DE60013093T2

DE60013093T2 - Methoden und kits zum sequenzieren von polypeptiden

Info

Publication number: DE60013093T2
Application number: DE60013093T
Authority: DE
Inventors: Woods Thomas KEOUGH; Scott Robert YOUNGQUIST
Original assignee: Procter and Gamble Co
Current assignee: Procter and Gamble Co
Priority date: 1999-01-20
Filing date: 2000-01-12
Publication date: 2005-09-01
Anticipated expiration: 2020-01-13
Also published as: CN1340162A; DK1145012T3; AU2848700A; IL144129A0; EP1145012A2; WO2000043792A2; ATE274190T1; DE60013093D1; ES2223463T3; CN1149398C; IL144129A; WO2000043792A3; NO20013563D0; CA2359163C; NO20013563L; EP1145012B1; CA2359163A1; AU757356B2; JP2002535659A

Description

GEBIET DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Verfahren und Kits, welche die Polypeptidsequenzierung unter Verwendung von Massenspektrometrietechniken ermöglichen. Die Verfahren und Kits sind insbesondere geeignet für die Identifizierung von Polypeptiden mit hohem Molekulargewicht zur Verwendung beispielsweise auf den Gebieten der Biologie, Pharmazie, persönlichen Körperpflege und Gewebereinigung.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Kürzlich wurde die Matrix-unterstützte Laserdesorptionsionisierung-(MAL-DI) Massenspektrometrie und die Elektrospray-Ionisierung für hochsensitive Peptid- und Polypeptidsequenzierungsanwendungen entwickelt. Vergleiche z. B. Spengler et al. "Peptide Sequencing by Matrix-assisted Laser-desorption Mass Spectrometry", Rapid Communications in Mass Spectrometry, Bd. 6, S. 105 – 108 (1992); Spengler et al., "Fundamental Aspects of Postsource Decay in Matrix-Assisted Laser Desorption Mass Spectrometry", Journal of Physical Chemistry, Bd. 96, S. 9678 – 9684 (1992); Kaufmann et al., "Mass Spectrometric Sequencing of Linear Peptides by Product-ion Analysis in a Reflectron Time-of-flight Mass Spektrometer Using Matrix-assisted Laser Desorption Ionization", Rapid Communications in Mass Spectrometry, Bd. 7, S. 902 – 910 (1993); Kaufmann et al., "Sequencing of Peptides in a Time-of-flight Mass Spectrometer: Evaluation of Postsource Decay Following Matrix-assisted Laser Desorption Ionisation (MALDI), International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes, Bd. 131, S. 355-385 (1994); Kaufmann et al., "Post-source Decay and Delayed Extraction in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Refelctron Time-of-flight Mass Spectrometry", Rapid Communications in Mass Spectrometry, Bd. 10, S. 1199 – 1208 (1996); und Spengler, "Post-source Decay Analysis in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry of Biomolecules", Journal of Mass Spectrometry, Bd. 32, S. 1019 – 1036 (1997); Carr et al., "Integration of Mass Spectrometry in Analytical Biotechnology", Analytical Chemistry, Bd. 63, S. 2802 – 2824 (1991); Yates III et al., "Mining Genomes With MS", Analytical Chemistry, Bd. 68, S. 534A – 540A (1996); Morris et al., "High Sensitivity Collisionally Activated Decomposition Tandem Mass Spectrometry on a Novel Quadrupole/Orthagonal Acceleration Time-of-Flight Mass Spectrometry", Rapid Communications in Mass Spectrometry, Bd. 10, 889 – 896 (1996).
MALDI bietet einige Vorteile auf dem Gebiet der Massenspektrometrie. Beispielsweise erbringt MALDI eine höhere Empfindlichkeit als herkömmliche Elektrospray-Triple-Quadrupol-Geräte. Bei der Verwendung in Kombination mit Time-of-Flight-Massenanalysatoren ist MALDI auch auf Peptide mit höherer Masse anwendbar, als mit Triple-Quadrupol-Geräten analysiert werden können. MALDI ist weiterhin für die Analyse komplexer Mischungen bei minimaler Probenaufreinigung geeignet. Andererseits kann die Elektrospray-Ionisierung einfach mit wirksamen Trennungstechniken verknüpft werden, eingeschlossen Flüssigkeits-Chromatographie (LC) und verschiedene Formen der Kapillarelektrophorese (CE). Hochautomatisierte Analysen sind möglich, wenn LC und CE als Probenaufreinigungs- und Zufuhrvorrichtungen verwendet werden.
Jedoch kann die herkömmliche MALDI und in geringerem Umfang die Elektrospray-Ionisierungsmassenspektrometrie, keine vorhersehbaren Tandemmassenspektrometrie-Fragmentierungsmuster erbringen. Zum Beispiel werden typischerweise multiple Ionenreihen (einschließlich a-Ionen, b-Ionen und y-Ionen) beobachtet, was zu MALDI post-source decay-Spektren führt, die für eine effiziente Interpretation und Sequenzierung zu komplex sind. Multiple Ionenreihen (b- und y-Ionen) sowie interne Fragmente als auch gleichzeitig einfach- und mehrfachgeladene Ionen werden aus mehrfach-geladenen, durch die Elektrospray-Ionisierung erzeugte Vorläuferinnen gebildet, und die resultierenden Tandem-Massenspektren sind oftmals de novo nur schwer zu interpretieren. Dementsprechend haben die Probleme der Fragmentierung die Möglichkeit begrenzt, schnell Polypeptide unter Verwendung der Massenspektrometrie zu sequenzieren. Somit ist die Massenspektrometrie und insbesondere die MALDI-Massenspektrometrie auf diesem Gebiet von geringem Wert.
Einige Forschungsgruppen haben versucht, die Verwendung der Massenspektrometrie auf dem Gebiet der Polypeptidsequenzierung durch die Verwendung chemischer Derivatisierungstechniken zu verbessern. Solche Techniken wurden angewendet, um die Fragmentierung von Peptiden in den MSMS-Spektren zu begünstigen und zu steuern, mit dem Ziel, die Empfindlichkeit zu erhöhen und die Komplexität der sich ergebenden Spektren zu verringern. Die meisten dieser bekannten Techniken sehen kationische Derivate vor. Vergleiche z. B. Kidwell et al., "Sequencing of Peptides by Secondary Ion Mass Spectrometry", Journal of the American Chemical Society, Bd. 106, S. 2219 – 2220 (1984) (Derivatisierung mittels einer quaternären Ammoniumgruppe, Analyse unter Verwendung des statischen SIMS-Ionisierungsverfahrens (vor der Entwicklung sowohl der MALDI und der Elektrospray-Ionisierung)). Die Anwendung solcher Techniken unter Verwendung von MALDI und Elektrospray-Ionisierung mit Niederenergie- Kollisionsaktivierung haben sich im allgemeinen als nicht wirksam herausgestellt.
In neuerer Zeit haben Forscher andere Derivatisierungstechniken verwendet, um die Peptid/Polypeptid-Sequenzierung unter Verwendung von massenspektrometrischen Verfahren zu verbessern. Beispielsweise konnte gezeigt werden, dass die Oxidierung von Cysteinresten, welche in tryptischen Peptiden vorliegen (Peptide, welche durch Digestion mit Trypsin erzeugt werden), möglicherweise die Fragmentierung bei Verwendung der Elektrospray-Tandemmassenspektrometrie verbessern kann. Vergleiche beispielsweise Gaskell et al., "Role of the Site of Protonation in the Low-Energy Decompositions of Gas-Phase Peptide Ions", Journal of the American Society of Mass Spectrometry, Bd. 7, S. 522 – 531 (1996) und Gaskell et al., "Influence of Cysteine to Cysteic Acid Oxidation on the Collision-Activated Decomposition of Protonated Peptides: Evidence for Intraionic Interactions", Journal of the American Society of Mass Spectrometry, Bd. 3, S. 337 – 344 (1992). Insbesondere wurde die y-Ionenfragmentation unterstützt. Jedoch besitzt diese Technik einige Beschränkungen. Beispielsweise wurde diese Technik nicht auf MALDI-Verfahren ausgeweitet. Diese Technik ist weiterhin auf die Analyse solcher Polypeptide beschränkt, die Cysteinreste in der zu analysierenden Sequenz besitzen. Tatsächlich treten jedoch Cysteine eher selten in natürlich vorkommenden Polypeptiden auf, wodurch sich eine ernsthafte Limitierung der Verwendbarkeit dieser Technik ergibt.
Dementsprechend herrscht ein Bedarf vor, ein Massenspektrometrieverfahren für die Sequenzierung von Polypeptiden vorzusehen, das einfach, effizient und auf breiter Basis auf Wildtyp und variance Polypeptide anwendbar ist. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung sehen hierin ein Verfahren für die hochsensitive Polypeptidsequenzierung unter Verwendung von Massenspektrometrietechniken vor. Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, dass mit relativ starken Säuregruppen derivatisierte Polypeptide und Peptide daraus fast ausschließlich y-Ionenfragmentation erbringen, wodurch sich Spektren ergeben, welche leicht de novo interpretiert werden können. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin Kits, welche verwendet werden können, um zweckdienlich das vorliegende Verfahren durchzuführen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Massenspektrometrieverfahren und Kits, welche insbesondere geeignet sind für die Sequenzierung von Polypeptiden. Diese Verfahren schließen die Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Polypeptids ein, wobei die Schritte umfassen:

(a) Derivatisieren des N-Terminus des Polypeptids oder der N-Termini eines oder mehrere Peptide des Polypeptids mit einer oder mehreren sauren Einheiten mit pKas von weniger als 2 bei Kupplung mit dem Polypeptid oder den Peptiden, um einen oder mehrere derivatisierte Analyte vorzusehen;
(b) Analysieren eines oder mehrerer derivatisierter Analyte unter Verwendung einer Massenspektrometrietechnik, um ein Fragmentationsmuster vorzusehen; und (c) Interpretieren des Fragmentationsmusters.

