DE19918949A1 - Überexpression einer DNA-Sequenz codierend für eine 1-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase in Pflanzen - Google Patents

Abstract

Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen durch Überexpression eines DXPRI-Gens.

Description

Die Erfindung betrifft eine DNA kodierend für ein Polypeptid mit 1-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase(DXPRI)-Aktivität pflanzlichen Ursprungs. Zudem betrifft die Erfindung die Verwendung von DNA-Sequenzen codierend für ein Polypeptid mit DXPRI-Aktivität pflanzlichen Ursprungs zur Herstellung von Pflan­ zen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Carotinoiden, Vitamin K, Chlorophyllen und Polyterpenen, speziell die Verwendung der DNA- Sequenz SEQ-ID No. 1 oder mit dieser hybridisierenden DNA-Sequen­ zen, einem Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Carotinoiden, Vitamin K, Chlorophyllen und Polyterpenen, sowie die derart hergestellte Pflanze selbst.

Ein wichtiges Ziel pflanzenmolekulargenetischer Arbeiten ist bis­ her die Erzeugung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Zuckern, Enzymen und Aminosäuren. Wirtschaftlich interessant ist jedoch auch die Entwicklung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Vitami­ nen, wie z. B. der Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes.

Die in der Natur vorkommenden acht Verbindungen mit Vitamin E-Ak­ tivität sind Derivate des 6-Chromanols (Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, Vol. A 27 (1996), VCH Verlagsgesell­ schaft, Chapter 4., 478-488, Vitamin E). Die erste Gruppe (1a-d) stammt von Tocopherol ab, die zweite Gruppe besteht aus Derivaten des Tocotrienols (2a-d):

1a, α-Tocopherol: R¹ = R² = R³ = CH₃
1b, β-Tocopherol [148-03-8]: R¹ = R³ = CH₃, R² = H
1c, γ-Tocopherol [54-28-4]: R¹ = H, R² = R³ = CH₃
1d, δ-Tocopherol [119-13-1]: R¹ = R² = H, R³ = CH₃

2a, α-Tocotrienol [1721-51-3]: R¹ = R² = R³ = CH₃
2b, β-Tocotrienol [490-23-3]: R¹ = R³ = CH₃, R² = H
2c, γ-Tocotrienol [14101-61-2]: R¹ = H, R² = R³ = CH₃
2d, δ-Tocotrienol [25612-59-3]: R¹ = R² = H, R³ = CH₃

Wirtschaftlich große Bedeutung besitzt α-Tocopherol.

Der Entwicklung von Kulturpflanzen mit erhöhtem Gehalt an Toco­ pherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen durch Gewebekultur oder Samenmutagenese und natürliche Auswahl sind Grenzen gesetzt. So muß einerseits beispielsweise der Toco­ pherol-Gehalt bzw. der Gehalt des gewünschten Stoffwechselendpro­ duktes bereits in Gewebekultur erfaßbar sein und andererseits können nur diejenigen Pflanzen über Gewebekulturtechniken manipu­ liert werden, deren Regeneration zu ganzen Pflanzen aus Zell­ kulturen gelingt. Außerdem können Kulturpflanzen nach Mutagenese und Selektion unerwünschte Eigenschaften zeigen, die durch teil­ weise mehrmalige Rückkreuzungen wieder beseitigt werden müssen. Auch wäre beispielsweise die Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes durch Kreuzung auf Pflanzen der selben Art beschränkt.

Aus diesen Gründen ist das gentechnische Vorgehen, beispielsweise die für die Tocopherol Syntheseleistung kodierenden, essentiellen Biosynthesegene zu isolieren und in Kulturpflanzen gezielt zu übertragen, dem klassischen Züchtungsverfahren überlegen. Dieses Verfahren setzt voraus, daß die Biosynthese und deren Regulation bekannt ist und daß Gene, die die Biosyntheseleistung beeinflus­ sen, identifiziert werden.

Isoprenoide oder Terpenoide bestehen aus verschiedenen Klassen lipidlöslicher Moleküle und werden teilweise oder vollständig aus C₅-Isopren-Einheiten gebildet. Reine Prenyllipide (z. B. Carotinoide) bestehen aus C-Gerüsten, die ausschließlich auf Iso­ pren-Einheiten zurückgehen, während gemischte Prenyllipide (z. B. Chlorophylle, Tocopherole und Vitamin K) eine Isoprenoid-Seiten­ kette besitzen, die mit einem aromatischen Kern verbunden ist.

Ausgangspunkt der Biosynthese von Prenyllipiden sind 3 × Acetyl- CoA-Einheiten, die über β-Hydroxymethylglutaryl-CoA (HMG-CoA) und Mevalonat in die Ausgangs-Isopren-Einheit (C5), dem Isopentenyl­ pyrophosphat (IPP), umgewandelt werden. Kürzlich wurde durch in vivo Fütterungsexperimente mit C¹³ gezeigt, daß in verschiedenen Eubakterien, Grünalgen und pflanzlichen Chloroplasten ein Mevalo­ nat unabhängiger Weg zur Bildung von IPP beschritten wird (Abb. 1). Dabei werden Hydroxyethylthiamin, das durch De­ carboxylierung von Pyruvat entsteht, und Glycerinalde­ hyd-3-Phosphat (3-GAP) in einer durch die 1-Deoxy-D-Xylu­ lose-5-Phosphat Synthase (DOXS) vermittelten "Transketolase"-Re­ aktion zunächst in 1-Deoxy-D-Xylulose-5-phosphat umgewandelt (Lange et al. 1998; Schwender et al. 1997; Arigoni et al. 1997; Lichtenthaler et al. 1997; Sprenger et al. 1997). Dieses wird dann durch eine intramolekulare Umordnung durch die DXPRI in 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-Phosphat und im weiteren zu IPP umge­ setzt (Arigoni et al. 1997; Zeidler et al. 1998). Biochemische Daten deuten darauf hin, daß der Mevalonat-Weg im Zytosol ope­ riert und zur Bildung von Phytosterolen führt. Das Antibiotikum Mevinolin, ein spezifischer Inhibitor der Mevalonat-Bildung, führt lediglich zur Inhibition der Sterol-Biosynthese im Zyto­ plasma, während die Prenyllipid-Bildung in den Plastiden unbeein­ flußt ist (Bach & Lichtenthaler, 1993). Der Mevalonat-unabhängige Weg ist dagegen plastidär lokalisiert und führt vornehmlich zur Bildung von Carotinoiden und plastidären Prenyllipiden (Schwender et al. 1997; Arigoni et al. 1997).

IPP steht im Gleichgewicht mit seinem Isomer, dem Dimethylallyl Pyrophosphat (DMAPP). Eine Kondensation von IPP mit DMAPP in Kopf-Schwanz-Anlagerung ergibt das Monoterpen (C10) Geranyl-Pyro­ phosphat (GPP). Die Addition von weiteren IPP Einheiten führt zum Sesquiterpen (C15) Farnesy-Pyrophosphat (FPP) und zum Diterpen (C20) Geranyl-Geranyl-Pyrophosphat (GGPP). Die Verknüpfung zweier GGPP Moleküle führt zur Bildung der C40-Vorläufer für Carotinoide.

Bei gemischten Prenyllipiden ist die Isopren-Seitenkette ver­ schiedener Länge mit Nicht-Isopren Ringen verbunden wie beispielsweise ein Porphyrin-Ring bei Chlorophyll a und b. Die Chlorophylle und Phylloquinone enthalten eine C20 Phytyl-Kette, in der nur die erste Isopren-Einheit eine Doppelbindung enthält. GGPP wird durch die Geranylgeranyl-Pyrophosphat-Oxidoreduktase (GGPPOR) zum Phytyl-Pyrophosphat (PPP) umgeformt, dem Ausgangs­ stoff für die weitere Bildung von Tocopherolen.

