DE60025713T2

DE60025713T2 - Nukleinsäuresequenzen für proteine, die an der tocopherolbiosynthese beteiligt sind

Info

Publication number: DE60025713T2
Application number: DE60025713T
Authority: DE
Inventors: Beth Davis SAVIDGE; W. Michael Davis LASSNER; D. James St. Louis WEISS; Dusty St. Louis POST-BEITTENMILLER
Original assignee: Calgene LLC
Current assignee: Monsanto Co
Priority date: 1999-04-15
Filing date: 2000-04-14
Publication date: 2006-11-02
Anticipated expiration: 2020-04-15
Also published as: BR0010616A; BR0009763A; CA2369844C; CN1318593C; US20020108148A1; AU777584B2; CN100387721C; US20040018602A1; EP1190068A2; CA2369844A1; US20050120406A1; MXPA01010486A; DK1190068T3; US7067647B2; US7265207B2; PT1190068E; AU2005200270A1; US7141718B2; JP2002541851A; CA2370616C

Description

EINLEITUNG
TECHNISCHES GEBIET
Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen und Konstrukte und Verfahren, die damit in Beziehung stehen.
HINTERGRUND
Isoprenoide sind allgegenwärtig vorkommende Verbindungen, die in allen lebenden Organismen vorkommen. Pflanzen synthetisieren eine vielfältige Anzahl von mehr als 22 000 Isoprenoiden (Connolly und Hill (1992) Dictionary of Terpenoids, Chapman und Hall, New York, NY). In Pflanzen spielen Isoprenoide wesentliche Rollen bei bestimmten Zellfunktionen, wie der Produktion von Sterolen, die zur Membranarchitektur der Eukaryonten beitragen, azyklischen Polyprenoiden, die in den Seitenketten von Ubichinon und Plastochinon vorkommen, Wachstumsregulatoren wie Abscisinsäure, Gibberellinen, Brassinosteroiden oder den photosynthetischen Pigmenten Chlorophylle und Carotinoiden. Obwohl die physiologische Funktion von anderen Pflanzen-Isoprenoiden weniger deutlich ist, wie die der großen Anzahl von Sekundärmetaboliten, ist von einigen bekannt, dass sie eine wichtige Rolle bei der adaptiven Antwort auf verschiedene Umwelteinflüsse spielen. Trotz der bemerkenswerten Vielfältigkeit der Struktur und Funktion, stammen alle Isoprenoide von einem einzigen metabolischen Vorläufer, Isopentenyldiphosphat (IPP), ab (Wright, (1961) Annu. Rev. Biochem. 20: 525–548; und Spurgeon und Porter, (1981) in Biosynthesis of Isoprenoid Compounds., Porter und Spurgeon, Hrsg. (John Wiley, New York) Band 1, Seiten 1–46).
Es existiert eine Anzahl von einzigartigen und miteinander verbundenen biochemischen Stoffwechselwegen in Chloroplasten höherer Pflanzen, die von dem Isoprenoidstoffwechselweg, der zu Sekundärmetaboliten einschließlich von Tocopherolen führt, abgeleitet sind. Tocopherole haben nicht nur lebenswichtige Funktionen in Pflanzen, sondern sind ferner aus Sicht der Sicht der Säugetierernährung wichtig. In Plastiden machen Tocopherole bis zu 40% des gesamten Chinonpools aus.
Tocopherole und Tocotrienole (ungesättigte Tocopherolderivate) sind gut bekannte Antioxidantien und spielen eine wichtige Rolle beim Schutz von Zellen vor Schäden durch freie Radikale und in der Verhinderung von vielen Krankheiten einschließlich Herzkrankheiten, Krebs, Katarakten, Retinopathien, Alzheimer-Krankheit und Neurodegeneration, und es wurde gezeigt, dass sie positive Wirkungen auf die Symptome von Arthritis und beim Anti-Aging haben. Vitamin E wird im Hühnerfutter verwendet, um die Haltbarkeit, das Aussehen, den Geschmack und die oxidative Stabilität des Fleisches zu verbessern und um Tocole aus dem Futter in die Eier zu überführen. Es wurde gezeigt, dass Vitamin E für eine normale Reproduktion essentiell ist, die Gesamtentwicklung verbessert und die Immunkompetenz bei Tieren aus Viehbeständen verbessert. Vitamin E-Zusatz in Tierfutter verleiht auch Milchprodukten oxidative Stabilität.
Der Bedarf an natürlichen Tocopherolen als Ergänzungen ist innerhalb der letzten drei Jahre mit einer Rate von 10 bis 20% stetig angewachsen. Derzeit übersteigt der Bedarf den Vorrat an natürlichen Tocopherolen, von denen man weiß, daß sie eine größere Biopotenz aufweisen als racemische Gemische von synthetisch hergestellten Tocopherolen. Natürlich vorkommende Tocopherole sind alles d-Stereoisomere, wohingegen synthetisches α-Tocopherol eine Mischung aus acht d,l-α-Tocopherolisomeren ist, von denen nur eins (12,5%) mit natür lichem d-α-Tocopherol identisch ist. Natürliches d-α-Tocopherol hat die höchste Vitamin E-Aktivität (1,49 IU/mg) verglichen mit anderen natürlichen Tocopherolen oder Tocotrienolen. Das synthetische α-Tocopherol hat eine Vitamin E-Aktivität von 1,1 IU/mg. 1995 betrug der weltweite Markt für aufbereitete Tocopherole 1020 Millionen Dollar; synthetische Materialien umfassten 85 bis 88% des Marktes während die verbleibenden 12 bis 15% natürliche Materialien waren. Die besten Quellen für natürliche Tocopherole und Tocotrienole sind pflanzliche Öle und Getreideprodukte. Derzeit wird der größte Teil des natürlichen Vitamin E aus γ-Tocopherol produziert, das aus der Sojaölgewinnung stammt, und das später durch chemische Modifizierung zu α-Tocopherol umgewandelt wird (α-Tocopherol zeigt die größte biologische Aktivität).
Verfahren zur Steigerung des Gehaltes an Tocopherolen und Tocotrienolen in Pflanzen, insbesondere den Gehalten an mehr gewünschten Verbindungen, die ohne chemische Modifizierung direkt verwendet werden können, wären für das Fachgebiet nützlich, da solche Moleküle eine bessere Funktionalität und Bioverfügbarkeit aufweisen.
Weiterhin sind Verfahren für die gesteigerte Produktion von anderen, von Isoprenoiden abgeleiteten Verbindungen in einer Wirtspflanzenzelle wünschenswert. Zudem werden Verfahren für die Produktion bestimmter Isoprenoidverbindungen in einer Wirtspflanzenzelle benötigt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft eine isolierte Nukleinsäuresequenz, die für eine Prenyltransferase kodiert, wobei die Prenyltransferase Homogentisinsäure prenyliert, und wobei die Nukleinsäuresequenz die SEQ ID NO: 1 umfasst.
Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die Erfindung ein Nukleinsäurekonstrukt, das als funktionsfähig verknüpfte Bestandteile einen Transkriptions-Initiationsbereich, der in einer Wirtszelle aktiv ist, eine Nukleinsäure, die für eine Prenyltransferase kodiert, wobei die Prenyltransferase Homogentisinsäure prenyliert, und wobei die Nukleinsäuresequenz die SEQ ID NO: 1 umfaßt oder wobei die Nukleinsäure für die SEQ ID NO: 2 kodiert, umfasst.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Wirtszelle, welche die oben genannten Konstrukte umfasst. Die Wirtszelle ist vorzugsweise eine Pflanzenzelle.
Die Erfindung umfasst ebenfalls transgene Pflanzen, die eine entsprechende Pflanzenzelle umfassen.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 stellt einen Aminosäuresequenzabgleich zwischen ATPT2, ATPT3, ATPT4, ATPT4 und ATPT12, der mit ClustalW durchgeführt wurde, bereit.
2 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10800 bereit.
3 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10801 bereit.
4 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10803 bereit.
5 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10806 bereit.
6 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10807 bereit.
7 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10808 bereit.
8 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10809 bereit.
9 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10810 bereit.
10 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10811 bereit.
11 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10812 bereit.
12 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10813 bereit.
13 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10814 bereit.
14 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10815 bereit.
15 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10816 bereit.
16 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10817 bereit.
17 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10819 bereit.
18 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10824 bereit.
19 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10825 bereit.
20 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10826 bereit.
21 stellt einen Aminosäuresequenzabgleich unter Verwendung von ClustalW zwischen den Knockouts der Synechocystis-Sequenzen bereit.
22 stellt eine Aminosäuresequenz der ATPT2-, ATPT3-, ATPT4-, ATPT8-, und ATPT12-Proteinseqenzen aus Arabidopsis und den slr1736-, slr0926-, sll1899-, slr0056- und slr1518-Aminosäuresequenzen aus Synechocystis bereit.
23 stellt die Ergebnisse der enzymatischen Assays von Präparationen des Wildtyp-Synechocystis-Stamms 6803 und des Synechocystis slr1736-Knockouts bereit.
24 stellt Balkendiagramme der HPLC-Daten bereit, die aus Samenextrakten von transgenem Arabidopsis erhalten wurden, das pCGN10822 enthält, das die Expression der ATPT2-Sequenz in Sinn-Orientierung („sense") von dem Napinpromotor bereitstellt. Bereitgestellt werden Diagramme für alpha-, gamma- und delta-Tocopherole sowie für Gesamt-Tocopherol von 22 transformierten Linien sowie einer nicht-transformierten (Wildtyp)-Kontrolle.
25 stellt ein Balkendiagramm von HPLC-Analysen von Samenextrakten aus Arabidopsis-Pflanzen bereit, die mit pCGN10803 (35S-ATPT2 in der Gegensinn-Orientierung), pCGN10802(Linie 1625, Napin-ATPT2 in der Sinn-Orientierung), pCGN10809 (Linie 1627, 35S-ATPT3 in der Sinn-Orientierung), transformiert wurden, einer nicht-transformierten (wt) Kontrolle und einer mit einem leeren Vektor transformierten Kontrolle.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt unter anderem Zusammensetzungen und Verfahren zur Änderung (z.B. Erhöhung oder Verminderung) der Tocopherolgehalte und/oder Modulierung ihrer Verhältnisse in Wirtszellen zur Verfügung. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Polynukleotide und Verfahren zu ihrer Verwendung für die Modulierung des Tocopherolgehalts in Wirtspflanzenzellen zur Verfügung.
Die vorliegende Erfindung stellt Polynukleotidsequenzen zur Verfügung, die an der Prenylierung von geradlinigen Ketten und aromatischen Verbindungen beteiligt sind. Prenyltransferasen für geradlinige Ketten, wie sie hier verwendet werden, umfassen Sequenzen, die für Proteine kodieren, die an der Prenylierung von Verbindungen mit geradlinigen Ketten beteiligt sind, einschließlich aber nicht beschränkt auf Geranylgeranylpyrophosphat und Farnesylpyrophosphat. Aromatische Prenyltransferasen, wie sie hier verwendet werden, umfassen Sequenzen, die für Proteine kodieren, die an der Prenylierung von aromatischen Verbindungen beteiligt sind, einschließlich aber nicht beschränkt auf Menachinon, Ubichinon, Chlorophyll und Homogentisinsäure. Die Prenyltransferase der vorliegenden Erfindung prenyliert Homogentisinsäure.
Die Biosynthese von α-Tocopherol in höheren Pflanzen schließt die Kondensation von Homogentisinsäure und Phytylpyrophosphat zur Bildung von 2-Methyl-6-phytylbenzochinol ein, das durch Zyklisierung und anschließende Methylierungen verschiedene Tocopherole bilden kann (Fiedler et al., 1982, Planta, 155: 511–515, Soll et al., 1980, Arch. Biochem. Biophys. 204: 544–550, Marshall et al., 1985 Phytochem., 24: 1705–1711, die alle in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hier aufgenommen werden). Die von Norris et al. (1995) identifizierte und charakterisierte Arabidopsis-pds2-Mutante ist unzulänglich bei der Tocopherol- und Plastichinon-9-Akkumulation. Weitere genetische und biochemische Analysen legen nahe, dass das Protein, das durch PDS2 kodiert wird, für die Prenylierung von Homogentisinsäure verantwortlich sein könnte. Dies könnte ein geschwindigkeitsbegrenzender Schritt der Tocopherol-Biosynthese sein, und dieses Gen muss noch isoliert werden. Somit ist es ein Aspekt der vorliegenden Erfindung, Polynukleotide zur Verfügung zu stellen, die an der Prenylierung von Homogentisinsäure beteiligt sind.
