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DE60032600T2 - Spermin:peptidhaltige tenside - Google Patents

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DE60032600T2
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spermine
compound
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same
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DE60032600T
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SmithKline Beecham Pharm. Patrick Harlow CAMILLERI
Lipha S.A France Philippe GUEDAT
University of Cambridge Anthony John Lensfield Rd Cambridge KIRBY
SmithKline Beecham Pharm. Andreas Harlow KREMER
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SmithKline Beecham Ltd
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Description

  • Diese Erfindung betrifft neu identifizierte oberflächenaktive Verbindungen auf Spermin:Peptid-Basis, die Verwendung derartiger Verbindungen und Verfahren zu ihrer Herstellung. Die Erfindung betrifft auch die Anwendungen oberflächenaktiver Verbindungen auf Spermin:Peptid-Basis.
  • Oberflächenaktive Mittel sind Stoffe, welche die Oberflächeneigenschaften einer Flüssigkeit merklich beeinflussen, sogar bei geringen Konzentrationen. Zum Beispiel werden oberflächenaktive Mittel die Oberflächenspannung signifikant verringern, wenn sie in Wasser oder wässrigen Lösungen gelöst werden, und werden die Grenzflächenspannung zwischen zwei Flüssigkeiten oder einer Flüssigkeit und einem Feststoff verringern. Diese Eigenschaft von oberflächenaktiven Molekülen wird in der Industrie, insbesondere in der Reinigungsmittel- und Ölindustrie, weitgehend ausgenutzt. In den 1970iger Jahren wurde von einer neuen Klasse von oberflächenaktiven Molekülen berichtet, welche durch zwei hydrophobe Ketten mit polaren Köpfen gekennzeichnet waren, die durch eine hydrophobe Brücke gebunden sind (Deinega, Y. et al. Kolloidn. Zh. 36, 649, 1974). Diese Moleküle, welche "Gemini" genannt worden sind (Menger, F. M. und Littau, C. A., J. Am. Chem. Soc. 113, 1451, 1991) weisen gegenüber ihren monomeren Äquivalenten sehr erstrebenswerte Eigenschaften auf. Zum Beispiel sind sie beim Verringern der Grenzflächenspannung zwischen Flüssigkeiten auf Öl- und Wasserbasis sehr wirksam und weisen eine sehr niedrige kritische Mizellenkonzentration auf.
  • Kationische oberflächenaktive Mittel sind unter anderem zur Transfektion von Polynucleotiden in Zellen in Kultur verwendet worden, und es gibt Beispiele für derartige Mittel, welche im Handel für Wissenschaftler erhältlich sind, die an gentechnologischen Verfahren beteiligt sind (zum Beispiel das Mittel TfxTM-50 zur Transfektion von eukaryontischen Zellen, erhältlich von Promega Corp. WI, USA).
  • Die effiziente Zuführung von DNA in Zellen in vivo, entweder zur Gentherapie oder zur Antisense-Therapie, war einige Jahre lang ein Hauptziel. Sehr viel Aufmerksamkeit konzentrierte sich auf die Verwendung von Viren als Zuführungsvehikel, zum Beispiel Adenoviren für Epithelzellen im Respirationstrakt mit dem Ziel einer korrigierenden Gentherapie für zystische Fibrose (CF). Jedoch blieb ungeachtet einiger Beweise für einen erfolgreichen Gentransfer in CF-Patienten die Adenovirus-Route problematisch aufgrund von inflammatorischen Nebenwirkungen und begrenzter nicht dauerhafter Expression des übertragenen Gens. Es sind verschiedene alternative Verfahren zur in-vivo Gentransfer untersucht worden, einschließlich Studien, die kationische oberflächenaktive Mittel verwendeten. Gao, X. et al. (1995) Gene Ther. 2, 710–722, demonstrierte die Durchführbarkeit dieser Herangehensweise mit einem normalen humanen Gen für den CF-Transmembran-Leitfähigkeitsregulator (CFTR) in das respiratorische Epithel von CF-Mäusen unter Verwendung Amin-tragender kationischer Lipide. Diese Gruppe unternahm weitere Schritte mit einem liposomalen CF-Gentherapieversuch, der, wenn auch nur teilweise erfolgreich, das Potenzial für diese Herangehensweise an Menschen demonstrierte (Caplen, N. J. et al., Nature Medicine, 1, 39–46, 1995). Vor kurzem haben andere Gruppen das Potenzial von anderen kationischen Lipiden zur Genzuführung untersucht, zum Beispiel Cholesterinderivate (Oudrhiri, N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. 94, 1651–1656, 1997). Diese eingeschränkte Studie zeigte die Fähigkeit dieser cholesterinbasierten Verbindungen auf, den Gentransfer in Epithelzellen sowohl in vitro als auch in vivo zu ermöglichen, wodurch die Allgemeingültigkeit dieser Herangehensweise bestätigt wurde.
  • Diese und andere Studien zeigen, dass es auf diesem neuen Forschungsgebiet eine anhaltende Notwendigkeit gibt, neue, gering-toxische, oberflächenaktive Moleküle zu entwickeln, welche den wirksamen Transfer von Polynucleotiden in Zellen sowohl in vitro zur Transfektion in zellbasierten experimentellen Untersuchungen als auch in vivo zur Gentherapie und Antisense-Behandlungen ermöglichen. Durch vorliegende Erfindung wird angestrebt, die von den bestehenden Verbindungen gezeigten Schwierigkeiten zu überwinden.