Bei den Ringstrukturen der gemischten Prenyllipide, die zur Bildung der Vitamine E und K führen, handelt es sich um Quinone, deren Ausgangsmetabolite aus dem Shikimat-Weg stammen. Die aroma­ tischen Aminosäuren Phenylalanin bzw. Tyrosin werden in Hydroxy­ phenyl-Pyruvat umgewandelt, welches durch Dioxygenierung in Homo­ gentisinsäure überführt wird. Das Chorismat wird einerseits über Erythrose-4-Phosphat, 3'-Dehydrochinat, 3'-Dehydroshikimat, Shi­ kimat, Shikimat-3-Phosphat und 5'-Enolpyruvylshikimat-3-Phosphat gebildet (Abb. 1). Dabei werden Fruktose-6-Phosphat und Glyce­ rinaldehyd-3-Phosphat zu Xylulose-5-Phosphat und Eryt­ hrose-4-Phosphat umgesetzt. Die oben beschriebene Homogentisin­ säure wird anschließend an PPP gebunden, um den Vorläufer von α-Tocopherol und α-Tocoquinon, das 2-Methyl-6-phytylquinol, zu bilden. Durch Methylierungsschritte mit S-Adenosylmethionin als Methyl-Gruppen-Donor entsteht zunächst 2,3-Dimethyl-6-phytylqui­ nol, dann durch Zyklisierung α-Tocopherol und durch nochmalige Methylierung α-Tocopherol (Richter, Biochemie der Pflanzen, Georg Thieme Verlag Stuttgart, 1996).

In der Literatur finden sich Beispiele die zeigen, daß die Mani­ pulation eines Enzyms den Metabolit-Fluß direktional beeinflussen kann. In Experimenten mit einer veränderten Expression der Phy­ toen Synthase, welche zwei GGPP-Moleküle zu 15-cis-Phytoen mit­ einander verknüpft, konnte ein direkter Einfluß auf die Carotino­ id-Mengen dieser transgenen Tomatenpflanzen gemessen werden (Fray und Grierson, Plant Mol. Biol. 22(4), 589-602(1993); Fray et al., Plant J., 8, 693-701(1995)). Wie zu erwarten, zeigen transgene Tabakpflanzen mit verringerten Mengen an Phenylalanin-Ammonium Lyase reduzierte Phenylpropanoid-Mengen. Das Enzym Phenylalanin- Ammonium Lyase katalysiert den Abbau von Phenylalanin, entzieht es also der Phenylpropanoid-Biosynthese (Bate et al.,Proc. Natl. Acad. Sci USA 91 (16): 7608-7612 (1994); Howles et al., Plant Physiol. 112. 1617-1624(1996)).

Über die Erhöhung des Metabolitflusses zur Steigerung des Toco­ pherol-Gehaltes in Pflanzen durch Überexpression einzelner Bio­ synthesegene ist bisher wenig bekannt. Lediglich WO 97/27285 be­ schreibt eine Modifikation des Tocopherol-Gehaltes durch ver­ stärkte Expression bzw. durch Herunterregulation des Enzyms p-Hy­ droxyphenylpyruvatdioxygenase (HPPD).

Aufgabe der vorliegenden Erfindung war die Entwicklung einer transgenen Pflanze mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen.

Die Aufgabe wurden überraschenderweise gelöst durch die Über­ expression eines 1-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase (DXPRI)-Gens in den Pflanzen.

Um beispielsweise den Metabolit-Fluß aus dem Primärstoffwechsel in die Tocopherol-Biosynthese zu verstärken, wurde die Bildung von 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-P als essentiellem Ausgangssubstrat für alle plastidären Isoprenoide erhöht. Zu diesem Zweck wurde in transgenen Pflanzen die Aktivität der DXPRI durch Überexpression des DXPRI-Gens aus Arabidopsis thaliana erhöht. Dies kann prinzi­ piell auch durch Expression homologer oder heterologer DXPRI-Gene erreicht werden. Eine Nukleotidsequenz codierend für eine DXPRI wurde aus E.coli beschrieben (Accession Nummer AB 013300; Ku­ zuyama et al., 1998; Takahashi et al., 1998).

In Beispiel 1 wird erstmals ein pflanzliches DXPRI-Gen (Abb. 2, SEQ-ID No. 1) aus Arabidopsis thaliana beschrieben und in trans­ genen Pflanzen verstärkt exprimiert. Um eine Plastidenlokalisa­ tion zu gewährleisten wird der DXPRI-Nukleotidsequenz aus Arabi­ dopsis thaliana eine Transitsignalsequenz (Abb. 3, Abb. 4) voran­ gestellt. Fragment A (529 bp) in Abb. 4 beinhaltet den 35S- Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (Nukleotide 6909 bis 7437 des Cauliflower-Mosaik-Virus). Fragment B (259 bp) beinhaltet das Transitpeptid der Transketolase. Fragment E beinhaltet das Gen der DXPRI. Fragment D (192 bp) enthält das Polyadenylierungssi­ gnal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTIACH5 (Gielen et al., 1984) zur Transkriptionstermination. Auch geeignet als Expres­ sionskassette ist eine DNA-Sequenz, die für ein DXPRI-Gen co­ diert, das mit SEQ-ID No. 1 hybridisiert und das aus anderen Or­ ganismen bzw. aus anderen Pflanzen stammt.

Das durch die zusätzliche Expression des DXPRI-Gens nun vermehrt zur Verfügung stehende 2-C-Methyl-D-Erythritol-4-P wird weiter in Richtung Tocopherole, Carotinoide, Vitamin K, Chlorophylle und Polyterpene umgesetzt.

Die Herstellung der transgenen Pflanzen erfolgt durch Transforma­ tion der Pflanzen mit einem das DXPRI-Gen enthaltenden Konstrukt. Als Modellpflanzen für die Produktion von Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen wurden Tabak und Raps eingesetzt.

Antisensekonstrukte sowie homologe bzw. heterologe pflanzliche DXPRI-Gene wurden unabhängig voneinander in Pflanzen transfor­ miert (Abb. 5). Fragment A (529 bp) in Abb. 5 beinhaltet den 35S-Promotor des Cauliflower-Mosaik-Virus (Nukleotide 6909 bis 7437 des Cauliflower-Mosaik-Virus). Fragment B (259 bp) beinhal­ tet das Transitpeptid der Transketolase (Abb. 3). Fragment E beinhaltet das Gen der DXPRI in Antisense-Orientierung. Frag­ ment D (192 bp) enthält das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTIACH5 (Gielen et al., 1984) zur Transkriptionstermination. Messungen an DXPRI-Antisensepflanzen ergaben bezüglich des Gehaltes an Tocopherolen und Carotinoiden eine drastische Abnahme. Dies belegt den direkten Einfluß der plastidären pflanzlichen DXPRI auf die Synthese von Carotinoiden und Tocopherolen.

Gegenstand der Erfindung ist die Verwendung der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 aus Arabidopsis thaliana, die für eine DXPRI oder deren funktionelle Äquivalente kodieren, zur Herstellung einer Pflanze mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Carotinoiden, Vita­ min K, Chlorophyllen und Polyterpenen. Die Nukleinsäuresequenz kann dabei z. B. eine DNA- oder cDNA-Sequenz sein. Zur Insertion in eine Expressionskassette geeignete kodierende Sequenzen sind beispielsweise solche, die für eine DXPRI kodieren und die dem Wirt die Fähigkeit zur Überproduktion von Tocopherolen, Carotinoiden, Vitamin K, Chlorophyllen und Polyterpenen verlei­ hen.

Die Expressionskassetten beinhalten außerdem regulative Nuklein­ säuresequenzen, welche die Expression der kodierenden Sequenz in der Wirtszelle steuern. Gemäß einer bevorzugten Ausführungsform umfaßt eine Expressionskassette stromaufwärts, d. h. am 5'-Ende der kodierenden Sequenz, einen Promotor und stromabwärts, d. h. am 3'-Ende, ein Polyadenylierungssignal und gegebenenfalls weitere regulatorische Elemente, welche mit der dazwischenliegenden ko­ dierenden Sequenz für das DXPRI-Gen operativ verknüpft sind. Unter einer operativen Verknüpfung versteht man die sequenzielle Anordnung von Promotor, kodierender Sequenz, Terminator und ggf. weiterer regulativer Elemente derart, daß jedes der regulativen Elemente seine Funktion bei der Expression der kodierenden Se­ quenz bestimmungsgemäß erfüllen kann. Die zur operativen Verknüp­ fung bevorzugten aber nicht darauf beschränkten Sequenzen sind Targeting-Sequenzen zur Gewährleistung der subzellulären Lokali­ sation im Apoplasten, in der Vakuole, in Plastiden, im Mitochon­ drium, im Endoplasmatischen Retikulum (ER), im Zellkern, in Öl­ körperchen oder anderen Kompartimenten und Translationsverstärker wie die 5'-Führungssequenz aus dem Tabak-Mosaik-Virus (Gallie et al., Nucl. Acids Res. 15 (1987), 8693-8711).

