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DE19834683A1 - Neue Lipopolyamine, deren Darstellung und Anwendung - Google Patents

Neue Lipopolyamine, deren Darstellung und Anwendung

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Publication number
DE19834683A1
DE19834683A1 DE19834683A DE19834683A DE19834683A1 DE 19834683 A1 DE19834683 A1 DE 19834683A1 DE 19834683 A DE19834683 A DE 19834683A DE 19834683 A DE19834683 A DE 19834683A DE 19834683 A1 DE19834683 A1 DE 19834683A1
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DE
Germany
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case
compounds
octadecyl
hexadecenyl
tetradecenyl
Prior art date
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Withdrawn
Application number
DE19834683A
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English (en)
Inventor
Stephan Koenig
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Biontex Laboratories GmbH
Original Assignee
Biontex Laboratories GmbH
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Biontex Laboratories GmbH filed Critical Biontex Laboratories GmbH
Priority to DE19834683A priority Critical patent/DE19834683A1/de
Priority to DE59802084T priority patent/DE59802084D1/de
Priority to CA2299429A priority patent/CA2299429C/en
Priority to EP98946333A priority patent/EP1003711B1/de
Priority to AU93421/98A priority patent/AU745958B2/en
Priority to PCT/EP1998/005156 priority patent/WO1999008997A1/de
Priority to AT98946333T priority patent/ATE208369T1/de
Priority to ES98946333T priority patent/ES2167939T3/es
Priority to US09/463,172 priority patent/US6281371B1/en
Priority to JP2000509683A priority patent/JP4504559B2/ja
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Description

Positiv geladene Lipide (J. P. Behr, Bioconjugate Chem. 5, 382-389, 1994) werden in Form von Liposomen, Micellen oder als solche zur Einschleusung von biologisch aktiven Substanzen wie Peptiden, Peptoiden, Proteinen, PNA, antiviralen Wirkstoffen insbesondere aber DNA, RNA, Antisense-DNA/RNA oder Ribozymen in eukariotische Zellen (zum Beispiel Säuger-, Pflanzen- oder Insektenzellen) eingesetzt. Lipopolyamine sind eine spezielle Klasse von kationischen Lipiden, die vergleichsweise hervorragende Transfektionseigenschaften zeigen. Unter Transfektion versteht man die Einschleusung von Erbmaterial in eukariotische Zellen.
Die Notwendigkeit DNA (zum Beispiel Plasmide, Cosmide, einzelsträngig oder doppelsträngig), RNA oder verwandte Stoffklassen, wie Antisense-DNA/RNA oder Ribozyme in eukariotische Zellen einzuführen, um beispielsweise erfolgreich Gentherapie betreiben zu können, führte zur Entwicklung einer Vielzahl von Transfektionsmethoden. Zur Einführung von Nukleinsäuren in eukariotische und insbesondere in Säugerzellen ist eine Vielzahl von Verfahren, wie zum Beispiel die CaPO4-Präzipitationsmethode, die DEAE-Dextran-Methode, synthetische Polyamine (Polyethylenimin, Polylysin, PAMAM-Dendrimere), Methoden, welche die rezeptorvermittelte Endocytose nutzen, Elektroporation, Mikrobombardement, Mikroinjektion und Verfahren, die virale Capside als DNA-Carrier benutzen, bekannt. Eine weitere Methode wird Lipofektion (P. L. Felgner et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74, 7413 1987) genannt. Diese nützt die Tatsache, daß synthetische kationische Lipide in Form von Liposomen, Micellen oder als solche mit der negativ geladenen DNA Komplexe bilden. Stellt man die Mengenverhältnisse von DNA und kationischem Lipid so ein, daß die resultierenden Komplexe eine positive Nettoladung tragen, so besitzen sie eine hohe Affinität zu der negativ geladenen Membranoberfläche eukariotischer Zellen. Treffen solche DNA/Lipid-Komplexe auf Zellen, so kommt es zu einer Einschleusung des genetischen Materials in die Zelle. Der genaue Mechanismus, wie die DNA in die Zellen gelangt, ist noch weitgehend unbekannt, man vermutet jedoch, daß es entweder zu einer Fusionierung der kationischen Lipide mit der anionischen Zellmembran bei gleichzeitiger Ausschüttung der DNA in das Zellinnere kommt, oder daß die DNA/Lipid-Komplexe als ganzes über einen natürlichen Transportmechanismus der Zellen, die sogenannte Endozytose, in die Zelle gelangen und danach die DNA freigesetzt wird.
Liposomen sind in der Regel kugelartige Anordnungen von Lipiden in wäßrigen Lösungen mit "Bilayer-Struktur" und werden typischerweise in drei Klassifikationen eingeteilt (siehe N. Y. Academy Sciences Meeting: "Liposomes and their use in Biology and Medicine" von Dezember 1977): Multilamellare Vesikel (MLV, bis zu 10 000 nm), kleine unilamellare Vesikel (SUV, 20-50 nm) und große unilamellare Vesikel (LUV, 600-30 000 nm). Eine Reihe von Herstellungsmethoden für Liposomen ist bekannt und in "Liposome Technology" (Gregoriadis, CFC Press, N. Y. 1984), in "Liposomes" (Ostro, Marcel Dekker, N. Y. 1987) oder in Übersichtsartikeln von Lichtenberg et al. (Methods Biochem. Anal. 33, 337-462, 1988), Pagano und Weinstein (Ann. Rev. Biophysic. Bioeng. 7, 435-68, 1978), oder Szoka und Papahadjopoulos (Ann. Rev. Biophysic. Bioeng. 9, 467-508, 1980) beschrieben. Bekannte Methoden sind beispielsweise die "reverse-phase evaporation"-Methode und die Extrusionsmethode, bei der eine Lipidlösung durch eine mikroporöse Membran gepreßt wird.
Liposomen werden typischerweise auch auf folgendem Weg hergestellt: Die Lipide werden in einem organischen Lösungsmittel aufgenommen. Durch Verdampfen des Lösungsmittels unter einem Strom von Stickstoff wird an der Glasgefäßwand ein dünner Lipidfilm erzeugt. Zugabe von Wasser oder wäßriger Pufferlösung hydratisiert diesen Film. Die erhaltene Lösung wird zuletzt mit Ultraschall behandelt.
Kationische Lipide gewinnen zunehmende Bedeutung in der Gentherapie. Dabei werden in vivo mit verschiedenen Verfahren Körperzellen transfektiert, indem Komplexe aus Carrier und DNA intradermal, intramuskulär, intraperitoneal, intravenös, subkutan, intranasal, in Liquorräume oder direkt in Tumore verabreicht werden oder Körperzellen entnommen, transfektiert und wieder reimplantiert werden. Eine in diesem Zusammenhang favorisierte Methode war bis vor einiger Zeit die Einbringung des genetischen Materials durch virale Carrier. Diese Methode besitzt jedoch die Gefahr der Rückmutation zu einem pathogenen Virus. Des weiteren wird die eingeschleuste DNA stabil in das Erbgut eingebaut, so daß eine Steuerung der Therapie oder eine Rückführung der Zellen in ihren ursprünglichen Zustand nicht mehr möglich ist. Zudem besitzen virale Carrier Restriktionen bezüglich der Größe der einzuschleusenden DNA. Modifizierte DNA oder RNA wird durch Viren nicht übertragen. Außerdem können nur sich teilende Zellen auf diesem Wege transfektiert werden.
