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DE69506900T2 - Enzymatisches verfahren zur herstellung von chiralen alpha-tertiären carbonsäureestern - Google Patents

Enzymatisches verfahren zur herstellung von chiralen alpha-tertiären carbonsäureestern

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Publication number
DE69506900T2
DE69506900T2 DE69506900T DE69506900T DE69506900T2 DE 69506900 T2 DE69506900 T2 DE 69506900T2 DE 69506900 T DE69506900 T DE 69506900T DE 69506900 T DE69506900 T DE 69506900T DE 69506900 T2 DE69506900 T2 DE 69506900T2
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DE
Germany
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atcc
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rhodococcus
carboxylic acid
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DE69506900T
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Fateme Sima Newark De 19711-6014 Sariaslani
Barry Wynnewood Pa 19096-3511 Stieglitz
Vincent G. Wilmington De 19803-2422 Witterholt
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Vanderbilt University
Original Assignee
EI Du Pont de Nemours and Co
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P41/00—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture
    • C12P41/003—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions
    • C12P41/005—Processes using enzymes or microorganisms to separate optical isomers from a racemic mixture by ester formation, lactone formation or the inverse reactions by esterification of carboxylic acid groups in the enantiomers or the inverse reaction
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P7/00—Preparation of oxygen-containing organic compounds
    • C12P7/40—Preparation of oxygen-containing organic compounds containing a carboxyl group including Peroxycarboxylic acids
    • C12P7/42—Hydroxy-carboxylic acids

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  • Organic Low-Molecular-Weight Compounds And Preparation Thereof (AREA)

Description

    HINTERGRUND DER ERFINDUNG
  • Viele Agrochemikalien und Pharmazeutika werden gegenwärtig als racemische oder diastereomere Mischungen vemarktet. In vielen Fällen stammt der gewünschte physiologische Effekt von nur einem Enantiomer/Diastereomer ab, während das andere Enantiomer/Diastereomer inaktiv oder sogar schädlich oder hindernd ist. Chemische und enzymatische Techniken zum Trennen von Enantiomeren werden zunehmend wichtige Werkzeuge für die Herstellung von Chemikalien von hoher Enantiomerreinheit.
  • U. S. 4898822 beschreibt die Herstellung von optisch aktiven Indolin-2-Carbonsäuren durch Hydrolyse der entsprechenden racemischen Ester unter Verwenden von Enzymen oder Mikroorganismen, die stereoselektive Esteraseaktivität besitzen. Die in jenem Patent offenbarten Substrate sind Verbindungen der folgenden allgemeinen Formel:
  • wobei das chirale Zentrum, das durch den Stern angegeben ist, ein sekundär substituiertes α-Kohlenstoffatom ist.
  • U. S. 5202260 und Yee et al., J. Org. Chem (1992) 57: 3525-3527 offenbart die Herstellung von optisch aktiven Säuren und ihren entsprechenden Estern durch teilweise enzymatische Hydrolyse von α-tertiärem Carbonsäureestern unter Verwenden von Enzymen, die von Candida lipolytica abstammen. Das verwendete Enzym stammt ausschließlich von einer einzelnen Spezies von Hefe ab, und wandelt all ein den S-Ester der racemischen Mischung in seine korrespondierende S-Säure um, wobei der R-Ester intakt belassen wird.
  • Feichter et al in J. Chem. Soc. Perkin Trans. (1991) 1: 653-654 offenbart stereospezifische Hydrolyse von racemischem Methylatrolactat via die Wirkung von inter alia α-Chymotrypsin, was zur Bildung der entsprechenden R-Säure und des S-Esters führt.
  • Peters et al. in Appl. Microbiol. Biotechnol. (1992) 38: 334-340 beschreibt die stereospezifische Reduzierung von Ketosäuren oder Estern unter Herstellen ihrer entsprechenden chiralen Hydroxysäuren oder Ester. Spezifischerweise zeigen diese Autoren stereospezifische Ketoesterreduktaseaktivität von Candida parapsilosis und Rhodococcus erythropolis, wobei ein racemischer, azyklischer β-Ketosäureester stereospezifisch in seinen entsprechenden chiralen Hydroxysäureester umgewandelt wird.
    • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung liefert ein Verfahren für die Anreicherung von Enantiomeren von α-tertiären Carbonsäuren oder Estern aus Mischungen ihrer entsprechenden Ester durch In Berührung Bringen der Mischungen von Estern mit einem Biokatalysator umfassend Vollzellen oder teilweise oder hoch gereinigte Enzympräparationen. Die enantiomeren Esterverbindungen eignen sich als Zwischenverbindungen für die Herstellung von pharmazeutischen und landwirtschaftlich aktiven Verbindungen. Beispielsweise offenbart WO 92/11249 Methyl-5- chlor 2,3-dihydro-2-hydroxy-1-oxo-1H-Indol-2 Carboxylat als eine Zwischenverbindung für die Herstellung von bestimmten Arthropodencarboxaniliden.
  • Die Erfindung liefert insbesondere ein Verfahren für die Herstellung eines enantiomerisch angereicherten Carbonsäureesters, wobei das Verfahren umfaßt in Berührung bringen einer Mischung von Enantiomeren eines Esters der Formel I
  • wobei
  • R¹ und R² unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe aus Phenyl und C&sub1;-C&sub6; Alkyl, wobei jede Gruppe gewünschtenfalls substituiert ist mit bis zu 3 Gliedern der Gruppe bestehend aus Halogen, C&sub1;-C&sub3; Alkoxy und Phenoxy; unter der Voraussetzung, daß R¹ und R² unterschiedlich voneinander sind; oder
  • R¹, R² und der Kohlenstoff, an den sie angefügt sind, zusammengenommen sind unter Bilden der Gruppe
  • wobei
  • X ausgewählt ist aus der Gruppe aus C=O, O, S und NH;
  • R³ ist ausgewählt aus der Gruppe aus OH und NH&sub2;;
  • R&sup4; ist C&sub1;-C&sub6; Alkyl; und
  • R&sup5; ist ausgewählt aus der Gruppe aus Halogen und C&sub1;-C&sub3; Fluoralkoxy, wobei der chirale Kohlenstoff durch ein Sternchen angegeben ist,
  • mit einem Biokatalysator ausgewählt aus der Gruppe aus IM60 Lipozym; Chirazym L-2 Lipase; Chirazym L-5 Lipase; Chirazym L-7 Lipase; SP 524 Lipase; SP 526 Lipase; SP 539 Protease; Lipolase Lipase; CR Lipase; Corynebacterium hoagii ATCC 7005; Flavobacterium sp. ATCC 27551; Pseudomonas oleovorans NRRL-B-3429; Pseudomonas putida ATCC 23973; Pseudomonas sp. NRRL-B-11330; Rhodococcus equi ATCC 14887; Rhodococcus erythropolis ATCC 4277; Rhodococcus coprophilus NRRL-B-16536; Rhodococcus rhodnii NRRL-B-16535; Rhodococcus rhodochrous ATCC 55602; Rhodococcus sp. NRRL-B-16531; Rhodococcus sp. NRRL-B-16534; Streptomyces griseus ATCC 6855; Xanthomonas campestris ATCC 21818; Candida guilliermondii ATCC 6260; Candida kefyr ATCC 4135; Candida tropicalis ATCC 46491; Rhodotorula rubra ATCC 4557; Yarowia lipolytica ATCC 9773; Aspergillus alliacrus ATCC 10060; Beauveria bassiana ATCC 26037; Beauveria bassiana ATCC 74292; Beauveria bassiana ATCC 26851; Beauveria bassiana ATCC 38657, Beauveria nivea ATCC 74294, Cunninghamella echinulata ATCC 8688, Lophotrichus martinii ATCC 11221, Paecilomyces marquandi ATCC 10525, Pestalotia microspora ATCC 11816, Rhizopus oryzae ATCC 10404, Rhizopus oryzae ATCC 22580, Sporobolomyces sp. ATCC 20290, Trichophyton concentricum ATCC 74293, Bacillus cereus NRRL-B-14591, Nocardia sp. NRRL-B- 5646, Pseudomonas putida ATCC 17453, Saccharomyces cerevisiae NRRL-Y-2034, Schizosacharomyces ostoporus NRRL-Y-854, Aspergillus alliaceus NRRL-315, Penicillium chrysogenum ATCC 10002, Penicillium notatum ATCC 36740, Amycolatopsis rugosa NRRL-B-2295, Rhodococcus equi ATCC 13556, Streptomyces endus NRRL-B-2339, Aspergillus candidus ATCC 20022 und Mycophyta microspora ATCC 89821.
