DE60035687T2

DE60035687T2 - Bipolare lipide und ihre verwendung zum transport bioaktiver substanzen

Info

Publication number: DE60035687T2
Application number: DE60035687T
Authority: DE
Inventors: Ian Claverton Down Bath BLAGBROUGH; Andrew John Claverton Down GEALL; Michael Anthony William Aston Rowant EATON; Timothy John Great Missenden NORMAN; Terence Seward The Mayes Staines BAKER; Andrew Neil Charles Twyford WEIR; Catherine Fiona Gerrards Cross CATTERALL
Original assignee: UCB SA
Current assignee: UCB Pharma SA Belgium
Priority date: 1999-04-26
Filing date: 2000-04-26
Publication date: 2008-06-05
Anticipated expiration: 2020-04-27
Also published as: ES2288472T3; WO2000064858A1; AU4421200A; EP1187807A1; DE60035687D1; EP1187807B1; ATE368027T1

Description

Die Erfindung betrifft eine Reihe bipolarer Lipide und ihre Verwendung zum Transport bioaktiver Substanzen in Zellen.
Um wirksam zu sein, müssen viele pharmazeutische Mittel effizient ins Zytoplasma einer eukaryontischen Zelle transportiert werden. Für viele Substanzen mit niedrigem Molekulargewicht und geringer bis mäßiger Polarität ist dies kein Problem, da solche Moleküle direkt durch die Plasmamembran der Zelle ins Zytoplasma hindurch diffundieren können. Anderen Verbindungen größerer Polarität oder höheren Molekulargewichts ist keine direkte Passage möglich, und diese gelangen im Allgemeinen durch rezeptorvermittelte Endozytose oder Phagozytose in die Zelle. Diese Mechanismen sind jedoch nicht mit allen Größen und Arten von Molekülen wirksam. Insbesondere werden große polyanionische Verbindungen nicht leicht von Zellen aufgenommen, wenn sie ihnen in wässriger Lösung dargeboten werden.
Eine allgemeine Lösung für dieses Problem ist es, jedes schlecht transportierte pharmazeutische Mittel an einen Träger zu koppeln, der seinerseits ohne Weiteres in das Zytoplasma einer Zelle aufgenommen wird. Dies ist jedoch nicht immer zufriedenstellend, da dies eine unerwünschte Wirkung auf den Metabolismus und/oder die Antigenizität des pharmazeutischen Mittels haben kann und/oder es schwierig sein kann, die gewünschte biologische Aktivität aus dem resultierenden Konjugat zurückzugewinnen, sobald es einmal in der Zelle ist.
Eine alternative Lösung besteht darin, das pharmazeutische Mittel mit einem Transportvehikel zu formulieren, das in wässrigen Lösungen löslich ist, aber das auch in der Natur vorkommende Zellmembranbestandteile imitieren kann. Dies stimuliert die Fusion des Vehikels mit einer Zellmembran und den nachfolgenden Transport eines beliebigen damit assoziierten pharmazeutischen Mittels ins Zytoplasma.
Amphiphile Lipide wurden häufig zu diesem Zweck verwendet. Sie haben typischerweise ein hydrophobes Gerüst, das aus einem oder mehreren Kohlenwasserstoffen besteht, und eine hydrophile polare Kopfgruppe, die eine oder mehrere ionisierbare Gruppen enthält, um den Transport der Makromoleküle zu den Plasmamembranen der Zellen und durch sie hindurch und ins Zytoplasma zu erleichtern. Die Polarität der Kopfgruppe kann durch die Auswahl der Anzahl und/oder der Art der ionisierbaren Gruppen kontrolliert werden, um eine Reihe negativ geladener (anionischer), neutraler oder positiv geladener (kationischer) Lipide zu erhalten.
Zum Transport von Polyanionen ist es im Allgemeinen von Vorteil, kationische Lipide zu verwenden. Das Aufkommen der Gentherapie und die Notwendigkeit, anionische Moleküle wie z. B. Nukleinsäuren in Sängerzellen zu transportieren, haben einen großen Anreiz zur Entwick lung dieser Lipidklasse geboten. Zu Verbindungen der ersten Generation gehören solche mit einer monokationischen Kopfgruppe wie z. B. N-[1(2,3-Dioleyloxy)propyl]-N,N,N-trimethylammoniumchlorid [DOTMA; Feigner, P. L. und Ringold, G. M., Nature, 337 387–388 (1989)], 1,2-Dimyristyloxypropyl-3-dimethylhydroxyethylammoniumbromid [DMRIE; Zabner, J. et al., J. Biol. Chem, 270, 18997–19007 (1995)], und Bolaamphiphile [Fuhrhop, J.-H. et al., Chemistry and Physics of Lipids 43, 193–213 (1987)], 3β[N-(N¹,N¹-Dimethylaminoethan)carbamoyl]cholesterin [DC-Chol; Farhood, H. et al., Biochim. Biophys. Acta 1111, 239–246 (1992)] und diejenigen mit einer polykationischen Kopfgruppe wie z. B. Dioctadecyl-amidoglycylspermin [DOGS; Behr, J.-P., et al., Proc. Nati. Acad. Sci. 86, 6982–6986 (1989)].
In dem Bestreben, die Eigenschaften dieser frühen Verbindungen für den In-vivo-Transport von Polyanionen zu verbessern, wurden zahlreiche weitere kationische Lipide entwickelt, bei denen die Natur und Größe des hydrophoben Gerüsts und/oder der kationischen Kopfgruppe variiert wurden (siehe z. B. die internationalen Patentbeschreibungen Nrn. WO 95/21931 , WO 96/10038 , WO 96/17823 , WO 96/18273 , WO 96/25508 , WO 96/26179 , WO 96/41606 , WO 97/18185 , WO 97/25339 , WO 97/3010 , WO 97/31934 und WO 99/52858 .
Das Ziel bei der Entwicklung von kationischen Lipiden zur In-vivo-Verwendung ist es, ein Molekül bereitzustellen, das in einer klinischen Umgebung einfach zu verwenden ist; das robust ist; das in einem weiten pH- und Ionenstärkebereich kleine stabile Komplexe bildet; das ungiftig ist; und das imstande ist, eine hohe Konzentration der Polyanionen in eine Zelle zu transportieren.
Wie haben jetzt eine Lipidklasse entwickelt, die diese Erfordernisse erfüllt. Es ist von Bedeutung, dass unsere Lipide zur Selbstorganisation befähigt sind und in wässrigen Lösungen stabile Komplexe bilden. Die Lipide sind imstande, Polyanionen auf wirksame Weise zu kompaktieren, was definierte Partikelgrößen von weniger als 500 nm ergibt. Der Lipid-Polyanionen-Komplex bleibt über einen weiten pH- und Ionenstärkebereich hinweg assoziiert und ist imstande, hohe Konzentrationen an Polyanionen wirksam in die Zellen zu transportieren.
Somit stellen wir gemäß einem Aspekt der Erfindung ein bipolares Lipid bereit, das einen kationischen Kopf (1), ein hydrophobes Gerüst (2) und einen hydrophilen Schwanz (3) umfasst, wobei:

(A) der kationische Kopf zwei oder mehrere kationische Zentren umfasst, wobei jedes Zentrum wenigstens ein zur Ausbildung einer positiven Ladung bei einem pH im Bereich von 2 bis 10 fähiges Heteroatom enthält, welches über eine oder mehrere kohlenstoffhaltige Spacergruppen kovalent an ein oder mehrere andere Zentren gebunden ist;
(B) das hydrophobe Gerüst wenigstens eine Kohlenwasserstoffkette umfasst; und
(C) der hydrophile Schwanz wenigstens eine Schwanzeinheit umfasst, die unter synthetischen Polyolen, natürlich vorkommenden Polyolen, Poly(alkylenoxiden) und Derivaten davon ausgewählt ist;

