DE60109490T2

DE60109490T2 - Umgekehrtes labelierungsverfahren zur schnellen identifikation von marker/ziel-proteinen

Info

Publication number: DE60109490T2
Application number: DE60109490T
Authority: DE
Inventors: Karen Yingqi WANG; Zhixiang Ma; Frederick Douglas QUINN; W. Emil FU
Original assignee: Novartis AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 2000-12-22
Filing date: 2001-12-21
Publication date: 2006-04-13
Anticipated expiration: 2021-12-22
Also published as: ATE291231T1; DE60109490D1; CA2432052A1; ES2238493T3; JP2004516486A; EP1346229A2; US20020090652A1; WO2002052271A3; DK1346229T3; PT1346229E; AU2002240866B2; WO2002052271A2; EP1346229B1

Description

1. Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft Verfahren zur Identifizierung von spezifischen Proteinen in komplexen Proteingemischen. Insbesondere betreffen die erfindungsgemäßen Verfahren die schnelle Identifizierung von unterschiedlich exprimierten Proteinen aus zwei unterschiedlichen Proben, beispielsweise unterschiedlichen Geweben, unterschiedlichen Zelltypen oder unterschiedlichen Zellzuständen mittels Massenspektrometrie.
2. Beschreibung des Stands der Technik
Es wurde gut gezeigt, dass die meisten Erkrankungsprozesse und Erkrankungsbehandlungen sich auf Proteinebene manifestieren. Die Wirkmechanismen für die meisten Pharmazeutika auf dem Markt werden tatsächlich durch Proteine vermittelt. Eine vergleichende Analyse von Proteinprofilen aus normalen und erkrankten Zuständen mit oder ohne Arzneimittelbehandlung kann die systematische Untersuchung von Proteinen erleichtern, die in jedem biologischen System oder der Erkrankung beteiligt sind, was neue Einblicke in diese Mechanismen liefert, neue Ziele identifiziert, Information über Arzneimittel-Wirkungsmechanismen und Toxizität liefert und Ersatzmarker identifiziert. Man nimmt an, dass Proteomuntersuchungen zu wichtigen neuen Einblicken in Erkrankungsmechanismen und verbesserten Arzneimittelauffindungsstrategien zur Erlangung von neuen Therapeutika führen werden.
Die herkömmlichste Technologieplattform für Proteomuntersuchungen ist bisher die integrierte Verwendung der zweidimensionalen (2D) Gelelektrophorese für die Auffindung von Proteinen und die Massenspektrometrie für Proteinanalyse und Identifizierung, wie dies beispielsweise in Quadroni et al., Electrophoresis, 1999, 20: 664–677 beschrieben ist. Proteingemische, die von Zellen oder Geweben von normalen oder erkrankten Zuständen stammen, werden durch 2D PAGE getrennt und durch Färben sichtbargemacht. Quantitative Vergleiche von Bildern können durchgeführt werden, nachdem die Bilder der dargestellten Proteine digital in einen Computer eingescannt wurden. Die Flecken, die entweder einzigartig sind oder die, welche unterschiedlich exprimiert werden, werden dann identifiziert. Nach dem Ausschneiden dieser Flecken und einem in situ Verdau kann eine Vielzahl an Massenspektrometrietechniken verwendet werden, um einen Peptidfingerabdruck und eine Peptidsequenzinformation zu erhalten, die zur Suche in einer Sequenzdatenbank unter Identifizierung der Proteine verwendet werden. Wenn diese Proteine für die Erkrankung spezifisch sind, kann jedes potentiell ein neues Ziel für eine Arzneimittelauffindung sein oder kann als Krankheitsmarker verwendet werden. Derzeit ist die 2D-PAGE immer noch die umfassendste Methode, um Proteine darzustellen. 2D-Gele sind seit der Einführung von Streifen mit einem immobilisierten pH Gradienten (IPG) für die Auftrennung in der ersten Dimension sehr reproduzierbar. Sie ist zur Auftrennung von Tausenden an Proteinen fähig und liefert ein empfindliches Verfahren zur Quantifizierung der Proteinexpression, wenn sie mit Silber oder Fluoreszenzfarbstoffen gefärbt wird. Trotzdem gibt es einige Defizite bei der Technologie. Hierunter befindet sich vor allem die Unfähigkeit zur Darstellung aller Proteinkomponenten, wie Membranproteine, Proteine mit extremen pI's und Proteine mit geringer Kopiezahl. Nicht ausreichende Trennkraft ist ein weiterer Nachteil der Technik. Bis zu 20–40% aller Flecken können mehr als ein Protein enthalten, das einen quantitativen Vergleich von Proteinexpressionen und eine Interpretation von Experimenten sehr schwierig macht. Obwohl während der letzten Jahre große Fortschritte gemacht wurden, werden Proteomanalysen mittels 2D Gelen immer noch als schwierige Technologie in Bezug auf Automatisierung und Durchsatz angesehen. Die 2D Gel elektrophorese, die Färbung und die Bildanalyse sind nur einige der Schritte, die voll automatisiert werden müssen, bevor man den Prozess als einen mit hohem Durchsatz bezeichnen kann. Alternativen zu dieser Technologie, insbesondere der Ersatz der Verwendung von 2D Gelen, werden mit der Hoffnung untersucht, einen höheren Durchsatz und eine höhere Empfindlichkeit zu erreichen.
Ein Ansatz, der 2D Gele vermeidet, ist die Verwendung von multidimensionalen Flüssigphasetrenntechniken, wie Chromatographie und/oder isoelektrische Fokussierung in Lösung, um die Proteingemische oder ihre verdauten Peptidprodukte wie beschrieben teilweise aufzutrennen, beispielsweise gemäß Eng et al., J. Am. Soc. Mass. Spectrom. 1994, 5: 976–989, McCormack et al., Anal. Chem. 1997, 69: 767–776, Opiteck et al., Anal. Chem. 1997, 69: 2283–2291, Opiteck et al., Anal. Chem. 1997, 69: 1518–1524, Opiteck et al., Anal. Biochem. 1998, 258: 349–361, Kojima et al., J. Chromatogr. 1982, 239: 565–570, Isobe et al., J. Chromatogr. 1991, 588: 115–123, Wall et al., Anal. Chem. 2000, 72: 1009–1111, Jensen et al., Anal. Chem. 1999, 71: 2076–2084 und Pasa-Tolic et al., J. Am. Chem. Soc. 1999, 121: 7949–7950. Massenspektrometrie (MS) mit zusätzlicher Auflösungskraft wird zur Identifizierung des vereinfachten Gemisches verwendet. Da die Trennung in der flüssigen Phase passiert, ist das Automatisierungspotential viel höher, als die auf Gel basierende Plattform. Wenn sie in einem präparativen Maßstab ausgeführt wird, ist die Probenauftragung signifikant größer als die, die mittels 2D PAGE erreichbar ist. Zusätzlich verringert dieser Ansatz die Protein/Peptidgewinnungsverluste, die mit der 2D-Geltechnologie assoziiert sind, da die schließlich getrennten Proteine/Peptide in Lösung sind. Ein negativer Aspekt ist, dass die gewonnene quantitative Information, die aus einer 2D-Gelbildgebung erhalten wird, mit diesen Methoden noch nicht erreichbar ist.
Die Isotopenverdünnung wurde lange für eine quantitative Analyse eines Arzneimittels in biologischen Materialien verwendet. Es wird ein interner Standard, der in der Struktur isotopisch unterschiedlich ist, zu den Proben gegeben, um eine genaue Quantifizierung einer bestimmten Verbindung zu erreichen. Aufgrund des internen Standards sind Variablen, wie Probenverlust während der Probenvorbereitung, Matrixeffekte, Detektionswechselwirkungen, und sonstige nicht länger Probleme für eine akurate Quantifizierung. Um dasselbe Prinzip auf eine relative Proteinquantifizierung anzuwenden, wurden Versuche in Richtung von Proteinanhangs- oder Isotopenmarkierungsmethoden unternommen. Die Markierung eines Proteinpools kann metabolisch oder chemisch ausgeführt werden. Bei der Evaluierung einer unterschiedlichen Expression von Proteinen werden zwei Proteinpools (das heißt ein normaler gegen einen erkrankten Zustand) einer markiert (mit einem schweren Isotop) und der andere unmarkiert (das heißt mit dem natürlichen leichten Isotop) gemischt, proteolytisch verdaut und analysiert. Jedes Paar an Peptidsignalen mit und ohne Markierung wird ein interner Standard für das jeweils andere und ermöglicht den quantitativen Vergleich einer unterschiedlichen Proteinexpression. Während der Peptidfingerabdruck und die Peptidsequenzinformation, die aus der MS Analyse erhalten wurden, die Identifizierung von Proteinen liefert, bietet die Markierung ein Mittel zur Unterscheidung der zwei Populationen und eine akkurate Quantifizierung jedes Proteins. Die Proteinauffindung, Quantifizierung und Identifizierung werden daher in einem einzigen Schritt ausgeführt. Oda et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1999, 96: 6591–6596 haben einen solchen Ansatz gezeigt, bei dem die Proteine metabolisch während einer Zellkultur in einem mit N¹⁵ angereicherten Kulturmedium markiert werden. Es können auch ähnliche Strategien über Aminosäure-spezifische Markierung von Proteinen angewendet werden, die metabolisch während der Zellkultivierung erreicht wird, wie dies beispielsweise beschrieben ist in Chen et al., Anal. Chem. 2000, 72, 1134–1143. Gygi et al., Nature Biotech. 1999, 17: 994–999 haben ein chemisches Derivatisierungsschema entwickelt, das Isotopen-kodierte Affinitätsanfügung (ICAT) genannt wird, um eine Markierung an allen Cystein-enthaltenden Proteinen auszuführen. Mit diesem Ansatz wird die relative Proteinquantifizierung durch die Verwendung von zwei isotopisch unterschiedlichen, leichten und schweren Anhängen erreicht. Das Verfahren wurde erfolgreich auf eine Vielzahl an zellulären Systemen zur Erlangung eines quantitativen Vergleichs der Proteinexpression angewendet. Der eingebaute Affinitätsanhang in der Markierung ermöglicht die Verringerung der Komplexität des Proteingemisches durch selektive Anreicherung nur der Cystein-enthaltenden Peptide. Sie riskiert aber auch den Verlust der Information über nicht-Cystein-enthaltende Proteine und der Information bezüglich posttranslationalen Proteinmodifikationen. Die Datenanalyse kann mit diesen Methoden langatmig sein. Es gibt keinen eingebauten Mechanismus, um eine subtraktive Analyse zur Erlangung eines schnellen Fokus auf Proteine auszuführen, die sich in ihrer Expression am meisten ändern. Stattdessen muss jedes Peptidpaar an leichten und schweren Anhängen identifiziert und die relative Quantifizierung für alle Proteine ausgeführt werden, bevor man eine Rangordnung erhält. Dynamische Bereiche sind ein weiterer limitierender Faktor bei den Verfahren. Signale von Peptiden mit sowohl leichten als auch schweren Isotopanhängen müssen quantitativ detektiert werden, um eine genaue Quantifizierung der Proteinexpression zu erhalten. In einer extremen Situation, bei der nur ein Signal des Paares detektiert wird, kann das Signal als chemischer Hintergrund verwechselt werden oder von einem nicht-Cystein-enthaltenden Peptid statt von einem Protein, das stark unterschiedlich exprimiert wurde. Zusätzlich erfordern die hier erwähnten Markierungsmethoden alle spezielle Reagenzien (auf Anfrage synthetisierte Chemikalien oder isotopisch angereicherte Kulturmedien) und einen zusätzlichen Aufwand, die Markierungen einzuführen, die für ein analytisches Proteinlabor oder ein MS Labor leicht oder auch nicht so leicht zugänglich sein können.
Während die obigen Verfahren die Identifizierung und Quantifizierung der unterschiedlich exprimierten Proteine in komplexen Proteingemischen erlauben, fehlt den Methoden entweder die Geschwindigkeit/der Durchsatz, die Empfindlichkeit, die Fähigkeit, alle Proteine zu erfassen oder die Fähigkeit, extreme Veränderungen der Expression oder kovalente Veränderungen im Protein zu identifizieren. Demnach wäre es erwünscht, ein Verfahren zur Identifizierung von verschiedenen Klassen an unterschiedlich exprimierten Proteinen in komplexen Proteingemischen bereitzustellen, das schnell ist, einen hohen Durchsatz aufweist, empfindlich ist und zur unzweifelhaften Identifizierung aller Veränderungen in der Proteinexpression (quantitativ oder qualitativ) fähig ist.
