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DE60129011T2 - Nukleinsäuresequenzen für proteine, die an der tocopherolbiosynthese beteiligt sind - Google Patents

Nukleinsäuresequenzen für proteine, die an der tocopherolbiosynthese beteiligt sind Download PDF

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DE60129011T2
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plant
tocopherol
seq
sequence
construct
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DE60129011T
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Sai S. Sharon SUBRAMANIAM
Steven C. Acton SLATER
Katherine St.Louis KARBERG
Ridong Schaumburg CHEN
Henry E. Chesterfield VALENTIN
Yun-Hua Huang Chesterfield WONG
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Monsanto Co
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Calgene LLC
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Priority claimed from US09/688,069 external-priority patent/US6872815B1/en
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Description

  • TECHNISCHES GEBIET
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Nukleinsäure- und Aminosäuresequenzen und Konstrukte und Verfahren, die damit in Beziehung stehen.
  • HINTERGRUND
  • Isoprenoide sind allgegenwärtig vorkommende Verbindungen, die in allen lebenden Organismen vorkommen. Pflanzen synthetisieren eine vielfältige Anzahl von mehr als 22 000 Isoprenoiden (Connolly und Hill (1992) Dictionary of Terpenoids, Chapman und Hall, New York, NY). In Pflanzen spielen Isoprenoide wesentliche Rollen bei bestimmten Zellfunktionen, wie der Produktion von Sterolen, die zur Membranarchitektur der Eukaryonten beitragen, azyklischen Polyprenoiden, die in den Seitenketten von Ubichinon und Plastochinon vorkommen, Wachstumsregulatoren wie Abscisinsäure, Gibberellinen, Brassinosteroiden, oder den photosynthetischen Pigmenten Chlorophyllen und Carotinoiden. Obwohl die physiologische Funktion von anderen Pflanzen-Isoprenoiden weniger deutlich ist, wie die der großen Anzahl von Sekundärmetaboliten, ist von einigen bekannt, daß sie wichtige Rollen bei der Vermittlung adaptiver Antworten auf verschiedene Umwelteinflüsse spielen. Trotz der bemerkenswerten Vielfältigkeit der Struktur und Funktion stammen alle Isoprenoide von einem einzigen metabolischen Vorläufer, dem Isopentenyldiphosphat (IPP), ab (Wright, (1961) Annu. Rev. Biochem. 20:525-548; und Spurgeon und Porter, (1981) in Biosynthesis of Isoprenoid Compounds, Porter und Spurgeon, Hrsg. (John Wiley, New York) Band 1, Seiten 1-46).
  • Es existieren eine Anzahl einzigartiger und miteinander verbundener biochemischer Stoffwechselwege in Chloroplasten höherer Pflanzen, die von dem Isoprenoidstoffwechselweg, der zu Sekundärmetaboliten einschließlich der Tocopherole führt, abgeleitet sind. Tocopherole weisen nicht nur lebenswichtige Funktionen in Pflanzen auf, sie sind auch aus Sicht der Sicht der Säugetierernährung wichtig. In Plastiden machen Tocopherole bis zu 40 % des gesamten Chinonpools aus.
  • Tocopherole und Tocotrienole (ungesättigte Tocopherolderivate) sind gut bekannte Antioxidantien und spielen eine wichtige Rolle beim Schutz von Zellen vor Schäden durch freie Radikale und in der Verhinderung von vielen Krankheiten, einschließlich Herzkrankheiten, Krebs, Katarakten, Retinopathien, Alzheimer-Krankheit und Neurodegeneration, und es wurde gezeigt, daß sie positive Wirkungen auf die Symptome von Arthritis und beim Anti-Aging haben. Vitamin E wird im Hühnerfutter verwendet, um die Haltbarkeit, das Aussehen, den Geschmack und die oxidative Stabilität des Fleisches zu verbessern, und um Tocole aus dem Futter in die Eier zu überführen. Es wurde gezeigt, daß Vitamin E für eine normale Reproduktion essentiell ist, die Gesamtleistung verbessert und die Immunkompetenz bei Tieren aus Viehbeständen verbessert. Vitamin E-Zusatz in Tierfutter verleiht auch Milchprodukten oxidative Stabilität.
  • Der Bedarf an natürlichen Tocopherolen als Ergänzungen ist innerhalb der letzten drei Jahre stetig mit einer Rate von 10 bis 20 % angewachsen. Derzeit übersteigt der Bedarf das Angebot an natürlichen Tocopherolen, von denen man weiß, daß sie eine größere Biopotenz aufweisen als racemische Gemische von synthetisch hergestellten Tocopherolen. Natürlich vorkommende Tocopherole sind alles d-Stereoisomere, wohingegen synthetisches α-Tocopherol eine Mischung aus acht d,l-α-Tocopherolisomeren ist, von denen nur eins (12,5 %) mit natürlichem d-α-Tocopherol identisch ist. Natürliches d-α-Tocopherol hat die höchste Vitamin E-Aktivität (1,49 IU/mg) verglichen mit anderen natürlichen Tocopherolen oder Tocotrienolen. Das synthetische α-Tocopherol hat eine Vitamin E-Aktivität von 1,1 IU/mg. 1995 betrug der weltweite Markt für rohe raffinierte Tocopherole 1020 Millionen Dollar; synthetische Materialien umfaßten 85 bis 88 % des Marktes, während die verbleibenden 12 bis 15 % natürliche Materialien waren. Die besten Quellen für natürliche Tocopherole und Tocotrienole sind pflanzliche Öle und Getreideprodukte. Derzeit wird der größte Teil des natürlichen Vitamin E aus γ-Tocopherol produziert, das aus der Sojaölgewinnung stammt, und das später durch chemische Modifizierung zu α-Tocopherol umgewandelt wird (α-Tocopherol weist die größte biologische Aktivität auf).
  • Verfahren zur Steigerung der Gehalte von Tocopherolen und Tocotrienolen in Pflanzen, insbesondere den Gehalten der mehr erwünschten Verbindungen, die ohne chemische Modifizierung direkt verwendet werden können, wären für das Fachgebiet nützlich, da solche Moleküle eine bessere Funktionalität und Bioverfügbarkeit aufweisen.
  • Weiterhin sind Verfahren für die gesteigerte Produktion von anderen, von Isoprenoiden abgeleiteten Verbindungen in einer Wirtspflanzenzelle erwünscht. Zudem werden Verfahren für die Produktion bestimmter Isoprenoidverbindungen in einer Wirtspflanzenzelle benötigt.
  • Sowohl die WO 99/04522 als auch die WO 00/10380 offenbaren beide die für gamma-Tocopherolmethyltransferasen kodierende Gensequenz.
  • Die EMBL-Sequenzdatenbank-Zugangsnummer D90909, XP002193030, und die TREMBL-Datenbank-Zugangsnummer = 73727, XP002193031, offenbaren Nukleotid- und abgeleitete Aminosäuresequenzen eines Gens aus Cyanobacterium synechocystis sp.. Die Veröffentlichungen offenbaren jedoch weder die Funktion des Gens noch das kodierte Protein.
  • ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung betrifft Sequenzen für Proteine, die an der Tocopherolbiosynthese beteiligt sind. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung eine Nukleinsäuresequenz, die für eine Tocopherolcyclase kodiert, die eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90 % Identität zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 110 umfaßt, und die als in funktionsfähiger Weise verknüpfte Bestandteile eine in einer pflanzlichen Wirtszelle funktionstüchtige Transkriptionsinitiationsregion, eine für die Tocopherolcyclase kodierende Nukleinsäuresequenz und eine Transkriptionsterminationsregion umfaßt.
  • Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Pflanzenzellen, die entsprechende Konstrukte umfassen, wobei die Pflanzen ausgewählt sind aus der Gruppe Acacia, Alfalfa, Dill, Apfel, Aprikose, Artischocke, Rukola, Spargel, Avocado, Banane, Gerste, Bohnen, Rübe, Brombeere, Blaubeere, Broccoli, Rosenkohl, Kohl, Canola, Melone, Karotte, Cassava, Blumenkohl, Sellerie, Kirsche, Chicorée, Koriander, Zitrus, Klementinen, Kaffee, Mais, Baumwolle, Gurke, Douglasie, Aubergine, Endivie, Eskariol, Eukalyptus, Fenchel, Feigen, Knoblauch, Kürbis, Traube, Grapefruit, Honigtau, Yambohne, Kiwi, Salat, Lauch, Zitrone, Limette, Weihrauchkiefer („pinus staeda"), Mango, Melone, Champignon, Nektarine, Nuß, Hafer, Ölpalme, Ölsamenraps, Eibisch, Zwiebel, Orange, eine Zierpflanze, Papaya, Petersilie, Erbse, Pfirsich, Erdnuß, Birne, Pfeffer, Persimone, Kiefer, Ananas, Kochbanane, Pflaume, Granatapfel, Pappel, Kartoffel, Kürbis, Quitte, Radiatakiefer, Radicchio, Rettich, Himbeere, Reis, Roggen, Sorghum, Südkiefer, Sojabohne, Spinat, Squash- Kürbis, Erdbeere, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Sonnenblume, Süßkartoffel, Amberbaum, Mandarine, Tee, Tabak, Tomate, Triticale, Rasen, Weißrübe, ein Wein, Wassermelone, Weizen, Yamswurzel und Zucchini, Distel, Kokosnuss-Palme.
  • In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Pflanzen und Samen, welche diese Zellen umfassen, ebenso wie eine Nahrungszusammensetzung, die entsprechende Pflanzen umfaßt.
  • In einer alternativen Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung von Öl unter Verwendung dieser Samen.
  • In verwandten Aspekten stellt die vorliegende Erfindung
    • • Verfahren zur Veränderung des Isoprenoidgehalts in einer Wirtszelle, wobei diese Verfahren das Transformieren einer Wirtszelle mit den obigen Konstrukten umfaßt, wobei die Isoprenoid-Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe von Tocopherolen und Tocotrienolen;
    • • Verfahren zur Herstellung einer Isoprenoid-Verbindung von Interesse in einer Wirtszelle, wobei diese Verfahren das Erhalten einer transformierten Wirtszelle, in die das obige Konstrukt eingebracht worden ist, umfassen, wobei die Wirtszelle dieses Konstrukt in ihrem Genom enthält und dieses exprimiert, und wobei die Isoprenoid-Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tocopherolen und Tocotrienolen;
    • • Verfahren zur Erhöhung des biosynthetischen Flusses in einer Wirtszelle in Richtung der Herstellung einer Isoprenoid-Verbindung, wobei diese Verfahren das Transformieren einer Wirtszelle mit dem obigen Konstrukt umfaßt, wobei die
  • Isoprenoid-Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe von Tocopherolen und Tocotrienolen, zur Verfügung.
  • KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
  • Die 1 stellt einen Aminosäuresequenzabgleich zwischen ATPT2, ATPT3, ATPT4, ATPT8 und ATPT12 bereit, der mit ClustalW durchgeführt wurde.
  • Die 2 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10800 bereit.
  • Die 3 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10801 bereit.
  • Die 4 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10803 bereit.
  • Die 5 stellt eine schematische Abbildung des Konstrukts pCGN 10806 bereit.
  • Die 6 stellt eine schematische Abbildung des Konstrukts pCGN 10807 bereit.
  • Die 7 stellt eine schematische Abbildung des Konstrukts pCGN 10808 bereit.
  • Die 8 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10809 bereit.
  • Die 9 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10810 bereit.
  • Die 10 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10811 bereit.
  • Die 11 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10812 bereit.
  • Die 12 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10813 bereit.
  • Die 13 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10814 bereit.
  • Die 14 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10815 bereit.
  • Die 15 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10816 bereit.
  • Die 16 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10817 bereit.
  • Die 17 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10819 bereit.
  • Die 18 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10824 bereit.
  • Die 19 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10825 bereit.
  • Die 20 stellt eine schematische Abbildung des Expressionskonstrukts pCGN 10826 bereit.
  • Die 21 stellt einen Aminosäuresequenzabgleich zwischen den Synechocystis-Prenyltransferasesequenzen unter Verwendung von ClustalW bereit.
  • Die 22 stellt eine Aminosäuresequenz der ATPT2-, ATPT3-, ATPT4-, ATPT8-, und ATPT12-Proteinsegenzen aus Arabidopsis und die slr1736-, slr0926-, sll1899-, slr0056- und slr1518-Aminosäuresequenzen aus Synechocystis bereit.
  • Die 23 stellt die Ergebnisse des enzymatischen Assays von Präparaten des Wildtyp-Synechocystis-Stamms 6803 und des Synechocystis slr1736-Knockouts bereit.
  • Die 24 stellt Balkendiagramme der HPLC-Daten bereit, die aus Samenextrakten von transgenem Arabidopsis erhalten wurden, das pCGN10822 enthält, das die Expression der ATPT2-Sequenz in sense-Orientierung durch den Napinpromotor bereitstellt. Bereitgestellt werden Diagramme für alpha-, gamma- und delta-Tocopherole sowie für das Gesamt-Tocopherol von 22 transformierten Linien sowie einer nicht-transformierten (Wildtyp)-Kontrolle.
  • Die 25 stellt ein Balkendiagramm einer HPLC-Analyse von Samenextrakten aus Arabidopsis-Pflanzen bereit, die mit pCGN10803 (35S-ATPT2 in der Antisense-Orientierung), pCGN10802 (Linie 1625, Napin-ATPT2 in der Sense-Orientierung), pCGN10809 (Linie 1627, 35S-ATPT3 in der Sense-Orientierung), transformiert wurden, einer nicht-transformierten (wt) Kontrolle und einer mit einem leeren Vektor transformierten Kontrolle.
  • Die 26 zeigt die Gesamttocopherolgehalte, die in T#-Arabidopsissamen der Linie gemessen wurden.
  • Die 27 zeigt die Gesamttocopherolgehalte, die in T#-Arabidopsissamen der Linie gemessen wurden.
  • Die 28 zeigt die Gesamttocopherolgehalte, die in sich entwickelnden Canolasamen der Linie 10822-1 gemessen wurden.
  • Die 29 zeigt die Ergebnisse des Phytylprenyltransferase-Aktivitätsassays unter Verwendung von Membranpräparationen des Synechocystis-Wildtyps und der slr1737-Knockout-Mutante.
  • Die 30 ist das Chromatogramm einer HPLC-Analyse von Synechocystis-Extrakten.
  • Die 31 ist ein Sequenzabgleich des Arabidopsis-Homologs mit der Sequenz aus der öffentlichen Datenbank.
  • Die 32 zeigt die Ergebnisse der hydropathischen Analyse von slr1737.
  • Die 33 zeigt die Ergebnisse der hydropathischen Analyse des Arabidopsis-Homologs von slr1737.
  • Die 34 zeigt den katalytischen Mechanismus verschiedener Cyclaseenzyme.
  • Die 35 ist ein Sequenzabgleich von slr1737, von dem Arabidopsis-Homolog des slr1737 und der Arabidopsis-Chalkonisomerase.
  • AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
  • Die vorliegende Erfindung stellt unter anderem Zusammensetzungen und Verfahren zur Veränderung (zum Beispiel zur Erhö hung oder Verringerung) der Tocopherolgehalte und/oder zur Modulierung ihrer Verhältnisse in Wirtszellen zur Verfügung. Insbesondere stellt die vorliegende Erfindung Polynukleotide und Verfahren zu ihrer Verwendung für die Modulierung des Tocopherolgehalts in Wirtspflanzenzellen zur Verfügung.
  • Die Biosynthese von α-Tocopherol in höheren Pflanzen schließt die Kondensation von Homogentisinsäure und Phytylpyrophosphat zur Bildung von 2-Methyl-6-phytylbenzochinol ein, das durch Ringschließung und anschließende Methylierungen verschiedene Tocopherole bilden kann (Fiedler et al., 1982, Planta, 155:511-515, Soll et al., 1980, Arch. Biochem. Biophys. 204:544-550, Marshall et al., 1985 Phytochem., 24:1705-1711, die alle in ihrer Gesamtheit durch Bezugnahme hier aufgenommen werden).
  • Die von Norris et al. (1995) identifizierte und charakterisierte Arabidopsis-pds2-Mutante ist hinsichtlich der Tocopherol- und Plastichinon-9-Akkumulation fehlerhaft („deficient"). Weitere genetische und biochemische Analysen legen nahe, daß das Protein, das durch PDS2 kodiert wird, für die Prenylierung von Homogentisinsäure verantwortlich sein könnte. Für den von Norris et al. (1995) identifizierten PDS2-Lokus wurde angenommen, das er für die Tocopherol-phytylprenyltransferase kodiert, da die pds2-Mutante nicht in der Lage ist, Tocopherole zu akkumulieren.