Weitere Gefahren, die bei der Anwendung von viralen Carriersystemen zu berücksichtigen sind, sind die mögliche Aktivierung von Oncogenen und eine Immunreaktion des behandelten Organismus.
Die Transfektion mit kationischen Lipiden ist diesen Restriktionen hingegen nicht unterworfen. Die Transfektion verläuft in der Regel transient, das heißt die transfektierte DNA oder RNA wird nur für eine bestimmte Zeit exprimiert, da sie nicht in das Erbgut eingebaut wird und durch Nukleasen mit der Zeit abgebaut wird. Auf diese Weise kann Gentherapie dosiert und reversibel gemacht werden. Restriktionen bezüglich der Größe der DNA bestehen nicht und auch modifizierte DNA oder RNA (z. B. Antisense-DNA/RNA oder durch Einbau modifizierter Nukleotide stabilisierte Ribozyme) kann mittels kationischer Lipide in Zellen eingeschleust werden. Auch sich nicht teilende Zellen, wie zum Beispiel Nervenzellen, können durch kationische Lipide transfektiert werden. Des weiteren wurde bisher kein immunogenes Verhalten von kationischen Lipiden bei in vivo Versuchen gefunden.
Während die in vivo-Anwendung von Mikroinjektion und Elektroporation aus Verfahrensgründen nicht möglich erscheint, besitzen die CaPO4- und DEAE-Dextran- Methoden verglichen mit der Lipofektion eine schlechtere Transfektionseffizienz.
Unter den kationischen Lipiden gibt es eine Klasse, die die bekannt hohe Affinität zwischen Polyaminen (z. B. Spermin, Spermidin) und DNA zur Transfektion ausnützen, sogenannte Lipopolyamide. Die Polyamine sind dabei linear oder verzweigt aufgebaut und enthalten Ethylen-; Propylen-; oder Butylengruppen zwischen den Aminofunktionen. Die Polyamine sind auf unterschiedlichste Weise mit einem lipophilen Rest verbunden.
Beispielsweise wird das bei physiologischem pH-Wert positiv geladene Spermin mit einem hydrophilen Rest, in manchen Fällen über einen Spacer, verknüpft. Spermin bildet stabile Komplexe mit DNA und ähnlichen Verbindungen, indem es über Wasserstoffbrückenbindung in der Furche der DNA gebunden wird.
Die ersten solchen Liposperminderivate wurden von Behr, J. P. et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 6982-6986; 1989; EP 0394111) synthetisiert. Dabei verknüpften sie Carboxyspermin über einen Spacer mit zwei unterschiedlichen hydrophilen Resten. Die Struktur des dabei erhaltenen 5-Carboxyspermylglycindioctadecylamid (DOGS) ist:
DOGS ist als Transfectam™ (Promega) kommerziell erhältlich.
Die zweite von Behr et al. entwickelte Verbindung ist Dipalmitoylphosphatidylethanolamin-5- carboxyspermylamid (DPPES):
Ein weiteres Liposperminderivat wird von P. L. Felgner et al. in WO 9116024 unter der Bezeichnung L-Spermin-5-carboxyl-3-(DL-1,2-dioleoyldimethylaminopropyl-β-hydroxyethyl­ amin) beansprucht. In der Patentschrift beschrieben ist jedoch L-Spermin-5-carboxyl-3-(DL- 1,2-dipalmitoyl-dimethylaminopropyl-β-hydroxyethylamin):
Gebeyehu, G. et al. beschreiben in WO 9405624 die Verbindung N-[N-(5- Carboxyspermyl)aminoethyl] N, N-dimethyl-2,3-bis (9-octadecenyloxy) 1-propanammonium tetra (trifluoracetat), welches kommerziell als Lipofectamin™ (Gibco-BRL: Life Technologies Inc.) erhältlich ist.
Von Der Eltz et al. beschreiben in WO 9700241 die Verbindung 2-(6-Carboxy-spermyl)-1,3- dioleoyloxy-propylamid, die unter dem Namen DOSPER auf den Markt gebracht wurde (Boehringer Mannheim GmbH).
Die bisher genannten Verbindungen wurden alle über eine Amid- oder Esterverknüpfung eines linearen Polyamins, welches eine Carboxyfunktion als Seitenkette trägt, i. e. von Carboxyspermin zu einem lipophilen Rest hergestellt. Spätere Veröffentlichungen zeigen schließlich auch andere Verknüpfungsweisen von linearen Polyaminen zu den lipophilen Resten, z. B. durch eine Amid- oder Carbamatverknüpfung zu einer endständigen Aminofunktion (lineare Struktur) oder inneren Aminofunktion ("T-shape-structure") des linearen Polyamins. Beispiele finden sich in den Veröffentlichungen DE 19 63 189, WO 9640726, WO 9640725, WO 9618372, WO 9746223, WO 9802190 und WO 9802191. Auch verzweigte Polyamine wurden beschrieben (G. Byk et al, J. Med. Chem., 41, 224-235, 1998).
Trotz großer Fortschritte auf dem Gebiet der Transfektion mittels kationischer Lipide, verbleibt ein Bedarf an einer größeren Auswahl solcher Lipide. Der Grund dafür liegt darin, daß bis heute kein kationisches Lipid gefunden wurde, daß mit allen Zelltypen befriedigende Ergebnisse liefert. Da verschiedene Zelltypen sich in ihrer Membranzusammensetzung unterscheiden, ist es nicht verwunderlich, daß verschiedene Kompositionen von Lipiden und verschiedenartige Lipidtypen für eine effektive Transfektion unterschiedlicher Zellen benötigt werden.
Da über den eigentlichen Transfektionsschritt bis heute noch wenig bekannt ist, ist die Entwicklung von neuen kationischen Lipiden weitgehend empirisch. Wichtige zu beachtende Punkte für das Design solcher Lipide sollten daher ihre physikalische Eigenschaften bezüglich der Ausbildung von Liposomen oder Micellen, die Eigenschaften der gebildeten Liposomen oder Micellen, die Toxizität gegenüber den zu transfektierenden Zielzellen, des weiteren die Stabilität der Lipide, deren Metabolisierbarkeit und die Möglichkeit einer in vivo-Anwendung sein.
Die erfindungsgemäß zu lösende Aufgabe bestand also darin, neue kationische Lipide mit hoher Wirksamkeit und möglichst breitem Wirkungsspektrum in Kombination mit guter Stabilität zu finden. Bei der vorliegenden Erfindung wurde nun überraschenderweise gefunden, daß die Kombination von Polyaminen als Kopfgruppe mit einem speziellen lipophilen Rest zu besonders guten Eigenschaften in Hinblick auf Effizienz und Stabilität führt:
Die Reste R sind dabei gesättigte oder ungesättigte Alkylketten, vorzugsweise mit 10 bis 20 Kohlenstoffatomen.