In der Praxis hängt die Frage, ob ein Heteroatom im pH-Bereich von 2–10, wie oben spezifiziert, eine positive Ladung aufnimmt, von der Natur und Anzahl der anderen damit verbundenen Atome oder Gruppen ab. Zu diesen besonderen Beispielen geeigneter kationischer Zentren gehören primäre, sekundäre, tertiäre und quaternäre Aminogruppen, Sulfonium- und Phosphoniumgruppen.
Die Anzahl kationischer Zentren kann wie gewünscht variiert werden, abhängig von der beabsichtigten Verbindung der erfindungsgemäßen Lipide. Mindestens zwei Zentren liegen vor, aber drei, vier, fünf, sechs, sieben, acht oder mehr können optional eingebaut werden. Es kann mehr als eine Art von Zentren vorliegen, z. B. können Gemische von Aminogruppen und/oder Sulfonium- oder Phosphoniumgruppen aufgenommen werden.
In einer allgemein bevorzugten Ausführungsform ist jedes kationische Zentrum eine Aminogruppe. Zu besonders nützlichen Aminogruppen gehören primäre und sekundäre Aminogruppen. Die Anzahl kationischer Zentren im kationischen Kopf (1) beträgt vorzugsweise von drei bis sechs.
Jedes kationische Zentrum ist im allgemeinen von jedem anderen Zentrum durch Spacergruppen getrennt, die so angeordnet sind, dass sie die Zentren auf lineare (gerade und/oder verzweigte) oder cyclische Weise verbinden. Das Gesamtergebnis kann ein kationischer Kopf (1) sein, der eine gerade und/oder verzweigte lineare Struktur, eine cyclische Struktur oder ein Gemisch von geraden und/oder verzweigten linearen und cyclischen Strukturen hat. Mehr als eine Art von Spacergruppen kann in einem kationischen Kopf (1) vorliegen. Gegebenenfalls kann eine Spacergruppe eine Endgruppe an einem kationischen Kopf (1) bilden und als Substituent an einem kationischen Zentrum anstelle einer die Zentren miteinander verbindenden Gruppe fungieren.
Jede Spacergruppe ist grundsätzlich nichtionisch und enthält mindestens ein Kohlenstoffatom. Zu geeigneten Gruppen gehören gegebenenfalls substituierte aliphatische, cycloaliphatische, heteroaliphatische, heterocycloaliphatische, aromatische oder heteroaromatische Gruppen.
Zu besonderen Beispielen gegebenenfalls substituierter aliphatischer Spacergruppen gehören gegebenenfalls substituierte C_1-10-aliphatische Ketten, wie z. B. gegebenenfalls substituierte geradkettige oder verzweigte C_1-6-Alkylen-, C_2-6-Alkenylen- oder C_2-6-Alkinylenketten.
Zu den heteroaliphatischen Spacergruppen gehören die soeben beschriebenen aliphatischen Ketten, wobei jedoch jede Kette zusätzlich ein, zwei, drei oder vier Heteroatome oder heteroatomhaltige Gruppen enthält. Zu besonderen Heteroatomen oder Gruppen gehören die Atome oder Gruppen L², wobei L² wie nachfolgend für L¹ definiert ist, wenn L¹ ein Spaceratom oder eine Spacergruppe ist. Jedes L²-Atom oder jede L²-Gruppe kann die aliphatische Kette unterbrechen oder kann an dem terminalen Kohlenstoffatom positioniert sein, so dass es bzw. sie die Kette mit dem Atom oder der Gruppe R¹ verbindet.
Zu besonderen Beispielen aliphatischer Spacergruppen gehören gegebenenfalls substituierte -CH₂-, -CH₂CH₂-, -CH(CH₃)-, -C(CH₃)₂-, -(CH₂)₂CH₂-, -CH(CH₃)CH₂-, -(CH₂)₃CH₂-, -CH(CH₃)CH₂CH₂-, -CH₂CH(CH₃)CH₂-, -C(CH₃)₂CH₂-, -(CH₂)₄CH₂-, -(CH₂)₅CH₂-, -CHCH-, -CHCHCH₂-, -CH₂CHCH-, -CHCHCH₂CH₂-, -CH₂CHCHCH₂-, -(CH₂)₂CHCH-, -CC-, -CCCH₂-, -CH₂CC-, -CCCH₂CH₂-, -CH₂CCCH₂-, oder -(CH₂)₂CC-Ketten. Wo es passend ist, kann jede dieser Ketten gegebenenfalls von einem oder zwei Atomen und/oder ein oder zwei Gruppen 12 unterbrochen sein, so dass eine gegebenenfalls substituierte heteroaliphatische Spacergruppe entsteht. Zu besonderen Beispielen gehören gegebenenfalls substituierte -L²CH₂-, -CH₂L²CH₂-, -L²(CH₂)₂-, -CH₂L²(CH₂)₂-, -(CH₂)₂L²CH₂-, -L²(CH₂)₃- und -(CH₂)₂L²(CH₂)₂-Ketten. Die optionalen Substituenten, die auf den aliphatischen oder heteroaliphatischen Spacergruppen vorliegen können, enthalten ein, zwei, drei oder mehr Substituenten, ausgewählt unter Halogenatomen, z. B. Fluor-, Chlor-, Brom- oder Jodatomen, oder Hydroxy, C_1-6-Alkoxy, z. B. Methoxy oder Ethoxy, Halo-C_1-6-Alkoxy, z. B. Halomethoxy oder Haloethoxy, wie z. B. Difluormethoxy oder Trifluormethoxy, Thiol oder C_1-6-Alkylthio, z. B. Methylthio oder Ethylthio. Zu besonderen Beispielen substituierter Spacergruppen gehören die soeben beschriebenen spezifischen Ketten, substituiert mit ein, zwei oder drei Halogenatomen, wie z. B. Fluoratomen, z. B. Ketten vom Typ -CH(CF₃)-, -C(CF₃)₂-, -CH₂CH(CF₃)-, -CH₂C(CF₃)₂-, -CH(CF₃)- und -C(CF₃)₂CH₂-.
Zu gegebenenfalls substituierten cycloaliphatischen Spacergruppen in dem kationischen Kopf (1) gehören gegebenenfalls substituierte C_3-10-cycloaliphatische Gruppen. Zu besonderen Beispielen gehören gegebenenfalls substituierte C_3-10-Cycloalkylen-, z. B. C_3-7-Cycloalkylen-, C_3-10- Cycloalkenylen-, z. B. C_3-7-Cycloalkenylen-, oder C_3-10-Cycloalkinylen, z. B. C_3-7-Cycloalkinylengruppen.
Zu besonderen Beispielen cyclischer aliphatischer Spacergruppen gehören gegebenenfalls substituierte Cyclopropylen-, Cyclobutylen-, Cyclopentylen-, Cyclohexylen-, Cycloheptylen-, 2-Cyclobuten-1-ylen-, 2-Cyclopenten-1-ylen- und 3-Cyclopenten-1-ylengruppen.
Zu den gegebenenfalls substituierten heterocycloaliphatischen Spacergruppen gehören die soeben beschriebenen gegebenenfalls substituierten cycloaliphatischen Gruppen, wobei jede Gruppe zusätzlich ein, zwei, drei oder vier Heteroatome oder heteroatomhaltige Gruppen 12, wie soeben definiert, enthalten.
Zu den optionalen Substituenten, die auf den cycloaliphatischen oder heterocycloaliphatischen Spacergruppen vorliegen können, gehören ein, zwei, drei oder mehr Substituenten, ausgewählt unter Halogenatomen, C_1-6-Alkyl-, z. B. Methyl- oder Ethyl-, HaloC_1-6-Alkyl-, z. B. Halomethyl- oder Haloethyl-, wie Difluormethyl- oder Trifluormethyl-, Hydroxyl-, C_1-6-Alkoxy-, z. B. Methoxy- oder Ethoxy-, HaloC_1-6-Alkoxy-, z. B. Halomethoxy- oder Haloethoxy-, wie Difluormethoxy- oder Trifluormethoxy-, Thiol-, oder C_1-6-Alkylthio-, z. B. Methylthio- oder Ethylthiogruppen.
Zu den gegebenenfalls substituierten aromatischen Spacergruppen gehören z. B. monocyclische C_6-12-aromatische Gruppen, wie z. B. gegebenenfalls substituiertes Phenyl.
Zu den gegebenenfalls substituierten heteroaromatischen Spacergruppen gehören z. B. gegebenenfalls substituierte monocyclische C_1-9-heteroaromatische Gruppen, die z. B. ein, zwei, drei oder vier Heteroatome enthalten, ausgewählt unter Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatomen. Zu den monocyclischen heteroaromatischen Gruppen gehören z. B. fünf- oder sechsgliedrige heteroaromatische Gruppen, die ein, zwei, drei oder vier Heteroatome enthalten, ausgewählt unter Sauerstoff-, Schwefel- oder Stickstoffatomen.
Zu den optionalen Substituenten, die auf den aromatischen oder heteroaromatischen Spacergruppen vorliegen können, gehören ein, zwei, drei oder mehr Substituenten, ausgewählt unter den soeben im Zusammenhang mit cycloaliphatischen und heterocycloaliphatischen Spacergruppen beschriebenen.
In einer allgemein bevorzugten Ausführungsform ist jede Spacergruppe in dem kationischen Kopf (1) vorzugsweise eine gegebenenfalls substituierte geradkettige oder verzweigte C_1-6-Alkylenkette. Zu besonders nützlichen Ketten gehören -(CH₂)₂-, -(CH₂)₃- und -(CH₂)₄-Ketten.
Das hydrophobe Gerüst (2) in den erfindungsgemäßen Lipiden kann eine oder mehrere Kohlenwasserstoffketten umfassen. Jeder Kohlenwasserstoff kann z. B. eine gegebenenfalls substituierte geradkettige aliphatische oder heteroaliphatische Kette sein, die mindestens 10 bis höchstens ungefähr 100 kettenverbundene Atome, wie nachfolgend detaillierter beschrieben, enthält. Der Kohlenwasserstoff kann entweder direkt oder indirekt über ein Spaceratom oder eine Spacergruppe mit dem kationischen Kopf (1) verbunden sein. Besondere Beispiele geeigneter Spacergruppen sind diejenigen, die durch die nachfolgend beschriebene L¹-Gruppe dargestellt werden.
Mindestens ein eine positive Ladung aufnehmendes Heteroatom (wie zuvor definiert) in einem kationischen Zentrum der erfindungsgemäßen Lipide ist kovalent mit einer Kohlenwasserstoffkette des hydrophoben Gerüsts (2) verbunden. Gegebenenfalls kann jedes beliebige andere verfügbare eine positive Ladung aufnehmende Heteroatom in dem gleichen oder beliebigen anderen kationischen Zentrum zusätzlich mit den gleichen oder anderen Kohlenwasserstoffketten verbunden werden, die das Gerüst bilden (2). Es ist jedoch allgemein bevorzugt, das Gerüst (2) und den kationischen Kopf (1) an genau einem eine positive Ladung aufnehmenden Heteroatom in genau einem kationischen Zentrum zu verbinden. Somit hat eine bevorzugte Klasse von erfindungsgemäßen Lipiden ein oder zwei Kohlenwasserstoffketten, wie soeben beschrieben, über ein Spaceratom oder eine Spacergruppe mit einem eine positive Ladung aufnehmenden Heteroatom in einem kationischen Zentrum in dem kationischen Kopf (1) indirekt verbunden.
Jede Schwanzeinheit im hydrophilen Schwanz (3) kann direkt oder indirekt durch ein Spaceratom oder eine Spacergruppe an eine Kohlenwasserstoffkette des Kohlenwasserstoffgerüsts (2) gebunden sein. Der Verbindungspunkt kann eine beliebige Stelle auf der Kohlenwasserstoffkette sein, sofern er mindestens zehn kettenverbundene Atome (d. h. mindestens zehn Atome entlang der Kette unter Ausschluss von Verzweigungen) von dem terminalen Kohlenstoffatom entfernt ist, das die Kohlenwasserstoffkette des hydrophoben Gerüsts (2) mit dem kationischen Kopf (1) verbindet. In einer allgemein bevorzugten Ausführungsform kann der Verbindungspunkt an einem terminalen Kohlenstoffatom einer Kohlenwasserstoffkette distal von dem Kettenkohlenstoffatom sein, das an den kationischen Kopf (1) angehängt ist.
Eine besonders nützliche Gruppe von erfindungsgemäßen Lipiden kann durch die Formel (1) dargestellt werden: [R¹]_m-(L¹)_n-R² (1)worin
R¹ für eine Kohlenwasserstoffkette steht, die gegebenenfalls mit einer oder mehreren Schwanzeinheiten substituiert ist, die unter synthetischen Polyolen, natürlich vorkommenden Polyolen, Poly(alkylenoxiden) und Derivaten davon ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass wenigstens eine Kohlenwasserstoffkette R¹ durch wenigstens eine derartige Schwanzeinheit substituiert ist und dass jede derartige Schwanzeinheit so an die Kohlenwasserstoffkette gebunden ist, dass ein Abstand von wenigstens 10 kettenverbundenen Atomen entlang der Kette zwischen der Schwanzeinheit und der Gruppe -(L¹)_n-R² erreicht wird;
m für eine ganze Zahl von 1 bis 6 steht;
L¹ für ein Linkeratom oder eine Linkergruppe steht;
n für Null oder die ganze Zahl 1 steht; und
R² für eine gegebenenfalls substituierte aliphatische, cycloaliphatische, heteroaliphatische, heterocycloaliphatische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe steht, die zwei oder mehr kationische Zentren enthält, so dass jede [R¹]_m-(L¹)_n-Gruppe an ein eine positive Ladung aufnehmendes Heteroatom in einem kationischen Zentrum in R² gebunden ist;
und die Salze, Solvate und Hydrate davon.
In den Verbindungen der Formel (1) kann die durch R² dargestellte gegebenenfalls substituierte aliphatische, cycloaliphatische, heteroaliphatische, heterocycloaliphatische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe eine gegebenenfalls substituierte C_1-30-aliphatische, C_3-10-cycloaliphatische, C_1-30-heteroaliphatische, C_3-10-heterocycloaliphatische, C_8-12-aromatische oder C_1-9-heteroaromatische Gruppe sein, die zwei oder mehr kationische Zentren enthält. Zu besonderen Beispielen solcher Gruppen gehören die oben allgemein und spezifisch im Hinblick auf die in dem kationischen Kopf (1) beschriebenen Spacergruppen mit der zusätzlichen Gegenwart von einem oder mehreren kationischen Zentren, wie hier definiert.
Im Allgemeinen ist in den erfindungsgemäßen Lipiden, wenn das hydrophobe Gerüst (2) und der kationische Kopf (1) indirekt durch ein Spaceratom oder eine Spacergruppe, wie dargestellt durch L¹ in den Verbindungen der Formel (1) bei n gleich 1, verbunden sind, das Spaceratom oder die Spacergruppe ein beliebiges multivalentes Atom oder eine beliebige multivalente Gruppe. Zu besonderen Beispielen geeigneter Spaceratome oder Spacergruppen gehören die Formeln -(Alk¹), (X¹)_s(Alk²)_t-, in welcher X¹ für ein -O- oder -S-Atom oder eine -C(O)-, -C(O)O-, -C(S)-, -S(O)-, -S(O)₂-, -N(R³), -CON(R³)-, -OC(O)N(R³)-, -CSN(R³)-, -N(R³)CO-, -N(R³)C(O)O-, -N(R³)CS-, -S(O)N(R³)-, -S(O)₂N(R³)-, -N(R³)S(O)-, -N(R³)S(O)₂-, -N(R³)CON(R³)- oder -N(R³)SO₂N(R³)-Gruppe steht, worin jedes R³ unabhängig ausgewählt ist unter Wasserstoffatomen, geradkettigen und verzweigten Alkylgruppen und -Alk¹X¹-Ketten; und Alk¹ und Alk² gleich oder verschieden sein können und jeweils für eine gegebenenfalls substituierte geradkettige oder verzweigte C_1-6-Alkylen-, C_2-6-Alkenylen oder C_2-6-Alkinylen-Kette stehen, die gegebenenfalls durch eine oder mehrere carbocyclische oder heterocarbocyclische Gruppen, Heteroatome oder heteroatomhaltige Gruppen X¹ gemäß Definition in diesem Anspruch unterbrochen oder terminiert ist, und r, s und t, die gleich oder verschieden sein können, jeweils für null oder die ganze Zahl 1 stehen, mit der Maßgabe, dass, wenn einer von r, s oder t für null steht, mindestens einer der anderen für die ganze Zahl 1 steht.
Zu den carbocyclischen Gruppen, die die Gruppen Alk¹ und Alk² unterbrechen können, gehören z. B. gegebenenfalls substituiertes C_4-8-Cycloalkyl, z. B. gegebenenfalls substituierte Cyclopentyl- oder Cyclohexylgruppen oder gegebenenfalls substituiertes C_4-8-Cycloalkenyl, z. B. gegebenenfalls substituierte Cyclopentenyl- oder Cyclohexenylgruppen. Zu heterocarbocyclischen Gruppen gehören z. B. carbocyclische Gruppen der soeben beschriebenen Arten, die ein oder mehrere Heteroatome oder Heteroatome enthaltende Gruppen X¹, wie oben definiert, enthalten. Optionale Substituenten, die auf den von Alk¹ oder Alk² dargestellten Ketten und den carbocyclischen oder heterocarbocyclischen Gruppen vorliegen können, die sie unterbrechen oder terminieren können, umfassen ein, zwei oder drei Substituenten, ausgewählt unter Halogenatomen, z. B. Fluor-, Chlor, Brom- oder Jodatomen, oder C_1-3-Alkyl-, z. B. Methyl- oder Ethyl-, oder C_1-3-Alkoxy-, z. B. Methoxy- oder Ethoxygruppen.
In dem Fall, dass eine Kohlenwasserstoffkette in dem hydrophoben Gerüst (2) daran gebunden ist, muss das Spaceratom oder die Spacergruppe mindestens bivalent sein. Wo es gewünscht ist, mehr als eine Kohlenwasserstoffkette an den Spacer zu binden, muss der letztere mit einer geeigneten Valenz ausgewählt werden, und dies bedeutet grundsätzlich, das mindestens eine der Gruppen Alk¹ oder Alk² in einer verzweigten Form und mit der erforderlichen Anzahl von X¹-Atomen oder -Gruppen vorliegen muss, um die gewünschte Kopplung zu erreichen.
Zu besonderen Beispielen für Linkergruppen gehören Gruppen der Formel X¹Alk²-, worin X¹ wie oben definiert ist und Alk² für eine gegebenenfalls substituierte -CH₂-, -(CH₂)₂-, -(CH₂)₃-, -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅- oder -(CH₂)₆-Kette steht; Gruppen der Formel [X¹]₂Alk¹X¹Alk₂, wobei Alk¹ für eine -CH₂CH<-Gruppe steht und X¹ und Alk² wie soeben definiert sind, oder eine Gruppe der Formel [X¹]₂Alk¹Alk², wobei X¹, Alk¹ und Alk² wie soeben definiert sind.
Jede Kohlenwasserstoffkette in dem hydrophoben Gerüst (2) der erfindungsgemäßen Lipide, dargestellt durch R¹ in den Verbindungen der Formel (1), kann eine C₁₀- bis zu ungefähr einer C₆₀-Kohlenwasserstoffkette sein, z. B. eine C₁₆- bis C₆₀-Kohlenwasserstoffkette, wie z. B. eine C₁₈- bis C₄₈-Kohlenwasserstoffkette.
Insbesondere kann die Kette eine optional substituierte C_10-60-aliphatische Kette sein, wie z. B. eine gegebenenfalls substituierte lineare oder verzweigte C_10-60-Alkylen-, C_10-60-Alkenylen- oder C_10-60-Alkinylenkette. Zu den optionalen Substituenten, die auf solchen Ketten vorliegen können, gehören ein oder mehrere Halogenatome, z. B. Fluor-, Chlor-, Brom- oder Jodatome oder HaloC_1-6-Alkyl-, z. B. CF₃-Gruppen. Gegebenenfalls kann jede Alkylen-, Alkenylen- oder Alkinylengruppe von einem oder mehreren Sauerstoff- oder Schwefelatomen oder optional substituierten C_5-7-Cycloalkyl-, z. B. Cyclopentyl- oder Cyclohexyl-, C_5-7-Cycloalkenyl-, z. B. Cyclopentenyl- oder Cyclohexenyl-, -C(O)-, -C(S)-, -C(O)N(R³)-, -C(S)N(R³)-, N(R³)C(O)-, N(R³)C(S)-, -C(O)O-, -C(O)S-, OC(O)N(R³)-, -S(O)-, -S(O₂)-, -S(O)N(R³)-, S(O)₂N(R³)-, -N(R³)S(O)-, -N(R³)S(O)₂-, -N(R³)C(O)N(R³)-, -N(R³)C(S)N(R³)-, -N(R³)S(O)N(R³)- oder -N(R³)S(O)₂N(R³)-Gruppen unterbrochen sein. Zu optionalen Substituenten, die auf Cycloalkyl- oder Cycloalkenylgruppen dieser Art vorliegen können, gehören ein oder mehrere Halogenatome oder Haloalkylgruppen wie soeben beschrieben. Wenn die Kohlenwasserstoffkette in dem hydrophoben Gerüst (2) eine Alkenylen- oder eine Alkinylenkette ist, kann sie mehr als eine ungesättigte Gruppe besitzen.
Geeignete Polyolschwänze sind in der Natur vorkommende Polyole wie z. B. acyclische Zucker und Derivate davon und synthetische Polyole. Zu besonderen Zuckern gehören acyclische Mono- und Oligosaccharide. Zu den Zuckerderivaten gehören acyclische Glykoside, in denen eine nichtionische aliphatische oder heteroaliphatische Gruppe (z. B. von der hier beschriebenen Art) über eine Glykosidbindung mit einem Zucker verbunden ist. Zu acyclischen Monosacchariden gehören z. B. offenkettige Verbindungen, die drei bis acht, z. B. fünf oder sechs Kohlenstoffatome mit mindestens zwei Hydroxylsubstituenten enthalten. Zu acyclischen Oligosacchariden gehören z. B. mindestens zwei offenkettige Monosaccharide wie soeben definiert, die über eine Glykosidbindung verbunden sind. Es kann mehr als eine Art von offenkettigen Monosacchariden vorliegen, um ein Homo- oder Heterooligosaccharid zu bilden.
Alternativ kann die Schwanzeinheit ein Polyalkylenoxid oder ein Derivat davon, wie z. B. Polyethylenoxid, Polypropylenoxid oder Methoxypolyethylenoxid, sein.
Jede Schwanzeinheit kann direkt oder indirekt mit einer Kohlenwasserstoffkette in dem hydrophoben Gerüst (2) verbunden sein. Für eine indirekte Verbindung kann ein Linkeratom oder eine Linkergruppe verwendet werden, z. B. ein Atom oder eine Gruppe L³, wobei L³ wie oben für das Linkeratom oder die Linkergruppe 1¹ definiert ist. Wo die Gruppe L³ multivalent ist, z. B. wenn sie eine verzweigte Alkylenkette ist, die mehr als ein X¹-Atom oder mehr als eine X¹-Gruppe enthält, kann mehr als ein hydrophiler Kohlenwasserstoff daran angehängt sein.
Eine besonders nützliche Gruppe der erfindungsgemäßen Verbindung hat die Formel (1a): [R⁷]_p-(L³)_q-[R⁶]_m-L¹)_n-R² (1a)worin
R², L¹, m und n die für die Formel (1) angegebene Bedeutung haben;
R⁶ für eine Kohlenwasserstoffkette steht;
L³ für ein Linkeratom oder -gruppe steht;
R⁷ für eine Schwanzgruppe steht, die ausgewählt ist unter synthetischen Polyolen, natürlich vorkommenden Polyolen, Poly(alkylenoxiden) und Derivaten davon;
q für Null oder eine ganze Zahl von eins bis sechs steht;
p für eine ganze Zahl von eins bis sechs steht; mit der Maßgabe, dass jede Gruppe R⁷ oder L³, sofern vorliegend, so an eine Gruppe R⁶ gebunden ist, dass ein Abstand von wenigstens zehn kettenverbundenen Atomen entlang R⁶ zwischen R⁷ oder L³ und der Gruppe -(L¹)_n-R² erreicht wird;
und die Salze, Solvate und Hydrate davon.
In den Verbindungen der Formel (1a) kann die durch R⁶ dargestellte Kohlenwasserstoffkette eine C₁₀- bis etwa eine C₆₀-Kohlenwasserstoffkette sein, wie allgemein und insbesondere oben im Hinblick auf die Gruppe R¹ beschrieben. Die Gruppe L³ kann ein Spaceratom oder eine Spacergruppe sein, wie soeben oben definiert.
Der kationische Kopf (1) der erfindungsgemäßen Lipide ist vorzugsweise eine Gruppe R² wie oben im Hinblick auf die Verbindungen der Formel (1) und (1a) beschrieben. In Gruppen dieser Art steht R² vorzugsweise für eine Gruppe -WSp¹[WSp²]_bWSp³ oder -WSp¹[WSp²]_bWH, in denen Sp¹, Sp² und Sp³, die gleich oder verschieden sein können, jeweils eine Spacergruppe wie oben definiert sind, W für ein kationisches Zentrum wie hier definiert steht, b für 0 oder eine ganze Zahl von 1 bis 6 steht.
In besonderen Gruppen dieser Art ist das kationische Zentrum W vorzugsweise eine -NH-Gruppe. Sp¹, Sp² und Sp³, die gleichartig oder verschieden sein können, stehen jeweils vorzugsweise für eine gegebenenfalls substituierte C_1-6-Alkylenkette. b steht vorzugsweise für eine ganze Zahl von zwei bis vier.
Zu den besonders nützlichen kationischen Köpfen (1) der erfindungsgemäßen Verbindungen gehören diejenigen der Formeln -NH[Sp¹NHSp²]NH₂, -NH[Sp¹NHSp²NHSp²]NH₂ oder -NH[Sp¹NHSp²NHSp²]NHCH₃, worin jede Sp¹- und Sp²-Gruppe gleich oder verschieden ist und für eine gegebenenfalls substituierte C_1-6-Alkylenkette steht, insbesondere wobei SP¹ für -CH₂- und jedes Sp² für -(CH₂)₃- oder -(CH₂)₄- steht.
Im Allgemeinen umfasst das hydrophobe Gerüst (2) in den erfindungsgemäßen Lipiden vorzugsweise zwei oder insbesondere eine Kohlenwasserstoffkette wie hier definiert. Somit steht m in den Formeln (1) und (1a) vorzugsweise für eine ganze Zahl 2 oder insbesondere für eine ganze Zahl 1. Jede Kohlenwasserstoffkette, z. B. durch R¹ und R⁶ in den Formeln (1) bzw. (1a) dargestellt, ist vorzugsweise linear und insbesondere eine lineare, gegebenenfalls substituierte C_16-38-Alkylenkette. Gegebenenfalls substituierte C_18-24-Alkylenketten sind besonders nützlich.
Im Allgemeinen ist jede Kohlenwasserstoffkette in dem hydrophoben Gerüst (2) vorzugsweise indirekt durch ein Spaceratom oder eine Spacergruppe mit dem kationischen Kopf (1) verbunden. Das Spaceratom oder die Spacergruppe kann z. B. ein Atom oder eine Gruppe L¹ wie hier definiert, sein und somit ist in den Verbindungen der Formeln (1) und (1a) n z. B. vorzugsweise die ganze Zahl 1.
Zu den bevorzugten Spacern gehören die der Formeln -X¹Alk²- oder -[X¹]₂Alk¹X¹Alk²-, worin X¹, Alk¹ und Alk² wie zuvor definiert sind. Besonders nützliche Spacer dieser Arten sind diejenigen, in denen Alk² für -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅- oder insbesondere eine -(CH₂)₅-Kette steht. X¹ steht in diesen Spacern vorzugsweise für eine -CONH-Gruppe. Wenn vorliegend, ist Alk¹ vorzugsweise eine -CH₂-CH <-Kette.