  • Die Anmelder haben festgestellt, daß bestimmte der bevorzugten Biokatalysatoren der Erfindung geeignet für die Anreicherung von entweder dem (+) oder (-) Enantiomeren von zwei spezifisch bevorzugten Mischungen von Enantiomeren von Estern sind: Ethyl-α-hydroxy- α-methyl-4-phenoxybenzolacetat:
  • und Methyl-5-chlor-2,3-dihydro-2-hydroxy-1-oxo-1H-Indol-2-carboxylat
  • Postulierte Mechanismen der Erfindung für enantiospezifische Biotransformation umfassen enantiospezifische Hydrolyse eines Enantiomeren der Mischung von α-tertiären Estern unter Herstellen der entsprechenden Carbonsäure und im Falle von Mischungen von Enantiomeren von Ketosäureestern enantiospezifische Reduzierung der Ketogruppe, was zur Bildung von entsprechenden α-tert-Hydroxysäureestern führt.
    • EINZELHEITEN DER ERFINDUNG
  • Diese Erfindung betrifft ein Verfahren für die Herstellung von enantiomerisch angereicherten α-tertiären Carbonsäuren oder Estern von Ausgangssubstraten, bestehend aus einer Mischung von Enantiomeren ihrer entsprechenden Ester.
  • Die Ausgangsverbindungen sind Mischungen von Enantiomeren von Estern mit einem α-tert Kohlenstoff und sind durch die Formel I dargestellt:
  • wobei
  • R¹ und R² unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe aus Phenyl und C&sub1;-C&sub6; Alkyl, wobei jede Gruppe gewünschtenfalls substituiert ist mit bis zu 3 Gliedern der Gruppe bestehend aus Halogen, C&sub1;-C&sub3; Alkoxy und Phenoxy; unter der Voraussetzung, daß R¹ und R² unteschiedlich voneinander sind; oder
  • R¹, R² und der Kohlenstoff, an den sie gefügt sind, sind zusammengenommen unter Bilden der Gruppe
  • wobei
  • X ausgewählt ist aus der Gruppe aus C=O, O, S und NH;
  • R³ ist ausgewählt aus der Gruppe aus OH und NH&sub2;;
  • R&sup4; ist C&sub1;-C&sub6; Alkyl; und
  • R&sup5; ist ausgewählt aus der Gruppe aus Halogen und C&sub1;-C&sub3; Fluoralkoxy, wobei der chirale Kohlenstoff durch ein Sternchen angegeben ist.
  • Bevorzugte Substrate sind Verbindungen der Formel I, wobei:
  • R¹ Phenyl, gewünschtenfalls substituiert mit Phenoxy ist;
  • R² ist C&sub1;-C&sub3; Alkyl; oder
  • R¹, R² und der Kohlenstoff, an den sie angefügt sind, sind zusammengenommen unter Bilden der Gruppe
  • R³ ist OH;
  • R&sup4; ist C&sub1;-C&sub3; Alkyl; und
  • R&sup5; ist Halogen.
  • Spezifisch bevorzugte Substrate sind:
  • Ethyl-α-hydroxy-α-Methyl-4-phenoxybenzolacetat und Methyl-5-chlor-2,3-dihydro-2- hydroxy-1-oxo-1H-indol-2-carboxylat.
  • Substrate dieser Erfindung werden leicht mithilfe von Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt. Beispielsweise kann Ethyl-α-hydroxy-α-methyl-4-phenoxybenzolacetat, wie im nachfolgenden beschrieben, hergestellt werden. Ein 250 ml Kolben, ausgerüstet mit magnetischem Rühren. Wasserkondensator, 125 ml Tropftrichter. Thermometer und Stickstoffeinlaß wurde mit 2,7 g (110 Millimol) Magnesiummetall gefüllt und mit einem Hitzegewehr unter starker Stickstoffspülung getrocknet. Nach dem Kühlen wurde in den Trichter eine Lösung von 17,5 ml (24,9 g, 100 Millimol) 4-Bromdiphenylether in 67 ml trockenem THF gefüllt, und man ließ 10 ml in den Kolben laufen. Unter Rühren begann der Grignard spontan, und der Rest der Bromidlösung wurde über 15 Minuten hinzugefügt, wobei eine Innentemperatur von 67-68ºC aufrechterhalten wurde. Als die Zugabe vollständig war, wurde die Temperatur 5 Minuten lang auf 68ºC gehalten, begann dann zu fallen, erreichte 30ºC nach 45 Minuten. Inzwischen wurde ein 250 ml Kolben, magnetischer Rührer und 125 ml Tropftrichter, der im Ofen getrocknet worden war, heiß unter Stickstoff zusammengebaut und abkühlen gelassen. Ein Niedrig-Temperatur-Thermometer wurde dann hinzugegeben, der Kolben wurde mit einer Lösung von 11,5 ml (12,2 g, 105 Millimol) Ethylpyruvat in 66 ml trockenem THF beladen, und die Lösung aus Grignardreagenz wurde in den Tropftrichter mithilfe einer Spritze gegeben. Die Pyruvatlösung wurde auf -10ºC abgekühlt, und die Grignardlösung wurde 15 Minuten lang unter gutem Rühren, Kühlen unter Aufrechterhalten einer Innentemperatur von -5 bis -10ºC einlaufengelassen. Die sich ergebende Lösung wurde gerührt und mit 50 ml Wasser behandelt, gefolgt von 50 ml gesättigtem wäßrigem Ammoniumchlorid, was zwei klare Phasen ergab. Diese wurden getrennt, und die obere Phase wurde Rotationsverdampfen unter Entfernen des meisten von THF ausgesetzt. Zugabe von 50 ml Portionen von Wasser und Methylenchlorid ergaben zwei klare Phasen. Diese wurden getrennt, die wäßrige Phase wurde mit weiteren 25 ml Methylenchlorid gewaschen, und die kombinierten organischen Phasen wurden mit Wasser und Kochsalzlösung gewaschen, über Magnesiumsulfat getrocknet und verdampft, wobei 23,8 g gelb-oranges Öl zurückgelassen wurden. Kugelrohrdestillation bei 140ºC/0,1-0,2 mM für 60 Minuten entfernte flüchtige Verunreinigungen, wobei 17,1 g (60%) des Produktes als ein klares oranges Öl verblieben.