Die Kits der vorliegenden Erfindung umfassen ein oder mehrere Reagenzien mit sauren Einheiten, welche eine oder mehrere saure Einheiten mit pKas von weniger als 2 vorsehen bei Kupplung mit dem Polypeptid; und Mittel zur Derivatisierung des N-Terminus des Polypeptids oder der N-Termini eines oder mehrerer Peptide des Polypeptids mit einem oder mehreren Reagenzien mit sauren Einheiten. Die vorliegenden Kits sind insbesondere geeignet in Verbindung mit der Durchführung dieser Verfahren.
DETAILLIERTE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die erfindungsgemäßen Verfahren und Kits sind geeignet für die Sequenzierung von Polypeptiden, eingeschlossen beispielsweise Wildtyp, variante und/oder synthetische Polypeptide. Die Verfahren und Kits sind insbesondere geeignet für die Identifizierung von Polypeptiden mit hohem Molekulargewicht für die Verwendung beispielsweise auf biologischen, pharmazeutischen, Körperpflege- und Gewebereinigungsgebieten.
Die vorliegenden Verfahren und Kits besitzen eine breit gefächerte Anwendbarkeit. Anwendungen schließen ein, sind jedoch nicht begrenzt auf: die Erleichterung biologischer Studien, welche die schnelle Bestimmung von Peptiden oder Polypeptidsequenzen voraussetzen; Identifizierung von post-translationalen Modifikationen in Proteinen sowie für die Identifizierung von Aminosäuremodifikationen in varianten Proteinen, wie solchen, wie sie beispielsweise in gewerblichen Waschmittel- und Reinigungsmittelprodukten verwendet werden; der Unterstützung des Designs von Oligonucleotidproben für die Genklonierung; rasche Charakterisierung von Produkten, die in gerichteten Evolutionsstudien gebildet werden; kombinatorische Chemie und Peptidbibliothek-Identifizierung; und die Proteomforschung.
Die vorliegende Erfindung beinhaltet die Anlagerung einer oder mehrerer relativ starker Säuregruppen an den N-Terminus des Polypeptids oder eines oder mehrerer Peptide, welche durch Digestion des Polypeptids vor der massenspektrometrischen Analyse gebildet werden. Ohne durch die Theorie beschränkt zu werden, wird angenommen, dass das/die sich ergebende(n) negativ geladene(n) Derivate) die Ladungsstellen-initiierte Fragmentation niedriger Energie begünstigen. Dies ist insbesondere dort effektiv, wo die C-Termini des Polypeptids oder der Peptide daraus basische oder hydrophobe, vorzugsweise basische Rest sind. Wiederum wird angenommen, ohne sich durch die Theorie zu beschränken, dass dort, wo ein basischer Rest während der massenspektrometrischen Analyse protoniert wird, die relativ starke Säuregruppe deprotoniert wird, was die positive Ladung an dem basischen Rest ausgleicht. Ein zusätzliches Proton zur Ionisierung des Derivats wird im wesentlichen "frei"gesetzt, um statistisch die Hauptketten-Amidgruppen des Polypeptids / Peptids zu ionisieren, da der am stärksten basische Rest schon protoniert ist. Darüber hinausgehend wird, ohne sich durch die Theorie zu beschränken, angenommen, dass dort, wo eine zweite relativ starke Säuregruppe in das Polypeptid / Peptid eingeführt wird, beide Säuregruppen deprotoniert werden, wodurch zwei im wesentlichen "freie" Protonen vorgesehen werden, die statistisch die Hauptketten-Amidgruppen des Polypeptids / Peptids ionisieren.
Die Anwendung des vorliegenden Verfahrens sieht eine beträchtliche Zunahmen der Fragmentierungsausbeuten vor. Darüber hinaus werden erhöhte Fragmentionen-Signal-zu-Hintergrundrauschen-Verhältnisse für derivatisierte Peptide im Vergleich zu nicht-derivatisierten Peptiden beobachtet, welche die gleiche Sequenz aufweisen. Die sich ergebenden einfachen PSD MALDI und Elektrospray-Tandemmassenspektren können routinemäßig de novo interpretiert werden.
Alle Prozentsätze, Verhältnisse und Anteile, die hierin verwendet werden, beziehen sich auf das Gewicht, soweit nichts anderes angegeben ist.
Wie hierin verwendet, werden Abkürzungen verwendet werden, um Aminosäuren zu beschreiben. Solche Abkürzungen werden in der nachfolgenden Tabelle I aufgeführt. Weiterhin werden in Tabelle I durchschnittliche Aminosäurerestmassen angegeben, die für die Durchführung der vorliegenden Erfindung hilfreich sind.
Tabelle I
Definitionen
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Desorptionsionisierung" auf den Übergang eines Analyten aus der festen Phase in die Gasphase in Form von Ionen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Desorption" auf den Austritt des Analyts aus der Oberfläche und/oder den Wiedereintritt des Analyts in die Gasphase.
Wie hierin verwendet, bezieht sich "Ionisierung" auf den Vorgang der Erzeugung oder Beibehaltung einer elektrischen Ladung auf einem Analyt, entsprechend plus/minus eine oder mehrere Elektroneneinheiten.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "MALDI" auf die Matrix-unterstützte Laserdesorptionsionisierung.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Matrix" in Bezug auf "MAL DI" auf kleine saure, leicht absorbierende Chemikalien, welche mit dem interessierenden Polypeptid oder Peptiden daraus in Lösung gemischt werden können, in einer Art und Weise, so dass nach Trocknung auf dem Probentisch die kristallinen, Matrix-eingebetteten Analyte nach Laserbestrahlung erfolgreich aus der festen Phase in die Gas- oder Dampfphase desorbiert und ionisiert werden können. Alternativ dazu können Lösungen von Polypeptiden oder Peptiden daraus auf geeignete Matrizen geladen werden, welche auf dem Probentisch vorgetrocknet sind. Nicht einschränkende Beispiele geeigneter Matrizen schließen Nicotinsäure, Sinapinsäure, 4-Hydroxy-3-methoxyzimtsäure, Kaffeesäure, a-Cyano-4-hydroxycinnamonsäure und a-Cyano-4-hydroxycinnamonsäure in Mischung mit Nitrocellulose ein.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Elektrospray-Ionisierung" auf ein Verfahren der Herstellung von Ionen aus einer Lösung mittels elektrostatischem Versprühen der Lösung aus einer Kapillarelektrode bei hoher Spannung in Bezug auf die geerdete Gegenelektrode. Die Definition sollte in diesem Sinne gleichermaßen die Elektrospray-Ionisierung und die pneumatisch unterstützte Elektrospray-Ionisierung, welche auch als Ionenspray in Bezug genommen wird, einschließen. Wie hierin verwendet, trifft der Begriff "Elektrospray-Ionisierung" auf alle Durchflußmengen zu und sollte Mikrospray- und Nanosprayexperimente mit einschließen. Darüber hinaus ist die Definition so zu verstehen, dass sie auf Analysen von Peptiden, welche direkt in die Ionenquelle ohne Trennung eingespritzt werden, und auf die Analyse von Peptiden oder Peptidmischungen, welche vor der Elektrospray-Ionisierung getrennt werden, angewendet werden kann. Geeignete prozessgekoppelte Trennungsverfahren schließen die HPLC, kapillare HPLC und Kapillarelektrophorese ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Die Elektrospray-Ionisierungsexperimente können mittels einer Vielzahl von Massenanalysegeräten durchgeführt werden, eingeschlossen, jedoch nicht beschränkt auf Triplequadrupole, Ionenfallen, Orthogonal-Beschleunigungs-Time-of-Flight-Analysegeräte und Fourier-Umwandlungsionenzyklotron-Resonanzvorrichtungen.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Polypeptid" auf ein Molekül mit zwei oder mehreren Aminosäureresten. Das erfindungsgemäße Verfahren ist geeignet für die Sequenzaufklärung von Polypeptiden mit hoher Masse.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "Wildtyp" auf ein Polypeptid, welches durch unmutierte Organismen erzeugt wird.
Wie hierin verwendet, bezieht sich der Begriff "variant" auf ein Polypeptid, das eine Aminosäuresequenz besitzt, die von der des Wildtyp-Polypeptids abweicht.
Erfindungsgemäße Verfahren
Das vorliegende Verfahren ist geeignet zur Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Polypeptids. Mit der Verwendung des Ausdrucks "Bestimmung der Aminosäuresequenz" wollen die Erfinder der vorliegenden Erfindung nicht auf die Bestimmung der Gesamtsequenz eines gegeben Polypeptids beschränkt sein. Vielmehr wird mit diesem Ausdruck gemeint, dass ein Teil oder Teile und/oder die Gesamtsequenz bestimmt wird.
Das vorliegende Verfahren schließt die Anlagerung einer oder mehrerer relativ starker Säuregruppen an den N-Terminus eines Polypeptids oder eines oder mehrerer Peptide daraus ein, um einen oder mehrere derivatisierte Analyte für die Massenspektrometrieanalyse zu erzeugen. Die Polypeptide / Peptide werden anschließend unter Verwendung einer massenspektrometrischen Technik analysiert, um ein Fragmentationsmuster vorzusehen. Das sich ergebende Fragmentationsmuster wird ausgewertet, wodurch das Polypeptid sequenziert werden kann.