Isolierte Polynukleotide
Ein erster Aspekt der vorliegenden Erfindung betrifft isolierte Prenyltransferase-Polynukleotide, wie sie oben in der Zusammenfassung der Erfindung definiert sind.
Die Polynukleotide der Erfindung können beispielsweise bei der Transformation von Wirtszellen, wie beispielsweise Pflanzenwirtszellen, verwendet werden, wie hier im Weiteren diskutiert werden wird.
Die Erfindung stellt ebenfalls Polynukleotide zur Verfügung, die für ein Polypeptid kodieren, das ein reifes Protein plus zusätzlicher amino- oder carboxyterminaler Aminosäuren oder Aminosäuren innerhalb des reifen Polypeptids (z.B. wenn die reife Form des Proteins mehr als eine Polypeptidkette aufweist) ist. Solche Sequenzen können beispielsweise eine Rolle bei der Prozessierung eines Proteins von einem Vorläufer zu einer reifen Form spielen, Proteintransport ermöglichen, die Halbwertszeit eines Proteins verkürzen oder verlängern, oder die Handhabung des Proteins in Assays oder bei der Herstellung erleichtern. Es wird erwogen, dass zelluläre Enzyme verwendet werden können, um jegliche zusätzlichen Aminosäuren aus dem reifen Protein zu entfernen.
Ein Vorläuferprotein, das die reife Form des Polypeptids fusioniert an ein oder mehrere Prosequenzen aufweist, kann eine inaktive Form des Polypeptids sein. Die inaktiven Vorläufer werden im Allgemeinen aktiviert, wenn die Prosequenzen entfernt werden. Einige oder alle der Prosequenzen können vor der Aktivierung entfernt werden. Solche Vorläuferproteine werden im Allgemeinen Proproteine genannt.
Pflanzenkonstrukte und Verfahren der Verwendung
Von besonderem Interesse ist die Verwendung der Nukleotidsequenzen in rekombinanten DNA-Konstrukten, um die Transkription oder Transkription und Translation (Expression) der Prenyltransferasesequenzen der vorliegenden Erfindung in einer Wirtspflanzenzelle zu steuern. Die Expressionskonstrukte umfassen im allgemeinen einen Promotor, der in einer Wirtspflanzenzelle funktionsfähig ist und funktionsfähig mit einer Nukleinsäuresequenz verknüpft ist, die für eine Prenyltransferase der vorliegenden Erfindung kodiert, und einen Transkriptionsterminierungsbereich, der in der Wirtspflanzenzelle funktionsfähig ist.
Eine erste Nukleinsäuresequenz ist "funktionsfähig verknüpft" oder "funktionsfähig assoziiert" mit einer zweiten Nukleinsäuresequenz, wenn diese Sequenzen so angeordnet sind, dass die erste Nukleinsäuresequenz die Funktion der zweiten Nukleinsäuresequenz beeinflusst. Bevorzugt sind die zwei Sequenzen Teil eines einzigen zusammenhängenden Nukleinsäuremoleküls und bevorzugter sind sie angrenzend. Zum Beispiel ist ein Promotor mit einem Gen funktionsfähig verknüpft, wenn der Promotor die Transkription des Gens in einer Zelle reguliert oder vermittelt.
Fachleute werden erkennen, dass es eine Anzahl von Promotoren gibt, die in Pflanzenzellen funktionsfähig sind und die in der Literatur beschrieben wurden. Chloroplasten- und Plastiden-spezifische Promotoren, Promotoren, die in Chloroplasten oder Plastiden funktionsfähig sind, und Promotoren, die in Chloroplasten oder Plastiden verwendbar sind, sind ebenfalls bekannt.
Eine Gruppe von funktionsfähigen Pflanzenpromotoren sind konstitutive Promotoren, wie z.B. CaMV35S- oder FMV35S-Promotoren, die zu hohen Expressionsniveaus in den meisten Pflanzenorganen führen. Verstärkte oder duplizierte Versionen der CaMV35S- und FMV35S-Promotoren sind für die Ausführung dieser Erfindung nützlich (Odell et al. (1985) Nature 313: 810–812; Rogers, US-Patent Nr. 5,378,619). Des Weiteren kann es bevorzugt sein, die Expression des Prenyltransferasegens in spezifischen Geweben der Pflanze, wie z.B. Blatt, Stamm, Wurzel, Knolle, Samen, Frucht, etc. zu bewirken, und die ausgewählten Promotoren sollten die gewünschte Gewebs- und Entwicklungsspezifität aufweisen.
Von besonderem Interesse ist die Expression von Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung ausgehend von Transkriptions-Initiationsregionen, die bevorzugt in einem Pflan zensamengewebe exprimiert werden. Beispiele für solche in Samen bevorzugten Transkriptions-Initiationssequenzen schließen die Sequenzen ein, die von Sequenzen abgeleitet werden, die für Pflanzenspeicherproteingene kodieren oder von Genen stammen, die an der Fettsäurebiosynthese in Ölsamen beteiligt sind. Beispiele solcher Promotoren schließen die 5'-regulatorischen Bereiche von Genen wie Napin (Kridl et al., Seed Sci. Res. 1: 209:219 (1991)), Phaseolin, Zein, Sojabohnentrypsininhibitor, ACP, Stearyl-ACP-Desaturase, Sojabohnen-α'-Untereinheit von β-Conglycinin (Soja 7s, (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83: 8560–8564 (1986))) und Oleosin ein.
Es kann vorteilhaft sein, die Lokalisation von Proteinen, die Prenyltransferaseaktivität verleihen, in ein bestimmtes subzelluläres Kompartiment zu steuern, z.B. in das Mitochondrium, endoplasmatische Reticulum, Vakuolen, Chloroplast oder ein anderes Plastiden-Kompartiment. Wenn die Gene von Interesse der vorliegenden Erfindung beispielsweise für eine Expression auf Plastiden, wie z.B. Chloroplasten, gerichtet sind, werden die Konstrukte ebenfalls Sequenzen, zur Lenkung des Gen in das Plastid verwenden. Solche Sequenzen werden hier als Chloroplastentransitpeptide (CTP) oder Plastidentransitpeptide (PTP) bezeichnet. Auf diese Weise werden, wenn das Gen von Interesse nicht direkt in den Plastiden eingebracht wird, die Expressionskonstrukte zusätzlich ein Gen enthalten, das für ein Transitpeptid kodiert, um das Gen von Interesse zu den Plastiden zu lenken. Die Chloroplastentransitpeptide können von dem Gen von Interesse abgeleitet werden, oder können von einer heterologen Sequenz, die ein CTP aufweist, abgeleitet sein. Solche Transitpeptide sind im Fachgebiet bekannt. Siehe z.B. Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9: 104–126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264: 17544–17550; della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84: 965–968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196: 1414–1421; und Shah et al. (1986) Science 233: 478–481.
Abhängig von der geplanten Verwendung können die Konstrukte eine Nukleinsäuresequenz enthalten, die für das gesamte Prenyltransferaseprotein kodiert.
Der Fachmann wird erkennen, dass es verschiedene Verfahren für die Inhibierung der Expression endogener Sequenzen in einer Wirtszelle gibt. Solche Verfahren schließen die Folgenden ein, sind aber nicht auf sie beschränkt, Antisense-Supprimierung (Smith et al. (1988) Nature 334: 724–726), Ko-Supprimierung (Napoli, et al. (1989) Plant Cell 2: 279–289), Ribozyme (PCT-Veröffentlichung WO 97/10328) und Kombinationen von Sense und Antisense (Waterhouse et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95: 13959–13964). Verfahren für die Supprimierung endogener Sequenzen in einer Wirtszelle verwenden üblicherweise die Transkription oder Transkription und Translation mindestens eines Bereichs der Sequenz, die supprimiert werden soll. Solche Sequenzen können homolog zu kodierenden genauso wie zu nicht-kodierenden Bereichen der endogenen Sequenz sein.
Regulatorische Transkript-Terminierungsbereiche können auch in Pflanzenexpressionskonstrukten dieser Erfindung zur Verfügung gestellt werden. Transkript-Terminierungsbereiche können durch die DNA-Sequenz zur Verfügung gestellt werden, die für die Prenyltransferase kodiert, oder durch einen geeigneten Transkriptions-Terminierungsbereich, der von einer anderen Genquelle abgeleitet ist, z.B. dem Transkriptions-Terminierungsbereich, der natürlicherweise mit dem Transkript-Initiationsbereich assoziiert ist. Der Fachmann wird erkennen, dass jeder geeignete Transkript-Terminierungsbereich, der in der Lage ist, die Transkription in einer Pflanzenzelle zu beenden, in den Konstrukten der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
Alternativ können Konstrukte hergestellt werden, welche die Expression der Prenyltransferasesequenzen direkt von dem Wirtspflanzenzellen-Plastid steuern. Solche Konstrukte und Verfahren sind im Stand der Technik bekannt und werden z.B. in Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 8526–8530 und Svab und Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 913–917 und im US-Patent Nr. 5,693,507 allgemein beschrieben.
In Transformationsverfahren können die Prenyltransferasekonstrukte der vorliegenden Erfindung mit zusätzlichen Konstrukten verwendet werden, die für die Expression von anderen Nukleinsäuresequenzen sorgen, die für Proteine kodieren, die an der Bildung von Tocopherolen oder Tocopherol-Vorläufern wie beispielsweise Homogentisinsäure und/oder Phytylpyrophosphat beteiligt sind. Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, die an der Bildung von Homogentisinsäure beteiligt sind, sind im Stand der Technik bekannt und schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf 4-Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase (HPPD, EC 1.13.11.27), die z.B. von Garcia et al. ((1999) Plant Physiol. 119 (4): 1507–1516) beschrieben wurde, mono- oder bifunktionales tyrA (z.B. beschrieben von Xia et al. (1992) J. Gen Microbiol. 138: 1309–1316 und Hudson et al. (1984) J. Mol. Biol. 180: 1023–1051), Oxygenase, 4-Hydroxyphenylpyruvatdi-(9CI), 4-Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase; p-Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase; p-Hydroxyphenylpyruvathydroxylase; p-Hydroxyphenylpyruvatoxidase; p-Hydroxyphenylbrenztraubensäurehydroxylase; p-Hydroxyphenylbrenztraubenhydroxylase; p-Hydroxyphenylbrenztraubenoxydase), 4-Hydroxyphenylacetat, NAD(P)H:Oxygenoxidoreduktase (1-hydroxylierend); 4-Hydroxyphenylacetat-1-monooxygenase und dergleichen. Zusätzlich können auch Konstrukte für die Expression von Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, die an der Bildung von Phytylpyrophosphat beteiligt sind, mit den Prenyltransferasekonstrukten der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, die an der Bildung von Phytylpyrophosphat beteiligt sind, sind im Stand der Technik bekannt und schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf Geranylgeranylpyrophosphat-Synthase (GGPPS), Geranylgeranylpyrophosphat-Reduktase (GGH), 1-Deoxyxylulose-5-phosphat-Synthase, 1-Deoxy-D-xylolose-5-phosphat-Reduktoisomerase, 4-Diphosphocytidyl-2-C-methylerythritol-Synthase, Isopentylpyrophosphatisomerase.
Die Prenyltransferasesequenzen der vorliegenden Erfindung finden bei der Herstellung von Transformationskonstrukten Verwendung, die eine zweite Expressionskassette für die Expression von zusätzlichen Sequenzen aufweisen, die an der Tocopherolbiosynthese beteiligt sind. Zusätzliche Tocopherol-Biosynthesesequenzen von Interesse in der vorliegenden Erfindung schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf gamma-Tocopherolmethyltransferase (Shintani, et al. (1998) Science 282 (5396): 2098–2100), Tocopherolcyclase und Tocopherol-methyltransferase.