  • In ähnlicher Weise können 5-Chlor-2,3-dihydro-2-hydroxy-1-oxo-1H-indol-2-carboxylat mithilfe des nachfolgenden Protokolls hergestellt werden. Natriumhydrid (24 g 60% Lösung in Öl, 0,6 Mol) wurde mit Hexanen unter Entfernen des Öls gewaschen. Das sich ergebende gewaschene NaH wurde in 200 ml DMF suspendiert und dann mit einer Lösung von 50 g (0,3 Mol) 5-Chlor-1-Indanon und 150 ml DMF mit einer solchen Geschwindigkeit behandelt, daß die Reaktionstemperatur unterhalb von 35ºC blieb. Die sich ergebende Mischung wurde 30 Minuten lang gerührt und dann mit 38 ml (0,45 Mol) über 15 Minuten lang hinzugefügtem Dimethylcarbonat behandelt. Die sich ergebende Mischung wurde bei Raumtemperatur 1,5 h lang gerührt und dann über Nacht stehen gelassen. Die Reaktionsmischung wurde sorgfältig in eine Mischung aus 100 ml konzentrierter HCl und etwa 1000 ml Eis gegossen. Dann wurden 500 ml Ether hinzugegeben, und die wäßrige Schicht wurde zweimal mit Ether extrahiert. Die kombinierten organischen Schichten wurden mit drei Teilen H&sub2;O gewaschen, getrocknet (MgSO&sub4;) und konzentriert, wobei 64,6 g eines braunen Öls erhalten wurden. Eine Lösung von 5,0 g (0,022 Mol) des zuvor angegebenen Produktes und 70 ml Methylenchlorid wurde mit 10 g (ca. 0,032 Mol) 50-60% m-Chlorperbenzoesäure (Aldrich) bei Raumtemperatur behandelt. Nach einer Stunde wurde die Reaktion auf 0ºC gekühlt und durch sorgfältige Zugabe von gesättigtem wäßrigem Natriumcarbonat abgekühlt. Die Schicht wurde zweimal mit gesättigtem wäßrigem Natriumcarbonat gewaschen, einmal mit gesättigtem Natriumbisulfit, getrocknet (MgSO&sub4;) und unter Erhalten von 4,0 g eines gelben Feststoffes konzentriert.
  • In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung führt die biokatalytische Wirkung der offenbarten Enzyme und biologischen Materialien zur Umwandlung des unerwünschten Enantiomeren in Produkte, die leicht von dem nicht beeinträchtigten Enantiomeren abtrennbar sind. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Offenbarung ist die Wirksamkeit des gegenwärtigen präparativen Verfahrens durch mengenmäßiges Bestimmen (1) des Grades der Gewinnung und 2) der Enantiomerreinheit des (der) gewünschten Produktes (e) gemessen worden. Der Gewinnungsgrad sind diejenigen Prozente des Ausgangssubstrats, die unter Verfolgen der biokatalytischen Behandlung verbleiben. Enantiomerreinheit des gewünschten Produkts wird durch Berechnung des Überschusses des gewünschten Enantiomeren über das nicht erwünschte Enantiomer, das in dem gewonnenen Substrat im Anschluß an die biokatalytische Behandlung verbleibt, bestimmt. Dieser Enantiomerenüberschuss (% e. e.) wird berechnet aus der Konzentration der individuellen Enantiomeren unter Verwenden einer der folgenden Gleichungen:
  • % e. e. der (+) Form = ([(+)]-[(-)])/([(+)]+[(-)]) · 100
  • % e. e. der (-) Form = ([(-)]-[(+)])/([(-)]+[(+)]) · 100
  • wobei [(+)] und [(-)] die Konzentrationen der (+) bzw. (-) Formen sind. Obwohl es nicht ein wesentlicher Aspekt des vorliegenden Verfahrens ist, kann gewünschtenfalls das enantiomerisch angereicherte Esterprodukt (definiert als ≥50% e. e.) von der biokatalytischen Reaktionsmischung mithilfe irgendwelcher in dieser Technik bekannter Mittel abgetrennt werden.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Erfindung sind Mischungen von Enantiomeren, die als Substrate für die offenbarten Verfahren dienen, Mischungen von enantiomeren Estern, wobei die % e. e. geringer als 50 sind. Dieses umfaßt notwendigerweise racemische Mischungen, wobei beide Enantiomere in gleichen Anteilen vorhanden sind, wie optisch aktive Mischungen, wo ein Enantiomer im Überschuß über sein komplementäres Enantiomer vorhanden ist, aber wobei der enantiomere Überschuß geringer als 50% ist. In jedem Fall führt das Verfahren der vorliegenden Erfindung zur Herstellung eines enantiomerisch angereicherten Carbonsäureesters, wobei das gewünschte Enantiomer zu 0% e. e. von mindestens 50 erhalten worden ist.
  • Für die Zwecke der vorliegenden Offenbarung beabsichtigen die Anmelder, daß die folgenden Ausdrücke die im nachfolgenden dargelegte Bedeutung mitteilen.
  • Der Ausdruck "enantiomerisch angereichert" bedeutet, daß das gewünschte Enantiomer zu einem % e.e, von mindestens 50 erhalten worden ist.
  • Der Ausdruck "Biokatalysator" umfaßt enzymatische Aktivität, die von Vollbakterien. Hefe- oder Pilzzellen oder Zellextrakten oder Produkten geliefert wird; oder enzymatische Aktivität in gereinigter oder teil weise gereinigter Form aus Bakterien-, Hefe- Pilz- oder Säugerzellen, welches enzymatisch das Reaktionsverfahren der vorliegenden Erfindung katalysiert.
  • Jene Biokatalysatoren, welche einen enantiomeren Überschuß größer als 50% ergeben (stellen mehr als einen 3-fachen Überschuß des gewünschten Enantiomeren über die verbleibenden anderen enantiomeren Spezies dar), sind bevorzugt. Bevorzugter ist Anreicherung über etwa 90%., noch bevorzugter über etwa 95%, und am bevorzugtesten über etwa 99%.
