Umsetzen von 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon (vorzugsweise optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon) dadurch zustande, dass die vorliegende Reductase, ein das Enzym produzierender Mikroorganismus oder dessen behandeltes Material (und gegebenenfalls ein Coenzym) mit 1,3-Cyclohexandion reagieren gelassen wird.
  • Die Reaktion wird normalerweise in Gegenwart von Wasser durchgeführt. Das Wasser kann in Form eines Puffers vorliegen, und zu den in diesem Fall verwendeten Puffern gehören beispielsweise Alkalimetallphosphate, wie etwa Natriumphosphat und Kaliumphosphat, und Alkalimetallsalze, wie etwa Natriumacetat und Kaliumacetat.
  • Bei Verwendung des Puffers als Lösungsmittel beträgt seine Menge normalerweise 1 bis 300 Masseteile, vorzugsweise 5 bis 100 Masseteile, bezogen auf 1 Masseteil 1,3-Cyclohexandion.
  • Bei der Reaktion kann 1,3-Cyclohexandion kontinuierlich oder nacheinander zu dem Reaktionssystem gegeben werden.
  • Die Reaktionstemperatur beträgt unter dem Aspekt der Stabilität und Reaktionsgeschwindigkeit der vorliegenden Reductase oder der vorliegenden Reductase, die in einem das Enzym produzierenden Mikroorganismus oder in dessen behandeltem Material enthalten ist, normalerweise etwa 0 bis 70 °C, vorzugsweise etwa 10 bis 40 °C.
  • Der pH der Reaktion kann entsprechend dem Reaktionsfortschritt geändert werden und beträgt beispielsweise 5 bis 8.
  • Die Reaktion kann auch in Gegenwart von Wasser und eines organischen Lösungsmittels durchgeführt werden. Zu den organischen Lösungsmitteln gehören in diesem Fall beispielsweise Ether, wie etwa Tetrahydrofuran, t-Butylmethylether und Isopropylether; Kohlenwasserstoffe, wie etwa Toluen, Hexan, Cyclohexan, Heptan, Isooctan und Decan; Alkohole, wie etwa t-Butanol, Methanol, Ethanol, Isopropanol und n-Butanol; Sulfoxide, wie etwa Dimethylsulfoxid; Ketone, wie etwa Aceton; Nitrile, wie etwa Acetonitril, und Gemische daraus.
  • Die Menge des bei der Reaktion verwendeten organischen Lösungsmittels ist normalerweise nicht größer als 100 Masseteile, vorzugsweise nicht größer als 70 Masseteile, bezogen auf 1,3-Cyclohexandion.
  • Die Reaktion wird vorzugsweise in Gegenwart eines Coenzyms, wie etwa NADH oder NADPH, durchgeführt.
  • Die Menge des bei der Reaktion verwendeten Coenzyms ist normalerweise nicht größer als 0,5 Masseteile, vorzugsweise nicht größer als 0,1 Masseteile, bezogen auf 1,3-Cyclohexandion.
  • Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren wird vorzugsweise das vorliegende Coenzymregenerierendes-Enzym, das ein Coenzym regenerieren kann, von dem das Enzym, das 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon (vorzugsweise optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon) reduzieren kann, abhängt, das heißt, das Coenzym-regenerierendes-Enzym, das ein oxidiertes Coenzym (Elektronenakzeptor), das aus einem reduzierten Coenzym (Elektronendonator) in einer stöchiometrischen Menge in einer Elementarreaktion zum Reduzieren von 1,3-Cyclohexandion erzeugt wird, wieder zu einem reduzierten Coenzym (Elektronendonator) umsetzen kann, verwendet. In diesem Fall kann das vorliegende Coenzymregenerierendes-Enzym ein Enzym sein, das von der vorliegenden Reductase, die die Reduktionsreaktion katalysiert, unabhängig ist, oder es kann ein Enzym sein, das die Reduktionsreaktion katalysieren kann, oder es können beide gemeinsam verwendet werden.
  • Ob die vorliegende Reductase ein Enzym ist, das gleichzeitig das Coenzym regenerieren kann, kann beispielsweise dadurch festgestellt werden, dass das isolierte vorliegende Enzym in Gegenwart eines oxidierten Coenzyms in Kontakt mit einer Elektronenabgebenden Verbindung gebracht wird und ein reduziertes Coenzym (Elektronendonator) nachgewiesen wird.
  • Beispiele für das vorliegende Coenzym-regenerierendes-Enzym sind unter anderem Glucosedehydrogenase, Alkoholdehydrogenase, Aldehyddehydrogenase, Aminosäuredehydrogenase und organische Dehydrogenase (Malatdehydrogenase usw.). Insbesondere ist das Coenzym-regenerierendes-Enzym vorzugsweise ein Enzym, das ein Coenzym als Elektronen-abgebende Verbindung durch Oxidieren eines Fettalkohols regeneriert (z. B. Alkohole mit einem Siedepunkt von 200 °C oder weniger, wie etwa 2-Propanol, 2-Butanol, 2-Pentanol, 2-Hexanol, 2-Heptanol und 2-Octanol). Das Molverhältnis des Fettalkohols zu 1,3-Cyclohexandion ist nicht größer als 10, vorzugsweise nicht größer als 10.
  • Die Reaktion kann gegebenenfalls auch unter Zugabe von Zucker, wie etwa Glucose, Fructose o. Ä., Alkoholen, wie etwa Ethanol o. Ä., und eines grenzflächenaktiven Stoffs durchgeführt werden.
  • Der Reaktionsfortschritt kann beispielsweise hinsichtlich der Menge der Ausgangsverbindung in der Reaktionslösung mittels Flüssigchromatographie, Gaschromatographie usw. überwacht werden. Die Reaktionsdauer beträgt normalerweise 5 Minuten bis 10 Tage, vorzugsweise 30 Minuten bis 4 Tage.
  • Nach Abschluss der Reaktion kann das gewünschte Produkt mit einem Rückgewinnungsverfahren gewonnen werden, das herkömmlich bei dem Verfahren zur Herstellung von Verbindungen unter Verwendung eines Enzyms oder eines Mikroorganismus als Katalysator verwendet wird. Die Reaktionslösung wird beispielsweise mit einem organischen Lösungsmittel, wie etwa Hexan, Heptan, tert-Butylmethylether, Ethylacetat oder Toluen, extrahiert. Gegebenenfalls kann die Reaktionslösung vor der Durchführung der Extraktion filtriert oder zentrifugiert werden, um unlösliche Substanzen zu entfernen. Dann kann die extrahierte organische Schicht getrocknet werden, um das gewünschte Produkt als Konzentrat rückzugewinnen. Das gewünschte Produkt kann gegebenenfalls mittels Säulenchromatographie weiter reindargestellt werden.
  • Beispiele
  • Nachstehend wird die vorliegende Erfindung anhand von Herstellungsbeispielen usw. näher beschrieben, aber die vorliegende Erfindung ist nicht auf die Beispiele beschränkt.
  • Beispiel 1 (Herstellung des vorliegenden Reductase-Gens (Nr. 1) und Herstellung einer das vorliegende Reductase-Gen enthaltenden Transformanten]
  • Das Plasmid pKAR, das eine DNA enthält, die aus der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 2 besteht, wurde wie folgt hergestellt.