  • Norris et al. (1995) bestimmten, daß der genetischen Karte zufolge pds2 in Arabidopsis an der Spitze des Chromosoms 3 liegt, ungefähr 7 Centimorgan über dem „long hypocotyl 2". ATPT2 ist auf Chromosom 2 zwischen 36 und 41 Centimorgan lokalisiert, auf BAC F19F24 liegend, was andeutet, daß ATPT2 nicht PDS2 entspricht. Somit ist es ein Aspekt der vorliegenden Erfindung, neue Polynukleotide und Polypeptide zur Verfügung zu stellen, die an der Prenylierung von Homogentisinsäure betei ligt sind. Diese Umsetzung könnte ein geschwindigkeitsbegrenzender Schritt in der Tocopherolbiosynthese sein, und dieses Gen muß noch isoliert werden.
  • Das US-Patent 5,432,069 beschreibt die teilweise Aufreinigung und Charakterisierung der Tocopherolcyclase aus Chlorella protothecoides, Dunaliella salina und aus Weizen. Die Cyclase wird als Glycin-reich, wasserlöslich und mit einem vorhergesagten MW von 4-50 kDa beschrieben. Jedoch waren nur einschränkte Peptidfragmentsequenzen verfügbar.
  • In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung Polynukleotide und Polypeptidsequenzen, wie oben definiert, für Tocopherolcyclaseenzyme zur Verfügung. Die 2,3-Dimethyl-5-phytylplastochinolcyclase (Tocopherolcyclase) ist für die Ringbildung („cyclization") von 2,3-Dimethyl-5-phytylplastochinol hin zu Tocopherol verantwortlich.
  • Isolierte Polynukleotide, Proteine und Polypeptide
  • Die vorliegende Erfindung betrifft isolierte Tocopherolcyclase-Polynukleotide, wie sie oben definiert sind. Die erfindungsgemäßen Polynukleotidsequenzen schließen isolierte Polynukleotide ein, die für die erfindungsgemäßen Polypeptide kodieren, die eine abgeleitete Aminosäuresequenz aufweisen, die ausgewählt ist aus der Gruppe von Sequenzen, die in dem Sequenzprotokoll dargestellt sind, und anderen Polynukleotidsequenzen, die mit solchen Sequenzen und deren Varianten, wie sie oben definiert sind, nah verwandt sind.
  • Üblicherweise wird eine Tocopherolcyclasesequenz, die aus der Verwendung von Nukleinsäuresonden erhältlich ist, eine Sequenzidentität von 90% zwischen der Zielprenyltransferase- oder Tocopherolcyclasesequenz und der als eine Sonde verwendeten kodierendem Sequenz aufweisen.
  • „Identität", wie sie im Fachgebiet verstanden wird, ist eine Beziehung zwischen zwei oder mehr Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehr Polynukleotidsequenzen, die durch ein Vergleichen der Sequenzen bestimmt wird. In dem Fachgebiet bedeutet „Identität" ferner der Grad der Sequenzverwandtschaft zwischen Polypeptid- oder Polynukleotidsequenzen, so wie er durch die Übereinstimmung zwischen Bereichen solcher Sequenzen bestimmt wird. Die „Identität" kann durch bekannte Verfahren leicht berechnet werden, einschließlich derer, die in Computational Molecular Biology, Lesk, A.M., Hrsg., Oxford University Press, New York (1988), Biocomputing: Informatics and Genome Projects, Smith, D.W., Hrsg., Academic Press, New York, 1993, Computer Analysis of Sequence Data, Teil I, Griffin, A.M. und Griffin, H.G., Hrsg., Humana Press, New Jersey (1994), Sequence Analysis in Molecular Biology, von Heinje, G., Academic Press (1987), Sequence Analysis Primer, Gribskov, M. und Devereux, J., Hrsg., Stockton Press, New York (1991), und Carillo, H., und Lipman, D., SIAM J Applied Math, 48:1073 (1988) beschrieben werden, ohne auf diese beschränkt zu sein. Verfahren zur Bestimmung der Identität sind so gestaltet, daß sie die größte Übereinstimmung zwischen den getesteten Sequenzen ergeben. Weiterhin werden Verfahren zum Bestimmen der Identität in öffentlich zugänglichen Programmen kodifiziert. Computerprogramme, die verwendet werden können, um die Identität zwischen zwei Sequenzen zu bestimmen, schließen GCG (Devereux, J., et al., Nucleic Acids Research 12(1):387 (1984), eine Gruppe von fünf BLAST-Programmen, wovon drei für Nukleotidsequenzabfragen (BLASTN, BLASTX, und TBLASTX) und zwei für Proteinsequenzabfragen (BLASTP und TBLASTP) entworfen wurden (Coulson, Trends in Biotechnology, 12:76-80(1994), Birren, et al., Genome Analysis, 1:543-559(1997)) ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Das BLAST X-Programm ist beim NCBI und anderen Quel len öffentlich zugänglich (BLAST-Anleitung, Altschul, S., et al., NCBI NLM NIH, Bethesda, MD 20894; Altschul, S., et al., J Mol. Biol., 215:403-410 (1990)). Der bekannte Smith-Waterman-Algorithmus kann ebenfalls verwendet werden, um die Identität zu bestimmen.
  • Die Parameter für den Polypeptidsequenzvergleich schließen üblicherweise die folgenden ein:
    • Algorithmus: Needleman und Wunsch, J Mol. Biol. 45:443-453 (1970)
    • Vergleichsmatrix: BLOSSUM62 von Hentikoff und Hentikoff, Proc. Natl. Acad Sci USA 89:10915-10919 (1992)
    • Gap Penalty: 12
    • Gap Length Penalty: 4
  • Ein Programm, das mit diesen Parametern verwendet werden kann, ist wie das „gap"-Programm der Genetics Computer Gruppe, Madison Wisconsin, öffentlich zugänglich. Die obigen Parameter sind gemeinsam mit „no penalty" für „end gap" die Vorgabeparameter für Peptidvergleiche.
  • Die Parameter für den Polynukleotidsequenzvergleich schließen die folgenden ein:
    • Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-453 (1970)
    • Vergleichsmatrix: matches = +10; mismatches = 0
    • Gap Penalty: 50
    • Gap Length Penalty: 3
  • Ein Programm, das mit diesen Parametern verwendet werden kann, ist wie das „gap"-Programm der Genetics Computer Gruppe, Madison Wisconsin, öffentlich zugänglich. Die oberen Parameter sind die Vorgabeparameter für Nukleinsäurevergleiche.
  • Die erfindungsgemäßen Polynukleotide können zum Beispiel bei der Transformation von Wirtszellen, wie beispielsweise Pflanzenwirtszellen, wie hier weiterhin diskutiert wird, verwendet werden.
  • Die Erfindung stellt ferner Polynukleotide bereit, die für ein Polypeptid kodieren, das ein reifes Protein plus zusätzliche Amino- oder carboxyterminale Aminosäuren oder Aminosäuren innerhalb des reifen Polypeptids (zum Beispiel wenn die reife Form des Proteins mehr als eine Polypeptidkette aufweist) kodiert. Solche Sequenzen können zum Beispiel eine Rolle beim Prozessieren eines Proteins aus einer Vorläufer- in eine reife Form spielen, können den Proteintransport ermöglichen, können die Proteinhalbwertszeit verkürzen oder verlängern, oder können die Handhabung des Proteins in Assays oder bei der Herstellung erleichtern. Es wird in Erwägung gezogen, daß zelluläre Enzyme verwendet werden können, um jegliche zusätzliche Aminosäuren aus dem reifen Protein zu entfernen.
  • Ein Vorläuferprotein, daß die reife Form des Polypeptids an eine oder mehrere pro-Sequenzen gekoppelt aufweist, kann eine inaktive Form des Polypeptids sein. Die inaktiven Vorläufer werden im allgemeinen aktiviert, wenn die pro-Sequenzen entfernt werden. Einige oder alle pro-Sequenzen können vor der Aktivierung entfernt werden. Solche Vorläuferproteine werden im allgemeinen pro-Proteine genannt.
  • Pflanzenkonstrukte und Verfahren der Verwendung
  • Von besonderem Interesse ist die Verwendung der Nukleotidsequenzen, wie sie oben definiert sind, in rekombinanten DNA-Konstrukten, um die Transkription oder Transkription und Translation (Expression) der Tocopherolcyclasesequenzen der vorliegenden Erfindung in einer Wirtspflanzenzelle zu steuern.
  • Die Expressionskonstrukte umfassen im allgemeinen einen Promotor, der in einer Wirtspflanzenzelle funktionsfähig ist und funktionsfähig mit einer Nukleinsäuresequenz verknüpft ist, die für eine Tocopherolcyclase der vorliegenden Erfindung kodiert, und einen Transkriptionsterminierungsbereich, der in der Wirtspflanzenzelle funktionsfähig ist.
  • Eine erste Nukleinsäuresequenz ist mit einer zweiten Nukleinsäuresequenz "funktionsfähig verknüpft" oder "funktionsfähig assoziiert", wenn diese Sequenzen so angeordnet sind, daß die erste Nukleinsäuresequenz die Funktion der zweiten Nukleinsäuresequenz beeinflußt. Bevorzugt sind die zwei Sequenzen Teil eines einzigen zusammenhängenden Nukleinsäuremoleküls und bevorzugter sind sie angrenzend. Zum Beispiel ist ein Promotor mit einem Gen funktionsfähig verknüpft, wenn der Promotor die Transkription des Gens in einer Zelle reguliert oder vermittelt.
  • Die Fachleute werden erkennen, daß es eine Anzahl von Promotoren gibt, die in Pflanzenzellen funktionsfähig sind und die in der Literatur beschrieben wurden. Chloroplasten- und Plastiden-spezifische Promotoren, Promotoren, die in Chloroplasten oder Plastiden funktionsfähig sind, und Promotoren, die in Chloroplasten oder Plastiden verwendbar sind, sind ebenfalls vorgesehen.
  • Eine Gruppe von funktionsfähigen Pflanzenpromotoren sind konstitutive Promotoren, wie zum Beispiel CaMV35S- oder FMV35S-Promotoren, die in den meisten Pflanzenorganen zu hohen Expressionsniveaus führen. Verstärkte oder duplizierte Versionen der CaMV35S- und FMV35S-Promotoren sind für die Ausführung dieser Erfindung nützlich (Odell et al. (1985) Nature 313:810-812; Rogers, US-Patent 5,378,619 ). Des Weiteren kann es ferner bevorzugt sein, die Expression des Tocopherolcyclasegens in spezifischen Geweben der Pflanze, wie zum Beispiel Blatt, Stamm, Wurzel, Knolle, Samen, Frucht, etc. zu bewirken, und die ausgewählten Promotoren sollten die gewünschte Gewebs- und Entwicklungsspezifität aufweisen.
  • Von besonderem Interesse ist die Expression von Nukleinsäuresequenzen der vorliegenden Erfindung ausgehend von Transkriptions-Initiationsregionen, die bevorzugt in einem Pflanzensamengewebe exprimiert werden. Beispiele für solche in Samen bevorzugten Transkriptions-Initiationssequenzen schließen die Sequenzen ein, die von Sequenzen abgeleitet werden, die für Pflanzenspeicherproteingene kodieren, oder von Genen stammen, die an der Fettsäurebiosynthese in Ölsamen beteiligt sind. Beispiele solcher Promotoren schließen die 5'-regulatorischen Bereiche von Genen wie Napin (Kridl et al., Seed Sci. Res. 1:209:219 (1991)), Phaseolin, Zein, Sojabohnentrypsininhibitor, ACP, Stearyl-ACP-Desaturase, Sojabohnen-α'-Untereinheit von β-Conglycinin (Soja 7s, (Chen et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 83:8560-8564 (1986))) und Oleosin ein.
  • Es kann vorteilhaft sein, die Lokalisation von Proteinen, die Tocopherolcyclaseaktivität verleihen, in ein bestimmtes subzelluläres Kompartiment zu steuern, zum Beispiel in das Mitochondrium, endoplasmatische Reticulum, Vakuolen, Chloroplast oder ein anderes Plastiden-Kompartiment. Wenn die Gene von Interesse der vorliegenden Erfindung beispielsweise für eine Expression auf Plastiden, wie zum Beispiel Chloroplasten, gerichtet sind, werden die Konstrukte ebenfalls Sequenzen zur Lenkung des Gens in das Plastid verwenden. Solche Sequenzen werden hier als Chloroplastentransitpeptide (CTP) oder Plastidentransitpeptide (PTP) bezeichnet. Auf diese Weise werden, wenn das Gen von Interesse nicht direkt in den Plastiden eingebracht wird, die Expressionskonstrukte zusätzlich ein Gen enthalten, das für ein Transitpeptid kodiert, um das Gen von Interesse zu den Plastiden zu lenken. Die Chloroplastentransitpeptide können von dem Gen von Interesse abgeleitet werden, oder können von einer heterologen Sequenz, die ein CTP aufweist, abgeleitet sein. Solche Transitpeptide sind im Fachgebiet bekannt. Siehe zum Beispiel Von Heijne et al. (1991) Plant Mol. Biol. Rep. 9:104-126; Clark et al. (1989) J. Biol. Chem. 264:17544-17550; della-Cioppa et al. (1987) Plant Physiol. 84:965-968; Romer et al. (1993) Biochem. Biophys. Res. Commun. 196:1414-1421; und Shah et al. (1986) Science 233:478-481.
  • Abhängig von der geplanten Verwendung können die Konstrukte die Nukleinsäuresequenz enthalten, die für das gesamte Tocopherolcyclaseprotein kodiert, oder einen Teil davon. Wenn zum Beispiel eine antisense-Inhibierung eines bestimmten Prenyltransferase- oder Tocopherolcyclaseproteins gewünscht ist, wird nicht die gesamte Tocopherolcyclasesequenz benötigt. Weiterhin kann es vorteilhaft sein, Konstrukte herzustellen, die nur einen bestimmten Bereich einer für eine Tocopherolcyclase kodierenden Sequenz enthalten, beispielsweise eine Sequenz, für die gefunden wurde, daß sie für einen hochkonservierten Tocopherolcyclasebereich kodiert, wenn Tocopherolcyclasesequenzen in Konstrukten verwendet werden, die für eine Verwendung als Sonde gedacht sind.
  • Der Fachmann wird erkennen, daß es verschiedene Verfahren für die Inhibierung der Expression endogener Sequenzen in einer Wirtszelle gibt. Solche Verfahren schließen antisense-Supprimierung (Smith et al. (1988) Nature 334:724-726), Ko-Supprimierung (Napoli, et al. (1989) Plant Cell 2:279-289), Ribozyme (PCT-Veröffentlichung WO 97/10328 ) und Kombinationen von Sense und Antisense (Waterhouse et al. (1998) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13959-13964) ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Verfahren für die Supprimierung endogener Sequenzen in einer Wirtszelle verwenden üblicherweise die Transkription oder Transkription und Translation mindestens eines Bereichs der Sequenz, die supprimiert werden soll. Solche Se quenzen können homolog zu kodierenden genauso wie zu nicht-kodierenden Bereichen der endogenen Sequenz sein.
  • Regulatorische Transkript-Terminierungsbereiche können auch in Pflanzenexpressionskonstrukten dieser Erfindung zur Verfügung gestellt werden. Transkript-Terminierungsbereiche können durch die DNA-Sequenz zur Verfügung gestellt werden, die für die Tocopherolcyclase kodiert, oder durch einen geeigneten Transkriptions-Terminierungsbereich, der von einer anderen Genquelle abgeleitet ist, zum Beispiel dem Transkriptions-Terminierungsbereich, der natürlicherweise mit dem Transkript-Initiationsbereich assoziiert ist. Der Fachmann wird erkennen, daß jeder geeignete Transkript-Terminierungsbereich, der in der Lage ist, die Transkription in einer Pflanzenzelle zu beenden, in den Konstrukten der vorliegenden Erfindung verwendet werden kann.
  • Alternativ können Konstrukte hergestellt werden, welche die Expression der Tocopherolcyclasesequenzen direkt von dem Wirtspflanzenzellen-Plastid steuern. Solche Konstrukte und Verfahren sind im Stand der Technik bekannt und werden zum Beispiel in Svab et al. (1990) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:8526-8530 und Svab und Maliga (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:913-917 und im US-Patent 5,693,507 allgemein beschrieben.