  • Im Laufe der Experimentierung beurteilten die Erfinder mehr als vierhundert potentielle Quellen von Biokatalysatoren. Überraschenderweise besaßen die hier offenbarten die von den Erfindern gesuchte Aktivität. Deshalb ist diese Erfindung besonders gekennzeichnet durch die Biokatalysatoren (Mikroorganismen oder Mutanten davon oder Enzyme), die sich dazu eignen, die enantiospezifische Reaktion (en) durchzuführen. Bevorzugte Biokatalysatoren umfassen diejenigen, die von den folgenden Mikroorganismen abstammen: Corynebakterium hoagii ATCC 7005; Flavobakterium sp. ATCC 27551; Pseudomonas oleovorans NRRL-B-3429; Pseudomonas putida ATCC 23973; Pseudomonas sp. NRRL-B-11330; Rhodococcus equi ATCC 14887; Rhodococcus erythropolis ATCC 4277; Rhodococcus coprophilus NRRL-B-16536; Rhodococcus rhodnii NRRL-B-16535; Rhodococcus rhodochrous ATCC 55602; Rhodococcus sp. NRRL-B-16531; Rhodococcus sp. NRRL-B-16534; Streptomyces griseus ATCC 6855; Xanthomonas campestris ATCC 21818; Candida guilliermondii ATCC 6260; Candida kefyr ATCC 4135; Candida tropicalis ATCC 46491; Rhodotorula rubra ATCC 4557; Yarowia lipolytica ATCC 9773; Aspergillus alliacrus ATCC 10060; Beauveria bassiana ATCC 26037; Beauveria bassiana ATCC 74292; Beauveria bassiana ATCC 26851; Beauveria bassiana ATCC 38657; Beauveria nivea ATCC 74294; Cunnninghamella echinulata ATCC 8688; Lophotrichus martinii ATCC 11221; Paecilomyces marquandi ATCC 10525; Pestalotia microspora ATCC 11816; Rhizopus oryzae ATCC 10404; Rhizopus oryzae ATCC 22580; Sporobolomyces sp. ATCC 20290; Trichophyton concentricum ATCC 74293; Bacillus cereus NRRL-B-14591; Nocardia sp. NRRL-B-5646; Pseudomonas putida ATCC 17453; Saccharomyces cerevisiae NRRL-Y-2034; Schizosaccharomyces ostoporus NRRL-Y-854; Aspergillus alliaceus NRRL-315; Penicillium chrysogenum ATCC 10002; Penicillium notatum ATCC 36740; Amycolatopsis rugosa NRRL-B-2295; Rhodococcus equi ATCC 13556; Streptomyces endus NRRL-B-2339; Aspergillus candidus ATCC 20022; und Mycophyta microspora ATCC 89821. Das biologische Material, das die enantiospezifischen Enzyme umfaßt, die geeignet sind, das Verfahren der Erfindung durchzuführen, kann isoliert oder biosynthetisiert und als solches verwendet werden, aber es ist üblicherweise geeigneter, den (die) entsprechenden Mikroorganismus (en) direkt zu verwenden.
  • Auch bevorzugt sind gereinigte Präparationen von hydrolytischen Enzymen aus den folgenden Quellen: α-Chymotrypsin (aus Rinderpankreas; Sigma Chemical Co.), β-Chymotrypsin (aus Rinderpankreas; Sigma Chemical Co.), y-Chymotrypsin (aus Rinderpankreas; Sigma Chemical Co.), δ-Chymotrypsin (aus Rinderpankreas; Sigma Chemical Co.), IM 60 Lipozym (Novo Nordisk), Chirazym L-2 Lipase (Boehringer Mannheim), Chirazym L-5 Lipase (Boehringer Mannheim), Chirazym L-7 Lipase (Boehringer Mannheim), SP 524 Lipase (Novo Nordisk), SP 526 Lipase (Novo Nordisk). SP 539 Protease (Novo Nordisk), Lipolase Lipase (Novo Nordisk) und CR Lipase (Altus Biologics. Inc.).
  • Am bevorzugtesten sind Biokatalysatoren, die diejenigen umfassen, die in den folgenden Mikroorganismen gefunden werden: Rhodococcus rhodochrous ATCC 55602, Trichophyton concentricum ATCC 74293. Beauveria bassiana ATCC 74292 und Beauveria nivea ATCC 74294.
  • Bei diesem Verfahren zum Anreichern von Mischungen von Enantiomeren von α-tertiären Carbonsäureestern für entweder das (+) oder (-) Enantiomer wird Biokatalyse durch die Wirkung von einem oder mehreren enantiospezifischen Enzymen durchgeführt, die passenderweise erhalten worden sind durch Kultivieren des Mikroorganismus in einem Medium. welches geeignet für die Herstellung des enantiospezifischen Enzyms ist. Das auf diese Weise erhaltene Enzym wird hinzugegeben, um selektiv auf entweder den (+) oder (-) α-tertiären Carbonsäureester der Mischung zu wirken, welches zur Anreicherung des verbleibenden (+) oder (-) Carbonsäureesters führt. Das gewünschte Produkt (der angereicherte Carbonsäureester) kann dann von den unerwünschten Produkten (die (+) oder (-) Carbonsäure oder (+) oder (-) Hydroxysäureester) mithilfe von dem Fachmann bekannten Verfahren zum Trennen von Carbonsäureestern von Säuren, Ketosäureestern von Hydroxysäureestern und zum Trennen individueller Enantiomere abgetrennt werden. Die Anmelder erkennen offensichtlich, daß das Verfahren der Erfindung auch gleichermaßen gut beschrieben werden könnte als ein Verfahren für enantiomere Anreicherung von (+) oder (-) α-tertiären Carbonsäuren oder (+) oder (-) Hydroxysäureestern via die selektive Biokatalyse der entsprechenden Mischung von Enantiomeren von α-tertiärem Carbonsäureester.