Beispielhaft kann die pflanzliche Expressionskassette in den Ta­ bak-Transformationsvektor pBinAR-Hyg eingebaut werden. Abb. 6 zeigt die Tabaktransformationsvektoren pBinAR-Hyg mit 35S-Promo­ tor (A) bzw. pBinAR-Hyg mit samenspezifischem Promotor Phaseolin 796 (B):

• - HPT: Hygromycin-Phosphotransferase
• - OCS: Octopin-Synthase-Terminator
• - PNOS: Nopalin-Synthase-Promotor
• - außerdem sind solche Restriktionsschnittstellen eingezeich­ net, die nur einmal den Vektor schneiden.

Als Promotoren der Expressionskassette ist grundsätzlich jeder Promotor geeignet, der die Expression von Fremdgenen in Pflanzen steuern kann. Vorzugsweise verwendet man insbesondere einen pflanzlichen Promotor oder einen Promotor, der einem Pflanzenvi­ rus entstammt. Insbesondere bevorzugt ist der CaMV 35S-Promotor aus dem Blumenkohl-Mosaik-Virus (Franck et al., Cell 21 (1980), 285-294). Dieser Promotor enthält bekanntlich unterschiedliche Erkennungssequenzen für transkriptionale Effektoren, die in ihrer Gesamtheit zu einer permanenten und konstitutiven Expression des eingeführten Gens führen (Benfey et al., EMBO J. 8 (1989), 2195-2202).

Die Expressionskassette kann auch einen chemisch induzierbaren Promotor enthalten, durch den die Expression des exogenen DXPRI- Gens in der Pflanze zu einem bestimmten Zeitpunkt gesteuert wer­ den kann. Derartige Promotoren wie z. B. der PRP1-Promotor (Ward et al., Plant. Mol. Biol. 22 (1993), 361-366), ein durch Salizyl­ säure induzierbarer Promotor (WO 95/19443), ein durch Benzenesul­ fonamid-induzierbarer (EP-A 388186), ein durch Tetrazyklin- induzierbarer (Gatz et al., (1992) Plant J. 2, 397-404), ein durch Abscisinsäure-induzierbarer (EP-A 335528) bzw. ein durch Ethanol- oder Cyclohexanon-induzierbarer (WO 93/21334) Promotor können u. a. verwendet werden.

Weiterhin sind insbesonders solche Promotoren bevorzugt, die die Expression in Geweben oder Pflanzenteilen sicherstellen, in denen beispielsweise die Biosynthese von Tocopherol bzw. dessen Vorstu­ fen stattfindet. Insbesondere zu nennen sind Promotoren, die eine blattspezifische Expression gewährleisten. Zu nennen sind der Promotor der cytosolischen FBPase aus Kartoffel oder der ST-LSI Promotor aus Kartoffel (Stockhaus et al., EMBO J. 8 (1989), 2445 - 245).

Mit Hilfe eines samenspezifischen Promotors konnte ein Fremd­ protein stabil bis zu einem Anteil von 0,67% des gesamten lösli­ chen Samenproteins in den Samen transgener Tabakpflanzen expri­ miert werden (Fiedler und Conrad, Bio/Technology 10 (1995), 1090-1094). Die Expressionskassette kann daher beispielsweise einen samenspezifischen Promotor (bevorzugt den Phaseolin- Promotor (US 5504200), den USP- (Baumlein, H. et al., Mol. Gen. Genet. (1991) 225 (3), 459-467) oder LEB4-Promotor (Fiedler und Conrad, 1995)), das LEB4-Signalpeptid, das zu exprimierende Gen und ein ER-Retentionssignal enthalten.

Die Herstellung einer Expressionskassette erfolgt durch Fusion eines geeigneten Promotors mit einer geeigneten DXPRI-DNA-Sequenz und vorzugsweise einer zwischen Promotor und DXPRI-DNA-Sequenz inserierten DNA, die für ein chloroplastenspezifisches Transit­ peptid kodiert, sowie einem Polyadenylierungssignal nach gängigen Rekombinations- und Klonierungstechniken, wie sie beispielsweise in T. Maniatis, E. F. Fritsch und J. Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989) sowie in T. J. Silhavy, M. L. Berman und L. W. En­ quist, Experiments with Gene Fusions, Cold Spring Harbor Labora­ tory, Cold Spring Harbor, NY (1984) und in Ausubel, F. M. et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Assoc. and Wiley-Interscience (1987) beschrieben sind.

Insbesondere bevorzugt sind Sequenzen, die ein Targeting in den Apoplasten, in Plastiden, in die Vakuole, in das Mitochondrium, in das Endoplasmatische Retikulum (ER) oder durch ein Fehlen ent­ sprechender operativer Sequenzen einen Verbleib im Kompartiment des Entstehens, dem Zytosol, gewährleisten (Kermode, Crit. Rev. Plant Sci. 15, 4 (1996), 285-423). Für die Menge der Proteinakku­ mulation in transgenen Pflanzen besonders förderlich erwiesen hat sich eine Lokalisation im ER (Schouten et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792).

Es können auch Expressionskassetten verwendet werden, deren DNA- Sequenz für ein DXPRI-Fusionsprotein kodiert, wobei ein Teil des Fusionsproteins ein Transitpeptid ist, das die Translokation des Polypeptides steuert. Bevorzugt sind für die Chloroplasten spezi­ fische Transitpeptide, welche nach Translokation des DXPRI-Gens in die Chloroplasten vom DXPRI-Teil enzymatisch abgespalten wer­ den. Insbesondere bevorzugt ist das Transitpeptid, das von der plastidären DXPRI oder einem funktionellen Äquivalent dieses Transitpeptids (z. B. dem Transitpeptid der kleinen Untereinheit der Rubisco oder der Ferredoxin NADP Oxidoreduktase) abgeleitet ist.

Besonders bevorzugt sind DNA-Sequenzen von drei Kassetten des Plastiden-Transitpeptids der plastidären Transketolase aus Kar­ toffel in drei Leserastern als KpnI/BamHI Fragmente mit einem ATG-Codon in der NcoI Schnittstelle:

pTP09

pTP10

pTP11

Die inserierte Nukleotid-Sequenz kodierend für eine DXPRI kann synthetisch hergestellt oder natürlich gewonnen sein oder eine Mischung aus synthetischen und natürlichen DNA-Bestandteilen ent­ halten, sowie aus verschiedenen heterologen DXPRI-Genabschnitten verschiedener Organismen bestehen. Im allgemeinen werden synthe­ tische Nukleotid-Sequenzen mit Kodons erzeugt, die von Pflanzen bevorzugt werden. Diese von Pflanzen bevorzugten Kodons können aus Kodons mit der höchsten Proteinhäufigkeit bestimmt werden, die in den meisten interessanten Pflanzenspezies exprimiert wer­ den. Bei der Präparation einer Expressionskassette können ver­ schiedene DNA-Fragmente manipuliert werden, um eine Nukleotid-Se­ quenz zu erhalten, die zweckmäßigerweise in der korrekten Rich­ tung liest und die mit einem korrekten Leseraster ausgestattet ist. Für die Verbindung der DNA-Fragmente miteinander können an die Fragmente Adaptoren oder Linker angesetzt werden.

Zweckmäßigerweise können die Promotor- und die Terminator-Regio­ nen in Transkriptionsrichtung mit einem Linker oder Polylinker, der eine oder mehrere Restriktionsstellen für die Insertion die­ ser Sequenz enthält, versehen werden. In der Regel hat der Linker 1 bis 10, meistens 1 bis 8, vorzugsweise 2 bis 6 Restriktions­ stellen. Im allgemeinen hat der Linker innerhalb der regulatori­ schen Bereiche eine Größe von weniger als 100 bp, häufig weniger als 60 bp, mindestens jedoch 5 bp. Der Promotor kann sowohl nativ bzw. homolog als auch fremdartig bzw. heterolog zur Wirtspflanze sein. Die Expressionskassette beinhaltet in der 5'-3'-Transkrip­ tionsrichtung den Promotor, eine DNA-Sequenz die für ein DXPRI- Gen codiert und eine Region für die transkriptionale Termination.