Als Erklärung mögen folgende Hypothesen dienen. Von besonderer Bedeutung für eine erfolgreiche Transfektion hat sich die Bildung eines sogenannten DNA-Lipid-Komplexes erwiesen. Beim Zusammentreffen von DNA und kationischen Lipiden, die als Liposomen- oder Micellenformulierungen eingesetzt werden, kommt es zu einer spontanen Kondensation der DNA unter Zusammenbruch der liposomalen oder micellenartigen Organisationsstruktur der kationischen Lipide. Es bildet sich ein DNA-Lipid-Komplex aus, in dem die DNA in einem multilamellaren Komplex mit "Bilayerstruktur" aus den besagten Lipiden eingebettet ist (J. O. Rädler et al. Science, 275, 810, 1997). Ist z. B. die Spermingruppe als DNA-affine Kopfgruppe erst einmal an die DNA gebunden, kommt somit der Flexibilität und Symmetrie des restlichen Molekülteils (lipophiler Rest) besondere Bedeutung zu, da die Alkylgruppen in der Lage sein müssen, sich möglichst parallel auszurichten, um über Van-der-Waals-Kräfte stabile "Bilayer- Strukturen" ausbilden zu können.
Die bisher vorgeschlagenen Verbindungen sind in der Regel wenig symmetrisch aufgebaut, was eine parallele Ausrichtung der Alkylreste erschwert, und beinhalten allesamt Ester, Ether oder Amidverknüpfungen zwischen den Alkylresten und einem Grundgerüst bzw. einem Spacer. Diese Verbindungen sind daher in ihrer Flexibilität auf Grund der festgelegten Bindungswinkel und im Falle von Amidverknüpfungen (z. B. bei Verbindungen aus G. Byk et al, J. Med. Chem., 41, 224-235, 1998, EP 0394111, WO 9618372, WO 9746223, WO 9802190 und WO 9802191) auf Grund vorhandener Resonanzstrukturen stark eingeschränkt.
In der Resonanzstruktur für Amide trägt das O-Atom eine negative und das Amid-N-Atom eine positive Ladung. Es resultiert eine planare Anordnung der an der Amidbindung beteiligten Atome. Eine freie Rotation der Amidbindung zwischen Carbonyl-Kohlenstoff und dem Stickstoffatom ist nicht möglich. Diese Eigenschaft wirkt sich beispielsweise in ganz besonderer Weise auf die Struktur von Proteinen aus. (Sekundär-, Tertiär- und Quartärstruktur), deren Peptidbindungen nichts anderes als Amidverknüpfungen sind. Erst die starren, nichtflexiblen Amidverknüpfungen geben dem Protein seine biologisch notwendige Struktur.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen (siehe auch unten) verknüpfen die Alkylreste über ein tertiäres Stickstoffatom (Amin). Damit ist eine hohe Symmetrie und durch die Möglichkeit des "Durchschwingens" des freien Elektronenpaares (Pseudorotation) am Stickstoffatom maximale Flexibilität gewährleistet. Somit besteht bei diesen Verbindungen die optimale Voraussetzung zur parallelen Ausrichtung der Alkylreste (trotz an der DNA fest verankerter Kopfgruppen) und somit zur Bildung stabiler DNA-Lipid-Komplexe, was eine möglichst große Überlappung der van der Waals-Regionen der Alkylgruppen voraussetzt.
Eine weitere Erklärungsmöglichkeit für die besonders guten Eigenschaften der beanspruchten Verbindungen besteht darin, daß diese Verbindungen auf Grund des nicht an der DNA-Komplexbildung beteiligten basischen Stickstoffatoms, welches die Alkylreste trägt, Pufferungsvermögen im physiologischen pH-Bereich besitzen. Diese Eigenschaft fördert auf dem Weg der Endocytose die osmotische Zerstörung der Endosomen, so daß die DNA um so besser in das Zytosol freigesetzt wird (J. P. Behr, Gene Therapy, 3, 1010-1017, 1996).
Die vorliegende Erfindung betrifft somit neue Lipopolyamine der allgemeinen Formel I, die in der Lage sind, biologisch aktive Moleküle in eukariotische Zellen zu transportieren:
Formel I:
die bei Vorhandensein eines Asymmetriezentrums in der D-, L- oder DL-Form vorliegen, einschließlich ihrer Salze, wobei
R1 ein lipophiler Rest folgender allgemeinen Formel ist:
in welcher R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl, Octadecenyl oder andere Alkylreste, die in allen möglichen Kombinationen gesättigt, ungesättigt, verzweigt, unverzweigt, fluoriert oder nicht fluoriert sein können, und aus 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 oder 30 Kohlenstoffatomen aufgebaut sind,
und X eine der folgenden Gruppierungen ist:
ist,
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können,
oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können,
oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können,
oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 oder l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können,
oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können,
oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können.
Von besonderem Interesse sind dabei Verbindungen und ihre Salze mit folgenden Strukturen:
wobei h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und wobei g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein können, R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
Von ganz besonderem Interesse ist dabei folgende Verbindung und ihre Salze:
Von weiterem besonderen Interesse sind Formulierungen die Liposomen oder Micellen enthalten, die diese Verbindungen kombiniert mit Colipiden oder ohne Colipide, wie z. B. Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), Dioleoylphosphatidylcholin, Cholesterol oder Cholesterylamin enthalten.
Von weiterem besonderen Interesse sind Verfahren zum Einbringen von biologisch wirksamen Verbindungen, wie DNA, RNA, Ribozymen, Antisense-DNA, PNA, Peptiden, Peptoiden und Proteinen in eukariotische Zellen, wobei die genannten Verbindungen oder Formulierungen mit den einzubringenden Verbindungen komplexieren und die entstandenen Komplexe mit eukariotischen Zellen in vivo oder in vitro in Kontakt gebracht werden.
Von weiterem besonderen Interesse ist die Verwendung der genannten Verbindungen oder Formulierungen als Reagenz oder Medikament oder als Bestandteil von einem Reagenz oder Medikament zum Einbringen von biologisch wirksamen Verbindungen, wie DNA, RNA, Ribozymen, Antisense-DNA, PNA, Peptiden, Peptoiden und Proteinen in eukariotische Zellen in vivo oder in vitro.
Von weiterem besonderen Interesse ist die Verwendung der genannten Verbindungen oder Formulierung als Reagenz oder Medikament oder als Bestandteil von einem Reagenz oder Medikament zum Einbringen von biologisch wirksamen Verbindungen, wie DNA, RNA, Ribozymen, Antisense-DNA, PNA, Peptiden, Peptoiden und Proteinen in eukariotische Zellen in vivo oder in vitro in Kombination mit sogenannten "Enhancern", die deren Wirkung verstärken.
Die erfindungsgemäßen Lipide enthalten also Polyamine als DNA-affine Kopfgruppen, die über einen Spacer an einen speziellen lipophilen Rest gebunden sind. Ein besonderer Wert der erfindungsgemäßen Lipide liegt in ihrer Stabilität in Lösung, bei gleichzeitiger geringer Toxizität für die Zelle in Kombination mit außergewöhnlich guten Transfektionseigenschaften.
So konnte gezeigt werden, daß die erfindungsgemäßen Verbindungen, im Vergleich mit Lipofectamin™ (Gibco-BRL: Life Technologies Inc.), dem bis dato in der Fachwelt anerkannt wirksamsten Transfektionsreagenz aus der Gruppe der Lipopolyamine, bessere Transfektionseigenschaften besitzen, wenn sie die gleiche Kopfgruppe tragen. Die Transfektionseffizienz ist dabei nicht nur jeweils im serumfreien und serumhaltigen Milieu höher, sondern es zeigt sich auch, daß ein hohes Niveau bezüglich Transfektionseffizienz über ein wesentlich breiteres DNA-Lipid-Verhältnis erreicht werden kann.