  • Die Biokatalysatoren der gegenwärtigen Erfindung umfassen biologische Materialien, abstammend von oder angeordnet in Bakterien-, Hefe-, Pilz- und Säugerzellen. Mehrere dieser Biokatalysatoren sind unter den Bedingungen des Budapester Vertrages bei ATCC (American Type Culture Collection. 12301 Parklawn Drive, Rockville, MD 20852) hinterlegt worden und tragen die folgenden Hinterlegungsnummern:
  • Biokatalysator Hinterlegungsnummer
  • Rhodococcus rhodochrous ATCC 55602
  • Trichophyton concentricum ATCC 74293
  • Beauveria bassiana ATCC 74292
  • Beauveria nivea ATCC 74294
  • Die folgenden Abkürzungen werden hier verwendet:
  • MCIC Methyl 5-chlor-2,3-dihydro-2-hydroxy-1-oxo-1H-indol-2-carboxylat
  • EHPA Ethyl-α-hydroxy-α-methyl-4-phenoxybenzolacetat
  • HPLC Hochleistungsflüssigkeitschromatographie
  • DMF Dimethylformamid
  • ACN Acetonitril
  • e. e. Enantiomerenüberschuß
  • SM Sabouraud-Maltose-Brühe
  • SBG Sojabohnenglycerol
  • NB Nährstoffbrühe
  • PD Kartoffeldextrosebrühe
  • Zur Bestimmung von biokatalytischer Aktivität wurden 25 ml eines geeigneten Wachstumsmediums mit einem geringen Anteil von einem gefrorenem oder lyophylisiertem Stamm von Testorganismus unter Verwenden von mikrobiologischen Standardtechniken angeimpft. Medien, die für Wachstum der Organismen verwendet werden, die in der gegenwärtigen Patentschrift offenbart sind, wurden aus den folgenden gewählt:
  • SM (Sabouraud Maltose Brühe; BBL Inc., Cockeysville MD);
  • PD (Kartoffeldextrosebrühe; Difco Laboratories, Inc.. Detroit. MI);
  • NB (Nährmittelbrühe; Difco Laboratories. Inc., Detroit, MI);
  • SBG (Sojabohnenglycerol)(pH 7,0) g/l
  • Glycerol 20,0
  • Hefeextrakt 5,0
  • Sojabohnenmehl 5,0
  • Natriumchlorid 5,0
  • Kaliumphosphat (zweibasig) 5,0
  • Für jeden offenbarten Mikroorganismus verwendetes Wachstumsmedium ist in Tabellen 1-6 angegeben. Angeimpfte Kulturen wurden 72 h bei 28-30ºC unter konstantem Schütteln (250 UPM; Stufe I Wachstum) gezüchtet. Zehn bis zwanzig Prozent dieser Starterkultur wurde in frisches Medium übertragen (25 ml), und Inkubation zusätzliche 24 h fortgeführt (Stufe II Wachstum). Zellen wurden geerntet und in einem geeigneten Puffer (pH 4,5-8,5) resuspendiert, wobei die Endkonzentration des Biokatalysators etwa 10-250 mg Katalysator (Trockengewicht) pro ml Puffer war, und die Endkonzentration des Substrats war etwa 2-200 mM. Inkubation zum Erzielen von Biotransformation wurde 4-72 h bei 25-50ºC unter konstantem Schütteln (250 UPM) fortgesetzt. Die Reaktionen wurden dann angesäuert und mit Methylenchlorid extrahiert. Im Anschluß an die CH&sub2;Cl&sub2; Verdampfung wurden die Rückstände in ACN resuspendiert. Die Prozentgewinnung von Substrat in der ACN Lösung wurde mittels Umkehrphasen HPLC bestimmt, und die Enantiomer-Reinheit wurde mittels Chiral-HPLC bestimmt.
    • ANALYTISCHE VERFAHREN
  • Tertiäre α-substituierte Carbonsäureester und Hydrolyseproduke wurden mittels Umkehrphasen HPLC gemessen. Nachweis war mittels ultravioletter Lichtabsorption. Für MCIC wurde eine Zorbax® RX-C&sub8; Säule (4,6 · 250 mM) unter Verwenden einer mobilen Phase von 40% Acetonitril und 60% H&sub2;O +0,1% Triethylamin (eingestellt auf pH 6,5) verwendet. Für EHPA wurde eine Zorbax® C&sub1;&sub8; Säule (4,6 · 250 mM) unter Verwenden einer mobilen Phase von 50% Acetonitril und 50% H&sub2;O, angesäuert mit 0,1% H&sub3;PO&sub4;, verwendet. Chromatographieidentität und mengenmäßige Bestimmung von Estern wurde durch Vergleich mit authentischen Standards bestimmt.
  • Chiral-HPLC für die Trennung von Enantiomeren wird mit einer von Chromatech (Schweden) erhaltenen α-Säuren-Glycoprotein-Säule durchgeführt. Die mobilen Phasen für die Trennung der Esterenantiomeren sind im nachfolgenden zusammengefaßt.
  • Enantiomere Mobile Phasen
  • MCIC 98% 0,01 M Phosphatpuffer (pH 4,8): 2% Ethanol
  • EHPA 91% H&sub2;O + O,1% Triethylamin (pH 6,0): 9% Acetonitril
  • Chiral-HPLC für die Trennung von EHPA Enantiomeren in Beispiel 10 wurde mit einer Bakerbond® Chiral-OD-Säule, erhalten von J. T. Baker, durchgeführt. Die mobile Phase für die Trennung von EHPA Enantiomeren betrug 90% Hexan: 10% Propanol.
  • Enantiomerenzusammensetzung, Reinheit und Chromatographieidentität der zuvor angegebenen Ester wurde durch Vergleich mit authentischen Standards von Enantiomeren oder racemischen Mischungen bestimmt.
    • BEISPIEL 1
  • Für die in Tabelle I aufgelisteten mikrobiellen Stämme wurden Zellen aus Stufe 1I Wachstum durch Zentrifugation geerntet und in 5 ml 50 mM Phosphatpuffer. pH 6,0 (50-100 mg Naßgewichtzellen/ml Puffer) resuspendiert. Dann wurden 10 uMol racemisches MCIC in 50 ul DMF hinzugegeben. Nach 24 h Inkubation bei 30ºC wurden die Reaktionen beendet (2 mM Biotransformationen) und weitere 10 uMol racemisches MCIC in 50 ul DMF wurden hinzugegeben, und die Inkubation weitere 24 h (4 mM Biotransformation) fortgesetzt. Sowohl 2 mM wie 4 mM MCIC Biotransformationen wurden durch Ansäuern auf einen pH 3 mit 3 M H&sub2;SO&sub4; beendet. Zwei Volumenteile von Methylenchlorid wurden zu jeder Probe hinzugegeben und die Suspensionen wurden 15 Minuten lang gerührt. Die Methylenchloridschichten wurden entfernt und zur Trockne unter einem Stickstoffstrom eingedampft, und die Rückstände wurden in 10 ml Acetonitril resuspendiert. Der Prozente sowohl von gewonnenem MCIC wie (+)-MCIC e. e. wurden mittels Umkehrphasen-HPLC und Chiral-HPLC bestimmt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt.
    • BEISPIEL 2
  • Eine 10 mg Probe von jedem Chymotrypsinenzym (Tabelle 1) wurde zu 2 ml 50 mM Phosphatpuffer pH 6,0 hinzugefügt. Dann wurden 4 uMol racemisches MCIC in 20 ul DMF hinzugefügt. In ähnlicher Weise wurde ein 20 mg Probe von Chirazym L-7 Lipase zu 50 mM Phosphatpuffer pH 6,0 und 40 uMol racemisches MCIC in 20 ul DMF hinzugegeben. Nach 24 h Inkubation bei 30ºC (Chymotrypsine) oder 25ºC (L-7) und im Anschluß an die gleichen Extraktions- und analytischen Verfahren wie in Beispiel 1 wurden die Prozente gewonnenes MCIC und (+)-MCIC e. e. bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 1 dargestellt. TABELLE 1 Enantiomeranreicherung von (+)-Methyl-5-chlor-2,3-dihydro-2-hydroxy-1-oxo-1H-indol-2- carboxylat
  • aNA Nicht Anwendbar
    • BEISPIEL 3
  • Für die in Tabelle 2 aufgeführten mikrobiellen Stämme wurden Zellen aus Stufe II Wachstum mittels Zentrifugation geerntet und in 5 ml 50 mM Phosphatpuffer ph 6,0 (50-100 mg Naßgewicht Zellen/ml Puffer) resuspendiert. Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 1 wurden 10 uMol racemisches MCIC hinzugegeben. Im Anschluß an die gleiche Inkubation (4 mM Biotransformation), Extraktion und analytische Verfahren wie in Beispiel 1 wurden die Prozente gewonnenes MCIC und (-)-MCIC e. e. bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 dargestellt.