  • Zunächst wurde ein DNA-Fragment, das die bei SEQ ID NO: 2 angegebene DNA enthält, mit PstI und SmaI aus dem bekannten Plasmid pUAR exzidiert, das in Appl. Microbial Biotechnol. 52, 386–392 (1999), beschrieben ist. [Das Plasmid wurde nach dem Budapester Vertrag als FERM BP-7752 hinterlegt, das ursprünglich als FERM P-18127 hinterlegt worden war. Die Hinterlegungseinrichtung war die International Patent Organism Depositary (IPOD; Internationale Hinterlegungsstelle für patentierte Organismen), früher als National Institute of Bioscience and Human-Technology (NIBH; Staatliches Institut für Biowissenschaft und Humantechnologie) bekannt.] Das exzidierte DNA-Fragment wurde in eine Region stromabwärts eines Tac-Promotors im PstI/SmaI-behandelten pKK223-3-Vektor (Amersham Pharmacia Biotech.) inseriert. Auf diese Weise wurde das Plasmid pKAR hergestellt.
  • Das hergestellte Plasmid pKAR wurde zum Transformieren von E. coli JM109 verwendet.
  • Dann wurden 100 ml flüssiges Medium (eine Lösung aus 10 g Trypton, 5g Hefeextrakt und 5 g Natriumchlorid in 1000 ml Wasser, die durch tropfenweise Zugabe von 1 N wässriges Natriumhydroxid auf pH 7,0 eingestellt worden war) in einen Kolben eingebracht und sterilisiert und dann mit 100 μg/ml Ampicillin, 0,01 % (Masse/Volumen) ZnCl2 und 0,4 mM Isopropyl-thio-β-D-galactosid (IPTG) versetzt. Das so hergestellte Medium wurde mit 0,3 ml Kultur der vorstehend erhaltenen Transformanten (E. coli JM109/pKAR) beimpft, die vorher in einem flüssigen Medium mit der vorgenannten Zusammensetzung kultiviert worden war, und die Transformante wurde unter Schütteln 14 Stunden bei 30 °C kultiviert.
  • Nach der Kultivierung wurde die resultierende Kultur zentrifugiert (15.000 × g, 15 Minuten, 4 °C), um den Mikroorganismus rückzugewinnen. Der rückgewonnene Mikroorganismus wurde in 30 ml 50 mM Kaliumdihydrogenphosphat-Kaliumhydrogenphosphat-Puffer (pH 7,0) suspendiert, und diese Suspension wurde zentrifugiert (15.000 × g, 15 Minuten, 4 °C), wodurch der gereinigte Mikroorganismus, d. h. die an das vorliegende Reductase-Gen angelagerte Transformante, erhalten wurde.
  • Beispiel 2 (Herstellung des vorliegenden Enzymgens (Nr. 2)]
  • 2.1. Herstellung der chromosomalen DNA
  • 100 ml flüssiges Medium (eine Lösung aus 5 g Trypton, 2,5 g Hefeextrakt, 4 g Natriumchlorid, 2,5 g Gelatine, 1,5 g Natriumacetat und 2,4 g Threonin in 1000 ml Wasser, die durch tropfenweise Zugabe von 1 N wässriges Natriumhydroxid auf pH 7,0 eingestellt worden war) wurden in einen Kolben eingebracht und sterilisiert. Das so hergestellte Medium wurde mit 0,3 ml Kultur des beispielsweise in JP-A-10-94399 beschriebenen bekannten Corynebacterium pseudodiphteriticum, Unterart ST-10 (Zugangsnr. FERM P-13150), das vorher in einem flüssigen Medium mit der vorgenannten Zusammensetzung kultiviert worden war, beimpft, und der Mikroorganismus wurde unter Schütteln 10 Stunden bei 30 °C kultiviert.
  • Nach der Kultivierung wurde die resultierende Kultur zentrifugiert (15.000 × g, 15 Minuten, 4 °C), um den Mikroorganismus rückzugewinnen. Der rückgewonnene Mikroorganismus wurde in 30 ml 50 mM Kaliumdihydrogenphosphat-Kaliumhydrogenphosphat-Puffer (pH 7,0) suspendiert, und diese Suspension wurde zentrifugiert (15.000 × g, 15 Minuten, 4 °C), wodurch der gereinigte Mikroorganismus erhalten wurde.
  • Der so erhaltene gereinigte Mikroorganismus wurde verwendet, um chromosomale DNA nach einem Verfahren von J. C. Wang et al., Appl. Microbiol. Biotechnol., 52, 386–392 (1999), herzustellen.
  • 2.2. Herstellung eines Plasmids, das das vorliegende Reductase-Gen enthält (Herstellung des Plasmids pTrcPAR)
  • Es wurde eine PCR durchgeführt, bei der ein Oligonucleotid mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 5 und ein Oligonucleotid mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 6 als Primer verwendet wurden, und die bei Punkt 2.1. hergestellte chromosomale DNA wurde als Matrize verwendet. Die Reaktionslösung hatte folgende Zusammensetzung, und es wurden folgende Reaktionsbedingungen verwendet (es wurde das Expand High Fidelity PCR-System, hergestellt von Roche Diagnostics, verwendet). Zusammensetzung der Reaktionslösung:
    Chromosomale DNA 1 μl
    dNTP (jeweils 2,5 mM Gemisch) 0,4 μl
    Primer (20 pM/μl) jeweils 0,75 μl
    10 × Puffer (mit MgCl2) 5 μl
    Enzym Expand HiFi (3,5 × 103 E/ml) 0,375 μl
    Hochreines Wasser 41,725 μl
  • Reaktionsbedingungen:
  • Ein Behälter, der die Reaktionslösung mit der vorgenannten Zusammensetzung enthielt, wurde in ein PerkinElmer GeneAmp PCR System 2400 gestellt und 2 Minuten auf 97 °C erwärmt, und die Reaktionslösung wurde mit zehn Zyklen, die jeweils aus Reaktionen bei 97 °C (0,25 Minuten), 55 °C (0,5 Minuten) und 72 °C (1,5 Minuten) bestanden, und dann nochmals mit zwanzig Zyklen, die jeweils aus Reaktionen bei 97 °C (0,25 Minuten), 55 °C (0,5 Minuten) und 72 °C (2,5 Minuten) bestanden, behandelt, und die Reaktionslösung wurde dann weitere 7 Minuten auf 72 °C gehalten.
  • Zu dem PCR-amplifizierten DNA-Fragment, das durch Reindarstellung der PCR-Reaktionslösung erhalten worden war, wurden zwei Restriktionsenzyme (Ncol und BamHI) gegeben, und das DNA-Fragment wurde mit den beiden Enzymen digeriert. Dann wurde das resultierende DNA-Fragment reindargestellt.
  • Gesondert wurden zwei Restriktionsenzyme (NcoI und BamHI) zu dem Vektor pTrc99A (Pharmacia) gegeben, und der Vektor wurde mit den beiden Enzymen digeriert. Dann wurde das resultierende DNA-Fragment reindargestellt.