Eine Pflanzenzelle, ein Gewebe, ein Organ oder eine Pflanze, in die/das die rekombinanten DNA-Konstrukte, welche die Expressionskonstrukte enthalten, eingebracht wurden, wird als transformiert, transfoziert oder transgen angesehen. Eine transgene oder transformierte Zelle oder Pflanze schließt ebenfalls Nachkommen von der Zelle oder Pflanze und die Nachkommen ein, die von einem Zuchtprogramm gebildet werden, das eine derartige transgene Pflanze als einen Elter in einer Kreuzung einsetzt, und das einen veränderten Phänotyp aufweist, der aus der Gegenwart einer Prenyltransferase-Nukleinsäuresequenz resultiert.
Pflanzenexpressions- oder -transkriptionskonstrukte, die eine Prenyltransferase als DNA-Sequenz von Interesse für deren gesteigerte oder verminderte Expression aufweisen, können mit einer großen Vielfalt an pflanzlichem Leben genutzt werden, insbesondere mit der Pflanzenwelt, die an der Bildung von Pflanzenölen für Speise- und industrielle Verwendungen beteiligt ist. Besonders bevorzugte Pflanzen für eine Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf: Acacia, Alfalfa, Aneth, Apfel, Aprikose, Artischocke, Rukola, Spargel, Avocado, Banane, Gerste, Bohnen, Rübe, Brombeere, Blaubeere, Brokkoli, Rosenkohl, Kohl, Raps, Melone, Karotte, Maniok, Blumenkohl, Sellerie, Kirsche, Chicorée, Koriander, Zitrone, Clementinen, Kaffee, Mais, Baumwolle, Gurke, Douglastanne, Aubergine, Endivie, Winterendivie, Eukalyptus, Fenchel, Feigen, Knoblauch, Kürbis, Traube, Pampelmuse, Honigmelone („honey dew"), Jicama, Kiwi, Blattsalat, Lauch, Zitrone, Limette, Loblolly-Kiefer, Mango, Melone, Pilz, Nektarine, Nuß, Hafer, Ölpalme, Ölsamenraps, Okra, Zwiebel, Orange, eine Zierpflanze, Papaya, Petersilie, Erbse, Pfirsich, Erdnuß, Birne, Pfeffer, Dattelpflaume „persimmon", Kiefer, Ananas, Wegerich, Pflaume, Granatapfel, Pappel, Kartoffel, Kürbis, Quitte, Radiatakiefer, Radicchio, Rettich, Himbeere, Reis, Roggen, Hirse, Southern-Kiefer, Sojabohne, Spinat, Kürbispflanze, Erdbeere, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Sonnenblume, Süßkartoffel, Amberbaum, Mandarine, Teepflanze, Tabak, Tomate, Triticale, Rasen, Steckrübe, eine Weinpflanze, Wassermelone, Weizen, Yamswurzel, und Zucchini.
Ganz besonders bevorzugt sind in gemäßigten Klimazonen beheimatete Ölsamensaaten. In gemäßigten Klimazonen beheimatete Ölsamensaaten von Interesse schließen ein, sind aber nicht begrenzt auf Rapssamen (Raps und Hoch-Erucasäure („High Erucic Acid")-Arten), Sonnenblume, Färberdistel, Baumwolle, Sojabohne, Erdnuss, Kokosnuss und Ölpalmen und Mais. Abhängig von dem Verfahren zum Einbringen der rekombinanten Konstrukte in die Wirtszelle können andere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Es ist wichtig anzumerken, daß diese Erfindung gleichermaßen auf Dikotyledonen- und Monokotyledonenarten anwendbar ist und leicht auf neue und/oder verbesserte Transformations- und Regulationstechniken angewendet werden kann.
Von besonderem Interesse ist die Verwendung von Prenyltransferasekonstrukten in Pflanzen, um Pflanzen oder Pflanzenteile zu bilden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Blätter, Stengel, Wurzeln, reproduzierende Teile und Samen, mit einem modifizierten Gehalt an Tocopherolen in den Pflanzenteilen, welche die transformierten Pflanzenzellen aufweisen.
Für ein immunologisches Screening können Antikörper gegen das Protein durch Injektion eines gereinigten Proteins oder Teils davon in Kaninchen oder Mäuse hergestellt werden, wobei solche Verfahren zur Herstellung von Antikörpern dem Fachmann gut bekannt sind. Es können entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper produziert werden, obwohl normalerweise polyklonale Antikörper für die Genisolierung nützlicher sind. Western-Analysen können durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob ein verwandtes Protein in einem Rohextrakt der gewünschten Pflanzenart vorhanden ist, wobei die Bestimmung durch Kreuzreaktion mit den Antikörpern gegen das kodierte Protein erfolgt. Wenn eine Kreuzreaktivität beobachtet wird, werden die Gene, die für die verwandten Proteine kodieren, durch Durchmustern von Expressionsbibliotheken, welche die gewünschten Pflanzenarten repräsentieren, isoliert. Expressionsbibliotheken können in einer Vielzahl von kommerziell verfügbaren Vektoren konstruiert werden, einschließlich Lambda gt11, wie in Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage (1989) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben.
Um die Aktivität und Spezifität der Proteine, die von den identifizierten Nukleinsäuresequenzen als Prenyltransferaseenzyme kodiert werden, zu bestätigen, werden in vitro-Assays in Insektenzellenkulturen durchgeführt, wobei Baculovirus-Expressionssysteme verwendet werden. Solche Baculovirus- Expressionssysteme sind im Stand der Technik bekannt und werden von Lee et al., US-Patent Nr. 5,348,886 beschrieben.
Zusätzlich können andere Expressionskonstrukte hergestellt werden, um Proteinaktivitäten zu untersuchen, wobei verschiedene Expressionssysteme verwendet werden. Solche Expressionskonstrukte werden in Hefe oder prokaryontische Wirte transformiert und auf Prenyltransferaseaktivität untersucht. Solche Expressionssysteme sind im Stand der Technik bekannt und von kommerziellen Quellen verfügbar.
Für die Änderung der Tocopherolbildung in einer Wirtszelle kann ein zweites Expressionskonstrukt in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel kann das Prenyltransferase-Expressionskonstrukt in eine Wirtszelle in Verbindung mit einem zweiten Expressionskonstrukt eingebracht werden, das eine Nukleotidsequenz für ein Protein, das bei der Tocopherolbiosynthese beteiligt ist, aufweist.
Das Verfahren der Transformation zur Erlangung solcher transgenen Pflanzen ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend und verschiedene Verfahren der Pflanzentransformation sind derzeit verfügbar. Des Weiteren können neuere Verfahren, die für die Transformation von Saaten verfügbar werden, hier auch direkt hierunter angewendet werden. Beispielsweise könnten viele Pflanzenarten, die für Agrobacterium-Infektionen natürlicherweise empfänglich sind, erfolgreich über dreiteilige oder binäre Vektorverfahren der Agrobacterium-vermittelten Transformation transformiert werden. In vielen Fällen wird es wünschenswert sein, dass das Konstrukt auf einer oder beiden Seiten von T-DNA begrenzt wird, insbesondere die linken und rechten Grenzen, und vor allem die rechte Grenze. Dies ist besonders nützlich, wenn das Konstrukt A. tumefaciens oder A. rhizogenes als Mittel für die Transformation verwendet, obwohl die T-DNA-Grenzen auch bei anderen Arten der Transformation Verwendung finden können. Zusätzlich sind Techniken der Mikroinjektion, des DNA-Partikelbombardements und der Elektroporation entwickelt worden, welche die Transformation verschiedener monokotylen und dikotylen Pflanzenarten erlauben.
Normalerweise wird das DNA-Konstrukt ein strukturelles Gen einschließen, das die notwendigen regulatorischen Bereiche für die Expression in einem Wirt enthält und die Selektion der transformierten Zellen ermöglicht. Das Gen kann für Resistenz gegen ein zytotoxisches Agens, z.B. ein Antibiotikum, Schwermetall, Toxin, etc., eine Komplementierung, die einem auxotrophen Wirt eine Phototrophie verleiht, virale Immunität oder dergleichen sorgen. Abhängig von der Anzahl von verschiedenen Wirtsarten, in die das Expressionskonstrukt oder deren Komponenten eingebracht werden, können ein oder mehrere Marker verwendet werden, wobei verschiedene Bedingungen für Selektion für die verschiedenen Wirte verwendet werden.
Wo Agrobacterium für die Pflanzenzelltransformation verwendet wird, kann ein Vektor verwendet werden, der in den Agrobacterium-Wirt für homologe Rekombination mit T-DNA oder dem Ti- oder Ri-Plasmid, das im Agrobacterium-Wirt vorliegt, eingebracht wird. Das Ti- oder Ri-Plasmid, das die T-DNA für die Rekombination enthält, kann bewaffnet („armed", befähigt, die Gallenbildung zu verursachen) oder unbewaffnet („disarmed", nicht befähigt, die Gallenbildung zu verursachen) sein, wobei letzteres zulässig ist, solange die vir-Gene in dem transformierten Agrobacterium-Wirt vorhanden sind. Das bewaffnete Plasmid kann eine Mischung aus normalen Pflanzenzellen und Gallenzellen erzeugen.
In einigen Fällen, in denen Agrobacterium als Vehikel für die Transformation der Wirtspflanzenzellen verwendet wird, wird das Expressions- oder Transkriptionskonstrukt, das durch den/die T-DNA-Grenzbereich(e) begrenzt wird, in einen Vektor mit breitem Wirtsbereich, der zur Replikation in E. coli und Agrobacterium fähig ist, wobei diese Vektoren mit breitem Wirtsbereich in der Literatur beschrieben sind. Normalerweise werden pRK2 oder dessen Derivate verwendet. Siehe z.B. Ditta, et al., (Proc. Nat. Acad. Sci., USA (1980) 77: 7347–7351) und EPA 0 120 515 . Alternativ kann man die Sequenzen, die in Pflanzenzellen exprimiert werden sollen, in einen Vektor einbringen, der getrennte Replikationssequenzen enthält, von denen eine den Vektor in E. coli, und die andere ihn in Agrobacterium stabilisiert. Siehe beispielsweise McBride, et al., (Plant Mol. Biol. (1990) 14: 269–276), wo der pRiHRI-(Jouanin et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 201: 370–374) Replikationsorigin verwendet wird und zu einer zusätzlichen Stabilität des Pflanzenexpressionsvektors in den Wirts-Agrobacterium-Zellen führt.
In das Expressionskonstrukt und die T-DNA können ein oder mehrere Marker eingeschlossen sein, welche die Selektion des transformierten Agrobacteriums und der transformierten Pflanzenzellen erlauben. Eine Anzahl von Markern ist für die Verwendung mit Pflanzenzellen entwickelt worden, wie z.B. Resistenz gegen Chloramphenicol, Kanamycin, das Aminoglykosid G418, Hygromycin oder dergleichen. Der bestimmte eingesetzte Marker ist für die Erfindung nicht wesentlich, wobei der eine oder anderer Marker in Abhängigkeit von dem jeweiligen Wirt und der Art der Konstruktion bevorzugt sein kann.
Für die Transformation von Pflanzenzellen durch Verwendung von Agrobacterium, können Explantate vereint und während einer ausreichenden Zeit für die Transformation mit dem transformierten Agrobacterium inkubiert, die Bakterien getötet, und die Pflanzenzellen in einem geeigneten Selektionsmedium kultiviert werden. Sobald sich Kallus bildet, kann die Triebbildung unterstützt werden, indem geeignete Pflanzenhormone in Über einstimmung mit bekannten Verfahren eingesetzt werden und die Triebe zur Regenerierung der Pflanzen in ein Medium zur Wurzelbildung überführt werden. Die Pflanzen können dann bis zur Samenbildung angezogen und der Samen verwendet werden, um sich wiederholende Generationen herzustellen und um pflanzliche Öle zu isolieren.