Die Erfinder der vorliegenden Erfindung haben herausgefunden, dass die Säurestärke der Derivatisierungsgruppe(n) (saure Einheit) einen tiefgreifenden Effekt auf die sich ergebenden Massenspektren hat. Überraschenderweise führen solche sauren Einheiten mit einem pKa von weniger als etwa 2 zu Fragmentationsmustern, die leicht auszuwerten sind, um die gewünschte Sequenzinformation vorzusehen, wenn diese mit einem Polypeptid oder Peptid daraus gekoppelt sind. Der Fachmann ist in der Lage, die pKa-Werte, wie hierin beschrieben, unter Verwendung von Standardverfahren, wie sie im Stand der Technik bekannt sind, zu messen. Nicht beschränkende Beispiele solcher Verfahren schließen beispielsweise Titrations- und elektrochemische Verfahren ein. Das bevorzugte Verfahren für die Messung von pKa-Werten erfolgt mittels Titration.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann wie folgt durchgeführt werden: Derivatisierung des Polypeptids und / oder Peptide des Polypeptids Ein wichtiges Merkmal der vorliegenden Erfindung ist die Derivatisierung eines interessierenden Polypeptids oder Peptiden eines Polypeptids mit einer oder mehreren relativ starken Säuren, d. h., saure Einheiten mit pKas von weniger als etwa 2, vorzugsweise weniger als etwa 0 und am meisten bevorzugt weniger als etwa –2, bei Kopplung mit einem Polypeptid oder Peptiden des Polypeptids. Mit "Peptiden eines Polypeptids" ist hierin gemeint, dass das Polypeptid in zwei oder mehrere Peptide verdaut oder anderweitig gespalten wird (hierin zusammenfassend als "Digestion" oder ähnliches in Bezug genommen). Die sich ergebenden Peptide werden in Übereinstimmung mit dem vorliegenden Verfahren derivatisiert. Mit "bei Kopplung" wird hierin gemeint, dass die pKas der sauren Einheiten nach kovalenter Bindung mit einem Polypeptid oder Peptid gemessen werden.
Das Polypeptid oder die Peptide daraus können auf jede erdenkliche Art und Weise hergestellt werden. Beispielsweise wird das zu untersuchende Polypeptid für die Analyse falls notwendig isoliert. Unterschiedliche Verfahren können für die Isolierung verwendet werden, eingeschlossen beispielsweise die eindimensionale und zweidimensionale Gelelektrophorese. Als ein weiteres Beispiel können Polypeptide mittels kombinatorischer chemischer Verfahren, die aus dem Stand der Technik bekannt sind, synthetisiert werden.
Die Digestion kann durch eine Anzahl von Verfahren erfolgen, einschließlich im Gel oder auf einer Membran, vorzugsweise im Gel. Vergleiche z. B. Shevchenko et al., "Mass Spectrometric Sequencing of Proteins from Silver-Stained Polyacrylamide Gels", Analytical Chemistry, Bd. 68, S. 850 – 858 (996). Jedoch ist es möglich, die Polypeptide entweder enzymatisch oder chemisch, vorzugsweise enzymatisch, zu digerieren. Es ist am meisten bevorzugt, ein Digestionsverfahren zu verwenden, welches am oder nahe des C-Terminus der sich ergebenden Peptide einen basischen oder hydrophoben Rest erzeugt, am meisten bevorzugt einen basischen Rest. Mit "am" wird gemeint, dass der basische oder hydrophobe Rest der C-terminale Rest des Peptids ist. Mit "nahe" wird hierin gemeint, dass der basische oder hydrophobe Rest vorzugsweise innerhalb etwa 40 Aminosäureresten vom C-Terminus des Peptids entfernt liegt, noch bevorzugter etwa innerhalb 30 Resten, weiter bevorzugt etwa 20 Resten, und am meisten bevorzugt innerhalb etwa 10 Aminosäureresten ausgehend vom C-Terminus des Peptids.
Obwohl viele Methoden für dieses Verfahren verwendet werden können, ist es bevorzugt, die Polypeptide enzymatisch unter Verwendung z. B. von Trypsin, Endoproteinase Lys C, Endoproteinase Arg C oder Chymotrypsin, vorzugsweise Trypsin, Endoproteinase Lys C oder Endoproteinase Arg C, und am meisten bevorzugt Trypsin, zu verdauen. Trypsin, Endoproteinase Lys C und Endoproteinase Arg C sind bevorzugt, da die erzeugten Peptide des Polypeptids typischerweise am C-Terminus mit einem Arginin- oder Lysinrest (basische Reste), natürlich mit der Ausnahme des ursprünglichen C-Terminus des Polypeptids, enden. Weiterhin sind andere Enzyme geeignet, insbesondere falls basische Reste am oder nahe des C-Terminus der erzeugten Peptide auftreten. Chymotrypsin, welches typischerweise an hydrophoben Aminosäureresten schneidet, wird auch für die Digestion bevorzugt. Weiterhin ist die chemische Digestion anwendbar. Geeignet ist beispielsweise die Cyanbromiddigestion.
Das erfindungsgemäße Verfahren kann gemäß dem in Patterson et al., US-Patent Nr. 5,821,063, erteilt an PerSeptive Biosystems, Inc., Erteilung am 13. Oktober 1998 beschriebenen angepasst werden, insbesondere in Bezug auf die darin beschriebenen Digestionstechniken. Zum Beispiel kann eine Mehrzahl von Proben, die unterschiedliche Verhältnisse von Agens zu Polypeptid aufweisen, entsprechend der vorliegenden Erfindung verwendet und derivatisiert werden.
Jedoch ist eine Digestion nicht immer notwendig, insbesondere wenn kleine Polypeptide sequenziert werden (jedoch bestimmt nicht beschränkt darauf). Wie hierin verwendet, schließen "kleine" Polypeptide solche ein, welche vorzugsweise weniger als etwa fünfzig Aminosäurereste besitzen, noch bevorzugter weniger als etwa vierzig Reste, darüber hinaus weiter bevorzugt weniger als etwa dreißig Reste, und noch weiter bevorzugt weniger als etwa zwanzig Reste, am meisten bevorzugt weniger als etwa zehn Aminosäurereste.
Beispielsweise können Polypeptide charakterisiert werden, welche mittels bekannter Verfahren synthetisiert werden, eingeschlossen kombinatorische Chemieverfahren (ein "synthetisches PolyPpeptid"). In diesem Fall ist es am meisten bevorzugt, ein Polypeptid zu synthetisieren, welches basische oder hydrophobe Reste, vorzugsweise basische (am meisten bevorzugt Arginin oder Lysin) am oder nahe dem C-Terminus des erhaltenen Polypeptids besitzt.
Das Polypeptid (falls das Polypeptid ausreichend "klein" ist, wie hierin oben definiert) oder die Peptide des Polypeptids werden mit einer oder mehreren sauren Einheiten derivatisiert, die pKas von weniger als etwa 2, vorzugsweise weniger als etwa 0 und am meisten bevorzugt von weniger als etwa –2 (bei Kopplung mit dem Polypeptid oder den Peptiden) besitzen, um einen derivatisierten Analyt vorzusehen. Die sauren Einheiten des derivatisierten Analyts werden mittels Kopplung mit einem Reagens mit sauren Einheiten hergestellt. Das Reagens mit sauren Einheiten ist nicht beschränkt, unter der Voraussetzung, dass eine saure Einheit auf dem Polypeptid oder den Peptiden zu dem hierin beschriebenen pKa führt. Nicht beschränkende Beispiele für Reagenzien mit sauren Einheiten, die für die Kopplung verwendet verwendet werden können, schließen beispielsweise Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionat), S-Acetylmercaptosuccinsäureanhydrid, 2-Iminothiolan (welches auch als Trauts Reagens in Bezug genommen werden kann), Dithiodiglykolsäureanhydrid, Tetrafluorsuccinsäureanhydrid, Hexafluorglutarsäureanhydrid, Sulfosuccinsäureanhydrid, cyclisches 2-Sulfobenzoesäureanhydrid, Chlorsulfonylacetylchlorid und 1,3-Propansulton ein. Die Verwendung von Reaktionsmitteln, wie beispielsweise S-Acetylmercaptosuccinsäureanhydrid, 2-Iminothiolan und Dithiodiglykolsäureanhydrid, erfordern die Oxidation nach der Derivatisierung mit dem Peptid, um die saure Einheit zu erzeugen. Reagenzien mit sauren Einheiten, die den Oxidationsschritt nicht voraussetzen, schließen beispielsweise Tetrafluorsuccinsäureanhydrid, Hexafluorglutarsäureanhydrid, Sulfosuccinsäureanhydrid, cyclisches 2-Sulfobenzoesäureanhydrid und Chlorsulfonylacetylchlorid ein. Diese Reaktionsmittel sind oftmals bedingt durch eine wirksamere Synthese und/oder das Fehlen der verkomplizierenden Oxidation labiler Reste innerhalb des Polypeptids oder der Peptide daraus bevorzugt. Die Kopplung eines Reagens mit sauren Einheiten an den N-Terminus eines Cystein enthaltenden Peptids, gefolgt von einer Oxidation der Cysteinsulfhydrylgruppe zu Cysteinsäure ist eine Möglichkeit, Peptide zu erzeugen, die zwei saure Einheiten (Sulfonsäuren) enthalten.
Die sauren Einheiten sind am meisten bevorzugt eine Sulfonsäure. Innerhalb dieser schließen die bevorzugteren sauren Funktionen die 2-Sulfoacetyl-Einheit, 3-Sulfopropionyl-Einheit und 2-Sulfobenzoyl-Einheit ein.
Weiterhin ist die Verwendung von Disulfonsäurederivaten bevorzugt. Die Verwendung der Disulfonsäurederivate führt vorzugsweise dazu, dass beide Sulfonsäuregruppen nahe dem N-Terminus des Peptids vorliegen. Beispielsweise stellt die Kopplung eines Reagens mit sauren Einheiten an den N-Terminus eines Cystein enthaltenden Peptids, gefolgt von der Oxidation der Cysteinsulfhydrylgruppe, zu Cysteinsäure eine Möglichkeit zur Erzeugung von Peptiden, welche zwei saure Einheiten besitzen (Sulfonsäuren) dar.