Zusammenfassung der Erfindung
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Ausführung einer Proteinmarkierung für vergleichende Proteomanalysen, die inverse Markierung genannt wird und zur Identifizierung von unterschiedlich exprimierten Proteinen innerhalb von komplexen Proteingemischen verwendet werden kann. Insbesondere erlaubt das erfindungsgemäße Verfahren die Identifizierung von unterschiedlich exprimierten Proteinen in zwei unterschiedlichen Proben, beispielsweise unterschiedlichen Gewebe- oder Zelltypen, Erkrankungen oder Entwicklungsstufen.
Das hierin beschriebene Verfahren überwindet auch die Nachteile, die bei derzeit verfügbaren Verfahren inhärent vorhanden sind, dadurch dass es eine schnelle, empfindliche, verlässliche und un zweifelhafte Identifizierung mit hohem Durchsatz von verschiedenen Klassen an unterschiedlich exprimierten Proteinen bereitstellt.
In einem Aspekt wird ein Verfahren zur Identifizierung eines unterschiedlich exprimierten Proteins in zwei unterschiedlichen Proben bereitgestellt, die eine Proteinpopulation enthalten, das umfasst:

a) Bereitstellung von zwei gleichen Proteinpools aus jeweils einer Referenzprobe und einer Experimentalprobe,
b) Markierung der Proteinpools mit einem im wesentlichen chemisch identischen isotopisch unterschiedlichen Markierungsreagenz für Proteine, worin ein Pool jeweils aus dem Referenz- und Experimentalpool mit einem isotopisch schweren Proteinmarkierungsreagenz unter Bildung eines isotopisch schwer markierten Referenzpools und eines isotopisch schwer markierten Experimentalpools markiert wird und worin die verbleibenden Referenz- und Experimentalpools mit einem isotopisch leichten Proteinmarkierungsreagenz unter Bildung eines isotopisch leicht markierten Referenzpools und eines isotopisch leicht markierten Experimentalpools markiert werden,
c) Kombination des isotopisch leicht markierten Referenzpools mit dem isotopisch schwer markierten Experimentalpool unter Bildung eines ersten Gemisches,
d) Kombination des isotopisch schwer markierten Referenzpools mit dem isotopisch leicht markierten Experimentalpool unter Bildung eines zweiten Gemisches,
e) Detektion der markierten Proteine jeweils aus den zwei Gemischen, und
f) Vergleich des für die markierten Proteine aus den ersten und zweiten Gemischen erhaltenen Markierungsmusters, worin ein inverses Markierungsmuster eines Proteins im zweiten Gemisch im Vergleich mit dem Markierungsmuster des Proteins im ersten Gemisch das unterschiedlich exprimierte Protein in den zwei unterschiedlichen Proben anzeigt.

In einem weiteren Aspekt wird ein Verfahren zur Identifizierung eines unterschiedlich exprimierten Proteins in zwei unterschiedlichen Proben bereitgestellt, die eine Proteinpopulation enthalten, das umfasst

a) Bereitstellung von zwei gleichen Proteinpools aus jeweils einer Referenzprobe und einer Experimentalprobe,
b) Proteolyse jedes Proteinpools während der Markierung jedes der Proteinpools mit isotopisch markiertem Wasser, worin jeweils ein Pool der Referenz- und der Experimentalpools mit ¹⁸O-Wasser unter Bildung eines ¹⁸O-markierten Referenzpools und eines ¹⁸O-markierten Experimentalpools markiert wird und worin die verbleibenden Referenz- und Experimentalpools mit ¹⁶O-Wasser unter Bildung eines ¹⁶O-markierten Referenzpools und eines ¹⁶O-markierten Experimentalpools markiert werden,
c) Kombination des ¹⁶O-markierten Referenzpools mit dem ¹⁸O-markierten Experimentalpool unter Bildung eines ersten Gemisches, das ¹⁶O- und ¹⁸O-markierte Peptide enthält,
d) Kombination des ¹⁸O-markierten Referenzpools mit dem ¹⁶O-markierten Experimentalpool unter Bildung eines zweiten Gemisches, das ¹⁸O- und ¹⁶O-markierte Peptide enthält,
e) Detektion der markierten Peptide jeweils aus den zwei Gemischen, und
f) Vergleich der für die markierten Peptide in den ersten und zweiten Gemischen erhaltenen Markierungsmuster, worin ein inverses Markierungsmuster, das für ein Peptid im zweiten Gemisch erhalten wurde, im Vergleich mit dem Markierungsmuster, das für das Peptid im ersten Gemisch erhalten wurde, das unterschiedlich exprimierte Protein anzeigt, von dem das Peptid stammt.

a) Bereitstellung von zwei gleichen Proteinpools aus jeweils einer Referenzprobe und einer Experimentalprobe,
b) Proteolyse der Proteine in jedem Proteinpool unter Bildung von Peptidpools,
c) Markierung jedes Peptidpools mit isotopisch markiertem Wasser, worin jeweils ein Peptidpool der Referenz- und der Experimentalpools mit ¹⁸O-Wasser unter Bildung eines ¹⁸O-markierten Referenzpeptidpools und eines ¹⁸O-markierten Experimentalpeptidpools markiert wird und worin die verbleibenden Referenz- und Experimentalpeptidpools mit ¹⁶O-Wasser unter Bildung eines ¹⁶O-markierten Referenzpeptidpools und eines ¹⁶O-markierten Experimentalpeptidpools markiert werden,
d) Kombination des ¹⁶O-markierten Referenzpools mit dem ¹⁸O-markierten Experimentalpool unter Bildung eines ersten Gemisches, das ¹⁶O- und ¹⁸O-markierte Peptide enthält,
e) Kombination des ¹⁸O-markierten Referenzpools mit dem ¹⁶O-markierten Experimentalpool unter Bildung eines zweiten Gemisches, das ¹⁸O- und ¹⁶O-markierte Peptide enthält,
f) Detektion der markierten Peptide jeweils aus den zwei Gemischen, und
g) Vergleich der für die markierten Peptide in den ersten und zweiten Gemischen erhaltenen Markierungsmuster, worin ein inverses Markierungsmuster, das für ein Peptid im zweiten Gemisch erhalten wurde, im Vergleich mit dem Markierungsmuster, das für das Peptid im ersten Gemisch erhalten wurde, das unterschiedlich exprimierte Protein anzeigt, von dem das Peptid stammt.

a) Bereitstellung von zwei gleichen Proteinpools aus jeweils einer Referenzprobe und einer Experimentalprobe, worin ein Pool aus jedem der Referenz- und Experimentalpools durch Kultivierung in einem Kulturmedium, das eine isotopisch schwer markierte, assimilierbare Quelle enthält, unter Bildung eines isotopisch schwer markierten Referenzpools und eines isotopisch schwer markierten Experimentalpools hergestellt wird und worin die verbleibenden Referenz- und Experimentalpools durch die Kultivierung in einem Kulturmedium, das eine isotopisch leicht markierte, assimilierbare Quelle enthält, unter Bildung eines isotopisch leicht markierten Referenzpools und eines isotopisch leicht markierten Experimentalpools hergestellt werden,
b) Kombination des isotopisch leicht markierten Referenzpools mit dem isotopisch schwer markierten Experimentalpool unter Bildung eines ersten Proteingemisches,
c) Kombination des isotopisch schwer markierten Referenzpools mit dem isotopisch leicht markierten Experimentalpool unter Bildung eines zweiten Proteingemisches,
d) Detektion der markierten Proteine jeweils aus den zwei Gemischen, und
e) Vergleich des für die markierten Proteine aus den ersten und zweiten Gemischen erhaltenen Markierungsmusters, worin ein inverses Markierungsmuster eines Proteins im zweiten Gemisch im Vergleich mit dem Markierungsmuster des Proteins im ersten Gemisch das unterschiedlich exprimierte Protein in den zwei unterschiedlichen Proben anzeigt.

Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 – Das inverse Markierungsverfahren zur schnellen Identifizierung der Marker-/Zielproteine. Zu Erläuterungszwecken sind Proteine, die in den zwei Proteinpools unverändert bleiben, gleich im Vorkommen dargestellt. (In der Praxis müssen sie nicht notwendigerweise gleich im Vorkommen sein, sondern sie können in einem konstanten Verhältnis vorkommen, das nicht gleich eins ist.) Die ¹⁸O-Markierung der Proteinproteolyse wird in diesem schematischen Diagramm zur Erläuterung verwendet.
2 – Detektion durch Flüssigchromatographie/Massenspektrometrie (LC/MS) eines invers ¹⁸O-markierten tryptischen BSA Peptids. (A): MS der ¹⁶O-Kontrolle- ¹⁸O "behandelte" Probe, (B): MS der ¹⁸O-Kontrolle- ¹⁶O-"behandelten" Probe, (C): MS/MS des Peptids in (A) und (D): MS/MS des Peptids in (B). Eine 2 Da Massenverschiebung zwischen (A) und (B) der am häufigsten vorkommenden Isotopenionen zeigt eine signifikant unterschiedliche Expression des Proteins an. Die Massenverschiebung wird ferner in den MS/MS Spektren (C) und (D) durch die 2 Da Verschiebung aller Y Ionen verifiziert/bestätigt, die auch hilft, die Y Ionen und B Ionen zu identifizieren und so bei der Interpretation der Spektren hilft. Das BSA Protein wird ausschließlich durch eine Datenbanksuche unter Verwendung der Y Ionen identifiziert (jene mit einer 2 Da Verschiebung).
3 – LC/MS Detektion eines invers ¹⁸O-markierten tryptischen Aldolasepeptids. (A): MS der ¹⁶O-Kontroll- und ¹⁸O-"behandelten" Probe, (B): MS der ¹⁸O-Kontroll- und ¹⁶O-"behandelten" Probe, (C): MS/MS des Peptids in (A) und (D): MS/MS des Peptids in (B). Eine 4 Da Massenverschiebung zwischen (A) und (B) der am häufigsten vorkommenden Isotopenionen zeigt eine signifikant unterschiedliche Expression des Proteins. Die Massenverschiebung wird ferner in den MS/MS Spektren (C) und (D) durch die 4 Da Verschiebung aller Y Ionen verifiziert/bestätigt, die auch hilft, die Y Ionen und B Ionen zu identifizieren und so bei der Interpretation der Spektren hilft. Das Aldolaseprotein wird ausschließlich durch die Datenbanksuche unter Verwendung der Y Ionen identifiziert (jene mit einer 4 Da Verschiebung).
4 – MALDI TOF Detektion der inversen ¹⁸O-markierten tryptischen Verdaus der Gemische aus 8 Proteinen. (A): ¹⁶O-Kontroll- und ¹⁸-O"behandelte" Probe, (B) ¹⁸O-Kontroll- und ¹⁶O-"behandelte" Probe, (C): Monoisotopenmuster eines BSA Peptids MH⁺ 1567,9 in (A) (oben) und (B) (unten) und (D): Monoisotopenmuster eines Aldolasepeptids MH⁺ 2107,3 in (A) (oben) und (B) (unten). Die Massenverschiebungen oder die Umkehr des ¹⁶O/¹⁸O-Intensitätsverhältnisses zeigt eine unterschiedliche Expression der Proteine: "Herabregulation" von BSA und "Heraufregulation" der Aldolase.
5 – MALDI PSD Spektren eines invers ¹⁸O-markierten tryptischen Aldolasepeptids MH⁺ 2107,3. (A): In der ¹⁶O-Kontroll- und ¹⁸O-"behandelten" Probe und (B): In der ¹⁸O-Kontroll- und ¹⁶O-"behandelten" Probe. Die 4 Da Massenverschiebung, die beim Molekularion in 4(D) beobachtet wird, wird ferner in den PSD Spektren durch die 4 Da Verschiebung aller Y Ionen verifiziert/bestätigt. Dies hilft auch bei der Identifizierung von Y Ionen und B Ionen und hilft daher bei der Interpretation der PSD Spektren. Das Aldolaseprotein wird ausschließlich aus der Datenbanksuche mittels der Y Ionen identifiziert (die mit einem 4 Da Verschiebung).