In einer anderen allgemein bevorzugten Ausführungsform hat jede Kohlenwasserstoffkette in dem Kohlenwasserstoffgerüst (2) zwei oder insbesondere eine daran angehängte Schwanzeinheit. Jede Schwanzeinheit ist vorzugsweise an das terminale Kohlenstoffatom der Kohlenwasserstoffkette distal von dem an den kationischen Kopf (1) angehängten Kettenkohlenstoffatom angehängt. Vorzugsweise sind die hydrophile Kohlenwasserstoff- und die Kohlenwasserstoffkette indirekt durch ein Spaceratom oder eine Spacergruppe verbunden. Somit steht in einer besonders bevorzugten Ausführungsform in Verbindungen der Formel (1a) q für die ganze Zahl 1 und p für die ganze Zahl 1 oder 2.
In Verbindungen dieser Art, und im Allgemeinen kann die Gruppe L³ vorzugsweise ein Atom oder die Gruppe -X¹-, -X¹Alk¹X¹- oder [X¹Alk¹]₂X¹Alk²X¹- sein. Zu besonders nützlichen L³-Gruppen gehören die -NHCO-, -CONH-, -CONH(CH₂)₂NHCO-, oder -[CONH(CH₂)₂-]₂NCO (CH₂)₂CONH-Gruppen.
Besonders nützliche erfindungsgemäße Lipide sind die in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen.
Die erfindungsgemäßen Lipide können grundsätzlich dadurch hergestellt werden, das man in geeignete funktionalisierte kationische Köpfe (1), hydrophobe Kohlenwasserstoffe (2) und hydrophile Schwänze (3) in einer zuvor festgelegten Reihenfolge miteinander koppelt. Standardmäßige chemische Kopplungstechniken können verwendet werden unter Verwendung von Ausgangsmaterialien, die ein oder mehrere aktive funktionelle Gruppen enthalten, wie z. B. Säuren, Thioacide, Anhydride, Säurehalide, Ester, Imide, Aldehyde, Ketone, Alkohole und Amine. Beispielhafte Reaktionen sind in den Beispielen nachfolgend beschrieben zur Herstellung einer Anzahl von erfindungsgemäßen Lipiden. Diese können ohne Weiteres unter Verwendung verschiedener Ausgangsmaterialien angepasst werden, um andere erfindungsgemäße Verbindungen bereitzustellen.
Somit kann in einem allgemeinen Ansatz eine homo- oder heterobifunktionelle Kohlenwasserstoffkette zuerst an einen hydrophilen Schwanz oder an einen kationischen Kopf gekoppelt werden und das resultierende Produkt dann wie notwendig an die restliche Komponente gekoppelt werden, um das erfindungsgemäße Lipid bereitzustellen.
Die homo- oder heterobifunktionelle Kohlenwasserstoffkette kann eine beliebige hier beschriebene Kohlenwasserstoffkette sein, die zwei verschiedene reaktive funktionelle Gruppen der soeben beschriebenen Arten enthält. Besonders nützliche Gruppen umfassen Säuren und Thioacide und reaktive Derivate davon sowie Amine. Diese können verwendet werden, um an Acylierungs- oder Thioacylierungsreaktionen teilzunehmen, um die Kohlenwasserstoffkette an ein Amin oder eine Säure zu koppeln, wie es bei irgendeinem geeigneten hydrophilen Schwanz und/oder kationischen Kopf passt.
Acylierung oder Thioacylierung können unter Verwendung von Standardbedingungen für Reaktionen dieser Art erfolgen. Somit kann die Reaktion z. B. in einem Lösungsmittel, z. B. einem inerten organischen Lösungsmittel, wie z. B. einem Amid, z. B. einem substituierten Amid, wie z. B. Dimethylformamid, einem Ether, z. B. einem cyclischen Ether, wie z. B. Tetrahydrofuran, oder einem halogenierten Kohlenwasserstoff, wie z. B. Dichlormethan, bei einer Temperatur im Bereich von ungefähr Umgebungstemperatur bis zur Rückflusstemperatur, optional in Gegenwart einer Base, wie z. B. eines Amins, z. B. Triethylamin, oder eines cyclischen Amins, wie z. B. von 1,8-Diazabicyclo[5.4.0]undec7-en, Pyridin, Dimethylaminopyridin oder N-Methylmorpholin durchgeführt werden.
Sofern eine Säure verwendet wird, kann die Acetylierung zusätzlich in Gegenwart eines Kondensationsmittels durchgeführt werden, z. B. eines Diimids, wie z. B. 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimid oder N,N'-Dicyclohexylcarbodiimid, vorteilhafterweise in Gegenwart eines Katalysators, wie z. B. einer N-Hydroxyverbindung, z. B. eines N- Hydroxytriazols, wie z. B. 1-Hydroxybenzotriazol oder eines N-Hydroxyimids, wie z. B. N-Hydroxysuccinimid. Alternativ kann die Säure vor der Reaktion mit dem Amin mit einem Chloroformiat, z. B. Ethylchloroformiat, umgesetzt werden.
In der heterobifunktionellen Kohlenwasserstoffkette kann es notwendig sein, dass eine der reaktiven funktionellen Gruppen vor einer Kopplungsreaktion in einer geschützten Form sein muss, um ihre unerwünschte Beteiligung an der Reaktion zu vermeiden. In ähnlicher Weise kann es notwendig sein, dass andere funktionelle Gruppen, wenn sie an der Kohlenwasserstoffkette vorliegen, oder die zur Herstellung des hydrophilen Schwanzes und/oder des kationischen Kopfes verwendeten Zwischenprodukte in einer geschützten Form sind, bevor diese Reagenzien verwendet werden. Herkömmliche Schutzgruppen können in Übereinstimmung mit der üblichen Praxis verwendet werden [siehe z. B. Green, T. W. in "Protective Groups in Organic Synthesis", John Wiley & Sons, 1991 und die darin nachfolgenden Beispiele].
Geeignete heterobifunktionelle Kohlenwasserstoffketten sind entweder bekannte, ohne Weiteres verfügbare Materialien, oder sie können durch Synthese unter Verwendung herkömmlicher Techniken, wie z. B. nachfolgend in den Beispielen beschrieben, erhalten werden. Auf diese Weise kann grundsätzlich eine heterobifunktionelle Kohlenwasserstoffkette jeder beliebigen gewünschten Länge in einer oder mehreren Reaktionen unter Verwendung entsprechend funktionalisierter kürzerer Ketten synthetisiert werden. So kann in einem Beispiel ein kürzerkettiges Aldehyd mit einem kürzerkettigen Phosphoniumsalz umgesetzt werden, um ein längerkettiges Olefin der gewünschten Länge herzustellen. In diesem besonderen Beispiel kann die Reaktion in Gegenwart einer Base, z. B. einer Organometallbase, wie z. B. einer Organolithiumverbindung, eines Hydrides, wie z. B. Natrium- oder Kaliumhydrid oder eines Alkoxids, wie z. B. Natriumalkoxid, z. B. Natriummethoxid, durchgeführt werden. Die Reaktion kann in einem geeigneten Lösungsmittel erfolgen, z. B. in einem polaren aprotischen Lösungsmittel, wie z. B. in einem Alkylsulfoxid, z. B. Dimethylsulfoxid bei niedriger Temperatur, z. B. bei ungefähr 0 °C. Das Ausgangsaldehyd und -phosphoniumsalz können ausgehend von bekannten Alkoholen bzw. Haliden unter Verwendung herkömmlicher Verfahren erhalten werden. Gegebenenfalls kann das oben erhaltene Olefin unter Verwendung von Wasserstoff und einem Katalysator, z. B. dem Peariman-Katalysator, zu der entsprechenden gesättigten Kohlenwasserstoffkette hydrogeniert werden.
Sofern es gewünscht ist, Kohlenwasserstoffketten zu erhalten, die ein oder mehrere Heteroatome oder Heteroatome enthaltende Gruppen enthalten, können diese aus kürzeren Ketten, die funktionelle Gruppen enthalten, die chemisch gekoppelt werden können, synthetisiert werden, z. B. durch Acylierung oder Thioacylierung, wie allgemein oben beschrieben.
Geeignete funktionalisierte hydrophile Schwänze oder kationische Köpfe zur Kopplung an die heterobifunktionelle Kohlenwasserstoffkette sind entweder ohne Weiteres verfügbar oder können aus bekannten Materialien durch herkömmliche Verfahren, wie z. B. die in den nachfolgenden Beispielen beschriebenen synthetisiert werden.
Die vorteilhaften Eigenschaften der erfindungsgemäßen Lipide können unter Verwendung der nachfolgend in den Beispielen beschriebenen Tests im kleinen Maßstab genutzt werden. In diesen kann gezeigt werden, dass die Lipide effizient jede bioaktive Substanz kompaktieren und sich mit der Substanz in wässriger Lösung zu stabilen Komplexen selbstassoziieren, die über weite pH-Wert- und Ionenstärke-Bereiche hinweg assoziiert bleiben, und die die Substanz wirksam in eukaryontische Zellen transportieren.
Es kann somit erwartet werden, dass die Lipide zum Transport bioaktiver Substanzen an Zellen, insbesondere eukaryontische Zellen, in vitro und insbesondere in vivo verwendbar sind. Zur besonderen allgemeinen Verwendung, die die Lipide finden können, gehören somit der Transport bioaktiver Substanzen an Zellen in Kulturen und in der Humanmedizin zum Transport therapeutischer und diagnostischer Mittel oder Mittel, die eine Wirtsimmunreaktion auf ein Vakzin erzeugen können, oder zu anderen immunmodulierenden Zwecken. Die Lipide eignen sich in besonderem Maße zum Transport bioaktiver Polyanionen, insbesondere von Nukleinsäuren, und sind von besonderem Wert zur Modifikation des Genotyps eines Wirtes oder seiner Expression.
Somit stellen wir in einem anderen Aspekt der Erfindung einen Lipidkomplex bereit, der dadurch gekennzeichnet ist, dass er ein erfindungsgemäßes bipolares Lipid assoziiert mit mindestens einer bioaktiven Substanz umfasst.
In den erfindungsgemäßen Komplexen kann jede bioaktive Substanz z. B. ein pharmakologisch aktives Mittel, ein diagnostisches Mittel oder ein beliebiges Mittel, das imstande ist, den Genotyp und/oder Phänotyp einer Zelle zu modifizieren, sein.
Zu besonderen Beispielen solcher Substanzen gehören bioaktive Proteine, Peptide, Polysaccharide, Nukleinsäuren, einschließlich synthetischer Polynukleotide, Oligonukleotide und Derivate davon, Lipide, Glykolipide, Lipoproteine, Lipopolysaccharide und virale, bakterielle, protozoale, zelluläre oder Gewebsfraktionen.
Gegebenenfalls können die erfindungsgemäßen Komplexe zwei oder mehrere erfindungsgemäße bipolare Lipide enthalten. Zu besonders nützlichen Gemischen gehören diejenigen, die zwei oder mehrere bipolare erfindungsgemäße Lipide enthalten, die sich voneinander in der Natur des in jedem von ihnen vorliegenden hydrophilen Schwanzes unterscheiden. Der Anteil jedes Lipids in Komplexen dieser Art kann verändert werden, um Komplexe mit unterschiedlichen physikochemischen Eigenschaften, z. B. Gesamtoberflächenladung und/oder Partikelgröße, zu erhalten, maßgeschneidert für die beabsichtigte Verwendung des Komplexes. Somit kann z. B. in einem vorteilhaften Lipidkomplex, der zwei oder mehrere bipolare Lipide enthält, eines der Lipide einen hydrophilen Schwanz haben, der aus einem Polyalkylenoxid oder Derivat davon, wie hier beschrieben, besteht, während jede der anderen einen hydrophilen Schwanz hat, der aus einem synthetischen oder in der Natur vorkommenden Polyol, wie zuvor beschrieben, besteht. Der Anteil des ersten polyalkylenoxidhaltigen Lipids kann in solchen Komplexen so variiert werden, dass das molare Verhältnis des ersten Lipids zum zweiten und anderen Lipiden von 1:10000 bis 1:1 beträgt, vorzugsweise von ungefähr 1:1000 bis 1:20, insbesondere ungefähr 1:10. Komplexe dieser Arten, insbesondere solche, bei denen das Polyalkylenoxid Polyethylenoxid ist, können erhalten werden, die vorteilhafterweise eine Oberflächenladung von null haben und nicht aggregieren, wenn sie in Lösung gelassen werden, und die überdies imstande sind, eine bioaktive Substanz zu kleinen Partikeln von 150 nm und weniger, insbesondere 100 nm und weniger, insbesondere von ungefähr 80–85 nm zu kompaktieren.
Die erfindungsgemäßen Lipide sind insbesondere zum Transport von Polyanionen in Zellen geeignet, und zu bevorzugten erfindungsgemäßen Lipidkomplexen gehören Lipid-Polyanionen-Komplexe, in denen das Polyanion jede beliebige der oben erwähnten bioaktiven Substanzen mit einer negativen Gesamtladung sein kann. Zu besonderen Polyanionen gehören Nukleinsäuren, z. B. einzel- oder doppelsträngige, zirkuläre oder superspiralisierte DNA oder RNA und Derivate davon. Gegebenenfalls kann die DNA ein Teil einer Struktur, wie z. B. eines Plasmids sein.
Die Lipidkomplexe enthalten im Allgemeinen ein erfindungsgemäßes Lipid und eine bioaktive Substanz in einem Gewichtsverhältnis von ungefähr 0,1:1 bis ungefähr 100:1, z. B. ungefähr 1:1 bis ungefähr 50:1. Die Komplexe können im Flüssigen gebildet werden, indem man anfänglich ein oder mehrere erfindungsgemäße bipolare Lipide und eine bioaktive Substanz miteinander mischt, vorteilhafterweise in wässriger Lösung unter Verwendung herkömmlicher Verfahren. Gegebenenfalls kann das Lösungsmittel entfernt werden, z. B. durch Lyophilisation, um einen soliden Lipidkomplex zu erhalten.
Gegebenenfalls können die Lipidkomplexe dirigierende Lipidkomplexe sein, in denen der Lipidkomplex mit einem oder mehreren, vorzugsweise einem dirigierenden Molekül verbunden ist, und die Erfindung schließt solche Verbünde ein. Das dirigierende Molekül kann z. B. ein Mitglied eines komplementären Bindungspaares sein, dessen anderes Mitglied in einem Säuger, z. B. einem Menschen, oder einem anderen Tier, einem Insekt, einem Mikroorganismus oder einer Pflanze vorliegt, entweder an eine Zellmembran oder andere Zelloberfläche gebunden, oder in löslicher Form und intrazellulär und/oder extrazellulär vorliegend. Somit kann das dirigierende Molekül allgemein ein Peptid, einschließlich eines Glykopeptids sein, ein Polypeptid, ein Protein, einschließlich eines Glykoproteins oder Phosphoproteins, ein Kohlenhydrat, ein Glykolipid, ein Phospholipid, ein Oligonukleotid, ein Polynukleotid oder anderes organisches Molekül, z. B. ein Vitamin, sein, das spezifisch an einen Rezeptor, Liganden, an ein Antigen oder ein anderes in der Natur vorkommendes oder synthetisches organisches Molekül binden kann.
Die Bindungsaffinität des dirigierenden Moleküls für das andere Mitglied des komplementären Paares beträgt mindestens 10^–5 M, vorzugsweise 10^–7 M und größer, z. B. von ungefähr 10^–8 M bis 10^–12 M. Vorzugsweise ist das dirigierende Molekül für das andere Molekül des Paares selektiv und zeigt keine Kreuzreaktivität, obwohl absolute Spezifität nicht essentiell ist. Vorteilhafterweise führt die Interaktion des dirigierenden Moleküls mit seinem Liganden zum Transport des Lipidkomplexes ins Zellinnere. Antikörper und antigenbindende Fragmente und Derivate davon, wie z. B. Fab, Fab' und Einzelketten-F_v-Fragmente bilden eine besondere Klasse geeigneter dirigierender Moleküle. Zweckmäßigerweise ist der Antikörper ein ganzer Antikörper, insbesondere ein IgG-Antikörper, oder ein Fab, Fab' oder Einzelketten-F_v davon. Vorteilhafterweise ist der Antikörper, das Fragment oder Derivat davon ein internalisierender Antikörper, internalisierendes Fragment oder Derivat.
Zu anderen Beispielen geeigneter dirigierender Moleküle gehören antikörpermimetische Moleküle, die durch kombinatorische oder andere synthetische Mittel hergestellt werden; Interferon, z. B. Interferone α, β und γ; die Tumornekrosefaktoren α und β; Interleukine, z. B. die Interleukine 1 bis 15; Chemokine, z. B. MIP-1α, MIP-1β, und RANTES; Wachstumsfaktoren, z. B. PDGF, VEGF, EGF, TGFα, TBFβ, GM-CSF, G-CSF, M-CSF, FGF, IGF, Bombesine, Thrombopoietin, Erythropoietin, Oncostatin und Endothelin 1; Peptidhormone, z. B. LH, FSH, TRH, TSH, ACTH, CRH, PRH, MRH, MSH, Glucagon und Prolactin; Transferrin; Lactoferrin; Angiotensin; Histamin; Insulin; Lectine; Metallproteinasen-Gewebeinhibitoren, z. B. TIMP-1, TIMP-2 und TIMP-3; Apolipoproteine, z. B. Apolipoprotein E; Kinine; und Vitamine, z. B. Folsäure und Vitamin B12. Fragmente oder andere synthetische Analoga dieser Moleküle können verwendet werden, sofern diese die geeignete selektive Bindungswirkung aufnehmen oder besitzen. Die obige Liste ist nicht erschöpfend und kann auf andere in der Natur vorkommende Bindungsmoleküle ausgedehnt werden, darunter z. B. den komplementären Bindungspartner oder ein bindendes Fragment desselben, von jedem der erwähnten, z. B. dem PDGF-Rezeptor, dem VEGF-Rezeptor usw.
In ähnlicher Weise können Adhäsionsmoleküle und ihre Bindungspartner oder bindende Fragmente davon erfindungsgemäß als dirigierende Moleküle verwendet werden. Zu besonderen Beispielen gehören VLA-4, VMAC-1, Fibronectin, LFA-1, MAC-1, ICAM-1, ICAM-2, Lewis X, GMP-140, ELAM-1, S-Lewis X, Fibrinogen, GPIIb/IIIa, CD28, B7, CD40, CD402L, CD4, Laminin, VLA-1, VLA-2, VLA-3 und VLA-6.
Zu anderen Beispielen geeigneter dirigierender Moleküle gehören Monosaccharide und Oligosaccharide wie z. B. Galaktose, Laktose und Mannose.
Das dirigierende Molekül kann in dem dirigierenden Lipidkomplex entweder nichtkovalent assoziiert oder kovalent verbunden mit einem erfindungsgemäßen bipolaren Lipid oder irgendeinem anderen Lipid oder anderen Bestandteilen, die als Bestandteil der Formulierung wie oben beschrieben vorliegen können, vorliegen. Kovalent verbundene dirigierende Lipidkomplexe können durch Kopplung eines dirigierenden Moleküls und eines bipolaren oder anderen Lipids oder anderen Bestandteils, standardmäßige chemische Kopplungstechniken und geeigneter funktioneller Gruppen, die in den Ausgangsmaterialien vorliegen, erhalten werden, z. B. wie oben für die Herstellung der erfindungsgemäßen bipolaren Lipide beschrieben.
Die erfindungsgemäßen Lipidkomplexe, einschließlich von dirigierenden Lipidkomplexen können mit anderen Materialien wie z. B. einem oder mehreren anderen Lipiden oder anderen pharmazeutisch akzeptablen Trägern, Hilfsstoffen oder Verbindungsmitteln formuliert werden, und die Erfindung erstreckt sich auf solche Zusammensetzungen. In diesem Aspekt der Erfindung kann das „andere" Lipid z. B. unter allen anderen bekannten neutralen und/oder kationischen Lipiden ausgewählt sein, z. B. unter den hier in der Einleitung zu dieser Beschreibung beschriebenen ausgewählt, und insbesondere einschließlich von DOPE und anderen Cholesterinderivaten, wie z. B. Cholesterinhemisuccinat. Besonders nützliche Formulierungen dieser Art sind solche, in denen das erfindungsgemäße bipolare Lipid einen Polyalkylenoxidschwanz hat, insbesondere einen Polyethylenoxidschwanz.
Zu besonderen Zusammensetzungen gehören Liposomenformulierungen, die unter Verwendung herkömmlicher Liposomentechnologie hergestellt werden. Ansonsten können die Zusammensetzungen jede beliebige andere Form haben, die für orale, bukkale, parenterale, nasale, lokale oder rektale Verabreichung geeignet ist, oder eine Form, die zur Verabreichung durch Inhalation oder Insufflation geeignet ist.
Zur oralen Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von z. B. Tabletten, Pastillen oder Kapseln haben, die durch herkömmliche Mittel mit pharmazeutisch akzeptablen Hilfsstoffen, wie z. B. Bindemitteln (z. B. prägelatinisierte Maisstärke, Polyvinylpyrrolidon oder Hydroxypropylmethylcellulose); Füllstoffen (z. B. Laktose, mikrokristalline Cellulose oder Kalziumhydrogenphosphat); Schmiermitteln (z. B. Magnesiumstearat, Talk oder Silikat); Zerfallsförderern (z. B. Kartoffelstärke oder Natriumglykollat); oder Feuchthaltemitteln (z. B. Natriumlaurylsulfat) hergestellt werden. Die Tabletten können durch aus dem Stand der Technik bekannte Verfahren beschichtet werden. Flüssige Präparationen zur oralen Verabreichung können die Form von z. B. Lösungen, Sirupen oder Suspensionen haben, oder sie können als Trockenprodukt zur Rekonstitution mit Wasser oder einem anderen geeigneten Exzipienten vor der Verwendung dargeboten werden. Solche flüssigen Präparationen können durch herkömmliche Mittel mit pharmazeutisch akzeptablen Zusatzstoffen hergestellt werden, wie z. B. Suspensionsmitteln, Emulgatoren, nicht wässrigen Exzipienten und Konservierungsmitteln. Die Präparationen können auch Puffersalz, Geschmacksstoffe, Farbstoffe und Süßmittel, wie es passt, enthalten.
Präparationen zur oralen Verabreichung können passenderweise so formuliert werden, dass sie eine kontrollierte Freisetzung des aktiven Inhaltsstoffes ergeben.
Zur bukkalen Verabreichung können die Zusammensetzungen die Form von Tabletten oder Pastillen annehmen, die auf herkömmliche Weise formuliert werden.
Die erfindungsgemäßen Komplexe können zur parenteralen Verabreichung durch Injektion, einschließlich von Bolusinjektion oder Infusion oder partikelvermittelter Injektion, formuliert werden. Formulierungen zur Injektion können in Einzeldosisform, z. B. in Glasampullen, oder Multidosiscontainern, z. B. Glasgefäßen oder einem Gerät, das ein komprimiertes Gas wie z. B. Helium zur partikelvermittelten Verabreichung enthält, dargeboten werden. Die Zusammensetzungen für Bolusinjektion oder Infusion können Formen wie z. B. Suspensionen, Lösungen oder Emulsionen in öligen oder wässrigen Trägerstoffen annehmen, und sie können Formulierungshilfsmittel, wie suspendierende, stabilisierende, konservierende und/oder dispergierende Mittel enthalten. Alternativ kann der Komplex in Pulverform zur Rekonstitution mit einem geeigneten Lösungsmittel, z. B. sterilem pyrogenfreiem Wasser, vor der Verwendung sein. Für die partikelvermittelte Verabreichung kann der Komplex auf Partikel wie z. B. mikroskopische Goldpartikel aufgetragen sein.
Zusätzlich zu den oben beschriebenen Formulierungen können die Komplexe auch als Depotpräparationen formuliert werden. Solche langfristig wirksamen Formulierungen können durch Implantation oder durch intramuskuläre Injektion verabreicht werden.
Zur nasalen Verabreichung oder Verabreichung durch Inhalation können die Komplexe zweckmäßigerweise in Form einer Aerosolspraydarbietung für Druckpakets oder einen Vernebler unter Verwendung eines geeigneten Treibgases, wie z. B. Dichlordifluormethan, Trichlorfluor methan, Dichlortetrafluorethan, Kohlendioxid oder anderer geeigneter Gasgemische abgegeben werden.
Die Komplexe können gegebenenfalls mit einem Paket oder Dosiergerät dargeboten werden, das eine oder mehrere Einzeldosisformen, die den aktiven Inhaltsstoff enthalten, enthalten. Das Paket oder Spendiergerät kann von Verabreichungsanweisungen begleitet sein.
Die Menge des für eine bestimmte Anwendung erforderlichen Lipidkomplexes ist in hohem Maße abhängig von der Natur der zu transportierenden bioaktiven Substanz. Ein anderer wichtiger Faktor schließt die Frage ein, ob der Lipidkomplex zur Verwendung in vitro oder in vivo vorgesehen ist. In letzterem Fall bestimmen der Verabreichungsweg und die jeweils ausgewählte besondere Formulierung, ebenso wie Faktoren wie das Alter und der Zustand des Empfängers die Menge des zu verwendenden Lipidkomplexes. Im Allgemeinen können jedoch ungefähr 50 mg Lipidkomplex pro Kilogramm Körpergewicht verwendet werden.
Die folgenden Beispiele illustrieren die Erfindung. In den Beispielen werden die folgenden Abkürzungen verwendet: THF – Tetrahydrofuran; Bn – Benzyl; DMSO – Dimethylsulfoxid; DMF – Dimethylformamid. IDA – Lithiumdiisopropylamid; Ac – Acetyl; MeOH – Methanol; DCM – Dichlormethan; BOC – t-Butyloxycarbonyl.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen, die in diesen Beispielen hergestellt werden, sind nachfolgend dargestellt und mit (14), (19) und (24) nummeriert; (14) N-(Aminopropylaminobutylaminopropylaminohexyl)-24-(glucuronylamino)tetracosanamid
(19) N-Aminopropylaminobutylaminopropyl-N'-glucuronyl-1,24-diaminotetracosan
(24) N-Aminopropylaminobutylaminopropyl-N'-glucuronyl-1,36-diaminohexatriacontan
(1) 12-Aminododecanolhydrochlorid