Der Fachmann wird in der Lage sein, die relativ einfachen Kopplungsverfahren, die von der vorliegenden Erfindung vorausgesetzt werden, durchzuführen. Jedoch werden zum Zwecke der Einfachheit nicht beschränkende Beispiele der Derivatisierung von Polypeptiden oder Peptiden des interessierenden Polypeptids im folgenden veranschaulicht:
Beispiel 1
Cyclisches 2-Sulfobenzoesäureanhydrid (kommerziell erhältlich von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) wird auf eine Konzentration von 0,1 M in wasserfreiem Tetrahydrofuran vor der Verwendung hergestellt. Das Polypeptid ASHLGLAR (1 nMol, kommerziell erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (SEQ ID NR: 1) wird in 20 μl 0,05 M Trimethylamin gelöst. Die Lösung von cyclischem 2-Sulfobenzoesäureanhydrid (2 μl) wird zugegeben und die Reaktionsmischung für 30 Sekunden gevortext. Die Reaktion erfolgt bei Raumtemperatur über ungefähr 2 Minuten vor dem Verdünnen des sich ergebenden derivatisierten Analyts und der Massenspektrumanalyse. Die Konzentration des Reagens mit sauren Einheiten wird um einen Faktor von bis zu 100 verringert, falls kleinere Mengen derivatisiert werden.
Beispiel 2
ASHLGLAR (1 nMol, kommerziell erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (SEQ ID NR: 1) wird mit 2 μl 0,02 M Sulfoessigsäure gemischt, die wiederum durch Mischen von 2 μl reinem Chlorsulfonylacetylchlorid (kommerziell erhältlich von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) mit 500 μl Wasseer erzeugt wird. Die Mischung wird getrocknet und anschließend in 20 μl Tetrahydrofuran:Diisopropylethylamin (4:1 V:V) aufgenommen. 0,1 M Chlorsulfonylacetylchlorid (2 μl, kommerziell erhältlich von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) in trockenem Tetrahydrofuran wird zugegeben und die Mischung für 30 Sekunden gevortext. Die Derivatisierungsreaktion vollzieht sich bei Umgebungstemperatur über ungefähr zwei Minuten. Das derivatisierte Analyt wird getrocknet, in 20 μl Wasser aufgenommen und vor der Massenspektrumanalyse weiter verdünnt. Chlorsulfonylacetylchlorid ist weiterhin ein sehr nützliches Reaktionsmittel für die Derivatisierung von Isolaten aus 2D-Gel, jedoch führt ein modifiziertes Syntheseverfahren zu konsistenteren Produktausbeuten. Das modifizierte Verfahren wird in Beispiel 14 diskutiert.
Beispiel 3
S-Acetylmercaptosuccinsäureanhydrid (kommerziell erhältlich von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) wird vor Verwendung auf eine Konzentration von 0,1 M in wasserfreiem Tetrahydrofuran hergestellt. ASHLGLAR (1 nMol, kommerziell erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (SEQ ID NR: 1) wird in 20 μl 0,05 M Trimethylamin gelöst. Die S-Acetylmercaptosuccinsäureanhydrid-Lösung (5 μl) wird zugegeben und die Reaktionsmischung für 30 Sekunden gevortext. Die Reaktion erstreckt sich bei Raumtemperatur über etwa 2 Minuten und wird anschließend mit 10 μl Ameisensäure (88 %): H₂O₂ (30 %), hergestellt in einem Verhältnis von 19:1 (V:V), oxidiert. Die Oxidation erstreckt sich bei Raumtemperatur über 16 Stunden, und die Probe wird vor dem Verdünnen und der Massenspektrumanalyse getrocknet. Die Konzentration des Reagens mit sauren Einheiten wird um einen Faktor von bis zu 100 verringert, falls kleinere Mengen derivatisiert werden.
Beispiel 4
Zu ASHLGLAR (1 nMol, kommerziell erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (SEQ ID NR: 1) in 0,1 M Trimethylamin (20 μl) wird 2-Iminothiolan (Trauts Reagens, kommerziell erhältlich von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) (3 μl, 0,1 M in entionisiertem Wasser) gegeben. Die Reaktion erstreckt sich bei Raumtemperatur über 5 Minuten. Das Produkt wird mit 3 μl Ameisensäure (88 %) : H₂O₂ (30 %), hergestellt in einem Verhältnis von 19:1 (V:V) oxidiert. Die Oxidation erstreckt sich bei Raumtemperatur über 5 Minuten und das derivatisierte Analyt wird vor der Massenspektrumanalyse getrocknet.
Beispiel 5
Das Polypeptid CDPGYIGSR (kommerziell erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (SEQ ID NR: 2) wird mittels Mischen von 1 bis zu 5 nM Polypeptid (in 5 – 20 μl Wasser) mit 10 μl Ameisensäure (88 %) : H₂O₂ (30 %), hergestellt in einem Verhältnis von 19:1 (V:V) oxidiert. Die Oxidation erstreckt sich bei Raumtemperatur über 30 Minuten und das derivatisierte Analyt wird vor der Massenspektrumanalyse getrocknet.
Beispiel 6
Dithiobis(sulfosuccinimidylpropionat) (DTSSP) (kommerziell erhältlich von Pierce Chemical Co., Rockford, IL) wird in Phosphat-gepufferter Salzlösung bei 50 nM /20 μl aufgenommen und der pH mit 1N NaOH auf 7,7 eingestellt. Die Lösung (20 μl) wird zu 1 μl des Peptids HLGLAR (bei 1 nM/μL) (SEQ ID NR: 3) gegeben und für 30 Minuten zur Reaktion gebracht. Die Reaktion wird mit Tris-hydroxymethyl-aminomethan (0,1 M, 20 μl) gestoppt. Die Probe wird entsalzt und mit 10 μl Ameisensäure (88 %) : H₂O₂ (30 %), hergestellt in einem Verhältnis von 19:1 (V:V), oxidiert. Die Oxidation erstreckt sich bei Raumtemperatur über 30 Minuten und das derivatisierte Analyt wird vor der Massenspektrumanalyse getrocknet.
Beispiel 7
Dithiodiglykolsäure (0,93 g, 5,1 mMol, kommerziell erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) (alternativ dazu kann ein Polymer oder Anhydrid daraus (cyclisch oder acyclisch) verwendet werden) wird in Dichlormethan (20 ml) gelöst und unter eine inerte Atmosphäre verbracht. Dicyclohexylcarbodiimid (1,05 g, 5,1 mMol) wird in einem Schritt komplett zugegeben. Nach etwa 96 Stunden wird das Präzipitat mittels Filtration entfernt und das Filtrat im Vakuum konzentriert. Das sich ergebende Material wird in Diethylether aufgenommen und filtriert. Das Filtrat wird erneut im Vakuum konzentriert, um Dithiodiglykolsäureanhydrid vorzusehen.
Dithiodiglykolsäureanhydrid (die cyclische Form wird in diesem Beispiel gezeigt) wird vor der Verwendung in einer Konzentration von 0,1 M in trockenem Tetrahydrofuran hergestellt. ASHLGLAR (1 nMol) (SEQ ID NR: 1) wird in 20 μl 0,05 M Trimethylamin verdünnt. Die Dithiodiglykolsäureanhydridlösung (5 μl) wird zugegeben und die Reaktionsmischung für 30 Sekunden gevortext. Die Reaktion erstreckt sich bei Raumtemperatur über etwa zwei Minuten. Das sich ergebende Produkt wird mit 2 μl Ameisensäure (88 %) : H₂O₂ (30 %), hergestellt in einem Verhältnis von 19:1 (V:V), oxidiert. Die Oxidation erstreckt sich bei Raumtemperatur über 30 Minuten und das derivatisierte Analyt wird vor der Massenspektrumanalyse getrocknet. Die Konzentration des Reagens mit sauren Einheiten wird um einen Faktor von bis zu 100 verringert, falls kleinere Mengen derivatisiert werden.
Beispiel 8
3-Sulfopropionsäureanhydrid wird vor der Verwendung in einer Konzentration von 0,1 M in wasserfreiem Tetrahydrofuran hergestellt. ASHLGLAR (1 nMol) (SEQ ID NR: 1) wird in 20 μl Tetrahydrofuran:Diisopropylethylamin 4:1 (V:V) verdünnt. Die 3-Sulfopropionsäureanhydridlösung (2 μl) wird zugegeben und die Reaktionsmischung für 30 Sekunden gevortext. Die Reaktion erstreckt sich bei Raumtemperatur vor Verdünnen und Massenspektrumanalysen über etwa zwei Minuten. Die Konzentration des Reagens mit sauren Einheiten wird um einen Faktor von bis zu 100 verringert, falls kleinere Mengen derivatisiert werden.
Beispiel 9
Tetrafluorsuccinsäureanhydrid wird vor der Verwendung in einer Konzentration von 0,1 M in wasserfreiem Tetrahydrofuran hergestellt. ASHLGLAR (1 nMol) (SEQ ID NR: 1) wird in 20 μl 0,05 M Trimethylamin gelöst. Die Tetrafluorsuccinsäureanhydridlösung (2 μl) wird zugegeben und die Reaktionsmischung für 30 Sekunden gevortext. Die Reaktion erstreckt sichbei Raumtemperatur vor Verdünnen und Massenspektrumanalysen über ungefähr zwei Minuten. Die Konzentration des Kopplungsmittels wird um einen Faktor von ungefähr 100 verringert, falls kleinere Mengen derivatisiert werden.