  • Die so erhaltenen zwei reindargestellten DNA-Fragmente wurden gemischt und mit T4-DNA-Ligase ligiert. Die resultierende Ligationslösung wurde zu E. coli DH5α transformiert.
  • Aus der resultierenden Transformanten wurde ein Plasmid, das das vorliegende Reductase-Gen (nachstehend auch als „Plasmid pTrcPAR" bezeichnet) enthielt, mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) eliminiert.
  • Beispiel 3 (Herstellung des vorliegenden Reductase-Gens (Nr. 3)]
  • 3.1. Herstellung der cDNA-Bank
  • 100 ml Medium [24 g/I Kartoffel-Glucose-Nährlösung (Becton Dickinson) in Wasser] wurden in einen 500-ml-Kolben eingebracht und 15 Minuten bei 121 °C sterilisiert. Das so hergestellte Medium wurde mit 0,5 ml Kultur des Penicillium citrinum IFO4631 [lieferbar vom Institue for Fermentation Osaka (IFO, Japan) (www.ifo.or.jp)], die vorher unter 48-stündigem Schütteln bei 30 °C in einem Medium mit der gleichen Zusammensetzung kultiviert worden war, beimpft, und der Mikroorganismus wurde unter Schütteln 72 Stunden bei 30 °C kultiviert. Dann wurde die resultierende Kultur zentrifugiert (8000 × g, 15 Minuten), und die entstandenen Pellets wurden rückgewonnen. Die Pellets wurden dreimal mit 50 ml 20 mM Kaliumdihydrogenphosphat-Kaliumhydrogenphosphat-Puffer (pH 7,0) gereinigt, um etwa 1,0 g gereinigter Mikroorganismus zu erhalten.
  • Der so erhaltene gereinigte Mikroorganismus wurde verwendet, um die Gesamt-RNA nach dem Guanidinthiocyanat-Phenol-Chloroform-Verfahren herzustellen. Aus der so hergestellten Gesamt-RNA wurde RNA mit Poly(A) unter Verwendung von Oligotex(dT)30-Super (Takara Shuzo Co., Ltd.) gewonnen.
  • Nach dem Gubler-Hoffman-Verfahren wurde eine cDNA-Bank erstellt. Zunächst wurde eine einzelsträngige cDNA unter Verwendung der vorstehend gewonnenen RNA mit Poly(a), von Oligo(dT)18-Linker-Primern [(die eine Xhol-Stelle enthalten), hergestellt von Takara Shuzo Co., Ltd.], RAV-2 Rtase und Superscript II Rtase hergestellt. Zu der Reaktionslösung, die die hergestellte einzelsträngige cDNA enthielt, wurden E.coli-DNA-Polymerase, ein Gemisch aus E.coli-Rnase und Ecoli-DNA-Ligase sowie T4-DNA-Polymerase gegeben, wodurch eine doppelsträngige cDNA mit einem glatten Ende synthetisiert wurde.
  • Die so gewonnene doppelsträngige cDNA wurde mit einem EcoRI-NotI-BamHI-Adaptor (Takara Shuzo Co., Ltd.) ligiert. Nach der Ligation wurde die resultierende DNA phosphoryliert, mit XhoI gespalten, zum Entfernen von niedermolekularer DNA in eine Spin-Säule (Takara Shuzo Co., Ltd.) eingebracht, mit λZapII ligiert (das mit EcoRI-XhoI gespalten worden war) und mit einem in-vitro-Verpackungs-Kit (Stratagene) verpackt, wodurch eine cDNA-Bank (nachstehend auch als „cDNA-Bank A" bezeichnet) erhalten wurde.
  • 3.2. Herstellung eines Plasmids, das das vorliegende Reductase-Gen enthält (Herstellung des Plasmids pTrcRPc)
  • Es wurde eine PCR durchgeführt, bei der ein Oligonucleotid mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 7 und ein Oligonucleotid mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 8 als Primer verwendet wurden, und die bei Punkt 3.1. hergestellte cDNA-Bank wurde als Matrize verwendet. Die Reaktionslösung hatte folgende Zusammensetzung, und es wurden folgende Reaktionsbedingungen verwendet (es wurde das Expand High Fidelity PCR System, hergestellt von Roche Diagnostics, verwendet). Zusammensetzung der Reaktionslösung:
    cDNA-Bank 1 c
    dNTP (jeweils 2,5 mM Gemisch) 0,4 μl
    Primer (20 pM/μl) jeweils 0,75 μl
    10 × Puffer (mit MgCl2) 5 μl
    Enzym Expand HiFi (3,5 × 103 E/ml) 0,375 μl
    Hochreines Wasser 41,725 μl
  • Reaktionsbedingungen:
  • Ein Behälter, der die Reaktionslösung mit der vorgenannten Zusammensetzung enthielt, wurde in ein PerkinElmer GeneAmp PCR System 2400 gestellt und 2 Minuten auf 97 °C erwärmt, und die Reaktionslösung wurde mit zehn Zyklen, die jeweils aus Reaktionen bei 97 °C (0,25 Minuten), 55 °C (0,5 Minuten) und 72 °C (1,5 Minuten) bestanden, und dann nochmals mit zwanzig Zyklen, die jeweils aus Reaktionen bei 97 °C (0,25 Minuten), 55 °C (0,5 Minuten) und 72 °C (2,5 Minuten) bestanden, behandelt, und die Reaktionslösung wurde dann weitere 7 Minuten auf 72 °C gehalten.
  • Zu dem PCR-amplifizierten DNA-Fragment, das durch Reindarstellung der PCR-Reaktionslösung erhalten worden war, wurden zwei Restriktionsenzyme (NcoI und BamHI) gegeben, und das DNA-Fragment wurde mit den beiden Enzymen digeriert. Dann wurde das resultierende DNA-Fragment reindargestellt.
  • Gesondert wurden zwei Restriktionsenzyme (NcoI und BamHI) zu dem Vektor pTrc99A (Pharmacia) gegeben, und der Vektor wurde mit den beiden Enzymen digeriert. Dann wurde das resultierende DNA-Fragment reindargestellt.
  • Die so erhaltenen zwei reindargestellten DNA-Fragmente wurden gemischt und mit T4-DNA-Ligase ligiert. Die resultierende Ligationslösung wurde zu E. coli DH5α transformiert.
  • Aus der resultierenden Transformanten wurde ein das vorliegende Reductase-Gen enthaltendes Plasmid (nachstehend auch als „Plasmid pTrcRPc" bezeichnet) mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) eliminiert.
  • Beispiel 4 (Herstellung des vorliegenden Coenzym-regenerierendes-Enzym-Gens)
  • 4.1. Vorverfahren zur Herstellung eines Gens mit einer Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz eines Enzyms codiert, das oxidiertes β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid u. Ä. zu reduziertem β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid u. Ä. umsetzen kann
  • 100 ml LB-Medium (1 % Trypton, 0,5 % Hefeextrakt, 1 % Natriumchlorid) wurden in einen Kolben eingebracht und sterilisiert. Das so hergestellte Medium wurde mit 0,3 ml Kultur des Bacillus megaterium IFO12108 [lieferbar vom Institue for Fermentation Osaka (IFO, Japan) (www.ifo.or.jp)], die vorher in einem flüssigen Medium mit der gleichen Zusammensetzung kultiviert worden war, beimpft, und der Mikroorganismus wurde unter Schütteln 10 Stunden bei 30 °C kultiviert.