NH₂(CH₂)₁₁CH₂OH·HCl

12-Aminododecansäure (21,52 g, 100 mmol) wurde in THF (100 cm³) suspendiert, und es wurde ein Boran-THF-Komplex (500 mmol, 1 M Lösung) zugesetzt. Man ließ die Reaktion über Nacht stehen und löschte sie sorgfältig mit Methanol vor der Entfernung des Lösungsmittels. Die Reste wurden in 1 M HCl (500 cm³) suspendiert, 1 Stunde lang auf 40 °C erhitzt und über Nacht stehen gelassen. Der weiße Feststoff wurde abfiltriert, mit kalter 1 M HCl gewaschen, und das Produkt wurde aus 1 M HCl umkristallisiert. Ausbeute 18,70 g (79 %). Schmelzpunkt: 120 °C Erweichung, 169 °C Verflüssigung.
C₁₂H₂₈N₁O₁Cl·1/5 H₂O benötigt C: 59,70 %, H: 11,86 %, N: 5,80 %. Gefunden: C: 59,65 %, H: 11,82 %, N: 5,76 %. C₁₂H₂₇N₁O₁ benötigt 201. Gefunden: ES+: MH⁺ 202.1 (100%). δ_H(CD₃CO₂D) 3.64 (2H, t, CH₂O), 3.06 (2H, t, NCH₂), 1.73 (2H, m, CH₂CH₂O), 1.57 (2H, m, NCH₂CH₂), 1.2-1.5 (16H, m, CH₂).
(2) 12-(Dibenzylamino)dodecanol