  • In Transformationsverfahren können die Tocopherolcyclasekonstrukte der vorliegenden Erfindung mit zusätzlichen Konstrukten verwendet werden, die für die Expression von anderen Nukleinsäuresequenzen sorgen, die für Proteine kodieren, die an der Bildung von Tocopherolen oder Tocopherol-Vorläufern wie beispielsweise Homogentisinsäure und/oder Phytylpyrophosphat beteiligt sind. Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, die an der Bildung von Homogentisinsäure beteiligt sind, sind im Stand der Technik bekannt und schließen 4-Hydroxy phenylpyruvatdioxygenase (HPPD, EC 1.13.11.27), die zum Beispiel von Garcia et al. ((1999) Plant Physiol. 119(4):1507-1516) beschrieben wurde, mono- oder bifunktionales tyrA (zum Beispiel beschrieben von Xia et al. (1992) J. Gen Microbiol. 138:1309-1316 und Hudson et al. (1984) J. Mol. Biol. 180:1023-1051), Oxygenase, 4-Hydroxyphenylpyruvatdi-(9CI), 4-Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase; p-Hydroxyphenylpyruvatdioxygenase; p-Hydroxyphenylpyruvathydroxylase; p-Hydroxyphenylpyruvatoxidase; p-Hydroxyphenylbrenztraubensäurehydroxylase; p-Hydroxyphenylbrenztraubenhydroxylase; p-Hydroxyphenylbrenztraubenoxydase, 4-Hydroxyphenylacetat, NAD(P)H:Sauerstoffoxidoreduktase (1-hydroxylierend); 4-Hydroxyphenylacetat-1-monooxygenase und dergleichen ein, sind aber nicht auf sie beschränkt. Zusätzlich können auch Konstrukte für die Expression von Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, die an der Bildung von Phytylpyrophosphat beteiligt sind, mit den Tocopherolcyclasekonstrukten der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Nukleinsäuresequenzen, die für Proteine kodieren, die an der Bildung von Phytylpyrophosphat beteiligt sind, sind im Stand der Technik bekannt und schließen die Geranylgeranylpyrophosphat-Synthase (GGPPS), Geranylgeranylpyrophosphat-Reduktase (GGH), 1-Deoxyxylulose-5-phosphat-Synthase, 1-Deoxy-D-xylolose-5-phosphat-Reduktoisomerase, 4-Diphosphocytidyl-2-C-methylerythritol-Synthase, Isopentylpyrophosphatisomerase ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
  • Die Tocopherolcyclasesequenzen der vorliegenden Erfindung finden bei der Herstellung von Transformationskonstrukten Verwendung, die eine zweite Expressionskassette für die Expression von zusätzlichen Sequenzen aufweisen, die an der Tocopherolbiosynthese beteiligt sind. Zusätzliche Tocopherol-Biosynthesesequenzen von Interesse in der vorliegenden Erfindung schließen die gamma-Tocopherolmethyltransferase (Shintani, et al. (1998) Science 282(5396):2098-2100), Tocopherolcy clase und Tocopherolmethyltransferase ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
  • Eine Pflanzenzelle, ein Gewebe, ein Organ oder eine Pflanze, in die/das die rekombinanten DNA-Konstrukte, welche die Expressionskonstrukte enthalten, eingebracht wurden, wird als transformiert, transfiziert oder transgen angesehen. Eine transgene oder transformierte Zelle oder Pflanze schließt ebenfalls Nachkommen von der Zelle oder Pflanze und die Nachkommen ein, die von einem Zuchtprogramm gebildet werden, das eine derartige transgene Pflanze als einen Elter in einer Kreuzung einsetzt, und das einen veränderten Phänotyp aufweist, der aus der Gegenwart einer Tocopherolcyclase-Nukleinsäuresequenz resultiert.
  • Pflanzenexpressions- oder -transkriptionskonstrukte, die eine Tocopherolcyclase als DNA-Sequenz von Interesse für deren gesteigerte oder verminderte Expression aufweisen, können mit einer großen Vielfalt an pflanzlichem Leben genutzt werden, insbesondere mit der Pflanzenwelt, die an der Bildung von Pflanzenölen für Speise- und industrielle Verwendungen beteiligt ist. Besonders bevorzugte Pflanzen für eine Verwendung in den Verfahren der vorliegenden Erfindung schließen Acacia, Alfalfa, Aneth, Apfel, Aprikose, Artischocke, Rukola, Spargel, Avocado, Banane, Gerste, Bohnen, Rübe, Brombeere, Blaubeere, Brokkoli, Rosenkohl, Kohl, Raps, Melone, Karotte, Maniok, Blumenkohl, Sellerie, Kirsche, Chicorée, Koriander, Zitrone, Klementinen, Kaffee, Mais, Baumwolle, Gurke, Douglasie, Aubergine, Endivie, Winterendivie, Eukalyptus, Fenchel, Feigen, Knoblauch, Kürbis, Traube, Pampelmuse, Honigmelone („honey dew"), Jicama, Kiwi, Blattsalat, Lauch, Zitrone, Limette, Loblolly-Kiefer, Mango, Melone, Pilz, Nektarine, Nuß, Hafer, Ölpalme, Ölsamenraps, Okra, Zwiebel, Orange, eine Zierpflanze, Papaya, Petersilie, Erbse, Pfirsich, Erdnuß, Birne, Pfeffer, Dattelpflaume („persimmon"), Kiefer, Ananas, Wegerich, Pflaume, Gra natapfel, Pappel, Kartoffel, Kürbis, Quitte, Radiatakiefer, Radicchio, Rettich, Himbeere, Reis, Roggen, Hirse, Southern-Kiefer, Sojabohne, Spinat, Kürbispflanze, Erdbeere, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Sonnenblume, Süßkartoffel, Amberbaum, Mandarine, Teepflanze, Tabak, Tomate, Triticale, Rasen, Steckrübe, eine Weinpflanze, Wassermelone, Weizen, Yamswurzel, und Zucchini ein, sind aber nicht auf diese beschränkt.
  • Ganz besonders bevorzugt sind in gemäßigten Klimazonen beheimatete Ölsamensaaten. In gemäßigten Klimazonen beheimatete Ölsamensaaten von Interesse schließen Rapssamen (Raps und Hoch-Erucasäure („High Erucic Acid")-Arten), Sonnenblume, Färberdistel, Baumwolle, Sojabohne, Erdnuß, Kokosnuß und Ölpalmen und Mais ein, sind aber nicht auf diese beschränkt. Abhängig von dem Verfahren zum Einbringen der rekombinanten Konstrukte in die Wirtszelle können andere DNA-Sequenzen erforderlich sein. Es ist wichtig anzumerken, daß diese Erfindung gleichermaßen auf Dikotyledonen- und Monokotyledonenarten anwendbar ist und leicht auf neue und/oder verbesserte Transformations- und Regulationstechniken angewendet werden kann.
  • Von besonderem Interesse ist die Verwendung von Tocopherolcyclasekonstrukten in Pflanzen, um Pflanzen oder Pflanzenteile zu bilden, einschließlich, aber nicht beschränkt auf Blätter, Stengel, Wurzeln, reproduzierende Teile und Samen, mit einem modifizierten Gehalt an Tocopherolen in den Pflanzenteilen, welche die transformierten Pflanzenzellen aufweisen.
  • Für ein immunologisches Screening können Antikörper gegen das Protein durch Injektion eines gereinigten Proteins oder Teils davon in Kaninchen oder Mäuse hergestellt werden, wobei solche Verfahren zur Herstellung von Antikörpern dem Fachmann gut bekannt sind. Es können entweder monoklonale oder polyklonale Antikörper produziert werden, obwohl normalerweise poly klonale Antikörper für die Genisolierung nützlicher sind. Western-Analysen können durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob ein verwandtes Protein in einem Rohextrakt der gewünschten Pflanzenart vorhanden ist, wobei die Bestimmung durch Kreuzreaktion mit den Antikörpern gegen das kodierte Protein erfolgt. Wenn eine Kreuzreaktivität beobachtet wird, werden die Gene, die für die verwandten Proteine kodieren, durch Durchmustern von Expressionsbibliotheken, welche die gewünschten Pflanzenarten repräsentieren, isoliert. Expressionsbibliotheken können in einer Vielzahl von kommerziell verfügbaren Vektoren konstruiert werden, einschließlich Lambda gt11, wie in Sambrook, et al. (Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Zweite Auflage (1989) Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, New York) beschrieben.
  • Um die Aktivität und Spezifität der Proteine, die von den identifizierten Nukleinsäuresequenzen kodiert werden, als Tocopherolcyclaseenzyme zu bestätigen, werden in vitro-Assays in Insektenzellenkulturen durchgeführt, wobei Baculovirus-Expressionssysteme verwendet werden. Solche Baculovirus-Expressionssysteme sind im Stand der Technik bekannt und werden von Lee et al., US-Patent 5,348,886 beschrieben, das hier in seiner Gesamtheit durch Bezugnahme aufgenommen wird.
  • Zusätzlich können andere Expressionskonstrukte hergestellt werden, um Proteinaktivitäten zu untersuchen, wobei verschiedene Expressionssysteme verwendet werden. Solche Expressionskonstrukte werden in Hefe oder prokaryontische Wirte transformiert und auf Tocopherolcyclaseaktivität untersucht. Solche Expressionssysteme sind im Stand der Technik bekannt und aus kommerziellen Quellen verfügbar.
  • Zusätzlich zu den in der vorliegenden Erfindung beschriebenen Sequenzen können DNA-kodierende Sequenzen, die in der vorliegenden Erfindung verwendbar sind, aus Algen, Pilzen, Bakte rien, Säugetierquellen, Pflanzen etc. stammen. Homologiesuchen in vorliegenden Datenbanken unter Verwendung von Signatursequenzen, die konservierten Nukleotid- und Aminosäuresequenzen der Tocopherolcyclase entsprechen, können eingesetzt werden, um äquivalente, verwandte Gene aus anderen Quellen, wie beispielsweise Pflanzen und Mikroorganismen, zu isolieren. Ferner können Suchen in EST-Datenbanken durchgeführt werden. Weiterhin wird die Verwendung von DNA-Sequenzen, die für Enzyme kodieren, die zu den hier offenbarten funktionell enzymatisch äquivalent sind, in der vorliegenden Erfindung ebenfalls in Betracht gezogen, wobei solche DNA-Sequenzen degenerierte Äquivalente der hier offenbarten Nukleinsäuresequenzen in Übereinstimmung mit der Degeneriertheit des genetischen Codes sind. Ein Nachweis der Funktionalität der kodierenden Sequenzen, die durch eines dieser Verfahren identifiziert wurden, kann durch Komplementation von Mutanten geeigneter Organismen, wie beispielsweise Synechocystis, Shewanella, Hefe, Pseudomonas, Rhodobacteria, etc., denen spezifische biochemische Reaktionen fehlen, oder die mutiert wurden sind, durchgeführt werden. Die Sequenzen der DNA-kodierenden Bereiche kann durch Gen-Resynthese auf Grundlage des Codon-Usage für eine maximale Expression in bestimmten Wirten optimiert werden.
  • Für die Veränderung der Tocopherolbildung in einer Wirtszelle kann ein zweites Expressionskonstrukt in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung verwendet werden. Zum Beispiel kann das Prenyltransferase- oder Tocopherolcyclase-Expressionskonstrukt in Verbindung mit einem zweiten Expressionskonstrukt, das eine Nukleotidsequenz für ein Protein, das bei der Tocopherolbiosynthese beteiligt ist, aufweist, in eine Wirtszelle eingebracht werden.
  • Das Verfahren der Transformation beim Erlangen solcher transgener Pflanzen ist für die vorliegende Erfindung nicht entscheidend und verschiedene Verfahren der Pflanzentransfor mation sind derzeit verfügbar. Des Weiteren können neuere Verfahren, die für die Transformation von Saaten verfügbar werden, hier auch direkt hierunter angewendet werden. Beispielsweise könnten viele Pflanzenarten, die für Agrobacterium-Infektionen natürlicherweise empfänglich sind, erfolgreich über dreiteilige („tripartite") oder binäre Vektorverfahren der Agrobacterium-vermittelten Transformation transformiert werden. In vielen Fällen wird es wünschenswert sein, daß das Konstrukt auf einer oder beiden Seiten von T-DNA begrenzt wird, insbesondere die linken und rechten Grenzen, und vor allem die rechte Grenze. Dies ist besonders nützlich, wenn das Konstrukt A. tumefaciens oder A. rhizogenes als Mittel für die Transformation verwendet, obwohl die T-DNA-Grenzen auch bei anderen Arten der Transformation Verwendung finden können. Zusätzlich sind Techniken der Mikroinjektion, des DNA-Partikelbombardements und der Elektroporation entwickelt worden, welche die Transformation verschiedener monokotylen und dikotylen Pflanzenarten erlauben.
  • Normalerweise wird das DNA-Konstrukt ein strukturelles Gen einschließen, das die notwendigen regulatorischen Bereiche für die Expression in einem Wirt enthält und die Selektion der transformierten Zellen ermöglicht. Das Gen kann für eine Resistenz gegen ein zytotoxisches Agens, zum Beispiel ein Antibiotikum, Schwermetall, Toxin, etc., eine Komplementierung, die einem auxotrophen Wirt eine Phototrophie verleiht, eine virale Immunität oder dergleichen sorgen. Abhängig von der Anzahl von verschiedenen Wirtsarten, in die das Expressionskonstrukt oder deren Komponenten eingebracht werden, können ein oder mehrere Marker verwendet werden, wobei verschiedene Bedingungen für Selektion für die verschiedenen Wirte verwendet werden.
  • Wo Agrobacterium für die Pflanzenzelltransformation verwendet wird, kann ein Vektor verwendet werden, der in den Agrobacterium-Wirt für homologe Rekombination mit T-DNA oder dem Ti- oder Ri-Plasmid, das im Agrobacterium-Wirt vorliegt, eingebracht wird. Das Ti- oder Ri-Plasmid, das die T-DNA für die Rekombination enthält, kann bewaffnet („armed", d.h. befähigt, eine Gallenbildung zu verursachen) oder unbewaffnet („disarmed", d.h. nicht befähigt, eine Gallenbildung zu verursachen) sein, wobei letzteres zulässig ist, solange die vir-Gene in dem transformierten Agrobacterium-Wirt vorhanden sind. Das bewaffnete Plasmid kann eine Mischung aus normalen Pflanzenzellen und Gallenzellen erzeugen.
  • In einigen Fällen, in denen Agrobacterium als Vehikel für die Transformation der Wirtspflanzenzellen verwendet wird, wird das Expressions- oder Transkriptionskonstrukt, das durch den/die T-DNA-Grenzbereich(e) begrenzt wird, in einen Vektor mit breitem Wirtsbereich, der zur Replikation in E. coli und Agrobacterium fähig ist, wobei diese Vektoren mit breitem Wirtsbereich in der Literatur beschrieben sind. Normalerweise werden pRK2 oder dessen Derivate verwendet. Siehe zum Beispiel Ditta, et al., (Proc. Nat. Acad. Sci., USA (1980) 77:7347-7351) und EPA 0 120 515 , die durch Bezugnahme hierin aufgenommen werden. Alternativ kann man die Sequenzen, die in Pflanzenzellen exprimiert werden sollen, in einen Vektor einbringen, der getrennte Replikationssequenzen enthält, von denen eine den Vektor in E. coli, und die andere ihn in Agrobacterium stabilisiert. Siehe beispielsweise McBride, et al., (Plant Mol. Biol. (1990) 14:269-276), wo der pRiHRI-(Jouanin et al., Mol. Gen. Genet. (1985) 201:370-374) Replikationsorigin verwendet wird und zu einer zusätzlichen Stabilität des Pflanzenexpressionsvektors in den Wirts-Agrobacterium-Zellen führt.
  • In das Expressionskonstrukt und die T-DNA können ein oder mehrere Marker eingeschlossen sein, welche die Selektion des transformierten Agrobacteriums und der transformierten Pflanzenzellen erlauben. Eine Anzahl von Markern ist für die Verwendung mit Pflanzenzellen entwickelt worden, wie zum Beispiel eine Resistenz gegen Chloramphenicol, Kanamycin, das Aminoglykosid G418, Hygromycin oder dergleichen. Der bestimmte eingesetzte Marker ist für die Erfindung nicht wesentlich, wobei der eine oder anderer Marker in Abhängigkeit von dem jeweiligen Wirt und der Art der Konstruktion bevorzugt sein kann.
  • Für die Transformation von Pflanzenzellen durch Verwendung von Agrobacterium können Explantate vereint und während einer ausreichenden Zeit für die Transformation mit dem transformierten Agrobacterium inkubiert, die Bakterien getötet, und die Pflanzenzellen in einem geeigneten Selektionsmedium kultiviert werden. Sobald sich ein Kallus bildet, kann die Triebbildung unterstützt werden, indem geeignete Pflanzenhormone in Übereinstimmung mit bekannten Verfahren eingesetzt werden und die Triebe zur Regenerierung der Pflanzen in ein Medium zur Wurzelbildung überführt werden. Die Pflanzen können dann bis zur Samenbildung angezogen und der Samen verwendet werden, um sich wiederholende Generationen herzustellen und um pflanzliche Öle zu isolieren.