    • BEISPIEL 4
  • Fünf mg Chirazym L-2 Lipase, 10 mg SP 524 Lipase, SP 526 Lipase, SP 539 Protease oder 20 mg Chirazym L-5 Lipase (Tabelle 2) wurden zu 2 ml 50 mM Phosphatpuffer pH 6,0 hinzugefügt. Dann wurden 40 uMol racemischs MCIC (20 uMol für SP526) in 20 ul DMF hinzugegeben. Nach 24 Stunden Inkubation bei 25ºC und im Anschluß an die gleichen Extraktions- und analytischen Verfahren wie in Beispiel 1 wurden die Prozente gewonnenes MCIC und (-)-MCIC e. e. bestimmte. Die Ergebnisse sind in Tabelle 2 gezeigt. TABELLE 2 Enantiomeranreicherung von (-)-Methyl-5-chlor-2,3-dihydro-2-hydroxy-1-oxo-1H-indol-2- carboxylat
  • aND nicht bestimmt
  • bNA nicht anwendbar
    • BEISPIEL 5
  • Für die in Tabelle 3 aufgelisteten mikrobiellen Stämme wurden 42 uMol racemisches MCIC in 100 ul DMF zu jeder 24 h Stufe II Kultur (25 ml SBG Medium) hinzugegeben. Im Anschluß an die MCIC Zugabe werden 4 ml Aliquote aus den Brühen nach 8 h oder 29 h Inkubation bei 27ºC entfernt. Ein ml Ethylacetat wurde zu jeder Probe hinzugegeben, und die Suspensionen wurden 10 Sekunden lang gerührt. Zwei Zehntel ml der Ethylacetatschicht wurden aus jeder Probe entfernt, zur Trockne unter einem Stickstoffstrom eingedampft, und die Rückstände wurden in 3 ml Acetonitril resuspendiert. Die Prozente gewonnenes MCIC und (-)-MCIC e. e. wurden mittels Umkehrphasen-HPLC und Chiral- HPLC bestimmt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 3 dargestellt. TABELLE 3 Enantiomeranreicherung von (-)-Methyl-5-chlor-2,3-dihydro-2-hydroxy-1-oxo-1H-indol-2- carboxylat
    • BEISPIEL 6
  • Für die in Tabelle 4 untersuchten mikrobiellen Stämme wurden die Zellen aus Stufe II Wachstum mittels Zentrifugation geerntet und in 5 ml 50 mM Phosphatpuffer pH 6,0 (50- 100 mg Naßgewicht Zellen/ml Puffer) resuspendiert. Dann wurden 10 uMol racemisches EHPA in 50 ul DMF hinzugegeben. Nach 24 Stunden Inkubation bei 30ºC wurden die Reaktionen beendet (2 mM Biotransformation) oder weitere 10 uMol racemisches EHPA in 50 ul DMF wurden hinzugegeben, und die Inkubation wurde weitere 24 h (4 mM Biotransformation) fortgesetzt. Sowohl 2 mM wie 4 mM EHPA Biotransformationen wurden durch Ansäuerung auf pH 3 mit 3 M H&sub2;SO&sub4; beendet. Zwei Volumenteile Methylenchlorid wurden zu jeder Probe hinzugegeben, und die Suspensionen wurden 15 Minuten lang gerührt. Die Methylenchloridschichten wurden entfernt und zur Trockne unter einem Stickstoffstrom eingedampft, und die Rückstände wurden in 10 ml Acetonitril resuspendiert. Sowohl Prozent gewonnenes EHPA wie (+)-EHPA e. e. wurden mittels Umkehrphasen-HPLC und Chiral-HPLC bestimmt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt.
    • BEISPIEL 7
  • Eine 20 mg Probe IM60 Lipozym, SP 524 Lipase, SP 526 Lipase oder 1 ml Lipolase- Lipase wurde zu 2 ml 50 mM Phosphatpuffer pH 6,0 (1 ml für Lipolase) hinzugefügt. Dann wurden 20 uMol racemisches EHPA in 20 ul DMF hinzugegeben. Nach 48 h Inkubation bei 30ºC (IM60 Lipozym) oder 24 h bei 25ºC (SP 525. SP 526. Lipolase) wurden die Reaktionen durch Ansäuerung auf pH 3 mit 3 M H&sub2;SO&sub4; beendet. Im Anschluß an die gleichen Extraktions- und analytischen Verfahren wie in Beispiel 6 wurden die Prozente EHPA und (+)-EHPA e. e. bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 4 gezeigt. TABELLE 4 Enantiomeranreicherung von (+)-Ethyl-α-hydroxy-α-methyl-4-phenoxybenzolacetat
  • aNA Nicht anwendbar
    • BEISPIEL 8
  • Für die zwei in Tabelle 5 aufgelisteten mikrobiellen Stämme wurden Zellen aus Stufe II Wachstum mittels Zentrifugation geerntet und in 5 ml 50 mM Phosphatpuffer pH 6,0 (50- 100 mg Naßgewicht Zellen/ml Puffer) resuspendiert. Auf die gleiche Weise wie in Beispiel 5 wurden 10 uMol racemisches EHPA hinzugegeben. Im Anschluß an die gleiche Inkubation (2 mM Biotransformation), Extraktion und analytische Verfahren wie in Beispiel 5 wurden Prozent gewonnenes EHPA und (-)-EHPA e. e. bestimmt. Die Ergebnisse sind in Tabelle 5 dargestellt. TABELLE 5 Enantiomeranreicherung von (-)-Ethyl-α-hydroxy-α-methyl-4-phenoxybenzolacetat
    • BEISPIEL 9
  • Für die in Tabelle 6 aufgelisteten mikrobiellen Stämme wurden aus Stufe II Wachstum durch Zentrifugation geerntete und bei -80ºC gefroren gelagerte Zellen aufgetaut und in 2 ml 50 mM Phosphatpuffer pH 6,0 (150-300 mg Naßgewicht Zellen/ml Puffer) resuspendiert.