Es gibt verschiedene mögliche Wege, um die Pflanzenzellen der vorliegenden Erfindung zu erhalten, die multiple Expressionskonstrukte enthalten. Jedwede Mittel zur Herstellung einer Pflanze, die ein Konstrukt umfasst, das eine DNA-Sequenz, die für ein Expressionskonstrukt der vorliegenden Erfindung kodiert, und mindestens ein weiteres Konstrukt aufweist, das eine andere DNA-Sequenz enthält, die für ein Enzym kodiert, werden von der vorliegenden Erfindung umfasst. Beispielsweise kann das Expressionskonstrukt verwendet werden, um eine Pflanze gleichzeitig mit dem zweiten Konstrukt zu transformieren, entweder durch Einschluß beider Expressionskonstrukte in einen einzigen Transformationsvektor oder durch Verwendung getrennter Vektoren, von denen jeder gewünschte Gene exprimiert. Das zweite Konstrukt kann in eine Pflanze eingebracht werden, die bereits mit dem Prenyltransferase-Expressionskonstrukt transformiert wurde, oder alternativ können transformierte Pflanzen, von denen eine das Prenyltransferasekonstrukt exprimiert und die andere das zweite Konstrukt exprimiert, gekreuzt werden, um die Konstrukte in derselben Pflanze zusammen zu bringen.
Die Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung können in Konstrukten verwendet werden, um die Expression der Sequenz in einer Vielzahl von Wirtszellen, sowohl prokaryontische als auch eukaryontische, zu ermöglichen. Wirtszellen der vorliegenden Erfindung umfassen vorzugsweise monokotyledone und dikotyledone Pflanzenzellen.
Im Allgemeinen wird der Fachmann mit Standardquellenmaterialien vertraut sein, die spezifische Bedingungen und Prozeduren für die Konstruktion, Manipulation und Isolation von Makromolekülen (z.B. DNA-Molekülen, Plasmiden, etc.), die Herstellung von rekombinanten Organismen und das Durchmustern und die Isolierung von Klonen beschreiben (siehe z.B. Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989); Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995); Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, 1, Cold Spring Harbor, New York).
Verfahren für die Expression von Sequenzen in Insektenwirtszellen sind im Stand der Technik bekannt. Baculovirus-Expressionsvektoren sind rekombinante Insektenviren, in welche die kodierende Sequenz für ein ausgewähltes Fremdgen hinter einen Baculovirus-Promotor anstelle eines viralen Gens, z.B. Polyhedrin (Smith und Summers, US-Patent Nr. 4,745,051) eingesetzt wurde. Baculovirus-Expressionsvektoren sind im Stand der Technik bekannt und werden z.B. in Doerfler, Curr. Top. Microbiol. Immunol. 131: 51–68 (1968); Luckow und Summers, Bio/Technology 6: 47–55 (1988a); Miller, Annual. Review of Microbiol. 42: 177–199 (1988); Summers Curr. Comm. Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1988); Summers und Smith, A Manual of Methods for Baculovirus Vectors and Insect Cell Culture Procedures, Texas, Ag. Exper. Station Bulletin Nr. 1555 (1988)) beschrieben.
Verfahren für die Expression einer Nukleinsäuresequenz von Interesse in einer Pilzwirtszelle sind im Stand der Technik bekannt. Die Pilzwirtszelle kann z.B. eine Hefezelle oder eine afilamentöse Pilzzelle sein. Verfahren für die Expression von DNA-Sequenzen von Interesse in Hefezellen sind im "Guide to yeast genetics and molecular biology", Guthrie und Fink, Hrsg. Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., Band 194 (1991) und in "Gene expression Technology", Goeddel Hrsg., Methods in Enzymology, Academic Press, Inc., Band 185 (1991) allgemein beschrieben.
Säugetierzellinien, die als Wirte für die Expression zur Verfügung stehen, sind im Stand der Technik bekannt und schließen viele immortalisierte Zellinien ein, die bei der American Type Culture Collection (ATCC, Manassas, VA) verfügbar sind, wie beispielsweise HeLa-Zellen, Zellen aus chinesischen Hamster-Ovarien (CHO), Babyhamsternieren- (BHK) zellen und eine Anzahl von anderen Zellinien. Geeignete Promotoren für Säugetierzelllinien sind ebenfalls im Stand der Technik bekannt und schließen ein, sind aber nicht beschränkt auf virale Promotoren, wie beispielsweise den vom Simian-Virus 40 (SV40) (Fiers et al., Nature 273: 113 (1978) das in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme hier aufgenommen wird), Rous-Sarkomavirus (RSV), Adenovirus (ADV) und bovinem Papillomavirus (BPV). Säugetierzellen können ebenfalls Terminatorsequenzen und poly-A-Additionssequenzen erfordern. Enhancer-Sequenzen, welche die Expression steigern, können ebenfalls eingeschlossen sein, und Sequenzen, welche die Amplifizierung Gens fördern, können ebenfalls wünschenswert sein (z.B. Methotrexatresistenzgene).
Vektoren, die für eine Replikation in Säugetierzellen geeignet sind, sind im Stand der Technik gut bekannt und können virale Replikons einschließen, oder Sequenzen, welche die Integration der geeigneten Sequenzen, die für Epitope kodieren, in das Wirtsgenom sicherstellen. Plasmidvektoren, welche die Konstruktion rekombinanter Viren erheblich erleichtern, wurden beschrieben (siehe z.B. Mackett et al., J Virol. 49: 857 (1984); Chakrabati et al., Mol. Cell. Biol. 5: 3403 (1985); Moss, in: Gene Transfer Vectors For Mammalian Cells (Miller and Calos, Hrsg., Cold Spring Harbor Laboratory, N. Y., S. 10, (1987).
Die Erfindung, die nun allgemein beschrieben wurde, wird durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele verständlicher.
BEISPIELE
Beispiel 1: Identifizierung von Prenyltransferasesequenzen
PSI-BLAST-Profile (Altschul, et al. (1997) Nuc Acid Res 25: 3389–3402) wurden sowohl für die Klassen von Prenyltransferasen mit geradliniger Kette als aromatische Klassen erzeugt. Um die Profile für geradlinigen Ketten zu erzeugen, wurde als Suchanfrage eine Prenyltransferase von Porphyra purpurea (Genbank-Zugangscode 1709766) in der NCBI nicht-redundanten Proteindatenbank verwendet. Das an der Bildung von Ubichinon beteiligte Enzym ubiA aus E. coli (Genbank-Zugangscode 1790473) wurde als Ausgangssequenz verwendet, um das Profil der aromatischen Prenyltransferase zu erzeugen. Diese Profile wurden verwendet, um öffentliche und urheberrechtlich geschützte DNA- und Proteindatenbanken zu durchsuchen. In Arabidopsis wurden sieben mögliche Prenyltransferasen der Klasse der geradlinigen Ketten identifiziert, ATPT1 (SEQ ID NO: 9); ATPT7 (SEQ ID NO: 10), ATPT8 (SEQ ID NO: 11); ATPT9 (SEQ ID NO: 13), ATPT10 (SEQ ID NO: 14); ATPT11 (SEQ ID NO: 15), und ATPT12 (SEQ ID NO: 16) und fünf der aromatischen Klasse wurden identifiziert, ATPT2 (SEQ ID NO: 1), ATPT3 (SEQ ID NO: 3), ATPT4 (SEQ ID NO: 5), ATPT5 (SEQ ID NO: 7), ATPT6 (SEQ ID NO: 8). Zusätzliche Prenyltransferasesequenzen aus anderen Pflanzen, die mit der aromatischen Klasse der Prenyltransferasen verwandt waren, wie beispielsweise von Soja (SEQ ID NOs: 19–23, die abgeleitete Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 23 wird in SEQ ID NO: 24 zur Verfügung gestellt) und Mais (SEQ ID NOs: 25–29 und 31) wurden ebenfalls identifiziert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von ZMPT5 (SEQ ID NO: 29) wird in SEQ ID NO: 30 zur Verfügung gestellt.
Die Suchen wurden auf einem Silicon Graphics Unix-Computer unter Verwendung zusätzlicher „Bioaccellerator"-Hardware und GenWeb-Software durchgeführt, die von Compugen Ltd. bereitgestellt wurden. Diese Software und Hardware ermöglicht die Verwendung des Smith-Waterman-Algorithmus für die Suche in DNA- und Proteindatenbanken bei Verwendung von Profilen als Suchanfragen. Das zur Abfrage von Proteindatenbanken verwendete Programm ist "profilesearch". Dies ist eine Suche, bei der die Suchanfrage nicht eine einzelne Sequenz, sondern ein Profil ist, das auf einem multiplen Abgleich von Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzen basiert. Das Profil wird verwendet, um einen Sequenzdatensatz, d.h. eine Sequenzdatenbank, abzufragen. Das Profil enthält die gesamte relevante Information, um jede Position in einer Sequenz zu bewerten, was eigentlich zu einem Ersetzen der für die Standardabfragesuchen verwendeten "Scoring Matrix" führt. Das zur Abfrage von Nukleotiddatenbanken verwendete Programm ist "tprofilesearch". „Tprofilesearch" durchsucht Nukleinsäure-Datenbanken unter Verwendung einer Aminosäure-Profilsuchabfrage. Während die Suche läuft, werden die Sequenzen in der Datenbank in sechs Leserrahmen in Aminosäuresequenzen übersetzt. Die Ausgabedatei von „Tprofilesearch" ist identisch mit der Ausgabedatei von „profilesearch" mit Ausnahme einer zusätzlichen Spalte, die den Leserahmen angibt, in dem der beste Abgleich stattfindet.
Der Smith-Waterman-Algorithmus (Smith und Waterman (1981) loc. cit.) wird verwendet, um nach Ähnlichkeiten zwischen einer Sequenz der Suchanfrage und einer Gruppe von Sequenzen zu suchen, die in der Datenbank enthalten sind. „E-Score"-Werte sowie andere Sequenzinformationen, wie beispielsweise konservierte Peptidsequenzen, werden verwendet, um verwandte Sequenzen zu identifizieren.
Um den gesamten kodierenden Bereich zu erhalten, die den Prenyltransferasesequenzen aus Arabidopsis entspricht, zu erhalten, werden synthetische Oligonukleotidprimer entworfen, um die 5'- und 3'-Enden der partiellen cDNA-Klone, welche Prenyltransferasesequenzen enthalten, zu amplifizieren. Die Primer werden gemäß den entsprechenden Arabidopsis-Prenyltransferasesequenzen entworfen und in "Rapid Amplification of cDNA Ends" (RACE)-Reaktionen (Frohman et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 8998–9002) unter Einsatz des Marathon-cDNA-Amplifikationskit (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA) verwendet.
Zusätzliche BLAST-Suchen werden unter Verwendung der ATPT2-Sequenz durchgeführt, die eine Sequenz der Klasse der aromatischen Prenyltransferasen ist. Zusätzliche Sequenzen, die der ATPT2-Sequenz ähnlich sind, werden in Sojabohne-Bibliotheken identifiziert. Die zusätzliche Sojabohnensequenz weist 80% Identität und 91% Ähnlichkeit der Aminosäuresequenz auf.
Aminosäuresequenzabgleiche zwischen ATPT2 (SEQ ID NO: 2), ATPT3 (SEQ ID NO: 4), ATPT4 (SEQ ID NO: 6), ATPT8 (SEQ ID NO: 12) und ATPT12 (SEQ ID NO: 17) werden mit Hilfe von ClustalW (1) durchgeführt, und die Prozentidentitäten und Ähnlichkeiten werden unten in Tabelle 1 gezeigt.
Tabelle 1
Beispiel 2: Herstellung von Expressionskonstrukten
Ein Plasmid, das die von pCGN3223 (beschrieben in US-Patent 5,639,790, das in seiner Gesamtheit hier durch Bezugnahme aufgenommen wird) abgeleitete Napinkassette enthält, wurde modifiziert, um es für die Klonierung großer DNA-Fragmente, die multiple Restriktionsstellen enthalten, verwendbarer zu machen und um die Klonierung von multiplen Napinfusionsgenen in binäre Pflanzen-Transformationsvektoren zu erlauben. Ein das selbstanlagernde („self annealed") Oligonukleotid der Sequenz CGCGATTTAAATGGCGCGCCCTGCAGGCGGCCGCCTGCAGGGCGCGCCATTTAAAT (SEQ ID NO: 40) beinhaltender Adapter wurde in den Klonierungsvektor pBC SK+ (Stratagene) nach Verdau mit der Restriktionsendonuklease BssHII ligiert, um den Vektor pCGN7765 zu konstruieren. Die Plasmide pCGN3223 und pCGN7765 wurden mit NotI verdaut und miteinander ligiert. Der entstehende Vektor pCGN7770 enthält das pCGN7765-Rückgrat mit der Napin-Samenspezifischen Expressionskassette aus pCGN3223.