Nachstehend wird ein allgemeiner Syntheseweg am Beispiel einer der ganz besonders interessanten Verbindungen, von N-[2,5-Bis [(3-aminopropyl) amino]-1-oxopentyl]- N',N'- dioctadecylethylendiamin, erläutert.
Dabei wird von N-tert.-Butyloxycarbonyl-geschütztem (BOC-geschütztem) Alkylendiamin ausgegangen. Die freie Aminogruppe wird durch Alkylbromide in Anwesenheit einer Base derivatisiert. Anschließend wird die zweite im Molekül vorhandene Aminofunktion deblockiert und an BOC-geschütztes Carboxypolyalkylamin (hier BOC-geschütztes Carboxyspermin) gekuppelt. Nach deblockieren dieser Kopfgruppe erhält man die gewünschten Verbindungen, je nach Aufarbeitung als freies Amin oder in Form ihrer Salze.
Eine weitere bevorzugte Verbindung ist N,N-Bis-(3-aminopropyl)-N',N'- dioctadecylethylendiamin. Diese Verbindung wird ausgehend von N-tert.- Butyloxycarbonylethylendiamin (BOC-Ethylendiamin) durch umsetzen mit Acrylnitril, Alkylierung mit Alkylbromid und anschließender Hydrierung gewonnen. Die anschließenden Schritte dienen der Aufreinigung.
Ein alternativer Weg zum gleichen Molekül ist die Alkylierung von N,N- Dioctadecylethylendiamin mit N-BOC-3-brompropylamin:
Nach folgendem altbekanntem Reaktionsschema, das im übrigen auch im vorigen Beispiel enthalten ist, können durch Wahl geeigneter Bedingungen, die Polyaminkopfgruppen verlängert, oder auch verzweigte Polyaminkopfgruppen erzeugt werden. Dabei besteht die Möglichkeit die Kopfgruppe einzeln zu erzeugen und anschließend an den lipophilen Rest zu kuppeln oder schon gekuppelte Kopfgruppen am Molekül zu erweitern.
Als explizites Beispiel soll die Umsetzung von Ornithin mit Acrylnitril dienen. Über die Menge an Acrylnitril und der richtigen Wahl der Reaktionstemperatur kann das gewünschte Produkt als Hauptmenge erhalten werden. Die Hydrierung der Nitrile zu den Aminen und dessen Schutz durch die BOC-Schutzgruppe werden nach J. P. Behr et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, pp. 6982-6986, 1989 analog der Synthese von Tetra-BOC-Carboxyspermin durchgeführt.
Eine weitere Möglichkeit zur Verlängerung und Verzweigung der Polyaminkopfgruppen besteht in der Alkylierung von Aminen durch N-(tert.-Butyloxycarbonyl)-3-brompropylamin:
Allgemein können sämtliche aufgeführte Lipide mit den in den Beispielen aufgeführten Methoden (Blockieren und Deblockieren von Aminofunktionen mit der BOC-Schutzgruppe, Alkylierung von Aminofunktionen mit Alkylbromiden, Knüpfen von und Amidbindungen analog bekannter Peptidchemie, Cyanoethylierung von Aminofunktionen via Acrylnitril, Hydrierung von Cyanofunktionen zu Aminen) oder mit dem organischen Chemiker vertrauten, allgemein bekannten Methoden (Alkylierung von Alkoholen, Knüpfen von Esterbindungen, Reduktion von Estern zu Ethern bzw. von Amiden zu Aminen via Lithiumalanat) erzeugt werden.
Bezüglich der Verbindungen, die die zwei zuletzt beanspruchten Spacer enthalten, sei auf WO 9802191 verwiesen. Hier wird beschrieben, wie Ester und Amide mit Lithiumalanat zu Ethern und Aminen reduziert werden können, ohne die BOC-Schutzgruppe anzugreifen. Auf diesem Wege resultieren solche Verbindungen aus den entsprechenden Vorläufern.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können als solche in wäßriger oder wäßriger Puffer- oder ethanolischer Lösung angewendet werden. Es können jedoch auch Liposomen (oder Micellen) mit oben genannten Lipiden allein, oder in Kombination mit anderen Lipiden wie zum Beispiel Cholesterol, Cholesterylamin, Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE) oder Dioleoylphosphatidylcholin (DOPC) formuliert werden.
Um die Transfektionseffizienz der erfindungsgemäßen Lipide zu steigern, besteht die Möglichkeit, Zellen in Gegenwart von Substanzen zu transfektieren, die die enzymatische Aktivität in den Lysosomen inhibieren, sogenannte lysosomatotrope Substanzen, wie zum Beispiel Chloroquin oder von Viren abgeleitete lysosomatropisch wirkende Proteine.
Weiter besteht die Möglichkeit sogenannte Enhancer in Kombination mit den kationischen Lipiden einzusetzen. Enhancer verstärken die Wirkung der kationischen Lipide. Dabei gibt es Enhancer, die selbst keine transfizierenden Eigenschaften besitzen und solche die auch ohne kationische Lipide zur Transfektion verwendet werden können. Im ersten Fall kommt es zu einer einfachen Verstärkung (Amplifikation) der Transfektionseffizienz der kationischen Lipide. In letzterem Fall zeigt sich in kombinierter Anwendung eine Transfektionseffizienz die größer ist als bei Einzelanwendung. Die Kombinationswirkung kommt daher durch einen Synergieeffekt zustande. Enhancer entfalten ihre Wirkung in der Regel durch eine Vorkondensation der zu transfizierenden DNA oder sie Erhöhen die Permeabilisierbarkeit der zu durchdringenden Zellmembran. Beispiele für Enhancer sind Polyethylenimin, Transferrin, Protaminsulfat, Polyhistone, fusogene Peptide, Virushüllen, virale Oberflächenpeptide, replikationsdefiziente Viren usw.
Die erfindungsgemäßen Lipopolyamine sind bei physiologischem pH positiv geladen und können daher mit negativ geladenen Makromolekülen, insbesondere mit DNA und verwandten Stoffklassen stabile Aggregate Bilden. Die mit den Lipopolyaminen bemäntelten und positivierten Makromoleküle wechselwirken mit der negativ geladenen Zellmembran auf eine Weise, die zu einer Einschleusung der Makromoleküle in die Zelle führt. Dabei sind in vitro als auch in vivo Anwendungen möglich.