Verschiedene Terminationsbereiche sind gegeneinander beliebig austauschbar.

Ferner können Manipulationen, die passende Restriktionsschnitt­ stellen bereitstellen oder die überflüssige DNA oder Restrikti­ onsschnittstellen entfernen, eingesetzt werden. Wo Insertionen, Deletionen oder Substitutionen wie z. B. Transitionen und Trans­ versionen in Frage kommen, können in vitro-Mutagenese, "primerre­ pair", Restriktion oder Ligation verwendet werden. Bei geeigneten Manipulationen, wie z. B. Restriktion, "chewing-back" oder Auffül­ len von Überhängen für "bluntends", können komplementäre Enden der Fragmente für die Ligation zur Verfügung gestellt werden.

Von Bedeutung für den erfindungsgemäßen Erfolg kann u. a. das An­ hängen des spezifischen ER-Retentionssignals SEKDEL sein (Schou­ ten, A. et al., Plant Mol. Biol. 30 (1996), 781-792), die durchschnittliche Expressionshöhe wird damit verdreifacht bis vervierfacht. Es können auch andere Retentionssignale, die natür­ licherweise bei im ER lokalisierten pflanzlichen und tierischen Proteinen vorkommen, für den Aufbau der Kassette eingesetzt wer­ den.

Bevorzugte Polyadenylierungssignale sind pflanzliche Polyadeny­ lierungssignale, vorzugsweise solche, die im wesentlichen T-DNA- Polyadenylierungssignale aus Agrobacterium tumefaciens, ins­ besondere des Gens 3 der T-DNA (Octopin Synthase) des Ti-Plasmids pTiACH5 entsprechen (Gielen et al., EMBO J. 3 (1984), 835 ff) oder funktionelle Äquivalente.

Eine Expressionskassette kann beispielsweise einen konstitutiven Promotor (bevorzugt den CaMV 35 S-Promotor), das LeB4-Signalpep­ tid, das zu exprimierende Gen und das ER-Retentionssignal enthal­ ten. Als ER-Retentionssignal wird bevorzugt die Aminosäuresequenz KDEL (Lysin, Asparaginsäure, Glutaminsäure, Leucin) verwendet.

Vorzugsweise wird die fusionierte Expressionskassette, die für ein DXPRI-Gen kodiert, in einen Vektor, beispielsweise pBin19, kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu trans­ formieren. Mit einem solchen Vektor transformierte Agrobakterien können dann in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie z. B. von Tabakpflanzen, verwendet werden, indem beispielsweise verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden. Die Transformation von Pflanzen durch Agrobakterien ist unter anderem bekannt aus F. F. White, Vectors for Gene Transfer in Higher Plants; in Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press, 1993, S. 15-38. Aus den transformierten Zellen der verwundeten Blätter bzw. Blattstücke können in bekannter Weise transgene Pflanzen regeneriert werden, die ein in die Expressionskassette integriertes Gen für die Ex­ pression eines DXPRI-Gens enthalten.

Zur Transformation einer Wirtspflanze mit einer für eine DXPRI kodierenden DNA wird eine Expressionskassette als Insertion in einen rekombinanten Vektor eingebaut, dessen Vektor-DNA zusätzli­ che funktionelle Regulationssignale, beispielsweise Sequenzen für Replikation oder Integration enthält. Geeignete Vektoren sind unter anderem in "Methods in Plant Molecular Biology and Bio­ technology" (CRC Press), Kap. 6/7, S. 71-119 (1993) beschrie­ ben.

Unter Verwendung der oben zitierten Rekombinations- und Klonierungstechniken können die Expressionskassetten in geeignete Vektoren kloniert werden, die ihre Vermehrung, beispielsweise in E. coli, ermöglichen. Geeignete Klonierungsvektoren sind u. a. pBR332, pUC-Serien, N13mp-Serien und pACYC184. Besonders geeignet sind binäre Vektoren, die sowohl in E. coli als auch in Agrobak­ terien replizieren können.

Ein weiterer Gegenstand der Erfindung betrifft die Verwendung einer Expressionskassette enthaltend DNA-Sequenzen SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA-Sequenzen zur Transformation von Pflanzen, -zellen, -geweben oder Pflanzenteilen. Vorzugsweise ist Ziel der Verwendung die Erhöhung des Gehaltes an Tocophero­ len, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen der Pflanze.

Dabei kann je nach Wahl des Promotors die Expression spezifisch in den Blättern, in den Samen oder anderen Teilen der Pflanze er­ folgen. Solche transgenen Pflanzen, deren Vermehrungsgut, sowie deren Pflanzenzellen, -gewebe oder -teile sind ein weiterer Ge­ genstand der vorliegenden Erfindung.

Die Expressionskassette kann darüberhinaus auch zur Transforma­ tion von Bakterien, Cyanobakterien, Hefen, filamentösen Pilzen und Algen mit dem Ziel einer Erhöhung des Gehaltes an Tocophero­ len, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyll und Polyterpenen einge­ setzt werden.

Die Übertragung von Fremdgenen in das Genom einer Pflanze wird als Transformation bezeichnet. Es werden dabei die beschriebenen Methoden zur Transformation und Regeneration von Pflanzen aus Pflanzengeweben oder Pflanzenzellen zur transienten oder stabilen Transformation genutzt. Geeignete Methoden sind die Protoplasten­ transformation durch Polyethylenglykol-induzierte DNA-Aufnahme, das biolistische Verfahren mit der Genkanone - die sogenannte particle bombardment Methode, die Elektroporation, die Inkubation trockener Embryonen in DNA-haltiger Lösung, die Mikroinjektion und der durch Agrobacterium vermittelte Gentransfer. Die genann­ ten Verfahren sind beispielsweise in B. Jenes et al., Techniques for Gene Transfer, in: Transgenic Plants, Vol. 1, Engineering and Utilization, herausgegeben von S. D. Kung und R. Wu, Academic Press (1993), 128-143 sowie in Potrykus, Annu. Rev. Plant Phy­ siol. Plant Molec. Biol. 42 (1991), 205-225) beschrieben. Vorzugsweise wird das zu exprimierende Konstrukt in einen Vektor kloniert, der geeignet ist, Agrobacterium tumefaciens zu trans­ formieren, beispielsweise pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711).

Mit einer Expressionskassette transformierte Agrobakterien können ebenfalls in bekannter Weise zur Transformation von Pflanzen, insbesondere von Kulturpflanzen, wie Getreide, Mais, Hafer, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und den verschie­ denen Baum-, Nuß- und Weinspezies, verwendet werden, z. B. indem verwundete Blätter oder Blattstücke in einer Agrobakterienlösung gebadet und anschließend in geeigneten Medien kultiviert werden.

Funktionell äquivalente Sequenzen, die für ein DXPRI-Gen kodie­ ren, sind solche Sequenzen, welche trotz abweichender Nukleotid­ sequenz noch die gewünschten Funktionen besitzen. Funktionelle Äquivalente umfassen somit natürlich vorkommende Varianten der hierin beschriebenen Sequenzen sowie künstliche, z. B. durch che­ mische Synthese erhaltene, an den Kodon-Gebrauch einer Pflanze angepaßte, künstliche Nukleotid-Sequenzen.

Unter einem funktionellen Äquivalent versteht man insbesondere auch natürliche oder künstliche Mutationen einer ursprünglich isolierten für eine DXPRI kodierende Sequenz, welche weiterhin die gewünschte Funktion zeigen. Mutationen umfassen Substitutio­ nen, Additionen, Deletionen, Vertauschungen oder Insertionen eines oder mehrerer Nukleotidreste. Somit werden beispielsweise auch solche Nukleotidsequenzen durch die vorliegende Erfindung mit umfaßt, welche man durch Modifikation der DXPRI-Nukleotid­ sequenz erhält. Ziel einer solchen Modifikation kann z. B. die weitere Eingrenzung der darin enthaltenen kodierenden Sequenz oder z. B. auch die Einfügung weiterer Restriktionsenzym-Schnitt­ stellen sein.

Funktionelle Äquivalente sind auch solche Varianten, deren Funk­ tion, verglichen mit dem Ausgangsgen bzw. Genfragment, abge­ schwächt oder verstärkt ist.