Die Klonierungskassette pCGN7787, (mit) im Wesentlichen den gleichen Regulierungselementen wie pCGN7770, mit Ausnahme der Napin-regulatorischen Bereiche von pCGN7770, wurde mit dem doppelten CAMV 35S-Promotor und dem tml-Polyadenylierungs- und transkriptionalen Terminationsbereich ersetzt.
Ein binärer Vektor für die Pflanzentransformation, pCGN5139, wurde aus pCGN1558 (McBride und Summerfeld, (1990) Plant Molecular Biology, 14: 269–276) gebildet. Der Polylinker von pCGN1558 wurde als ein HindIII/Asp718-Fragment durch einen Polylinker ersetzt, der einzigartige Restriktionsendonukleasestellen, AscI, PacI, XbaI, SwaI, BamHI, und NotI, enthält. Die Asp718- und HindIII-Restriktionsendonukleasestellen sind in pCGN5139 erhalten.
Eine Reihe von turbobinären Vektoren wurde konstruiert, um das schnelle Klonieren von DNA-Sequenzen in binäre Vektoren, die transkriptionelle Initiationsbereiche (Promotoren) und transkriptionelle Terminationsbereiche enthalten, zu ermöglichen.
Das Plasmid pCGN8618 wurde durch Ligieren der Oligonukleotide 5'-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3' (SEQ ID NO: 41) und 5'-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3' (SEQ ID NO: 42) in SalI/XhoI-verdautes pCGN7770 gebildet. Ein Fragment, das den Napin-Promotor, Polylinker und den Napin-3'-Bereich enthält, wurde durch Verdau mit Asp718I aus pCGN8618 herausgeschnitten; das Fragment wurde durch Auffüllen der 5'-Überhänge mit Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen („blunt ended") und dann in pCGN5139 ligiert, das mit Asp718I und HindIII verdaut und durch Auffüllen der 5'-Überhänge mit Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen wurde. Ein Plasmid, welches das Insert so orientiert enthält, dass der Napin-Promotor der stumpfen („blunted") Asp718I-Stelle des pCGN5139 am nächsten lag und das Napin-3' der stumpfen HindIII-Stelle am nächsten gelegen war, wurde einer Sequenzanalyse unterzogen, um sowohl die Insert-Orientierung als auch die Vollständigkeit der Klonierungsstellen zu bestätigen. Das entstandene Plasmid wurde als pCGN8622 bezeichnet.
Das Plasmid pCGN8619 wurde durch Ligieren der Oligonukleotide 5'-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3' (SEQ ID NO: 43) und 5'-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3' (SEQ ID NO: 44) in SalI/XhoI-verdautes pCGN7770 gebildet. Ein Fragment, das den Napin-Promotor, Polylinker und den Napin-3'-Bereich enthält, wurde durch Verdau mit Asp718I aus pCGN6819 entfernt; das Fragment wurde durch Auffüllen der 5'-Überhänge mit Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen und dann in pCGN5139 ligiert, das mit Asp718I und HindIII verdaut und durch Auffüllen der 5'-Überhänge mit Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen wurde. Ein Plasmid, welches das Insert so orientiert enthält, daß der Napin-Promotor der stumpfen Asp718I-Stelle des pCGN5139 am nächsten lag und das Napin-3' der stumpfen HindIII-Stelle am nächsten gelegen war, wurde einer Sequenzanalyse unterzogen, um sowohl die Insert-Orientierung als auch die Vollständigkeit der Klonierungsstellen zu bestätigen. Das entstandene Plasmid wurde als pCGN8623 bezeichnet.
Das Plasmid pCGN8620 wurde durch Ligieren der Oligonukleotide 5'-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGGAGCT-3' (SEQ ID NO: 45) und 5'-CCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3' (SEQ ID NO: 46) in SalI/SacI-verdautes pCGN7787 gebildet. Ein Fragment, das den d35S-Promotor, Polylinker und den tml 3'-Bereich enthält, wurde durch vollständigen Verdau mit Aps718I und partiellen Verdau mit NotI aus pCGN8620 entfernt. Das Fragment wurde durch Auffüllen der 5'-Überhänge mit Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen und dann in pCGN5139 ligiert, das mit Asp718I und HindIII verdaut und durch Auffüllen der 5'-Überhänge mit Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen würde. Ein Plasmid, welches das Insert so orientiert enthält, daß der d35S-Promotor der stumpfen Asp718I-Stelle des pCGN5139 am nächsten lag und das tml-3' der stumpfen HindIII-Stelle am nächsten gelegen war, wurde einer Sequenzanalyse unterzogen, um sowohl die Insert-Orientierung als auch die Vollständigkeit der Klo nierungsstellen zu bestätigen. Das entstandene Plasmid wurde als pCGN8624 bezeichnet.
Das Plasmid pCGN8621 wurde durch Ligieren der Oligonukleotide 5'-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCCAGCT-3' (SEQ ID NO: 47) und 5'-GGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3' (SEQ ID NO: 48) in SalI/SacI-verdautes pCGN7787 gebildet. Ein Fragment, das den d35S-Promotor, Polylinker und den tml 3'-Bereich enthält, wurde durch vollständigen Verdau mit Asp718I und partiellen Verdau mit NotI aus pCGN8621 entfernt. Das Fragment wurde durch Auffüllen der 5'-Überhänge mit Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen und dann in pCGN5139 ligiert, das mit Asp718I und HindIII verdaut und durch Auffüllen der 5'-Überhänge mit Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen wurde. Ein Plasmid, welches das Insert so orientiert enthält, daß der d35S-Promotor der stumpfen Asp718I-Stelle des pCGN5139 am nächsten lag und das tml-3' der stumpfen HindIII-Stelle am nächsten gelegen war, wurde einer Sequenzanalyse unterzogen, um sowohl die Insert-Orientierung als auch die Vollständigkeit der Klonierungsstellen zu bestätigen. Das entstandene Plasmid wurde als pCGN8625 bezeichnet.
Das Plasmidkonstrukt pCGN8640 ist eine Modifikation des oben beschriebenen pCGN8624. Ein 938 Bp-PstI-Fragment, das aus dem Transposon Tn7 isoliert wurde, welches für bakterielle Spectinomycin- und Streptomycinresistenz kodiert (Fling et al. (1985), Nucleic Acids Research 13 (19): 7095–7106), einem bestimmenden Faktor für E. coli- und Agrobacterium-Selektion, wurde durch Pfu-Polymerase mit stumpfen Enden versehen. Das mit stumpfen Enden versehene Fragment wurde in pCGN8624 ligiert, das mit SpeI verdaut und durch Pfu-Polymerase mit stumpfen Enden versehen wurde. Der Bereich, der das PstI-Fragment enthält, wurde sequenziert, um sowohl die Insert-Orientierung als auch die Vollständigkeit der Klonierungsstellen zu bestätigen.
Der Spectinomycin-Resistenzmarker wurde wie folgt in pCGN8622 und pCGN8623 eingefügt. Ein 7,7 kBp-AvrII-SnaBI-Fragment aus pCGN8640 wurde an ein 10,9 kBp-pAvrII-SnaBI-Fragment aus pCGN8623 oder pCGN8622 wie oben beschrieben ligiert. Die erhaltenen Plasmide waren pCGN8641 bzw. pCGN8643.
Das Plasmid pCGN8644 wurde durch Ligieren der Oligonukleotide 5'-GATCACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCCAATGCA-3' (SEQ ID NO: 49) und 5'-TTGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGGT-3' (SEQ ID NO: 50) in BamHI-PstI-verdautes pCGN8640 gebildet.
Synthetische Oligonukleotide für die Verwendung bei der Polymerasekettenreaktion (PCR) wurden entworfen, um die kodierenden Sequenzen aus ATPT2, ATPT3, ATPT4, ATPT8 und ATPT12 für die Herstellung von Expressionskonstrukten zu amplifizieren, und werden in Tabelle 2 unten gezeigt.
Tabelle 2:
Die kodierenden Sequenzen von ATPT2, ATPT3, ATPT4, ATPT8 und ATPT12 wurden alle durch Verwendung der entsprechenden PCR-Primer, die in Tabelle 2 oben gezeigt werden, amplifiziert und in den TopoTA-Vektor (Invitrogen) kloniert. Konstrukte, welche die entsprechenden Prenyltransferasesequenzen enthalten, wurden mit NotI und Sse8387I verdaut und in die turbobinären Vektoren, die oben beschrieben sind, kloniert.
Die für ATPT2-Prenyltransferase kodierende Sequenz wurde in der Sinn-Orientierung in pCGN8640 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10800 (2) zu bilden. Die ATPT2-Sequenz steht unter der Kontrolle des 35S-Promotors.
Die ATPT2-Sequenz wurde auch in Gegensinn („antisense")-Orientierung in das Konstrukt pCGN8641 kloniert, um pCGN10801 (3) zu bilden. Dieses Konstrukt ermöglicht die antisense-Expression der ATPT2-Sequenz von dem Napin-Promotor.
Die für ATPT2-kodierende Sequenz wurde auch in Gegensinn-Orientierung in den Vektor pCGN8643 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10802 zu bilden.
Die ATPT2-kodierende Sequenz wurde auch in Gegensinn-Orientierung in den Vektor pCGN8644 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10803 (4) zu bilden.
Die ATPT4-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN864 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10806 (5) zu bilden. Die ATPT2-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN864 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10807 (6) zu bilden. Die ATPT3-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN864 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10808 (7) zu bilden. Die ATPT3-kodierende Sequenz wurde in der Sinn-Orientierung in den Vektor pCGN8640 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10809 (8) zu bilden. Die ATPT3-kodierende Sequenz wurde in der Gegensinn-Orientierung in den Vektor pCGN8641 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10810 (9) zu bilden. Die ATPT3-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN8643 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10811 (10) zu bilden. Die ATPT3-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN8640 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10812 (11) zu bilden. Die ATPT4-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN8640 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10813 (12) zu bilden. Die ATPT4-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN8643 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10814 (13) zu bilden. Die ATPT4-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN8641 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10815 (14) zu bilden. Die ATPT4-kodierende Sequenz wurde in der Gegensinn-Orientierung in den Vektor pCGN8644 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10816 (15) zu bilden. Die ATPT2-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN???? kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10817 (16) zu bilden. Die ATPT8-kodierende Sequenz wurde in der Sinn-Orientierung in den Vektor pCGN8643 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10819 (17) zu bilden. Die ATPT12-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN8644 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10824 (18) zu bilden. Die ATPT12-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN8641 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10825 (19) zu bilden. Die ATPT8-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN8644 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10826 (20) zu bilden.
Beispiel 3: Pflanzentransformation
Transgene Brassica-Pflanzen werden durch Agrobacterium-vermittelte Transformation wie von Radke et al. (Theor. Appl. Genet. (1988) 75: 685–694; Plant Cell Reports (1992) 11: 499–505) beschrieben erhalten. Transgene Arabidopsis thaliana-Pflanzen können durch Agrobacterium-vermittelte Transformation wie von Valverkens et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. (1988) 85: 5536–5540) beschrieben oder wie von Bent et al. ((1994), Science 256: 1856–1860) oder Bechthold et al. ((1993), C. R. Acad. Sci. Life Sciences 316: 1194–1199) beschrieben erhalten werden. Andere Pflanzenarten können auf ähnliche Weise unter Verwendung verwandter Techniken transformiert werden.
Alternativ können Mikroprojektilbombardierungsverfahren, wie sie von Klein et al. (Bio/Technology 10: 286–291) beschrieben werden, verwendet werden, um kerntransformierte Pflanzen zu erhalten.
Referenzbeispiel 4: Identifizierung zusätzlicher Prenyltransferasen
Ein unter Verwendung der E. coli ubiA-Sequenz (Genbank-Zugangscodenummer 1790473) erzeugtes PSI-Blastprofil wurde verwendet, um das Synechocystis-Genom zu analysieren. Diese Analyse identifizierte 5 offene Leserahmen (ORFs) in dem Synechocystis-Genom, die potentielle Prenyltransferasen dar stellten; slr0926 (vermerkt als ubiA (4-Hydroxybenzoat-octaprenyltransferase, SEQ ID NO: 32), sll1899 (vermerkt als ctaB (Cytochrom c-Oxidase-Faltungsprotein, SEQ ID NO: 33), slr0056 (vermerkt als g4 (Chlorophyllsynthase 33 kD-Untereinheit, SEQ ID NO: 34), slr1518 (vermerkt als menA (Menachinon-Biosyntheseprotein, SEQ ID NO: 35) und slr1736 (vermerkt als ein hypothetisches Protein mit unbekannter Funktion (SEQ ID NO: 36)
Um die Funktionalität dieser ORFs und ihrer Beteiligung, soweit vorhanden, an der Biosynthese von Tocopherolen zu untersuchen, wurden Knockout-Konstrukte hergestellt, um den in Synechocystis identifizierten ORF zu unterbrechen.