  • Es gibt verschiedene mögliche Wege, um die Pflanzenzellen der vorliegenden Erfindung zu erhalten, die multiple Expressionskonstrukte enthalten. Jedes Mittel zur Herstellung einer Pflanze, die ein Konstrukt umfaßt, das eine DNA-Sequenz, die für ein Expressionskonstrukt der vorliegenden Erfindung kodiert, und mindestens ein weiteres Konstrukt aufweist, das eine andere DNA-Sequenz enthält, die für ein Enzym kodiert, werden von der vorliegenden Erfindung umfaßt. Beispielsweise kann das Expressionskonstrukt verwendet werden, um eine Pflanze gleichzeitig mit dem zweiten Konstrukt zu transformieren, entweder durch Einschluß beider Expressionskonstrukte in einen einzigen Transformationsvektor oder durch Verwendung getrennter Vektoren, von denen jeder einzelne gewünschte Gene exprimiert. Das zweite Konstrukt kann in eine Pflanze eingebracht werden, die bereits mit dem Prenyltransferase- oder Tocophe rolcyclase-Expressionskonstrukt transformiert wurde, oder alternativ können transformierte Pflanzen, von denen eine das Prenyltransferase- oder Tocopherolcyclase-Expressionskonstrukt exprimiert und die andere das zweite Konstrukt exprimiert, gekreuzt werden, um die Konstrukte in derselben Pflanze zusammen zu bringen.
  • Erfindungsgemäße transgene Pflanzen können aus Gewebekultur hergestellt und nachfolgende Generationen aus Saatgut angezogen werden. Alternativ können transgene Pflanzen unter Verwendung der Apomixis angezogen werden. Die Apomixis ist ein genetisch kontrolliertes Reproduktionsverfahren in Pflanzen, bei dem der Embryo ohne Vereinigung eines Eis und eines Spermiums gebildet wird. Es gibt drei grundlegende Formen der apomiktischen Reproduktion: 1) Aposporie, bei der sich der Embryo aus einem chromosomal nicht verminderten Ei in einem Embryosack, der aus dem Kern abgeleitet ist, entwickelt, 2) Diplosporie, bei der sich der Embryo aus einem nicht verminderten Ei in einem Embryosack entwickelt, der von der Megasporenmutterzelle stammt, und 3) Adventiv-Embryonie, bei der sich der Embryo direkt aus einer somatischen Zelle entwickelt. In den meisten Formen der Apomixis ist Pseudogamie oder eine Befruchtung des polaren Kerns zur Bildung von Endosperm für das Überleben des Samens erforderlich. Bei der Aposporie kann ein „nurse"-Kultivar als eine Pollenquelle für die Endospermbildung in Samen verwendet werden. Das „nurse"-Kultivar beeinflußt die Genetik des aposporiden, apomiktischen Kultivars nicht, da sich das chromosomal nicht verringerte Ei des Kultivars parthenogenetisch entwickelt, es macht jedoch eine Endospermbildung möglich. Die Apomixis ist wirtschaftlich bedeutsam, insbesondere bei transgenen Pflanzen, da sie jeden Genotyp, unabhängig davon, wie heterozygot er ist, dazu veranlaßt, sich reinrassig fortzupflanzen. Daher können mit apomiktischer Reproduktion heterozygotische transgene Pflanzen ihre genetische Genauigkeit („fidelity") über wiederholte Lebenszyklen hinweg erhal ten. Verfahren für die Herstellung apomiktischer Pflanzen sind im Fachgebiet bekannt. Siehe U.S.-Patent 5,811,636 .
  • Wirtszellen der vorliegenden Erfindung schließen vorzugsweise monokotyledone und dikotyledone Pflanzenzellen ein.
  • Im Allgemeinen wird der Fachmann mit Standardquellenmaterialien vertraut sein, die spezifische Bedingungen und Prozeduren für die Konstruktion, Manipulation und Isolation von Makromolekülen (zum Beispiel DNA-Moleküle, Plasmide, etc.), die Herstellung von rekombinanten Organismen und das Durchmustern und die Isolierung von Klonen beschreiben (siehe zum Beispiel Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press (1989); Maliga et al., Methods in Plant Molecular Biology, Cold Spring Harbor Press (1995); Birren et al., Genome Analysis: Analyzing DNA, 1, Cold Spring Harbor, New York).
  • Die Erfindung schließt ferner Pflanzen und Pflanzenteile, wie beispielsweise Saat, Öl und Mahlzeiten, die aus der Saat erhalten werden, und Futter- und Nahrungsmittelprodukte ein, die aus Pflanzen hergestellt werden, in denen Tocopherole angereichert sind. Von besonderem Interesse ist Öl aus der Saat, das aus transgenen Pflanzen erhalten wurde, in denen der Tocopherolgehalt verglichen mit Öl aus der Saat einer nicht-transformierten Pflanze erhöht wurde.
  • Das geerntete Pflanzenmaterial kann einer zusätzlichen Verarbeitung unterzogen werden, um den Tocopherolgehalt weiter anzureichern. Der Fachmann wird erkennen, daß es viele solcher Prozesse oder Verfahren zum Veredeln, Bleichen und Degummieren von Öl gibt. Das US-Patent 5,932,261 , erteilt am 3. August 1999, offenbart ein derartiges Verfahren für die Herstellung eines natürlichen, Carotin-reichen, raffinierten und deodorierten Öls, bei dem das Öl einem Druck von weniger als 0,060 mbar und einer Temperatur von weniger als 200 Grad Celsius ausgesetzt wird. Das Öl, das durch dieses Verfahren destilliert wird, weißt verringerte freie Fettsäuren auf, und ergibt ein raffiniertes, deodoriertes Öl, bei dem das Vitamin E, das in dem zugeführtem Öl enthalten ist, in dem verarbeiteten Öl im wesentlichen erhalten bleibt. Die Lehren dieses Patents werden durch Bezugnahme hierin aufgenommen.
  • Die Erfindung, die nun allgemein beschrieben wurde, wird durch Bezugnahme auf die folgenden Beispiele verständlicher, die nur zum Zweck der Veranschaulichung aufgenommen wurden, und nicht dazu gedacht sind, die vorliegende Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.
  • BEISPIELE
  • Beispiel 1: Identifizierung von Prenyltransferase- und Tocopherolcyclasesequenzen
  • PSI-BLAST-(Altschul, et al. (1997) Nuc Acid Res 25:3389-3402) Profile wurden sowohl für die Prenyltransferaseklassen mit geradliniger Kette als auch für die Klassen aromatischer Prenyltransferasen erzeugt. Um die Profile für geradlinige Ketten zu erzeugen, wurde als Suchanfrage eine Prenyltransferase aus Porphyra purpurea (Genbank-Zugangscode 1709766) in der NCBI nicht-redundanten Proteindatenbank verwendet. Das an der Bildung von Ubichinon beteiligte Enzym ubiA aus E. coli (Genbank-Zugangscode 1790473) wurde als Ausgangssequenz verwendet, um das Profil der aromatischen Prenyltransferase zu erzeugen. Diese Profile wurden verwendet, um öffentliche und urheberrechtlich geschützte DNA- und Proteindatenbanken zu durchsuchen. In Arabidopsis wurden sieben mögliche Prenyltransferasen aus der Klasse mit geradlinigen Ketten identifiziert, ATPT1 (SEQ ID NO: 9); ATPT7 (SEQ ID NO: 10), ATPT8 (SEQ ID NO:11); ATPT9 (SEQ ID NO: 13), ATPT10 (SEQ ID NO: 14); ATPT11 (SEQ ID NO: 15), und sechs aus der aromatischen Klasse wurden identifiziert, ATPT2 (SEQ ID NO: 1), ATPT3 (SEQ ID NO: 3), ATPT4 (SEQ ID NO: 5), ATPT5 (SEQ ID NO: 7), ATPT6 (SEQ ID NO: 8) und ATPT12 (SEQ ID NO: 16). Zusätzliche Prenyltransferasesequenzen aus anderen Pflanzen, die mit der aromatischen Klasse der Prenyltransferasen verwandt sind, zum Beispiel aus Soja (SEQ ID NOs: 19-23, die abgeleitete Aminosäuresequenz der SEQ ID NO: 23 wird als SEQ ID NO: 24 zur Verfügung gestellt) und Mais (SEQ ID NOs: 25-29 und 31) wurden ebenfalls identifiziert. Die abgeleitete Aminosäuresequenz von ZMPT5 (SEQ ID NO: 29) wird als SEQ ID NO: 30 zur Verfügung gestellt.
  • Die Abfragen wurden auf einem Silicon Graphics Unix-Computer unter Verwendung zusätzlicher „Bioaccellerator"-Hardware und GenWeb-Software durchgeführt, die von Compugen Ltd. geliefert wurde. Diese Software und Hardware ermöglicht die Verwendung des Smith-Waterman-Algorithmus für die Suche in DNA- und Proteindatenbanken bei Verwendung von Profilen als Suchanfragen. Das zur Abfrage von Proteindatenbanken verwendete Programm ist "profilesearch". Dies ist eine Suche, bei der die Suchanfrage nicht eine einzelne Sequenz, sondern ein Profil ist, das auf einem multiplen Abgleich von Aminosäure- oder Nukleinsäuresequenzen basiert. Das Profil wird verwendet, um einen Sequenzdatensatz, d.h. eine Sequenzdatenbank, abzufragen. Das Profil enthält die gesamte relevante Information, um jede Position in einer Sequenz zu bewerten, was eigentlich zu einem Ersetzen der für die Standardabfragesuchen verwendeten "Scoring Matrix" führt. Das zur Abfrage von Nukleotiddatenbanken verwendete Programm ist "tprofilesearch". „Tprofilesearch" durchsucht Nukleinsäuredatenbanken unter Verwendung einer Aminosäureprofil-Suchabfrage. Während die Suche läuft, werden die Sequenzen in der Datenbank in sechs Leserrahmen in Aminosäuresequenzen übersetzt. Die Ausgabedatei von „tprofilesearch" ist identisch mit der Ausgabedatei von „profilesearch" mit Ausnah me einer zusätzlichen Spalte, die den Leserahmen angibt, in dem der beste Abgleich stattfindet.
  • Der Smith-Waterman-Algorithmus (Smith und Waterman (1981) loc. cit.) wird verwendet, um nach Ähnlichkeiten zwischen einer Sequenz der Suchanfrage und einer Gruppe von Sequenzen zu suchen, die in der Datenbank enthalten sind. „E-Score"-Werte ebenso wie andere Sequenzinformationen, wie beispielsweise konservierte Peptidsequenzen, werden verwendet, um verwandte Sequenzen zu identifizieren.
  • Um den gesamten kodierenden Bereich zu erhalten, die den Prenyltransferasesequenzen aus Arabidopsis entspricht, zu erhalten, werden synthetische Oligonukleotidprimer entworfen, um die 5'- und 3'-Enden der partiellen cDNA-Klone, welche Prenyltransferasesequenzen enthalten, zu amplifizieren. Die Primer werden gemäß den entsprechenden Arabidopsis-Prenyltransferasesequenzen entworfen und in "Rapid Amplification of cDNA Ends" (RACE)-Reaktionen (Frohman et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:8998-9002) unter Einsatz des Marathon-cDNA-Amplifikationskit (Clontech Laboratories Inc., Palo Alto, CA) verwendet.
  • Aminosäuresequenzabgleiche zwischen ATPT2 (SEQ ID NO: 2), ATPT3 (SEQ ID NO: 4), ATPT4 (SEQ ID NO: 6), ATPT8 (SEQ ID NO: 12) und ATPT12 (SEQ ID NO: 17) werden mit Hilfe von ClustalW (1) durchgeführt, und die Prozentidentitäten und Ähnlichkeiten werden unten in Tabelle 1 gezeigt. Tabelle 1
    ATPT2 ATPT3 ATPT4 ATPT8 ATPT12
    ATPT2 % Identität 12 13 11 15
    % ähnlich 25 25 22 32
    % Lücke 17 20 20 9
    ATPT3 % Identität 12 6 22
    % ähnlich 29 16 38
    % Lücke 20 24 14
    ATPT4 % Identität 9 14
    % ähnlich 18 29
    % Lücke 26 19
    ATPT8 % Identität 7
    % ähnlich 19
    % Lücke 20
    ATPT12 % Identität
    % ähnlich
    % Lücke
  • Vergleichsbeispiel 2: Herstellung von Prenyltransferase-Expressionskonstrukten
  • Ein Plasmid, das die aus pCGN3223 (im US-Patent 5,639,790 beschrieben, das in seiner Gesamtheit hier durch Bezugnahme aufgenommen wird) abgeleitete Napinkassette enthält, wurde modifiziert, um es für die Klonierung großer DNA-Fragmente, die multiple Restriktionsstellen enthalten, verwendbarer zu machen und um die Klonierung von multiplen Napinfusionsgenen in binäre Pflanzen-Transformationsvektoren zu erlauben. Ein das sich selbst anlagernde („self annealed") Oligonukleotid der Sequenz CGCGATTTAAATGGCGCGCCCTGCAGGCGGCCGCCTGCAGGGCGCGCCATTTAAAT (SEQ ID NO: 40) beinhaltender Adapter wurde in den Klonierungsvektor pBC SK+ (Stratagene) nach Verdau mit der Restriktionsendonuklease BssHII ligiert, um den Vektor pCGN7765 zu konstruieren. Die Plasmide pCGN3223 und pCGN7765 wurden mit NotI verdaut und miteinander ligiert. Der entstehende Vektor pCGN7770 enthält das pCGN7765-Rückgrat mit der Napin-Samenspezifischen Expressionskassette aus pCGN3223.
  • Die Klonierungskassette pCGN7787, (mit) im Wesentlichen den gleichen Regulierungselementen wie pCGN7770, mit Ausnahme der Napin-regulatorischen Bereiche von pCGN7770, wurde mit dem doppelten CAMV 35S-Promotor und dem tml-Polyadenylierungs- und transkriptionalen Terminationsbereich ersetzt.
  • pCGN5139, ein binärer Vektor für die Pflanzentransformation, wurde aus pCGN1558 (McBride und Summerfeld, (1990) Plant Molecular Biology, 14:269-276) gebildet. Der Polylinker von pCGN1558 wurde als ein HindIII/Asp718-Fragment durch einen Polylinker ersetzt, der die einzigartigen Restriktionsendonukleasestellen, AscI, PacI, XbaI, SwaI, BamHI, und NotI, enthält. Die Asp718- und HindIII-Restriktionsendonukleasestellen bleiben in pCGN5139 erhalten.
  • Eine Reihe von turbobinären Vektoren wurde konstruiert, um das schnelle Klonieren von DNA-Sequenzen in binäre Vektoren, die transkriptionelle Initiationsbereiche (Promotoren) und transkriptionelle Terminationsbereiche enthalten, zu ermöglichen.
  • Das Plasmid pCGN8618 wurde durch Ligieren der Oligonukleotide 5'-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3' (SEQ ID NO: 41) und 5'-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3' (SEQ ID NO: 42) in SalI/XhoI-verdautes pCGN7770 gebildet. Ein Fragment, das den Napin-Promotor, Polylinker und den Napin-3'-Bereich enthält, wurde durch Verdau mit Asp718I aus pCGN8618 herausgeschnitten; das Fragment wurde durch Auffüllen der 5'-Überhänge mit Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen („blunt ended") und dann in pCGN5139 ligiert, das mit Asp718I und HindIII verdaut und durch Auffüllen der 5'-Überhänge mit Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen wurde. Ein Plasmid, welches das Insert so orientiert enthält, daß der Napin-Promotor der stumpfen („blunted") Asp718I-Stelle des pCGN5139 am nächsten lag und das Napin-3' der stumpfen HindIII-Stelle am nächsten gelegen war, wurde einer Sequenzanalyse unterzogen, um sowohl die Insert-Orientierung als auch die Vollständigkeit der Klo nierungsstellen zu bestätigen. Das entstandene Plasmid wurde als pCGN8622 bezeichnet.
  • Das Plasmid pCGN8619 wurde durch Ligieren der Oligonukleotide 5'-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3' (SEQ ID NO: 43) und 5'-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3' (SEQ ID NO: 44) in SalI/XhoI-verdautes pCGN7770 gebildet. Ein Fragment, das den Napin-Promotor, Polylinker und den Napin-3'-Bereich enthält, wurde durch Verdau mit Asp718I aus pCGN6819 entfernt; das Fragment wurde durch Auffüllen der 5'-Überhänge mit Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen und dann in pCGN5139 ligiert, das mit Asp718I und HindIII verdaut und durch Auffüllen der 5'-Überhänge mit Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen wurde. Ein Plasmid, welches das Insert so orientiert enthält, daß der Napin-Promotor der stumpfen Asp718I-Stelle des pCGN5139 am nächsten lag und das Napin-3' der stumpfen HindI-II-Stelle am nächsten gelegen war, wurde einer Sequenzanalyse unterzogen, um sowohl die Insert-Orientierung als auch die Vollständigkeit der Klonierungsstellen zu bestätigen. Das entstandene Plasmid wurde als pCGN8623 bezeichnet.