  • Nach der Kultivierung wurde die resultierende Kultur zentrifugiert (15.000 × g, 15 Minuten, 4 °C), um den Mikroorganismus rückzugewinnen. Der rückgewonnene Mikroorganismus wurde in 30 ml 50 mM Kaliumdihydrogenphosphat-Kaliumhydrogenphosphat-Puffer (pH 7,0) suspendiert, und diese Suspension wurde zentrifugiert (15.000 × g, 15 Minuten, 4 °C), wodurch der gereinigte Mikroorganismus erhalten wurde.
  • Aus dem so erhaltenen gereinigten Mikroorganismus wurde chromosomale DNA unter Verwendung des Qiagen Genomic Tip (Qiagen) nach einem Verfahren reindargestellt, das in dem dort beigefügten Handbuch beschrieben ist.
  • 4.2. Herstellung eines Gens mit einer Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz eines Enzyms codiert, das oxidiertes β-Nicotinamid-adenin-dinucleotid u. Ä. zu reduziertem Q-Nicotinamid-adenin-dinucleotid u. Ä. umsetzen kann (Nr. 1: Herstellung des Plasmids pSDGDH 12)
  • Aufgrund der Aminosäuresequenz der Glucosedehydrogenase, die von dem bekannten Bacillus megaterium IWG3 stammt, das in The Journal of Biological Chemistry, Bd. 264, Nr. 11, 6381–6385 (1989), beschrieben ist, wurden ein Oligonucleotid mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 9 und ein Oligonucleotid mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 10 synthetisiert.
  • Es wurde eine PCR durchgeführt, in der das Oligonucleotid mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 9 und das Oligonucleotid mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 10 als Primer verwendet wurden, und die bei Punkt 4.1. hergestellte chromosomale DNA. wurde als Matrize verwendet. Die Reaktionslösung hatte die im Beispiel 2 (2.2.) angegebene Zusammensetzung, und es wurden die dort angegebenen Reaktionsbedingungen verwendet (es wurde das Expand High Fidelity PCR System, hergestellt von Roche Diagnostics, verwendet).
  • Das PCR-amplifizierte DNA-Fragment, das durch Reindarstellung der PCR-Reaktionslösung erhalten worden war, wurde mit einer im Vektor pCR2.1-TOPO vorhandenen „PCR-Produkt-Insertionsstelle" unter Verwendung des Klonierungskits TOPOTTM TA, hergestellt von Invitrogen, ligiert. Die resultierende Ligationslösung wurde zu E. coli DHSα transformiert.
  • Aus der resultierenden Transformanten wurde ein das Glucosedehydrogenase-Gen enthaltendes Plasmid (nachstehend auch als „Plasmid pSDGDH12" bezeichnet) mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) eliminiert.
  • Dann wurde das eliminierte Plasmid pSDGDH12 als Matrize einer Sequenzierungsreaktion mit dem Dye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit (PerkinElmer) unterzogen, und dann wurde die Nucleotidsequenz der resultierenden DNA mit dem DNA-Sequenzierungsautomaten 373A (PerkinElmer) analysiert. Die Ergebnisse sind bei SEQ ID NO: 11 angegeben.
  • 4.3. Herstellung eines Gens mit einer Nucleotidsequenz, die die Aminosäuresequenz eines Enzyms codiert, das oxidiertes β-Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat u. Ä. zu reduziertem β-Nicotinamid-adenin-dinucleotidphosphat u. Ä. umsetzen kann (Nr. 2: Herstellung des Plasmids pAGDH12)
  • 4.3.1. Herstellung des Plasmids pTGDH12
  • Aufgrund der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 11 wurden ein Oligonucleotid mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 13 und ein Oligonucleotid mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 14 synthetisiert.
  • Es wurde eine PCR durchgeführt, bei der das Oligonucleotid mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 13 und das Oligonucleotid mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 14 als Primer verwendet wurden, und die bei Punkt 4.1. hergestellte chromosomale DNA wurde als Matrize verwendet. Die Reaktionslösung hatte folgende Zusammensetzung, und es wurden folgende Reaktionsbedingungen verwendet (es wurde das Expand High Fidelity PCR System, hergestellt von Roche Diagnostics, verwendet). Zusammensetzung der Reaktionslösung:
    Sock-Lösung der chromosomalen DNA 1 μl
    dNTP (jeweils 2,5 mM Gemisch) 0,4 μl
    Primer (20 pMiuI) jeweils 0,75 μl
    10 × Puffer (mit MgCl2) 5 μl
    Enzym Expand HiFi (3,5 × 103 E/ml) 0,375 μl
    Hochreines Wasser 41,725 μl
  • Reaktionsbedingungen:
  • Ein Behälter, der die Reaktionslösung mit der vorgenannten Zusammensetzung enthielt, wurde in ein PerkinElmer GeneAmp PCR System 2400 gestellt und 2 Minuten auf 97 °C erwärmt, und die Reaktionslösung wurde mit zehn Zyklen, die jeweils aus Reaktionen bei 97 °C (0,25 Minuten), 55 °C (0,5 Minuten) und 72 °C (1,5 Minuten) bestanden, und dann nochmals mit zwanzig Zyklen, die jeweils aus Reaktionen bei 97 °C (0,25 Minuten), 55 °C (0,5 Minuten) und 72 °C (2,5 Minuten) bestanden, behandelt, und die Reaktionslösung wurde dann weitere 7 Minuten auf 72 °C gehalten.
  • Zu dem PCR-amplifizierten DNA-Fragment, das durch Reindarstellung der PCR-Reaktionslösung erhalten worden war, wurden zwei Restriktionsenzyme (NcoI und BamHI) gegeben, und das DNA-Fragment wurde mit den beiden Enzymen digeriert. Dann wurde das resultierende DNA-Fragment reindargestellt.
  • Gesondert wurden zwei Restriktionsenzyme (NcoI und BamHI) zu dem Vektor pTV118N (Takara Shuzo Co., Ltd.) gegeben, und der Vektor wurde mit den beiden Enzymen digeriert. Dann wurde das resultierende DNA-Fragment reindargestellt.
  • Die so erhaltenen zwei reindargestellten DNA-Fragmente wurden gemischt und mit T4-DNA-Ligase ligiert. Die resultierende Ligationslösung wurde zu E. coli DH5α transformiert.
  • Aus der resultierenden Transformanten wurde ein das vorliegende Reductase-Gen enthaltendes Plasmid (nachstehend auch als „Plasmid pTGDH12" bezeichnet) mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) eliminiert.
  • 4.3.2. Herstellung des Plasmids pCGDH12
  • Aufgrund der Nucleotidsequenz des Vektors pTV118N (Takara Shuzo Co., Ltd.) wurde ein Oligonucleotid mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 15 synthetisiert.