Synthetische Oligos wurden entworfen, um Bereiche der 5'-(5'-TAATGTGTACATTGTCGGCCTC (17365') (SEQ ID NO: 61) und 5'-GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCACAATTCCCCGCACCTC (1736kanpr1)) (SEQ ID NO: 62) und 3'-(5'-AGGCTAATAAGCACAAATGGGA (17363') (SEQ ID NO: 63) und 5'-GGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGGAATTGGTTTAGGTTATCCC (1736kanpr2)) (SEQ ID NO: 64) Enden des slr1736-ORF zu amplifizieren. Die 1736kanpr1- und 1736kanpr2-Oligos enthielten 20 Basenpaare Homologie zu dem slr1736-ORF mit zusätzlichen 40 Bp Homologie zu den Enden der Kanamycinresistenzkassette. Getrennte PCR-Schritte wurden mit diesen Oligos abgeschlossen und die Produkte wurden Gel-aufgereinigt und mit dem Kanamycinresistenzgen von puc4K (Pharmacia) kombiniert, das mit HincII verdaut und von dem Vektorrückgrat mittels Gelaufreinigung entfernt wurde. Den kombinierten Fragmenten wurde ermöglicht, ohne Oligos unter den folgenden Bedingungen zu assemblieren: 94°C für 1 min, 55°C für 1 min, 72°C für 1 min plus 5 Sekunden pro Zyklus für 40 Zyklen unter Verwendung von pfu-Polymerase in 100 μl-Reaktionsvolumen (Zhao, H. und Arnold (1997) Nucleic Acids Res. 25 (6): 1307–1308). Ein μl oder fünf μl dieser Assemblierungsreaktion wurden dann unter Verwendung der 5'- und 3'- Oligos ineinander verschachtelt („nested") innerhalb der Enden des ORF-Fragments amplifiziert, so dass das entstehende Produkt 100 bis 200 Bp des 5'-Endes des auszuschaltenden („knokked out") Synechocystis-Gens, die Kanamcynresistenzkassette und 100–200 Bp des 3'-Endes des auszuschaltenden Gens enthielt. Dieses PCR-Produkt wurde dann in den Vektor pGemT easy (Promega) kloniert, um das Konstrukt pMON21681 zu bilden und für die Synechocystis-Transformation zu verwenden.
Primer wurden auch für die Herstellung von Synechocystis Knockout-Konstrukten für die anderen Sequenzen unter Verwendung des Verfahrens wie oben beschrieben mit den folgenden Primern synthetisiert. Die ubiA-5'-Sequenz wurde unter Verwendung der Primer 5'-GGATCCATGGT7GCCCAAACCCCATC (SEQ ID NO: 65) und 5'-GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTGGGTAAGCAACAATGACCGGC (SEQ ID NO: 66) amplifiziert. Der 3'-Bereich wurde unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotidprimer 5'-GAATTCTCAAAGCCAGCCCAGTAAC (SEQ ID NO: 67) und 5'-GGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGGGTGCGAAAAGGGTTTTCCC (SEQ ID NO: 68) amplifiziert. Die Amplifikationsprodukte wurden mit dem Kanamycinresistenzgen aus puc4K (Pharmacia), das mit HincII verdaut und von dem Vektorrückgrat weg Gelaufgereinigt wurde, kombiniert. Das angelagerte („annealed") Fragment wurde amplifiziert unter Verwendung der 5'- und 3'-Oligos, die innerhalb der Enden des ORF-Fragments (5'-CCAGTGGTTTAGGCTGTGTGGTC (SEQ ID NO: 69) und 5'-CTGAGTTGGATGTATTGGATC (SEQ ID NO: 70)), ineinander verschachtelt waren, so dass das entstehende Produkt 100–200 Bp des 5'-Endes des auszuschaltenden Synechocystis-Gens, die Kanamcynresistenzkassette und 100–200 Bp des 3'-Endes des auszuschaltenden Gens enthielt. Dieses PCR-Produkt wurde dann in den Vektor pGemT easy (Promega) kloniert, um das Konstrukt pMON21682 zu erzeugen, und für die Synechocystis-Transformation verwendet.
Primer wurden auch für die Herstellung von Synechocystis Knockout-Konstrukten für die anderen Sequenzen unter Verwendung des Verfahrens wie oben beschrieben mit den folgenden Primern synthetisiert. Die sll1899-5'-Sequenz wurde amplifiziert unter Verwendung der Primer 5'-GGATCCATGGTTACTTCGACAAAAATCC (SEQ ID NO: 71) und 5'-GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTGCTAGGCAACCGCTTAGTAC (SEQ ID NO: 72). Der 3'-Bereich wurde unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotidprimer 5'-GAATTCTTAACCCAACAGTAAAGTTCCC (SEQ ID NO: 73) und 5'-GGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGCCGGCATTGTCTTTTACATG (SEQ ID NO: 74) amplifiziert. Die Amplifikationsprodukte wurden mit dem Kanamycinresistenzgen aus puc4K (Pharmacia), das mit HincII verdaut und von dem Vektorrückgrat weg Gelaufgereinigt wurde, kombiniert. Das angelagerte Fragment wurde amplifiziert unter Verwendung von 5'- und 3'-Oligos, die innerhalb der Enden des ORF-Fragments (5'-GGAACCCTTGCAGCCGCTTC (SEQ ID NO: 75) und 5'-GTATGCCCAACTGGTGCAGAGG (SEQ ID NO: 76)) miteinander verschachtelt waren, so daß das entstehende Produkt 100–200 Bp des 5'-Endes des auszuschaltenden Synechocystis-Gens, die Kanamcynresistenzkassette und 100–200 Bp des 3'-Endes des auszuschaltenden Gens enthielt. Dieses PCR-Produkt wurde dann in den Vektor pGemT easy (Promega) kloniert, um das Konstrukt pMON21679 zu erzeugen, und für die Synechocystis-Transformation verwendet.
Primer wurden auch für die Herstellung von Synechocystis Knockout-Konstrukten für die anderen Sequenzen unter Verwendung des Verfahrens wie oben beschrieben mit den folgenden Primern synthetisiert. Die slr0056-5'-Sequenz wurde amplifiziert unter Verwendung der Primer 5'-GGATCCATGTCTGACACACAAAATACCG (SEQ ID NO: 77) und 5'-GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCGCCAATACCAGCCACCAACAG (SEQ ID NO: 78). Der 3'-Bereich wurde unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotidprimer 5'-GAATTCTCAAATCCCCGCATGGCCTAG (SEQ ID NO: 79) und 5'-GGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGGCCTACGGCTTGGACGTGTGGG (SEQ ID NO: 80) amplifiziert. Die Amplifikationsprodukte wurden mit dem Kanamycinresistenzgen aus puc4K (Pharmacia), das mit HincII verdaut und von dem Vektorrückgrat weg Gelaufgereinigt wurde, kombiniert. Das angelagerte Fragment wurde amplifiziert unter Verwendung von 5'- und 3'-Oligos, die innerhalb der Enden des ORF-Fragments (5'-CACTTGGATTCCCCTGATCTG (SEQ ID NO: 81) und 5'-GCAATACCCGCTTGGAAAACG (SEQ ID NO: 82)) miteinander verschachtelt waren, so daß das entstehende Produkt 100–200 Bp des 5'-Endes des auszuschaltenden Synechocystis-Gens, die Kanamcynresistenzkassette und 100–200 Bp des 3'-Endes des auszuschaltenden Gens enthielt. Dieses PCR-Produkt wurde dann in den Vektor pGemT easy (Promega) kloniert, um das Konstrukt pMON21677 zu erzeugen, und für die Synechocystis-Transformation verwendet.
Primer wurden auch für die Herstellung von Synechocystis Knockout-Konstrukten für die anderen Sequenzen unter Verwendung des Verfahrens wie oben beschrieben mit den folgenden Primern synthetisiert. Die slr1518-5'-Sequenz wurde amplifiziert unter Verwendung der Primer 5'-GGATCCATGACCGAATCTTCGCCCCTAGC (SEQ ID NO: 83) und 5'-GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCAATCCTAGGTAGCCGAGGCG (SEQ ID NO: 84). Der 3'-Bereich wurde unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotidprimer 5'-GAATTCTTAGCCCAGGCCAGCCCAGCC (SEQ ID NO: 85) und 5'-GGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGGGGAATTGATTTGTTTAATTACC (SEQ ID NO: 86) amplifiziert. Die Amplifikationsprodukte wurden mit dem Kanamycinresistenzgen aus puc4K (Pharmacia), das mit HincII verdaut und von dem Vektorrückgrat weg Gelaufgereinigt wurde, kombiniert. Das angelagerte Fragment wurde amplifiziert unter Verwendung von 5'- und 3'-Oligos, die innerhalb der Enden des ORF-Fragments (5'-GCGATCGCCATTATCGCTTGG (SEQ ID NO: 87) und 5'-GCAGACTGGCAATTATCAGTAACG (SEQ ID NO: 88)) miteinander verschachtelt waren, so daß das entste hende Produkt 100–200 Bp des 5'-Endes des auszuschaltenden Synechocystis-Gens, die Kanamcynresistenzkassette und 100–200 Bp des 3'-Endes des auszuschaltenden Gens enthielt. Dieses PCR-Produkt wurde dann in den Vektor pGemT easy (Promega) kloniert, um das Konstrukt pMON21680 zu erzeugen, und für die Synechocystis-Transformation verwendet.
B. Transformation von Synechocystis
Zellen von Synechocystis 6803 wurden bis zu einer Dichte von ungefähr 2 × 10⁸-Zellen/ml angezogen und durch Zentrifugation geerntet. Das Zellsediment wurde in frischem BG-11-Medium (ATCC Medium 616) mit einer Dichte von 1 × 10⁹ Zellen pro ml resuspendiert und sofort für Transformation verwendet. 100 μl dieser Zellen wurden mit 5 μl Miniprep-DNA gemischt und mit Licht bei 30°C für 4 Stunden inkubiert. Diese Mischung wurde dann auf Nylonfiltern, die auf BG-11-Agar ergänzt mit TES pH 8 aufgebracht waren, ausplattiert und den Zellen ermöglicht, für 12–18 Stunden zu wachsen. Die Filter wurden dann auf BG-11-Agar + TES + 5 μg/ml Kanamycin transferiert und konnten wachsen, bis Kolonien innerhalb von 7–10 Tagen erschienen (Packer und Glazer, 1988). Kolonien wurden dann in BG-11-Flüssigmedium, das 5 μg/ml Kanamycin enthielt, gepickt und konnten für 5 Tage wachsen. Diese Zellen wurden dann in BG-11-Medium, das 10 mg/ml Kanamycin enthielt, transferiert und konnten 5 Tage wachsen und wurden dann in Bg-11 + Kanamycin mit 25 μg/ml transferiert und konnten für 5 Tage wachsen. Zellen wurden dann für PCR-Analysen geerntet, um das Vorhandensein eines zerstörten ORFs zu bestimmen, und auch für HPLC-Analysen, um zu bestimmen, ob die Zerstörung irgendeinen Einfluß auf Tocopherolgehalte hat.
PCR-Analysen der Synechocystis-Isolate für slr1736 und sll1899 zeigten eine vollständige Trennung des Mutantengenoms, was bedeutet, dass keine Kopien des Wildtyp-Genoms in diesen Stämmen nachgewiesen werden konnte. Dies legt nahe, dass die Funktion des nativen Gens für die Zellfunktion nicht notwendig ist. HPLC-Analysen derselben Isolate zeigte, dass der sll1899-Stamm keine nachweisbare Verringerung bei den Tocopherolgehalten aufwies. Der Stamm jedoch, der den Knockout für slr1736 trug, produzierte keine nachweisbaren Tocopherolgehalte.