  • Das Plasmid pCGN8620 wurde durch Ligieren der Oligonukleotide 5'-TCGAGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGGAGCT-3' (SEQ ID NO: 45) und 5'-CCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCC-3' (SEQ ID NO: 46) in SalI/SacI-verdautes pCGN7787 gebildet. Ein Fragment, das den d35S-Promotor, Polylinker und den tml 3'-Bereich enthält, wurde durch vollständigen Verdau mit Aps718I und partiellen Verdau mit NotI aus pCGN8620 entfernt. Das Fragment wurde durch Auffüllen der 5'-Überhänge mit Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen und dann in pCGN5139 ligiert, das mit Asp718I und HindIII verdaut und durch Auffüllen der 5'-Überhänge mit Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen wurde. Ein Plasmid, welches das Insert so orientiert enthält, daß der d35S-Promotor der stumpfen Asp718I-Stelle des pCGN5139 am nächsten lag und das tml-3' der stumpfen HindIII-Stelle am nächsten ge legen war, wurde einer Sequenzanalyse unterzogen, um sowohl die Insert-Orientierung als auch die Vollständigkeit der Klonierungsstellen zu bestätigen. Das entstandene Plasmid wurde als pCGN8624 bezeichnet.
  • Das Plasmid pCGN8621 wurde durch Ligieren der Oligonukleotide 5'-TCGACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCCAGCT-3' (SEQ ID NO: 47) und 5'-GGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGG-3' (SEQ ID NO: 48) in SalI/SacI-verdautes pCGN7787 gebildet. Ein Fragment, das den d35S-Promotor, Polylinker und den tml 3'-Bereich enthält, wurde durch vollständigen Verdau mit Asp718I und partiellen Verdau mit NotI aus pCGN8621 entfernt. Das Fragment wurde durch Auffüllen der 5'-Überhänge mit Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen und dann in pCGN5139 ligiert, das mit Asp718I und HindIII verdaut und durch Auffüllen der 5'-Überhänge mit Klenow-Fragment mit stumpfen Enden versehen wurde. Ein Plasmid, welches das Insert so orientiert enthält, daß der d35S-Promotor der stumpfen Asp718I-Stelle des pCGN5139 am nächsten lag und das tml-3' der stumpfen HindIII-Stelle am nächsten gelegen war, wurde einer Sequenzanalyse unterzogen, um sowohl die Insert-Orientierung als auch die Vollständigkeit der Klonierungsstellen zu bestätigen. Das entstandene Plasmid wurde als pCGN8625 bezeichnet.
  • Das Plasmidkonstrukt pCGN8640 ist eine Modifikation des oben beschriebenen pCGN8624. Ein 938 Bp-PstI-Fragment, das aus dem Transposon Tn7 isoliert wurde, welches für bakterielle Spectinomycin- und Streptomycinresistenz kodiert (Fling et al. (1985), Nucleic Acids Research 13(19):7095-7106), einem bestimmenden Faktor für E. coli- und Agrobacterium-Selektion, wurde durch Pfu-Polymerase mit stumpfen Enden versehen. Das mit stumpfen Enden versehene Fragment wurde in pCGN8624 ligiert, das mit SpeI verdaut und durch Pfu-Polymerase mit stumpfen Enden versehen wurde. Der Bereich, der das PstI-Fragment enthält, wurde sequenziert, um sowohl die Insert- Orientierung als auch die Vollständigkeit der Klonierungsstellen zu bestätigen.
  • Der Spectinomycin-Resistenzmarker wurde wie folgt in pCGN8622 und pCGN8623 eingefügt. Ein 7,7 kBp-AvrII-SnaBI-Fragment aus pCGN8640 wurde an ein 10,9 kBp-pAvrII-SnaBI-Fragment aus pCGN8623 oder pCGN8622 wie oben beschrieben ligiert. Die erhaltenen Plasmide waren pCGN8641 bzw. pCGN8643.
  • Das Plasmid pCGN8644 wurde durch Ligieren der Oligonukleotide 5'-GATCACCTGCAGGAAGCTTGCGGCCGCGGATCCAATGCA-3 (SEQ ID NO: 49) und 5'-TTGGATCCGCGGCCGCAAGCTTCCTGCAGGT-3' (SEQ ID NO: 50) in BamHI-PstI-verdautes pCGN8640 gebildet.
  • Synthetische Oligonukleotide für die Verwendung bei der Polymerasekettenreaktion (PCR) wurden entworfen, um die kodierenden Sequenzen aus ATPT2, ATPT3, ATPT4, ATPT8 und ATPT12 für die Herstellung von Expressionskonstrukten zu amplifizieren, und werden unten in der Tabelle 2 gezeigt. Tabelle 2:
    Figure 00360001
    Figure 00370001
  • Die kodierenden Sequenzen von ATPT2, ATPT3, ATPT4, ATPT8 und ATPT12 wurden alle durch Verwendung der entsprechenden PCR-Primer, die in Tabelle 2 oben gezeigt werden, amplifiziert und in den TopoTA-Vektor (Invitrogen) kloniert. Konstrukte, welche die entsprechenden Prenyltransferasesequenzen enthalten, wurden mit NotI und Sse8387I verdaut und in die turbobinären Vektoren, die oben beschrieben sind, kloniert.
  • Die für ATPT2-Prenyltransferase kodierende Sequenz wurde in der Sense-Orientierung in pCGN8640 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10800 (2) zu bilden. Die ATPT2-Sequenz steht unter der Kontrolle des 35S-Promotors.
  • Die ATPT2-Sequenz wurde auch in antisense-Orientierung in das Konstrukt pCGN8641 kloniert, um pCGN10801 (3) zu bilden. Dieses Konstrukt ermöglicht die antisense-Expression der ATPT2-Sequenz von dem Napin-Promotor.
  • Die für ATPT2-kodierende Sequenz wurde auch in antisense-Orientierung in den Vektor pCGN8643 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10822 zu bilden.
  • Die ATPT2-kodierende Sequenz wurde auch in antisense-Orientierung in den Vektor pCGN8644 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10803 (4) zu bilden.
  • Die ATPT4-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN864 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10806 (5) zu bilden. Die ATPT2-kodierende Sequenz wurde in den Vektor TopoTATM von Invitrogen kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10807 (6) zu bilden. Die ATPT3-kodierende Sequenz wurde in der sense-Orientierung in den TopoTA-Vektor kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10808 (7) zu bilden. Die ATPT3-kodierende Sequenz wurde in der sense-Orientierung in den Vektor pCGN8640 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10809 (8) zu bilden. Die ATPT3-kodierende Sequenz wurde in der antisense-Orientierung in den Vektor pCGN8641 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10810 (9) zu bilden. Die ATPT3-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN8643 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10811 (10) zu bilden. Die ATPT3-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN8640 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10812 (11) zu bilden. Die ATPT4-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN8640 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10813 (12) zu bilden. Die ATPT4-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN8641 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10814 (13) zu bilden. Die ATPT4-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN8643 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10815 (14) zu bilden. Die ATPT4-kodierende Sequenz wurde in der antisense-Orientierung in den Vektor pCGN8644 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10816 (15) zu bilden. Die ATPT8-kodierende Sequenz wurde in der sense-Orientierung in den Vektor pCGN8643 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10819 (17) zu bilden. Die ATPT12-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN8640 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10824 (18) zu bilden. Die ATPT12-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN8643 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10825 (19) zu bilden.
  • Die ATPT8-kodierende Sequenz wurde in den Vektor pCGN8640 kloniert, um das Pflanzentransformationskonstrukt pCGN10826 (20) zu bilden.
  • Vergleichsbeispiel 3: Pflanzentransformation mit Prenyltransferasekonstrukten
  • Transgene Brassica-Pflanzen werden durch Agrobacteriumvermittelte Transformation wie von Radke et al. (Theor. Appl. Genet. (1988) 75:685-694; Plant Cell Reports (1992) 11:499-505) beschrieben erhalten. Transgene Arabidopsis thaliana-Pflanzen können durch Agrobacterium-vermittelte Transformation wie von Valverkens et al. (Proc. Nat. Acad. Sci. (1988) 85:5536-5540) beschrieben oder wie von Bent et al. ((1994), Science 256:1856-1860) oder von Bechthold et al. ((1993), C.R. Acad. Sci, Life Sciences 316:1194-1199) beschrieben erhalten werden. Andere Pflanzenarten können auf ähnliche Weise unter Verwendung verwandter Techniken transformiert werden.
  • Alternativ können Mikroprojektilbombardierungsverfahren, wie sie von Klein et al. (Bio/Technology 10:286-291) beschrieben werden, verwendet werden, um kerntransformierte Pflanzen zu erhalten.
  • Vergleichsbeispiel 4: Identifizierung zusätzlicher Prenyltransferasen
  • Zusätzliche BLAST-Suchen wurden unter Verwendung der ATPT2-Sequenz durchgeführt, einer Sequenz aus der Klasse der aromatischen Prenyltransferasen. ESTs, und in einigen Fällen kodierende Bereiche mit Vollänge, wurden in urheberrechtlich geschützten DNA-Bibliotheken identifiziert.
  • Soja-Homologe des ATPT2 mit Vollänge wurden durch eine Kombination aus BLAST (unter Verwendung der ATPT2-Proteinsequenz) und 5'-RACE identifiziert. Es resultierten zwei Homologe (SEQ ID No:95 und SEQ ID NO:96). Die übersetzten Aminosäuresequenzen werden in SEQ ID NO:97 und in SEQ ID NO:98 bereitgestellt.
  • Ein Rice-EST-ATPT2-Homolog wird als SEQ ID NO:99 gezeigt (aus BLAST unter Verwendung des Weizen-ATPT2-Homologs erhalten).
  • Andere homologe Sequenzen wurden unter Verwendung von ATPT2 und PSI-BLAST erhalten, einschließlich EST-Sequenzen aus Weizen (SEQ ID No:100), Lauch (SEQ ID NOs:101 und 102), Canola (SEQ ID NO:103), Mais (SEQ ID NOs:104, 105 und 106), Baumwolle (SEQ ID NO:107) und Tomate (SEQ ID No:108).
  • Ein unter Verwendung der E. coli ubiA-Sequenz (Genbank-Zugangscodenummer 1790473) erzeugtes PSI-Blastprofil wurde verwendet, um das Synechocystis-Genom zu analysieren. Diese Analyse identifizierte 5 offene Leserahmen (ORFs) in dem Synechocystis-Genom, die potentielle Prenyltransferasen darstellten: slr0926 (als ubiA (4-Hydroxybenzoat-octaprenyltransferase annotiert, SEQ ID NO: 32), sll1899 (als ctaB (Cytochrom c-Oxidase-Faltungsprotein annotiert, SEQ ID NO: 33), slr0056 (als g4 (Chlorophyllsynthase-33 kD Untereinheit annotiert, SEQ ID NO: 34), slr1518 (als menA (Menachinon-Biosyntheseprotein annotiert, SEQ ID NO: 35) und slr1736 (als ein hypothetisches Protein mit unbekannter Funktion annotiert (SEQ ID NO: 36)).
  • 4A. Synechocystis-Knockouts
  • Um die Funktionalität dieser ORFs und ihre Einbindung, soweit vorhanden, in die Biosynthese von Tocopherolen zu untersuchen, wurden Knockout-Konstrukte hergestellt, um den in Synechocystis identifizierten ORF zu unterbrechen.
  • Synthetische Oligos wurden entworfen, um Bereiche der 5'-(5'-TAATGTGTACATTGTCGGCCTC (17365') (SEQ ID NO: 61) und 5'-GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCCACAATTCCCCGCACCTC (1736kanpr1)) (SEQ ID NO: 62) und 3'-(5'-AGGCTAATAAGCACAAATGGGA (17363') (SEQ ID NO: 63) und 5'-GGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGGAATTGGTTTAGGTTATCCC (1736kanpr2)) (SEQ ID NO: 64) Enden des slr1736-ORF zu amplifizieren. Die 1736kanpr1- und 1736kanpr2-Oligos enthielten 20 Basenpaare Homologie zu dem slr1736-ORF mit zusätzlichen 40 Bp Homologie zu den Enden der Kanamycinresistenzkassette. Getrennte PCR-Schritte wurden mit diesen Oligos abgeschlossen und die Produkte wurden Gel-aufgereinigt und mit dem Kanamycinresistenzgen von puc4K (Pharmacia) kombiniert, das mit HincII verdaut und von dem Vektorrückgrat mittels Gelaufreinigung entfernt wurde. Den kombinierten Fragmenten wurde ermöglicht, ohne Oligos unter den folgenden Bedingungen zu assemblieren: 94°C für 1 min, 55°C für 1 min, 72°C für 1 min plus 5 Sekunden pro Zyklus für 40 Zyklen unter Verwendung von pfu-Polymerase in 100 μl-Reaktionsvolumen (Zhao, H. und Arnold (1997) Nucleic Acids Res. 25(6):1307-1308). Ein μl oder fünf μl dieser Assemblierungsreaktion wurden dann unter Verwendung der 5'- und 3'-Oligos ineinander verschachtelt („nested") innerhalb der Enden des ORF-Fragments amplifiziert, so daß das entstehende Produkt 100 bis 200 Bp des 5'-Endes des auszuschaltenden („knocked out") Synechocystis-Gens, die Kanamcynresistenzkassette und 100-200 Bp des 3'-Endes des auszuschaltenden Gens enthielt. Dieses PCR-Produkt wurde dann in den Vektor pGemT easy (Promega) kloniert, um das Konstrukt pMON21681 zu bilden und für die Synechocystis-Transformation zu verwenden.
  • Primer wurden ferner für die Herstellung von Synechocystis Knockout-Konstrukten für die anderen Sequenzen unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie oben beschrieben mit den folgenden Primern synthetisiert. Die ubiA-5'-Sequenz wurde unter Verwendung der Primer 5'-GGATCCATGGT7GCCCAAACCCCATC (SEQ ID NO: 65) und 5'-GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTGGGTAAGCAACAATGACCGGC (SEQ ID NO: 66) amplifiziert. Der 3'-Bereich wurde unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotidprimer 5'-GAATTCTCAAAGCCAGCCCAGTAAC (SEQ ID NO: 67) und 5'-GGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGGGTGCGAAAAGGGTTTTCCC (SEQ ID NO: 68) amplifiziert. Die Amplifikationsprodukte wurden mit dem Kanamycinresistenzgen aus puc4K (Pharmacia), das mit HincII verdaut und von dem Vektorrückgrat weg Gelaufgereinigt wurde, kombiniert. Das angelagerte („annealed") Fragment wurde amplifiziert unter Verwendung der 5'- und 3'-Oligos, die innerhalb der Enden des ORF-Fragments (5'-CCAGTGGTTTAGGCTGTGTGGTC (SEQ ID NO: 69) und 5'-CTGAGTTGGATGTATTGGATC (SEQ ID NO:70)), ineinander verschachtelt waren, so daß das entstehende Produkt 100-200 Bp des 5'-Endes des auszuschaltenden Synechocystis-Gens, die Kanamcynresistenzkassette und 100-200 Bp des 3'-Endes des auszuschaltenden Gens enthielt. Dieses PCR-Produkt wurde dann in den Vektor pGemT easy (Promega) kloniert, um das Konstrukt pMON21682 zu erzeugen, und für die Synechocystis-Transformation verwendet.
  • Primer wurden ferner für die Herstellung von Synechocystis Knockout-Konstrukten für die anderen Sequenzen unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie oben beschrieben mit den folgenden Primern synthetisiert. Die sll1899-5'-Sequenz wurde amplifiziert unter Verwendung der Primer 5'-GGATCCATGGTTACTTCGACAAAAATCC (SEQ ID NO: 71) und 5'-GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTGCTAGGCAACCGCTTAGTAC (SEQ ID NO: 72). Der 3'-Bereich wurde unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotidprimer 5'-GAATTCTTAACCCAACAGTAAAGTTCCC (SEQ ID NO: 73) und 5'-GGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGCCGGCATTGTCTTTTACATG (SEQ ID NO: 74) amplifiziert. Die Amplifikationsprodukte wurden mit dem Kanamycinresistenzgen aus puc4K (Pharmacia), das mit HincII verdaut und von dem Vektorrückgrat weg Gelauf gereinigt wurde, kombiniert. Das angelagerte Fragment wurde amplifiziert unter Verwendung von 5'- und 3'-Oligos, die innerhalb der Enden des ORF-Fragments (5'-GGAACCCTTGCAGCCGCTTC (SEQ ID NO: 75) und 5'-GTATGCCCAACTGGTGCAGAGG (SEQ ID NO: 76)) miteinander verschachtelt waren, so daß das entstehende Produkt 100-200 Bp des 5'-Endes des auszuschaltenden Synechocystis-Gens, die Kanamcynresistenzkassette und 100-200 Bp des 3'-Endes des auszuschaltenden Gens enthielt. Dieses PCR-Produkt wurde dann in den Vektor pGemT easy (Promega) kloniert, um das Konstrukt pMON21679 zu erzeugen, und für die Synechocystis-Transformation verwendet.