Bn₂N(CH₂)₁₁CH₂OH

Zu 1 (15 g, 63,2 mmol), suspendiert in einem Gemisch von Dichlormethan (150 cm³) und gesättigtem Natriumcarbonat in Wasser (150 cm³) wurde Benzylbromid (33,7 g, 23,5 cm³, 189,6 mmol) langsam zugesetzt. Die Suspension klärte sich, und die Reaktion war nach 4 Stunden vollständig. Man setzte wässrigen Ammoniak (0,880,30 cm³) zu und ließ die Reaktion über Nacht stehen. Die organische Schicht wurde getrocknet (Magnesiumsulfat) und bis zur Trockne eingedampft. Die Rückstände wurden unter Rückfluss in Hexan gelöst und bei –20 °C kristallisiert, was 18,03 g (75 %) ergab.
Schmelzpunkt: 45 °C. C₂₆H₃₉N₁O₁ benötigt C: 81,84 %, H: 10,30 %, N: 3,67 %. Gefunden: C: 81,64 %, H: 10,24 %, N: 3,54 %. C₂₆H₃₉N₁O₁ benötigt 381. Gefunden ES+: MH⁺ 382 (100%). δ_H (CDCl₃) 7.1-7.6 (10 H, m, Ar), 3.64 (2H, t, CH₂O), 3.56 (4H, s, ArCH₂), 2.41 (2H, t, NCH₂), 1.1-1.8 (22H, dm, CH₂).
(3) 12-(Dibenzylamino)dodecanal

Bn₂N(CH₂)₁₁CHO

Zu einer Lösung von wasserfreiem Dimethylsulfoxid (30 mmol, 2,13 cm³) in Dichlormethan (200 cm³) wurde bei –78 °C Oxalylchlorid (2,6 cm³, 30 mmol) in Dichlormethan (60 cm³) vorsichtig zugesetzt. Nach 15 Minuten wurde 2 (10 g, 26 mmol) in Dichlormethan (60 cm³) zugesetzt, und die Reaktion wurde 20 Minuten lang bei –78 °C gerührt. Triethylamin (28 cm³) wurde dem kalten Reaktionsgemisch tropfenweise zugesetzt. Es bildete sich ein Niederschlag, und nach 15 Minuten ließ man die Reaktion Raumtemperatur erreichen. Wasser (100 cm³) wurde dem Reaktionsgemisch zugesetzt, das mit Dichlormethan extrahiert wurde. Die organischen Schichten wurden mit Wasser gewaschen, getrocknet (Magnesiumsulfat) und bis zur Trockne eingedampft. Der Rückstand wurde chromatographisch aufgetrennt (SiO₂, Hexan-10% Ethylacetat in Hexan), was das Produkt als Öl lieferte (7,97 g, 80 %). Diese Verbindung ist instabil und sollte am Tag der Herstellung verwendet werden.
Infrarotspektrum: 1725 cm^–1 (COH). C₂₆H₃₇NO benötigt 379,29. Gefunden: ES+: MH⁺ 380.29. δ_H (CDCl₃) 1.32(14H, br, (CH₂)₇(CH₂)₂N), 1.61 (4H, 2xp, CH₂CH₂N, CH₂CH₂CO), 2.43, 2.44 (4H, 2xt, CH₂N, CH₂CO), 3.60 (4H, s, CH₂Ph), 7.2-7.5 (10H, m, Ph), 9.78 (1H, t, COH). δ_C (CDCl₃) 22.0, 26.9, 27.1, 29.0, 29.3, 29.4, 29.5 (9C, (CH₂)₉CH₂N), 43.8 (1C, CH₂COH), 53.3 (1C, CH₂N), 58.2 (2C, CH₂Ph), 126.6 (2C, CH(CH)₂C), 128.0 (4C, CHC), 128.6 (4C, CHCHC), 140.0 (2C, CCH₂N), 202.3 (1C, COH).
(4) 11-(Carboxyundecyl)triphenylphosphoniumbromid

Ph₃P +-(CH₂)₁₁CO₂H·Br^–

In Acetonitril (12 cm³) suspendierter 12-Bromdodecansäure (3,000 g, 10,7 mmol) wurde Triphenylphosphin (2,818 g, 10,7 mmol) langsam zugesetzt. Die Reaktion wurde auf 100 °C erhitzt (ohne Kondensator), wobei Argon über den Kolben strömte, bis die Reaktion eine Verschmelzung war, dann (mit Kondensator) 24 Stunden lang bei 100 °C gehalten. Die warmen Rückstände wurden in Acetonitril (18 cm³) gelöst und tropfenweise zu schnell gerührtem kaltem (Trockeneis) Diethylether zugesetzt. Das gebildete weiße Präzipitat wurde abfiltriert, und das Phosphoniumsalz wurde getrocknet (5,353 g, 92 %).
Schmelzpunkt: 100–112 °C. C₃₀H₃₈O₂PBr benötigt C: 66,54%, H: 7,0 %. Gefunden: C: 66.42%, H: 7.10%. δ_P (CDCl₃) 24.3 (s). δ_H (CDCl₃) 1.05-1.30 (12 H, br, (CH₂)₆(CH₂)₂CO₂H), 1.53 (6H, br, (CH₂)₂CH₂P, CH₂CH₂CO₂H), 2.28 (2H, t, CH₂CO₂), 3.55 (2H, br, CH₂P), 7.6-7.8 (15H, m, Ph). δ_C (CDCl₃) 22.1, 22.3, 22.8, 24.5, 28.8, 28.9, 30.0, 30.2 (10C, (CH₂)₁₀CO₂H), 34.2 (1 C, CH₂P), 117.3, 118.7 (3 C, CP), 130.3, 130.5 (6C, CHCHCP), 133.3, 133.5 (6C, CHCP), 134.9 (3C, CH(CH)₂CP), 177.4 (1 C, CO₂H).
(5) 24-(Dibenzylamino)-12-tetracosensäure

Bn₂N-(CH₂)₁₁-CH=CH-(CH₂)₁₀-CO₂H

4 (13,52 g, 25 mmol) wurde in trockenem DMSO (40 cm³) unter Argon bei ~0 °C (keine DMSO-Verfestigung) gelöst. 2,2 Äquivalente von 2,0 M IDA (25 cm³) wurden zugesetzt, woraufhin die Lösung sich orangefarbig verfärbte. Man ließ das Reaktionsgemisch 30 Minuten lang bei 0 °C stehen und setzte zu der jetzt dunkelorangefarbigen Lösung eine Lösung von 3 (7,97 g, 21 mmol) in trockenem THF (30 cm³) zu. Man hielt die Lösung 4 Stunden lang bei 0 °C, dann setzte man 2 M HCl (50 cm³) zu. Die wässrige Schicht wurde mit Dichlormethan extrahiert, die Fraktionen wurden vereinigt und getrocknet (MgSO₄), und das Lösungsmittel wurde entfernt, was das Rohmaterial als hellgelbes Gummi ergab. Silikatsäulenchromatographie (30–100 % Ethylacetat in Hexan) ergab das gewünschte Produkt (6,20 g, 53 %) als hellgelbes Gummi.
C₃₈H₅₉NO₂ benötigt 561,46. Gefunden: ES+: MH⁺ 562,53, ES–: (M – H⁺)^– 560.55. δ_H(CDCl₃) 1.26 (30H, br, (CH₂)₈CH₂CH=CHCH₂(CH₂)₇), 1.42-1.72 (4H, m, CH₂CH₂CO₂H, CH₂CH₂N), 2.02 (4 H, dxt, CH₂CH=CHCH₂), 2.34 (2H, t, CH₂CO₂H), 2.46 (2H, t, CH₂N), 3.65 (4H, s, CH₂Ph), 5.36 (2H, t, CH=CH), 7.2-7.4 (10H, m, Ph). δ_C (CDCl₃) 25.0, 26.4, 27.2, 29.3, 29.6 (19C, (CH₂)₁₀CH=CH(CH₂)₉), 34.5 (1C, CH₂CO₂H), 52.9 (1C, CH₂N), 57.7 (2C, CH₂Ph), 127.0 (2C, CH(CH)₂C, 128.2 (4C, CHC), 129.1 (4C, CHCHC), 129.9 (2C, CH=CH), 138.6 (2C, CCH₂N), 179.2 (1C, CO₂H).
(6) 24-Aminotetracosansäure