  • Die Erfindung betrifft eine oberflächenaktive Verbindung auf Spermin:Peptid-Basis mit einem Spermingrundgerüst und mit der allgemeinen Struktur der Formel (I):
    Figure 00030001
    wobei R1 und R3 Wasserstoff sind und R2 und R4, welche gleich oder voneinander verschieden sein können, Peptidreste sind, welche aus einer oder mehreren Aminosäuren gebildet werden, die in einer linearen oder verzweigten Weise durch Amid-(CONH)-Bindungen aneinander gebunden sind, und die ferner an das Spermingrundgerüst durch Amidbindungen gebunden sind, mit der allgemeinen Formel (II):
    Figure 00030002
    wobei p1 0 bis 5 ist und p2 1 bis 5 ist, bevorzugt 1; und die Werte für p3 und p4, welche gleich oder voneinander verschieden sein können, 0 bis 5 betragen, bevorzugt 0;
    A1, A3 und A4, welche gleich oder voneinander verschieden sein können, Aminosäuren sind, welche aus Serin, Lysin, Ornithin, Threonin, Histidin, Cystein, Arginin und Tyrosin ausgewählt sind; und
    A2 eine Aminosäure ist, welche aus Lysin, Ornithin und Histidin ausgewählt ist;
    und R5 und R6 gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffreste sind, welche bis zu 24 Kohlenstoffatome aufweisen und an das Spermingrundgerüst durch eine Amid- oder Amin-(NCH2)-Bindung gebunden sind;
    oder
    wenn R1 und R3 Wasserstoff sind, R2 und R4, welche gleich oder voneinander verschieden sein können, gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffreste sind, welche bis zu 24 Kohlenstoffatome aufweisen und an das Spermingrundgerüst durch Amid- oder Aminbindungen gebunden sind, und R5 und R6, welche gleich oder voneinander verschieden sein können, Peptidreste der Formel (II) sind, welche an das Spermingrundgerüst durch Amidbindungen gebunden sind,
    oder
    ein Salz, vorzugsweise ein pharmazeutisch verträgliches Salz, davon.
  • Wenn hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Kohlenwasserstoff" auf einen Rest mit 1 bis 24 Kohlenstoffatomen, der geradkettig oder verzweigt sein kann und einen gesättigten carbocylischen Ring mit 3 bis 6 Kohlenstoffatomen einschließen kann und der Ungesättigtheit (Doppel- und/oder Dreifach-Kohlenstoff-Kohlenstoffbindungen) enthalten kann.
  • Die Amidbindungen zwischen den Aminosäuren A1, A2 und A3 im Peptidrest der Formel (II) sind Standardpeptidbindungen (α-Bindungen), außer wenn die Aminosäure ein Diamin ist, zum Beispiel Lysin oder Ornithin, wo die Bindung einen der beiden Aminreste umfassen kann. Zum Beispiel kann, wo A1 Lysin ist, die Bindung an die Aminosäure A2 eine Standard-Alpha-Amidbindung sein oder eine Epsilon-(ε)-Amidbindung, welche das Amin der Lysinseitenkette umfasst. Ähnlich kann, wo A1 Ornithin ist, die Amidbindung, welche A1 an A2 bindet, eine Alphabindung oder eine Delta-(δ)-Bindung sein, die unter Verwendung des Amins an der Seitenkette des Ornithinaminosäurerests erzeugt wird.
  • Bevorzugt ist die Verbindung symmetrisch, das heißt, R1 und R3 sind gleich, R2 und R4 sind gleich und R5 und R6 sind gleich. Erfindungsgemäße symmetrische oberflächenaktive Verbindungen auf Spermin:Peptid-Basis sind "Gemini"-oberflächenaktive-Mittel.
  • In einer bevorzugten Ausführungsform ist A1 im Rest der Formel (II) Serin oder Threonin, bevorzugt Serin. Bevorzugt sind A3 und A4 im Rest der Formel (II) Lysin, Ornithin, Histidin oder Arginin.
  • In einer weiteren, bevorzugten Ausführungsform ist der Kohlenwasserstoffrest ausgewählt aus:
    -(CH2)11CH3
    -(CH2)13CH3
    -(CH2)15CH3
    -(CH2)17CH3
    -(CH2)19CH3
    -(CH2)23CH3
    -(CH2)8CH=CH(CH2)5CH3
    -(CH2)8CH=CH(CH2)7CH3
    -(CH2)8CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3
    -(CH2)8(CH=CHCH2)3CH3
    -(CH2)4CH=CH(CH2CH=CH)3(CH2)4CH3
    -(CH2)8CH=CH(CH2)5CH3 trans
    -(CH2)8CH=CH(CH2)7CH3 trans
    -(CH2)9CHCH3(CH2)7CH3.
  • Die Verbindungen der vorliegenden Erfindung können aus leicht erhältlichen Ausgangsmaterialien unter Verwendung der dem Fachmann bekannten synthetischen Peptidchemie hergestellt werden. Das in den 1a und 1b gezeigte Schema zeigt ein allgemeines Verfahren zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen, wobei die Kohlenwasserstoffreste an die Spermineinheit durch Aminbindungen gebunden sind, und das in den 2a und 2b gezeigte Schema zeigt ein allgemeines Verfahren zur Synthese der erfindungsgemäßen Verbindungen, wobei die Carbonylreste an die Spermineinheit über Amidbindungen gebunden sind.
  • Die in den 1 und 2 gezeigten Verfahren dienen der Synthese von symmetrischen, das heißt "Gemini"-oberflächenaktiven-Mitteln auf Spermin:Peptid-Basis. Die erfindungsgemäßen nicht symmetrischen oberflächenaktiven Mittel auf Spermin:Peptid-Basis können durch Einführen von Asymmetrie hergestellt werden, zum Beispiel an den primären Aminen des Spermins unter Verwendung von unterschiedlichen Schutzgruppen. Geeignete Stickstoffschutzgruppen sind auf dem Fachgebiet bekannt und in zum Beispiel "Protective Groups in Organic Chemistry" (T. W. Greene, Wiley-Interscience, New York, 2. Auflage, 1991) beschrieben.
  • Eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft Verfahren zur Verwendung der oberflächenaktiven Verbindungen auf Spermin:Peptid-Basis. Derartige Verwendungen schließen das Erleichtern des Transfers von DNA- oder RNA-Polynucleotiden oder von Analoga davon in eukaryontische oder prokaryontische Zellen in vitro ein. Diese Verwendungen schließen das Erleichtern der Transfektion von Polynucleotiden ein, um eine Antisense-Knock-out-Wirkung zu erzielen.
  • Andere Anwendungen schließen die Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen ein, um die Transfektion von Polynucleotiden in Zellen in Kultur zu erleichtern, wenn ein derartiger Transfer, zum Beispiel unter anderem in Genexpressionsstudien und in Antisense-Kontrollexperimenten erforderlich ist. Die Polynucleotide können mit den Verbindungen gemischt, zu den Zellen gegeben und inkubiert werden, um die Polynucleotidaufnahme zu ermöglichen. Nach weiterer Inkubation können die Zellen auf phänotypische Merkmale die durch die transfizierte DNA hervorgebracht werden, untersucht werden, oder die Spiegel der mRNA, die von der DNA exprimiert wird, können durch Northern Blotting oder unter Verwendung von PCR-basierten Quantifizierungsverfahren, zum Beispiel dem Taqman®-Verfahren (Perkin Elmer, Connecticut, USA), bestimmt werden. Die Verbindungen der Erfindung bieten eine signifikante Verbesserung, typischerweise zwischen 3- und 6-fach, in der Wirksamkeit der zellulären Aufnahme von DNA in Zellen in Kultur, verglichen mit Verbindungen nach bisherigem Stand der Technik. Im Transfektionsprotokoll kann die Gemini-Verbindung in Kombination mit einer oder mehreren Zusätzen verwendet werden, um die Wirksamkeit der Transfektion zu steigern. Derartige Zusätze können zum Beispiel ausgewählt werden aus:
    • (i) einem neutralen Träger, zum Beispiel Dioleylphosphatidylethanolamin (DOPE) (Farhood, H., et al. (1985) Biochim. Biophys. Acta 1235, 289);
    • (ii) einem Komplexbildner, zum Beispiel das im Handel erhältliche PLUS-Reagens (Life Technologies Inc. Maryland, USA) oder Peptide, wie Polylysin- oder Polyornithinpeptide, welche primär, aber nicht ausschließlich basische Aminosäuren wie Lysin, Ornithin und/oder Arginin umfassen. Die vorstehende Liste soll nicht erschöpfend sein und andere Zusätze, welche die Wirksamkeit der Transfektion steigern, sollen unter den Umfang der Erfindung fallen.
  • Noch eine andere Ausführungsform der Erfindung betrifft die Verfahren, um die Zuführung der Nicht-Nucleotid-basierten Arzneistoff-Verbindungen in Zellen in vitro unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen zu bewirken.
  • Die folgenden Definitionen werden bereitgestellt, um das Verständnis bestimmter, hierin häufig verwendeter Begriffe zu erleichtern.
  • "Aminosäure" bezieht sich auf dipolare Ionen (Zwitterionen) von der Form +H3NCH(R)CO2 –. Sie werden anhand der Natur des Restes R unterschieden, und wenn R sich von Wasserstoff unterscheidet, können sie auch asymmetrisch sein, wobei sie D- und L-Familien bilden. Aminosäuren können natürliche oder nicht natürliche Aminosäuren sein. Es gibt 20 natürlich vorkommende Aminosäuren, wobei der R-Rest zum Beispiel nicht polar (z. B. Alanin, Leucin, Phenylalanin) oder polar (z. B. Glutamsäure, Histidin, Arginin und Lysin) sein kann. In Fall der nicht natürlichen Aminosäuren kann R jeder andere Rest sein, der in Aminosäuren in der Natur nicht vorkommt.
  • "Polynucleotid" bezieht sich im Allgemeinen auf jedes Polyribonucleotid oder Polydesoxyribonucleotid, welches unmodifizierte RNA oder DNA oder modifizierte RNA oder DNA sein kann. "Polynucleotide" schließen einzel- oder doppelsträngige DNA, DNA, welche ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen ist, einzel- und doppelsträngige RNA und RNA, welche ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen ist, Hybridmoleküle umfassend DNA und RNA, welche einzelsträngig oder typischer doppelsträngig oder ein Gemisch aus einzel- und doppelsträngigen Regionen sein kann, ein. Zudem bezieht sich "Polynucleotid" auf dreifachsträngige Regionen umfassend RNA oder DNA oder sowohl RNA als auch DNA. Der Begriff Polynucleotid schließt auch DNAs oder RNAs ein, welche eine oder mehrere modifizierte Basen und DNAs oder RNAs mit Gerüsten enthalten, die wegen der Stabilität oder aus anderen Gründen modifiziert wurden. "Modifizierte" Basen schließen zum Beispiel tritylierte Basen und unübliche Basen wie Inosin ein. Eine Vielzahl von Modifikationen ist an DNA und RNA vorgenommen worden; deshalb umfasst "Polynucleotid" chemisch, enzymatisch oder metabolisch modifizierte Formen von Polynucleotiden, wie sie typischerweise in der Natur gefunden werden, ebenso wie die chemischen Formen von DNA und RNA, die für Viren und Zellen charakteristisch sind. "Polynucleotid" umfasst auch relativ kurze Polynucleotide, die häufig als Oligonucleotide bezeichnet werden.
  • "Transfektion" bezieht sich auf die Einführung von Polynucleotiden in Zellen in Kultur unter Verwendung von Methoden, welche die Modifikation der Zellmembran entweder durch chemische oder physikalische Mittel umfassen. Derartige Methoden sind zum Beispiel in Sambrook et al., MOLECULAR CLONING: A LABORATORY MANUAL, 2. Auflage, Cold Spring Harbor, Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989) beschrieben. Die Polynucleotide können linear oder zirkulär, einzelsträngig oder doppelsträngig sein und können Elemente einschließen, welche die Replikation des Polynucleotids oder die Expression von homologen oder heterologen Genen steuern, welche einen Teil des Polynucleotids umfassen.