Außerdem sind artifizielle DNA-Sequenzen geeignet, solange sie, wie oben beschrieben, die gewünschte Eigenschaft beispielsweise der Erhöhung des Tocopherol-Gehaltes in der Pflanze durch Über­ expression des DXPRI-Gens in Kulturpflanzen vermitteln. Solche artifiziellen DNA-Sequenzen können beispielsweise durch Rücküber­ setzung mittels Molecular Modelling konstruierter Proteine, die DXPRI-Aktivität aufweisen oder durch in vitro-Selektion ermittelt werden. Besonders geeignet sind kodierende DNA-Sequenzen, die durch Rückübersetzung einer Polypeptidsequenz gemäß der für die Wirtspflanze spezifischen Kodon-Nutzung erhalten wurden. Die spe­ zifische Kodon-Nutzung kann ein mit pflanzengenetischen Methoden vertrauter Fachmann durch Computerauswertungen anderer, bekannter Gene der zu transformierenden Pflanze leicht ermitteln.

Als weitere geeignete äquivalente Nukleinsäure-Sequenzen sind zu nennen Sequenzen, welche für Fusionsproteine kodieren, wobei Be­ standteil des Fusionsproteins ein DXPRI-Polypeptid oder ein funk­ tionell äquivalenter Teil davon ist. Der zweite Teil des Fusion­ sproteins kann z. B. ein weiteres Polypeptid mit enzymatischer Aktivität sein oder eine antigene Polypeptidsequenz mit deren Hilfe ein Nachweis auf DXPRI-Expression möglich ist (z. B. myc-tag oder his-tag). Bevorzugt handelt es sich dabei jedoch um eine re­ gulative Proteinsequenz, wie z. B. ein Signal- oder Transitpeptid, das das DXPRI-Protein an den gewünschten Wirkort leitet.

Erhöhung des Gehaltes an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, Carotinoiden und Polyterpenen bedeutet im Rahmen der vorliegenden Erfindung die künstlich erworbene Fähigkeit einer erhöhten Bio­ syntheseleistung dieser Verbindungen durch funktionelle Über­ expression des DXPRI-Gens in der Pflanze gegenüber der nicht gen­ technisch modifizierten Pflanze für die Dauer mindestens einer Pflanzengeneration.

Der Biosyntheseort von Tocopherolen beispielsweise ist im allge­ meinen das Blattgewebe, so daß eine blattspezifische Expression des DXPRI-Gens sinnvoll ist. Es ist jedoch naheliegend, daß die Tocopherol-Biosynthese nicht auf das Blattgewebe beschränkt sein muß, sondern auch in allen übrigen Teilen der Pflanze - beispielsweise in fetthaltigen Samen - gewebespezifisch erfolgen kann.

Darüberhinaus ist eine konstitutive Expression des exogenen DXPRI-Gens von Vorteil. Andererseits kann aber auch eine indu­ zierbare Expression wünschenswert erscheinen.

Die Wirksamkeit der Expression des transgen exprimierten DXPRI- Gens kann beispielsweise in vitro durch Sproßmeristenvermehrung ermittelt werden. Zudem kann eine in Art und Höhe veränderte Ex­ pression des DXPRI-Gens und deren Auswirkung auf die Tocopherol- Biosyntheseleistung an Testpflanzen in Gewächshausversuchen gete­ stet werden.

Gegenstand der Erfindung sind außerdem transgene Pflanzen, trans­ formiert mit einer Expressionskassette enthaltend die Sequenz SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA-Sequenzen, sowie transgene Zellen, Gewebe, Teile und Vermehrungsgut solcher Pflan­ zen. Besonders bevorzugt sind dabei transgene Kulturpflanzen, wie z. B. Gerste, Weizen, Roggen, Mais, Hafer, Soja, Reis, Baumwolle, Zuckerrübe, Canola, Sonnenblume, Flachs, Hanf, Kartoffel, Tabak, Tomate, Raps, Alfalfa, Salat und die verschiedenen Baum-, Nuß- und Weinspezies.

Pflanzen im Sinne der Erfindung sind mono- und dikotyle Pflanzen oder Algen.

Da es sich bei diesem Biosyntheseweg um einen ausschließlich chloroplastidär-lokalisierten Stoffwechselweg handelt, bietet er optimale Targetenzyme für die Entwicklung von Inhibitoren. Da sich nach heutigem Stand der Technik kein mit der Arabidopsis thaliana DXPRI identisches oder ähnliches Enzym in anderen höhe­ ren Organismen befindet, ist davon auszugehen, daß Inhibitoren sehr spezifisch auf Pflanzen wirken sollten. Der Wirkort eines Inhibitors, Fosmidomycin (3-(N-formyl-N-hydroxyamino)-propyl­ phosphonsäure; Fujisawa Pharmaceutical Co.) konnte als DXPRI identifiziert werden. Im biochemischen Assay findet man eine ef­ fektive Hemmung der enzymatischen Aktivität (Abb. 7). Folgende Abkürzungen wurden in Abb. 7 verwendet: DOX = 1-Deoxy-D-xylulose, ME = Methylerythritol. Die gleiche Wirkung findet man in einem Pflanzenassay, in dem Gerstenkeimlinge nach Fosmidomycinwirkung auf ihren Chlorophyll- und Carotinoidgehalt untersucht werden. Beide Substanzen, die sich aus Vorläufern des Isoprenoidstoff­ wechsels ableiten, sind in ihren Mengen stark erniedrigt (Abb. 8).

Durch Überexpression der für eine DXPRI kodierenden Gensequenz SEQ-ID No. 1 bzw. SEQ-ID No. 3 in einer Pflanze kann prinzipiell eine erhöhte Resistenz gegenüber Inhibitoren der DXPRI erreicht werden. Die derart hergestellten transgenen Pflanzen sind eben­ falls Gegenstand der Erfindung.

Weitere Gegenstände der Erfindung sind:

• - Verfahren zur Transformation einer Pflanze dadurch gekenn­ zeichnet, daß man Expressionskassetten enthaltend eine DNA- Sequenz SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA-Se­ quenzen in eine Pflanzenzelle, in Kallusgewebe, eine ganze Pflanze oder Protoplasten von Pflanzen einbringt.
• - Verwendung der Expressionskassette enthaltend eine DNA-Se­ quenz SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisierende DNA-Se­ quenzen zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhter Resistenz gegenüber Inhibitoren der DXPRI durch verstärkte Expression der DNA-Sequenzen SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hybridisie­ rende DNA Sequenzen.
• - Verwendung der DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder mit diesen hy­ bridisierende DNA-Sequenzen zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Chlorophyllen, Carotinoiden und Polyterpenen durch Expression einer DXPRI DNA-Sequenz in Pflanzen.

Die Erfindung wird durch die nun folgenden Beispiele erläutert, ist aber nicht auf diese beschränkt:

Allgemeine Klonierungsverfahren

Die im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Klonie­ rungsschritte wie z. B. Restriktionsspaltungen, Agarose-Gel­ elektrophorese, Reinigung von DNA-Fragmenten, Transfer von Nu­ kleinsäuren auf Nitrozellulose und Nylonmembranen, Verknüpfen von DNA-Fragmenten, Transformation von E. coli Zellen, Anzucht von Bakterien, Vermehrung von Phagen und Sequenzanalyse rekombinanter DNA wurden wie bei Sambrook et al. (1989) Cold Spring Harbor La­ boratory Press; ISBN 0-87969-309-6 beschrieben durchgeführt.

Die im folgenden verwendeten Bakterienstämme (E. coli, XL-I Blue) wurden von Stratagene bezogen. Der zur Pflanzentransformation verwendete Agrobakterienstamm (Agrobacterium tumefaciens, C58C1 mit dem Plasmid pGV2260 oder pGV3850kan) wurde von Deblaere et al. in Nucl. Acids Res. 13 (1985), 4777 beschrieben. Alternativ können auch der Agrobakterienstamm LBA4404 (Clontech) oder andere geeignete Stämme eingesetzt werden. Zur Klonierung können die Vektoren pUC19 (Yanish-Perron, Gene 33 (1985), 103-119) pBluescript SK- (Stratagene), pGEM-T (Promega), pZerO (Invitro­ gen), pBin19 (Bevan et al., Nucl. Acids Res. 12 (1984), 8711-8720) und pBinAR (Höfgen und Willmitzer, Plant Science 66 (1990), 221-230) benutzt werden.