  • Primer wurden ferner für die Herstellung von Synechocystis Knockout-Konstrukten für die anderen Sequenzen unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie oben beschrieben mit den folgenden Primern synthetisiert. Die slr0056-5'-Sequenz wurde amplifiziert unter Verwendung der Primer 5'-GGATCCATGTCTGACACACAAAATACCG (SEQ ID NO: 77) und 5'-GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCGCCAATACCAGCCACCAACAG (SEQ ID NO: 78). Der 3'-Bereich wurde unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotidprimer 5'-GAATTCTCAAATCCCCGCATGGCCTAG (SEQ ID NO: 79) und 5'-GGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGGCCTACGGCTTGGACGTGTGGG (SEQ ID NO: 80) amplifiziert. Die Amplifikationsprodukte wurden mit dem Kanamycinresistenzgen aus puc4K (Pharmacia), das mit HincII verdaut und von dem Vektorrückgrat weg Gelaufgereinigt wurde, kombiniert. Das angelagerte Fragment wurde amplifiziert unter Verwendung von 5'- und 3'-Oligos, die innerhalb der Enden des ORF-Fragments (5'-CACTTGGATTCCCCTGATCTG (SEQ ID NO: 81) und 5'-GCAATACCCGCTTGGAAAACG (SEQ ID NO: 82)) miteinander verschachtelt waren, so daß das entstehende Produkt 100-200 Bp des 5'-Endes des auszuschaltenden Synechocystis-Gens, die Kanamcynresistenzkassette und 100-200 Bp des 3'-Endes des auszuschaltenden Gens enthielt. Dieses PCR-Produkt wurde dann in den Vektor pGemT easy (Promega) klo niert, um das Konstrukt pMON21677 zu erzeugen, und für die Synechocystis-Transformation verwendet.
  • Primer wurden ferner für die Herstellung von Synechocystis Knockout-Konstrukten für die anderen Sequenzen unter Verwendung des gleichen Verfahrens wie oben beschrieben mit den folgenden Primern synthetisiert. Die slr1518-5'-Sequenz wurde amplifiziert unter Verwendung der Primer 5'-GGATCCATGACCGAATCTTCGCCCCTAGC (SEQ ID NO: 83) und 5'-GCAATGTAACATCAGAGATTTTGAGACACAACGTGGCTTTCAATCCTAGGTAGCCGAGGCG (SEQ ID NO: 84). Der 3'-Bereich wurde unter Verwendung der synthetischen Oligonukleotidprimer 5'-GAATTCTTAGCCCAGGCCAGCCCAGCC (SEQ ID NO: 85) und 5'-GGTATGAGTCAGCAACACCTTCTTCACGAGGCAGACCTCAGCGGGGAATTGATTTGTTTAATTACC (SEQ ID NO: 86) amplifiziert. Die Amplifikationsprodukte wurden mit dem Kanamycinresistenzgen aus puc4K (Pharmacia), das mit HincII verdaut und von dem Vektorrückgrat weg Gelaufgereinigt wurde, kombiniert. Das angelagerte Fragment wurde amplifiziert unter Verwendung von 5'- und 3'-Oligos, die innerhalb der Enden des ORF-Fragments (5'-GCGATCGCCATTATCGCTTGG (SEQ ID NO: 87) und 5'-GCAGACTGGCAATTATCAGTAACG (SEQ ID NO: 88)) miteinander verschachtelt waren, so daß das entstehende Produkt 100-200 Bp des 5'-Endes des auszuschaltenden Synechocystis-Gens, die Kanamcynresistenzkassette und 100-200 Bp des 3'-Endes des auszuschaltenden Gens enthielt. Dieses PCR-Produkt wurde dann in den Vektor pGemT easy (Promega) kloniert, um das Konstrukt pMON21680 zu erzeugen, und für die Synechocystis-Transformation verwendet.
  • 4B. Transformation von Synechocystis
  • Zellen von Synechocystis 6803 wurden bis zu einer Dichte von ungefähr 2 × 108-Zellen/ml angezogen und durch Zentrifugation geerntet. Das Zellsediment wurde in frischem BG-11-Medium (ATCC Medium 616) mit einer Dichte von 1 × 109 Zellen pro ml resuspendiert und sofort für Transformation verwendet. 100 μl dieser Zellen wurden mit 5 μl Miniprep-DNA gemischt und mit Licht bei 30°C für 4 Stunden inkubiert. Diese Mischung wurde dann auf Nylonfiltern, die auf BG-11-Agar ergänzt mit TES pH 8 aufgebracht waren, ausplattiert und den Zellen ermöglicht, für 12-18 Stunden zu wachsen. Die Filter wurden dann auf BG-11-Agar + TES + 5 μg/ml Kanamycin transferiert und konnten wachsen, bis Kolonien innerhalb von 7-10 Tagen erschienen (Packer und Glazer, 1988). Kolonien wurden dann in BG-11-Flüssigmedium, das 5 μg/ml Kanamycin enthielt, gepickt und konnten für 5 Tage wachsen. Diese Zellen wurden dann in BG-11-Medium, das 10 mg/ml Kanamycin enthielt, transferiert und konnten 5 Tage wachsen und wurden dann in Bg-11 + Kanamycin mit 25 μg/ml transferiert und konnten für 5 Tage wachsen. Zellen wurden dann für PCR-Analysen geerntet, um das Vorhandensein eines zerstörten ORFs zu bestimmen, und auch für HPLC-Analysen, um zu bestimmen, ob die Zerstörung irgendeinen Einfluß auf Tocopherolgehalte hat.
  • PCR-Analysen der Synechocystis-Isolate für slr1736 und sll1899 zeigten eine vollständige Trennung des Mutantengenoms, was bedeutet, daß keine Kopien des Wildtyp-Genoms in diesen Stämmen nachgewiesen werden konnte. Dies legt nahe, daß die Funktion des nativen Gens für die Zellfunktion nicht notwendig ist. HPLC-Analysen derselben Isolate zeigte, daß der sll1899-Stamm keine nachweisbare Verringerung bei den Tocopherolgehalten aufwies. Der Stamm jedoch, der den Knockout für slr1736 trug, produzierte keine nachweisbaren Tocopherolgehalte.
  • Die Aminosäuresequenzen für die Synechocystis-Knockouts wurden durch Verwendung von ClustalW verglichen und sind in Tabelle 3 unten gezeigt. Dargestellt sind die Identität, Ähnlichkeit und Lücke in Prozent. Der Abgleich der Sequenzen ist in 21 gezeigt. Tabelle 3:
    Slr1736 slr0926 slll899 slr0056 slr1518
    slr1736 % Identität 14 12 18 11
    % ähnlich 29 30 34 26
    % Lücke 8 7 10 5
    slr0926 % Identität 20 19 14
    % ähnlich 39 32 28
    % Lücke 7 9 4
    slll899 % Identität 17 13
    % ähnlich 29 29
    % Lücke 12 9
    slr0056 % Identität 15
    % ähnlich 31
    % Lücke 8
    slr1518 % Identität
    % ähnlich
    % Lücke
  • Aminosäuresequenzvergleiche wurden unter Verwendung verschiedener Arabidopsis-Prenyltransferasesequenzen und Synechocystis-Sequenzen durchgeführt. Die Vergleiche sind in Tabelle 4 unten dargestellt. Gezeigt sind die Identität, Ähnlichkeit und Lücke in Prozent. Der Abgleich der Sequenzen ist in 22 gezeigt. Tabelle 4:
    ATPT2 slr1736 ATPT3 slr0926 ATPT4 sll1899 ATPT12 slr0056 ATPT8 slr1518
    ATPT2 29 9 9 8 8 12 9 7 9
    46 23 21 20 20 28 23 21 20
    27 13 28 23 29 11 24 25 24
    slr1736 9 13 8 12 13 15 8 10
    19 28 19 28 26 33 21 26
    34 12 34 15 26 10 12 10
    ATPT3 23 11 14 13 10 5 11
    36 26 26 26 21 14 22
    29 21 31 16 30 30 30
    slr0926 12 20 17 20 11 14
    24 37 28 33 24 29
    33 12 25 10 11 9
    ATPT4 18 11 8 6 7
    33 23 18 16 19
    28 19 32 32 33
    slr1899 13 17 10 12
    24 30 23 26
    27 13 10 11
    ATPT1 52 8 11
    66 19 26
    18 25 23
    slr0056 9 13
    23 32
    10 8
    ATPT8 7
    23
    7
    slr1518
  • 4C. Phytylprenyltransferase-Enzymassays
  • [3H]-Homogentisinsäure in 0,1 % H3PO4 (spezifische Radioaktivität 40 Ci/mmol). Phytylpyrophosphat wurde wie von Joo, et al. (1973) Can J. Biochem. 51:1527 beschrieben synthetisiert. 2-Methyl-6-phytylchinol und 2,3-Dimethyl-5-phytylchinol wurden wie von Soll, et al. (1980) Phytochemistry 19:215 beschrieben synthetisiert. Homogentisinsäure, α, β, δ und γ-Tocopherol und Tocol wurden käuflich erworben.
  • Der Wildtyp-Stamm von Synechocystis sp. PCC6803 wurde in BG-11-Medium mit eingeblasener Luft bei 30°C unter 50 μE·m–2·s–1 Fluoreszenzlicht und 70% relativer Feuchte angezogen. Das Wachstumsmedium des slr1736-Knockout-(potentiellen PPT)- Stamms dieses Organismus wurde mit 25 μg mL–1 Kanamycin ergänzt. Zellen wurden aus 0,25 bis 1 Literkulturen durch Zentrifugation bei 5000 g für 10 Minuten gesammelt und bei –80°C gelagert.
  • Gesamtmembranen wurden gemäß der Prozedur von Zak mit einigen Abwandlungen (Zak et al. (1999) Eur J. Biochem 261:311) isoliert. Die Zellen wurden in einer French-Presse aufgebrochen. Vor der Behandlung mit der French-Presse wurden die Zellen für 1 Stunde mit Lysozym (0,5 w/v) bei 30°C in einem Medium, das 7 mM EDTA, 5 mM NaCl und 10 mM Hepes-NaOH, pH 7,4, enthielt, inkubiert. Die Sphäroplasten wurden durch Zentrifugation bei 5000 g für 10 Minuten gesammelt und mit 0,1-0,5 mg Chlorophyll·ml–1 in 20 mM Kaliumphosphatpuffer, pH 7,8, resuspendiert. Eine geeignete Menge des Proteaseinhibitorcocktails und DNAse I von Boehringer Mannheim wurde zu der Lösung hinzugegeben. Die Behandlungen mit der French-Presse wurde zwei- bis dreimal bei 100 MPa durchgeführt. Nach dem Aufbrechen wurde die Zellsuspension für 10 Minuten bei 5000 g zentrifugiert, um nicht aufgebrochene Zellen zu sedimentieren, gefolgt von einer Zentrifugation bei 100 000 g für 1 Stunde, um die Gesamtmembranen zu sammeln. Das finale Sediment wurde in einem Puffer resuspendiert, der 50 mM Tris-HCl und 4 mM MgCl2 enthielt.
  • Chloroplastensedimente wurden aus 250 g Spinatblättern, die vom örtlichen Markt erhalten wurden, isoliert. Blattabschnitte ohne Blattgefäße („devined") wurden in Mahlpuffer („grinding buffer”) (2 l/250 g Blätter), der 2 mM EDTA, 1 mM MgCl2, 1 mM Mncl2, 0,33 M Sorbitol, 0,1 % Ascorbinsäure und 50 mM Hepes bei pH 7,5 enthielt, geschnitten. Die Blätter wurden für 3 Sekunden dreimal in einem 1 l-Mixer homogenisiert und durch 4 Lagen Mirocloth filtriert. Der Überstand wurde bei 5000 g für 6 min zentrifugiert. Die Chloroplastensedimente wurden in einer kleinen Menge Mahlpuffer (Douce et al. Methods in Chloroplast Molecular Biology, 239 (1982)) resuspendiert.
  • Chloroplasten in den Sedimenten können auf drei verschiedene Arten aufgebrochen werden. Chloroplastensedimente wurden zuerst in 1 mg Chlorophyll/Röhrchen aliquotiert, bei 6000 UpM für 2 Minuten in einer Mikrozentrifuge zentrifugiert und der Mahlpuffer entfernt. 200 μl Triton X-100-Puffer (0,1 % Triton X-100, 50 mM Tris-HCl pH 7,6 und 4 mM MgCl2) oder Schwellpuffer (10 mM Tris pH 7,6 und 4 mM MgCl2) wurde zu jedem Röhrchen hinzugegeben und für eine halbe Stunde bei 4°C inkubiert. Die aufgebrochenen Chloroplastensedimente wurden dann sofort für die Untersuchung verwendet. Zusätzlich können aufgebrochene Chloroplasten ebenfalls durch Gefrieren in flüssigem Stickstoff und Lagern bei –80°C für eine halbe Stunde erhalten und dann für die Untersuchung verwendet werden.
  • In einigen Fällen wurden die Chloroplastensedimente mit 40%/80% Percoll-Gradienten weiter aufgereinigt, um intakte Chloroplasten zu erhalten. Die intakten Chloroplasten wurden mit Schwellpuffer aufgebrochen, und dann entweder für die Untersuchung verwendet oder für Hüllmembranen mit 20,5%/31,8% Saccharose-Dichtegradienten (Soll et al. (1980) loc. cit.) weiter aufgereinigt. Die Membranfraktionen wurden mit 100 000 g für 40 Minuten zentrifugiert und in 50 mM Tris-HCl pH 7,6, 4 mM MgCl2 resuspendiert.
  • Verschiedene Mengen von [3H]HGA, 40 bis 60 μM unmarkiertes HGA mit einer spezifischen Aktivität im Bereich von 0,16 bis 4 Ci/mmol wurden mit einer geeigneten Menge 1 M Tris-NaOH pH 10 gemischt, um einen pH von 7,6 einzustellen. HGA wurde für 4 Minuten mit einer geringen Menge festen NaBH4 reduziert. Zusätzlich zu HGA enthielt die Standardinkubationsmischung (Endvolumen 1 ml) 50 mM Tris-HCl, pH 7,6, 3-5 mM MgCl2 und 100 μM Phytylpyrophosphat. Die Reaktion wurde durch Zugabe von Synechocystis-Gesamtmembranen, Spinat-Chloroplastensedimenten, aufgebrochenen Spinat-Chloroplasten oder Spinat-Hüllmembranen gestartet. Die Enzymreaktion wurde für 2 Stunden bei 23 C oder 30°C im Dunklen oder bei Licht durchgeführt. Die Reaktion wird durch Frieren mit flüssigem Stickstoff und Lagerung bei –80°C oder direkt durch Extraktion gestoppt.
  • Eine konstante Menge Tocol wurde zu jeder Testmischung zugegeben und die Reaktionsprodukte wurden mit einer 2 ml-Mischung Chloroform/Methanol (1:2, v/v) extrahiert, um eine einphasische Lösung zu ergeben. NaCl-Lösung (2 ml; 0,9 %) wurde unter energischem Schütteln hinzu gegeben. Diese Extraktionsprozedur wurde dreimal wiederholt. Die organische Schicht, welche die Prenylchinone enthält, wurde durch einen 20 mμ-Filter filtriert, unter N2 abgedampft und dann in 100 μl Ethanol resuspendiert.
  • Die Proben wurden hauptsächlich durch die Normalphasen-HPLC-Methode (isokratisch 90 % Hexan und 10 Methyl-t-butylether) und Verwendung einer Zorbax-Kieselsäuresäule, 4,6 × 250 mm analysiert. Die Proben wurden ebenfalls durch ein Umkehrphasen-HPLC-Verfahren (isokratisch 0,1 % H3PO4 in MeOH) und Verwendung einer Vydac 201HS54-C18-Säule; 4,6 × 250 mm gekoppelt mit einer All-tech C18-Guardsäule analysiert. Die Menge der Produkte wurde auf Basis der substratspezifischen Radioaktivität berechnet und gemäß der prozentualen Rückgewinnung basierend auf der Menge des internen Standards eingestellt.
  • Die Chlorophyllmenge wurde wie in Arnon (1949) Plant Physiol. 24:1 beschrieben bestimmt. Die Proteinmenge wurde durch das Bradford-Verfahren unter Verwendung von gamma-Globulin als einem Standard bestimmt (Bradford, (1976) Anal. Biochem. 72:248).
  • Die Ergebnisse des Tests zeigen, daß 2-Methyl-6-Phytylplastochinon in den Synechocystis-slrl736-Knockout-Zubereitungen nicht gebildet wird. Die Ergebnisse des Phytylprenyltransferase-Enzymaktivitätsassays für den slr1736-Knockout sind in 23 dargestellt.