6 – LC/MS Detektion eines tryptisch verdauten PTP (Proteintyrosinphopshatase) Peptids aus einem CHO Zelllysat, das mit PTP-1B versetzt wurde. (A): MS der ¹⁶O-PTP10- ¹⁸O-PTP30 Probe, (B): MS der ¹⁸O-PTP10- ¹⁶O-PTP30 Probe, (C): MS/MS des Peptids in (A) im Satz und (D): MS/MS des Peptids in (B) im Satz, worin PTP10 0,25 mg eines CHO Zelllysats darstellt, das mit 10 pmol PTP-1B versetzt wurde, PTP30 0,25 mg eines CHO Zelllysats darstellt, das mit 30 pmol PTP-1B versetzt wird. Nach dem Zusetzen werden die Proteingemische proteolytisch verdaut und anschließend unter Bildung der zwei Gemische A und B invers ¹⁸O-markiert. Eine 4 Da Massenverschiebung zwischen (A) und (B) (Insertionen) der häufigsten Isotopenionen zeigt eine signifikant "unterschiedliche Expression" des Proteins. Die Massenverschiebung wird ferner in den MS/MS Spektren durch die 4 Da Verschiebung aller Y Ionen verifiziert/bestätigt, die auch bei der Identifizierung der Y Ionen und B Ionen und so bei der Interpretation der MS/MS Spektren hilft. Das PTP-1B Protein wird exklusiv aus der Datenbanksuche unter Verwendung der Y Ionen (jene mit einer 4 Da Verschiebung) identifiziert.
7 – MALDI TOF Detektion von tryptischen Verdaus eines invers ¹⁵N-markierten Systems mit 2 Proteinen mit PTP Protein, das in der "behandelten" Probe dreifach heraufreguliert ist. (A): ¹⁴N-Kontroll- und ¹⁵N-"behandelte" Probe, (B): ¹⁵N-Kontroll- und ¹⁴N-"behandelte" Probe. Die unteren Darstellungen sind selektiv vergrößerte m/z Regionen.
8 – MALDI TOF Detektion der tryptischen Verdaus eines inversen ¹⁵N-markierten Systems mit 2 Proteinen mit PTP Protein, das in der "behandelten" Probe hundertfach herabreguliert ist. (A): ¹⁴N-Kontroll- und ¹⁵N-"behandelte" Probe, (B): ¹⁵N-Kontroll- und ¹⁴N-"behandelte" Probe. Die unteren Darstellungen sind selektiv vergrößerte m/z Regionen.
9 – LC/MS-MS/MS Detektion von tryptischen Verdaus eines invers ¹⁵N-markierten Systems mit 2 Proteinen mit PTP Protein, das in der "behandelten" Probe dreifach herabreguliert ist. (A): MS der ¹⁴N-Kontroll- und ¹⁵N-"behandelten" Probe, (B): MS der ¹⁵N-Kontroll- und ¹⁴N-"behandelten" Probe, (a) Basispeakionenchromatogramme der zwei LC/MS-MS/MS Läufe, (b) MS Spektren eines Peptids in (a), das ein inverses Markierungsmuster (Massenverschiebung) zeigt und (c) MS/MS Spektren des Peptids in (b) (des zweifelhaft geladenen Ions). Das PTP Protein wird ausschließlich durch die Datenbanksuche mittels der MS/MS Daten des ¹⁴N-Peptids identifiziert (oberes (c)).
10 – LC/MS-MS/MS Detektion von tryptischen Verdaus eines invers ¹⁵N-markierten Algenzelllysats, das mit PTP Protein versetzt ist, wobei das PTP in der "behandelten" Probe dreifach herabreguliert ist. (A): MS der ¹⁴N-Kontroll- und ¹⁵N-"behandelten" Probe, wobei das Spektrum über ein 3 Minuten LC/MS Fenster gemittelt wird, (B): MS der ¹⁵N-Kontroll- und ¹⁴N-"behandelten" Probe, wobei das Spektrum über ein 3 Minuten LC/MS Fenster gemittelt wird, (C): MS/MS des Peptids in (A) m/z 623,5 und (D): MS/MS des Peptids in (B) m/z 631,3, worin die ¹⁴N-Kontrolle 0,05 mg eines ¹³C-Algenproteins darstellt, die mit 10 pmol PTP-1B versetzt ist, die ¹⁵N-Kontrolle 0,05 mg eines ¹³C-¹⁵N-Algenproteins darstellt, die mit 10 pmol ¹⁵N-PTP versetzt ist, die ¹⁴N-"behandelte" Probe 0,05 mg eines ¹³C-Algenproteins darstellt, die mit 0,3 pmol PTP-1B versetzt ist, und die ¹⁵N-"behandelte" Probe 0,05 mg eines ¹³C-¹⁵N-Algenproteins darstellt, die mit 0,3 pmol ¹⁵N-PTP versetzt ist. Die Massenverschiebungen oder das inverse Markierungsmuster zwischen (A) und (B) werden anhand der markierten Ionen (*) beobachtet. Die inverse Markierung oder die unterschiedliche Expression wird ferner durch MS/MS Spektren ihrer ähnlichen Fragmentierungsmuster verifiziert/bestätigt. Das PTP-1B Protein wird ausschließlich aus der Datenbanksuche unter Verwendung der MS/MS Daten des ¹⁴N-Peptids (C) identifiziert.
11 – MALDI TOF Detektion der tryptischen Verdaus eines invers ICAT-markierten Systems mit 6 Proteinen. (A): D₀-Kontroll- und D₈-"behandelte" Probe, (B) De-Kontroll- und D₀-"behandelte" Probe. Die unteren Darstellungen sind die selektiv vergrößerten m/z Regionen. Die Massenverschiebungen oder die Umkehr des D₀-/D₈-Intensitätsverhältnisses, zeigt eine unterschiedliche Expression von Proteinen an.
12 – LC/MS Detektion von tryptischen Verdaus eines invers ICAT-markierten Systems mit 6 Proteinen. (A): Basispeakionenchromatogramm der D₀-Kontroll- und D₈-"behandelten" Probe, (B): Basispeakionenchromatogramm der D₈-Kontroll- und D₀-"behandelten" Probe. Die Signale des charakteristischen inversen Markierungsmusters der Massenverschiebungen werden deutlich detektiert. Die unterschiedlich exprimierten Proteine werden schnell mittels ihrer MS Daten identifiziert.
Beschreibung der Erfindung
Der Ausdruck "unterschiedlich exprimiert" bezieht sich in Bezug auf die Proteine auf quantitative Veränderungen der Expressionsmenge wie auch auf qualitative Veränderungen, wie kovalente Veränderungen, beispielsweise posttranslationale Modifikationen, wie Proteinphosphorylierung, Proteinglycosylierung, Proteinacetylierung und Proteinprozessierung des C- oder N-Terminus eines Proteins.
Der Ausdruck "Probe", wie er hierin verwendet wird, wird im breitesten Sinn verwendet. Geeignete Proben umfassen unter anderem Zellhomogenate, Zellfraktionen, Gewebehomogenate, biologische Flüssigkeiten, wie Blut, Urin und cerebrospinale Flüssigkeiten, Tränen, Fäkalien, Speichel und Lavageflüssigkeiten, wie Lungen- oder Peritoneallavagen.
Der Ausdruck "stabiles Isotop" bezieht sich auf eine nicht radioaktive Isotopenform eines Elements.
Der Ausdruck "radioaktives Isotop" bezieht sich auf eine Isotopenform eines Elements, das eine Radioaktivität zeigt, das heißt die Eigenschaft von einigen Kernen, spontan Gammastrahlen oder subatomare Partikel zu emittieren (beispielsweise α- und β-Strahlen).
Der Ausdruck "isotopisch leichtes Proteinmarkierungsreagenz" bezieht sich auf ein Proteinmarkierungsreagenz, das eine leichte Form eines Elements eingearbeitet aufweist, beispielsweise H, ¹²C, ¹⁴N, ¹⁶O oder ³²S.
Der Ausdruck "isotopisch schweres Proteinmarkierungseagenz" bezieht sich auf ein Proteinmarkierungsreagenz, das eine schwere Form eines Elements eingearbeitet aufweist, beispielsweise ²H, ¹³C, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O oder ³⁴S. Isotopisch leichte und isotopisch schwere Proteinmarkierungsreagenzien werden hierin jeweils auch als unmarkierte und markierte Reagenzien bezeichnet.
Der Ausdruck "inverses Markierungsmuster" meint eine qualitative Massenverschiebung oder eine Umkehr des Verhältnisses der Isotopenpeakintensität, das heißt vom stärkeren schwer markierten Signal zum stärkeren leicht markierten Signal (oder umgekehrt), das zwischen den zwei invers markierten Gemischen detektiert wird.
Die vorliegende Erfindung betrifft ein neues Verfahren zur Ausführung einer Proteinmarkierung für vergleichende Proteomanalysen, das als inverse Markierung bekannt ist und die schnelle Identifizierung von Marker- oder Zielproteinen erlaubt, deren Expressionsmengen bei einer Pertubation signifikant verändert wurden oder bei denen kovalente Veränderungen auf eine Pertubation aufgetreten sind, beispielsweise als Ergebnis eines Krankheitszustands oder einer Arzneimittelbehandlung, einem Kontakt mit einem potentiell toxischen Material oder einer Veränderung in der Umgebung (beispielsweise Nährstoffspiegel, Temperatur, Zeitdauer). Die schnelle Identifizierung von unterschiedlich exprimierten Proteinen kann in Richtung der Aufklärung von neuen Krankheitsmechanismen, der Ermittlung von Arzneimittel-Wirkungsmechanismen und der Untersuchung der Arzneimitteltoxizität angewendet werden. Das Verfahren umfasst die Ausführung von zwei entgegengesetzt zusammenwirkenden Markierungsexperimenten parallel auf zwei unterschiedliche Proben, die jeweils eine Proteinpopulation enthalten. Die zwei unterschiedlichen Proben werden daher als Referenz- und Experimentalproben bezeichnet. Diese Proben können sich im Zelltyp, Gewebetyp, Organellentyp, physiologischen Zustand, Krankheitszustand, Entwicklungszustand, Umgebungs- oder Ernährungsbedingungen, chemischen oder physikalischen Stimuli oder Zeitperioden unterscheiden. Beispielsweise können die Referenz- und Experimentalproben jeweils normale Zellen und Krebszellen, jeweils eine Behandlung ohne und mit einem Arzneimittel und dergleichen darstellen.
Das Verfahren umfasst die Bereitstellung von zwei gleichen Proteinpools jeweils aus der Referenz- und der Experimentalprobe. Jeder Proteinpool wird dann mit einem Proteinmarkierungsreagenz markiert, das im wesentlichen chemisch identisch ist, außer dass es sich in der Masse durch die Einarbeitung eines entweder schweren oder leichten Isotops unterscheidet. Das Isotop kann ein stabiles Isotop oder ein radioaktives Isotop sein. Die Einarbeitung eines stabilen Isotops in das Proteinmarkierungsreagenz ist bevorzugt, da es über die Zeit stabil ist und hierbei die Variationen aufgrund von Handhabung minimiert und so genauere, quantitative Messungen bereitstellt und umweltfreundlicher ist, als ein radioaktives Isotop.
Im Hinblick auf die Markierung der Proteinpools wird jeweils ein Proteinpool der Referenz- und der Experimentalproben mit einem isotopisch schweren Proteinmarkierungsreagenz unter Bildung eines isotopisch schwer markierten Referenzpools und eines isotopisch schwer markierten Experimentalpools markiert. Der verbleibende Pool aus jeweils den Referenz- und Experimentalproben wird mit einem isotopisch leichten Proteinmarkierungsreagenz unter Bildung eines isotopisch leicht markierten Referenzpools und eines isotopisch leicht markierten Experimentalpools markiert.
Das Proteinmarkierungsreagenz kann jedes geeignete Reagenz sein, das zur Markierung von Proteinen verwendet wird. Das Isotop ist im Reagenz enthalten und wird so in die Proteine eingeführt. Die Markierung kann chemisch, metabolisch, proteolytisch oder durch andere geeignete Mittel zur Einarbeitung des Isotops in die Proteine erreicht werden.