Sequenzanalyse rekombinanter DNA

Die Sequenzierung rekombinanter DNA-Moleküle erfolgte mit einem Laserfluoreszenz-DNA-Sequenzierer der Firma Licor (Vertrieb durch MWG Biotech, Ebersbach) nach der Methode von Sanger (Sanger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463-5467).

Beispiel 1 Klonierung der Arabidopsis thaliana DXPRI

Ausgehend von der in der Genbank abgelegten Sequenz der E. coli DXPRI konnten in Gendatenbanken andere DXPRI-homologe bakterielle Proteinsequenzen identifiziert werden. Ein Vergleich der je le­ diglich 400 Aminosäuren langen Proteinsequenzen zeigte mehrere konservierte Aminosäure-Sequenzmotive. Ein solches Motiv zeigte Homologien mit einer abgelegten genomischen Arabidopsis-Sequenz (Accession Nummer AB009053).

Da die bakteriellen DXPRI-Sequenzen nahe am vermeintlichen N-Ter­ minus eine konservierte Aminosäurensequenz aufweisen, wurde der Beginn eines funktionellen Teils der Arabidopsis-DXPRI-Sequenz sehr genau in abgelegten genomischen Sequenzen lokalisiert. Das C-terminale Ende der Sequenz (Stop-Codon) konnte durch einen Ver­ gleich mit dem EST-Klon (Accession Nummer AA586087) gefunden wer­ den. Es wurde ein 1215 bp großes Fragment der DXPRI kloniert, welches durch heterologe Expression auf enzymatische Funktionalität untersucht wurde.

Es wurde mRNA aus Arabidopsis thaliana (var. Columbia) isoliert und cDNA (nach Herstellerangaben Stratagene) erzeugt. Es wurden aus den Sequenzen AB009053 und AA586087 PCR-Primer abgeleitet, mit welchen aus der hergestellten cDNA ein 1215 bp großes DNA- Fragment amplifiziert wurde. Der Primer ATRv3 besitzt eine BamHI- Schnittstelle und ist so gewählt, daß nach Restriktionsverdau und Ligation in pBluescript oder pET5b (Expressionsplasmid; Promega) die kodierende Sequenz ab der N-terminalen ersten konservierten Sequenz im Leserahmen der Proteintranslation einligiert wird.

Die Primer Atrv3 und Atrr1 enthielten eine BamHI- bzw. eine EcoRI-Schnittstelle (jeweils unterstrichen). Das PCR-Produkt (Atrv3/Atrr1) wurde mittels Gene-Clean-Kit (Dianova GmbH, Hilden) gereinigt und mit BamHI und EcoRI verdaut. Zur Ligation wurden der Vektor pET5b ebenfalls mit BamHI und EcoRI geschnitten. Die Ligationsprodukte wurden in E. coli XL1Blue (Stratagene) trans­ formiert.

Das Plasmid pET5bAtr enthält ein Genfragment kodierend für DXPRI aus Arabidopsis thaliana. Dessen Sequenz wurde bestimmt (Abb. 2, SEQ-ID No. 1). Die aus dem Plasmid pET5bAtr erhaltene Nu­ cleotid-Sequenz läßt sich mit den Sequenzen AB009053 und AA586087 abgleichen. Demnach enthält die genomische Sequenz AB009053 10 Introns.

Beispiel 2 Klonierung der Arabidopsis thaliana DXPRI in den Expressionsvek­ tor pET5bAtr und Nachweis der enzymatischen Aktivität

Der Expressionsvektor pET5b (Promega) ist ein Expressionsvektor für die Expression rekombinanter Proteine in E. coli. Das Plasmid ist abgeleitet von pBR322 und trägt für die Expression einen Bak­ teriophage T7-Promotor. Zur Expression wird das Plasmid in einem E. coli-Stamm vermehrt, welcher ein induzierbares Gen für die T7-Polymerase trägt (z. B. JM109(DE3); Promega). Die Expression des rekombinanten Proteines wird aktiviert über die Induktion der T7-Polymerase.

pET5bAtr codiert für ein Fusionsprotein mit 420 Aminosäuren Länge. Die Aminosäuren 1 bis 14 stammen aus pET5b (Fusionspeptid; Abb. 3). Die Aminosäuren 15 bis 420 stammen aus dem klonier­ ten DXPRI-Fragment (Abb. 2). In Abb. 3 ist die DNA-Sequenz für das Fusionspeptid unterstrichen. Aus der gesamten Sequenz läßt sich ein Molekulargewicht von 45,6 KDa für das Protein berechnen.

Der transgene Stamm wurde im Anzuchtsmedium "2x YT" (pro 1 l: Bacto-Trypton 16 g, Hefe-Extrakt 10 g, NaCl 5 g) inkubiert. Die Anzucht erfolgte bei 37°C bis zu einer OD_{560 nm} von 0,6. Nach Zu­ gabe von IPTG (1 mM) erfolgte das Wachstum weitere 10 min bei 37°C, dann weitere 4 h bei 22° bis zur Ernte. Die Zellen wurden abzentri­ fugiert und in 1% NaCl gewaschen. Nach Aufbruch der Zellen (50 bis 500 ml Zellkultur (OD_{560 nm} von 1,0) mittels French Press wurde ein Protein-Rohextrakt für Enzymtests verwendet (in 4 ml Extrak­ tionspuffer (Tris/HCl (pH 7,5) 100 mM, MgCl₂ 5 mM, DTT 2 mM, PMSF 0,1 mM). Zur Aufbewahrung wurden die Rohextrakte mit 20% Glycerin bei -20°C eingefroren.

Für den Enzymtest wurden 15 µl (auf 1 bis 7 mg Protein/ml ver­ dünnt) Proteinextrakt mit MnCl₂ (1 mM), NaF (5 mM), NADPH₂ (0,5 mM) und ¹⁴C-1-Deoxy-D-Xylulose-5-Phosphat (0,25 mM, 3 KBq) für 30 min. bei 30°C inkubiert. Das Abstoppen der Reaktion erfolgte bei 100°C (30 sec.) durch Zugabe von CaCl₂ (auf 100 mM) und alkali­ scher Phosphatase (0.5 units). Das Dephosphorylieren des Produk­ tes erfolgte für 2 h bei 30°C. Die Detektion erfolgte durch die dünnschichtchromatographische Auftrennung des Produktes auf Kieselgel 60 (Merck) mit Aceton/Ethylacetat/Wasser (50+50+2) mit anschließender Auswertung via Instant Imager. Man erhält 1-Deoxy- D-xylulose (DOX; Rf 0,4) und Methylerythritol (ME; Rf 0,2). Abb. 9 gibt die dünnschichtchromatographische, autoradiogra­ phische Auswertung nach heterloger Expression der DXPRI aus Ara­ bidopsis thaliana in E. coli und Enzymassay bei Einsatz verschie­ dener Gesamt-Proteinkonzentrationen (µg Protein/µl) wieder.
K = Kontrolle E. coli JM 109 (DE3) mit Plasmid pET5b ohne DXPRI.
Proben: E. coli JM 109 (DE3) mit Plasmid pET5b ohne DXPRI aus Ara­ bidopsis thalania. Die Bildung von ME kann effektiv inhibiert werden durch Verwendung von Fosmidomycin in verschiedenen Konzen­ trationen. Dies zeigt den "mode-of-action" von Fosmidomycin als Inhibitor der DXPRI.

Beispiel 3 Herstellung des Substrats 1-Desoxy-D-Xylulose-5-Phosphat (DOXP) für den Enzymassay

Für die Herstellung von DOXP wurde aus Chlamydomonas reinhardtii klonierte DOXS verwendet (pET5b, E. coli JM109(DE3)).

Enzymextrakte aus mit IPTG induzierten E. coli-Zellen wurde mit [3-¹⁴C]-Pyruvat und DL-GAP inkubiert. Die Reaktion wurde abge­ stoppt nach 30 min. durch Hitzedenaturierung der Proteine. Nach Abzentrifugieren wurde der Umsatz des radioaktiven Pyruvats mittels DC/Autoradiographie überprüft und der Überstand als Sub­ strat für die Reduktoisomerase verwendet.