  • Die Erfindung wird nun anhand der folgenden Beispiele beschrieben werden.
  • BEISPIELE Beispiel 1 – Synthese von GSC1 Schritt 1:
    Figure 00080001
  • Eine Lösung aus N-Carbethoxyphthalimid (4 mmol, 439 mg) in Chloroform (5 ml) wurde in einer Portion bei Raumtemperatur zu einer gerührten Lösung aus Spermin (2 mmol, 406,7 mg) in Chloroform (5 ml) zugegeben. Das Gemisch wurde für 1 Stunde gerührt und das Lösungsmittel wurde entfernt, das rohe Material wurde unter starkem Vakuum getrocknet, um die Titelverbindung ohne weitere Reinigung zu erhalten (Sosnovsky, G. (1986) Zeitschrift für Naturforschung 41b: 122–129).
  • Schritt 2:
    Figure 00080002
  • Das geschützte Spermin 350 mg, (0,76 mmol) wurde in 10 ml trockenem THF gelöst, das Lauroylchlorid 3 eq (2,28 mmol) und 2 ml trockenes Pyridin wurden zugegeben. Nach dem Erhitzen unter Rückfluss für 30 min wurde das Gemisch bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und das rohe Material wurde in AcOEt (25 ml) gelöst und mit gesättigtem Bicarbonat (2 × 20 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und eingedampft. Das so erhaltene Öl wurde auf Kieselgel mit AcOEt/Hexan (1 : 1 bis 4 : 1), Rf = 0,20 (AcOEt/Hexan 1 : 1) chromatographiert, um 490 mg (84%) Bis-dodecyl als Öl zu ergeben, welches als weißer, halbfester Kristall kristallisierte. 1H-NMR (CDCl3): 7,9–7,6 m (8H, (-C6H4-)2); 3,7–3,6 m (4H); 3,4–3,2 m (8H); 2,3–2,1 m (4H); 2,0–1,8 m (4H); 1,6–1,4 m (8H); 1,3–1,1 m (32H); 0,9–0,8 m (6H). 13C-NMR (CDCl3): 173,1, 173,0, 172,9, 172,8, 168,3, 168,2, 134,2, 134,1, 133,9, 133,8, 132,2, 132,1, 132,0, 131,9, 123,4, 123,2, 47,6, 45,7, 45,5, 45,4, 43,5, 43,4, 35,9, 33,9, 33,2, 33,1, 30,9, 29,6, 29,5, 29,4, 29,3, 29,1, 28,3, 28,2, 27,1, 26,7, 26,4, 25,5, 25,4, 25,2, 25,1, 24,9, 22,7, 14,1.
  • Schritt 3:
    Figure 00090001
  • Das Bis-phthalimid (400 mg, 0,48 mmol) wurde in 20 ml MeOH gelöst, Hydrazinmonohydrat 0,4 ml wurde zugegeben und das Gemisch wurde für 6 h unter Rückfluss erhitzt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und das rohe Material wurde in MeOH (20 ml) wieder gelöst, und 2 ml konzentrierte HCl wurde zugegeben. Das Gemisch wurde für 30 min unter Rückfluss erhitzt und das Lösungsmittel wurde entfernt. Der Rückstand wurde in wässrigem NaOH 10% gelöst, das Präzipitat wurde filtriert und mit 3 Mengen kaltem Wasser gewaschen. Der Rückstand wurde getrocknet, um 112 mg (41%) weißes Pulver zu ergeben. 1H-NMR (MeOH): 3,21 t (3J = 6,8 Hz, 4H); 2,6–2,5 m (8H); 2,76 t (3J = 7,5 Hz, 4H); 1,7–1,5 m (12H); 1,4–1,2 m (32H); 0,89 t, (3J = 6,9 Hz, 6H (-CH3)2).
  • Schritt 4:
    Figure 00100001
  • Das Diamin 100 mg (0,176 mmol), HOBt 2 eq (0,353 mmol, 54 mg), BOC2Lys 2,4 eq (0,423 mmol, 135 mg) und DIPEA 2 eq (0,353 mmol, 62 ml) wurden in CH2Cl2 (20 ml) gelöst. Das Gemisch wurde bei –10°C gekühlt und DCC 2,4 eq (0,423 mmol, 87 mg) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde bei –10°C gerührt und man ließ es sehr langsam Raumtemperatur erreichen und es wurde über Nacht beiseite gestellt. Die DCU wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde verdampft. Das rohe Material wurde wieder in AcOEt (30 ml) gelöst, nacheinander mit 4% NaHCO3 (2 × 15 ml), 4% Citronensäure (2 × 15 ml), Wasser (20 ml) und schließlich Salzlösung (20 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde auf Kieselgel chromatographiert und mit Hexan/AcOEt 1/1 (Rf = 0,01) bis AcOEt/MeOH 9/1 (Rf = 0,6) eluiert, um 152 mg (71%) als Öl zu ergeben. 1H-NMR (CDCl3): 7,05 breites Singulett (1H); 6,69 breites Singulett (1H); 5,6–4,7 m (6H); 4,9–4,1 m (4H); 3,7–3,0 m (16H); 2,2–2,0 m (6H); 2,0–1,0 m (88H); 0,88 t (3J = 6,8 Hz, 6H (-CH3)2).