In einer Ausführungsform kann das Proteinmarkierungsreagenz ein Reagenz sein, das eine Gruppe enthält, die mit einer bestimmten funktionellen Gruppe eines Proteins reagiert, das heißt eine chemische Markierung des Proteins. Beispiele für reaktive Gruppen von Proteinmarkierungsreagenzien umfassen die, welche mit Sulfhydrylgruppen, Aminogruppen, Carboxylgruppen, Estergruppen, Phosphatgruppen, Aldehyd- und Ketongruppen und dergleichen reagieren. Beispiele für Thiol-reaktive Gruppen sind unter anderem Nitrile, sulfonierte Alkyl- oder Arylthiole, Maleimid, Epoxide und α-Halogenacylgruppen. Beispiele für Amino-reaktive Gruppen umfassen unter anderem, Isocyanate, Isothiocyanate, aktive Ester, beispielsweise Tetrafluorphenylester und N-Hydroxysuccinimidylester, Sulfonylhalogenide, Säureanhydride und Säurehalogenide. Beispiele für Carbonsäure-reaktive Gruppen umfassen unter anderem Amine oder Alkohole in Gegenwart eines Kupplungsreagenzes, wie Dicyclohexylcarbodiimid oder 2,3,4,5-Tetrafluorphenyltrifluoracetat. Beispiele für Ester-reaktive Gruppen umfassen unter anderem Amine, die mit Homoserin oder Lacton reagieren. Beispiele für Phosphat-reaktive Gruppen umfassen unter anderem Chelat-gebundenes Metall, beispielsweise Fe(III) oder Ga(III), das mit Nitriltriessigsäure oder Iminodiessigsäure im Chelat gebunden ist. Aldehyd- oder Keton-reaktive Gruppen umfassen unter anderem Amine und NaBH₄ oder NaCNBH₄, wie sie in Chemical Reagents for Protein Modification von R. Lundbald (CRC Press 1991) beschrieben sind.
Ein besonders brauchbarer Typ eines Proteinmarkierungsreagenzes ist das einen Affinitätsanhang enthaltende Reagenz. Die Verwendung eines Affinitätsanhang-enthaltenden Reagenzes ist besonders vorteilhaft, da spezifische Klassen von Proteinen, beispielsweise diejenigen, die Phosphatgruppen enthalten, einer Affinitätsreinigung unterzogen werden können, die unerwünschte Proteine eliminieren kann und hierbei die Komplexität der Proteinpools verringert und ferner die bestimmten Proteinklassen anreichert. Zusätzlich können solche einen Affinitätsanhang enthaltenden Reagenzien auch unerwünschte Kontaminanten eliminieren, die nicht kompatibel sind oder die eine Identifizierung der spezifischen Proteine mit einer Massenspektrometrie maskieren würden. Beispielsweise können die obigen Proteinpools mit einem isotopisch schweren und isotopisch leichten Biotin-enthaltenden Proteinmarkierungsreagenz biotinyliert werden. Mit Biotin markierte Proteine, die in den Proteinpools vorkommen, können dann über eine Biotin-Avidin-Chromatographie gereinigt werden. Dasselbe Prinzip kann auf Peptide nach einer Proteolyse der markierten Proteingemische angewendet werden, um bestimmte Peptidklassen anzureichern oder die Gemischkomplexität und so eine potentielle Wechselwirkung mit der Identifizierung von spezifischen Proteinen mit der Massenspektrometrie zu reduzieren.
Der Affinitätsanhang für die selektive Isolierung eines Proteins oder Peptids, das mit einem Proteinmarkierungsmittel modifiziert ist, kann zur selben Zeit wie die Isotopeneinarbeitung oder in einer getrennten Reaktion vor oder nach der Proteinisotopenmarkierung erfolgen. Im Fall eines spezifischen Reagenzes mit Affinitätsanhang, das als Isotopen-kodiertes Affinitätsanhangsreagenz (ICAT) bekannt ist, wie dies von Gygi et al., siehe obige Literaturstelle beschrieben ist, ist der Biotinaffinitätsanhang Teil des Proteinmarkierungsreagenzes und wird so zur selben Zeit eingeführt, wie die Isotopenmarkierung. Johnson et al. und Shaler et al., 2001, The 49^th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Chicago, Illinois, wobei beide Affinitätsanhänge beschreiben, die vor einer Isotopenmarkierung durch eine Aminosäure-spezifische Chemie eingeführt werden. Nach der Affinitätsanreicherung der den Anhang enthaltenden Proteine/Peptide, können die Isotopenmarkierungen durch ein allgemeines Modifikationsschema eingeführt werden, wie N-terminale Acylierung, C-terminale Veresterung oder Cysteinchemie, falls ein abspaltbarer Anhang verwendet wird, wie dies beispielsweise in Johnson et al., siehe obige Literaturstelle beschrieben ist. Eine Einführung eines Affinitätsanhangs kann auch nach einer Isotopenmarkierung erfolgen. In solchen Beispielen enthalten ist die Verwendung eines Cystein-spezifischen Biotinylierungsreagenzes zur Umsetzung und Heraushebung von Cystein-enthaltenden Proteinen/Peptiden nachdem ein allgemeines Markierungsverfahren ausgeführt wurde, wie eine N-terminale Acylierung, C-terminale Veresterung oder andere nicht-chemische Markierungsverfahren, wie metabolische ¹⁵N-Markierung, wie sie beispielsweise in Conrads et al., Anal. Chem. 2001, 73: 2132–2139 beschrieben ist.
Ein Beispiel für ein spezifisches, einen Affinitätsanhang enthaltendes Proteinmarkierungsreagenz, das zur Markierung von Proteinen verwendet wurde, die aus unterschiedlichen Proben zur Untersuchung der unterschiedlichen Proteinexpression stammen, ist das ICAT Reagenz, wie dies in Gygi et al. siehe obige Literaturstelle und WO 00/11208 A beschrieben wurde. Die Struktur des ICAT Reagenzes besteht aus drei funktionellen Elementen: 1) einem Biotinaffinitätsanhang, 2) einem Linker, der entweder H oder ²H eingearbeitet aufweist und 3) einer Protein-reaktiven Gruppe, beispielsweise einer Sulfhydryl-reaktiven Gruppe. Im ICAT Verfahren werden die Seitenketten von Aminosäureresten, beispielsweise Cysteinylresten, in einer reduzierten Proteinprobe mit der isotopisch leichten Form des ICAT Reagenzes modifiziert. Dieselben Gruppen werden in einer zweiten Proteinprobe mit einer isotopisch schweren Form des ICAT Reagenzes modifiziert. Die zwei markierten Proteinproben werden kombiniert und dann unter Bildung von Peptidfragmenten einer Proteolyse unterzogen, von denen einige markiert sind. Die markierten (Cystein-enthaltenden) Peptide werden durch Avidinaffinitätschromatographie isoliert und dann abgetrennt und durch LC-MS/MS analysiert. Ein Beispiel für ein ICAT Reagenz ist Biotinyliodacetylamidyl-4,7,10-trioxatridecandiamin, das aus einer Biotingruppe für eine Affinitätsreinigung, einem chemisch inerten Spacer, der isotopisch mit stabilen Isotopen für eine Massenspektrumsanalyse markiert werden kann und einer Iodacetamidylgruppe zur Reaktion mit Sulfhydrylgruppen auf Proteinen besteht, wie dies beispielsweise in WO 00/11208 A beschrieben ist. Ähnliche Strategien können auf die Verwendung von anderen Reagenzien angewendet werden, die unterschiedliche reaktive Gruppen für Proteine enthalten.
In einer anderen Ausführungsform kann das Proteinmarkierungsreagenz ein Reagenz sein, das in das Protein eingearbeitet werden kann, beispielsweise durch metabolische Markierung der Proteinpools. Beispielsweise können die Proteinpools der Referenz- und Experimentalproben unterschiedliche Zelltypen repräsentieren, die in einem Kulturmedium kultiviert wurden, das eine isotopisch schwer oder leicht markierte, assimilierbare Quelle enthält, wie unter anderem Ammoniumsalze (beispielsweise Ammoniumchlorid), Glucose oder Wasser oder eine oder mehrere isotopisch schwer oder leicht markierte Aminosäuren, beispielsweise Cystein, Methionin, Lysin usw., um markierte Proteine bereitzustellen, die das schwere oder leichte Isotop einbauen, wie jeweils ¹⁵N und ¹⁴N, ¹³C und ¹²C, ²H und H oder ³⁵S und ³²S.
In einer besonders brauchbaren Ausführungsform werden die Proteine als direktes Ergebnis einer Proteolyse markiert, die mit dem Proteinmarkierungsreagenz ¹⁸O- und ¹⁶O-markiertem Wasser ausgeführt wird, wie dies in Rose et al., Biochem. J. 1983, 215: 273–277 und Rose et al., Biochem. J. 1988, 250: 253–259 beschrieben ist und später detaillierter beschrieben ist.
Wenn die Markierung der Pools abgeschlossen ist, wird der isotopisch leicht markierte Referenzpool mit dem isotopisch schwer markierten Experimentalpool unter Bildung eines ersten Gemisches kombiniert. Der isotopisch schwer markierte Referenzpool wird dann mit dem isotopisch leicht markierten Experimentalpool unter Bildung eines zweiten Gemisches kombiniert. Demnach stammen im ersten Gemisch die isotopisch schwer markierten Proteine vom Experimentalpool, während im zweiten Gemisch die isotopisch schwer markierten Proteine vom Referenzpool stammen. Durch die Isotopenmarkierung wird das identische Protein in den Referenz- und Experimentalproben durch die Masse unterschieden, um eine unabhängige Detektion und einen quantitativen Vergleich zwischen den zwei Proben durch geeignete Techniken zu erlauben, wie beispielsweise Massenspektrometrietechniken.
Die Proteine in den ersten und zweiten Gemischen werden vorzugsweise enzymatisch oder chemisch in Peptide unter Verwendung von Proteasen, beispielsweise Trypsin, Chemikalien, beispielsweise Cyanogenbromid oder verdünnte Säuren, beispielsweise Chlorwasserstoff gespalten. Vorzugsweise werden die markierten Proteine mit Trypsin verdaut. Typische Trypsin : Proteinverhältnisse (Gewicht Gewicht), die zu jeder Proteinlösung gegeben werden, reichen von etwa 1:200 bis etwa 1:20. Der Verdau kann bei etwa 37°C für etwa 2 bis etwa 30 Stunden ablaufen. Der Verdau der Proteine in Peptide kann auch vor oder während der Markierung von jedem der Proteinpools der Referenz- und Experimentalproben ausgeführt werden, wie dies später detaillierter beschrieben ist. Der Verdauschritt kann eliminiert werden, wenn kleine Proteine analysiert werden.
Die verdauten, markierten Peptide oder markierten Proteine aus den ersten und zweiten Gemischen werden dann durch jede geeignete Technik detektiert, die zur Detektion des Unterschieds in der Masse zwischen dem isotopenmarkierten Peptid oder isotopenmarkierten Protein fähig ist, das aus den Referenz- und Experimentalproben stammt. Vorzugsweise werden die verdauten markierten Peptide oder markierten Proteine getrennt und anschließend durch gut bekannte Fraktionierungstechniken, wie sie später beschrieben sind, gekuppelt mit MS Techniken analysiert, die in der Technik gut bekannt sind. Während mehrere MS und Tandem MS (MS/MS) Techniken verfügbar sind und zur Detektion der Peptide verwendet werden können, sind die Matrix unterstütze Laserdesorptionsionisations-MS (MALDI/MS) und die Elektrosprayionisations-MS bevorzugt. Der quantitative Vergleich der getrennten, markierten Peptide oder der getrennten, markierten Proteine wird durch die relativen Signalintensitäten für Peptid- oder Proteinionen reflektiert, die die identische Sequenz aufweisen und die mit dem isotopisch schwer und leicht markierten Proteinreagenz markiert sind. Die chemisch identischen Peptid- oder Proteinpaare können leicht während eines massenspektrometrischen Durchlaufs sichtbargemacht werden, da sie durch Chromatographie co-eluieren oder nahe zusammen eluieren und sich in der Masse unterscheiden. Falls die Expression eines Proteins herauf- oder herunterreguliert wurde, das heißt eine wirkliche Verschiebung in den Signalintensitäten des leichten und schweren Isotops im ersten Gemisch beobachtet wird, sollte das Inverse bei der Analyse des zweiten Gemisches aufgrund einer inversen Markierung beobachtet werden. Falls die Expression eines Proteins nach einer Pertubation unverändert bleibt, tritt kein signifikanter Unterschied im Markierungsmuster zwischen den ersten und zweiten Gemischen auf. Demnach werden mit der inversen Markierung anstelle der quantitativen Berechnung des Verhältnisses der isotopisch leichten zu den isotopisch schweren Signalen für jedes Peptid, wie dies bei Isotopenmarkierungsmethoden des Stands der Technik zur Identifizierung der unterschiedlich exprimierten Proteine ausgeführt wird, zwei Datensätze einfach verglichen, zum schnell Peptide mit solchen qualitativen Veränderungen zu identifizieren, die unterschiedlich exprimierte Proteine anzeigen.