NH₂(CH₂)₂₃CO₂H

5 (6,2 g) wurde über Nacht in Eisessigsäure unter Verwendung eines Pearlman-Katalysators (10 Gew.-%) unter einer Wasserstoffatmosphäre auf 60 °C erhitzt. Das Reaktionsgemisch wurde durch Glasfaserfilter filtriert und bis zur Trockne eingedampft. Das Produkt wurde aus Essig säure/Äther (4,2 g, 100 %) kristallisiert. Das Produkt wurde einem Hochvakuum ausgesetzt, um Essigsäurespuren zu entfernen.
Schmelzpunkt 151–155 °C. C₂₄H₄₉NO₂·0,75 CH₃CO₂H benötigt: C: 71,44 %, H: 12,23 %, N: 3,27 %. Gefunden: C: 71,43 %, H: 12,15 %, N: 3,26 %. C₂₄H₄₉NO₂ benötigt 383,38. Gefunden ES+: MH⁺ 384,29. δ_H (CD₃OD + TFA) 1,32 (38H, br, (CH₂)₁₉(CH₂)₂NH₂), 1,65 (4H, br, CH₂CH₂NH₂, CH₂CH₂CO₂H), 2,33 (2H, t, CH₂CO₂H), 2,74 (2H, m, CH₂NH₂). δ_C (CD₃OD) + TFA) teilweise 33,8 (1C, CH₂CO₂H), 35,3 (1C, CH₂NH₂). (7) 24-(Glucuronylamino)tetracosansäure
Eine Suspension von 6 (792 mg, 2,064 mmol) 6-Gluconolacton (1,839 g, 10.32 mmol) und 1,8-Diazabicyclo(5.4.0)undecen (DBU) (4,2 g, 30,9 mmol) in trockenem Methanol (90 cm³) wurden ungefähr 10 Minuten lang auf 60 °C erhitzt, bis alle Feststoffe verschwunden waren. Man ließ die Lösung über Nacht bei Raumtemperatur stehen, dann entfernte man das Lösungsmittel. Die Rückstände wurden in Wasser (5 cm³) aufgenommen und mit 1 M HCl auf pH 1 angesäuert, um die gewünschte Verbindung auszufällen. Sie wurde abfiltriert und getrocknet, was einen weißen Feststoff ergab (765 mg, 66 %). Silikat-Dünnschichtchromatographie R_f = 0,35, Ninhydrin negativ (1:1:1 Methanol: Essigsäure: Dichlormethan).
I.R. 1581 cm^–1 (CO₂ ^–), 1639 cm^–1 (CONH). δ_H (DMSO) 1.32 (42 H, br, (CH₂)₂₁CH₂CO₂H), 2.27 (2 H, t, CH₂CO₂H), 3.15 (2 H, m, CH₂N), 3.3-3.8 (4 H, m, CHOH), 4.0-4.1 (2 H, m, CH₂O). (8) 24-(Peracetylglucuronylamino)tetracosansäure
Zu in trockenem Pyridin (20 cm³) gelöstem 7 (765 mg, 1,362 mmol) wurde Essigsäureanhydrid (20 cm³) zugesetzt. Die Lösung wurde über Nacht unter Argon gerührt, und Wasser (50 cm³) wurde langsam zugesetzt. Die Lösung wurde mit Dichlormethan extrahiert, das Dichlormethan wurde dann mit HCl, pH 3 (2 × 20 cm³), und Wasser (5 × 30 cm³) gewaschen. Die organische Schicht wurde getrocknet (MgSO₄) und das Lösungsmittel entfernt, was das pentaacetylierte Produkt als weißen Feststoff ergab (940 mg, 89 %). Aluminium-Dünnschichtchromatographie R_f = 0,15 (15 % Methanol in Dichlormethan).
C₄₀H₆₉NO₁₃ benötigt 771,48. Gefunden: ES+: MH⁺ 772,07, MNa⁺ 794,25. ES^–: (M – H⁺)^– 770.65. δ_H (CDCl₃) 1.26 (33 H, br, (CH₂)₁₉(CH₂)₂CO₂H), 1.64 (4 H, m, CH₂CH₂CO₂H, CH₂CH₂NH), 2.07, 2.11, 2.13, 2.21 (15 H, s, CH₃CO), 2.35 (2 H, t, CH₂CO₂H), 3.24 (2 H, m, CH₂NH), 4.30 (2 H, 2 × dxd, CH₂OAc), 5.05 (1 H, q, CH(OAc)CH₂OAc), 5.32 (1 H, d, CH(OAc)CONH), 5.46 (1 H, t, CH(OAc)CH(OAc) CH₂OAc), 5.70 (1 H, t, CH(OAc)CH(OAc)CONH), 6.42 (1 H, t, NH). δ_C (CDCl₃) 20.4, 24.5, 26.6, 28.8-29.5 (26 C, (CH₂)₂₁CH₂CO₂H, CH₃CO), 33.8 (1 C, CH₂CO₂H), 39.3 (1 C, CH₂NH), 61.3 (1 C, CH₂OAc), 63.5, 68.9, 69.1, 71.5 (4 C, CHOAc), 165.8 (1 C, CONH), 160.0, 169.5, 169.7, 170.4 (5 C, CH₃CO), 178.6 (1 C, CO₂H). (9) N,N'-bis(t-Butyloxycarbonyl)-N-t-butyloxycarbonylaminopropyl-N'-aminopropyl-1,4-diaminobutan
Zu in Methanol (200 cm³) gelöstem Spermin (3,704 g, 18,31 mmol) wurde bei –78 °C Ethyltrifluoracetat (2,601 g, 18,31 mmol) über einen Zeitraum von 30 Minuten hinweg zugegeben. Die Losung wurde weitere 30 Minuten lang bei –78 °C gerührt, dann innerhalb von 1 Stunde auf 0 °C erwärmt. Tert-Butyldicarbonat (15,981 g, 73,23 mmol) wurde dann als Feststoff zugesetzt, man ließ das Gemisch sich innerhalb von 1 Stunde bei Umgebungstemperatur aufwärmen und setzte 2 Stunden später konzentriertes Ammoniumhydroxid (ungefähr 40 cm³) zu, bis ein pH-Wert > 11 erreicht war. Die Reaktion wurde über Nacht bei Umgebungstemperatur gerührt, die Lösungsmittel wurden entfernt und die Rückstände durch Silikatchromatographie (70:10:1 DCM:MeOH:NH₄OH) gereinigt, was das Produkt (4,240 g, 46 %) als hellgelbes Öl ergab.
C₂₅H₅₀N₄O₆ benötigt 502,4. Gefunden: ES+: MH⁺ 503,04. δ_H (CDCl₃) 1,44 (31H, m, C(CH₃)₃, NCH₂(CH₂)₂CH₂N), 1.64 (4H, m, NCH₂CH₂CH₂N), 3.14 (2H, t, CH₂NH₂), 3.0-3.4 (10H, m, CH₂N). (10) N-t-Butyloxycarbonyl-N-[t-butyloxycarbonylaminopropyl(t-butyloxycarbonyl)aminobutyl(t-butyloxycarbonyl)aminopropyl-N,N'-dibenzyl-1,6-diaminohexan
9 (535 mg, 1,064 mmol), 6-(Dibenzylamino)hexanal (286 mg, 0,968 mmol) (wie für 3 aus 6-Aminohexanol synthetisiert) und Na₂SO₄ wurden über Nacht in wasserfreiem Methanol (50 cm³) bei Umgebungstemperatur unter Argon gerührt. Der filtrierten Reaktionslösung wurde Natriumtriacetoxyborhydrid (410 mg, 1,94 mmol) zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde 3 Stunden stehen gelassen, zu welchem Zeitpunkt Wasser (0,5 cm³) zugesetzt und das Reaktionsgemisch über Nacht stehen gelassen wurde, um überschüssiges Reduktionsmittel zu löschen. Der Reaktion wurden tert-Butylcarbonat (633 mg, 2,903 mmol) und Triethylamin (490 mg, 4,838 mmol) zugesetzt, und die Reaktion wurde 3 Stunden lang stehen gelassen. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und die Rückstände wurden durch Silikatsäulenchromatographie gereinigt, wobei Elution mit 25–50 % Ethylacetat in Hexan den gewünschten Inhaltsstoff (311 g, 36 %) als farbloses Gummi ergab.
C₅₀H₈₂N₅O₈ benötigt 881,6. Gefunden: ES+: MH⁺ 882,5, δ_H (CDCL₃) 1,1-1,8 (52H, m, (CH₃)₃C, Bn₂NCH2(CH₂)₄, CH₂CH₂N), 2.39 (2H, t, Bn₂NCH₂), 3.0-3.4 (14H, br, CH₂N), 3.54 (4H, s, CH₂Ph), 7.2-7.4 (10H, m, Ph). (11) N-t-Butyloxycarbonyl-N-[t-butyloxycarbonylaminopropyl(t-butyloxycarbonyl)aminobutyl(t-butyloxycarbonyl)aminopropyl-1,6-diaminohexan
Zu 10 (311 mg) in tert-Butanol wurde Pearlmans Katalysator (100 mg) bei 40 °C zugesetzt, und die Atmosphäre wurde auf Wasserstoff geändert. Man ließ den Hydrogenierungsansatz zwei Tage lang bei 40 °C stehen, filtrierte den Katalysator ab und entfernte das Lösungsmittel. Die Rückstände wurden durch Silikatchromatographie gereinigt, wobei anfänglich mit 100:10:0 DCM:MeOH:NH₄OH eluiert wurde, um die Verunreinigung zu entfernen, dann mit 100:10:1, um das gewünschte primäre Amin als farbloses klares Öl (163 mg, 66 %) abzulösen.
C₃₆H₇₁N₅O₈ benötigt 701,5. Gefunden: ES+: MH⁺ 702,4, δ_H (CDCl₃) 1,2-1,8 (52H, m, (CH₃)₃C, H₂NCH₂(CH₂)₄, CH₂CH₂N), 2.88 (2H, br, CH₂NH₂), 3.0-3.4 (14H, m, CH₂N). (12) N-(t-Butyloxycarbonylaminopropyl(t-butyloxycarbonyl)aminobutyl(t-butyloxycarbonyl)aminopropyl(t-butyloxycarbonyl)aminohexyl]-24-(peracetylglucuronylamino)tetracosanamid
Zu 8 (96 mg, 0,125 mmol) in wasserfreiem Dichlormethan (10 cm³) wurde 1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidhydrochlorid (48 mg, 0,250 mmol) und N-Hydroxysuccinimid (22 mg, 0,187 mmol) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde über Nacht stehen gelassen. Dann wurden hierzu 11 (92 mg, 0,131 mmol) und Triethylamin (63 mg, 0,624 mmol) zugesetzt, das Reaktionsgemisch wurde erneut über Nacht stehen gelassen. Die Lösungsmittel wurden entfernt und die Rückstände durch Silikatgradientenchromatographie gereinigt, wobei Flution mit 50–70 % Ethylacetat in Hexan das Produkt (157 mg, 86 %) als weißen Feststoff ergab.
δ_H (CDCl₃)^– 1.24 (44H, br, (CH₂)₂₀CH₂CO, N(CH₂)₂(CH₂)₂(CH₂)₂N), 1.44 (50H, br+m, (CH₃)₃C, CH₂CH₂N), 2.04-2.20 (15H, 5xs, CH₃CO), 2.29 (2H, t, CH₂CO), 3.0-3.4 (18H, m, NCH₂), 4.12, 4.31 (2H, m, CH₂OAc), 5.05 (1H, m, CHCH₂OAc), 5.29 (1H, d, NHCOCHOAc), 5.44, 5.67 (2H, 2xt, AcOCH₂CHOAc(CHOAc)₂), 6.06 (2H, br, NHCO). (13) N-(t-Butyloxycarbonylaminopropyl(t-butyloxycarbonyl)aminobutyl(t-butyloxycarbonyl)aminopropyl(t-butyloxycarbonyl)aminohexyl]-24-(glucuronylamino)tetracosanamid
Zu in Methanol (10 cm³) gelöstem 12 (156 mg) wurde langsam unter Rühren NH₄OH (4 cm³) zugesetzt, bis die Lösung anfing, wolkig zu werden. Nach ungefähr 20 Minuten wurden weitere 3 cm³ Methanol zugesetzt, um einen Teil des sich bildenden weißen Präzipitats zu lösen. Die Lösung/Suspension wurde insgesamt eine Stunde lang gerührt, zu welchem Zeitpunkt alle Lösungsmittel entfernt wurden. Die Rückstände wurden durch Reversphasenchromatographie gereinigt, wobei Flution mit 2:6:1 CH₂Cl₂:MeOH:Na₄OH einen farblosen Feststoff ergab (123 mg, 92 %).
C₆₆H₁₂₈N₆O₁₅ benötigt 1244,9. Gefunden: ES+: MNa⁺ 1267,8, δ_H (CD₃OD) 1,28 (44H, br, NH(CH₂)₂(CH₂)₂₀, N(CH₂)₂(CH₂)₂(CH₂)₂N), 1.4-1.9 (50H, brm, (CH₃)₃C, CH₂CH₂N), 2.16 (2H, t, CH₂CO), 3.0-3.4 (18H, m, CH₂N), 3.6-3.9 (4H, m, CHOH), 4.09, 4.19 (2H, 2xm, CH₂OH). (14) N-(Aminopropylaminobutylaminopropylaminohexyl)-24-(glucuronylamino)tetracosanamid
13 (120 mg) wurde mit 96:4 Trifluoressigsäure:Wasser 20 Minuten lang behandelt, dann wurden die Lösungsmittel entfernt, was einen Feststoff ergab, der in Wasser aufgenommen wurde, durch einen 0,2 μm-Polypropylenfilter filtriert und gefriergetrocknet wurde, was das Produkt in quantitativer Ausbeute als weißen Feststoff ergab.
C₄₆H₉₆N₆O₇ benötigt 844,7. Gefunden: ES+: MH₂ ²⁺ 423,5. δ_H (CD₃OD) 1,28 (44H, m, (CH₂)₂₀CH₂CO, N(CH₂)₂(CH₂)₂(CH₂)₂N), 1.5-1.8 (6H, m, CH₂CH₂N), 1.81 (4H, m, NCH₂(CH₂)₂CH₂N), 2.10 (2H, m, CH₂CO), 2.16 (4H, m, NCH₂CH₂CH₂N), 2.95-3.30 (18H, m, NCH₂), 3.55-3.80 (4H, m, CHOH), 4.03, 4.20 (2H, 2xm, CH₂OH). (15) 23-Azido-1-(1,3-dioxalan-2-yl)tricosa-11-en
Zu 23-Chlor-1-(1,3-dioxalan-2-yl)tricosa-11-en (7,7 g, 16,3 mmol) (durch Wittig-Kopplung von 12-Chlordodecanal mit dem Triphenylphosphoniumsalz seines Acetals unter Verwendung von 1 Äquivalent IDA in THF bei 0 °C synthetisiert) in DMF (120 cm³) wurde Natriumazid (7,4 g, 113,8 mmol) zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur unter Argon gerührt. Das Lösungsmittel wurde auf ungefähr 20 cm³ verringert, und Wasser (50 cm³) wurde zugesetzt. Die Lösung wurde mit Hexan extrahiert, getrocknet (MgSO₄), das Lösungsmittel wurde entfernt, was einen wachsartigen Feststoff ergab (7,023 g, 99 %).
δ_H (CDCl₃) 1,27 (32H, m, N₃(CH₂)₂(CH₂)₈CH₂CH=CHCH₂(CH₂)₈), 1,60 (4H, m, CH₂CH₂N₃, CH₂CHO), 2,00 (4H, m, CH₂CH=), 3,25 (2H, t, CH₂N₃;), 3,83, 3,96 (4H, 2xm, OCH₂), 4,84 (1H, t, CHO), 5,34 (2H, m, CH=CH). (16) N-Azidotetracos-12-enyl(t-butyloxycarbonyl)aminopropyl-N,N'-bis(t-butyloxycarbonyl)-N'-t-butyloxycarbonylaminopropyl-1,4-diaminobutan
Einer schnell gerührten Suspension von Silikat (100 cm³) und 40 % Dichlormethan in Hexan (100 cm³) wurde Tosinsäure (1 g) in Wasser (3 cm³) langsam zugesetzt. Die Suspension wurde 10 Minuten lang gerührt und verwendet, um eine Säule zu füllen. Nach dem Waschen der Säule mit 40 % Dichlormethan in Hexan wurde 15 (537 mg) aufgetragen und über 2 Stunden hinweg langsam mit 40 % Dichlormethan in Hexan eluiert, was das Aldehyd (464 mg, 96 %) als farbloses Öl ergab. Zu diesem Aldehyd (464 mg, 1,185 mmol) und 9 (655 mg, 1,303 mmol), in wasserfreiem THF (40 cm³) gelöst, wurden Na₂SO₄, Essigsäure (20 μl) und Natriumtriacetoxyborhydrid (377 mg, 1,77 mmol) zugesetzt, und die Reaktion wurde über Nacht unter Argon gelassen. Alle Feststoffe wurden abfiltriert, das Lösungsmittel wurde entfernt, und die Rückstände wurden in Dichlormethan aufgenommen. Die Lösung wurde gewaschen (KOH₍ _aq ₎), getrocknet (MgSO₄) und auf ungefähr 30 cm³ eingeengt. Dieser Lösung wurde tert-Butyldicarbonat (388 mg, 1,77 mmol) zugesetzt, und die Reaktion wurde über Nacht stehen gelassen. Das Lösungsmittel wurde entfernt und die Rückstände wurden durch Gradientensilikatchromatographie (20–40 % Ethylacetat in Hexan) gereinigt, was das gewünschte Produkt (352 MG; 30 %) als farbloses Gummi ergab.
C₅₄H₁₀₃N₇O₈ benötigt 977,8. Gefunden: ES⁺: MH⁺ 978,7. δ_H (CDCl₃) 1,26 (34H, m, (CH₂)₈CH₂CH=CHCH₂(CH₂)₉), 1.44 (40H, m, (CH₃)₃C, NCH₂(CH₂)₂CH₂N), 1.55-1.80 (6H, m, CH₂CH₂N₃, NCH₂CH₂CH₂N), 2.03 (4H, m, CH₂CH=), 3.05-3.40 (14H, m, NCH₂), 3.24 (2H, t, CH₂N₃), 5.34 (4H, m, CH=CH). (17) N-t-Butyloxycarbonyl-N-(t-butyloxycarbonylaminopropyl(t-butyloxycarbonyl)aminobutyl(t-butyloxycarbonyl)aminopropyl-1,24-diaminotetracosan
Zu 16 (204 mg), in t-Butanol (20 cm³) gelöst, wurde 10 % Palladium auf Aktivkohle (40 mg) bei 40 °C zugesetzt, und die Atmosphäre wurde auf Wasserstoff umgestellt. Die Hydrogenierungs reaktion wurde 3 Tage lange bei 40 °C gehalten, der Katalysator wurde abfiltriert und das Lösungsmittel entfernt. Die Rückstände wurde durch Silikatsäulenchromatographie unter Flution mit 10 % Methanol in Dichlormethan zur Entfernung von Unreinheiten, gefolgt von 90:10:1 DCM:MeOH:NH₄OH zur Ablösung des gewünschten Amins als farbloses Gummi (61 mg, 31 %), gereinigt.
C₅₄H₁₀₇N₅O₈ benötigt 953,8. Gefunden: ES⁺: MH⁺ 954,6. δ_H (CDCl₃) 1,24 (4214, br, (CH₂)₂₁CH₂NH₂), 1.43 (42H, br, (CH₃)₃C, NCH₂(CH₂)₂CH₂N, CH₂(CH₂)₂₂NH₂), 1.70 (4H, m, NCH₂CH₂CH₂N), 2.70 (2H, t, CH₂NH₂), 3.0-3.4 (14H, brm, CH₂N), 5.35 (1H, b r, CONH). (18) N-t-Butyloxycarbonyl-N-(t-butyloxycarbonylaminopropyl(t-butyloxycarbonyl)aminobutyl(t-butyloxycarbonyl)aminopropyl-N'-glucuronyl-1,24-diaminotetracosan
Zu 17 (62 mg, 0,065 mmol) in wasserfreiem Methanol (8 cm³) wurden 6-Gluconolacton (17 mg, 0,097) und Triethylamin (26 mg, 0,260 mmol) zugesetzt, und das Reaktionsgemisch wurde über Nacht unter Argon bei Raumtemperatur gerührt. Die Lösungsmittel wurden entfernt und die Rückstände durch Reversphasenchromatographie gereinigt, wobei mit 2:6:1 DCM:MeOH:H₂O eluiert wurde, was das Produkt (32 mg, 43 %) als weißen Feststoff ergab.
C₆₀H₁₁₇N₅O₁₄ benötigt 1131,9. Gefunden: ES⁺: MH⁺ 1132,8. δ_H (CDCl₃) 1,25 (40H, br, N(CH₂)₂(CH₂)₂₀), 1.44 (40H, br, (CH₃)₃C, CH₂CH₂CO, NCH₂CH₂(CH₂)₂₀CH₂CH₂N), 1.6-1.8 (8H, m, NCH₂CH₂CH₂N, NCH₂(CH₂)₂CH₂N), 3.0-3.4 (16H, brm, NCH₂), 3.80 (4H, br, CHOH), 4.1, 4.3 (2H, 2xbr, CH₂OH), 5.37 (1H, br, NHCO₂), 7.22 (1H, br, NHCO). (19) N-Aminopropylaminobutylaminopropyl-N-glucuronyl-1,24-diaminotetracosan
18 (32 mg) wurde wie bei der Synthese von 14 behandelt, was das Produkt in quantitativer Ausbeute als weißen Feststoff ergab.