  • Es wurde eine PCR durchgeführt, bei der das Oligonucleotid mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 15 und das Oligonucleotid mit der Nucleotidsequenz SEQ ID NO: 14 als Primer verwendet wurden, und das Plasmid pTGDH12 wurde als Matrize verwendet. Die Reaktionslösung hatte folgende Zusammensetzung, und es wurden folgende Reaktionsbedingungen verwendet (es wurde das Expand High Fidelity PCR System, hergestellt von Roche Diagnostics, verwendet). Zusammensetzung der Reaktionslösung:
    Plasmid-pTGDH12-Lösung 1 μl
    dNTP (jeweils 2,5 mM Gemisch) 0,4 μl
    Primer (20 pM/μl) jeweils 0,75 μl
    10 × Puffer (mit MgCl2) 5 μl
    Enzym Expand HiFi (3,5 × 103 E/ml) 0,375 μl
    Hochreines Wasser 41,725 μl
  • Reaktionsbedingungen:
  • Ein Behälter, der die Reaktionslösung mit der vorgenannten Zusammensetzung enthielt, wurde in ein PerkinElmer GeneAmp PCR System 2400 gestellt und 2 Minuten auf 97 °C erwärmt, und die Reaktionslösung wurde mit zehn Zyklen, die jeweils aus Reaktionen bei 97 °C (0,25 Minuten), 55 °C (0,5 Minuten) und 72 °C (1,5 Minuten) bestanden, und dann nochmals mit zwanzig Zyklen, die jeweils aus Reaktionen bei 97 °C (0,25 Minuten), 55 °C (0,5 Minuten) und 72 °C (2,5 Minuten) bestanden, behandelt, und die Reaktionslösung wurde dann weitere 7 Minuten auf 72 °C gehalten.
  • Unter Verwendung der resultierenden PCR-Reaktionslösung und des Klonierungskits TOPOTM TA, Variante E, wurde das durch PCR erhaltene DNA-Fragment mit etwa 1000 by mit einer im Vektor pCR2.1-TOPO vorhandenen „PCR-Produkt-Insertionsstelle" ligiert, und die Ligationslösung wurde zu E. coli DHSα transformiert.
  • Aus der resultierenden Transformanten wurde ein das vorliegende Reductase-Gen enthaltendes Plasmid (nachstehend auch als „Plasmid pCGDH12" bezeichnet) mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) eliminiert.
  • 4.3.3. Herstellung des Plasmids pAGDH12
  • Durch Zugeben eines Restriktionsenzyms (BamHI) zu dem Plasmid pCGDH12 wurde das Plasmid digeriert. Dann wurde das resultierende DNA-Fragment (etwa 1000 bp) reindargestellt.
  • Gesondert wurde ein Restriktionsenzym (BamHI) zu dem Vektor pACYC184 (Nippon Gene) gegeben, wodurch das Plasmid digeriert wurde. Dann wurde das resultierende DNA-Fragment reindargestellt. Außerdem wurde das DNA-Fragment mit alkalischer Phosphatase (Takara Shuzo Co., Ltd.) dephosphoryliert, um eine Selbst-Ligation zu vermeiden.
  • Die so erhaltenen zwei reindargestellten DNA-Fragmente wurden gemischt und mit T4-DNA-Ligase ligiert. Die resultierende Ligationslösung wurde zu E. coli DH5α transformiert.
  • Die resultierende Transformante wurde in einem LB-Agarmedium, das 20 μg/ml Chloramphenicol enthielt, kultiviert, und aus den proliferierten Kolonien wurden vier Kolonien zufällig ausgewählt. Die ausgewählten Kolonien wurden jeweils in 2 ml sterilisiertes LB-Medium eingeimpft, das 20 μg/ml Chloramphenicol enthielt, und in einem Reagenzglas unter Schütteln 24 Stunden bei 30 °C kultiviert. Aus den einzelnen kultivierten Mikroorganismen wurden Plasmide mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) eliminiert. Ein Teil jedes der eliminierten Plasmide wurde mit BamHI digeriert, und dann wurde das Digestionsprodukt der Elektrophorese unterworfen, wodurch nachgewiesen wurde, dass alle eliminierten Plasmide das dort inserierte vorgenannte DNA-Fragment (etwa 1000 bp) hatten. (Die eliminierten Plasmide werden nachstehend auch als „Plasmid pAGDH12" bezeichnet.)
  • Beispiel 5 (Herstellung eines Plasmids, das das Reductase-Gen und das Coenzymregenerierendes-Enzym-Gen enthält (Nr. 1: Herstellung des Plasmids pTrcPARSbG)]
  • Zwei Restriktionsenzyme (BamHI und XbaI) wurden zu dem im Beispiel 4 (4.2.) hergestellten Plasmid pSDGDH12 gegeben, und das Plasmid wurde mit den beiden Enzymen digeriert. Dann wurde das digerierte DNA-Fragment reindargestellt.
  • Gesondert wurden die beiden Restriktionsenzyme (BamHI und XbaI) zu dem im Beispiel 2 hergestellten Plasmid gegeben, und das Plasmid wurde mit den beiden Enzymen digeriert. Dann wurde das resultierende DNA-Fragment reindargestellt.
  • Die so erhaltenen zwei reindargestellten DNA-Fragmente wurden gemischt und mit T4-DNA-Ligase ligiert. Die resultierende Ligationslösung wurde zu E. coli DH5α transformiert.
  • Aus der resultierenden Transformanten wurde ein das Reductase-Gen und das Coenzym-regenerierendes-Enzym-Gen enthaltendes Plasmid (nachstehend auch als „Plasmid pTrcPARSbG" bezeichnet) mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Diagen) eliminiert.
  • Beispiel 6 [Herstellung eines Plasmids, das das Reductase-Gen und das Coenzymregenerierendes-Enzym-Gen enthält (Nr. 2 Herstellung des Plasmids pTrcRSbG12)]
  • Zwei Restriktionsenzyme (BamHI und XbaI) wurden zu dem im Beispiel 4 (4.2.) hergestellten Plasmid pSDGDH12 gegeben, und das Plasmid wurde mit den beiden Enzymen digeriert. Dann wurde das digerierte DNA-Fragment reindargestellt.
  • Gesondert wurden die beiden Restriktionsenzyme (BamHI und XbaI) zu dem im Beispiel 3 hergestellten Plasmid pTrcRPc gegeben, und das Plasmid wurde mit den beiden Enzymen digeriert. Dann wurde die digerierte DNA reindargestellt.
  • Die so erhaltenen zwei reindargestellten DNA-Fragmente wurden gemischt und mit T4-DNA-Ligase ligiert. Die resultierende Ligationslösung wurde zu E. coli DHSα transformiert.
  • Aus der resultierenden --ransformanten wurde ein das Reductase-Gen und das Coenzym-regenerierendes-Enzym-Gen enthaltendes Plasmid (nachstehend auch als „Plasmid pTrcRSbG12" bezeichnet) mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (Qiagen) eliminiert.