DOXP als Reaktionsprodukt wurde nach folgenden Kriterien identi­ fiziert:

• 1. Es entsteht ein radioaktives Produkt, welches nach Behandlung mit alkalischer Phosphatase sich in DC-Trennungen weniger po­ lar verhält. Dies legt nahe, daß ein phosphoryliertes Produkt aus ¹⁴C-Pyruvat und GAP gebildet wurde.
• 2. Das dephosphorylierte Produkt läuft in der DC (Kieselgel, Aceton/Ethylacetat/Wasser-50/50/2) gleich mit einer syntheti­ schen Probe von 1-Desoxy-D-Xylulose.
  Der Reaktionsansatz enthielt Proteinextrakt (20 µl/100 µl An­ satz), Tris/HCl (pH 7,5) 100 mM, DTT 2 mM, MgCl₂ 5 mM, Na- EDTA 500 µM, PMSF 100 pH, NaF 5 mM, TPP 1 mM, Na-Pyruvat 1 mM, Na-[2-¹⁴C] Pyruvat 20 KBq/100 µl und DL-Glycerinalde­ hyd-3-Phosphat 3,75 mM.

Beispiel 4 Klonierung der Arabidopsis thaliana DXPRI in den Pflanzentrans­ formationsvektor pBin19AR-TP

Zur Klonierung der DXPRI in einen binären Vektor wurden die Pri­ mer so gewählt, daß nach Restriktionsverdau und Ligation in pBin19AR-TP (Promega) die kodierende Sequenz ab der N-terminalen ersten konservierten Sequenz im Leserahmen der Proteintranslation einligiert wird.

Die Primer AtrvpBin1 und AtrpBin2 enthielten eine BamHI- bzw. eine SmaI-Schnittstelle (jeweils unterstrichen). Das PCR-Produkt (AtrvpBin1/AtrrpBin2) wurde mittels Gene-Clean-Kit (Dianova GmbH, Hilden) gereinigt und mit BamHI und SmaI verdaut. Zur Ligation wurden der Vektor pBin19AR-TP ebenfalls mit BamHI und SmaI ge­ schnitten, der zusätzlich das Transitpeptid der Transketolase aus Kartoffel hinter dem CaMV 355 Promotor enthält. Das Transitpeptid gewährleistet die plastidäre Lokalisierung. Das Konstrukt ist in Abb. 4 dargestellt.

Beispiel 5 Herstellung von DXPRI-Antisense-Konstrukten

Zur Klonierung der DXPRI in einen binären Vektor in Antisense- Orientierung wurden folgende Primer gewählt.

Die Primer AtrvpBin3 und AtrrpBin4 enthielten eine SmaI- bzw. eine BamHI-Schnittstelle (jeweils unterstrichen). Das PCR- Produkt (AtrvpBin3/AtrrpBin4) wurde mittels Gene-Clean-Kit (Dia­ nova GmbH, Hilden) gereinigt und mit SmaI und BamHI verdaut. Zur Ligation wurden der Vektor pBin19AR-TP ebenfalls mit SmaI und BamHI geschnitten, der zusätzlich das Transitpeptid der Trans­ ketolase aus Kartoffel hinter dem CaMV 35S Promotor enthält. Das Transitpeptid gewährleistet die plastidäre Lokalisierung. Das Konstrukt ist in Abb. 5 dargestellt.

Tabakpflanzen mit reduzierter DXPRI-Aktivität wurden einer Selb­ stung unterzogen und der erhaltene Samen geerntet. Zur weiteren Analyse der Pflanzen wurde Samen aus der F1-Generation verwendet.

Alle untersuchten Antisense-Pflanzen zeigten hinsichtlich der Pflanzengröße deutliche Unterschiede auf. Es wurden Pflanzen ge­ funden, die die gleiche Größe hatten wie der Wildtyp, bis hin zu ganz kleinen Pflanzen. Die nachfolgenden Generationen waren also nicht einheitlich. Dies gilt auch für die Reduktion in der DXPRI- Aktivität, die innerhalb einer Linie nicht einheitlich war, d. h. man kann eine Linie nicht durch eine spezifische Reduktion in der DXPRI-Aktivität definieren, sondern die Linien spalten auf (Sedo­ heptulose-1,7-Bisphosphatase-antisense-Tabak-Pflanzen weisen ein vergleichbares Phänomen auf; vgl. Harrison et al. 1998, Planta 204: 27-36).

Die Biomassen-Analyse ergab eine Korrelation zwischen Reduktion der DXPRI-Aktivität und Reduktion in der Biomasse.

Beispiel 6 Extraktion und Detektion von Tocopherol Extraktionsverfahren

• - 100 mg Feuchtgewicht Blattmaterial
• - Extraktionspuffer: 80% Ethanol, 10 mM Hepes pH 7,0, 1 mM Ascorbat
• - Extraktion: 1 : 5 (w/v)
• - Inkubation bei 50°C, 30 Minuten
• - Keine Zentrifugation
• - Zugabe von ½ Volumen n-Hexan zu dem Extrakt
• - Vortex und Zentrifugation (5 Minuten, Raumtemperatur)
• - Gewinnung der oberen sehr grün gefärbten Phase
• - Wiederholung der n-Hexan Extraktion mit der unteren Phase
• - Vereinigung der n-Hexan Phasen
• - Vakuum Trocknung (2-3 Stunden für 1 ml n-Hexan bei Raumtem­ peratur)
• - Wiederauflösung des Rückstandes in ca. 1/5 des ursprünglichen n-Hexan Volumens
• - Injektion von 30-50 µl auf die HPLC
• - HPLC-Detektion für Tocopherol
• - Detektion der Fluoreszenz: Anregung bei 295 nm, Emission bei 330 nm
• - pH-Säule: RP-18 (Nucleosil 100, C18, 3 µm, Fa. Knauer)
• - Isokratisches System: n-Hexan plus 0,2% 2-Propanol
• - Fluß: 0,8 ml/min (Druck: 110 bar) Standards von Sigma oder Merck
• - Laufzeit: 15 Minuten

Beispiel 7 Extraktion phenolischer Substanzen aus Blättern und HPLC-Analytik

Die Extrakton phenolischer Substanzen aus Blättern wurde wie bei Yao et al., The Plant Cell, 7 (1955), 1787 beschrieben durchge­ führt.

Beispiel 8 Herstellung von transgenen Tabakpflanzen (Nicotiana tabacum L. cv. Samsun NN)

Für die Herstellung transgener Tabakpflanzen, die einen veränder­ ten Prenyllipidgehalt aufweisen, wurden Tabakblattscheiben mit Sequenzen der DXPRI (SEQ-ID No. 1), kloniert wie in Beispiel 4 beschrieben in den Transformationsvektor pBin19AR-TP, transfor­ miert. Zur Transformation von Tabakpflanzen wurden 10 ml einer unter Selektion gewachsenen Übernachtkultur von Agrobacterium tu­ mefaciens abzentrifugiert, der Überstand verworfen und die Bakte­ rien in gleichem Volumen Antibiotika-freien Mediums resuspen­ diert. In einer sterilen Petrischale wurden Blattscheiben steri­ ler Pflanzen (Durchmesser ca. 1 cm) in dieser Bakteriensuspension gebadet. Anschließend wurden die Blattscheiben in Petrischalen auf MS-Medium (Murashige und Skoog, Physiol. Plant (1962) 15, 473) mit 2% Saccharose und 0.8% Bacto-Agar ausgelegt. Nach 2-tä­ giger Inkubation im Dunkeln bei 25°C wurden sie auf MS-Medium mit 100 mg/l Kanamycin, 500 mg/l Claforan, mg/l Benzylaminopurin (BAP), 0.2 mg/l Naphtylessigsäure (NAA), 1.6% Glukose und 0.8% Bacto-Agar übertragen und die Kultivierung (16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit) fortgesetzt. Wachsende Sprosse wurden auf hormonfreies MS-Medium mit 2% Saccharose, 250 mg/l Claforan und 0.8% Bacto-Agar überführt.

Beispiel 9 Herstellung von transgenen Rapspflanzen (Brassica napus)

Die Herstellung der transgenen Rapspflanzen, die einen veränder­ ten Prenyllipidgehalt aufweisen, orientierte sich an einem Proto­ koll von Bade, J. B. und Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Po­ trykus, I. und Spangenberg, G., eds, Springer Lab Manual, Sprin­ ger Verlag, 1995, 30-38), in welchem auch die Zusammensetzungen der verwendeten Medien und Puffer angegeben sind.