Im Vergleich zur zielgerichteten rezeptorvermittelten Endocytose (Wu et al., J. Chem. 262, 4429-4432, 1987), in denen Polykationen, welche auch DNA-Binder genannt werden (zum Beispiel Polylysin etc.) an sogenannte Internalisierungsfaktoren (zum Beispiel bestimmte Glykoproteine) gebunden sind, die zielgerichtet an Oberflächenrezeptoren bestimmter Zellen binden, besitzen die erfindungsgemäßen Lipide, bzw. deren Liposomenformulierungen keine Zellspezifität. Eine zielgerichtete Lieferung durch die erfindungsgemäßen Lipide bzw. deren Liposomenformulierungen kann dadurch erreicht werden, daß die Ladungen von Lipiden und den zu transportierenden Biomolekülen ausgeglichen werden und zusätzlich an das Aggregat zwischen Biomolekül und Lipiden Internalisierungsfaktoren angebracht werden. Dies kann zum Beispiel durch Liposomenformulierung mit Colipiden erreicht werden, falls die Colipide als Kopfgruppe solche Internalisierungsfaktoren tragen. Eine andere Möglichkeit ist ein auf Ladungsneutralität abgestimmtes Aggregat aus Biomolekül, Lipiden und Internalisierungs­ faktoren. Sogenannte Internalisierungsfaktoren sind Transferrin, Galactose, Mannose, Mannose-6-phosphat, Asialglycoprotein, Conalbumin, Lectine, Transcobalamin, α-2- Makroglobulin, Biotin, Folat, mannosylierte Glycoproteine. Weitere sind in EP 0535576, EP 0544292, WO 9421808 zu entnehmen, die hierin unter Bezugnahme aufgenommen werden. Analog wie Internalisierungsfaktoren, können auch zellspezifische Antikörper eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können zu Therapiezwecken eingesetzt werden. Insbesondere können solche Verbindungen für die Gentherapie von zum Beispiel Cystischer Fibrose, Muskeldystrophie, Phenylketonurie, Ahornsirupkrankheit, Propionazidämie, Methylmalonazidämie, Adenosindeaminasemangel, Hypercholesterinämie, Hämophilie und β-Thalassämie genutzt werden. Gentherapeutische Behandlungsmethoden sind weiters interessant, wenn Hormone, Wachstumsfaktoren, Cytotoxine oder immunomodulierend wirkende Proteine im Organismus synthetisiert werden sollen. Für die oben genannten Zwecke können DNA- Fragmente mittels dieser Lipide in Zellen gebracht werden, in denen diese DNA die gewünschte Wirkung entfaltet. Die gewünschte Wirkung kann der Ersatz fehlender oder defekter DNA- Bereiche oder die Inhibition von DNA-Bereichen (zum Beispiel Antisense-DNA/RNA), die die Erkrankung auslösen, im erkrankten Zelltyp sein. Auf diese Weise können tumorunterdrückende Gene in der Krebs-Therapie eingesetzt werden oder durch die Einführung cholesterolregulierender Gene ein Beitrag zur Vorbeugung von Herz- und Blutgefäßkrankheiten leisten. Weiter kann DNA, welche Ribozyme kodiert, oder Ribozyme selbst in erkrankte Zellen eingeschleust werden. Die Translation jener DNA erzeugt aktive Ribozyme, die an spezifischen Stellen m-RNA katalytisch spalten und auf diese Weise die Transkription verhindern. Auf diese Weise kann zum Beispiel virale m-RNA spezifisch gespalten werden, ohne eine andere zelluläre m-RNA in Mitleidenschaft zu ziehen. Der Vermehrungszyklus von Viren (z. B. HIV, Herpes, Hepatitis) kann auf diesem Wege unterbrochen werden.
Auch in der Krebstherapie spielt Transfektion zur Herstellung von Krebsvakzinen eine immer größer werdende Rolle. Damit ist dieses Feld auch mögliches Anwendungsgebiet für die erfindungsgemäßen Verbindungen.
Eine weitere Anwendung können solche Lipide zum Beispiel in Impfverfahren finden, die auf der Basis der Expression von DNA, welche immunogene Peptide kodiert, im Körper von Mensch und Tier funktionieren. Dazu werden Lipid/DNA-Komplexe als Impfstoffe benutzt. Die Einschleusung der DNA in die Körperzellen führt zur Expression des immunogenen Peptids und löst somit die Immunantwort aus.
Abgesehen von DNA können auch andere Makromoleküle, wie zum Beispiel PNA, Peptide, Peptoide oder Proteine, in Zellen eingeschleust werden. Zu diesem Zweck können sie mit den erfindungsgemäßen Lipopolyaminen als solche bemäntelt werden oder in Liposomen, welche als Komponente die erfindungsgemäßen Lipopolyamine enthalten, eingeschlossen oder an deren Oberfläche adsorbiert werden, falls eine negative Nettoladung vorhanden ist. Bringt man derartige Aggregate mit Zellen in Kontakt, so findet ein Transport dieser Moleküle durch die Zellwand statt. Therapeutische Peptide haben einen günstigen Einfluß auf zahlreiche Erkrankungen. Solche Peptide oder Proteine sind zum Beispiel Lymphokine, Interleukine, Tumore Nekrose Faktoren oder Interferone, weiterhin Wachstumsfaktoren, Gewebeplasminogenaktivator, Faktor-VIII:c, Granulocyten-Makrophagen-Kolonie- stimulierender Faktor, Erythropoietin, Insulin, Calcitonin, Thymidinkinase und andere. Auch toxische Peptide wie Ricin, Diphteriatoxin und andere können therapeutisch auf diese Weise gewinnbringend eingesetzt werden. Peptoide können erfolgreich als Peptidanaloga zur Verhinderung eines schnellen enzymatischen Abbaus im Körper eingesetzt werden.
Die erfindungsgemäßen Lipide werden auf Grund ihrer positiven Ladung vorwiegend dazu eingesetzt, negativ geladene Moleküle wegen ihrer negativen Ladung zu komplexieren und in Zellen einzuschleusen. Durch sogenannte "self assembling systems" können jedoch auch positiv geladene Moleküle transportiert werden, in dem zunächst negativ geladene Liposomen mit diesem positiv geladenen Molekülen komplexiert werden. Wählt man die Verhältnisse so, daß eine negative Nettoladung verbleibt, können diese Komplexe mit diesen erfindungsgemäßen Lipopolyaminen als solche oder in Form von Liposomen positiviert werden, in dem die gegensätzlich geladenen Komponenten in Kontakt gebracht werden. Die resultierenden positiv geladenen Gesamtkomplexe werden von den Zellen aufgenommen.
Weitere Anwendungsmöglichkeiten für kationische Lipide sind den Veröffentlichungen WO 9011092, WO 9116024, WO 9303768, Science 258, 744-746, 1992 zu entnehmen, die hierin unter Bezugnahme aufgenommen werden.
Beispiele für derzeit als therapeutisch aussichtsreich anzunehmende Sequenzen genetischen Materials sind in der Übersicht von F. W. Anderson, Science 256, 808, 1992 entnehmbar, die ebenfalls hierin unter Bezugnahme aufgenommen werden.
Beispiele
Bezugsquellen:
1. Plasmide: pCMV<Sport<β-Gal; Gibco BRL, Life Technologies
2. β-Galaktosidase-Assay-Kit, Stratagene
3. Tetra-BOC-Carboxyspermin wurde nach J.-P. Behr et al. Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, pp. 6982-6986, (1989) synthetisiert.
4. Lipofectamin™; Gibco-BRL: Life Technologies Inc.
5. N-tert.-Butyloxycarbonylethylendiamin, Aldrich.
6. O-(tert.-Butoxycarbonyl)-phenylglyoxyl-säurenitriloxim (BOC-ON); Aldrich.
7. N'-(3-Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid Methojodid (EDC), Aldrich.
8. 1-Hydroxy-1H-benzotriazol (HOBT), Aldrich.
9. 4-Methylmorpholin, Diisopropylethylamin (DIPEA), Triethylamin, Aldrich.