  • Beispiel 7 ((Herstellung einer Transformanten, die das Reductase-Gen und das Coenzymregenerierendes-Enzym-Gen enthält (Nr. 1)]
  • Mit dem im Beispiel 5 hergestellten Plasmid pTrcPARSbG wurde E. coli HB101 transformiert. Die resultierende Treinsformante wurde in ein sterilisiertes LB-Medium (drei 100-ml-Röhrchen), das 0,4 mM IPTG 0,01 % (Masse/Volumen) ZnCl2 und 50 μg/ml Ampicillin enthielt, eingeimpft und dann 18 Stunden unter Schütteln bei 30 °C kultiviert. Nach der Kultivierung wurde die Kulturlösung zentrifugiert und gereinigt, um den gereinigten Mikroorganismus rückzugewinnen.
  • Beispiel 8 [Herstellung einer Transformanten, die das Reductase-Gen und das Coenzymregenerierendes-Enzym-Gen enthält (Nr. 2)]
  • Mit dem im Beispiel 6 hergestellten Plasmid pTrcRSbG12 wurde E. coli HB101 transformiert. Die resultierende Transformante wird in ein sterilisiertes LB-Medium (drei 100-ml-Röhrchen), das 0,1 mM IPTG und 50 μg/ml Ampicillin enthielt, eingeimpft und dann 18 Stunden unter Schütteln bei 30 °C kultiviert. Nach der Kultivierung wurde die Kulturlösung zentrifugiert und gereinigt, um 1,2 g gereinigten Mikroorganismus rückzugewinnen.
  • Beispiel 9 (Herstellung einer Transformanten, die das Reductase-Gen und das Coenzymregenerierendes-Enzym-Gen enthält (Nr. 3)]
  • Mit dem im Beispiel 3 hergestellten Plasmid pTrcRPc und dem im Beispiel 4 (4.3.) hergestellten Plasmid pAGDH12 wurde E. coli HB101 transformiert. Die resultierende Transformante wurde in ein sterilisiertes LB-Medium (drei 100-ml-Röhrchen), das 0,4 mM IPTG, 20 μg/ml Chloramphenicol und 50 μg/ml Ampicillin enthielt, eingeimpft und dann 18 Stunden unter Schütteln bei 30 °C kultiviert. Nach der Kultivierung wurde die Kulturlösung zentrifugiert und gereinigt, um den gereinigten Mikroorganismus rückzugewinnen.
  • Beispiel 10 (Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxycyclohexanon (Nr. 1)]
  • 15 mg des im Beispiel 1 hergestellten gereinigten Mikroorganismus, 2,5 mg NAD+ (Reagens von Oriental Yeast Co., Ltd.) und 5 % (Volumen/Volumen) 2-Propanol wurden in 2,0 ml Kaliurndihydrogenphosphat-Kaliumhydrogenphosphat-Puffer (pH 6,5) gegeben. Dieses Gemisch wurde mit 50 mg 1,3-Cyclohexandion (Reagens von Aldrich) versetzt. Das so erhaltene Gemisch (Reaktionslösung) wurde unter Rühren 21 Stunden bei 30 °C reagieren gelassen. Nach Abschluss der Reaktion wurden 2,0 ml Butylacetat in die Reaktionslösung gegeben, dies wurde gerührt und zentrifugiert, wodurch die organische Schicht bzw. die wässrige Schicht rückgewonnen wurde. Mittels Gaschromatographie wurde die Bildung von 3-Hydroxycyclohexanon nachgewiesen. Die Ausbeute betrug 11 % (Gaschromatographie).
  • Gaschromatographie-Bedingungen:
    • Säule: DB-1 (0,53 mm ⌀ × 30 mm, 1,5 μm)
    • Temperatur der Einspritzöffnung: 170 °C
    • Detektor (Flammenionisationsdetektor): 300 °C
    • Temperatur des Säulenkabinetts: 70 °C (5 Minuten gehalten) → 5 °C/min → 170 °C (0 Minuten gehalten) → Temperaturerhöhung: 30 °C/min → 290 °C
    • Trägergas: 10 ml/min
    • Retentionszeit des 3-Hydroxycyclohexanons: 9,2 Minuten
  • 3-Hydroxycyclohexanon wurde nach einem bekannten Verfahren [Journal of Organic Chemistry, S. 1046 (2001)] hergestellt.
  • Beispiel 12 (Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxycyclohexanon (Nr. 2)]
  • 10 mg kommerzielles Enzym KRED1004 (Biocatalytics, USA), 25 mg NADP+ (Reagens von Oriental Yeast), 1,0 g Glucose und eine kommerzielle Enzym-Glucosedehydrogenase (Amano Pharmaceutical Co., Ltd.) wurden in 25 g 100 mM Kaliumdihydrogenphosphat-Kaliumhydrogenphosphat-Puffer (pH 6,5) gegeben. Nach Zugabe von 50 mg 1,3-Cyclohexandion zu diesem Gemisch wurde das Gemisch vier Stunden unter Rühren bei 30 °C reagieren gelassen. Während der Reaktion wurde die Reaktionslösung durch entsprechende Zugabe von 15-%igem wässrigen Natriumcarbonat auf einem pH von 6,4 bis 6,5 gehalten. Nach Abschluss der Reaktion wurden 25 ml Ethylacetat in die Reaktionslösung gegeben, dies wurde gerührt und zentrifugiert, wodurch die organische Schicht bzw. die wässrige Schicht rückgewonnen wurde. Dann wurden nochmals 25 ml Ethylacetat zu der rückgewonnenen wässrigen Schicht gegeben, und das vorstehende Verfahren wurde wiederholt. Die so erhaltenen organischen Schichten wurden vereinigt, eingedickt, in 30 ml Chloroform gelöst und über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet. Nach dem Trocknen wurde das Chloroform abdestilliert, wodurch 20 mg 3-Hydroxycyclohexanon mit den folgenden physikalischen Eigenschaften erhalten wurden:
    H-NMR (δ, ppm, CDCl3); 1,8 (2H, m), 2,0 (2H, m), 2,4 (2H, m), 2,7 (2H, m), 4,2 (1H, m) [α]D = –18° (c = 0,25, CDCl3)
  • Bezugsbeispiel 1 (Gewinnung eines Mikroorganismus, der 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon reduzieren kann)
  • 1.1. Herstellung eines gereinigten Mikroorganismus
  • Ein kommerzieller Mikroorganismus oder ein aus Boden o. Ä. isolierter Mikroorganismus wurde in 10 ml sterilisiertes LB-Medium eingeimpft und 18 Stunden unter Schütteln bei 30 °C kultiviert. Nach der Kultivierung wurde die Kulturlösung zentrifugiert und gereinigt, um den gereinigten Mikroorganismus rückzugewinnen.