Selektive massenspektrometrische Detektion kann auch zur selektiven Detektion einer bestimmten Gruppe an Peptiden nach einem allgemeinen Markierungsschema verwendet werden, wie durch Vorläuferionenscanning zur Detektion von Phosphopeptiden oder Glycopeptiden, wie dies beispielsweise in Wilm et al., Anal. Chem. 1996, 68: 527 beschrieben ist.
Die Sequenz eines oder mehrerer markierter, kleiner Proteine oder markierter Peptide wird durch Standardtechniken bestimmt, beispielsweise Tandemmassenspektrometrie (MS/MS) oder Post-Source Decay (PSD). Zumindest eine der Peptidsequenzen, die von einem unterschiedlich exprimierten Protein stammt, zeigt das Protein an und dessen Vorkommen in den Referenz- und Experimentalproben. Zusätzlich können Peptidfingerabdruckdaten durch MS erzeugt werden. Anschließend können Daten, die durch MS von Peptidfingerabdrücken generiert wurden oder eine Peptidsequenzinformation zur Suche in einer Proteindatenbank zur Proteinidentifizierung verwendet werden.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform des vorliegenden Verfahrens, wie es später beispielhaft dargestellt wird, werden Proteinpools der Referenz- und Experimentalproben unter Verwendung von Trypsin vorher oder gleichzeitig mit der Markierung mit ¹⁸O- und ¹⁶O-Wasser proteolytisch verdaut. Ein ¹⁸O-Atom und ein ¹⁶O-Atom werden in den neu gebildeten Carboxyterminus als Folge der Hydrolyse während der Proteolyse eingearbeitet. Ein zusätzliches ¹⁸O und ¹⁶O kann in die terminale Carboxygruppe durch einen Mechanismus eines durch Protease katalysierten Austausches eingearbeitet wer den, wie dies beispielsweise in Rose et al., 1988, siehe obige Literaturstelle beschrieben ist. Daher werden nach einem Verdau durch Trypsin alle entstehenden Peptide außer die C-terminalen Peptide, denen Lys oder Arg am C-Terminus fehlen, entweder mit einem oder zwei ¹⁸O- und ¹⁶O-Atomen am C-Terminus markiert (meistens 2, falls genug Zeit für den Austausch vorhanden ist). Vor allem um das teure ¹⁸O-Wasser zu sparen, wurde sowohl die Einarbeitung der ¹⁸O-Markierungen während oder nach der Proteolyse untersucht. Gemäß vorherigen Untersuchungen können ¹⁸O-Markierungen in Peptide an der C-terminalen Carboxygruppe durch einen Protease-katalysierten Austausch eingearbeitet werden. (Siehe beispielsweise Rose et al., 1988, siehe obige Literaturstelle und Schnolzer et al., Electrophoresis 1996, 17: 945–953.) Dies wird durch die Beobachtung bestätigt, dass die Mehrzahl der nicht-C-terminalen Peptide mehr als ein ¹⁸O-Atom aufgenommen hat, wenn ein Protein in ¹⁸O-Wasser verdaut wird. Durch die Zugabe eines sehr kleinen Volumens an ¹⁸O-Wasser (~10 μl) zu einem vollständig getrockneten Peptidgemisch nach der Proteolyse (mit oder ohne der Zugabe von zusätzlichem Trypsin) und einer Ermöglichung des Austausches bei Raumtemperatur für 5–12 Stunden, wird dasselbe Ausmaß des ¹⁸O-Einbaus wie bei der Markierung während der Proteolyse erreicht.
Die Markierung nach der Proteolyse kann sehr vorteilhaft sein, wenn man mit Proteinen oder Peptidgemischen arbeitet, für die die Verringerung des Volumens problematisch ist. Bei der Ausführung der Markierung nach der Proteolyse kann der Verdau auf normale Weise in einem normalen Wasserpuffer mit dem Zelllysat oder den Membranproteinen ausgeführt werden, ohne sich über die Proteinausfällung während der Konzentration oder der Verwendung einer großen Menge des teuren ¹⁸O-Wassers Sorgen machen zu müssen, um eine überwiegende ¹⁸O-Umgebung für die Markierung zu erreichen. Wenn die Proteine zu Peptiden proteolytisch verdaut wurden, ist die Konzentrierung und Ausfällung normalerweise ein geringeres Problem und der Markierungsprozess über den durch Protease katalysierten Austausch kann mittels einer sehr kleinen Menge an ¹⁸O-Wasser ausgeführt werden. Ein weiterer Bereich, bei dem eine Markierung nach einer Proteolyse sehr brauchbar sein kann, ist die Ausführung von ¹⁸O-Markierungsexperimenten von durch Gel getrennten Proteinen über einen Verdau im Gel. Durch die Ausführung der ¹⁸O-Markierung nach der Proteolyse wird die erforderliche Menge an ¹⁸O-Wasser wesentlich verringert, da die Markierung mit den getrockneten, extrahierten Peptiden ausgeführt wird. Im Gegensatz dazu wird die Markierung auf Gelen bei einer Markierung während der Proteolyse ausgeführt, wo ausreichend ¹⁸O-Wasser verwendet werden muss, um alle gequollenen Gelstücke zu bedecken.
Theoretische Berechnungen mit Peptiden bis zu einer Größe von 3000 Da zeigen an, dass eine Veränderung von 2,5-fach oder höher in der Proteinexpression wahrscheinlich erforderlich ist, um eine klare und verlässliche Beobachtung der charakteristischen ¹⁶O-/¹⁸O-Intensitätsumkehr oder Massenverschiebung bei den Peptiden zwischen den zwei Experimenten zu erreichen. Demnach wird in den später beispielhaft dargestellten zwei Modellsystemen ein dreifacher Unterschied zur Verwendung ausgewählt. In beiden Fällen werden die Peptide des charakteristischen inversen Markierungsmusters klar detektiert und mit den Daten werden. die erwarteten Proteine exklusiv aus den Datenbänken identifiziert. In der Realität wird bei einer unterschiedlichen Proteinexpression typischerweise ein zweifacher oder größerer Unterschied in den Expressionsmengen als statistisch signifikant betrachtet. In einer typischen Proteomanalyse, die eine Erkrankung und normales Säugermaterial umfasst, können 50–300 solcher einzigartigen oder unterschiedlich exprimierten Proteine identifiziert werden, wie dies beispielsweise in Page et al., Drug Discovery Today 1999, 4: 55–62 beschrieben ist. Eine Ausschlussgrenze von fünffach oder mehr bei Proteinänderungen kann angewendet werden, um auf die wichtigsten Proteine zu fokussieren.
Zusätzliche Fraktionierungsschemata auf Protein- oder Peptidebene können zur Verringerung der Komplexität der Proteine in den Referenz- und Experimentalproben und der Komplexität der Proteingemische oder Peptidgemische, die das Massenspektrometer erreichen, erforderlich sein, um die Wahrscheinlichkeit der Wechselwirkung von getrennten Peptiden oder kleinen Proteinen zu verringern und somit die Detektion der inversen Markierungsmuster und der Identifizierung der Proteine zu verdeutlichen. Herkömmliche Fraktionierungstechniken zur Verringerung der Komplexität der Proteingemische umfassen unter anderem Ammoniumsulfatfällung, isoelektrische Fokussierung, Größenausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Adsorptionschromatographie, Umkehrphasenchromatographie, Affinitätschromatographie, Ultrafiltration, Immunfällung und Kombinationen hiervon. Herkömmliche Fraktionierungstechniken zur Verringerung der Komplexität von Peptidgemischen umfassen unter anderem Größenausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Adsorptionschromatographie, Umkehrphasenchromatographie, Affinitätschromatographie, Immunfällung und Kombinationen hiervon. Beispielsweise können allgemeine Affinitätsverfahren nach einem allgemeinen Markierungsschema angewendet werden, um eine bestimmte Peptidklasse zu isolieren. Solche Beispiele umfassen die Verwendung von immobilisierten Metallaffinitätssäulen (IMAC) zur Anreicherung von Phosphopeptiden und die Verwendung von ConA Kügelchen zur Isolierung von glycosylierten Peptiden, wie dies in Chakraborty et al. und Regnier, 2001, The 49^th ASMS Conference on Mass Spectrometry and Allied Topics, Chicago, Illinois beschrieben ist.
Die inverse Markierungsmethode ist schematisch in 1 gezeigt. In diesem Verfahren wird jeder der zwei Proteinpools, die unterschiedlich verglichen werden sollen (beispielsweise eine Kontrolle gegen einen Erkrankungszustand) in zwei gleiche Portionen aufgeteilt. Eine Portion von jedem der zwei Pools wird beispielsweise mit einem Reagenz, das ein schweres Isotop enthält, wie ¹⁸O durch das obige Verfahren markiert, während die verbleibende Portion nicht markiert wird, das heißt mit einem leichten Isotop, wie ¹⁶O (1). Dann wird eine Portion aus der Kontrolle und eine Portion aus der Pertubationsprobe so kombiniert, dass im ersten Experiment die markierten Proteine vom Pertubationspool stammen und im zweiten Experiment die markierten Proteine vom Kontrollpool stammen. Falls die Expression eines Proteins signifikant durch die Pertubation herauf- oder herabreguliert wurde (das heißt eine echte Verschiebung in den Signalintensitäten von ¹⁶O und ¹⁸O in einer Analyse beobachtet wird) sollte das Umgekehrte in der Analyse der anderen Probe aufgrund der inversen Markierung beobachtet werden.
Wie in 1 gezeigt, wird die schnelle Identifizierung der unterschiedlich exprimierten Proteine durch eine schnelle Identifizierung der von diesen Proteinen stammenden Peptide erreicht, die das charakteristische inverse Markierungsmuster zeigen. Für die meisten Proteine bleibt der Expressionsspiegel nach der Pertubation unverändert, was in einem ähnlichen Mengenprofil von Pool 1 und Pool 2 widergespiegelt wird. Daher ist in den Markierungsmustern zwischen den zwei inversen Markierungsexperimenten kein signifikanter Unterschied (das heißt eine ähnliche Menge der ¹⁶O- und ¹⁸O-Signale in beiden Experimenten) und diese Signale können im Prinzip durch die vergleichende Analyse der zwei Datensätze heraussubtrahiert werden. Die C-terminalen Peptide ohne ¹⁸O-Markierung werden ebenfalls heraussubtrahiert. Für ein Protein, bei dem die Expressionsmenge signifikant durch die Pertubation nach oben oder unten reguliert wurde, werden Veränderungen in den ¹⁶O- und ¹⁸O-Signalintensitäten beobachtet.