Die Transformationen erfolgten mit dem Agrobacterium tumefaciens Stamm LBA4404 (Clontech GmbH, Heidelberg). Als binäre Vektoren wurden das bereits in Beispiel 4 beschriebene binäre Konstrukt mit der gesamten cDNA der DXPRI aus Arabidopsis thaliana (SEQ-ID No. 1) verwendet. In allen hier verwendeten binären Vektoren wurde die NOS-Terminatorsequenz durch das Polyadenylierungssignal des Gens 3 der T-DNA des Ti-Plasmids pTIACH5 (Gielen et al., 1984) zur Transkriptionstermination ersetzt. Brassica napus Samen wurden mit 70% (v/v) Ethanol oberflächensteril gemacht, 10 min bei 55°C in H₂O gewaschen, in 1%iger Hypochlorit-Lösung (25% v/v Teepol, 0,1% v/v Tween 20) für 20 min inkubiert und sechsmal mit sterilem H₂O für jeweils 20 min gewaschen. Die Samen wurden drei Tage auf Filterpapier getrocknet und 10-15 Samen in einem Glas­ kolben mit 15 ml Keimungsmedium zur Keimung gebracht. Von mehre­ ren Keimlingen (ca. 10 cm groß) wurden die Wurzeln und Apices entfernt und die verbleibenden Hypokotyle in ca. 6 mm lange Stücke geschnitten. Die so gewonnenen ca. 600 Explante werden 30 min mit 50 ml Basalmedium gewaschen und in einen 300 ml Kolben überführt. Nach Zugabe von 100 ml Kallus-Induktionsmedium wurden die Kulturen für 24 h bei 100 U/min inkubiert.

Vom Agrobacterium-Stamm wurde eine Übernachtkultur bei 29°C in Lu­ ria Broth-Medium mit Kanamycin (20 mg/l) angesetzt, davon 2 ml in 50 ml Luria Broth-Medium ohne Kanamycin für 4 h bei 29°C bis zu einer OD₆₀₀ von 0,4-0,5 inkubiert. Nach der Pelletierung der Kultur bei 2000 U/min für 25 min wurde das Zellpellet in 25 ml Basalmedium resuspendiert. Die Konzentration der Bakterien in der Lösung wurde durch Zugabe von weiterem Basalmedium auf eine OD₆₀₀ von 0.3 eingestellt.

Aus den Raps-Explanten wurde das Kallus-Induktionsmedium mit ste­ rilen Pipetten entfernt, 50 ml Agrobacterium-Lösung hinzugefügt, vorsichtig gemischt und für 20 min inkubiert. Die Agrobacterien- Suspension wurde entfernt, die Raps-Explante für 1 min mit 50 ml Kallus-Induktionsmedium gewaschen und anschließend 100 ml Kallus- Induktionsmedium hinzugefügt. Die Co-Kultivierung wurde für 24 h auf einem Rotationsschüttler bei 100 U/min durchgeführt. Die Co- Kultivierung wurde durch Wegnahme des Kallus-Induktionsmediums gestoppt und die Explante zweimal für jeweils 1 min mit 25 ml und zweimal für 60 min mit jeweils 100 ml Waschmedium bei 100 U/min gewaschen. Das Waschmedium mit den Explanten wurde in 15 cm Pe­ trischalen überführt und das Medium mit sterilen Pipetten ent­ fernt.

Zur Regeneration wurden jeweils 20-30 Explante in 90 mm Petri­ schalen überführt, welche 25 ml Sproß-Induktionsmedium mit Kana­ mycin enthielten. Die Petrischalen wurden mit 2 Lagen Leukopor verschlossen und bei 25°C und 2000 lux bei Photoperioden von 16 Stunden Licht/8 Stunden Dunkelheit inkubiert. Alle 12 Tage wurden die sich entwickelnden Kalli auf frische Petrischalen mit Sproß- Induktionsmedium überführt. Alle weiteren Schritte zur Regenera­ tion ganzer Pflanzen wurde wie von Bade, J. B. und Damm, B. (in Gene Transfer to Plants, Petrykus, I. und Spangenberg, G., eds. Springer Lab Manual, Springer Verlag, 1995, 30-38) beschrieben durchgeführt.

Beispiel 10 Steigerung der Tocopherolbiosynthese in Tabak

Die Überexpression der DXPRI aus Arabidopsis thaliana in Tabak erfolgte wie in Beispiel 8 beschrieben.

Mit den entsprechenden Konstrukten transformierte Takakpflanzen wurden im Gewächshaus angezogen. Anschließend wurde der α-Toco­ pherolgehalt der Gesamtpflanze bzw. der Samen der Pflanze bes­ timmt. In allen Fällen war die α-Tocopherolkonzentration im Verg­ leich zur nicht transfomierten Pflanze erhöht.

Beispiel 11 Steigerung der Tocopherolbiosynthese in Raps

Die cDNA der DXPRI aus Arabidopsis thaliana (SEQ-No.1) wurde mit einem CaMV35S-Promotor versehen und in Raps unter Verwendung des 35S-Promotors überexprimiert. Parallel dazu wurde der samenspezi­ fische Promotor des Phaseolingenes verwendet, um den Tocopherol­ gehalt spezifisch im Rapssamen zu erhöhen. Mit den entsprechenden Konstrukten transformierte Rapspflanzen wurden im Gewächshaus an­ gezogen. Anschließend wurde der α-Tocopherolgehalt der Gesamt­ pflanze bzw. der Samen der Pflanze bestimmt. In allen Fällen war die α-Tocopherolkonzentration im Vergleich zur nicht transfomier­ ten Pflanze erhöht.

Abb. 1

Schematische Übersicht des Prenyllipidstoffwechsels

Abb. 2

Nukleotid-Sequenz der DXPRI aus Arabidopsis thaliana

Abb. 3

Nukleotid-Sequenz der DXPRI aus Arabidopsis thaliana als Fusionssequenz

Abb. 4

Binärer Vektor zur Überexpression des DXPRI-Gens aus Arabidopsis thaliana im Plastiden transgener Pflanzen

Abb. 5

Binärer Vektor zur Antisense-Expression des DXPRI-Gens aus Arabidopsis thaliana im Plastiden transgener Pflanzen

Abb. 6

Abb. 7

Nachweis der Hemmbarkeit mit Fosmidomycin und Cofaktorbedarf der DXPRI

Abb. 8

Einfluß von Fosmidomycin auf die Neubildung von Pigmenten in etiolierten Gerstenkeimlingen

Abb. 9

Heterologe Expression der DXPRI aus Arabidopsis thaliana in E. coli

SEQUENZPROTOKOLL

Claims (8)

1. DNA-Sequenz SEQ ID No. 1 und damit hybridisierende DNA-Se­ quenzen kodierend für eine pflanzliche 1-Desoxy-D-Xylu­ lose-5-Phosphat Reduktoisomerase.

2. Verwendung von DNA-Sequenzen codierend für eine 1-Desoxy- D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen.

3. Verwendung einer DNA-Sequenz SEQ ID No. 1 oder einer mit die­ ser hybridisierenden DNA-Sequenz kodierend für eine 1-Desoxy- D-Xylulose-5-Phosphat Reduktoisomerase zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen.

4. Verfahren zur Herstellung von Pflanzen mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen, dadurch gekennzeichnet, daß eine DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder eine mit dieser hybridisierenden DNA-Se­ quenz in Pflanzen exprimiert wird.

5. Verfahren zur Transformation einer Pflanze dadurch gekenn­ zeichnet, daß man eine Expressionskassette enthaltend einen Promotor und eine DNA-Sequenz SEQ-ID No. 1 oder eine mit die­ ser hybridisierende DNA-Sequenz in eine Pflanzenzelle, in Kallusgewebe, eine ganze Pflanze oder Protoplasten von Pflan­ zenzellen einbringt.

6. Verfahren zur Transformation von Pflanzen gemäß Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformation mit Hilfe des Stammes Agrobacterium tumefaciens, der Elektroporation oder der particle bombardment Methode erfolgt.

7. Pflanze mit erhöhtem Gehalt an Tocopherolen, Vitamin K, Carotinoiden, Chlorophyllen und Polyterpenen enthaltend eine Expressionskassette gemäß Anspruch 5.

8. Pflanze nach Anspruch 7, ausgewählt aus der Gruppe Soja, Ca­ nola, Gerste, Hafer, Weizen, Raps, Mais oder Sonnenblume.