Die Aminosäuresequenzen für die Synechocystis-Knockouts wurden durch Verwendung von ClustalW verglichen und sind in Tabelle 3 unten gezeigt. Dargestellt sind die Identität, Ähnlichkeit und Lücke in Prozent. Der Abgleich der Sequenzen ist in 21 gezeigt.
Tabelle 3:
Aminosäuresequenzvergleiche wurden unter Verwendung verschiedener Arabidopsis-Prenyltransferasesequenzen und Synechocystis-Sequenzen durchgeführt. Die Vergleiche sind in Tabelle 4 unten dargestellt. Gezeigt sind die Identität, Ähnlichkeit und Lücke in Prozent. Der Abgleich der Sequenzen- ist in 22 gezeigt.
Tabelle 4:
4B. Herstellung des slr1737-Knockouts
Der Synechocystis sp. 6803 slr1737-Knockout wurde durch das folgende Verfahren konstruiert. Das GPS^TM-1-„Genome Priming System" (New England Biolabs) wurde verwendet, um eine Kanamycinresistenzkassette über ein Tn7-Transposase-System in slr1737 einzubringen. Ein Plasmid aus einem Klon aus einer Synechocystis-Genom-Bibliothek, der 652 Basenpaare des Ziel-ORFs (Synechocystis-Genom-Basenpaare 1324051–1324703; die vorhergesagten ORF-Basenpaare 1323672–1324763, wie von Cyanobase vermerkt) enthielt, wurde als Ziel-DNA verwendet. Die Reaktion wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde dann in elektrokompetente E. coli DH10B-Zellen transformiert und plattiert. Kolonien dieser Transformation wurden dann auf Transposon-Insertionen in die Zielsequenz durch Amplifizieren mit M13 Vorwärts- und Rückwärts-Universalprimern durchgemustert, was zu einem Produkt von 652 Basenpaaren plus –1700 Basenpaaren, der Größe der Transposon-Kanamycinkassette, für eine Gesamtfragmentgröße von –2300 Basenpaaren führte. Nach dieser Bestimmung war es notwendig, den ungefähren Ort der Insertion innerhalb des Ziel-ORFs zu bestimmen, da 100 Basenpaare der ORF-Sequenz als für eine effiziente homologe Rekombination in Synechocystis notwendig erachtet wurden. Dies wurde durch Amplifikationsreaktionen unter Verwendung von entweder den Primern für die Enden des Transposons, Primer S (5'-Ende) oder N (3'-Ende) in Verbindung mit entweder einem M13-Vorwärts- oder Rückwärtsprimer erreicht. Das bedeutet, dass vier verschiedene Primerkombinationen verwendet wurden, um jedes potentielle Knockout-Konstrukt zu kartieren: Primer S – M13-Vorwärts, Primer S – M13-Rückwärts, Primer N – M13-Vorwärts, Primer N – M13-Rückwärts. Es wurde bestimmt, daß das zur Transformation von Synechocystis und Knockout slr1737 verwendete Konstrukt aus ungefähr 150 Basenpaaren der slr1737-Sequenz auf der 5'-Seite der Transposon-Insertion und ungefähr 500 Basenpaare auf der 3'-Seite mit der Transkription des ORFs und der Kanamycinkassette in derselben Richtung besteht. Die Nukleinsäuresequenz von slr1737 wird in SEQ ID NO: 38 zur Verfügung gestellt und die abgeleitete Aminosäuresequenz wird in SEQ ID NO: 39 zur Verfügung gestellt.
Zellen von Synechocystis 6803 wurden bis zu einer Dichte von ~2 × 10⁸ Zellen/ml angezogen und durch Zentrifugation geerntet. Das Zellsediment wurde in frischem BG-11-Medium mit einer Dichte von 1 × 10⁹ Zellen/ml resuspendiert und sofort für Transformation verwendet. 100 μl dieser Zellen wurden mit 5 μl Miniprep-DNA gemischt und mit Licht bei 30°C für 4 Stunden inkubiert. Diese Mischung wurde dann auf Nylonfiltern, die auf BG-11-Agar ergänzt mit TES pH 8 aufgebracht waren, ausplattiert und den Zellen ermöglicht, für 12–18 Stunden zu wachsen. Die Filter wurden dann auf BG-11-Agar + TES + 5 μg/ml Kanamycin transferiert und konnten wachsen, bis Kolonien innerhalb von 7–10 Tagen erschienen (Packer und Glazer, 1988). Kolonien wurden dann in BG-11-Flüssigmedium, das 5 μg/ml Kanamycin enthielt, gepickt und konnten für 5 Tage wachsen. Diese Zellen wurden dann in BG-11-Medium, das 10 mg/ml Kanamycin enthielt, transferiert und konnten 5 Tage wachsen und wurden dann in Bg-11 + Kanamycin mit 25 μg/ml transferiert und konnten für 5 Tage wachsen. Zellen wurden dann für PCR-Analysen geerntet, um das Vorhandensein eines zerstörten ORFs zu bestimmen, und auch für HPLC-Analysen, um zu bestimmen, ob die Zerstörung irgendeinen Einfluß auf Tocopherolgehalte hat.
PCR-Analysen der Synechocystis-Isolate unter Verwendung der Primer für die Enden des slr1737-ORF zeigten eine vollständige Trennung des Mutantengenoms, was bedeutet, daß keine Kopien des Wildtyp-Genoms in diesen Stämmen nachgewiesen werden konnte. Dies legt nahe, daß die Funktion des nativen Gens für die Zellfunktion nicht notwendig ist. HPLC-Analysen des Stammes, der den Knockout für slr1737 trägt, brachte keine nachweisbaren Tocopherolgehalte hervor.
4C. Phytylprenyltransferase-Enzymassays
[³H]-Homogentisinsäure in 0,1% H₃PO₄ (spezifische Radioaktivität 40 Ci/mmol). Phytylpyrophosphat wurde wie von Joo, et al. (1973) Can J. Biochem. 51: 1527 beschrieben synthetisiert. 2-Methyl-6-phytylchinol und 2,3-Dimethyl-5-phytylchinol wurden wie von Soll, et al. (1980) Phytochemistry 19: 215 beschrieben synthetisiert. Homogentisinsäure, α, β, δ und γ-Tocopherol und Tocol wurden kommerziell erworben.
Der Wildtyp-Stamm von Synechocystis sp. PCC6803 wurde in BG-11-Medium mit eingeblasener Luft bei 30°C unter 50 μE·m^–2·s^–1 Fluoreszenzlicht und 70% relativer Feuchte angezogen. Das Wachstumsmedium des slr1736-Knockout- (potentiellen PPT)-Stamms dieses Organismus wurde mit 25 μg mL^–1 Kanamycin ergänzt. Zellen wurden aus 0,25 bis 1 Literkulturen durch Zentrifugation bei 5000 g für 10 Minuten gesammelt und bei –80°C gelagert.
Gesamtmembranen wurden gemäß der Prozedur von Zak mit einigen Abwandlungen (Zak et al. (1999) Eur J. Biochem 261: 311) isoliert. Die Zellen wurden in einer French-Presse aufgebrochen. Vor der Behandlung mit der French-Presse wurden die Zellen für 1 Stunde mit Lysozym (0,5%, w/v) bei 30°C in einem Medium, das 7 mM EDTA, 5 mM NaCl und 10 mM Hepes-NaOH, pH 7,4, enthielt, inkubiert. Die Sphäroplasten wurden durch Zentrifugation bei 5000 g für 10 Minuten gesammelt und mit 0,1–0,5 mg Chlorophyll·ml^–1 in 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,8, resuspendiert. Eine geeignete Menge des Proteaseinhibitorcocktails und DNAse I von Boehringer Mannheim wurde zu der Lösung hinzugegeben. Die Behandlungen mit der French-Presse wurde zwei bis dreimal bei 100 MPa durchgeführt. Nach dem, Aufbrechen wurde die Zellsuspension für 10 Minuten bei 5000 g zentrifugiert, um nicht aufgebrochene Zellen zu sedimentieren, gefolgt von einer Zentrifugation bei 100 000 g für 1 Stunde, um die Gesamtmembranen zu sammeln. Das finale Sediment wurde in einem Puffer resuspendiert, der 50 mM Tris-HCl und 4 mM MgCl₂ enthielt.
Chloroplastensedimente wurden aus 250 g Spinatblättern, die vom örtlichen Markt erhalten wurden, isoliert. Blattabschnitte ohne Blattgefäße („devined") wurden in Mahlpuffer („grinding buffer") (2 l/250 g Blätter), der 2 mM EDTA, 1 mM MgCl₂, 1 mM Mncl₂, 0,33 M Sorbitol, 0,1% Ascorbinsäure und 50 mM Hepes bei pH 7,5 enthielt, geschnitten. Die Blätter wurden für 3 Sekunden dreimal in einem 1 l-Mixer homogenisiert und durch 4 Lagen Mirocloth filtriert. Der Überstand wurde bei 5000 g für 6 min zentrifugiert. Die Chloroplastensedimente wurden in einer kleinen Menge Mahlpuffer (Douce et al. Methods in Chloroplast Molecular Biology, 239 (1982)) resuspendiert.
Chloroplasten in den Sedimenten können auf drei verschiedene Wegen aufgebrochen werden. Chloroplastensedimente wurden zuerst in 1 mg Chlorophyll/Röhrchen aliquotiert, bei 6000 UpM für 2 Minuten in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert und der Mahlpuffer entfernt. 200 μl Triton X-100-Puffer (0,1% Triton X-100, 50 mM Tris-HCl pH 7,6 und 4 mM MgCl₂) oder Schwellpuffer (10 mM Tris pH 7,6 und 4 mM MgCl₂) wurde zu jedem Röhrchen hinzugegeben und für eine halbe Stunde bei 4°C inkubiert. Die aufgebrochenen Chloroplastensedimente wurden dann sofort für die Untersuchung verwendet. Zusätzlich können aufgebrochene Chloroplasten ebenfalls durch Gefrieren in flüssigem Stickstoff und Lagern bei –80°C für eine halbe Stunde erhalten und dann für die Untersuchung verwendet werden.
In einigen Fällen wurden die Chloroplastensedimente mit 40%/80% Percoll-Gradienten weiter aufgereinigt, um intakte Chloroplasten zu erhalten. Die intakten Chloroplasten wurden mit Schwellpuffer aufgebrochen, und dann entweder für die Untersuchung verwendet oder für Hüllmembranen mit 20,5%/31,8% Saccharose-Dichtegradienten (Soll et al. (1980) loc. cit.) weiter aufgereinigt. Die Membranfraktionen wurden mit 100 000 g für 40 Minuten zentrifugiert und in 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 4 mM MgCl₂ resuspendiert.
Verschiedene Mengen von [³H]HGA, 40 bis 60 μM unmarkiertes HGA mit einer spezifischen Aktivität im Bereich von 0,16 bis 4 Ci/mmol wurden mit einer geeigneten Menge 1 M Tris-NaOH pH 10 gemischt, um einen pH von 7,6 einzustellen. HGA wurde für 4 Minuten mit einer geringen Menge festen NaBH₄ reduziert. Zusätzlich zu HGA enthielt die Standardinkubationsmischung (Endvolumen 1 ml) 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 3–5 mM MgCl₂ und 100 μM Phytylpyrophosphat. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Synechocystis-Gesamtmembranen, Spinat-Chloroplastensedimenten, aufgebrochenen Spinat-Chloroplasten oder Spinat-Hüllmembranen gestartet. Die Enzymreaktion wurde für 2 Stunden bei 23 C oder 30°C im Dunklen oder bei Licht durchgeführt. Die Reaktion wird durch Frieren mit flüssigem Stickstoff und Lagerung bei –80°C oder direkt durch Extraktion gestoppt.
Eine konstante Menge Tocol wurde zu jeder Testmischung zugegeben und die Reaktionsprodukte wurden mit einer 2 ml-Mischung Chloroform/Methanol (1:2, v/v) extrahiert, um eine einphasische Lösung zu ergeben. NaCl-Lösung (2 ml; 0,9%) wurde unter energischem Schütteln hinzugegeben. Diese Extraktionsprozedur wurde dreimal wiederholt. Die organische Schicht, welche die Prenylchinone enthält, wurde durch einen 20 mμ-Filter filtriert, unter N₂ abgedampft und dann in 100 μl Ethanol resuspendiert.