10. Trifluoressigsäure (TFA), Aldrich.
11. Dulbecco's modified Eagels Medium (DMEM), Gibco-BRL: Life Technologies Inc.
12. Fötales Kälberserum (FCS), Biochrom.
13. Penicillin, Streptomycin, SIGMA.
Beispiel 1 Transfektionsreagenz 1 Synthese von N-tert.-Butyloxycarbonyl-N',N'-dioctadecylethylendiamin
646 mg (1.94 mmol, MG 333.4) Octadecylbromid, 135 mg (0.84 mmol, Mg 160.22) N-tert.- Butyloxycarbonylethylendiamin (BOC-ethylendiamin) und 332 µl (1.94 mmol, MG 129.25, d 0.755) Diisopropylethylamin (DIPEA) werden in 10 ml Acetonitril gelöst und über Nacht unter Rückfluß gekocht. Nach Zugabe von 100 ml Ether wird mit Wasser gewaschen. Die organische Phase wird mit Magnesiumsulfat getrocknet und die Lösungsmittel abgezogen. Das schon relativ saubere Produkt wird durch Flashchromatographie gereinigt.
C43H88O2N2
MG 664.12
Rf = 0.44 (9 : 1 v/v Chloroform/Methanol)
MS (FAB): 665.7 (M + 1)
1H-NMR (CDCl3):
0.88 (tr, 6 H, CH3); 1.26 ("s", 60 H, CH2); 1.40 (m, 4 H, N-CH2CH 2); 1.44 (s, 9 H, CH3BOC); 2.40 (tr, 4 H, N-CH2); 2.50 (tr, 2 H, N-CH2); 3.15 (m, 2 H, OCO-N-CH2).
13C-NMR (CDCl3):
13.1 (CH3); 22.7, 27.0, 25.5 (CH2); 28.5 (CH3BOC); 29.4, 29.6 29.7, 29.7 (CH2); 53.2 (N- CH2); 54.0 (N-CH2); 78.9 (CqBOC); 156.1 (OCO).
Ausbeute: 390 mg (69%)
Synthese von N-[Tetra-tert.-butyloxycarbonyl-[(2,5-bis(3-aminopropyl)amino)-1-oxopentyl]]- N',N'-dioctadecylethylendiamin
157 mg (0.236 mmol, MG 665.12) N-tert.-Butyloxycarbonyl-N',N'-Dioctadecylethylendiamin werden in 4 ml eines 1 : 3 v/v Gemisches aus Trifluoressigsäure (TFA) und Methylenchlorid aufgenommen. Nach 2-3 h wird abrotriert und 0.5 h am Hochvakuum getrocknet. Anschließend wird in 6 ml eines 1 : 1 v/v Gemisches aus DMF und Methylenchlorid aufgenommen und mit 300 µl 4-Methylmorpholin versetzt. Anschließend werden 152.6 mg (0.236 mmol, MG 646.8) Tetra-BOC-Carboxyspermin in 2 ml eines 1 : 1 v/v Gemisches aus Dimethylformamid (DMF) und Methylenchlorid gelöst und zugegeben. Weiterhin werden 45 mg (0.330 mmol) 1-Hydroxy-1H-benzotriazol (HOBT) und 98 mg (0.330 mmol) N'-(3- Dimethylaminopropyl)-N-ethylcarbodiimid Methojodid (EDC) zugegeben und 50 h bei RT gerührt. Die Lösungsmittel werden abrotiert und der Rückstand in Methylenchlorid aufgenommen. Danach wird mit Wasser gewaschen, die organische Phase mit Natriumsulfat getrocknet und abrotiert. Das Rohprodukt wird über Flashchromatographie gereinigt.
C51H136N6O9
MG 997,65
Rf = 0.40 (9 : 1 v/v Methylenchlorid/Methanol)
1H-NMR (CDCl3):
0.88 (tr, 6 H, Ch3); 1.25 ("s", 64 H, CH2); 1.44 (m, 36 H, CH3BOC); 1.67 (m, 8 H, Spermin: CH2CH 2CH2); 236 (mr, 4 H, Stearyl: N-CH2); 2.51 (m, 2 H, Ethylendiamin: N-CH2); 3.1-3.25 (m, 10 H, OC-N-CH2).
Ausbeute: 135 mg (59%)
Synthese von N-[2,5-Bis((3-aminopropyl)amino)-1-oxopentyl]-N',N'-dioctadecylethylen­ diamin (TFA-Salz)
70 mg N-[Tetra-tert.-butyloxycarbonyl-[(2,5-bis(3-aminopropyl)amino)-1-oxopentyl]]- N',N'- dioctadecylethylendiamin werden in 2 ml eines Gemisches aus Methylenchlorid und Trifluoressigsäure (3 : 1 v/v) gelöst und 1.5 h bei RT gerührt. Danach wird abrotiert, in 10 ml eines Gemisches aus Wasser/tert.-Butanol (1 : 1 v/v) aufgenommen und lyophilisiert.
C53H104ON6 (× 4 CF3COOH)
MG 793.52 (+ 4 × 114 = 1249.52)
Ausbeute: 100%
Beispiel 2 Transfektionsreagenz 2 Synthese von N',N'-Bis-(2-cyanoethyl)-N-tert.-butyloxycarbonylethylendiamin
500 mg (3.12 mmol, MG 160.22) N-tert.-Butyloxycarbonylethylendiamin werden in 5 ml Wasser gelöst und 0.65 ml (9.8 mmol, MG 53.06) Acrylnitril zugegeben. Danach wird 7 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Danach wird mit Essigester überschichtet, ausgeschüttelt und die organische Phase abgetrennt. Nach Trocknen über Natriumsulfat wird abrotiert.
C13H22O2N4
MG 266.34
Rf = 0.69 (9 : 1 v/v Chloroform/Ethanol)
Ausbeute: 660 mg (80%)
Synthese von N',N'-Bis-(2-cyanoethyl)-N,N-dioctadecylethylendiamin
660 mg (2.48 mmol, MG 266.34) N',N'-Bis-(2-cyanoethyl)-N-tert.-butyloxycarbonylethylen­ diamin werden in 10 ml eines 1 : 3 v/v Gemisches aus Trifluoressigsäure und Methylenchlorid aufgenommen. Nach 2-3 h wird abrotriert und 0.5 h am Hochvakuum getrocknet. Danach wird aus Butanol/Wasser (1 : 1 v/v) lyophilisiert. Das erhaltene Trifluoracetat wird in 40 ml trockenen Acetonitril zusammen mit 2.43 g (7.28 mmol, MG 333.4) Octadecylbromid und 2.23 ml (1.68 g, 13.02 ml, MG 129.25, d 0.755) Diisopropylethylamin (DIPEA) gelöst und 24 Stunden unter Rückfluß gekocht. Das Rohprodukt wird über Flashchromatographie gereinigt.
C44H86N4
MG 671.16
Rf = 0.42 (9 : 1 v/v Methylenchlorid/Methanol)
1H-NMR (CDCL3):
0.88 (tr, 6 H, CH3); 1.26 ("s", 60 H, CH2); 1.42 (m, 4 H, N-CH2CH 2) 2.42 (m, 4 H, N-CH2); 2.48 (tr, 4 H, CH2-CN); 2.50 (m, 2 H, N-CH2); 2.50 (m, 2 H, N-CH2); 2.92 (tr, 4 H, N-CH2).