Wenn die Kontrolle nicht markiert wird und die Pertubationsprobe ¹⁸O-markiert ist, ist das ¹⁸O-Signal stärker, falls das Protein herausreguliert wurde, wobei im Gegensatz dazu das ¹⁶O-Signal stärker ist, falls eine Herabregulierung stattgefunden hat. Das Umgekehrte wird in der zweiten Analyse beobachtet, bei der die Markierung umgekehrt ist. In Abhängigkeit der Richtung der Umkehr des Intensitätsverhältnisses zwischen den zwei Analysen kann die Richtung der unterschiedlichen Expression des Proteins (das heißt Heraufregulation oder Herabregulation) bestimmt werden. Falls beispielsweise ein Protein durch einen Krankheitszustand in Pool 2 im Vergleich zu Kontrollpool 1 wesentlich heraufreguliert wird und wenn die Krankheitsprobe ¹⁸O-markiert ist, werden höhere Intensitäten der ¹⁸O-Signale für alle Peptide, die von diesem Protein stammen beobachtet, außer für das C-terminale Peptid. Wenn die Markierung im zweiten Experiment umgekehrt wird, worin der Kontrollpool ¹⁸O-markiert ist während der Krankheitspool nicht markiert ist, sind die ¹⁶O-Signale für diese Peptide stärker. Daher findet eine 2/4 Da Abwärtsmassenverschiebung des intensiveren Isotopenions zwischen den zwei inversen Markierungsexperimenten statt (das heißt vom ¹⁸O-Signal im ersten Experiment zum ¹⁶O-Signal im zweiten Experiment). In der Realität kann für Peptide mit größeren Massen (beispielsweise 1300 Da oder größer) die Massenverschiebung zwischen den zwei Analysen des intensivsten Ions als 1/3 Da statt 2/4 Da aufgrund der ¹³C-Interferenz detektiert werden, falls die unterschiedliche Proteinexpression nicht ausreichend signifikant ist, um den ¹³C-Effekt zu überwinden. Die Massenverschiebung des intensivsten Isotopenions spiegelt hier die Umkehr des Intensitätsverhältnisses wider. Mit diesem Verfahren muss man, statt das Verhältnis der ¹⁶O- zu den ¹⁸O-Signalen für jedes Peptid quantitativ zu berechnen, nur die zwei Datensätze vergleichen und die Peptide mit der charakteristischen Massenverschiebung identifizieren, was schnell und potentiell automatisch erreicht werden kann. Die Richtung der Verschiebung impliziert entweder eine Herauf- oder Herabregulation der betroffenen Proteine.
Bei der Identifizierung von unterschiedlich exprimierten Proteinen überwindet der inverse Markierungsansatz unter Verwendung jedes geeigneten Markierungsverfahrens Schwierigkeiten, die bei anderen Ansätzen des Stands der Technik inhärent sind, die eine Massenspektrometrie verwenden, wie dies später beschrieben ist.
Jede statistisch signifikante Veränderung in der Proteinexpressionsmenge sollte ein inverses Markierungsmuster in den inversen Markierungsexperimenten zeigen. Für eine metabolische ¹⁵N-Markierung ist die Massenzunahme bei der Markierung eine Variable, die von der Sequenz der Peptide abhängt (mit einem Bereich von etwa 1,0–1,5% des Peptidmolekulargewichts, im Mittel etwa 1,2%). Der variable oder unvorhersagbare Massenunterschied macht es extrem schwierig, die Peptidisotopenpaare mittels eines herkömmlichen Massenspektrometers zu korrelieren, falls die Spektren hoch komplex sind. Die Verwendung der ultrahoch auflösenden FT ICR (Fouriertransformationsionencyclotronresonanz) MS wurde für die Messung mit hoher Genauigkeit vorgeschlagen, um genaue Massenunterschiede zwischen den Peaks zu erhalten und so die Isotopenpeptidpaare mit hoher Zuverlässigkeit zuzuordnen. Eine weitere mögliche, aber unpraktikable Lösung ist die Verwendung der Tandem-MS. Das Isotopenpaar der Peptide sollte ein ähnliches Fragmentierungsmuster aufweisen und so mit den MS/MS Daten korreliert werden können. Bei der Anwendung des inversen Markierungsverfahrens schaut man auf die qualitativen Massenverschiebungen und nicht auf das Isotopenmuster und auch nicht auf die genauen Massenverschiebungen. Daher besteht keine starke Anforderung auf das Auflösungsvermögen der MS Geräte. Eine Massenverschiebung wird leicht erkannt, auch wenn die Isotopenpeaks für die Peptidionen mit höheren Ladungszuständen mittels eines Standardmassenspektrometers für die Einheitsauftrennung nicht vollkommen getrennt sind. Die Beobachtung/Schlussfolgerung wird ferner durch das ähnliche Fragmentierungsmuster der MS/MS Daten unterstützt, das im logischen anschließenden Schritt im Verfahren zur Erzielung der Identifizierung der Proteine erhalten wird. Bei den anderen Lösungen würde man eine doppelte Arbeit entweder durch die Messung der genauen Massenunterschiede von mehreren Signalpaaren zur Auswahl eines am besten passenden Paares oder durch Ausführung der MS/MS auf alle Signale und der Auffindung eines korrelierten Paares auf der Grundlage der Ähnlichkeit des Fragmentierungsmusters ausführen müssen. Der Ansatz der Verwendung eines MS/MS Fragmentierungsmusters zur Erreichung einer Korrelation der Isotopenpaare erfordert nicht nur eine enorme Menge an Gerätezeit zur Gewinnung der Daten, sondern erfordert auch einen großen Aufwand bei der Verarbeitung der Daten (unmöglich, dies manuell zu machen). Es würden immer Schwierigkeiten auftreten, wenn ein Isotopensignal zu schwach für eine genaue Massenmessung oder die Gewinnung von brauchbaren MS/MS Daten ist. Wenn keine inverse Markierung ausgeführt wird, ist die Zweideutigkeit ein echtes Problem, wenn ungepaarte (Isotopen) Signale im Fall von kovalenten Proteinveränderungen oder extremen Expressionsunterschieden detektiert werden. Detektierte ungepaarte Signale können mit ungepaarten Peptiden/Proteinen oder chemischem Hintergrund verwechselt werden. Eine qualitative Verschiebung wird mit einer inversen Markierung beobachtet, falls eine echte Veränderung bei einem Protein quantitativ oder qualitativ aufgetreten ist. Bei dem Ansatz der inversen Markierung kann man jedes Massenspektrometer mit Standardauftrennung verwenden und nur die minimalen, essentiellen Daten gewinnen, um eine schnelle Identifizierung von unterschiedlich exprimierten Proteinmarkern/Zielen ohne Zweideutigkeit zu erreichen. Eine relative Quantifizierung der Expressionsmenge kann wieder nur für die unterschiedlich exprimierten Proteine (oder Proteine von Interesse) erforderlichenfalls anschließend ausgeführt werden.
Die folgenden Beispiele dienen zur Erläuterung der Erfindung, sollen aber den Umfang hiervon nicht beschränken.
BEISPIELE
Materialien
¹⁸-O Wasser (95% Atom) wird von Isotech Inc. (Miamiburg, OH) bezogen.
¹³C-Algenproteinextrakt und ¹³C-¹⁵N-Algenproteinextrakt werden von Isotech Inc. (Miamisburg, OH) bezogen.
ICAT Reagenz (sowohl leichtes D₀ als auch schweres D₈) wird von Applied Biosystems (Cambridge, MA) bezogen.
Beispiel 1
Inverse ¹⁸O-Markierung unter Verwendung eines Modellsystems mit 8 Proteinen
Im Handel erhältliche Proteine wie BSA, Aldolase, Carbonsäureanhydrase, β-Casein, Hühneralbumin, Apotransferrin, β-Lactoglobulin und Cytochrom C (Sigma) werden ohne weitere Reinigung verwendet. Die 8 Proteine werden in einem molaren Verhältnis von 1:1:1:1:1:1:1:1 für den "Kontrollpool" und 0,3:3:1:1:1:1:1:1 für den "behandelten Pool" gemischt. Zwei identische Aliquots, die jeweils 10 pmol der unveränderten Komponenten enthalten, werden von jedem Pool entnommen und mittels einer Speedvac getrocknet. Die ¹⁸O-Markierung wird mittels zweier Verfahren während der Proteolyse und der Postproteolyse ausgeführt. Für eine Proteolysemarkierung wird eines der zwei getrockneten Aliquots mit 20 μl normalem Wasser und das andere mit 20 μl ¹⁸O-Wasser rekonstituiert, wobei beide 50 mM Ammoniumbicarbonat enthalten. Trypsin (modifiziert, Promega) wird mit einem 1:100 Trypsin-zu-Protein Verhältnis (Gewicht : Gewicht) zu jeder Lösung gegeben und der Verdau kann bei 37°C für ~20 Stunden ablaufen. Für die Markierung nach der Proteolyse werden alle Trypsinverdaus in einem normalen Wasser-Ammoniumbicarbonatpuffer mit demselben Trypsin-zu-Protein Verhältnis für ~12 Stunden ausgeführt. Die entstehenden Peptidgemische werden dann mit einer Speedvac vollständig getrocknet. 10 μl an ¹⁸O oder normalem Wasser werden jeweils zu den getrockneten Peptidgemischen für die ¹⁸O-Markierung nach der Proteolyse gegeben. Das Verfahren kann bei Raumtemperatur für ~12 Stunden ablaufen. Vor der Analyse wird sowohl für die Markierung während der Proteolyse als auch nach der Proteolyse die ¹⁶O-Kontrollprobe mit der ¹⁸O-"behandelten" Probe und die ¹⁸O-Kontrollprobe mit der ¹⁶O-"behandelten" Probe gemischt. Es wird dieselbe MS Analyse mit beiden Gemischen ausgeführt.
Beispiel 2
Inverse ¹⁸O-Markierung unter Verwendung eines Ganzzelllysats, das mit PTP (Protein-Tyrosin-Phosphatase) versetzt ist.
Etwa 5 × 10⁷ geerntete CHO Zellen werden mechanisch (Einfrieren/Auftauen) mittels eines Puffers lysiert, der 10 mM Tris, 1 mM EDTA, pH 7,4 enthält. Das entstehende Zelllysat aus 2,5 ml mit 0,4 mg/ml Proteinkonzentration wird in 4 Aliquots aufgeteilt. Zwei werden mit 10 pmol PTP-1B Protein (intern exprimiert, Reste 1–298) (PTP10) versetzt und die anderen zwei mit 30 pmol PTP-1B (PTP30). Es wird Trypsin zu jeder Lösung mit einem 1:100 (Gewicht : Gewicht) Trypsin-zu-Gesamtprotein Verhältnis gegeben, um den Verdau zu starten. Die Proteolyse kann für ~12 Stunden bei 37°C ablaufen. Die entstehenden Lösungen werden zentrifugiert und der Feststoff wird verworfen. Die Lösungen werden dann in einer Speedvac vollständig getrocknet. Sowohl bei PTP10 als auch bei PTP30 wird jeweils eines der identischen Aliquots mit 10 μl an ¹⁸-O Wasser und das andere mit 10 μl an normalem Wasser rekonstituiert. Der ¹⁸-O Einbau nach der Proteolyse kann bei Raumtemperatur für ~12 Stunden ablaufen. Nach der Analyse werden die ¹⁶O-PTP10 und ¹⁸O-PTP30 Proben gemischt und ebenfalls die ¹⁸O-PTP10 und ¹⁶O-PTP30 Proben. Jedes Gemisch wird mit 100 μl der mobilen Phase A (0,1% Ameisensäure – 0,01% TFA in Wasser) verdünnt und durch ein 0,4 μm Microcon-Filter filtriert. Das Filtrat wird auf LC/MS zur Analyse injiziert.
Beispiel 3
LC/MS und LC/MS/MS Peptidanalyse der invers ¹⁸O-markierten Peptidgemische
Die MS Analyse der invers ¹⁸O-markierten Peptidgemische wird durch LC-ESI MS mittels eines Finnigan LCQ Ionenfallenmassenspektrometers ausgeführt. Es wird eine 1,0 × 150 mm Vydac C18 Säule für die online Peptidtrennung mit einem Gradienten aus 2-2-20-45-98-98% B bei 0-2-10-65-66-70 Minuten verwendet. Die mobile Phase A ist 0,1% Ameisensäure – 0,01% TFA in Wasser und B ist 0,1% Ameisensäure – 0,01% TFA in Acetonitril. Die Flussrate beträgt 50 μl/min. Nach der LC Säule wird der Fluss 9:1 aufgetrennt, wobei etwa 5 μl/min in die MS gehen und 45 μl/min für eine spätere Verwendung gewonnen werden. Das LCQ Ionenfallenmassenspektrometer wird in einem datenabhängigen Modus gefahren, das automatisch eine MS/MS mit dem intensivsten Ionen jedes Scans ausführt, wenn die Signalintensität einen voreingestellten Grenzwert überschreitet. Erforderlichenfalls werden die gesammelten Proben konzentriert und erneut unter Bildung von MS/MS Daten analysiert, die nicht automatisch im ersten Lauf für die Peptide von Interesse gewonnen wurden. Die relative Kollisionsenergie wird auf 45% eingestellt. Unter dieser Bedingung fragmentieren erfahrungsgemäß die meisten Peptide. Ein 8 Da Fenster wird für die Vorläuferionenselektion verwendet.