Beispiel 10
Das Polypeptid CDPGYIGSR (kommerziell erhältlich von Sigma Chemical Company, St. Louis, MO) (SEQ ID NR: 2) wird mit 2 μl 0,02M Sulfoessigsäure gemischt, die durch Mischen von 2 μl reinem Chlorsulfonylacetylchlorid (kommerziell erhältlich von Aldrich Chemical Co., Milwaukee, WI) mit 500 μl Wasser erzeugt wird. Die Mischung wird getrocknet und in 20 μl Tetrahydrofuran:Diisopropylethylamin (4:1, V/V) aufgenommen. 0,1 M Chlorsulfonylacetylchlorid (2 μl in wasserfreiem Tetrahydrofuran wird zugegeben und die Mischung für 30 Sekunden gevortext. Die Derivatisierungsreaktion vollzieht sich bei Umgebungstemperatur über etwa 2 Minuten. Das derivatisierte Analyt wird getrocknet und in 10 μl Wasser aufgenommen. Zu dieser Lösung werden 10 μl Ameisensäure (88 %) H₂O₂ (30 %), hergestellt in einem Verhältnis von 19:1 (V:V), gegeben. Die Oxidation erstreckt sich bei Raumtemperatur über 5 Minuten, wodurch das derivatisierte Peptid erzeugt wird, das zwei Sulfonsäuregruppen nahe dem N-Terminus aufweist.
Analyse unter Verwendung der Massenspektrometrie-Technik
Nach der Derivatisierung wird das Polypeptid oder eines oder mehrere Peptide des Polypeptids unter Verwendung der Massenspektrometrie-Technik analysiert. Während die verwendete Technik nicht beschränkt ist, sind bevorzugte Techniken die Post-source-Decay (PSD) Matrix-unterstützte Laserdesorptionsionisierung (MALDI) und Elektrospray-Ionisierungs-Tandemmassenspektrometrie. Vgl. beispielsweise Spengle et al., "Peptide Sequencing by Matrix-assisted Laserdesorption Mass Spectrometry", Rapid Communications in Mass Spectrometry, Bd. 6, S. 105 – 108 (1992); Spengler et al., "Fundamental Aspects of Postsource Decay in Matrix-Assisted Laser Desorption Mass Spectrometry", Journal of Physical Chemistry, Bd. 96, S. 9678 – 9684 (1992); Kaufmann et al., "Mass Spectrometric Sequencing of Linear Peptides by Product-ion Analyss in a Reflectron Time-of-flight Mass Spectrometer Using Matrix-assisted Laser Desorption Ionization", Rapid Communications in Mass Spectrometry, Bd. 7, S. 902 – 910 (1993); Kaufmann et al., "Sequencing of Peptides in a Time-of-flight Mass Spectrometer: Evaluation of Postsource Decay Following Matrix-assisted Laser Desorption Ionization (MALDI), International Journal of Mass Spectrometry and Ion Processes, Bd. 131, S. 355 – 385 (1994); Kaufmann et al., "Post-source Decay and Delayed Extraction in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization-Reflectron Time-of-Flight Mass Spectrometry", Rapid Communications in Mass Spectrometry, Bd. 10, S. 1199 – 1208 (1996); und Spengler, "Post-source Decay Analysis in Matrix-assisted Laser Desorption/Ionization Mass Spectrometry of Biomolecules", Journal of Mass Spectrometry, Bd. 32, S. 1019 – 1036 (1997); Carr et al., "Integration of Mass Spectrometry in Analytical Biotechnology", Analytical Chemistry, Bd. 63, S. 2802 – 2824 (1991); Yates III et al., "Mining Genomes With MS", Analytical Che mistry, Bd. 68 , S. 534A – 540A (1996); Morris et al., "High Sensitivity Collisionally Activated Decomposition Tandem Mass Spectrometry on a Novel Quadrupole/Orthagonal Acceleration Time-of-Fligth Mass Spectrometer", Rapid Communications in Mass Spectrometry, Bd. 10, 889 – 896 (1996). Am meisten bevorzugt sind die angewendeten Techniken, die positive Ionen-Modus PSD MALDI und Elektrospray-Ionisierungs-Tandemmassenspektrometrie. Einfachheitshalber beschreiben die Beispiele 11 und 12 unten, massenspektrometrische Techniken, die zur Analyse des Polypeptids oder der Peptide daraus verwendet werden können.
Wie die Erfinder der vorliegenden Erfindung überraschend herausgefunden haben, ergeben geeignet derivatisierte Peptide oder Peptide des Polypeptids MSMS Spektren, welche hauptsächlich durch y-Ionen charakterisiert sind. Wie im Stand der Technik bekannt ist, weisen y-Ionen auf ionisierte Fragmente hin, welche den ursprünglichen C-Terminus des Polypeptids oder Peptids enthalten. Wie hierin verwendet, umfasst der Begriff "y-Ion" weiterhin (y-NH3)-Ionen; zur Veranschaulichung: unvollständige Digestionsprodukte, die (beispielsweise) einen zweiten basischen Rest enthalten, führen oftmals zu vermehrten (y-NH3)-Ionen. Vorzugsweise sind die durch dieses Verfahren erzeugten Spektren im wesentlichen frei von a-Ionen und b-Ionen. A-Ionen und b-Ionen werden durch Spaltungen beiderseits der Hauptketten-Carbonylgruppen gebildet. Im wesentlichen wird die Ladung mit dem N-terminalen Fragment mit a-Ionen und b-Ionen erhalten. Wie hierin verwendet, bedeutet der Begriff "im wesentlichen frei von" in Bezug auf a-Ionen und/oder b-Ionen, dass im Vergleich zu der dominanten y-Ionenreihe, a-Ionen und b-Ionen eine gemeinsame relative Häufigkeit von weniger als etwa 20 %, vorzugsweise weniger als etwa 10 % und am meisten bevorzugt weniger als etwa 5 % besitzen.
Gemäß dem erfindungsgemäßen Verfahren ist es nicht notwendig, alle Digestionsprodukte zu analysieren und/oder zu identifizieren, um das Polypeptid daraus zu identifizieren, insbesondere falls die Sequenz des Polypeptids sich in einer Sequenzbibliothek finden läßt.
Beispiel 11 – PSD MALDI Sequenzierungstechnik
Bei diesem Beispiel wird die Massenspektrometrietechnik auf einem Voyager DE-RP oder Voyager DE-STR (PerSeptive Biosystems, Inc., Framingham, MA) (oder einem geeigneten Äquivalent) durchgeführt, das mit einem N2-Laser (337 nm, 3 nsec Pulsbreite, 20 Hz Wiederholungsrate) ausgestattet ist. Die Massenspektren werden im Reflektronmodus bei verzögerter Extraktion aufgezeichnet. Die externe Massenkalibrierung wird mit einem Peptidstandard niedriger Masse durchgeführt, und die Genauigkeit der Massenbestimmung liegt typischerweise bei ± 0,3 Da. Das derivatisierte Polypeptid oder die Peptide werden auf etwa 10 pM/μl in 0,1 % Trifluoressigsäure (TFA) verdünnt. Die Proben werden anschließend fünffach bis zehnfach in a-Cyano-4-hydroxycinnamonsäure (alphaCN) weiter verdünnt, welche mittels Auflösen von 10 mg in 1 ml wässrigem, 50 %-igem Acetonitril, enthaltend 0,1 % TFA hergestellt wird. Vgl. beispielsweise Beavis et al., "a-Cyano-4-hydroxycinnamic Acid as a Matrix for Matrix-assisted Laser Desorption Mass Spectrometry", Organic Mass Spectrometry, Bd. 27, S. 156 – 158 (1992). Gelisolate werden ausgehend von dünnen Filmoberflächen von a-Cyano-4-hydroxycinnamonsäure/Nitrocellulose (alphaCN/NC) analysiert, hergestellt durch das Schnellverdampfungsverfahren. Vgl. beispielsweise Arnott et al., "An Integrated Approach to Proteome Analysis: Identification of Proteins Associated with Cardiac Hypertrophy", Analytical Biochemistry, Bd. 258, S. 1 – 18 (1998).
PSD MALDI Tandemmassenspektren für das derivatisierte Analyt werden nach Isolierung des geeigneten Vorläuferions unter Verwendung der ...... Ionenselektion aufgezeichnet. Die derivatisierten Analyte können unter Verwendung einer Vielzahl von MALDI-Matrizen analysiert werden, eingeschlossen, jedoch nicht beschränkt auf alphaCN, alphaCN/NC und 2,5-Dihydroxybenzoesäure (DHB). Fragmentionen werden auf den Enddetektor mittels Abstufen der dem Reflektron zugeführten Spannung refokussiert. Typische verwendete Spannungsverhältnisse sind wie folgt: 1,0000 (Vorläuferionensegment), 0,9126, 0,6049, 0,4125, 0,2738, 0,1975 und 0,1213 (Fragmentsegmente). Die einzelnen Segmente werden unter Verwendung von Software, die kommerziell von PerSeptive Biosystems, Framingham, MA erhältlich ist ("PSD" wird im Analysefenster angewäht) zusammengeführt (oder "miteinander vermascht", wie es im Stand der Technik heißt). Alle Vorläuferionensegmente werden bei niedriger Laserleistung aufgezeichnet (einstellbares Dämpfungsglied = 1450) für < 256 Laserpulse, um die Sättigung des Detektors zu verhindern. Die Laserleistung wird (einstellbares Dämpfungsglied = 1650) für die verbleibenden Segmente der PSD MALDI-Aufzeichnungen erhöht. Typischerweise werden 256 Laserpulse für jedes Fragmentionensegment benötigt. Die Daten werden bei einer Digitalisierungsrate von 20 MHz aufgezeichnet.