Ausbeute: 330 mg (20%)
Synthese von N',N'-Bis-(3-aminopropyl)-N,N-dioctadecylethylendiamin (TFA-Salz)
2.5 g Raney-Nickel werden zu 50 ml Wasser gegeben. Dazu wird unter Rühren 4.5 g Natriumhydroxid so schnell zugegeben, daß das Wasser gerade nicht überkocht und anschließend eine halbe Stunde gerührt. 320 mg (0.48 mmol, MG 671.2) N',N'-Bis-(2- cyanoethyl)-N,N-dioctadecylethylendiamin werden in 500 ml 0.5 M Kaliumhydroxidlösung (in EtOH/Wasser 95 : 5 v/v) aufgenommen. Das aktivierte Raney-Nickel wird vom Überstand durch abdekantieren getrennt und zur Eduktlösung gegeben. Danach wird 24 Stunden an einer Hydrieranlage hydriert. Nach Einrotieren des Lösungsmittels wird der Rückstand in 5 ml Methylenchlorid gelöst. Dazu werden 500 mg (2.02 mmol, MG 246.27) O-(tert.- Butoxycarbonyl)-phenylglyoxyl-säurenitriloxim (BOC-ON) gegeben und bei Raumtemperatur 24 Stunden gerührt. Danach wird einrotiert. Das Rohprodukt wird über Flashchromatographie gereinigt. Danach wird das Produkt in 10 ml eines 1 : 3 v/v Gemisches aus Trifluoressigsäure und Methylenchlorid aufgenommen. Nach 2-3 h wird abrotriert und 0.5 h am Hochvakuum getrocknet. Zuletzt wird aus Butanol/Wasser (1 : 1 v/v) lyophilisiert.
C44H94N4 × 4 CF3COOH
MG 679.21 (+4 × 114 = 1135.21)
MS (ESI): 680.2
Ausbeute: 250 mg (58% bezogen auf Nitril)
Beispiel 3 Verzweigte Kopfgruppen Synthese von N-(tert.-Butyloxycarbonyl)-3-brompropylamin
500 mg (2.28 mmol; MG 218.94) 3-Brom-1-propylamin Hydrobromid (Aldrich) werden zusammen mit 1.13 (4.59 mmol; MG 246.27) O-(tert.-Butoxycarbonyl)-phenylglyoxyl­ säurenitriloxim (BOC-ON) und 0.65 ml (0.46 g; 4.6 mmol) Triethylamin in einem Gemisch aus Aceton und Wasser (1 : 1, v/v) gelöst. Nach 2 Stunden Rühren wird eingeengt und in Methylenchlorid aufgenommen. Die organische Phase wird mit Wasser gewaschen, mit Natriumsulfat getrocknet und einrotiert. Das Rohprodukt wird durch Flashchromatographie gereinigt.
C8H16O2NBr
MG 238.31
Rf = 0.84 (9 : 1 v/v Methylenchlorid/Methanol)
1H-NMR (CDCl3):
1.36 (br s, 9 H, CH3BOC); 1.98 (m, 2 H, C-CH2-C); 3.19 (M, 2 H, Br-CH 2); 3.38 (m, 2 H, N-CH2); 4.90 (br s, 1 H, N-H).
13C-NMR (CDCl3):
28.2 (CH3); 30.6, 32.6, 38.8 (CH2); 79.1 (Cq); 155.8 (C=O).
Ausbeute: 250 mg (46%)
Synthese von N',N'-Bis-(3-aminopropyl)-N,N-dioctadecylethylendiamin (TFA-Salz)
200 mg (0.3 mmol, MG 665.12) N-tert.-Butyloxycarbonyl-N',N'-dioctadecylethylendiamin werden in 2 ml eines Gemisches aus Trifluoressigsäure und Methylenchlorid (1 : 3 v/v) gelöst. Nach zwei Stunden wird abrotiert und 2 Stunden im Hochvakuum getrocknet. Danach wird in 20 ml Chloroform aufgenommen und 1 ml (920 mg, 4.5 mmol, MG 101.15, d = 0.92) 4-Methylmorpholin zugegeben. Anschließend werden 640 mg (2.68 mmol, MG 238.13) N-(tert.- Butyloxycarbonyl)-3-brompropylamin zugegeben. Nach 48 Stunden Kochen unter Rückfluß wird einrotiert und das BOC-geschützte Vorläuferprodukt durch Flashchromatographie gereinigt. Abschließend wird in 2 ml eines Gemisches aus Trifluoressigsäure und Methylenchlorid (1 : 3 v/v) gelöst, einrotiert und lyophilisiert.
C44H94N4 × 4 CF3COOH
MG 679.21 (+4 × 114 = 1135.21)
MS (ESI): 680.2
Ausbeute: 46 mg (13%)
Synthese von N,N',N'-Tris(cyanoethyl)-ornithin
950 mg Natriumhydroxid werden in 20 ml Wasser gelöst. In der Natronlauge werden 2 g (11.86 mmol, MG 168.62) Ornithin Hydrochlorid gelöst. Danach werden 3 ml (45.57 mmol) Acrylnitril zugetropft und 24 Stunden bei Raumtemperatur gerührt. Nach der Zugabe von 1.7 ml 25%iger Salzsäure fällt ein Feststoff aus. Dieser wird nach Kühlung abgenutscht.
C14H21O2H5 × HCl
MG 327.82
Rf = 0.71 (1 : 1 : 1 v/v/v Isopropanol/Ethanol/Wasser)
1H-NMR (D2O):
1.58 (m, 2 H, CH 2-CHOrn); 1.90 (m, 2 H, CH2Orn); 2.61 (m, 6 H, NC-CH 2); 2.86 (tr, 4 H, N-CH2); 2.98 (tr, 2 H, N-CH2-CH 2); 3.39 (tr, 2 H, N-CH2); 368 (tr, 1 H, CHOrn).
Ausbeute: 2.1 g (54%)
Synthese von N,N,N',N'-Tetra (cyanoethyl)-ornithin
980 mg Natriumhydroxid werden in 20 ml Wasser gelöst. In der Natronlauge werden 2 g (11.86 mmol, MG 168.62) Ornithin Hydrochlorid gelöst. Danach werden 3.9 ml (59.3 mmol) Acrylnitril zugetropft und 8 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Danach werden nochmals 3 ml Acrylnitril zugetropft und weitere 6 Stunden gerührt. Nach der Zugabe von 1.7 ml 25%iger Salzsäure wird das Produkt 3 × mit Essigester ausgeschüttelt. Die organische Phase wird über Natriumsulfat getrocknet und einrotiert.
C17H24O2N6 × HCl
MG 344.4182
Rf = 0.84 (1 : 1 : 1 v/v/v Isopropanol/Ethanol/Wasser)
1H-NMR (D2O):
1.60 (m, 2 H, CH 2-CHOrn); 1.92 (m, 2 H, CH2Orn); 2.52 (m, 8 H, NC-CH 2); 2.61 (tr, 4 H, CH2Orn); 2.87 (tr, 4 H, N-CH2); 3.03 (tr, 4 H, N-CH2); 3.38 (m, 1 H, CHOrn).
Ausbeute: 2.4 g (59%)
Beispiel 4 Liposomen/Micellenformulierung
Dioleoylphosphatidylethanolamin, Dioleoylphosphatidylcholin, Cholesterol oder Cholesteryl­ amin werden in einem organischen Lösungsmittel (z. B. Chloroform) gelöst. Das Lipid aus Beispiel 1 wird als solches in Form seines Salzes, zum Beispiel Trifluoracetat-Salzes in einem organischen Lösungsmittel (z. B. Chloroform) gelöst. Durch Kombination verschiedener Mengen der unterschiedlichen Lösungen werden verschiedene Kompositionen aus Colipiden und kat. Lipid hergestellt. In einem Glaskolben wird mit Hilfe eines Rotationsverdampfers ein dünner Lipidfilm erzeugt. Dieser wird im Hochvakuum von Lösungsmittelresten befreit. Der Film wird mit soviel Wasser oder wäßriger Pufferlösung hydratisiert, daß die Konzentration 2 mg Lipid pro ml Lösung beträgt. Danach wird unter Kühlung mit Ultraschall (3 × 15 min) behandelt. Die Formulierung wird durch einen Filter (Porenweite 0.2 µm) sterilfiltriert.