Beispiel 4
MALDI TOF MS Peptidanalyse der invers ¹⁸O-markierten Peptidgemische
Die Gemischproben werden einfach 1:3 bis 1:5 mittels der MALDI Matrixlösung (gesättigte α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure in 50% Acetonitril – 0,1% TFA) verdünnt und ~1 μl der schließlichen Lösung (enthält etwa 500 fmol basierend auf den unveränderten Komponenten für das Achtproteinsystem) werden auf das MALDI Ziel zur Analyse aufgetragen. Die Analyse wird auf einem Bruker REFLEX III MALDI TOF Massenspektrometer ausgeführt, das im Reflektronmodus mit einer verzögerten Ionenextraktion gefahren wird. Erforderlichenfalls wird auch ein Post Source Decay (PSD) mit den Peptidionen von Interesse ausgeführt.
Beispiel 5
Datenbanksuche der invers ¹⁸O-markierten Peptide
Die Suchsoftware PROWL (Proteometrics, New York, NY) und MASCOT (Matrix Science, London, UK) werden zur Suche in den Proteindatenbanken zur Identifizierung von Proteinen mittels Peptidfingerabdrücken, MS/MS Fragmenten und prozessierten PSD Spektren verwendet. Zur Suche mittels Peptidfinderabdruck Information werden die Peptidionen, die ein inverses Markierungsmuster oder eine Massenverschiebung von 2 oder 4 Da des am häufigsten vorkommenden Isotopenions zwischen den zwei Markierungsexperimenten aufweisen, auf der Grundlage der Massenverschiebung (nach oben oder unten) aussortiert. Jede Liste wird getrennt für eine Datenbanksuche zur Identifizierung der Proteine verwendet. Für Suchen mittels Peptidsequenzinformation werden die MS/MS Spektren eines Peptids aus den zwei inversen Markierungsexperimenten verglichen und Y Ionen mit einer Massenverschiebung von 2 oder 4 Da werden identifiziert. Diese Ionen werden alleine oder in Kombination mit B Ionen verwendet, um unter Identifizierung der Proteine die Proteindatenbanken zu durchsuchen. Eine iterative Suche, die die Daten der Peptidkarte und MS/MS kombiniert, wird ebenfalls durchgeführt. Alle Ionen, die ein klares, inverses Markierungsmuster in der Karte zeigen und durch Massenverschiebungen von Fragmentionen in den MS/MS Daten unterstützt werden, werden identifiziert, indem man zuerst ihre MS/MS Fragmente/Sequenzanfügungen verwendet. Die mit den identifizierten Proteinen assoziierten Peptide werden dann aus der Liste entfernt und es wird eine zweite Suchrunde mittels der Massen der verbleibenden Peptide gestartet. Für die Ionen, für die keine überzeugende Schlussfolgerung getroffen werden kann, wird eine zweite Analyse mittels der gewonnenen Probe ausgeführt, um MS/MS Daten von ihnen zu erhalten. Die entstehenden Daten werden auf dieselbe Weise verwendet, um die Datenbanken bezüglich einer Proteinidentifizierung zu durchsuchen.
Beispiel 6
MS Analyse der inversen ¹⁸O-Markierungsmethode mittels des Modelsystems aus 8 Proteinen
Die inverse ¹⁸O-Markierung und die MS Analyse werden auf ähnliche Weise ausgeführt, wie dies in 1 mit dem aus 8 Proteinen bestehenden Modellsystem gezeigt ist, worin BSA um den Faktor 3 "herunterreguliert" wird und Aldolase um den Faktor 3 "heraufreguliert" wird. Bei einer Analyse mittels eines LCQ mit einer anschließenden RP LC wird ein klar inverses Markierungsmuster oder eine 2/4 Da Massenverschiebung für mehrere Peptide beobachtet (2–3 (A, B)). Nach einer Datananalyse werden schnell zwei Listen mit Peptidmassen erstellt, die auf der Richtung der Massenverschiebung beruhen. Wenn jede getrennt zum Durchsuchen der Datenbank verwendet wird, wird nur die Aldolase mittels der Liste einer 2/4 Abwärtsverschiebung identifiziert, die einer Hochregulation der Proteinexpression entspricht, während BSA mittels der Liste der Aufwärtsmassenverschiebung identifiziert wird, die eine Herabregulation der Proteinexpression entspricht. MS/MS Spektren werden automatisch in einem datenabhängigen Modus für wenige der Peptide erhalten. Es wird auch ein iteratives Suchschema angewendet, wobei die vereinigte Massenliste aller Verschobenen ohne Berücksichtigung der Richtung der Verschiebung angewendet wird. Wenn ein Protein mit hoher Sicherheit (in diesem Fall Aldolase), entweder mit der Massenliste oder einem MS/MS Spektrum identifiziert ist, werden die damit zusammenhängenden Peptide des Proteins von der Massenliste entfernt. Dann wird eine zweite Suche mit der verbleibenden Liste zur Identifizierung des zweithäufigsten Proteins (in diesem Fall BSA) ausgeführt. Als Konsequenz der inversen Markierung wird eine sehr reichhaltige Information in die MS/MS Daten eingebettet. Zuerst sind, da die Markierung am C-Terminus jedes Peptids eingeführt wurde, die Y Ionen in einem MS/MS Spektrum die Fragmente, die die Markierung tragen und das charakteristische inverse Markierungsmuster für Proteine zeigen, die unterschiedlich exprimiert werden. Wie in den 2–3 (C, D) gezeigt, wird für Proteine, deren "Expressionsmenge" signifikant durch "Pertubation" geändert wird, das inverse Markierungsmuster oder eine 2/4 Da Massenverschiebung, die auf molekularem Ionenlevel an den Peptiden beobachtet werden an die Y Ionen in den MS/MS Massenspektren weitergegeben. Die Beobachtung des charakteristisch inversen Markierungsmusters der Fragmentionen in den MS/MS Spektren liefert eine weitere Verifizierung und Bestätigung einer unterschiedlichen Proteinexpression. Da die meisten Peptidfragmente weniger Ladungen tragen, als das Elternmolekül (meistens einzeln geladen in den in dieser Schrift gezeigten Figuren) ist die Massenverschiebung deutlicher und daher leichter zu erkennen im Vergleich zu der des mehrfach geladenen Vorläuferions. Zweitens liefert das inverse Markierungsmuster, das in den Y Ionen der MS/MS Spektren reflektiert wird, ein sehr leichtes Verfahren zur Identifizierung von Y Ionen und B Ionen zur Interpretation eines MS/MS Spektrums. Die Fragmente mit Massenverschiebungen sind Y und Y-verwandte Ionen und die ohne Massenverschiebung sind B oder B-verwandte Ionen. Obwohl die Interpretation nicht zum Durchsuchen der Datenbanken mittels MS/MS Daten erforderlich ist, hilft eine angefügte Spezifität bei der Erhöhung der Effizienz und Genauigkeit der Proteinidentifizierung über eine Datenbanksuche. Sowohl BSA als auch Aldolase werden positiv mittels der MS/MS Daten und der Y/B Ionenzuordnungen (2–3) identifiziert. Tatsächlich werden alle erwarteten Proteine mittels der MS/MS Daten und der Y/B Ionenzuordnungen (2–3 und 5–6) identifiziert. Diese Vorteile sind wichtiger, wenn man mit neuen Proteinen umgeht, bei denen eine de novo Sequenzierung erforderlich ist. Die Fähigkeit zur Zuordnung von Y und B Ionen erleichtert sehr stark das "Auslesen" der Sequenz aus einem MS/MS Spektrum. Obwohl eine genaue Quantifizierung der Proteinexpression nicht die beabsichtigte Verwendung des Verfahrens ist, ist die Information sowohl mit MS als auch MS/MS Daten erhältlich, falls man die Aufgabe durchführen möchte (das heißt die Signalintensitäten von ¹⁶O zu ¹⁸O nach der Korrektur der natürlichen ¹³C-Isotopenverteilung). MALDI TOF MS, die direkt auf das Gemisch ohne jede Trennung ausgeführt wird, führt zu einem Peptidkartenspektrum, das deutliche Überlappungen zeigt, die die Dateninterpretation erschweren (4 (A, B)). Trotzdem kann das inverse Markierungsmuster immer noch für mehrere Ionen beobachtet werden (4 (C, D)). Die PSD wird mit wenigen Ionen ausgeführt und die Proteine können mittels der PSD Daten identifiziert werden (5).
Beispiel 7
MS Analyse der inversen ¹⁸O-Markierung mittels eines PTP-versetzten Zelllysatsystems
Mit dem Ganzzelllysatsystem, bei dem PTP-1B Protein in zwei verschiedenen Mengen mit der Intention zur Nachahmung eines komplexen Proteingemischsystems versetzt wird, werden viele Peptidsignale mit guten Signalintensitäten detektiert (Daten nicht gezeigt). Sogar mit einer anschließenden On-line-LC-Trennung erwartet man deutliche Überlappungen und beobachtet diese auch. Trotzdem werden, wenn die zwei Datensätze aus der inversen Markierung analysiert und verglichen werden, einige Ionen mit dem charakteristischen, inversen Markierungsmuster, primär mit einer 4 Da Verschiebung identifiziert (6 (A, B)). Die getrennten und gewonnenen Proben werden einer zweiten Analyserunde unterzogen, um ihre MS/MS Daten zu erhalten. Die MS/MS Daten mit Y Ionen, die das inverse Markierungsmuster einer 4 Da Verschiebung zwischen den zwei Parallelexperimenten zeigen, verifizieren/bestätigen die Massenverschiebung, die mit den Vorläuferpeptiden beobachtet wird und somit die unterschiedliche Expression des Proteins (6 (C, D)). Eine Datenbanksuche mittels der leicht erkannten Y Ionen der Massenverschiebung führt zur schlussfolgernden Identifizierung des Proteins als humanes PTP-1B. In diesem bestimmten Fall mit Ganzzelllysat liefert die MALDI MS Peptidkartierung erwartungsgemäß nicht so viel brauchbare Information aufgrund der starken Überlappung der Peptidsignale (Daten nicht gezeigt).
Im Gegensatz zum metabolischen Markieren der Proteine während der Zellkultur (¹³C/¹⁵N/²H) erfordert dieser Ansatz keine speziellen Kenntnisse und/oder Einrichtungen. Die Analyse von Gewebeproteinen und die Identifizierung der Marker-/Zielproteine von Geweben kann leicht durchgeführt werden. Im Gegensatz zur chemischen Markierung umfasst dieses Verfahren keine zusätzlichen Umsetzungs-/Aufarbeitungsschritte. Daher vermeidet es einen potentiellen Probenverlust, der mit zusätzlichen Schritten assoziiert ist. Ein weiterer Nachteil, der mit der für Reste spezifischen chemischen Markierung assoziiert ist, nämlich die hohe Wahrscheinlichkeit, posttranslationale Modifikationsinformation zu verlieren, wird auch vermieden. Da zwei zusammenwirkende Analysen mit der inversen Markierungsmethode ausgeführt werden, können Signale ohne isotopische Gegendetektion entweder aufgrund von extremen Veränderungen in der Expressionsmenge und der dynamischen Bereichslimitierung der MS Detektion oder von kovalenten Modifikationen von Proteinen ohne Zweifel identifiziert werden.