Beispiel 12 – Elektrospray-Ionisierungstandem-massenspektrometrische Sequenzierungstechnik
Bei diesem Beispiel werden die Massenspektren unter Verwendung eines kapillaren LC-Systems (Perkin Elmer Biosystems, Foster City, CA), gekoppelt an ein LCQ-Ionenfallenmassenspektrometer (ThermoQuest, San Jose, CA) ausgestattet mit einer selbstgebauten Mikroelektronensprayquelle (uES) aufgezeichnet. Eine 0,5 × 150 mm C18 LC-Säule (Perkin Elmer Biosystems, Foster City, CA) wird mit einer Durchflussgeschwindigkeit von 5 μl/min verwendet. Die mobilen Phasen der LC sind Wasser und Acetonitril, wobei beide 0,02 % TFA enthalten. Ein typischer Gradient ist 15 % Acetonitril über 5 Minuten, anschließend 15 – 60 % Acetonitril über 40 Minuten. Durchflussgeschwindigkeiten von 0,5 μl/min zur uES-Quelle und 4,5 μl/min zu einem UV-Detektor werden mittels Plazieren eines Trennungs-T-Stücks (1 / 16", 0,25 mm Öffnung, Valco, Houston, TX) nach der LC-Säule erzielt. Die derivatisierten Peptid- oder Polypeptidproben werden mit einem Autosampler auf die LC-Säule aufgebracht (ALCOTT, Modell 719, Norcross, GA). Die uES-Quelle befindet sich auf einem X,Y,Z-Mikrometer (New Focus, Inc., Santa Clara, CA), das an der Vorderseite des Geräts angebracht ist. Die Mikroelektrospraynadel ist eine PicoTip (FS360-50-15D) von New Objective (Cambridge, MA).
Die Elektrospray-Tandemmassenspektren werden unter Verwendung der folgenden Geräteeinstellungen aufgezeichnet: Sprühnadelspannung 1,5 kV, Kapillarheiztemperatur 200°C und Kollisionsenergie 35 eV. Bei jedem vollständigen MS-Scan wird ein Massebereich von 300 – 2000 m/z verwendet. Die Elektrospray-Tandemmassenspektren werden unter Verwendung eines Datenabhängigem Scannvorgangs im "Triple-play"-Modus aufgezeichnet, der aus drei aufeinanderfolgenden Mikroscanvorgängen besteht: I) vollständiger MS-Scan, 2) Zoom auf ausgewählte Ionen, um die Ladungszustände zu bestimmen und 3) MS/MS-Scanvorgänge geeigneter Ionen, ausgewählt aus den Zoomscanvorgängen. Diese drei Scanereignisse werden während des LC-Laufs wiederholt.
Interpretation des Fragmentationsmusters
Das durch die massenspektrometrische Analyse erzeugte Fragmentationsmuster wird ausgewertet, um das Polypeptid zu sequenzieren. Ein Fachmann auf dem Gebiet der Massenspektrometrie wird in der Lage sein, die Fragmentationsmuster kleiner Polypeptide de novo von Hand ohne Zuhilfenahme von kommerziell erhältlicher Software oder von Sequenzbibliotheken zu interpretieren. Demgemäß wird der Fachmann weiterhin fähig sein, die Peptide der Polypeptide (Digestionsprodukte) de novo zu sequenzieren. Alternativ dazu kann der Fachmann bekannte Hilfsmittel für die Interpretation verwenden, eingeschlossen beispielsweise kommerziell erhältliche Software oder Sequenzbibliotheken.
Zum Beispiel werden Sequenzen des Polypeptids oder der Peptide daraus effizient und genau mit dem y-Ionenfragmentationsmuster bestimmt, welches mittels dieser Erfindung erzeugt wird. Die Identifizierung einzelner Aminosäurereste kann de novo mittels Messen der Massenunterschiede zwischen sich benachbarten Mitgliedern in den y-Ionenreihen erreicht werden. Die Identifizierung wird sodann durch Vergleichen der gemessenen Massenunterschiede mit den bekannten Massen von Aminosäureresten (vgl. Tablle I, oben) erreicht. Zum Bei spiel korrespondiert eine gemessene Massendifferenz von 71,1 Da zu Alanin. Die Leserichtung wird weiterhin direkt aus dem Massenspektrum abgeleitet. Die Richtung verläuft vom C-Terminus zum N-Terminus, wenn von niedriger Masse zu hoher Masse gemessen wird. Die Leserichtung verläuft vom N-Terminus zum C-Terminus, falls von hoher Masse zu niedriger Masse gemessen wird.
Die Sequenzen des Polypeptids und der Peptide daraus kann weiterhin effizient und genau unter Verwendung von Software, welche Massenspektrum-Fragmentationsdaten, entweder uninterpretierte y-Ionenreihenmassen oder Sequenzkennungen, abgeleitet aus den y-Ionenmassen, als Eingaben für Sequenzbibliotheksuchen verarbeitet, bestimmt werden. Solche Suchsoftware, welche üblicherweise vom Fachmann verwendet wird, schließt ein, ist jedoch nicht beschränkt auf "Protein Prospector" (kommerziell erhältlich von der University of California in San Francisco oder http://prospector.ucsf.edu) und "Peptide Search" (kommerziell erhältlich vom European Molecular Biology Laboratory in Heidelberg, Deutschland oder http:/www.-mann.embl-heidelberg.de).
Eine Anzahl von Sequenzbibliotheken kann mit den durch diese Erfindung erzeugten Fragmentationsmustern durchsucht werden einschließlich, jedoch nicht beschränkt auf die NCBI-non-redundant Bibliothek (ncbi-nlm.nih.gov/blast/db.nr.z), SWISPROT (ncbi.nlm.gov/repository/SWISSPROT/sprot33.dat.z), EMBL (FTP://ftp.ebi.ac.uk/pub/databases/peptidseearch/), OWL (ncbi.nlm.nih. gov/repository/owl/FASTA.z), dbEST (ncbi.nlm.nih.giv/repository/dbEST/db EST.weekly.fasta.mmddyy.z) und Genebank (ncbi.nlm.nih.gov/genebank/gen pept.fsa.z). Die Gesamtsequenz des zu untersuchenden Polypeptids kann oftmals aus den Sequenzbibliotheken mittels Suchen nach den Fragmentationsdaten, die durch ein oder mehrere der relevanten, durch die erfindungsgemäßen Verfahren gebildeten Peptidderivate erzeugt werden, gewonnen werden.
Natürlich ist es, falls Datenbanksuchtechniken verwendet werden, am effizientesten, die Suche durch die Spezifikation zu begrenzen, dass nur y-Ionen oder (y-NH3)-Ionen erlaubte Fragmente sind, da y- und (y-NH3)-Ionen die am häufigsten vorliegenden beobachteten Spezies in den Fragmentationsmustern der vorliegenden Verfahren sind. Andere Innenfragment-Typen, wie a-, b- (b+H2O), (b-H2O), (b-NH3) und interne Spaltungsionen können ausgeschlossen werden, da diese selten in den Spektren der, unter Verwendung der erfindungsgemäßen Verfahren derivatisierten, Peptide vorliegen. Derivate, welche mittels der vorliegenden Erfindung gebildet werden, sehen einfache Fragmentationsmuster vor, die oftmals eine größere Datenbanksuchspezifität erbringen, als dies durch Spektren derselben Peptide ohne Derivatisierung erhalten werden kann.
Die erfindungsgemäßen Verfahren werden weiter durch die folgenden nicht beschränkenden Beispiele veranschauchlicht. In diesen Beispielen wird der Fachmann erkennen, dass die Zahl der erzeugten "Proteinkandidaten" von den hierin offenbarten abweichen kann, da kontinuierlich neue Proteine den Datenbanken hinzugefügt werden.
Beispiel 13
Die PSD MALDI-Tandemmassenspektrometrie von Polypeptiden mit hoher Masse wird mit oxidiertem Insulin B-Kette demonstriert FVNQHLC(SO₃H)GSHLVEALYLVC(SO₃H)GERGFFYTPKA (SEQ ID NR: 4) (MM-berechnet = 3495,9 Da) (kommerziell erhältlich von Sigma Chemical Co., St. Louis, MO). Die Masse dieses Polypeptids überschreitet bei weitem die obere Grenze der meisten herkömmlichen Triplequadrupol-Geräte. Das Tandemmassenspektrum des nativen Polypeptids zeigt eine relativ starke Ionenreihe, bestehend hauptsächlich aus y-Ionen. Alle y-Ionen zwischen y9 und y24 sind stark vertreten. Die Sequenz-spezifischen Fragmente, die den N-Terminus des Moleküls definieren, y25 bis y29, fehlen in dem Spektrum.
Das Spektrum dieses Polypeptids wird durch die Derivatisierung unter Verwendung des Reagens mit sauren Einheiten cyclisches Sulfobenzoesäureanhydrid (kommerziell erhältlich von Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO) verbessert. Das derivatisierte Polypeptid zeigt eine signifikante Verstärkung der y-Ionen, abgeleitet von der N-terminalen Region des Moleküls (y25, y26, y27, y28 und y29). Eine vollständige Reihe von y-Ionen von y8 bis y29 wird nach Derivatisierung beobachtet. Es werden keine auffallenden b-Ionen detektiert.
Beispiel 14
Ein mittels zweidimensionaler Gelelektrophorese getrenntes Polypeptid wird im Gel mit Trypsin verdaut, um Peptide des Polypeptids zu erzeugen. Die Peptide zeigen einige starke MH+-Signale im MALDI, eingeschlossen Ionen bei einem m/z von 1060,8, 1090,8, 1271,0, 1299,0, 1312,0, 1344,0, 1399,1, 1450,1, 1460,1 und 1794,4. Das Durchsuchen der Datenbanken unter Verwendung der Protein Prospector Software nach Einträgen in der NCBI-Proteinsequenzbibliothek erzeugt eine Liste von einundvierzig Proteinkandidaten, welche fünf oder mehr der eingegebenen tryptischen Massen (Suchparameter: MW-Bereich 1.000 bis 150.000, isoelektrischer Punkt von 3,0 bis 10,0, oxidiertes Met, erlaubt als eine Nebenreaktion und konservative Massentoleranz von +/– 0,6 Da) entsprechen.