  • Schritt 5:
    Figure 00100002
  • Das tetrageschützte Gemini 150 mg (0,12 mmol) wurde in CH2Cl2/TFA 1/1 (25 ml) gelöst und bei Raumtemperatur für 0,5 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt, um die entschützten Verbindungen als ein TFA-Salz zu ergeben, das auf anionischem Dowex 1X8 ausgetauscht wurde, um das Tetrahydrochloridsalz als ein klebriges Öl zu ergeben. Die Verbindung wurde in kleinen Mengen MeOH wieder gelöst und mit Ether präzipitiert, das Lösungsmittel wurde durch Dekantieren entfernt, dies wurde dreimal wiederholt, um GSC1 zu ergeben. 1H-NMR (MeOH): 3,8–3,1 m (8H); 3,0–2,8 m (4H); 2,2–2,1 m (4H); 2,0–1,4 m (26H); 1,4–1,2 m (36H); 0,90 t (3J = 6,8 Hz, 6H (-CH3)2). M/z (H+): 823,75; (2H+): 412,38.
  • Beispiel 2 – Synthese von GSC4 Schritt 1:
    Figure 00110001
  • Das Diamin 150 mg (0,265 mmol) wurde in 5% wässrigem Acetonitril (10 ml) gelöst und Triethylamin 2,2 eq (0,6 mmol, 80 μl) wurde zugegeben. Das Nα,Nε-Bis-ter-butylcarbamat-L-lysin-L-serin-O-succinimidat (durch die übliche Peptidsynthese aufgebaut) 2 eq (0,528 mmol, 280 mg) in Acetonitril (8 ml) wurde langsam zugegeben. Das Gemisch wurde 48 h bei Raumtemperatur gerührt und das Lösungsmittel wurde entfernt. Das rohe Material wurde wieder in AcOEt (30 ml) gelöst und nacheinander mit Wasser (2 × 20 ml), 3% HCl (2 × 20 ml), Wasser (20 ml) und schließlich Salzlösung (20 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bis zur Trockenheit eingedampft, um 252 mg (68%) zu ergeben. 1H-NMR (CDCl3): 4,9–4,1 m (4H); 3,6–3,0 m (20H); 2,2–2,0 m (8H); 2,0–1,0 m (80H); 0,88 t (3J = 6,8 Hz, 6H (-CH3)2).
  • Schritt 2:
    Figure 00110002
  • Das tetrageschützte Gemini 248 mg (0,177 mmol) wurde in THF/konz. HCl 1/1 (25 ml) gelöst und bei Raumtemperatur für 1 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt, um die entschützten Verbindungen als ein klebriges, dunkles Öl zu ergeben, das in einer kleinen Menge von MeOH wieder gelöst und mit Ether präzipitiert wurde, das Lösungsmittel wurde durch Dekantieren entfernt, dies wurde mehrere Male wiederholt, um 120 mg (60%) GSC4 als pinkfarbenes Pulver zu ergeben. 1H-NMR (MeOH): 4,0–3,9 m (2H); 3,5–3,2 m; 3,1–2,9 m (4H); 2,5–2,3 m (4H); 2,3–2,1 m (1H); 2,0–1,5 m (20H); 1,4–1,2 m (32H); 0,90 t (3J = 6,8 Hz, 6H (-CH3)2).
  • Beispiel 3 – Synthese von GSC40 Schritt 1:
    Figure 00120001
  • Das Diamin 120 mg (0,212 mmol), HOBt 2,5 eq (0,53 mmol, 72 mg), (BOC2Lys)Lys 2,5 eq (0,53 mmol, 426 mg) und DIPEA 2,5 eq (0,53 mmol, 92 μl) wurden in CH2Cl2/THF 1/1 (20 ml) gelöst. Das Gemisch wurde bei –10°C gekühlt und DCC 2,4 eq (0,508 mmol, 105 mg) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde bei –10°C gerührt und man ließ es sehr langsam Raumtemperatur erreichen und stellte es über Nacht beiseite. Die DCU wurde durch Filtration entfernt und das Lösungsmittel wurde verdampft. Das rohe Produkt wurde in EtOAc (30 ml) wieder gelöst, nacheinander mit 4% NaHCO3 (2 × 15 ml), 4% Citronensäure (2 × 15 ml), Wasser (20 ml) und schließlich Salzlösung (20 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bis zur Trockenheit eingedampft. Der Rückstand wurde auf Kieselgel chromatographiert und mit Hexan/EtOAc 1/1 (Rf = 0,01) bis EtOAc/MeOH 9/1 (Rf = 0,55) eluiert, um 210 mg (46%) als Öl zu ergeben. 1H-NMR (CDCl3): 4,9–4,6 m (2H); 4,1–3,9 m (4H); 3,5–2,9 m (16H); 2,3–2,1 m (2H), 1,9–1,0 m (164H); 0,88 t (3J = 6,8 Hz, 6H (-CH3)2).
  • Schritt 2:
    Figure 00120002
  • Das oktageschützte Gemini 200 mg (0,094 mmol) wurde in THF/konz. HCl 1/1 (20 ml) gelöst und bei Raumtemperatur für 1 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt, um die entschützten Verbindungen als ein gelbes Öl zu ergeben, welches in einer kleinen Menge MeOH wieder gelöst und mit Ether präzipitiert wurde, das Lösungsmittel wurde durch Dekantieren entfernt, dies wurde mehrere Male wiederholt, um 130 mg (85%) GSC40 als gelbes Pulver zu ergeben.
  • Beispiel 4 – Synthese von GSC41 Schritt 1:
    Figure 00130001
  • Das Diamin 200 mg (0,35 mmol) wurde in 5% wässrigem Acetonitril (20 ml) gelöst und Triethylamin 2 eq (0,7 mmol, 0,1 ml) wurde zugegeben. Das Bis-(Nα,Nε-bis-ter-butylcarbamat-L-lysin)-L-lysin-L-serin-O-succinimidat 2 eq (0,71 mmol, 700 mg) in Acetonitril (10 ml) wurde langsam zugegeben. Das Gemisch wurde 48 h bei Raumtemperatur gerührt und das Lösungsmittel wurde entfernt. Das rohe Produkt wurde in AcOEt (30 ml) wieder gelöst, nacheinander mit Wasser (2 × 20 ml), 3% HCl (2 × 20 ml), Wasser (20 ml) und schließlich Salzlösung (20 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bis zur Trockenheit eingedampft, um 509 mg (63%) zu ergeben. 1H-NMR (CDCl3): 4,9–4,6 m; 4,1–3,9 m (4H); 3,6–2,9 m (22H); 2,3–2,1 m (4H); 2,0–1,0 m; 0,88 t (3J = 6,8 Hz, 6H (-CH3)2).