  • 1.2. Screenen
  • 1 g gereinigter Mikroorganismus, der bei Punkt 1.1. hergestellt worden war, 12 mg NADP+, 12 mg NAD+ und 2,5 g Glucose wurden in 20 ml 100 mM Kaliumdihydrogenphosphat-Kaliumhydrogenphosphat-Puffer (pH 6,5) gegeben. Nach Zugabe von 240 mg 1,3-Cyclohexandion zu diesem Gemisch wurde der pH-Wert des Gemisches mit 15-%igem wässrigen Natriumcarbonat auf 6,5 eingestellt. Das so erhaltene Gemisch (Reaktionslösung) wurde 4 Stunden unter Rühren bei 30 °C reagieren gelassen. Nach Abschluss der Reaktion wurden 25 ml Ethylacetat in die Reaktionslösung gegeben, dies wurde gerührt und zentrifugiert, wodurch die organische Schicht bzw. die wässrige Schicht rückgewonnen wurden. Dann wurden nochmals 25 ml Ethylacetat zu der rückgewonnenen wässrigen Schicht gegeben, und das vorstehende Verfahren wurde wiederholt. Die so erhaltenen organischen Schichten wurden vereinigt, eingedickt, in 30 ml Chloroform gelöst und über wasserfreiem Na2SO4 getrocknet. Nach dem Trocknen wurde das Chloroform abdestilliert, um den Rückstand zu erhalten. Durch qualitative und/oder quantitative Analyse unter Verwendung der Flüssigchromatographie oder Gaschromatographie und Messung der optischen Drehung wurde nachgewiesen, dass 3-Hydroxycyclohexanon in dem resultierenden Rückstand enthalten war.
  • Wie vorstehend dargelegt, kann 3-Hydroxycyclohexanon erfindungsgemäß effizient oder problemlos hergestellt werden.
  • Freier Text der Sequenzliste
  • SEQ ID NO: 5 stellt ein Oligonucleotid dar, das ein für die PCR bestimmter Primer ist.
  • SEQ ID NO: 6 stellt ein Oligonucleotid dar, das ein für die PCR bestimmter Primer ist.
  • SEQ ID NO: 7 stellt ein Oligonucleotid dar, das ein für die PCR bestimmter Primer ist.
  • SEQ ID NO: 8 stellt ein Oligonucleotid dar, das ein für die PCR bestimmter Primer ist.
  • SEQ ID NO: 9 stellt ein Oligonucleotid dar, das ein für die PCR bestimmter Primer ist.
  • SEQ ID NO: 10 stellt ein Oligonucleotid dar, das ein für die PCR bestimmter Primer ist.
  • SEQ ID NO: 13 stellt ein Oligonucleotid dar, das ein für die PCR bestimmter Primer ist.
  • SEQ ID NO: 14 stellt ein Oligonucleotid dar, das ein für die PCR bestimmter Primer ist.
  • SEQ ID NO: 15 stellt ein Oligonucleotid dar, das ein für die PCR bestimmter Primer ist.
  • Sequenzliste
  • S. 56
    • Künstliche Sequenz
    • Für die PCR bestimmter Oligonucleotid-Primer
    • Künstliche Sequenz
    • Für die PCR bestimmter Oligonucleotid-Primer
    • Künstliche Sequenz
    • Für die PCR bestimmter Oligonucleotid-Primer
  • S. 57
    • Künstliche Sequenz
    • Für die PCR bestimmter Oligonucleotid-Primer
    • Künstliche Sequenz
    • Für die PCR bestimmter Oligonucleotid-Primer
  • S. 58
    • Künstliche Sequenz
    • Für die PCR bestimmter Oligonucleotid-Primer
  • S. 63
    • Künstliche Sequenz
    • Für die PCR bestimmter Oligonucleotid-Primer
    • Künstliche Sequenz
    • Für die PCR bestimmter Oligonucleotid-Primer
    • Künstliche Sequenz
  • S. 64
    • Für die PCR bestimmter Oligonucleotid-Primer
      Figure 00460001
      Figure 00470001
      Figure 00480001
      Figure 00490001
      Figure 00500001
      Figure 00510001
      Figure 00520001
      Figure 00530001
      Figure 00540001
      Figure 00550001
      Figure 00560001
      Figure 00570001
      Figure 00580001
      Figure 00590001
      Figure 00600001
      Figure 00610001
      Figure 00620001
      Figure 00630001
      Figure 00640001
      Figure 00640002

Claims (13)

  1. Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem 3-Hydroxycyclohexanon mit den Schritten: (a) Reagieren von 1,3-Cyclohexandion mit (I) einem Enzym mit der Fähigkeit, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon zu reduzieren, (II) einem Mikroorganismus, der das in (I) definierte Enzym produziert, oder (III) einem behandelten Material aus dem in (I) definierten Enzym oder dem in (II) definierten Mikroorganismus; und (b) Rückgewinnen des resultierenden 3-Hydroxycyclohexanons, dadurch gekennzeichnet, dass I) das Enzym mit der Fähigkeit, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon zu reduzieren, ein Enzym ist, das von einem Mikroorganismus abgeleitet ist, der zu der Gattung Arthrobacter, Rhodotorula, Bacillus, Pseudomonas, Streptomyces, Candida, Corynebacterium oder Penicillium gehört, oder das eine der folgenden Aminosäuresequenzen hat: die bei SEQ ID NO: 1 oder 3 angegebene Aminosäuresequenz, eine Aminosäuresequenz mit einer Deletion, Substitution oder Addition einer oder mehrerer Aminosäuren in der Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 1 oder 3, eine Aminosäuresequenz, die mit der bei SEQ ID NO: 2 oder 4 angegebenen Nucleotidsequenz codiert ist, und eine Aminosäuresequenz, die mit einer Nucleotidsequenz einer DNA codiert ist, die eine Sequenz-Identität von 90 % oder mehr mit der DNA der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 oder 4 hat, oder II) der Mikroorganismus, der das Enzym produziert, eine Transformante mit einem integrierten Plasmid ist, das eine Nucleotidsequenz der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 oder 4 oder eine Nucleotidsequenz einer DNA mit einer Sequenz-Identität von 90 % oder mehr mit der DNA der Nucleotidsequenz der SEQ ID NO: 2 oder 4 enthält, oder III) das behandelte Material aus dem Mikroorganismus, der das Enzym mit der Fähigkeit, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon zu reduzieren, produziert, tote Mikrobenzellen des unter II) definierten Mikroorganismus umfasst.
  2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Transformante Escherichia coli ist.
  3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym die bei SEQ ID NO: 1 angegebene Aminosäuresequenz hat.
  4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym die bei SEQ ID NO: 3 angegebene Aminosäuresequenz hat.
  5. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Aminosäuresequenz hat, die mit der bei SEQ ID NO: 2 angegebenen Nucleotidsequenz codiert ist.
  6. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass das Enzym eine Aminosäuresequenz hat, die mit der bei SEQ ID NO: 4 angegebenen Nucleotidsequenz codiert ist.
  7. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Transformante eine Transformante ist, die durch Integrieren des Plasmids, das eine unter II) definierte Nucleotidsequenz, die das Enzym codiert, enthält, und wahlweise eines Plasmids, das eine Nucleotidsequenz enthält, die ein Enzym codiert, das ein Coenzym regeneriert, von dem das Enzym mit der Fähigkeit, 1,3-Cyclohexandion zu 3-Hydroxycyclohexanon zu reduzieren, abhängt, produziert wird.
  8. Verfahren nach Anspruch 7, dadurch gekennzeichnet, dass das Coenzym NADH/NAD+ (Nicotinamid-adenin-dinucleotid) oder NADPH/NADP+ (Nicotinamid-adenindinucleotidphosphat) ist.