Die Proben wurden hauptsächlich durch die Normalphasen-HPLC-Methode (isokratisch 90% Hexan und 10% Methyl-t-butylether) und Verwendung einer Zorbax-Kieselsäuresäule, 4,6 × 250 mm analysiert. Die Proben wurden ebenfalls durch ein Umkehrphasen-HPLC-Verfahren (isokratisch 0,1% H₃PO₄ in MeOH) und Verwendung einer Vydac 201HS54-C18-Säule; 4,6 × 250 mm gekoppelt mit einer All-tech C18-Guardsäule analysiert. Die Menge der Produkte wurde auf Basis der substratspezifischen Radioaktivität berechnet und gemäß der prozentualen Rückgewinnung basierend auf der Menge des internen Standards eingestellt.
Die Chlorophyllmenge wurde, wie in Arnon (1949) Plant Physiol. 24: 1 beschrieben bestimmt. Die Proteinmenge wurde durch das Bradford-Verfahren unter Verwendung von gamma-Globulin als ein Standard bestimmt (Bradford, (1976) Anal. Biochem. 72: 248).
Ergebnisse des Tests zeigen, dass 2-Methyl-6-Phytylplastochinon in den Synechocystis-slr1736-Knockout-Zubereitungen gebildet wird. Die Ergebnisse des Phytylprenyltransferase-Enzymaktivitätsassays für den slr1736-Knockout sind in 23 dargestellt.
4D. Komplementierung des slr1736-Knockouts mit ATPT2
Um zu bestimmen, ob ATPT2 den Knockout von slr1736 in Synechocystis 6803 komplementieren kann, wurde ein Plasmid konstruiert, das die ATPT2-Sequenz von dem TAC-Promotor ausgehend exprimiert. Ein Vektor, Plasmid psl1211, wurde von dem Laboratorium von Dr. Himadri Pakrasi von der Washington University erhalten und basiert auf dem Plasmid RSF1010, welches ein Plasmid mit breitem Wirtsspektrum ist (Ng W.-O., Zentella R., Wang Y., Taylor J-S. A., Pakrasi, H. B. 2000). phrA, the major photoreactivating factor in the cyanobacterium Synechocystis sp. Strain PCC 6803 codes for a cyclobutane pyrimidine dimer specific DNA photolyase. Arch. Microbiol. (im Druck)). Das ATPT2-Gen wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden Primer aus dem Vektor pCGN10817 isoliert. ATPT2nco.pr 5'-CCATGGATTCGAGTAAAGTTGTCGC (SEQ ID NO: 89); ATPT2ri.pr 5'-GAATTCACTTCAAAAAAGGTAACAG (SEQ ID NO: 90). Diese Primer werden ungefähr 112 Bp vom 5'-Ende der ATPT2-Sequenz entfernen, von denen angenommen wird, dass sie das Chloroplastentransitpeptid sind. Diese Primer werden ebenfalls eine NcoI-Stelle am 5'-Ende und eine EcoRI-Stelle am 3'-Ende einfügen, die für eine Subklonierung in nachfolgende Vektoren verwendet werden können. Das PCR-Produkt aus der Verwendung dieser Primer und pCGN10817 wurde in pGEM T easy ligiert und der entstehende Vektor pMON21689 wurde durch Sequenzierung unter Verwendung der m13vorwärts- und m13rückwärts-Primer bestätigt. Das NcoI/EcoRI-Fragment aus pMON21689 wurde dann mit den EagI/EcoRI- und EagI/NcoI-Fragmenten des psl1211 ligiert, was zu pMON21690 führte. Das Plasmid pMON21690 wurde durch Konjugation in den slr1736-Synechocystis 6803-KO-Stamm eingefügt. Zellen von sl906 (ein Helferstamm) und DH10B-Zellen, die pMON21690 enthalten, wurden bis zur log-Phase (O.D. 600 = 0,4) angezogen und 1 ml wurde durch Zentrifugation geerntet. Die Zellsedimente wurden zweimal mit einer sterilen BG-11-Lösung gewaschen und in 200 μl BG-11 resuspendiert. Das Folgende wurde in einem sterilen Eppendorf-Röhrchen gemischt: 50 μl SL906, 50 μl DH10B-Zellen, die pMON21690 enthalten, und 100 μl einer frischen Kultur des slr1736-Synechocystis 6803-KO-Stamm (O.D. 730 = 0,2 – 0,4). Die Zellmischung wurde sofort auf einen Nitrocellulosefilter, der auf BG-11 aufgebracht war, transferiert und für 24 Stunden bei 30°C und 2500 Lux (50 ue) Licht inkubiert. Der Filter wurde dann auf mit 10 μg/ml Gentamycin ergänztes BG-11 transferiert und für ungefähr 5 Tage inkubiert. Wenn Kolonien erschienen, wurden diese gepickt und in flüssigem BG-11 + Gentamycin 10 μg/ml angezogen (Elhai, J. und Wolk, P. 1988. Conjugal transfer of DNA of Cyanobacteria. Methods in Enzymol ogy 167, 747–54). Die Flüssigkulturen wurden dann durch Ernten von 1 ml Kultur durch Zentrifugieren, Extrahieren mit Ethanol/Pyrogallol und HPLC-Auftrennung auf Tocopherole hin untersucht. Der slr1736-Synechocystis 6803 KO-Stamm enthielt keine nachweisbaren Tocopherole, während der slr1736-Synechocystis 6803 KO-Stamm, der mit pmon21690 transformiert war, nachweisbares alpha-Tocopherol enthielt. Ein mit psl1211 (Vektorkontrolle) transformierter Synechocystis 6803-Stamm produzierte ebenfalls alpha-Tocopherol.
Referenzbeispiel 5: Analyse transgener Pflanzen
Arabidopsis-Pflanzen, die mit Konstrukten für die Sinn- oder Gegensinn-Expression der ATPT-Proteine transformiert sind, wurden mit Hilfe der Hochdruckflüssigchromatography (HPLC) auf veränderte Gehalte an Gesamttocopherolen sowie auf veränderte Gehalte an spezifischen Tocopherolen (alpha-, beta-, gamma- und delta-Tocopherol) untersucht.
Extrakte von Blättern und Samen wurden für die HPLC wie folgt hergestellt. Für Samenextrakte wurden 10 mg Samen zu 1 g Microbeads (Biospec) in einem sterilen Mikro(zentri)fugenröhrchen zugegeben, in das 500 μl 1% Pyrogallol (Sigma Chem)/Ethanol zugegeben wurden. Die Mischung wurde für 3 Minuten in einem „mini Beadbeater" (Biospec) mit der Geschwindigkeit "schnell" geschüttelt. Der Extrakt wurde durch einen 0,2 μm-Filter in ein „autosampler"-Röhrchen filtriert. Die filtrierten Extrakte wurden dann wie unten beschrieben für die HPLC-Analyse verwendet.
Blattextrakte wurden durch Mischen von 30–50 mg Blattgewebe mit 1 g Microbeads hergestellt und in flüssigem Stickstoff bis zur Extraktion tiefgefroren. Für die Extraktion wurden 500 μl 1% Pyrogallol in Ethanol zu der Blatt/Bead-Mischung gegeben und für 1 Minute auf einem „Beadbeater" (Biospec) mit der Geschwindigkeit "schnell" geschüttelt. Die entstehende Mischung wurde für 4 Minuten bei 14 000 UpM zentrifugiert und vor der HPLC-Analyse wie oben beschrieben filtriert.
HPLC wurde auf einer Zorbax-Kieselsäure-HPLC-Säule (4,6 mm × 250 mm) mit einer Fluoreszenzdetektion, einer Anregung bei 290 nm, einer Emission von 336 nm, und Bandpass und Schlitzen („slits") durchgeführt. Lösungsmittel A war Hexan und Lösungsmittel B war Methyl-t-butylether. Das Injektionsvolumen betrug 20 μl, die Flußrate betrug 1,5 ml/min, die Laufzeit betrug 12 Minuten (40°C) bei Verwendung des Gradienten (Tabelle 5):
Tabelle 5:
Zum Vergleich wurden Tocopherolstandards in 1% Pyrogallol/Ethanol ebenfalls analysiert (alpha-Tocopherol, gamma-Tocopherol, beta-Tocopherol, delta-Tocopherol und Tocopherol (Tocol) (alle von Matreya)).
Standardkurven für alpha-, beta-, delta- und gamma-Tocopherol wurden unter Verwendung der Chemstation-Software berechnet. Die absolute Menge der Komponente x ist: Absolute Menge von x = Antwort_x × RF_x × Verdünnungsfaktor, wobei Antwort_x die Fläche des Peaks x ist, RF_x der Antwortfaktor für die Komponente x (Menge_x/Antwort_x) ist und der Verdünnungsfaktor 500 μl ist. Die ng/mg Gewebe werden bestimmt durch: Gesamt-ng Komponente/mg Pflanzengewebe.
Ergebnisse für die HPLC-Analyse der Samenextrakte von transgenen Arabidopsis-Linien, die pMON10822 für die Expression von ATAT2 ausgehend vom Napin-Promotor enthalten, sind in 24 dargestellt.
HPLC-Analyseergebnisse von Arabidopsis-Samengewebe, das die ATAT2-Sequenz ausgehend vom Napin-Promotor (pMON10822) exprimiert, zeigen einen erhöhten Gehalt an Tocopherolen in den Samen. Die Gesamt-Tocopherolgehalte sind um 50 bis 60% gegenüber den Gesamt-Tocopherolgehalten von nicht-transformierten (Wildtyp-)Arabidopsis-Pflanzen erhöht (24).
Weiterhin sind die Zunahmen von bestimmten Tocopherolen in transgenen Arabidopsis-Pflanzen, welche die ATAT2-Nukleinsäuresequenz ausgehend vom Napin-Promotor exprimieren, ebenfalls erhöht. Gehalte von delta-Tocopherol sind in diesen Linien mehr als dreifach gegenüber den delta-Tocopherolgehalten, die aus den Samen von Wildtyp-Arabidopsis-Linien erhalten wurden, erhöht. Gehalte von gamma-Tocopherol in transgenen Arabidopsis-Linien, welche die ATAT2-Nukleinsäuresequenz exprimieren, sind um ungefähr 60% über die Gehalte, die in den Samen von nicht-transgenen Kontrolllinien erhalten wurden, erhöht. Weiterhin sind die Gehalte von alpha-Tocopherol bis zu dreifach gegenüber denen, die aus nicht-transgenen Kontrollinien erhalten wurden, erhöht.
Ergebnisse für die HPLC-Analyse von Samenextrakten der transgenen Arabidopsis-Linien, die pMON10803 für die Expression von ATAT2 ausgehend von dem „enhanced" 35S-Promotor enthalten, sind in 25 dargestellt.
Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung erwähnt sind, deuten auf das Niveau des Fachwissens der Fachleute an, die diese Erfindung betrifft.
Sequenzprotokoll

Claims

Isolierte Nukleinsäuresequenz, die für eine Prenyltransferase kodiert, wobei die Prenyltransferase Homogentisinsäure prenyliert und wobei die Nukleinsäuresequenz die SEQ ID NO: 1 umfasst.
Isolierte DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1, wobei die Prenyltransferase aus Arabidopsis stammt.
Isolierte DNA-Sequenz gemäß Anspruch 1, wobei die Prenyltransferase die SEQ ID NO: 2 umfasst.
Vektorkonstrukt, das die folgenden Bestandteile in funktionsfähiger Verknüpfung umfasst einen Transkriptions-Initiationsbereich, der in Wirtszellen aktiv ist, eine Nukleinsäure, die für eine Prenyltransferase kodiert, wobei die Prenyltransferase Homogentisinsäure prenyliert und wobei die Nukleinsäuresequenz die SEQ ID NO: 1 umfaßt oder wobei die Nukleinsäure für die SEQ ID NO: 2 kodiert, und einen Transkriptions-Terminationsbereich.
Wirtszelle, die das Konstrukt gemäß Anspruch 4 umfasst.
Wirtszelle gemäß Anspruch 5, wobei die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.
Transgene Pflanze, welche die Pflanzenzelle gemäß Anspruch 6 umfasst.