  • Schritt 2:
    Figure 00130002
  • Das tetrageschützte Gemini 499 mg (0,216 mmol) wurde in THF/konz. HCl 1/1 (30 ml) gelöst und bei Raumtemperatur für 1 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt, um die entschützten Verbindungen als ein klebriges, braunes Öl zu ergeben, welches in einer kleinen Menge MeOH wieder gelöst und mit Ether präzipitiert wurde. Das Lösungsmittel wurde durch Dekantieren entfernt, dies wurde mehrere Male wiederholt, um 350 mg (90%) GSC41 als braunes Pulver zu ergeben.
  • Beispiel 5 – Synthese von GSC42 Schritt 1:
    Figure 00140001
  • Das Diamin 200 mg (0,35 mmol) wurde in 5% wässrigem Acetonitril (20 ml) gelöst und Triethylamin 2 eq (0,7 mmol, 0,1 ml) wurde zugegeben. Das Bis-(Nα,Nε-bis-ter-butylcarbamat-L-lysin)-L-lysin-L-serin-O-succinimidat 2 eq (0,71 mmol, 700 mg) in Acetonitril (10 ml) wurde langsam zugegeben. Das Gemisch wurde für 48 h bei Raumtemperatur gerührt und das Lösungsmittel wurde entfernt. Das rohe Produkt wurde in AcOEt (30 ml) wieder gelöst, nacheinander mit Wasser (2 × 20 ml), 3% HCl (2 × 20 ml), Wasser (20 ml) und schließlich Salzlösung (20 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und bis zur Trockenheit eingedampft, um 522 mg (70%) zu ergeben. 1H-NMR (CDCl3): 6,7–6,6 m (2H); 5,5–5,3 m (2H); 4,9–4,6 m (4H); 4,5–4,3 m (4H); 4,1–3,9 m (4H); 3,5–2,9 m (20H); 2,3–2,1 m (4H); 1,9–1,0 m; 0,88 t (3J = 6,8 Hz, 6H (-CH3)2).
  • Schritt 2:
    Figure 00140002
  • Das tetrageschützte Gemini 517 mg (0,242 mmol) wurde in THF/konz. HCl 1/1 (30 ml) gelöst und bei Raumtemperatur für 1 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt, um die entschützten Verbindungen als klebriges dunkles Öl zu ergeben, welches in einer kleinen Menge von MeOH wieder gelöst und mit Ether präzipitiert wurde, das Lösungsmittel wurde durch Dekantieren entfernt, dies wurde mehrere Male wiederholt, um 346 mg (88%) GSC42 als braunes Pulver zu ergeben.
  • Beispiel 6 – Synthese von GSC2 Schritt 1:
    Figure 00150001
  • Das geschützte Spermin 1,23 g (2,65 mmol) wurde in 1,2-Dichlorethan (25 ml) gelöst und Dodecylaldehyd 2,5 eq. (6,6 mmol, 1,5 ml) wurde zugegeben. Nach 10 min wurde Natriumcyanoborhydrid 6 eq. (15,9 mmol, 1 g) zugegeben und das Gemisch wurde bei Raumtemperatur über Nacht gerührt. Dann wurde wieder Natriumcyanoborhydrid 4,5 eq (750 mg) zugegeben und das Gemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt. Diese Lösung wurde zwischen Dichlormethan (150 ml) und Wasser (150 ml) verteilt und der pH-Wert wurde auf 9 eingestellt. Die so erhaltene Emulsion wurde für 12 h in einem Trenntrichter belassen. Dann wurde die organische Phase über Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Das rohe Produkt wurde auf Kieselgel chromatographiert, mit EtOAc/Hexan 1/4 bis 1/2 (Rf: 0,3), das 0,1% NEt3 enthielt, eluiert, um 540 mg einer halbfesten gelben Verbindung (26%) zu ergeben.
  • Schritt 2:
    Figure 00150002
  • Das geschützte Spermin 200 mg (0,25 mmol) wurde in Methanol (10 ml) gelöst und Hydrazinmonohydrat 10 eq (2,5 mmol, 0,13 ml) wurde zugegeben. Das Gemisch wurde unter Rückfluss für 8 h erhitzt und das Lösungsmittel wurde entfernt. Das rohe Produkt wurde in 10 ml Methanol wieder gelöst und konz. HCl (2 ml) wurde zugegeben, das Gemisch wurde für 30 min unter Rückfluss erhitzt, auf Eis gekühlt und filtriert. Das Lösungsmittel wurde entfernt und das rohe Produkt wurde in Dichlormethan (30 ml) wieder gelöst, 30 min bei Raumtemperatur gerührt und das Präzipitat wurde durch Filtration entfernt. Die Lösung wurde eingedampft und unter vermindertem Druck getrocknet, um 150 mg GSC2 als eine gelbe halbfeste Verbindung (88%) zu ergeben.
  • Beispiel 7 – Synthese von GSC12 Schritt 1:
    Figure 00160001
  • Das Diamin 143 mg (0,265 mmol) wurde in 5% wässrig. THF (10 ml) gelöst und NEt3 0,6 mmol (80 ml), aktiviertes Peptid 2 eq. (0,528 mmol, 282 mg) in THF (5 ml) wurden zugegeben. Das Gemisch wurde über Nacht gerührt und eingeengt. Dann wurde das rohe Produkt in EtOAc (60 ml) gelöst und nacheinander mit Wasser (2 × 20 ml), 3% HCl (2 × 20 ml), Wasser (20 ml), Salzlösung (20 ml) gewaschen. Die organische Phase wurde über Natriumsulfat getrocknet und das Lösungsmittel wurde verdampft, um 210 mg einer klebrigen weißen Verbindung (58%) zu erhalten.