Die Peptide des Polypeptids können mit einem oder mehreren der in den vorstehenden Beispielen beschriebenen Reaktionsmitteln derivatisiert werden. Diese schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, cyclisches 2-Sulfobenzoesäureanhydrid, 3-Sulfopropionsäureanhydrid oder Chlorsulfonylacetylchlorid. In diesem Beispiel wird Chlorsulfonylacetylchlorid als das Reagens mit sauren Ein heiten verwendet. Das Derivatisierungsverfahren für Niedrigmengenpeptide, welche aus einer 2D Gelelektrophorese isoliert werden, wird angepasst, um die Reproduzierbarkeit und Derivatausbeuten zu verbessern. Typischerweise wird das aus dem 2D Gel extrahierte Peptid auf einer Speedvac bis fast zur Trockenheit konzentriert (5 bis 10 μl). Die Konzentrate werden mit 15 μl 0,1 %-iger TFA angesäuert und mittels kommerziell erhältlicher C18-Minisäulen gereinigt (ZipTip^TM, Millipore Corporation, Bedford, MA 01730). Die reinigte Probe wird auf einer Speedvac getrocknet und in 10 μl Basis aufgenommen (THF : DIEA 19:1 V/V). Bei diesem Beispiel werden 2 μl einer Chlorsulfonylacetylchloridlösung (2 μl der reinen Flüssigkeit in 1 ml THF) zugegeben und die Reaktion erfolgt über 1 bis 2 Minuten bei Raumtemperatur. Die derivatisierten Proben werden wieder auf einer Speedvac getrocknet und in 10 μl 0,1 % TFA vor der Analyse rekonstituiert. An diesem Punkt kann die Probe mit MALDI-Matrix gemischt werden und ein Teil auf den Probentisch zur Analyse geladen werden, oder sie kann nochmals mittels Verwendung einer kommerziell erhältlichen C18-Minisäule (ZipTipTM, Millipore Corporation) aufgereinigt werden. Die aufgereinigte Probe kann anschließend direkt aus der ZipTip auf den MALDI-Probentisch in einem 1 – 2 μl Volumen von Acetonitril : 0,1 % TFA (I:I, V/V) enthaltend 10 mg/ml MALDI-Matrix, eluiert werden. Dieses letztere Verfahren erlaubt die Beladung der gesamten gewonnenen Derivate auf den MALDI-Probentisch zur Analyse, wodurch die Gesamtempfindlichkeit des Verfahrens verbessert wird. Das derivatisierte Peptid, welches etwa 1572 Da wiegt, wird der PSD MALDI-Tandemmassenspektrometrie unterworfen. Eine Sequenzkennung wird erhalten mit y-Ionen bei m/z 574,5, 661,7, 875,9, 1003,8, 1103,9, 1204,6, 1304,1, und dem (MH+-Derivat) Ion bei m/z 1451,0. Das Spektrum wird mit der Proteinsequenz-Datenbank verglichen, und sechs Proteinkandidaten (sämtliche mitochondrialen Aspartataminotransferasen) werden geefunden (Suchparameter: MW-Bereich 1.000 bis 150.000, Stammionenmassentoleranz +/– 0,6 Da, Ionenfragmentmassentoleranz +/– 2,5 Da, Par(mi)Frag(av), erlaubte Anzahl an fehlenden Ionen = 1). Dieser Grad an Spezifität wird erreicht, da die Datenbanksuche gezwungenermaßen nur y-Ionen als einzig erlaubte Fragmente ausgibt. Diese Suchbeschränkung ist möglich, da N-terminale und interne Spaltungsionen in den Massenspektren dieser Derivate nicht auftauchen (aufgrund der Derivatisierung gemäß der vorliegenden Erfindung). Weitaus geringere Spezifität wird erhalten (239 ausgegebene Proteinkandidaten), wenn dasselbe Tandemmassenspektrum mit der gesamten Bibliothek verglichen wird und alle Fragmentionentypen (a, b, (b + H2O), (b – NH3), (b – H2O), interne und y) erlaubt werden. Das identifizierte Peptid war FVTVQTISGTGALR (SEQ ID NR: 5).
Die Bestätigung der Proteinidentifizierung erfolgt mittels PSD MALDI des Derivats, das etwa 1916 Da wiegt. Das Spektrum enthält 7 Fragmentionen bei m/z 724,6, 1154,2, 1299,3, 1439,0, 1551,9, 1665,5 und 1779,2, zusätzlich zu den protonierten Vorläuferinnen. Dieses Spektrum wird mit der Datenbank verglichen, wobei angenommen wird, dass die Fragmente y-Ionen sind. Die Suche führt nicht zu mitochondrialer Aspartataminotransferase oder irgendeinem anderen Proteinkandidaten. Bei der Durchsuchung der Datenbank, wobei gleichermaßen y- und (y-NH3)-Ionen erlaubt sind, werden 16 Proteinkandidaten ausgegeben, wobei 10 davon mitochondriale Aspartataminotransferasen sind. Diese letztere Suche bestätigt die Proteinidentifizierung. Der Einschluss der (y-NH3)-Ionen als mögliche Fragmente wird für diese spezielle Suche benötigt, da das Peptid ein nicht vollständiges tryptisches Produkt (ILIRPLYSNPPLNGAR) (SEQ ID NR: 6) ist, welches einen zweiten Argininrest enthält. Wie oben angeführt, zeigt die Derivatisierung von nicht vollständig verdauten Produkten oftmals (y-NH3)-Fragmentionen in den PSD-Tandemmassenspektren.
Beispiel 15
Eine tryptische Digestion eines Proteins im Gel, welches durch eine 2D-Gelelektrophorese isoliert wurde, wird mittels LC-Elektrospray-Tandemmassenspektrometrie auf einer LCQ-Ionenfalle analysiert, gefolgt von Derivatisierung gemäß Beispiel 14 hierin. Alle Spektren werden in einem unbeaufsichtigten automatisierten datenabhängigen Modus unter Verwendung der "Triple play"-Sequenzen von Mikroscanvorgängen durchgeführt. Das Tandemmassenspektrum eines derivatisierten tryptischen Peptids (MH+ = 971,5) zeigt mehrere Produktionen vom y-Typ, eingeschlossen m/z 401,1, 538,3, 651,3, 750,4. Die gemessenen y-Ionen werden für die Suche in der Datenbank als Eingaben verwendet, zusammen mit der MH+ Masse des underivatisierten tryptischen Peptids (971,5 – 122 = 849,5). Die Durchsuchung der Datenbank unter Verwendung der Protein Prospector Software gegen die NCBI Proteinsequenzbibliothek führt zu 3 Proteinkandidaten (Suchparameter: MW-Gesamtbereich, Stammionentoleranz +/– 0,6 Da, Fragmentionentoleranz +/– 1,0 Da, monoisotopische Stamm- und Fragmentionen, weiterhin sind keine fehlenden Ionen erlaubt). Alle drei der durch die Datenbanksuche ausgegebenen Proteinkandidaten sind Haptoglobine. Das Peptid wurde als VVLHPER (SEQ ID NR: 7) identifiziert.
Die Bestätigung dieser Proteinidentifizierung erfolgt durch Durchsuchen der Datenbank unter Verwendung des aus einem zweiten derivatisierten Peptid erzeugten Tandemmassenspektrums (MH+ des Derivats = 771,4 Da). Das Spektrum zeigte einige Ionen, eingeschlossen y-Typ-Ionen bei m/z 322,1, 436,2 und 535,3. Dieselben Suchparameter, wie oben, wurden verwendet, drei Peptidse quenzen stimmten mit den eingegebenen Daten aus dem Elektrospray-Tandemmassenspektrum überein. Eine der drei Peptidsequenzen korrespondierte zu der von Haptoglobin. Das Peptid wurde als NVNFR (SEQ ID NR: 8) identifiziert. Dieses Ergebnis bestätigt die Identität des Proteins.
Beispiel 16
Das erfindungsgemäße Verfahren kann leicht verwendet werden, um variante Polypeptide zu identifizieren. Das MALDI-Massenspektrum eines tryptischen Verdaus eines Enzymisolats zeigt viele tryptische Massen, welche identisch sind zu denen der kommerziellen Protease Savinase^® (kommerziell erhältlich von Novo Nordisk, Copenhagen, Dänemark). Eines der erwarteten tryptischen Peptide GVLWAASGNSGAGSTSYPAR (MH+ = 1933 Da) (SEQ ID NR: 9) fehlt in dem Spektrum, und ein unbekanntes Ion wird bei m/z 1963 beobachtet. Dies legt nahe, dass das Isolat eine Savinase^®-Variante ist. Elf unterschiedliche einzelne Aminosäureaustausche könnten für die beobachtete + 30 Da-Massenverschiebung (4 G → S, 4 A → T und 3 V → E) verantwortlich sein. Das PSD MALDI-Tandemmassenspektrum wird nach der Derivatisierung, wie in Beispiel 2 hierin beschrieben, erhalten. Für das 21 Aminosäurepeptid wird eine vollständige Reihe von y-Ionen beobachtet. Das Spektrum bestätigt, dass das Glycin von Rest 14 zu einem Serin umgewandelt wird. Die Massen sämtlicher y-Ionen werden in diesem Spektrum gemessen. Das Spektrum wird automatisch unter Verwendung des Peptidleitersequenzierungsprogramms interpretiert, welches in das PerSeptive Biosystems MALDI-Datensystem eingebettet ist.