  • Die Zellsuspensionen wurden zu den Reaktionsphiolen hinzugegeben, welche 100 uMol 50% e. e., (+)-MCIC enthielten. Nach 24 h Inkubation bei 30ºC wurden die Reaktionen durch Ansäuerung auf pH 3 mit 3 M H&sub2;SO&sub4; beendet. Fünf Volumenteile Methylenchlorid wurden zu jeder Probe hinzugegeben, und die Suspensionen wurden 15 Minuten lang gerührt. Eine Hälfte jeder Methylenchloridschicht wurde entfernt und bis zur Trockne unter einem Stickstoffstrom verdampft, und die Rückstände wurden in 10 ml Acetonitril resuspendiert. Die Prozente von sowohl gewonnenem MCIC wie (+)-MCIC e. e. wurden mittels Umkehrphasen-HPLC und Chiral-HPLC bestimmt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 6 dargestellt. TABELLE 6 Enantiomeranreicherung von 50% e. e. (+)-Methyl-5-chlor-2,3-dihydro-2-hydroxy-1-oxo-1H- indol-2-carboxylat
    • BEISPIEL 10
  • Zehn mg CR Lipase (Altus Biologics Inc.. Cambridge. MA) wurden zu 2 ml 50 mM Phosphatpuffer pH 6,0 hinzugefügt. Dann wurden 10 uMol racemisches EHPA in 20 pHol DMF hinzugegeben. Nach 24 h Inkubation bei 30ºC wurden Reaktionen durch Ansäuerung auf pH 3 mit 3 M H&sub2;SO&sub4; beendet. Fünf Volumenteile Methylenchlorid wurden zu jeder Probe hinzugefügt, und die Suspensionen wurden 15 Minuten lang gerührt. Eine Hälfte jeder Methylenchloridschicht wurde entfernt und bis zur Trockne unter einem Stickstoffstrom eingedampft, und die Rückstände wurden in 10 ml Acetonitril resuspendiert. Die Prozente sowohl von gewonnenem EHPA wie (+)-EHPA wurden mittels Umkehrphasen-HPLC und Chiral-HPLC bestimmt, und die Ergebnisse sind in Tabelle 7 dargestellt. TABELLE 7 Enantiomeranreicherung von (+)-Ethyl-α-hydroxy-α-methyl-4-phenoxybenzolacetat

Claims (11)

1. Verfahren für die Herstellung eines enantiomerisch angereicherten Carbonsäureesters, welches umfaßt in Berührung bringen einer Mischung von Enantiomeren eines Esters der Formel I
wobei R¹ und R² unabhängig ausgewählt sind aus der Gruppe aus Phenyl und C&sub1;-C&sub6; Alkyl, wobei jede Gruppe gewünschtenfalls mit bis zu 3 Gliedern der Gruppe aus Halogen, C&sub1;-C&sub3; Alkoxy und Phenoxy substituiert ist; unter der Voraussetzung, daß R¹ und R² verschieden voneinander sind, oder
wobei R¹, R² und der Kohlenstoff, an den sie angefügt sind, unter Bilden der Gruppe
zusammengenommen sind, wobei
X aus der Gruppe aus C=O, O, S und NH ausgewählt ist;
R³ aus der Gruppe aus OH und NH&sub2; ausgewählt ist;
R&sup4; C&sub1;-C&sub6; Alkyl ist; und
R&sup5; aus der Gruppe aus Halogen und C&sub1;-C&sub3; Fluoralkoxy ausgewählt ist, wobei der chirale Kohlenstoff durch ein Sternchen gekennzeichnet ist:
mit einem Biokatalysator, ausgewählt aus der Gruppe aus IM60 Lipozyme; Chirazyme L-2 Lipase; Chirazyme L-5 Lipase; Chirazyme L-7 Lipase; SP 524 Lipase; SP 526 Lipase; SP 539 Protease; Lipolase Lipase; CR Lipase; Corynebacterium hoagii ATCC 7005; Flavobacterium sp. ATCC 27551; Pseudomonas oleovorans NRRL-B-3429; Pseudomonas putida ATCC 23973; Pseudomonas sp. NRRL-B-11330; Rhodococcus equi ATCC 14887; Rhodococcus erythropolis ATCC 4277; Rhodococcus coprophilus NRRL-B-16536; Rhodococcus rhodnii NRRL-B-16535; Rhodococcus rhodochrous ATCC 55602; Rhodococcus sp. NRRL-B-16531; Rhodococcus sp. NRRL-B-16534; Streptomyces griseus ATCC 6855; Xanthomonas campestris ATCC 21818; Candida guilliermondii ATCC 6260; Candida kefyr ATCC 4135; Candida tropicalis ATCC 46491; Rhodotorula rubra ATCC 4557; Yarowia lipolytica ATCC 9773; Aspergillus alliacrus ATCC 10060; Beauveria bassiana ATCC 26037; Beauveria bassiana ATCC 74292; Beauveria bassiana ATCC 26851; Beauveria bassiana ATCC 38657; Beauveria nivea ATCC 74294; Cunninghamella echinulata ATCC 8688; Lophotrichus martinii ATCC 11221; Paecilomyces marquandi ATCC 10525; Pestalotia microspora ATCC 11816; Rhizopus oryzae ATCC 10404; Rhizopus oryzae ATCC 22580; Sporobolomyces sp. ATCC 20290; Trichophyton concentricum ATCC 74293; Bacillus cereus NRRL-B-14591; Nocardia sp. NRRL-B-5646; Pseudomonas putida ATCC 17453; Saccharomyces cerevisiae NRRL-Y-2034; Schizosaccharomyces ostoporus NRRL-Y-854; Aspergillus alliaceus NRRL-315; Penicillium chrysogenum ATCC 10002; Penicillium notatum ATCC 36740; Amycolatopsis rugosa NRRL-B-2295; Rhodococcus equi ATCC 13556; Streptomyces endus NRRL-B-2339; Aspergillus candidus ATCC 20022; und Mycophyta microspora ATCC 89821.
2. Verfahren nach Anspruch 1, wobei in Formel I
R¹ Phenyl, gewünschtenfalls substituiert mit Phenoxy, ist:
R² C&sub1;-C&sub3; Alkyl ist; oder
R¹, R² und der Kohlenstoff, an den sie angefügt sind, unter Bilden der Gruppe
zusammengenommen sind, wobei
X C(=O) ist;
R³ OH ist;
R&sup4; C&sub1;-C&sub3; Alkyl ist; und
R&sup5; Halogen ist.
3. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Mischung von enantiomeren Estern der Formel I Methyl-5-chlor-2,3-dihydro-2-hydroxy-1-oxo-1H-finden-2-carboxylat ist, wobei der enantiomerisch angereicherte Carbonsäureester das (+) Enantiomer ist, und wobei der Biokatalysator ausgewählt ist aus Corynebacterium hoagii ATCC 7005, Flavobacterium sp. ATCC 27551, Pseudomonas oleovorans NRRL-B-3429, Pseudomonas putida ATCC 23973, Pseudomonas sp. NRRL-B-11330, Rhodococcus equi ATCC 14887, Rhodococcus erythropolis ATCC 4277, Rhodococcus coprophilus NRRL-B-16536, Rhodococcus rhodnii NRRL-B-16535, Rhodococcus rhodochrous ATCC 55602, Rhodococcus sp. NRRL-B-16531, Rhodococcus sp. NRRL-B-16534, Streptomyces griseus ATCC 6855, Xanthomonas campestris ATCC 21818, Rhodotorula rubra ATCC 4557, Beauveria bassiana ATCC 26037, Beauveria bassiana ATCC 74292, Beauveria bassiana ATCC 26851, Cunninghamella echinulata ATCC 8688, Paecilomyces marquandi ATCC 10525, Pestalotia microspora ATCC 11816, Rhizopus oryzae ATCC 10404, Rhizopus oryzae ATCC 22580, Trichophyton concentricum ATCC 74293 und Chirazyme L-7 Lipase.
4. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Mischung aus enantiomeren Estern der Formel I Methyl-5-chlor-2,3-dihydro-2-hydroxy-1-oxo-1H-finden-2-carboxylat ist, und der enantiomerisch angereicherte Carbonsäureester das (-) Enantiomer ist, und wobei der Biokatalysator ausgewählt ist aus Candida guilliermondii ATCC 6260, Candida kefyr ATCC 4135, Candida tropicalis ATCC 46491, Yarrowia lipolytica ATCC 9773, Aspergillus alliacrus ATCC 10060, Beauveria nivea ATCC 74294, Lophotrichus martinii ATCC 11221, Sporobolomyces sp. ATCC 20290, Bacillus cereus NRRL-8-14591, Nocardia sp. NRRL-B-5646, Pseudomonas putida ATCC 17453, Saccharomyces cerevisiae NRRL-Y-2034, Schizosaccharomyces ostoporus NRRL-Y- 854, Aspergillus alliaceus NRRL-315, Penicillium chrysogenum ATCC 10002, Penicillium notatum ATCC 36740, SP 524 Lipase, SP 526 Lipase, SP 539 Protease, Chirazyme L-2 Lipase und Chirazyme L-5 Lipase.
5. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Mischung aus enantiomeren Estern der Formel I Ethyl-α-hydroxy-α-methyl-4-phenoxybenzolacetat ist, wobei der enantiomerisch angereicherte Carbonsäureester das (+) Enantiomer ist, und wobei der Biokatalysator ausgewählt ist aus Pseudomonas sp. NRRL-B-11330, Rhodococcus equi ATCC 13556, Candida tropicalis ATCC 46491, Aspergillus candidus ATCC 20022. Beauveria bassiana ATCC 26851, Beauveria bassiana ATCC 38657, Mycophyta microspora ATCC 89821, Tricophyton concentricum ATCC 74293, IM60 Lipozyme, SP 524 Lipase, SP 526 Lipase, Lipolase lipase und CR Lipase.
6. Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Mischung aus enantiomeren Estern der Formel I Ethyl-α-hydroxy-α-methyl-4-phenoxybenzolacetat ist, wobei der enantiomerisch angereicherte Carbonsäureester das (-) Enantiomer ist, und wobei der Biokatalysator ausgewählt ist aus Amycolatopsis rugosa NRRL-B-2295 und Streptomyces endus NRRL-B-2339.
7. Verfahren nach Anspruch 1, welches ferner die zusätzliche Stufe des Trennens des enantiomerisch angereicherten Carbonsäureestersvon der biokatalytischen Reaktionsmischung umfaßt.
8. Verfahren nach Anspruch 7, wobei die Trennung durch Extraktion oder Phasentrennung durchgeführt wird.
9. Verfahren für die Herstellung eines enantiomerisch angereicherten Carbonsäureesters, welches umfaßt in Berührung bringen einer Mischung von enantiomeren Estern von Methyl-5-chlor-2,3-dihydro-2-hydroxy-1-oxo-1H-finden-2-carboxylat mit einem Biokatalysator, wobei der enantiomerisch angereicherte Carbonsäureester das (+) Enantiomer ist, und wobei der Biokatalysator ausgewählt ist aus α-Chymotrypsin, β-Chymotrypsin, γ-Chymotrypsin und δ-Chymotrypsin.
10. Verfahren nach Anspruch 9, welches ferner die zusätzliche Stufe des Trennens des enantiomerisch angereicherten Carbonsäureesters von der biokatalytischen Reaktionsmischung umfaßt.
11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Trennung durch Extraktion oder Phasentrennung durchgeführt wird.
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Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
FR2732679B1 (fr) * 1995-04-07 1997-04-30 Synthelabo Procede de preparation enzymatique d'un intermediaire de synthese de la befloxatone
CN1267429C (zh) * 2000-07-13 2006-08-02 三共株式会社 氨基醇衍生物
EP1684803B1 (de) * 2003-11-14 2010-07-07 UCL Business PLC Immunmodulator mit ganzzell-tsukamurella bakterien
CN1948499B (zh) * 2006-05-26 2010-12-08 江南大学 生物催化制备(r)-4,4,4-三氟-3-羟基丁酸乙酯的方法
CN102719496B (zh) * 2012-06-21 2014-08-06 浙江工业大学 一种微生物转化苯甲酰甲酸乙酯制备(s)-(+)-扁桃酸乙酯的方法
CN103290072B (zh) * 2013-02-28 2014-10-22 南京工业大学 一种酶法不对称还原制备(s)-4-氯-3羟基丁酸乙酯的方法
CN104313064A (zh) * 2014-10-01 2015-01-28 青岛科技大学 一种细胞法生产手性溴苯基丙酸甲酯的方法
CN105838772A (zh) * 2016-05-27 2016-08-10 苏州汉酶生物技术有限公司 (s)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1h-茚-2-羧酸甲酯的生物制备方法
CN105969815B (zh) * 2016-06-07 2021-02-26 苏州汉酶生物技术有限公司 一种(s)-5-氯-2,3-二氢-2-羟基-1-氧代-1h-茚-2-羧酸甲酯的生物制备方法
CN110527646B (zh) * 2019-08-20 2021-05-11 浙江工业大学 热带芽孢杆菌wzz018及其应用
CN112345663B (zh) * 2020-10-22 2022-10-21 京博农化科技有限公司 一种5-氯-2-甲氧羰基-1-茚酮酯含量的分析方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0197474B1 (de) * 1985-04-01 1991-07-10 Kanegafuchi Kagaku Kogyo Kabushiki Kaisha Verfahren zur Herstellung von optisch aktiver Indolin-2-carbonsäure
US4668628A (en) * 1985-04-01 1987-05-26 Stauffer Chemical Company Resolution of racemic mixtures of aliphatic acid esters
IL91453A0 (en) * 1988-09-02 1990-04-29 Tanabe Seiyaku Co Preparation of optically active 3-phenyl-glycidic acid esters
CA2068038A1 (en) * 1991-05-08 1992-11-09 Christopher Yee Enzymatic resolution of .alpha.-tertiary carboxylic acid esters
US5202260A (en) * 1991-05-08 1993-04-13 Genzyme Corporation Resolution of α-tertiary carboxylic acid esters using lipase from Candida lipolytica

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JP3794702B2 (ja) 2006-07-12
IL115594A0 (en) 1996-01-19
EP0786012A1 (de) 1997-07-30
WO1996012035A1 (en) 1996-04-25
EP0786012B1 (de) 1998-12-23

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