  • Schritt 2:
    Figure 00160002
  • Tetra-Boc 200 mg (0,146 mmol) wurde in THF/konz. HCl 1/1 (20 ml) gelöst und bei Raumtemperatur für 1 h gerührt. Das Lösungsmittel wurde entfernt und das rohe Produkt wurde in einer kleinen Menge MeOH wieder gelöst und mit Ether präzipitiert, auf –20°C gekühlt, das Lösungsmittel wurde durch Dekantieren entfernt, dies wurde mehrere Male wiederholt, um 150 mg (87%) GSC12 als ein gelbes Pulver zu ergeben.
  • Beispiel 8. Transfektion von rekombinantem, Luciferase exprimierendem Plasmid in Zellen unter Verwendung von oberflächenaktiven Verbindungen auf Spermin:Peptid-Basis
  • Die Transfektionsstudien wurden unter Verwendung der adhärenten Zelllinie CHO-K1 (Puck et al., 1958) durchgeführt. Das vollständige Medium bestand aus MEM Alphamedium ergänzt mit 10% Vol./Vol. fötalem Rinderserum und 1 × L-Glutamin. Alle Medien und Zusätze wurden von Life Technologies erhalten.
  • Es wurden stabil transfizierte Zelllinien, welche β-Galactosidase exprimieren, durch Co-transfektion des Plasmid pSV-β-Galactosidase-Kontrollvektors (Promega) mit dem Plasmid Selecta Vecta-Neo (R & D Systems) in einem 10 : 1 Verhältnis erzeugt. Nach der G418- (Life Technologies) Selektion (0,8 mg ml–1) wurden die Kandidaten-Zelllinien auf β-Galactosidaseaktivität getestet (β-Gal Reportergentest, chemilumineszierend; Roche Diagnostics).
  • In vitro Gentransfektion
  • Die Zellen wurden in MTP-Platten mit 96 Vertiefungen (Beckton Dickinson) 16–18 Stunden vor der Transfektion in einer ungefähren Dichte von 1 × 104 Zellen pro Vertiefung ausgesät. Zur Transfektion wurden 64 ng Luciferase-Reportergenplasmid, pGL3-Kontrollvektor (Promega), pro Vertiefung mit verschiedenen Konzentrationen der oberflächenaktiven Verbindungen auf Spermin:Peptid-Basis und Komplexbildnern inkubiert. Nach 30 Minuten Inkubation bei RT wurde OPTI-MEM®-Medium (Life Technologies) zu dem Transfektionsgemisch zugegeben und die Lösung wurde auf die Zellen (finales Volumen pro Vertiefung: 100 μl) gegeben. Nach einer 3-stündigen Inkubation oder einer Inkubation über Nacht bei 37°C wurde die Transfektionslösung mit vollständigem Medium ersetzt und die Zellen wurden weiter bei 37°C inkubiert. Es wurden annähernd 48 Stunden nach der Transfektion Reportergentests gemäß den Anleitungen des Herstellers (Roche Diagnostics) durchgeführt. Die Lumineszenz wurde in einem Packard TopCount NXT Mikroplatten Szintillations- und Lumineszenz-Zähler gemessen. Zum Zweck der Normalisierung wurde die β-Galactosidaseaktivität (β-Gal Reportergentest, chemilumineszierend; Roche Diagnostics) gemessen und die Luciferaseaktivität wurde pro β-Galactosidaseaktivität berechnet.
  • Kurze Beschreibung der Zeichnungen
  • 1a und 1b. Das allgemeine Syntheseschema der oberflächenaktiven Verbindungen auf Spermin:Peptid-Basis, wobei die Carbonylgruppen (in diesem Fall Dodecanoyl) mit der Spermineinheit durch Amidbindungen verbunden sind. Die finale Verbindung in 1a ist die erste Verbindung in 1b.
  • 2a und 2b. Das allgemeine Syntheseschema der oberflächenaktiven Verbindungen auf Spermin:Peptid-Basis, wobei die Carbonylgruppen (in diesem Fall Dodecanoyl) mit der Spermineinheit durch Aminbindungen verbunden sind. Die finale Verbindung in 2a ist die erste Verbindung in 2b.
  • 3. Transfektion von CHO-K1-Zellen (stabil mit beta-Galactosidase transfiziert) mit den Gemini-oberflächenaktiven-Mitteln auf Spermin:Peptid-Basis GS-C-1, GS-C-2, GS-C-3, GS-C-4 und GS-C-12. Die Balken repräsentieren die mittleren cps (Zählungen pro Sekunde) von 8 Experimenten ± Standardabweichung des Mittels.

Claims (28)

  1. Oberflächenaktive Verbindung auf Spermin:Peptid-Basis mit der allgemeinen Struktur der Formel (I):
    Figure 00190001
    wobei R1 und R3 Wasserstoff sind und R2 und R4, welche gleich oder voneinander verschieden sein können, Peptidreste sind, welche aus einer oder mehreren Aminosäuren gebildet werden, die in einer linearen oder verzweigten Weise durch Amid-(CONH)-Bindungen aneinander gebunden sind, und die ferner an das Spermingrundgerüst durch Amidbindungen gebunden sind, mit der allgemeinen Formel (II):
    Figure 00190002
    wobei p1 0 bis 5 ist und p2 1 bis 5 ist; und die Werte für p3 und p4, welche gleich oder voneinander verschieden sein können, 0 bis 5 betragen; A1, A3 und A4, welche gleich oder voneinander verschieden sein können, Aminosäuren sind, welche aus Serin, Lysin, Ornithin, Threonin, Histidin, Cystein, Arginin und Tyrosin ausgewählt sind; und A2 eine Aminosäure ist, welche aus Lysin, Ornithin und Histidin ausgewählt ist; und R5 und R6 gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffreste sind, welche bis zu 24 Kohlenstoffatome aufweisen und an das Spermingrundgerüst durch eine Amid- oder Amin-(NCH2)-Bindung gebunden sind; oder wenn R1 und R3 Wasserstoff sind, R2 und R4, welche gleich oder voneinander verschieden sein können, gesättigte oder ungesättigte Kohlenwasserstoffreste sind, welche bis zu 24 Kohlenstoffatome aufweisen und an das Spermingrundgerüst durch Amid- oder Aminbindungen gebunden sind, und R5 und R6, welche gleich oder voneinander verschieden sein können, Peptidreste der Formel (II) sind, welche an das Spermingrundgerüst durch Amidbindungen gebunden sind, oder ein Salz, vorzugsweise ein pharmazeutisch verträgliches Salz, davon.