  • 4D. Komplementierung des slr1736-Knockouts mit ATPT2
  • Um zu bestimmen, ob ATPT2 den Knockout von slr1736 in Synechocystis 6803 komplementieren kann, wurde ein Plasmid konstruiert, das die ATPT2-Sequenz von dem TAC-Promotor ausgehend exprimiert. Ein Vektor, Plasmid psl1211, wurde von dem Laboratorium von Dr. Himadri Pakrasi von der Washington University erhalten und beruht auf dem Plasmid RSF1010, welches ein Plasmid mit breitem Wirtsspektrum ist (Ng W.-O., Zentella R., Wang Y., Taylor J-S. A., Pakrasi, H.B. 2000. phrA, the major photoreactivating factor in the cyanobacterium Synechocystis sp. Strain PCC 6803 codes for a cyclobutane pyrimidine dimer specific DNA photolyase. Arch. Microbiol. (im Druck)). Das ATPT2-Gen wurde mittels PCR unter Verwendung der folgenden Primer aus dem Vektor pCGN10817 isoliert. ATPT2nco.pr 5'-CCATGGATTCGAGTAAAGTTGTCGC (SEQ ID NO: 89); ATPT2ri.pr 5'-GAATTCACTTCAAAAAAGGTAACAG (SEQ ID NO: 90). Diese Primer werden ungefähr 112 Bp vom 5'-Ende der ATPT2-Sequenz entfernen, von denen angenommen wird, daß sie das Chloroplastentransitpeptid sind. Diese Primer werden ebenfalls eine NcoI-Stelle am 5'-Ende und eine EcoRI-Stelle am 3'-Ende einfügen, die für eine Subklonierung in nachfolgende Vektoren verwendet werden können. Das PCR-Produkt aus der Verwendung dieser Primer und pCGN10817 wurde in pGEM T easy ligiert und der entstehende Vektor pMON21689 wurde durch Sequenzierung unter Verwendung der m13vorwärts- und m13rückwärts-Primer bestätigt. Das NcoI/EcoRI-Fragment aus pMON21689 wurde dann mit den EagI/EcoRI- und EagI/NcoI-Fragmenten des psl1211 ligiert, was zu pMON21690 führte. Das Plasmid pMON21690 wurde durch Konjugation in den slr1736- Synechocystis 6803-KO-Stamm eingefügt. Zellen von sl906 (ein Helferstamm) und DH10B-Zellen, die pMON21690 enthalten, wurden bis zur log-Phase (O.D. 600 = 0,4) angezogen und 1 ml wurde durch Zentrifugation geerntet. Die Zellsedimente wurden zweimal mit einer sterilen BG-11-Lösung gewaschen und in 200 μl BG-11 resuspendiert. Das Folgende wurde in einem sterilen Eppendorf-Röhrchen vermischt: 50 μl SL906, 50 μl DH10B-Zellen, die pMON21690 enthalten, und 100 μl einer frischen Kultur des slr1736-Synechocystis 6803-KO-Stamm (O.D. 730 = 0,2-0,4). Die Zellmischung wurde sofort auf einen Nitrocellulosefilter, der auf BG-11 aufgebracht war, transferiert und für 24 Stunden bei 30°C und 2500 Lux (50 ue) Licht inkubiert. Der Filter wurde dann auf mit 10 μg/ml Gentamycin ergänztes BG-11 transferiert und für ungefähr 5 Tage inkubiert. Wenn Kolonien erschienen, wurden diese gepickt und in flüssigem BG-11 + Gentamycin 10 μg/ml angezogen (Elhai, J. und Wolk, P. 1988. Conjugal transfer of DNA of Cyanobacteria. Methods in Enzymology 167, 747-54). Die Flüssigkulturen wurden dann durch Ernten von 1 ml Kultur durch Zentrifugieren, Extrahieren mit Ethanol/Pyrogallol und HPLC-Auftrennung auf Tocopherole hin untersucht. Der slr1736-Synechocystis 6803 KO-Stamm enthielt keine nachweisbaren Tocopherole, während der slr1736-Synechocystis 6803 KO-Stamm, der mit pmon21690 transformiert war, nachweisbares alpha-Tocopherol enthielt. Ein mit psl1211 (Vektorkontrolle) transformierter Synechocystis 6803-Stamm produzierte ebenfalls alpha-Tocopherol.
  • 4E. Zusätzliches Anzeichen für Prenyltransferase-Aktivität
  • Um die Hypothese zu testen, daß slr1736 oder ATPT2 als Einzelgene ausreichend sind, um Phytylprenyltransferase-Aktivität zu erhalten, wurden beide Gene in SF9-Zellen und in Hefe exprimiert. Wenn entweder slr1736 oder ATPT2 in Insektenzellen (Tabelle 5) oder in Hefe exprimiert wurden, war Phytylprenyltransferase-Aktivität in Membranpräparationen nachweisbar, während Membranpräparationen der Hefe-Vektorkontrolle oder Membranpräparationen aus Insektenzellen keine Phytylprenyltransferase-Aktivität zeigten. Tabelle 5: Phytylprenyltransferase-Aktivität
    Enzymquelle Enzymaktivität [pmol/mg × h]
    in SF9-Zellen exprimiertes slr1736 20
    In SF9-Zellen exprimiertes ATPT2 6
    SF9-Zellkontrolle < 0,05
    Synechocystis 6803 0,25
    Spinat-Chloroplasten 0,20
  • Vergleichsbeispiel 5: Analyse transgener Pflanzen
  • 5A. Arabidopsis
  • Arabidopsis-Pflanzen, die mit Konstrukten für die sense- oder antisense-Expression der ATPT-Proteine transformiert sind, wurden mit Hilfe der Hochdruckflüssigchromatographie (HPLC) auf veränderte Gesamttocopherolgehalte sowie auf veränderte Gehalte an spezifischen Tocopherolen (alpha-, beta-, gamma- und delta-Tocopherol) hin untersucht.
  • Extrakte von Blättern und Samen wurden für die HPLC wie folgt hergestellt. Für Samenextrakte wurden 10 mg Samen zu 1 g Microbeads (Biospec) in einem sterilen Mikro(zentri)fugenröhrchen zugegeben, in das 500 μl 1 % Pyrogallol (Sigma Chem)/Ethanol zugegeben wurden. Die Mischung wurde für 3 Minuten in einem „mini Beadbeater" (Biospec) mit der Geschwindigkeit "schnell" geschüttelt. Der Extrakt wurde durch einen 0,2 μm-Filter in ein „autosampler"-Röhrchen filtriert. Die filtrierten Extrakte wurden dann wie unten beschrieben für die HPLC-Analyse verwendet.
  • Blattextrakte wurden durch Mischen von 30-50 mg Blattgewebe mit 1 g Microbeads hergestellt und in flüssigem Stickstoff bis zur Extraktion tiefgefroren. Für die Extraktion wurden 500 μl 1 % Pyrogallol in Ethanol zu der Blatt/Bead-Mischung gegeben und für 1 Minute auf einem „Beadbeater" (Biospec) mit der Geschwindigkeit "schnell" geschüttelt. Die entstehende Mischung wurde für 4 Minuten bei 14 000 UpM zentrifugiert und vor der HPLC-Analyse wie oben beschrieben filtriert.
  • HPLC wurde auf einer Zorbax-Kieselsäure-HPLC-Säule (4,6 mm × 250 mm) mit einem Fluoreszenznachweis, einer Anregung bei 290 nm, einer Emission von 336 nm, und Bandpass und Schlitzen („slits") durchgeführt. Lösungsmittel A war Hexan und Lösungsmittel B war Methyl-t-butylether. Das Injektionsvolumen betrug 20 μl, die Flußrate betrug 1,5 ml/min, die Laufzeit betrug 12 Minuten (40°C) bei Verwendung des Gradienten (Tabelle 6): Tabelle 6:
    Zeit Lösungsmittel A Lösungsmittel B
    0 min 90 % 10 %
    10 min 90 % 10 %
    11 min 25 % 75 %
    12 min 90 % 10 %
  • Zum Vergleich wurden auch Tocopherolstandards in 1 % Pyrogallol/Ethanol analysiert (alpha-Tocopherol, gamma-Tocopherol, beta-Tocopherol, delta-Tocopherol und Tocopherol (Tocol) (alle von Matreya)).
  • Standardkurven für alpha-, beta-, delta- und gamma-Tocopherol wurden unter Verwendung der Chemstation-Software berechnet. Die absolute Menge der Komponente x ist: Absolute Menge von x = Antwortx × RFx × Verdünnungsfaktor, wobei die Antwortx die Fläche des Peaks x ist, RFx der Antwortfaktor für die Komponente x (Mengex/Antwortx) ist und der Verdünnungsfak tor 500 μl ist. Die ng/mg Gewebe werden bestimmt durch: Gesamt-ng Komponente/mg Pflanzengewebe.
  • Die Ergebnisse der HPLC-Analyse der Samenextrakte von transgenen Arabidopsis-Linien, die pMON10822 für die Expression von ATAT2 ausgehend vom Napin-Promotor enthalten, sind in 24 dargestellt.
  • Die Ergebnisse der HPLC-Analyse von Arabidopsis-Samengewebe, das die ATAT2-Sequenz ausgehend vom Napin-Promotor (pMON10822) exprimiert, zeigen einen erhöhten Gehalt an Tocopherolen in den Samen. Die Gesamt-Tocopherolgehalte sind um 50 bis 60 % gegenüber den Gesamt-Tocopherolgehalten von nicht-transformierten (Wildtyp-) Arabidopsis-Pflanzen erhöht (24). Homozygote Nachkommen aus den Top 3-Linien (T3-Saatgut) zeigen einen 2-fache Zunahme (100%) der Gesamttocopherolgehalte gegenüber den Kontoll-Arabidopsis-Samen (26).
  • Weiterhin sind die Zunahmen bestimmter Tocopherole in transgenen Arabidopsis-Pflanzen, welche die ATAT2-Nukleinsäuresequenz ausgehend vom Napin-Promotor exprimieren, ebenfalls erhöht. Gehalte von delta-Tocopherol sind in diesen Linien gegenüber den delta-Tocopherolgehalten, die aus den Samen von Wildtyp-Arabidopsis-Linien erhalten wurden, mehr als dreifach erhöht. Die Gehalte von gamma-Tocopherol in transgenen Arabidopsis-Linien, welche die ATAT2-Nukleinsäuresequenz exprimieren, sind um ungefähr 60 % gegenüber den Gehalten, die in den Samen von nicht-transgenen Kontrollinien erhalten wurden, erhöht. Weiterhin sind die Gehalte von alpha-Tocopherol bis zu dreifach gegenüber denen erhöht, die aus nicht-transgenen Kontrollinien erhalten wurden.
  • Die Ergebnisse für die HPLC-Analyse von Samenextrakten der transgenen Arabidopsis-Linien, die pMON10803 für die Expressi on von ATAT2 ausgehend von dem „enhanced" 35S-Promotor enthalten, sind in 25 dargestellt. Zwei Linien wurden identifiziert, die verringerte Gesamttocopherole aufweisen, bei einer bis zu 10-fachen Abnahme, die in T3-Samen verglichen mit Kontroll-Arabidopsis beobachtet wurden (27).
  • 5B. Canola
  • Brassica napus, Varietät SP30021, wurde mit pCGN10822 (Napin-ATPT2-napin3', sense-Orientierung) unter Verwendung der Agrobacterium tumefaciens-vermittelten Transformation transformiert. Blüten der R0-Pflanzen wurden bei Pollenbildung markiert und sich entwickelnde Samen wurde an den Tagen 35 und 45 nach Pollenbildung (DAP) gesammelt.
  • Der sich entwickelte Samen wurde auf die Tocopherolgehalte hin untersucht, wie es oben für Arabidopsis beschrieben ist. Die Linie 10822-1 zeigt bei 45 DAP eine 20%ige Zunahme der Gesamttocopherole im Vergleich zu der Wildtyp-Kontrolle. Die 28 zeigt die Gesamttocopherolgehalte, die in sich entwickelnden Canolasamen gemessen wurden.
  • Beispiel 6: Sequenzen für Tocopherolcyclase
  • 6A. Herstellung des slr1737-Knockouts
  • Der Synechocystis sp. 6803-slr 1737-Knockout wurde durch das folgende Verfahren hergestellt. Das GPSTM-1-Genome Priming-System (New England Biolabs) wurde verwendet, um durch ein Tn7-Transposasesystem eine Kanamycin-Resistenzkassette in slr1737 einzuführen. Ein Plasmid aus einem Klon einer genomischen Synechocystis-Bibliothek, der 652 Basenpaare des als Ziel gesetzten ORF enthielt (Basenpaare 1324051-1324703 des Synechocystis-Genoms; die vorhergesagten Basenpaare 1323672- 1324763 des ORF, wie von Cyanobase annotiert), wurden als Ziel-DNA verwendet. Die Reaktion wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Die Reaktionsmischung wurde dann in E. coli-DH10B-elektrokompotente Zellen transformiert und ausplattiert. Kolonien aus dieser Transformation wurden auf Transposoninsertionen in die Zielsequenz hin durch Amplifizieren mit M13-Forward- und -Reverse-Universal-Priman durchmustert, die ein Produkt von 652 Basenpaaren plus 1700 Basenpaaren, der Größe der Transposon-Kanamycinkassette, für eine Gesamtfragmentgröße von 2300 Basenpaaren ergeben. Nach dieser Bestimmung war es dann notwendig, die ungefähre Lokalisierung der Insertion innerhalb des als Ziel gesetzten ORF zu bestimmen, da 100 Basenpaare der ORF-Sequenz als für eine effiziente homologe Rekombination in Synechocystis notwendig erachtet werden. Dies wurde durch Amplifikationsreaktionen unter Verwendung von entweder den Primen für die Enden des Transposons, Primer S (5'-Ende) oder N (3'-Ende), in Verbindung mit entweder einem M13-Forward- oder -Reverse-Primer durchgeführt. Somit wurden vier verschiedene Primerkombinationen verwendet, um jedes potentielle Knockout-Konstrukt zu kartieren: Primer S-M13 Forward, Primer S-M13 Reverse, Primer N-M13 Forward, Primer N-M13 Reverse. Für das für die Transformation von Synechocystis und dem Knockout-slr1737 verwendete Konstrukt wurde bestimmt, daß es aus ungefähr 150 Basenpaaren der slr1737-Sequenz auf der 5'-Seite der Transposoninsertion und ungefähr 500 Basenpaaren auf der 3'-Seite besteht, wobei die Transkription des ORF und der Kanamycinkassette in der gleichen Richtung erfolgt. Die Nukleinsäuresequenz des slr1737 ist als SEQ ID No:38 dargestellt, die abgeleitete Aminosäuresequenz ist als SEQ ID:NO 39 dargestellt.
  • Zellen von Synechocystis 6803 wurde bis zu einer Dichte von ~2 × 108 Zellen pro ml angezogen und durch Zentrifugation geerntet. Das Zellsediment wurde in frischem BG-11-Medium mit einer Dichte von 1 × 109 Zellen pro ml resuspendiert und unmit telbar für die Transformation verwendet. 100 μl dieser Zellen wurde mit 5 μl mini prep-DNA vermischt und bei Licht und 30° Celsius für 4 Stunden inkubiert. Die Mischung wurde dann auf Nylonfiltern ausplattiert, die auf BG-11-Agarun, das mit TES, pH8, ergänzt war, ruhten, und konnten für 12-18 Stunden wachsen. Die Filter wurden dann auf BG-11-Agar + TES + 5μg/ml Kanamycin übertragen und konnten wachsen, bis innerhalb von 7-10 Tagen Kolonien erschienen (Packer und Glazer, 1988). Die Kolonien wurden dann in flüssiges BG-11-Medium gepickt, das 5 μg/ml Kanamycin enthält, und konnten für 5 Tage wachsen. Diese Zellen wurden dann in BG-11-Medium Überführt, das 10 μg/ml Kanamycin enthält, und konnten für 5 Tage wachsen, und wurden dann auf BG-11 + Kanamycin mit 25 μg/ml überführt und konnten für 5 Tage wachsen. Die Zellen wurden dann für die PCR-Analyse geerntet, um das Vorkommen eines unterbrochenen ORF zu bestimmen, und ferner für die HPLC-Analyse, um zu bestimmen, ob diese Störung einen Einfluß auf die Tocopherolgehalte hat.
  • Die PCR-Analyse der Synechocystis-Isolate unter Verwendung der Primer für die Enden des slr1737-ORF zeigte eine vollständige Aufspaltung des Mutantengenoms, was bedeutet, daß keine Kopien des Wildtyp-Genoms in diesen Stämmen nachgewiesen werden konnten. Dies liegt nahe, das die Funktion des nativen Gens für die Zellfunktion nicht wesentlich ist. HPLC-Analyse des Stamms, der das Knockout für slr1737 trägt, zeigte keine nachweisbaren Gehalte an Tocopherol.