C₄₀H₈₅N₅O₆ benötigt 731,7. Gefunden: ES⁺: MH⁺ 732,6, MH₂ ²⁺, 367,0. δ_H (CD₃OD) 1.28 (40H, br, NH(CH₂)₂(CH₂)₂₀), 1.53 (2H, p, CONHCH₂CH₂), 1.69 (2H, p, (CH₂)₂₂CH₂CH₂NHCH₂), 1.81 (4H, m, NCH₂(CH₂)₂CH₂N), 2.10 (4H, m, NCH₂CH₂CH₂N), 2.9-3.3 (16H, m, CH₂N), 3.55-3.85 (4H, m, CHOH), 4.09, 4.20 (2H, 2xm, CH₂OH). (20) 35-Azido-1-(1,3-dioxalan-2-yl)pentatriaconta-11,23-dien
Zu 35-Chlor-1-(1,3-dioxalan-2-yl)pentatriaconta-11,23-dien (1,602 g, 2,690 mmol) (synthetisiert durch Wittig-Kopplung von 12-Chlordodecanal mit dem Triphenylphosphoniumsalz von 23-Chlor-1-(1,3-dioxalan-2-yl)tricosa-11-en unter Verwendung von 1 Äquivalent IDA in THF bei 0 °C) in wasserfreiem DMF (70 cm³) wurde Natriumazid (1,224 g, 18,83 mmol) zugesetzt, und die Reaktion wurde 5 Tage lang unter Argon auf 50 °C erhitzt. Das Lösungsmittel wurde bis fast zur Trockne entfernt, und der Rückstand wurde in Wasser (150 cm³) und Ethylacetat (150 cm³) aufgenommen. Die wässrige Schicht wurde mit Ethylacetat (4 × 150 cm³) extrahiert, die Fraktionen wurden vereinigt, gewaschen (2 × 150 cm³ Wasser), getrocknet (MgSO₄), und das Lösungsmittel wurde entfernt, was das Azid quantitativ als hellgelben wachsartigen Feststoff ergab.
C₃₈H₇₁N₃O₂ benötigt 601,6. Gefunden: ES⁺: MNH₄ ⁺, 619,6. δ_H (CDCl₃) 1,27 (48H, br, N₃(CH₂)₂(CH₂)₈CH₂CH=CHCH₂(CH₂)₈CH₂CH=CHCH₂(CH₂)₈), 1.61 (4H, m, CH₂CH, CH₂CH₂N₃), 2.00 (8H, m, CH₂CH=), 3.25 (2H, t, CH₂N₃), 3.8-4.05(4H, m, CH₂O), 4.84 (1H, t, CH), 5.34 (4H, m, CH=CH). (21) N-Azidohexatriaconta-12,24-dienyl(t-butyloxycarbonyl)aminopropyl-N,N-bis(t-butyloxycarbonyl)-N'-t-butyloxycarbonylaminopropyl-1,4-diaminobutan
Einer schnell gerührten Suspension von Silikat (200 cm³) und 50 % Dichlormethan in Hexan (200 cm³) wurde Tosinsäure (2 g) in Wasser (6 cm³) langsam zugesetzt. Die Suspension wurde 10 Minuten lang gerührt und verwendet, um eine Säule zu füllen. Nach dem Waschen der Säule mit 50 % Dichlormethan in Hexan wurde 20 (998 mg) aufgetragen und über 2 Stunden hinweg langsam mit 50 Dichlormethan in Hexan eluiert, was das Aldehyd (591 mg, 65 %) als farbloses Öl ergab. Zu diesem Aldehyd (591 mg, 1,059 mmol) und 9 (559 mg, 1,112 mmol), in wasserfreiem 30:70 MeOH:DCM (30 cm³) gelöst, wurde Na₂SO₄ mmol zugesetzt, und die Reaktion wurde über Nacht unter Rückfluss erhitzt. Natriumtriacetoxyborhydrid (449 mg, 2,118 mmol) wurde zugesetzt, und die Reaktion wurde 4 Stunden lang stehen gelassen. Das Trocknungsmittel wurde entfernt, Wasser (1 cm³) wurde zugesetzt, die Reaktion wurde über Nacht stehen gelassen. t-Butyldicarbonat (694 mg, 3,178 mmol) und Triethylamin (536 mg, 5,296 mmol) wurden zugesetzt, und die Reaktion wurde wiederum über Nacht stehen gelassen. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und die Rückstände wurden durch Gradientensilikatchromatographie gereinigt, wobei mit 20–40 % Ethylacetat in Hexan eluiert wurde, was das Produkt (226 mg, 19 %) als farbloses Gummi ergab.
C₆₆H₁₂₅N₇O₈ benötigt 1144,0. Gefunden: ES⁺: MNa⁺, 1166,8. δ_H (CDCl₃) 1.27 (50H, br, N₃CH₂(CH₂)₉CH₂CH=CHCH₂(CH₂)₈CH₂CH=CHCH₂(CH₂)₈), 1.4-1.9 (46H, m, (CH₃)₃C, CH₂CH₂N), 2.0 (8H, m, CH₂CH=), 3.05-3.4 (14H, m, CH₂N), 3.24 (2H, t, CH₂N₃), 5.34 (4H, m, CH=). (22) N-t-Butyloxycarbonyl)-N-[t-butyloxycarbonylaminopropyl(t-butyloxycarbonyl)aminobutyl(t-butyloxycarbonyl)aminopropyl]-1,36-diaminohexatriacontan
Zu 21 (220 mg), in tert-Butanol gelöst, wurde 10 % Palladium auf Aktivkohle (60 mg) bei 40 °C zugesetzt, und die Atmosphäre wurde auf Wasserstoff umgestellt. Die Hydrogenierungsreaktion wurde zwei Tage lang stehen gelassen, der Katalysator wurde abfiltriert, das Lösemittel entfernt, die Rückstände wurden durch Silikatchromatographie gereinigt, wobei mit 100:10 Dichlormethan: Methanol, dann mit 100:10:1 Dichlormethan:Methanol:NH₄OH eluiert wurde, was das Produkt (147 mg, 68 %) als farbloses Gummi ergab.
C₆₆H₁₃₁N₅O₈ benötigt 1122,0. Gefunden: ES⁺: MH⁺, 1122,9. δ_H (CDCl₃) 1,25 (64H, br s, (CH₂)₃₂(CH₂)₂NH₂), 1.4-1.8 (48H, br s, (CH₃)₃C, CH₂CH₂N), 2.83 (2H, t, CH₂NH₂), 3.0-3.4 (14H, br, CH₂N). (23) N-t-Butyloxycarbonyl)-N-[t-butyloxycarbonylaminopropyl(t-butyloxycarbonyl)aminobutyl(t-butyloxycarbonyl)aminopropyl]-N'-glucuronyl-1,36-diaminohexatriacontan
Zu 22 (130 mg, 0,116 mmol) in wasserfreiem Methanol (8 cm³) wurde bei 40 °C unter Argon Triethylamin (47 mg, 0,463 mmol) und δ-Gluconolacton (62 mg, 0,347 mmol) zugesetzt, und die Reaktion wurde über Nacht stehen gelassen. Das Lösungsmittel wurde entfernt, und die Rückstände wurden durch Gradienten-Reversphasenchromatographie gereinigt, wobei die Elution mit 2:6:1 bis 2:6:0,25 Dichlormethan:Methanol:Wasser das Produkt als farblosen Feststoff (83 mg, 55 %) ergab.
C₇₂H₁₄₁N₅O₁₄ benötigt 1300,0. Gefunden: ES⁺: MNa⁺, 1323,0. δ_H (CDCl₃) 1.25 (64H, br, N(CH₂)₂(CH₂)₃₂), 1.35-1.80 (48H, br m, CH₂CH₂N, (CH₃)₃C), 3.0-3.4 (16H, br m, NCH₂), 3.55-4.0 (4H, br, CHOR), 4.20, 4.45 (2H, 2xbr, CH₂OH), 5.28 (1H, br, NHCO₂), 7.78 (1H, br, CONH(CH₂)₃₆). (24) N-Aminopropylaminobutylaminopropyl-N-glucuronyl-1,36-diaminohexatriacontan
23 (83 mg) wurden wie bei der Synthese von 14 behandelt, was das Produkt quantitativ als weißen Feststoff ergab.
C₅₂H₁₀₉₁N₅O₆ benötigt 899,8. Gefunden: ES⁺: MH⁺, 900,9. δ_H (CD₃OD) 0,8-2.2 (76H, br, (CH₂)₃₂(CH₂)₂N, CH₂CH₂N), 2.8-3.4 (16H, br, CH₂N), 3.5-3.9 (4H, br, CHOH), 4.08, 4.20 (2H, 2xbr, CH₂OH).
Die vorteilhaften Eigenschaften der erfindungsgemäßen Lipide können in den folgenden Tests demonstriert werden:
PRONASE- und DNAse-Behandlung
Eines der letztendlichen Ziele der gegenwärtigen Gentherapieforschung ist es, ein Transportsystem zu entwickeln, das in vivo stabil und effektiv bleibt, da dies die Notwendigkeit teurer und zeitaufwändiger Ex-vivo-Manipulationen überwinden würde. Da die intravenöse Verabreichung die Möglichkeit eines Transportes zu der größten Anzahl von Gewebestellen eröffnet, könnte das Überleben des Gen-Transportkomplexes in der Gegenwart von Serum ein wichtiges Merkmal jeder wirksamen Technologie sein. Viele publizierte Untersuchungen haben die Empfindlichkeit von Gen-Transportkomplexen gegenüber Inaktivierung durch Serum selbst bei Spiegeln von nicht mehr als 10 % gezeigt. Dieser Effekt ist zumindest teilweise eine Wirkung der Destabilisierung der Komplexe durch einen schlecht verstandenen Mechanismus, und dies kann zu Abbau der DNA in dem Komplex durch serumassoziierte Nukleasen führen. Wir haben daher Komplexe zwischen den erfindungsgemäßen Lipiden und Plasmid-DNA gebildet und diese einer Behandlung gereinigter DNAse und Pronase, ebenso wie mit 50 %igem Kälberserum unterzogen. Die Integrität der Plasmid-DNA wurde dann gemessen.
Verfahren
Plasmid-DNA (pEGlacZ) wurde mit einer Konzentration von 120 μg/ml in Wasser hergestellt. Ein erfindungsgemäßes Lipid [z. B. das im obigen Beispiel beschriebene Hexamin H18] wurde in einem Konzentrationsbereich hergestellt, so dass Lipid:DNA-Verhältnisse von 0,25:1, 1:1, 2:1, 4:1, 8:1 erreicht wurden (beruhend auf der Annahme, dass DNA mit 120 μg/ml 0,387 mmol negativer Ladung entspricht, und dass das Hexamin H18 bei z. B. 10 mg/ml äquivalent mit 36,23 mmol positiver Ladung ist). Ein gleiches DNA-Volumen wurde tropfenweise zu einem das Lipid in Wasser enthaltenden Vortexröhrchen zugesetzt. Zur Behandlung mit DNAse wurde DNAse I (FPLCpure, Pharmacia) mit einer Konzentration von 1 Einheit/1 μg DNA zugesetzt, und die Röhrchen wurden 10 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Um weitere Wirkung der DNAse zu inhibieren, wurde EGTA mit einer Konzentration von 25 mmol zugesetzt. Zur Pronasebehandlung wurde Protease XIV (Sigma) den Proben mit einer Endkonzentration von 150 μg/ml zugesetzt, die Proben wurden 30 Minuten lang bei 37 °C inkubiert. Die Komplexe wurden in 0,5 % SDS durch 20minütige Inkubation bei 55 °C aufgebrochen. Die Serumbehandlung umfasste Inkubation der Proben in Gegenwart von fötalem Rinderserum (Endkonzentration) bei 37 °C über einen Zeitraum von 30 Minuten. EGTA wurde zu einer Endkonzentration von 50 mmol in einem Versuch, die anschließende Wirkung serumassoziierter Nukleasen zu verhindern, zugesetzt. Schließlich wurden alle Proben durch Elektrophorese auf 0,8 %igen Agarosegelen analysiert.
Ergebnisse
Die Analyse der Beweglichkeit der Plasmid-DNA durch Gele zeigte, dass mit steigender Lipidmenge die DNA dazu neigte, in den Auftragungsvertiefungen zurückgehalten zu werden. Somit drang z. B. bei einem Ladungsverhältnis von 2:1 (H18:DNA), keine DNA in das Gel ein, und bei höheren Verhältnissen war die Plasmid-DNA durch Ethidiumbromidfluoreszenz (siehe unten) nicht mehr sichtbar, was vermuten ließ, dass die DNA vollständig kondensiert wurde. Die H18/DNA-Kondensate waren gegenüber Pronasebehandlung resistent. Weiterhin war mit H18 beim Ladungsfeld zumindest 2:1 kondensierte DNA gegenüber DNAse-behandelter resistent. Bei Ladungsverhältnissen von 2:1 oder höher führte Zusatz von Serum auf 50 % nicht zu einer Steigerung der Menge des DNA-Abbaus, was vermuten lässt, dass die erfindungsgemäßen Lipide im Serum stabilisiert sind.
PHYSIKOCHEMISCHE ASSAYS
Zwei physikochemische Assays können verwendet werden, um die Fähigkeit der erfindungsgemäßen Lipide, superspiralisierte DNA zu kompaktieren, zu messen und die Stabilität der kondensierten Partikel zu bestimmen.
Assay 1
Der erste Assay umfasst die Verwendung von Ethidiumbromid, eines Moleküls, das fluoresziert, wenn es in die DNA-Helix interkaliert. DNA und eine ein erfindungsgemäßes Lipid enthaltende Lösung werden hergestellt, so dass das Ladungsverhältnis zwischen den negativ geladenen Phosphatgruppen der DNA und den positiv geladenen Polyaminen der Lipide zwischen null und drei variiert (siehe die „Verfahren" im vorhergehenden Abschnitt). Nachdem Ethidiumbromid zu der Lösung zugesetzt worden ist, wird der Fluoreszenzwert gemessen. Mit auf neutrale Ladung hin wachsendem Ladungsverhältnis gibt es in Folge der steigenden Mengen an vorliegenden Lipiden eine progressive Abnahme der Fluoreszenz des Ethidiumbromids, wenn dieses Molekül von der DNA-Verbindung ausgeschlossen wird, während die Kompaktion erfolgt. Der Punkt, an dem die Kompaktion vollständig ist, entspricht dem Punkt, an dem der Fluoreszenzwert ein konstantes Minimum erreicht. Im Fall der erfindungsgemäßen Lipide wird das Fluoreszenzminimum bei Ladungsverhältnissen von Lipid zu DNA im Bereich von 0,8 bis 2,5 erreicht. Dieses Assay wurde verwendet, um zu zeigen, dass die Lipide unter physiologischen Salzbedingungen (150 mmol NaCl) und unter sauren Bedingungen bis hinab zu einem pH-Wert von 3,0 zur Kompaktion befähigt sind. Ein Wiederholungsversuch zeigt auch, dass die kompaktierten DNA-Partikel über viele Stunden hinweg sowohl unter physiologischen Salzbedingungen als auch unter niedrigen pH-Werten stabil sind.
Assay 2
Das zweite Assay umfasst Gelelektrophorese unter Verwendung von Ethidiumbromid als Färbung. Lipid- und DNA-Proben werden wie zuvor beschrieben hergestellt und auf verschiedene Spuren auf ein Polyacrylamidgel aufgetragen. nach der Elektrophorese wird der Fluoroszenzwert jeder Spur bestimmt. Zwei Effekte werden beobachtet. Erstens: mit in Richtung der Neutralität steigendem Ladungsverhältnis verringert sich die Entfernung, über die der DNA-Lipid-Komplex sich durch das Gel bewegt progressiv. Dies ist ein Ergebnis zweier physikalischer Prozesse: Kompaktion, die die DNA weniger leicht imstande macht, sich durch das viskose Gel zu be wegen, und Neutralisation der negativen Ladung der DNA, die die elektrostatische Attraktion zwischen dem Komplex und der Kathode verringert. Zweitens wird mit einem Anstieg des Ladungsverhältnisses über die Neutralität hinaus das Leuchten der Fluoreszenzantwort verringert, da die Ethidiumbromidfärbung aus der DNA-Helix ausgeschlossen wird. Dieses Assay wurde verwendet, um zu bestätigen, dass die erfindungsgemäßen Lipide eine Kompaktion der DNA in Übereinstimmung mit der Theorie im Bereich der Ladungsneutralität verursachen.
TRANSFEKTION VON SÄUGERZELLEN MIT LIPIDKONDENSIERTEN DNA-KOMPLEXEN
DNA-Kondensierung
Plasmid-DNA (pEGlacZ) wurde in Konzentrationen von typischerweise 60 oder 120 μg/ml in Wasser hergestellt. Erfindungsgemäße Lipidlösungen wurden in Wasser über einen Konzentrationsbereich (typischerweise 30 bis 960 μg/ml) hergestellt. Während das Röhrchen auf einem Vortex gerührt wurde, wurde ein gleiches DNA-Volumen tropfenweise zu einem die Lipidlösung enthaltenden Röhrchen zugesetzt.
CHO-Transfektionsprotokoll
24 Stunden vor dem Experiment wurden Quarzellen des chinesischen Goldhamsters (CHO) in 24-Loch-Platten mit einer Dichte von 100.000 Zellen pro Napf ausplattiert. Die Zellen wurden vor der Transfektion einmal mit Optimem^TM-Medium gewaschen. Das Waschmedium wurde entfernt und mit 0,5 ml Optimem^TM ersetzt, dem die erforderliche Menge lipidkondensierter DNA zugesetzt war (typischerweise 1 bis 5 mg DNA-Ägivalente). Üblicherweise wurden pro kondensierte DNA-Probe, die zu testen war, Triplikatnäpfe verwendet. Zellen wurden weitere 3–4 Stunden bei 37 °C, 5 % CO₂ inkubiert, bevor der Komplex entfernt wurde und 1 ml an frischem Medium zugesetzt wurde (Iscoves^TM-Medium: modifiziertes DMEM plus Glutamat, Asparagin, Adenosin, Guanosin, Cytidin, Uridin, Thymidin und 10 % an dialysiertem fötalem Kälberserum). Vor Ernte und Messung wurden die Zellen weitere 48–72 Stunden lang kultiviert. Das Ausmaß der beta-Galaktosidase-Reportergenaktivität wurde unter Verwendung eines enzymatischen Assaysystems von Promega wie nachfolgend bestimmt. Die Zellen wurden zweimal mit 1 ml phosphatgepufferter Kochsalzlösung gewaschen und in 200 μl 1 × Zelllysispuffer solubilisiert. 50 μl des Zellextraktes wurden mit dem bereitgestellten Puffer und dem Substrat o-Nitrophenyl-β-D-Galaktopyranosid inkubiert, und die optische Dicht wurde spektrophotometrisch gemessen. Das Ausmaß der β-gal-Expression wurde durch Vergleich mit einer Eichkurve quantifiziert und in Bezug zu der Proteinmenge in dem Extrakt (unter Verwendung des BCA-Assay-Kits von Pierce gemessen) gesetzt, um einen Endwert zu erhalten, der als Millieinheiten β-gal pro mg Protein dargestellt wurde.