  2. Oberflächenaktive Verbindung auf Spermin:Peptid-Basis gemäß Anspruch 1, welche symmetrisch ist, das heißt, R1 und R3 sind gleich, R2 und R4 sind gleich und R5 und R6 sind gleich.
  3. Oberflächenaktive Verbindung auf Spermin:Peptid-Basis gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei im Peptidrest der Formel (II) p1 1 ist und p2, p3 und p4 alle 0 sind.
  4. Oberflächenaktive Verbindung auf Spermin:Peptid-Basis gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei im Peptidrest der Formel (II) p1 und p2 jeweils 1 sind und p3 und p4 jeweils 0 sind.
  5. Oberflächenaktive Verbindung auf Spermin:Peptid-Basis gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei im Peptidrest der Formel (II) p1 0 ist und p2, p3 und p4 alle 1 sind.
  6. Oberflächenaktive Verbindung auf Spermin:Peptid-Basis gemäß Anspruch 1 oder 2, wobei im Peptidrest der Formel (II) p1 und p3 0 sind, p2 1 ist und p4 2 ist.
  7. Oberflächenaktive Verbindung auf Spermin:Peptid-Basis gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei A1 Serin ist.
  8. Oberflächenaktive Verbindung auf Spermin:Peptid-Basis gemäß einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei A2 Lysin ist.
  9. Oberflächenaktive Verbindung auf Spermin:Peptid-Basis gemäß Anspruch 1, wobei der Kohlenwasserstoffrest ausgewählt ist aus: -(CH2)11CH3 -(CH2)13CH3 -(CH2)15CH3 -(CH2)17CH3 -(CH2)19CH3 -(CH2)23CH3 -(CH2)8CH=CH(CH2)5CH3 -(CH2)8CH=CH(CH2)7CH3 -(CH2)8CH=CHCH2CH=CH(CH2)4CH3 -(CH2)8(CH=CHCH2)3CH3 -(CH2)4CH=CH(CH2CH=CH)3(CH2)4CH3 -(CH2)8CH=CH(CH2)5CH3 trans -(CH2)8CH=CH(CH2)7CH3 trans -(CH2)9CHCH3(CH2)7CH3.
  10. Verbindung:
    Figure 00210001
  11. Verbindung:
    Figure 00220001
  12. Verbindung GCS1 der Formel:
    Figure 00220002
  13. Verbindung GCS4 der Formel:
    Figure 00220003
  14. Verbindung GSC40 der Formel:
    Figure 00230001
  15. Verbindung GSC42 der Formel:
    Figure 00230002
  16. Verbindung GSC2 der Formel:
    Figure 00230003
  17. Verbindung GSC12 der Formel:
    Figure 00230004
  18. Verwendung einer oberflächenaktiven Verbindung auf Spermin:Peptid-Basis wie in einem der Ansprüche 1 bis 17 definiert, zur Erleichterung der Transfektion von DNA- oder RNA-Polynucleotiden oder Analoga davon in eine eukaryontische oder prokaryontische Zelle in vitro.
  19. Verwendung einer oberflächenaktiven Verbindung auf Spermin:Peptid-Basis gemäß Anspruch 18, wobei die Verbindung in Kombination mit einem oder mehreren Zusätzen verwendet wird, ausgewählt aus: (i) einem neutralen Träger; oder (ii) einem Komplexbildner.
  20. Verwendung gemäß Anspruch 19, wobei der neutrale Träger Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) ist.
  21. Verwendung gemäß Anspruch 19, wobei der Komplexbildner ein Peptid ist, das hauptsächlich basische Aminosäuren umfasst.
  22. Verwendung gemäß Anspruch 21, wobei das Peptid aus basischen Aminosäuren besteht.
  23. Verwendung gemäß Anspruch 21 oder 22, wobei die basischen Aminosäuren ausgewählt sind aus Lysin und Arginin.
  24. Verwendung gemäß Anspruch 22, wobei das Peptid Polylysin oder Polyornithin ist.
  25. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 24, wobei die Oligonucleotide oder Polynucleotide in Zellen transferiert werden, um einen Antisense-Knock-out-Effekt zu erzielen.
  26. Verwendung gemäß einem der Ansprüche 18 bis 24, wobei die Oligonucleotide oder Polynucleotide in Zellen in Kultur transferiert werden.
  27. Verwendung einer oberflächenaktiven Verbindung auf Spermin:Peptid-Basis gemäß einem der Ansprüche 1 bis 17, um die Adhäsion der Zellen in Kultur aneinander oder an einer Feststoff- oder Halbfeststoffoberfläche zu erleichtern.
  28. Verfahren zur Herstellung oberflächenaktiver Verbindungen auf Spermin:Peptid-Basis gemäß Anspruch 1, wobei das Verfahren das Zufügen von Aminosäuren oder Peptiden zu einem Kohlenwasserstoff-haltigen Spermingrundgerüst umfasst.
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