  • 6B. Die Beziehung zwischen slr1737 und slr1736
  • Das slr1737-Gen tritt in Synechocystis stromabwärts von und in der gleichen Orientierung wie slr1736, die Phytylprenyltransferase, auf. In Bakterien deutet diese Nähe oft eine Operonstruktur an, und ist daher ein Expressionsmuster, das in allen Genen, die zu diesem Operon gehören, zusammenhängt. Gelegentlich enthalten solche Operons verschiedene Gene, die be nötigt werden, um ein Enzym zu erzeugen. Um zu bestätigen, daß slr1737 für die Phytylprenyltransferase-Aktivität nicht benötigt wird, wurde die Phytylprenyltransferase in Extrakten aus der Synechocystis-slr1737-Knockout-Mutante gemessen. Die 29 zeigt, daß Extrakte aus der Synechocystis-slr1737-Knockout-Mutante immer noch Phytylprenyltransferase-Aktivität aufweisen. Die molekulare Organisation der Gene in Synechocystis 6803 wird in A gezeigt. Die Figuren B und C zeigen HPLC-Spuren (Normalphasen-HPLC) von Reaktionsprodukten, die aus Membranpräparationen des Synechocystis-Wildtyps bzw. aus slr1737-Membranpräparationen erhalten wurden.
  • Die Tatsache, daß slr1737 für die PPT-Aktivität nicht benötigt wird, stellt zusätzliche Daten bereit, wonach ATPT2 und slr1736 Phytylprenyltransferasen kodieren.
  • 6C. Synechocystis-Knockouts
  • Synechocystis 6803-Wildtyp und Synechosystis-slr1737-Knockout-Mutanten wurden photoautotroph angezogen. Zellen aus einer 20 ml-Kultur aus der späten logarithmischen Wachstumsphase wurden geerntet und mit Ethanol extrahiert. Die Extrakte wurden durch isokratische Normalphasen-HPLC unter Verwendung von Hexan/Methyl-t-butylether (95/5) und einer Zorbax-Kieselsäure-Säule, 4,6 × 250 mm, aufgetrennt. Die Tocopherole und Tocopherolzwischenprodukte wurden mittels Fluoreszenz nachgewiesen (Anregung 290 nm, Emission 336 nm)(30).
  • Die Extrakte von Synechocystis 6803 enthielten ein klares Signal für alpha-Tocopherol. 2,3-Dimethyl-5-phytylplastochinol lag in den Extrakten aus den Synechocystis-Wildtyp unter der Nachweisgrenze (C). Demgegenüber enthielten die Extrakte aus der Synechocystis-slr1737-Knockout-Mutante kein alpha-Tocopherol, sie enthielten jedoch 2,3-Dimethyl-5-phytylplastochinol (D), was darauf hindeutet, daß die Zerstörung des slr1737 zu einer Blockade der 2,3-Dimethyl-5-phytylplastochinolcyclase-Reaktion geführt hat.
  • Chromatogramme der Standardverbindungen alpha-, beta-, gamma-, und delta-Tocopherol sowie 2,3-Dimethyl-5-phytylplastochinol werden in A und B gezeigt. Die Chromatogramme der Extrakte aus dem Synechocystis-Wildtyp und der Synechocystis-slr1737-Knockout-Mutante werden in C bzw. D gezeigt. Abkürzungen: 2,3-DMPQ, 2,3-Dimethyl-5-phytylplastochinol.
  • 6D. Inkubation mit Lysozym-behandelten Synechocystis
  • Zellen des Synechocystis 6803-Wildtyp und der slr1737-Knockout-Mutanten aus der späten logarithmischen Wachstumsphase (ungefähr 1g feuchte Zellen pro Experiment in einem Gesamtvolumen von 3 ml) wurden mit Lysozym behandelt und anschließend mit S-Adenosylmethionin und Phytylpyrophosphat plus radiomarkierter Homogentisinsäure inkubiert. Nach 17 h Inkubation in der Dunkelheit bei Raumtemperatur wurden die Proben mit 6 ml Chloroform/Methanol (1/2 v/v) extrahiert. Eine Phasentrennung wurde durch die Zugabe von 6 ml 0,9 NaCl-Lösung erhalten. Diese Prozedur wurde dreimal wiederholt. Unter diesen Bedingungen wird 2,3-Dimethyl-5-phytylplastochinol oxidiert, um 2,3-Dimethyl-5-phytylplastochinon zu bilden.
  • Die Extrakte wurden durch Normalphasen- und Umkehrphasen-HPLC analysiert. Bei Verwendung von Extrakten aus Zellen der Wildtyp-Synechocystis wurden radiomarkiertes gamma-Tocopherol und Spuren von radiomarkierten 2,3-Dimethyl-5-phytylplastochinon nachgewiesen. Als Extrakte aus der slr1737-Knockoutmutante analysiert wurden, war nur radiomarkiertes 2,3-Dimethyl-5-phytyloplastochinon nachweisbar. Die Menge des 2,3-Dimethyl-5-phytyloplastochinons war im Vergleich zu Extrakten aus dem Wildtyp signifikant erhöht. Hitze-behandelte Proben des Wildtyps und der slr1737-Knockout-Mutante stellten weder radiomarkiertes 2,3-Dimethyl-5-phytyloplastochinon noch radiomarkierte Tocopherole her. Diese Ergebnisse stützen die Rolle des slr1737-Expressionsproduktes beim Ringschluß von 2,3-Dimethyl-5-phytyloplastochinol weiter.
  • 6E. Arabidopsis-Homolog zu slr1737
  • Ein Homolog zu slr1737 aus Arabidopsis wurde mittels einer BLASTALL-Recherche unter Verwendung des slr1737-Gens aus Synechocystis sp 6803 als Suchabfrage sowohl in öffentlichen als auch in urheberrechtlich geschützten Datenbanken identifiziert. Die SEQ ID NO:109 und SEQ ID NO:110 sind die DNA- bzw. die übersetzten Aminosäuresequenzen des Homologs zu slr1737 aus Arabidopsis. Der Start findet sich beim ATG an Base 56 in der SEQ ID No:109.
  • Die für das Homolog aus der urheberrechtlich geschützten Datenbank erhaltenen Sequenzen unterscheiden sich von der öffentlichen Datenbank (F4D11.30, BAC AL022537), indem sie eine Startsite 471 Basenpaare stromaufwärts von dem Start aufweisen, der in der öffentlichen Sequenz identifiziert wurde. Ein Vergleich der öffentlichen und der urheberrechtlich geschützten Sequenzen wird in 31 dargestellt. Die korrelierende richtige Start innerhalb der Sequenz aus der öffentlichen Datenbank liegt bei 12080, währen der Start bei der öffentlichen Sequenz als bei 11609 liegend angegeben wird.
  • Versuche, ein slr1737-Homolog unter Verwendung von Primern zu amplifizieren, die ausgehend von der öffentlichen Datenbank entworfen wurden, waren erfolglos, während eine Amplifikation des Gens mit Primern erreicht wurde, die aus der SEQ ID NO:109 erhalten wurden.
  • Eine Analyse der Proteinsequenz zur Identifizierung einer Transitpeptidsequenz sagte zwei potentielle Spaltstellen vor aus, eine zwischen den Aminosäuren 48 und 49, und die andere zwischen den Aminosäuren 98 und 99.
  • 6F. slr1737-Proteininformation
  • Der slr1737-ORF umfaßt 363 Aminosäurereste und hat ein vorhergesagtes MW von 41kDa (SEQ ID NO:39). Hydropathieanalysen deuten an, daß das Protein hydrophil ist (32).
  • Das Arabidopsis-Homolog zu slr1737 (SEQ ID xx) umfaßt 488 Aminosäurereste, weist ein vorhergesagtes MW von 55kDa auf, und besitzt eine putative Transitpeptidsequenz, welche die ersten 98 Aminosäuren umfaßt. Das vorhergesagte MW der reifen Form des Arabidopsis-Homologs ist 44kDa. Der hydrophatische Plot für das Arabidopsis-Homolog zeigt ferner, daß es hydrophil ist (33). Weitere BLAST-Analysen des Arabidopsis-Homologs zeigen eine begrenzte Sequenzidentität (25% Sequenzidentität) mit der beta-Untereinheit der respiratorischen Nitratreduktase. Auf Grundlage der Sequenzidentität mit der Nitratreduktase liegt es nahe, daß das slr1737-ORF ein Enzym ist, daß wahrscheinlich einen allgemeinen Säurekatalysemechanismus beinhaltet.
  • Eine Untersuchung bekannter Enzyme, die am Tocopherolmetabolismus beteiligt sind, legt nahe, daß der beste Kandidat dem allgemeinen Säuremechanismus entsprechend die Tocopherolcyclase ist. Es gibt viele bekannte Beispiele von Cyclasen einschließlich der Tocopherolcyclase, Chalconisomerase, Lycopencyclase und Aristolochinsynthase. Durch weitere Untersuchung des mikroskopischen katalytischen Mechanismus der Phytoplastochinolcyclisierung, als einem Beispiel, weist die Chalconisomerase einen katalytischen Mechanismus auf, welcher der Tocopherolcyclase am meisten ähnelt (34).
  • Ein multipler Sequenzabgleich wurde zwischen dem slr1737, dem slr1737-Arabidopsis-Homolog und der Arabidopsis-Chalcon-isomerase (Genbank: P41088) durchgeführt (35). 65% der konservierten Reste innerhalb der drei Enzyme sind bei den bekannten Chalconisomerasen streng konserviert. Die Kristallstruktur der Chalconisomerase aus Alfalfa wurde ermittelt (Jez, Joseph M., Bowman, Marianne E., Dixon, Richard A., und Noel, Joseph P. (2000) „Structure and mechanism of the evolutionarily unique plant enzyme chalcone isomerase". Nature Structural Biolgy 7:786-791). Es wurde gezeigt, daß Tyrosin (Y) 106 der Chalconisomerase aus Alfalfa als die Hauptsäure für die Ringschlußreaktion dient (Genbank: P28012). Der entsprechende Rest in slr1737 und dem slr1737-Arabidopsis-Homolog ist Lysin (K), das als Hauptsäure ein hervorragender katalytischer Rest ist.
  • Die Information, die aus der teilweisen Aufreinigung der Tocopherolcyclase aus Chlorella protothecoides ( U.S.-Patent 5,432,069 ), d.h. die als Glycin-reich, wasserlöslich und mit einem vorhergesagten MW von 49-50kDa beschrieben wurde, stimmt mit den Informationen aus der Proteininformatik überein, die für das slr1737 und das Arabidopsis-slr1737-Homolog erhalten wurden.
  • Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung erwähnt werden, geben das Niveau des Fachwissens der Fachleute an, die diese Erfindung betrifft. Alle Veröffentlichungen und Patentanmeldungen werden hierin durch Bezugnahme in dem selben Ausmaß aufgenommen, als wenn jede einzelne Veröffentlichung oder Patentanmeldung durch Bezugnahme spezifisch und individuell hierin aufgenommen würde.
  • Obwohl die vorangegangene Erfindung ausführlich durch Erläuterung und Beispiele zum Zweck des klaren Verständnis beschrieben wurde, ist es offensichtlich, daß gewisse Verände rungen und Modifizierungen im Rahmen der angehängten Ansprüche vorgenommen werden können. Sequenzprotokoll
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Claims (19)

  1. Nukleinsäure, die für eine Tocopherolcyclase kodiert, welche eine Aminosäuresequenz mit mindestens 90 Identität zu der Aminosäuresequenz von SEQ ID NO: 39 oder SEQ ID NO: 110 umfaßt, und die als in funktionsfähiger Weise verknüpfte Bestandteile einen in pflanzlichen Wirtszellen funktionstüchtigen Transkriptionsinitiationsbereich, eine für eine Tocopherolcyclase kodierende Nukleinsäuresequenz und einen Transkriptionsterminationsbereich umfaßt.
  2. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, bei der die Tocopherolcyclase bei dem Ringschluß von 2,3-Dimethyl-5-phytylplastochinol zu Tocopherol aktiv ist.
  3. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, bei der die Tocopherolcyclase bei dem Ringschluß von 2,3-Dimethyl-5-geranylgeranylplastochinol zu Tocotrienol aktiv ist.
  4. Nukleinsäure gemäß Anspruch 1, die eine Sequenz nach SEQ ID NO: 38 oder SEQ ID NO: 109 umfaßt.
  5. Pflanzenzelle, die das Konstrukt von Anspruch 1 umfaßt, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus der Gruppe von Akazie, Alfalfa, Dill, Apfel, Aprikose, Artischocke, Rukola, Spargel, Avocado, Banane, Gerste, Bohnen, Rübe, Brombeere, Blaubeere, Broccoli, Rosenkohl, Kohl, Canola, Melone, Karotte, Cassava, Blumenkohl, Sellerie, Kirsche, Chicorée, Koriander, Zitrus, Klementinen, Kaffee, Mais, Baumwolle, Gurke, Douglasie, Aubergine, Endivie, Eskariol, Eukalyptus, Fenchel, Feigen, Knoblauch, Kürbis, Traube, Grapefruit, Honigtau, Yambohne, Kiwi, Salat, Lauch, Zitrone, Limette, Weihrauch-Kiefer (punis staeda), Mango, Melone, Champignon, Nektarine, Nuß, Hafer, Ölpalme, Ölsamenraps, Eibisch, Zwiebel, Orange, eine Zierpflanze, Papaya, Petersilie, Erbse, Pfirsich, Erdnuß, Birne, Pfeffer, Persimone, Kiefer, Ananas, Kochbanane, Pflaume, Granatapfel, Pappel, Kartoffel, Kürbis, Quitte, Radiatakiefer, Radicchio, Rettich, Himbeere, Reis, Roggen, Sorghum, Südkiefer, Sojabohne, Spinat, Squash-Kürbis, Erdbeere, Zuckerrübe, Zuckerrohr, Sonnenblume, Süßkartoffel, Amberbaum, Mandarine, Tee, Tabak, Tomate, Triticale, Rasen, Weißrübe, ein Wein, Wassermelone, Weizen, Yamswurzeln und Zucchini, Distel, Kokosnuss-Palme.
  6. Pflanzenzelle, die das Konstrukt nach Anspruch 1 umfaßt, wobei die Pflanze ausgewählt ist aus Raps (Canola und Sorten mit einem hohen Anteil von Erucasäure), Sonnenblume, Distel, Baumwolle, Sojabohne, Erdnuß, Kokosnuß, Ölpalmen und Mais.
  7. Pflanze, die eine Zelle nach den Ansprüchen 5 oder 6 umfaßt.
  8. Nahrungszusammensetzung, die eine Pflanze nach Anspruch 7 umfaßt.
  9. Samen, der eine Zelle nach den Ansprüchen 5 oder 6 umfaßt.
  10. Verfahren zur Herstellung von Öl unter Verwendung eines Samens nach Anspruch 9.
  11. Verfahren nach Anspruch 10, bei dem das Öl ein natürliches Tocopherol-reiches, raffiniertes oder deodoriertes Öl ist, das durch ein Verfahren hergestellt worden ist, bei dem ein Öl durch Destillieren unter einem Druck von weniger als 0,060 mbar und bei einer Temperatur von weniger als 200°C behandelt worden ist, wobei das raffinierte Öl re duzierte freie Fettsäuren und einen wesentlichen prozentualen Anteil des in dem vorbehandelten Öl vorhandenen Tocopherols aufweist.
  12. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das vorbehandelte Öl ungereinigtes Sojabohnenöl oder vorbehandeltes Sojabohnenöl ist.
  13. Verfahren nach Anspruch 11, bei dem das raffinierte Öl degummiert und gebleicht ist.
  14. Verfahren zur Veränderung des Isoprenoidgehalts in einer Wirtszelle, bei dem das Verfahren das Transformieren der Wirtszelle mit einem Konstrukt nach Anspruch 1 umfaßt, wobei die Isoprenoid-Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe von Tocopherolen und Tocotrienolen.
  15. Verfahren zur Herstellung einer gewünschten Isoprenoid-Verbindung in einer Wirtszelle, bei dem das Verfahren das Erhalten einer transformierten Wirtszelle umfaßt, in die das Konstrukt nach Anspruch 1 eingebracht worden ist, wobei die Wirtszelle dieses Konstrukt in ihrem Genom enthält und dieses exprimiert, wobei die Isoprenoid-Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Tocopherolen und Tocotrienolen.
  16. Verfahren zur Erhöhung des biosynthetischen Flusses in einer Wirtszelle in Richtung der Herstellung einer Isoprenoid-Verbindung, bei dem das Verfahren das Transformieren der Wirtszelle mit einem Konstrukt nach Anspruch 1 umfaßt, wobei die Isoprenoid-Verbindung ausgewählt ist aus der Gruppe von Tocopherolen und Tocotrienolen.
  17. Verfahren nach Anspruch 15, bei dem die Wirtszelle eine Pflanzenzelle ist.
  18. Verfahren nach Anspruch 17, bei die Pflanzenzelle aus einer Pflanze erhalten wird, die ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Arabidopsis, Sojabohne, Mais, Reis, Weizen, Lauch, Canola, Lauch, Baumwolle und Tomate.
  19. Verfahren nach Anspruch 17, bei dem die Transkriptionsinitiationsregion ein samenspezifischer Promotor ist und bei dem das Verfahren zur Erhöhung des biosynthetischen Flusses in Richtung der Herstellung einer Isoprenoid-Verbindung in einer Wirtszelle dient.
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