Beispiel 17
Die Verwendung von Disulfonsäurederivaten, mit beiden Sulfonsäuregruppen nahe dem N-Terminus des Peptids, wird durch den Vergleich der MALDI-PSD-Spektren, erzeugt aus CDPGYIGSR (SEQ ID NO: 2), derivatisiert gemäß Beispiel 5 und gemäß Beispiel 10 hierin, demonstriert. Das durch die Säureoxidation der Sulfhydrylgruppe des Cysteinrests (Beispiel 5) erzeugte Derivat wird unter Verwendung der PSD MALDI analysiert, ausgehend von einer Matrix von alpha-Cyano-4-hydroxycinnamonsäure. Das sich ergebende PSD-Spektrum wird von dem y7-Fragmention dominiert, gebildet durch Spaltung der labilen Asp-Pro-Amidbindung. y-Typ-Ionen niedriger Masse zeigen relativ geringe Häufigkeit. Beispielsweise liegen die Häufigkeiten für die y3- und y4-Ionen relativ zum y7-Ion nur bei etwa 8 % und 5 %, respektive (Peakhöhenverhältnisse). Ohne durch die Theorie beschränkt zu sein, wird angenommen, dass das "frei bewegliche" Ionisierungsproton vorzugsweise an dem basischen Asp-Pro-Amidstickstoffatom lokalisiert ist, da der Pro-Amidstickstoff basischer ist als die anderen Hauptketten-Amidgruppen. Es wird angenommen, dass diese Ladungslokalisierung zu einer vorzugsweisen Fragmentierung der Amidbindung zwischen Asp und protoniertem Pro führt. Dieses Problem wird durch die Anlagerung einer zweiten Sulfonsäuregruppe nahe dem N-Terminus des Peptids gemäß Beispiel 10 minimiert. Die Anlagerung einer zweiten Sulfonsäuregruppe bedarf des Anlagerns eines zweiten "frei beweglichen" Protons, um das positiv geladene Ion zur Verwendung für die MALDI PSD-Analyse zu erzeugen. Es wird wiederum angenommen, ohne sich durch die Theorie zu beschränken, dass dieses zweite Proton frei ist, um andere Hauptketten-Amidgruppen zu ionisieren, da die relative basische Pro-Gruppe schon ionisiert ist. Die Protonierung anderer Hauptketten-Amidgruppen führt zu einer verbesserten Fragmentation dieser Gruppen und einer erhöhten relativen Häufigkeit der korrespondierenden y-Ionen in dem MALDI PSD-Spektrum. Im PSD-Spektrum des gemäß Beispiel 10 gebildeten Derivats ist die Häufigkeit der y3- und y4-Ionen auf etwa 41 % und 57 % respektive (Peakhöhenverhältnisse), relativ zu der des y7-Ions erhöht.
Kits der vorliegenden Erfindung
Eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung sind Kits, welche verwendet werden können, um die Aminosäuresequenz eines Polypeptids zu bestimmen. Die Kits umfassen:

(a) ein oder mehrere Reagenzien mit sauren Einheiten, welche eine oder mehrere saure Einheiten mit pKas von weniger als 2 vorsehen bei Kupplung mit dem Polypeptid oder einem oder mehreren Peptiden des Polypeptids; und
(b) Mittel zur Derivatisierung des N-Terminus des Polypeptids oder der N-Termini eines oder mehrerer Peptide des Polypeptids mit einem oder mehreren Reagenzien mit sauren Einheiten.

Die Kits der vorliegenden Erfindung können auf ähnliche Art und Weise wie der Probenhalter für ein Massenspektrometer angepasst werden, beispielsweise beschrieben in Patterson, US-Patent Nr. 5,827,659, erteilt an PerSeptive Biosystems, Inc., Erteilung 27. Oktober 1998.
Wahlweise können die Kits weiterhin eines oder mehrere Verifizierungspeptide zum Testen, beispielsweise der Genauigkeit der Massenspektrometrietechnik, umfassen. Weiterhin können wahlweise Referenz-Massenspektrumdaten eingeschlossen sein.
Die Reagenzien mit sauren Einheiten, welche durch die Kits umfasst sein können, werden oben beschrieben.
Besonders bevorzugte Mittel zur Derivatisierung schließen solche ein, welche eine leichte Derivatisierung durch den Anwender oder irgendeine andere Person ermöglichen, die daran interessiert ist, das derivatisierte Polypeptid oder die Peptide zu erhalten. Ein besonders bevorzugtes Mittel zum Derivatisieren um fasst ein oder mehrere Behältnisvorrichtungen, um beispielsweise das Reagens mit sauren Einheiten zu enthalten und letztendlich das (die) interessierende(n) Polypeptid / Peptide.
Geeignete Behältnisvorrichtungen schließen beispielsweise Glasfläschchen, Röhren, Pipettenspitzen, Platten, Probenhalter und Mehrfach-Muldenplatten ein. Eine wahlweise Erleichterung wird dort vorgesehen, wo das Reagens mit sauren Einheiten innerhalb der Behältnisvorrichtung vorliegt, so dass es nicht durch den Anwender zugegeben werden muss. Beispielsweise kann das Reagens mit sauren Einheiten an der Innenseite einer Pipettenspitze vorliegen und aktiviert werden, wenn das Polypeptid oder die Peptide mit einem geeigneten Puffer in die Spitze gesaugt werden. Die Behältnisvorrichtung ist am meisten bevorzugt, jedoch nicht zwingenderweise, zum einmaligen Gebrauch bestimmt.
Das Reagens mit sauren Einheiten kann weiterhin auf einem festen Träger gebunden vorliegen. Beispielsweise kann das Reaktionsmittel trägergebunden in einer Pipettenspitze vorliegen. Das zu untersuchende Polypeptid oder die Peptide können in einem geeigneten Puffersystem aufgenommen werden und wiederholt über das gebundene Reaktonsmittel gezogen werden. Nach der Reaktion kann eine geeignete Menge des derivatisierten Folypeptids oder der Peptide direkt auf den MALDI Massenspektrometer-Probentisch geladen werden oder in eine Elektrospray-Ionisierungsmassenspektrometerie-Vorrichtung gespritz werden.
Weiterhin kann ein oder mehrere Puffersysteme, welche zur Erleichterung der Derivatisierung verwendet werden, in die Kits der vorliegenden Erfindung einbezogen sein. Das geeignete beigelegte Puffersystem ist abhängig von dem vorhandenen Reagens mit sauren Einheiten. Beispiele für bevorzugte Puffersysteme werden in den oben angeführten Derivatisierungsbeispielen offenbart. Besonders geeignete Puffersysteme schließen tertiäre Aminlösungen (gleichermaßen wässrige und nicht-wässrige (zum Beispiel Lösungen in Tetrahydrofuran)) und reine tertiäre Amine ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Besonders bevorzugte tertiäre Amine schließen Trimethylamin, Triethylamin und Diisopropylethylamin ein.
Die erfindungsgemäßen Kits können weiterhin eine oder mehrere Digestionshilfen umfassen, wie beispielsweise solche wie hierin oben beschrieben. Die Digestionshilfen können chemischer oder enzymatischer Art sein. Beispielsweise Trypsin, Endoproteinase Lys C, Endoproteinase Arg C und/oder Chymotrypsin, vorzugsweise Trypsin, Endoproteinase Lys C und/oder Endoproteinase Arg C, und am meisten bevorzugt kann Trypsin als Digestionshilfe beigelegt sein. Chemische Digestionshilfen, wie beispielsweise Cyanbromid, können weiterhin hierin eingeschlossen sein.

Claims

Verfahren zur Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: (a) Derivatisieren des N-Terminus des Polypeptids oder der N-Termini eines oder mehrerer Peptide des Polypeptids mit einer oder mehreren sauren Einheiten mit pKas von weniger als 2 bei Kupplung mit dem Polypeptid oder den Peptiden, um einen oder mehrere derivatisierte Analyte vorzusehen; (b) Analysieren eines oder mehrerer derivatisierter Analyte unter Verwendung einer Massenspektrometrietechnik, um ein Fragmentationsmuster vorzusehen; und (c) Interpretieren des Fragmentationsmusters.
Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass die Massenspektrometrietechnik MALDI PSD-Massenspektrometrie oder Elektrospray-Ionisations-Tandem-Massenspektrometrie ist.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, dass die Interpretation des Fragmentationsmusters die Verwendung eines kommerziell erhältlichen Softwareprogramms oder einer Datenbank umfasst.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1–3, dadurch gekennzeichnet, dass das Polypeptid ein synthetisches Polypeptid ist.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1–4, dadurch gekennzeichnet, dass die Peptide des Polypeptids durch Digestion erzeugt werden.
Verfahren nach Anspruch 5, dadurch gekennzeichnet, dass die Digestion eine enzymatische Digestion ist.
Verfahren nach mindestens einem der Ansprüche 1–6, dadurch gekennzeichnet, dass die saure Einheit eine oder mehrere Sulfonsäuren oder ein Disulfonsäurederivat ist.
Kit zur Verwendung bei der Bestimmung der Aminosäuresequenz eines Polypeptids, dadurch gekennzeichnet, dass es umfasst: (a) ein oder mehrere Reagenzien mit sauren Einheiten, welche eine oder mehrere saure Einheiten mit pKas von weniger als 2 vorsehen bei Kupp lung mit dem Polypeptid oder einem oder mehreren Peptiden des Polypeptids; und (b) Mittel zur Derivatisierung des N-Terminus des Polypeptids oder der N-Termini eines oder mehrerer Peptide des Polypeptids mit einem oder mehreren Reagenzien mit sauren Einheiten.
Kit nach Anspruch 8, dadurch gekennzeichnet, dass das Mittel zum Derivatisieren ein oder mehrere Behältnisvorrichtungen umfasst.
Kit nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, dass es weiterhin eine oder mehrere Disgestionshilfen umfasst.