  9. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass 1,3-Cyclohexandion mit der Transformanten oder deren toten Mikrobenzellen in Gegenwart eines Fettalkohols reagieren gelassen wird.
  10. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Fettalkohol ein Alkohol mit einem Kochpunkt von 200 °C oder weniger ist.
  11. Verfahren nach Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, dass der Fettalkohol 2-Propanol ist.
  12. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass 1,3-Cyclohexandion mit der Transformanten oder deren toten Mikrobenzellen in Gegenwart von Glucose reagieren gelassen wird.
  13. Optisch aktives 3-Hydroxycyclohexanon.
DE60303644T 2002-07-15 2003-07-11 Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxycyclohexanon Expired - Lifetime DE60303644T2 (de)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
JP2002205207 2002-07-15
JP2002205207 2002-07-15

Publications (2)

Publication Number Publication Date
DE60303644D1 DE60303644D1 (de) 2006-04-27
DE60303644T2 true DE60303644T2 (de) 2006-12-21

Family

ID=29774585

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
DE60303644T Expired - Lifetime DE60303644T2 (de) 2002-07-15 2003-07-11 Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxycyclohexanon

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20050272136A1 (de)
EP (1) EP1382683B1 (de)
DE (1) DE60303644T2 (de)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102005008908A1 (de) * 2004-03-22 2006-01-19 Degussa Ag Neue Alkoholdehydrogenasen
US7172890B2 (en) 2004-10-28 2007-02-06 Roche Diagnostics Gmbh Inactivated enzyme variants and associated process and reagent system
CN101255103B (zh) * 2008-02-27 2011-05-11 厦门大学 海洋青霉菌抗肿瘤活性化合物的制备方法及其应用

Family Cites Families (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE3129935A1 (de) * 1980-08-01 1982-04-22 Imperial Chemical Industries Ltd., London Verfahren zum mikrobiologischen oxidieren einer organischen verbindung, verfahren zur anpassung von methan verwertenden bakterien an die verwertung von methanol als kohlenstoffquelle und nach diesem verfahren angepasste, methan verwertende bakterien
US5233095A (en) * 1986-03-18 1993-08-03 Catalytica, Inc. Process for manufacture of resorcinol
JPH0678277B2 (ja) * 1988-02-19 1994-10-05 高砂香料工業株式会社 光学活性アルコールおよびその誘導体の製造方法
US5215919A (en) * 1991-02-25 1993-06-01 Takeda Chemical Industries, Ltd. Process for producing optically active 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid esters using microbially derived reductase
US5908953A (en) * 1996-12-18 1999-06-01 Mitsubishi Chemical Corporation Method for producing (R)-4-cyano-3-hydroxybutyric acid lower alkyl ester
CZ298236B6 (cs) * 1997-02-07 2007-08-01 Kaneka Corporation Nová karbonylová reduktasa, gen, který ji kóduje a zpusob pro pouzití této reduktasy a genu
JP2000236883A (ja) * 1998-12-21 2000-09-05 Daicel Chem Ind Ltd 新規なカルボニル還元酵素、該酵素の製造方法、該酵素をコードするｄｎａおよびこれを利用したアルコールの製造方法
EP1201647B1 (de) * 2000-10-31 2004-09-22 Sumitomo Chemical Company, Limited Verfahren zur Herstellung von 4-Cyano-4-Oxobuttersäureester und 4-Cyano-3-Hydroxybuttersäureester
US6884607B2 (en) * 2000-12-07 2005-04-26 Sumitomo Chemical Company, Limited Process for producing optically active 4-halo-3-hydroxybutanoate
JP2003250577A (ja) * 2001-12-27 2003-09-09 Sumitomo Chem Co Ltd ２‐ヒドロキシシクロアルカンカルボン酸エステルの製造方法

Also Published As

Publication number Publication date
EP1382683A3 (de) 2004-01-28
DE60303644D1 (de) 2006-04-27
EP1382683A2 (de) 2004-01-21
EP1382683B1 (de) 2006-02-22
US20050272136A1 (en) 2005-12-08

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP2602329A1 (de) Biotechnologische Herstellung von 3-Hydroxyisobuttersäure
DE60128581T2 (de) Herstellung von alpha -hydroxy-carboxy säure mit hilfe von einem gekoppelten enzym system
EP0347374B1 (de) Verfahren zur Herstellung von Hydroxysäuren
DE69920568T2 (de) Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem 4-Halo-3-hydroxybuttersäureester
DE69506900T2 (de) Enzymatisches verfahren zur herstellung von chiralen alpha-tertiären carbonsäureestern
AT501928B1 (de) Verfahren zur herstellung von chiralen alkoholen
DE60128640T2 (de) Verfahren zur Herstellung von optisch aktivem 4-Halo-3-Hydroxybutanoat
DE60303644T2 (de) Verfahren zur Herstellung von 3-Hydroxycyclohexanon
US20030186400A1 (en) Method for producing optically active 2-hydroxycycloalkanecarboxylic acid ester
JP2002136293A (ja) 微生物およびｄ−乳酸の製造方法
EP0274146B1 (de) Verfahren zur Herstellung von 2-Arylpropionsäure
EP1313860B1 (de) Butinol i esterase
EP2054510A2 (de) Verfahren zur herstellung von optisch aktiven hydroxyalkylacetaten durch racematspaltung von 4-hydroxy-2-ketonen unter verwendung von baeyer-villiger monooxygenasen
JP5403498B2 (ja) （ｒ）−３−キヌクリジノールの製造方法
JP4742610B2 (ja) フマル酸の製造方法
DE69529514T2 (de) Verfahren zur herstellung von (r)-2-amino-1-phenylethanol oder seinen halogenierten derivaten, verfahren zur herstellung von optisch aktivem phenylserin und seinen halogenierten derivaten, und die neuartige verbindung 3-(3-chlorophenyl)serin
DE10220234B4 (de) Verfahren sowie Mikroorganismen zur mikrobiellen Herstellung von Pyruvat aus Kohlenhydraten sowie Alkoholen
EP1576147B1 (de) Bakterienstämme delftia acidovorans mc1-s, ihre herstellung sowie ihre verwendung zur produktion der s-enantiomeren von 2-phenoxypropionsäure-derivaten
EP1576194B1 (de) Bakterienstämme delftia acidovorans mc1-r, ihre herstellung sowie ihre verwendung zur produktion der r-enantiomeren von 2-phenoxypropionsäure-derivaten
JP2000175693A (ja) （ｒ）−２−ヒドロキシ−１−フェノキシプロパン誘導体の製造方法
JP2001025394A (ja) スチレン類からの芳香族カルボニル化合物の製造方法
JP2004097208A (ja) ３−ヒドロキシシクロヘキサノンの製造方法
JP3090761B2 (ja) 光学活性乳酸の製造法
JP2004350625A (ja) 光学活性ｎ−ベンジル−３−ピロリジノールの製造方法
WO2006129628A1 (ja) 光学活性２－置換プロパナール誘導体の製造法

Legal Events

Date Code Title Description
8364 No opposition during term of opposition