Claims

Bipolares Lipid, umfassend einen kationischen Kopf (1), ein hydrophobes Gerüst (2) und einen hydrophilen Schwanz (3), worin: (A) der kationische Kopf zwei oder mehrere kationische Zentren umfasst, wobei jedes Zentrum wenigstens ein zur Ausbildung einer positiven Ladung bei einem pH im Bereich von 2 bis 10 fähiges Heteroatom enthält, welches über eine oder mehrere kohlenstoffhaltige Spacergruppen kovalent an ein oder mehrere andere Zentren gebunden ist; (B) das hydrophobe Gerüst wenigstens eine Kohlenwasserstoffkette umfasst; und (C) der hydrophile Schwanz wenigstens eine Schwanzeinheit umfasst, die unter synthetischen Polyolen, natürlich vorkommenden Polyolen, Poly(alkylenoxiden) und Derivaten davon ausgewählt ist; wobei jede Komponente (1) bis (3) Kopf (1) an Gerüst (2) an Schwanz (3) kovalent gebunden und so angeordnet ist, dass die wenigstens eine Kohlenwasserstoffkette des hydrophoben Gerüsts (2) kovalent an eines der die positive Ladung aufnehmenden Heteroatome im kationischen Kopf (1) und an die wenigstens eine Schwanzeinheit im hydrophilen Schwanz (3) gebunden ist, so dass die Kette wenigstens 10 kettenverbundene Atome zwischen den Anbindungspunkten zum die positive Ladung aufnehmenden Heteroatom und die wenigstens eine Schwanzeinheit enthält.
Lipid nach Anspruch 1, wobei jedes kationische Zentrum eine Aminogruppe ist.
Lipid nach Anspruch 1 oder Anspruch 2, wobei die Zahl der kationischen Zentren im kationischen Kopf drei bis sechs beträgt.
Lipid nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei jede Kohlenstoff enthaltende Spacergruppe im kationischen Kopf eine gegebenenfalls substituierte aliphatische, cycloaliphatische, heteroaliphatische, heterocycloaliphatische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe ist.
Lipid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die wenigstens eine Kohlenwasserstoffkette im hydrophoben Gerüst eine gegebenenfalls substituierte geradkettige oder verzweigte aliphatische oder heteroaliphatische Kette mit 10 bis etwa 100 kettenverbundenen Atomen ist.
Lipid nach Anspruch 5, wobei das hydrophobe Gerüst eine oder zwei Kohlenwasserstoffketten aufweist, die über ein Linkeratom oder -gruppe indirekt an eines der die positive Ladung aufnehmenden Heteroatome im kationischen Kopf (1) gebunden sind.
Lipid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei die wenigstens eine Schwanzeinheit im hydrophilen Schwanz (3) am terminalen Kohlenstoffatom einer Kohlenwasserstoffkette des Kohlenwasserstoffgerüsts (2) an die Kette gebunden ist, das sich distal zum Kettenkohlenstoffatom befindet, das an den kationischen Kopf (1) gebunden ist.
Lipid nach einem der Ansprüche 1 bis 7, mit der Formel (1): [R¹]_m-(L¹)_n-R² (1)worin R¹ für eine Kohlenwasserstoffkette steht, die gegebenenfalls mit einer oder mehreren Schwanzeinheiten substituiert ist, die unter synthetischen Polyolen, natürlich vorkommenden Polyolen, Poly(alkylenoxiden) und Derivaten davon ausgewählt ist, mit der Maßgabe, dass wenigstens eine Kohlenwasserstoffkette R¹ durch wenigstens eine derartige Schwanzeinheit substituiert ist und dass jede derartige Schwanzeinheit so an die Kohlenwasserstoffkette gebunden ist, dass ein Abstand von wenigstens 10 kettenverbundenen Atomen entlang der Kette zwischen der Schwanzeinheit und der Gruppe -(L¹)-R² erreicht wird; m für eine ganze Zahl von 1 bis 6 steht; L¹ für ein Linkeratom oder -gruppe steht; n für Null oder die ganze Zahl 1 steht; und R² für eine gegebenenfalls substituierte aliphatische, cycloaliphatische, heteroaliphatische, heterocycloaliphatische, aromatische oder heteroaromatishe Gruppe steht, die zwei oder mehr kationische Zentren enthält, so dass jede [R¹]_m-(L¹)_n–Gruppe an ein eine positive Ladung aufnehmendes Heteroatom in einem kationischen Zentrum in R² gebunden ist; und die Salze, Solvate und Hydrate davon.
Lipid nach Anspruch 8, worin n in -(L¹)- für de ganze Zahl 1 steht.
Lipid nach Anspruch 9, worin 1¹ für eine Gruppe -X¹Alk²- oder -[X¹]₂Alk¹X¹Alk²-, in welcher X¹ für ein -O- oder -S-Atom oder eine -C(O)-, -C(O)O-, -C(S)-, -S(O)-, -S(O)₂-, -N(R³), -CON(R³)-, -OC(O)N(R³)-, -CSN(R³)-, -N(R³)CO-, -N(R³)C(O)O-, -N(R³)CS-, -S(O)N(R³)-, -S(O)₂N(R³)-, -N(R³)S(O)-, -N(R³)S(O)₂-, -N(R³)CON(R³)- oder -N(R³)SO₂N(R³)-Gruppe steht, worin jedes R³ unabhängig ausgewählt ist unter Wasserstoffatomen, geradkettigen und verzweigten Alkylgruppen und -Alk¹X¹-Ketten; und Alk¹ und Alk² gleich oder verschieden sein können und jeweils für eine gegebenenfalls substituierte geradkettige oder verzweigte C_1-6-Alkylen-, C_2-6-Alkenylen oder C_2-6-Alkinylen-Kette stehen, die gegebenenfalls durch eine oder mehrere carbocyclische oder heterocarbocyclische Gruppen, Heteroatome oder heteroatomhaltige Gruppen X¹ gemäß Definition in diesem Anspruch unterbrochen oder terminiert ist.
Lipid nach Anspruch 10, worin X¹ für eine -CONH-Gruppe steht, Alk¹ für eine -CH₂-CH< Kette und Alk² für eine -(CH₂)₄-, -(CH₂)₅ oder (CH₂)₆-Kette steht.
Lipid nach Anspruch 8 mit der Formel (1a): [R⁷]_p(L³)_q-[R⁶]_m-L¹)_n-R² (1a)worin R², L¹, m und n die für die Formel (1) angegebene Bedeutung haben; R⁶ für eine Kohlenwasserstoffkette steht; L³ für ein Linkeratom oder -gruppe steht; R⁷ für eine Schwanzgruppe steht, die ausgewählt ist unter synthetischen Polyolen, natürlich vorkommenden Polyolen, Poly(alkylenoxiden) und Derivaten davon; q für Null oder eine ganze Zahl von eins bis sechs steht; p für eine ganze Zahl von eins bis sechs steht; mit der Maßgabe, dass jede Gruppe R⁷ oder L³, sofern vorliegend, so an eine Gruppe R⁶ gebunden ist, dass ein Abstand von wenigstens zehn kettenverbundenen Atomen entlang R⁶ zwischen R⁷ oder L³ und der Gruppe -(L¹)_n-R² erreicht wird; und die Salze, Solvate und Hydrate davon.
Lipid nach Anspruch 12, worin R² für eine Gruppe -WSp¹[WSp²]_bWSp³ oder -WSp¹[WSp²]_bWH steht, worin Sp¹, Sp^e und Sp³, die gleich oder verschieden sein können, jeweils für eine Spacergruppe stehen, W für ein kationisches Zentrum steht und b für Null oder eine ganze Zahl von 1 bis 6 steht.
Lipid nach Anspruch 13, worin Sp¹, Sp² und Sp³ jeweils für eine gegebenenfalls substituierte aliphatische, cycloaliphatische, aromatische oder heteroaromatische Gruppe stehen.
Lipid nach Anspruch 14, worin Sp¹, Sp² und Sp³ jeweils für eine gegebenenfalls substituierte C_1-6-Alkylenkette stehen.
Lipid nach einem der Ansprüche 13 bis 15, worin W für eine -NH-Gruppe steht.
Lipid nach einem der Ansprüche 13 bis 16, worin b für eine ganze Zahl von 2 bis 4 steht.
Lipid nach Anspruch 12, worin R² für eine Gruppe -NH[Sp¹NHSp²]NH₂, -NH[Sp¹NHSp²NHSp²]NH₂, oder -NH[Sp¹NHSp²NHSp²]NHCH₃ steht, worin Sp¹ für -CH₂- und jedes Sp^e für -(CH₂)₃- oder -(CH₂)₄- steht.
Lipid nach einem der Ansprüche 12 bis 18, worin m für eine ganze Zahl 1 oder 2 steht.
Lipid nach einem der Ansprüche 12 bis 19, worin R⁶ für eine gegebenenfalls substituierte aliphatische C_10-60-Kette steht.
Lipid nach Anspruch 20, worin R⁶ für eine lineare, gegebenenfalls substituierte C_16-38-Alkylenkette steht.
Lipid nach einem der Ansprüche 12 bis 21, worin q für die ganze Zahl 1 steht und p für eine ganze Zahl 1 oder 2 steht.
Lipid nach einem der Ansprüche 12 bis 22, worin L³ für ein Atom oder Gruppe -X¹-, -X¹Alk¹X¹- oder -[X¹Alk¹]₂X¹Alk²X¹- steht, worin X¹ für ein -O- oder -S-Atom oder eine -C(O)-, -C(O)O-, -C(S)-, -S(O)-, -S(O)₂-, -N(R³), -CON(R³)-, -OC(O)N(R³)-, -CSN(R³)-, -N(R³)CO-, -N(R³)C(O)O-, -N(R³)CS-, -S(O)N(R³)-, -S(O)₂N(R³)-, -N(R³)S(O)-, -N(R³)S(O)₂-, -N(R³)CON(R³)- oder -N(R³)SO₂N(R³)-Gruppe steht, worin jedes R³ unabhängig ausgewählt ist unter Wasserstoffatomen, geradkettigen und verzweigten Alkylgruppen und -Alk¹X¹-Ketten; und Alk¹ und Alk² gleich oder verschieden sein können und jeweils für eine gegebenenfalls substituierte geradkettige oder verzweigte C_1-6-Alkylen-, C_2-6-Alkenylen- oder C_2-6-Alkinylenkette stehen, die gegebenenfalls durch eine oder mehrere carbocyclische oder heterocarbocyclische Gruppen, Heteroatome oder heteroatomhaltige Gruppen X¹ gemäß Definition in diesem Anspruch unterbrochen oder terminiert ist.
Lipid nach Anspruch 23, worin L³ für eine -NHCO-, -CONH-, -CONH(CH₂)₂NHCO- oder -[CONH(CH₂)₂]₂NCO(CH₂)₂CONH-Gruppe steht.
Lipid nach einem der Ansprüche 12 bis 24, worin R⁷ ein Poly(alkylenoxid) oder ein Derivat davon ist.
Lipid nach Anspruch 25, worin R⁷ ein Poly(ethylenoxid) ist.
Lipid nach einem der Ansprüche 12 bis 24, worin R⁷ ein natürlich vorkommendes Polyol ist.
Lipid nach Anspruch 27, worin R⁷ ein acylisches Mono- oder Oligosaccharid ist.
Wirkort-gerichtete Lipidzusammensetzung, umfassend ein bipolares Lipid nach einem der Ansprüche 1 bis 28 zusammen mit wenigstens einem dirigierenden Molekül.
Zusammensetzung nach Anspruch 29, worin das wenigstens eine dirigierende Molekül ein Antikörper oder ein Fragment oder ein Derivat davon ist.
Lipidkomplex, umfassend ein bipolares Lipid nach einem der Ansprüche 1 bis 28, assoziiert mit wenigstens einer bioaktiven Substanz.
Komplex nach Anspruch 31, worin die wenigstens eine bioaktive Substanz, ein bioaktives Protein, Peptid, Polysaccharid, Nukleinsäure, Oligonukleotid oder Derivat davon, Lipid, Glycolipid, Lipoprotein, Lipopolysaccharid oder eine virale, bakterielle, protozoale, zelluläre oder Gewebefraktion ist.
Komplex nach Anspruch 32, worin die wenigstens eine bioaktive Substanz ein Polyanion ist.
Komplex nach Anspruch 33, worin die wenigstens eine bioaktive Substanz eine Nukleinsäure ist.
Komplex nach einem der Ansprüche 31 bis 34, enthaltend zwei oder mehrere unterschiedliche bipolare Lipide.
Komplex nach Anspruch 35, worin ein bipolares Lipid eine von einem Poly(alkylenoxid) oder einem Derivat davon ausgebildete Schwanzeinheiten aufweist und das oder die anderen von einem synthetischen oder natürlich vorkommenden Polyol ausgebildete Schwanzeinheiten aufweist (aufweisen).
Komplex nach Anspruch 36, worin das Poly(alkylenoxid) Poly(ethylenoxid) ist.
Komplex nach einem der Ansprüche 31 bis 37, zusätzlich umfassend wenigstens ein dirigierendes Molekül.
Komplex nach Anspruch 38, worin das bipolare Lipid mit dem wenigstens einen dirigierenden Molekül assoziiert ist.
Zusammensetzung, umfassend einen Komplex nach einem der Ansprüche 31 bis 39 und wenigstens ein weiteres Lipid.
Zusammensetzung nach Anspruch 40, worin das wenigstens eine weitere Peptid ein neutrales oder kationisches Lipid ist.
Zusammensetzung, umfassend einen Komplex nach einem der Ansprüche 31 bis 41 und pharmazeutisch akzeptable Träger, Exzipienten und/oder Verdünnungsmittel.
Verfahren zur Herstellung eines bipolaren Lipids gemäß Definition in einem der Ansprüche 1 bis 28, bei dem man kuppelt: (A) einen kationischen Kopf (2), der zwei oder mehrere kationische Zentren umfasst, wobei jedes Zentrum wenigstens ein zur Ausbildung einer positiven Ladung bei einem pH im Bereich von 2 bis 10 fähiges Heteroatom enthält, welches über eine oder mehrere kohlenstoffhaltige Spacergruppen kovalent an ein oder mehrer andere Zentren gebunden sind; (B) ein hydrophobes Gerüst, das wenigstens eine Kohlenwasserstoffkette umfasst; und (C) einen hydrophilen Schwanz, der wenigstens eine Schwanzeinheit umfasst, die unter synthetischen Polyolen, natürlich vorkommenden Polyolen, Poly(alkylenoxiden) und Derivaten davon ausgewählt ist; wobei die Ausgangsmaterialien (A), (B) und (C), eine oder mehrere funktionelle Gruppen aufweisen, die zur Ermöglichung der Kupplung geeignet sind, dass die wenigstens eine Kohlenwasserstoffkette des hydrophoben Gerüsts kovalent an eines der die positive Ladung aufnehmenden Heteroatome im kationischen Kopf und an die wenigstens eine Schwanzeinheit im hydrophilen Schwanz gebunden ist, so dass die Kette wenigstens 10 kettenverbundene Atome zwischen den Anbindungspunkten zum die positive Ladung aufnehmenden Heteroatom und die wenigstens eine Schwanzeinheit enthält.
Verfahren nach Anspruch 43, bei dem man ein geschütztes Derivat des Lipids entschützt.
Verfahren zur Herstellung eines Lipidkomplexes gemäß Definition in einem der Ansprüche 31 bis 39, bei dem man das bipolare Lipid mit einer bioaktiven Substanz vermischt.
Verwendung eines Komplexes gemäß Definition in einem der Ansprüche 31 bis 39 zum in vitro-Transport einer bioaktiven Substanz zu Zellen.
Verwendung einer Zusammensetzung gemäß Definition in einem der Ansprüche 40 bis 42 zur Herstellung eines Arzneimittels zum Transport einer bioaktiven Substanz.
Verwendung nach Anspruch 46 oder Anspruch 47, wobei die bioaktive Substanz ein therapeutisches, diagnostisches oder immunmodulierendes Mittel ist.