Beispiel 5 Lipidlösungen
Die Lipide werden als solches und in Form ihrer TFA-Salze mit oder ohne Colipiden in Ethanol gelöst. Durch Mischen mit Wasser erhält man Lösungen unterschiedlicher Zusammensetzungen.
Beispiel 6 Zellkulturen
Die Zelllinien CV-1, Hela S3 und NIH 3T3 werden in "Dulbecco's-modified Eagle's medium" (DMEM), das 10% fötales Kälberserum (FBS), 2 mM L-Glutamin (Gln), 0.1 mM nicht essentielle Aminosäuren (NEAA), 100 U/ml Penicillin und 100 µg/ml Streptomycin enthält, in einem Inkubator (5% CO2-Atmosphäre) kultiviert.
Beispiel 7 Transfektion
Die Zellen werden auf einer 12-Well-Mikrotiterplatte mit einer Dichte von 1-1.5 × 105 ausplattiert und über Nacht zu annähernd 60-80% Konfluenz inkubiert. Um die Zellen in einem "Well" zu transfizieren, werden 1.5 µg von pCMV<Sport<β-Gal in 50 µl serum- und antibiotikafreiem DMEM gelöst. Das kationische Lipid (z. B. 3, 6, 9, 12 µl) als ethanolische Lösung oder Liposomenformulierung wird ebenfalls in 50 µl serum- und antibiotikafreiem DMEM gelöst. Die beiden Lösungen werden in einem Polystyrolbehälter gemischt und für 10-15 min stehengelassen, um die Bildung des Lipid/DNA-Komplexes zu ermöglichen.
Während dessen werden die Zellen einmal mit PBS (phosphate buffered saline) gewaschen. Je nach gewünschten Bedingungen (Transfektion im serumfreien oder serumhaltigen Milieu) werden 0.4 ml antibiotikafreies DMEM mit oder ohne Serum zu den Zellen gegeben. Der DNA/Lipid-Komplex wirkt direkt zu den Zellen gegeben und im Brutschrank 6 h inkubiert. Danach wird mit serum- und antibiotikahaltigem DMEM in der Weise auf 1 ml aufgefüllt, daß das Medium eine Endkonzentration von 10% Serum enthält. Die Zellen werden weitere 20 h kultiviert. Danach wird auf β-Galactosidase nach den Angaben des Herstellers des β-Galaktosidase-Assay-Kits getestet. Das entwickelte O-Nitrophenol wird photometrisch bei 405 nm vermessen.
Resultate
Folgende Tabelle und folgendes Balkendiagramm zeigen Transfektionseffizienzen am Beispiel von Hela S3 Zellen im Vergleich.
Transfektionsreagenz 1:
N-[2,5-Bis((3-aminopropyl)amino)-1-oxopentyl]-N',N'-dioctadecylethylen-diamin (TFA-Salz) wurde als Liposomenformulierung mit 25 Mol-% Dioleoylphosphatidylethanolamin in wäßriger steriler Lösung eingesetzt. Gesamtlipidmenge: 2 mg/ml.
Transfektionsreagenz 2:
N',N'-Bis-(3-aminopropyl)- N,N-dioctadecylethylendiamin (TFA-Salz) wurde als Liposomenformulierung mit 50 Mol-% Dioleoylphosphatidylethanolamin in wäßriger steriler Lösung eingesetzt. Gesamtlipidmenge: 2 mg/ml.
Transfektionsreagenz 3:
Lipofectamin™ (Gibco-BRL: Life Technologies Inc.) wurde vom Hersteller erworben.
Absorbtionswerte bei 405 nm
Relative Transfektionseffizienzen

Claims (16)

1. Verbindungen der allgemeinen Formel I:
Formel I:
die bei Vorhandensein eines Asymmetriezentrums in der D-, L- oder DL-Form vorliegen, einschließlich ihrer Salze, wobei
R1 ein lipophiler Rest folgender allgemeiner Formel ist:
in welcher R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl, Octadecenyl oder andere Alkylreste, die in allen möglichen Kombinationen gesättigt, ungesättigt, verzweigt, unverzweigt, fluoriert oder nicht fluoriert sein können, und aus 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29 oder 30 Kohlenstoffatomen aufgebaut sind,
und X eine der folgenden Gruppierungen ist:
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für den Fall g = 0, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 0 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 0 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 1 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 1 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können, oder
wobei m = 2 und n = 2 sind und für diesen Fall g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8, a = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, b = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, c = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, d = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, e = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, f = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 sein können.
In allen vorstehenden Fällen soll b kleiner oder gleich 1 sein, wenn a = 0 ist und f kleiner oder gleich 1 sein, wenn e = 0 ist.
2. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein kann und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
3. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei h = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein können und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
4. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei r = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein können und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
5. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein können und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
6. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei k = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein können und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
7. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein kann und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
8. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein kann und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
9. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei l = 0, 1, 2, 3, 4, 5 oder 6 und g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein können und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
10. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein kann und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
11. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
wobei g = 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 oder 8 sein kann und R2 und R3 unabhängig voneinander Dodecyl, Dodecenyl, Tetradecyl, Tetradecenyl, Hexadecyl, Hexadecenyl, Octadecyl oder Octadecenyl sein können.
12. Verbindungen und ihre Salze entsprechend Claim 1 mit folgenden Strukturen:
13. Formulierungen, die Liposomen oder Micellen enthalten, die Verbindungen der Ansprüche 1-12 kombiniert mit Colipiden mit oder ohne Colipide, wie z. B. Dioleoylphosphatidylethanolamin (DOPE), Dioleoylphosphatidylcholin, Cholesterol oder Cholesterylamin enthalten.
14. Verfahren zum Einbringen von biologisch wirksamen Verbindungen, wie DNA, RNA, Ribozymen, Antisense-DNA, PNA, Peptiden, Peptoiden und Proteinen in eukariotische Zellen, wobei Verbindungen oder Formulierungen nach einem der Ansprüche 1-13 mit den einzubringenden Verbindungen komplexieren und die entstandenen Komplexe mit eukariotischen Zellen in vivo oder in vitro in Kontakt gebracht werden.
15. Verwendung der Verbindungen oder Formulierungen nach einem der Ansprüche 1-13 als Reagenz oder Medikament oder als Bestandteil von einem Reagenz oder Medikament zum Einbringen von biologisch wirksamen Verbindungen, wie DNA, RNA, Ribozymen, Antisense- DNA, PNA, Peptiden, Peptoiden und Proteinen in eukariotische Zellen in vivo oder in vitro.
16. Verwendung der Verbindungen oder Formulierungen nach einem der Ansprüche 1-13 als Reagenz oder Medikament oder als Bestandteil von einem Reagenz oder Medikament zum Einbringen von biologisch wirksamen Verbindungen, wie DNA, RNA, Ribozymen, Antisense- DNA, PNA, Peptiden, Peptoiden und Proteinen in eukariotische Zellen in vivo oder in vitro in Kombination mit sogenannten Enhancern, die deren Wirkung verstärken.
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