Beispiel 8
Inverse ¹⁵N-Markierung unter Verwendung eines Modellsystems mit 2 Proteinen
Normales und ¹⁵N-markiertes PTP Protein (1–298) und normales und ¹⁵N-markiertes HtrA Protein (161–373) werden intern mittels Standardkulturbedingungen mit den ¹⁵N-markierten Materialien hergestellt, die durch Fermentation von ¹⁵N-angereicherten Kulturmedien hergestellt werden. Die Authentizität der Proteine und das Ausmaß des Isotopeneinbaus werden durch MS der Proteinendprodukte ermittelt. Die Markierungsausbeute beträgt mehr als 90% für beide Proteine gemäß den MS Ergebnissen. Die Modellsysteme mit 2 Proteinen werden hergestellt durch Zusammenmischen der zwei einzelnen Proteine, nämlich PTP und HtrA, mit dem regulären ¹⁴N-Gemisch, das das Gemisch aus den zwei ¹⁴N-Proteinen ist, und dem ¹⁵N-Gemisch, das das Gemisch der zwei ¹⁵N-markierten Proteine ist. Die "Kontrolle" ist ein Gemisch der zwei Proteine in einem molaren Verhältnis von 1:1. Die Materialien des "behandelten" oder "veränderten Zustands" werden so hergestellt, dass sie vier unterschiedliche Stufen einer "unterschiedlichen Proteinexpression" für das PTP Protein nachahmen, während das Ausmaß der "Expression" von HtrA unverändert bleibt. Die molaren Verhältnisse von PTP : HtrA für die vier "behandelten" Gemische sind 3:1, 100:1, 0,3:1 und 0,01:1, die jeweils eine dreifache und eine hundertfache Heraufregulierung und eine dreifache und hundertfache Herabregulierung nachahmen. Die normalen ¹⁴N-Gemische und die markierten ¹⁵N-Gemische werden auf dieselbe Weise hergestellt. Um die inversen Markierungsexperimente auszuführen, wird ein Aliquot einer ¹⁴N-Kontrolle mit einem Aliquot einer ¹⁵N-"behandelten" gemischt (die jeweils dieselbe Menge eines HtrA Proteins enthalten), wobei die inverse Markierung durch die Kombination der ¹⁵N-Kontrolle mit der ¹⁴N-"behandelten" auf dieselbe Weise erreicht wird. (Somit werden für jedes vergleichende Proteomanalyse-Experiment zwei inverse Markierungsgemische hergestellt). Dasselbe Verfahren wird für alle vier "unterschiedlichen" Stufen ausgeführt. Der anschließende Trypsinverdau wird mit allen Gemischen in einem 1:50 Trypsin-zu-Proteinverhältnis (Gewicht : Gewicht) (modifiziertes Trypsin von Promega, Sequenzierungsreinheit) bei 37°C für ~7 Stunden in 50 mM Ammoniumbicarbonatpuffer ausgeführt (die zwei Proteine lassen sich unter diesen Bedingungen bekanntermaßen ohne vorherige Reduktion und Alkylierung verdauen). Eine MS Analyse sowohl mittels MALDI als auch Elektrospray LC/MS wird mit allen Peptidgemischen ausgeführt. Aliquots, die jeweils 10 pmol HtrA Peptide enthalten, werden für die LC/MS Analyse verwendet.
Beispiel 9
Inverse ¹⁵N-Markierung unter Verwendung von Algenzelllysaten die mit PTP Protein versetzt sind
1 ml einer Lösung, die 6 M Guanidin HCl – 50 mM Tris – 50 mM NaCl pH 7,4 enthält, wird jeweils zu 10 mg eines ¹³C-Algenproteinextrakts und eines ¹³C-¹⁵N-Algenproteinextrakts gegeben. Die Gemische werden gevortext und für 40 Minuten zur Solubilisierung der Proteine ultrabeschallt. Nach der Zentrifugation bei 20 000 Upm für 20 Minuten werden die Überstände für eine weitere Verwendung entnommen. Eine große Menge an unlöslichem Material wird verworfen. 10 mM DTT wird zu den Lösungen gegeben und die Reduktionsreaktion wird für 1 Stunde bei 50°C fortgesetzt. Die Cysteinalkylierung wird durch die Zugabe von 40 mM Iodessigsäure-Natriumsalz ausgeführt, wonach bei Raumtemperatur im Dunkeln für 1 Stunde geschüttelt wird. Ein Centricon-Filter mit 1 kDa Molekulargewicht Ausschlussgrenze wird anschließend verwendet, um den Überschuss an Reagenzien zu entfernen und den Puffer mit 50 mM Ammoniumbicarbonat auszutauschen. Die Proteinkonzentration der Extrakte wird mittels der Bradford Standardmethode gemessen. 10 pmol des normalen PTP Proteins wird zu einem Aliquot an ¹³C-Algenproteinextrakt zugesetzt, der etwa 0,05 mg Gesamtprotein enthält, um die ¹⁴N-"Kontrolle" herzustellen und 10 pmol ¹⁵N-PTP werden zu einem Aliquot an ¹³C-¹⁵N-Algenproteinextrakt als ¹⁵N-"Kontrolle" zugesetzt, der etwa 0,05 mg Gesamtprotein enthält. Für die "behandelten" Proben wird eine dreifache Herabregulierung durch das Zusetzen von 3 pmol PTP zu einem identischen Aliquot eines Algenextrakts erzeugt und eine hundertfache Herabregulierung wird durch Zusetzen von 0,1 pmol PTP zu einem weiteren Aliquot eines Algenextrakts hergestellt. Das ¹⁴N-Material ist das Ergebnis der Zusetzung von ¹⁴N-PTP zu dem Aliquot des ¹³C-Algenextrakts und das ¹⁵N-Material wird durch Zusetzen von ¹⁵N-PTP zu einem Aliquot des ¹³C-¹⁵N-Algenextrakts hergestellt. Die inversen Markierungsexperimente laufen auf dieselbe Weise ab, indem die Aliquots der ¹⁴N-Kontrolle mit ¹⁵N-"behandelt" und der ¹⁵N-Kontrolle mit ¹⁴N-"behandelt" kombiniert werden. Ein Trypsinverdau der vier entstehenden, inversen Markierungsgemische (zwei für unterschiedliche Mengen) wird mit einem 1:100 Trypsin-zu-Proteinverhältnis (Gewicht : Gewicht) bei 37°C für ~16 Stunden in 50 mM Ammoniumbicarbonatpuffer ausgeführt. Alle Verdaus werden durch Elektrospray LC/MS analysiert.
Beispiel 10
MALDI TOF MS Peptidanalyse der invers ¹⁵N-markierten Peptidpemische
Alle Verdaugemische der zwei Proteinmodellsysteme werden durch MALDI TOF MS analysiert. Die Gemischproben werden 1:5 mittels der MALDI Matrixlösung (gesättigte α-Cyano-4-hydroxyzimtsäure in 50% Acetonitril – 0,1% TFA) verdünnt und jeweils ~1 μl der schließlichen Lösungen (enthalten etwa 500 fmol an HtrA Peptiden) wird auf das MALDI Ziel zur Analyse aufgetragen. Die Analyse wird auf einem Bruker REFLEX III MALDI TOF Massenspektrometer ausgeführt, das im Reflektronmodus mit einer verzögerten Ionenextraktion gefahren wird.
Beispiel 11
LC/MS und LC/MS/MS Peptidanalysen der invers ¹⁵N-markierten Peptidgemische
Alle Verdaugemische der Modellsysteme mit 2 Proteinen und die aus den Algenmarkierungssystemen werden durch LC/MS-MS/MS analysiert. Die Analyse wird durch Elektronenspray LC/MS mittels eines Finnigan LCQ Ionenfallenmassenspektrometers ausgeführt. Es wird eine 1,0 × 150 mm Vydac – C18 Säule für eine Online-Peptidtrennung verwendet. Ein Gradientenprogramm von 2-20-45-98-89% B bei 0-10-65-66-70 Minuten wird verwendet. Die mobile Phase A ist 0,25% Ameisensäure in Wasser und die mobile Phase B ist 0,25% Ameisensäure in Acetonitril. Die Flussrate beträgt 50 μl/min. Nach der Elution von der LC Säule wird der Fluss 9:1 aufgeteilt, wobei etwa 5 μl/min in die MS gehen und 45 μl/min zur späteren Verwendung gesammelt werden. Das LCQ Ionenfallenmassenspektrometer wird in einem Daten-abhängigen Modus gefahren, wobei die MS/MS automatisch mit dem intensivsten Ion jedes Scans ausgeführt wird, wenn die Signalintensität einen voreingestellten Grenzwert überschreitet. Erforderlichenfalls werden die gesammelten Proben konzentriert und erneut unter Gewinnung von MS/MS Daten analysiert, die nicht automatisch im ersten Lauf für die Peptide von Interesse gewonnen wurden. Die relative Kollisionsenergie wird auf 45% eingestellt, bei der die meisten Peptide wirksam fragmentieren. Ein 5 Da Fenster wird für die Vorläuferionenselektion verwendet.
Beispiel 12
Datenbanksuche der invers ¹⁵N-markierten Peptide
Die Suchsoftware PROWL (Proteometrics, New York, NY) und MASCOT (Matrix Science, London, UK) werden zur Suche der Proteindatenbanken zur Identifizierung von Proteinen mittels Peptidfingerabdrücken und MS/MS Fragmenten verwendet. Für die Suche unter Verwendung der Peptidfingerab druckinformation werden Peptidionen, die ein inverses Markierungsmuster zwischen den zwei inversen Markierungsexperimenten aufweisen, auf der Grundlage der Richtung der Massenverschiebung (zunehmend oder abnehmend) aussortiert. Jede Liste wird getrennt für eine Datenbanksuche zur Identifizierung der Proteine verwendet. Für Suchen mittels Peptidsequenzinformation werden die MS/MS Spektren eines Peptids aus den zwei inversen Markierungsexperimenten verglichen und ihre Korrelation wird weiter durch ihr ähnliches Fragmentierungsmuster verifiziert/bestätigt. Das MS/MS Spektrum des ¹⁴N-Peptids (geringer in der Masse) wird zur Datenbanksuche für die Proteinidentifizierung verwendet.
Beispiel 13
MS Analyse für das inverse ¹⁵N-Markierungsverfahren mittels des Modellsystems mit 2 Proteinen
Es wird eine direkte MALDI Analyse erfolgreich mit den Gemischen des Modellsystems mit 2 Proteinen ausgeführt. Eine Off-line Kupplung der Trennung (wie mit zweidimensionaler Chromatographie) und einer MALDI TOF MS mit einem Verdau eines komplexen Proteingemisches (beispielsweise einem Gesamtzelllysat) kann in jeder Fraktion die hier gezeigte Situation widerspiegeln. Im Gegensatz zum inversen Markierungsverfahren kann bei einer Anwendung eines Einzelexperimentansatzes sogar in Fällen, bei denen die unterschiedliche Proteinexpression nicht so drastisch ist, dass beide Isotopenpaare deutlich detektiert werden (beispielsweise eine dreifache Veränderung, 7(A)), eine Korrelation von Isotopenpaaren immer noch schwer zu erreichen sein, wie die, die im m/z Bereich von 1550–1600 gezeigt ist. Jedoch können durch einen Subtraktionsvergleich von zwei MALDI Spektren aus dem inversen Markierungsexperiment (7–8 (A, B)) die Signalpaare aus Proteinen ohne signifikante, differentielle Expression heraussubtrahiert werden (wie die, die mit Pfeilen entlang der horizontalen Achse markiert sind) und zu sehr viel einfacheren Spektren für eine leichtere Korrelation führen. Wenn die unterschiedliche Proteinexpression nicht zu drastisch ist (beispielsweise tausendfach oder weniger) und beide Isotopensignale detektiert werden, wird leicht erkannt, dass die Umkehr des Signalintensitätsverhältnisses die Korrelation unterstützt (7 (A, B)). Falls keine inverse Markierung verwendet wird, treten Fehler wahrscheinlicher bei der Korrelation von Isotopenpaaren auf, wenn eine deutlichere unterschiedliche Expression aufgetreten ist, so dass die schwächeren Isotopensignale aufgrund der Limitation des dynamischen Bereichs in der MS Detektion nicht detektiert werden. In dieselbe Kategorie fällt eine kovalente Veränderung des Proteins als Ergebnis einer Pertubation, bei der kovalente Modifikationen von Proteinen auftreten, wie eine Proteinprozessierung am Terminus oder posttranslationale Modifikationen. Die die kovalenten Veränderungen tragenden Peptide werden ohne das isotopische Gegenstück detektiert, da die Modifikationen im Kontrollzustand nicht vorkommen. Die inverse Markierung bietet eine einfache Lösung für diese Probleme. Obwohl eine hundertfache Herabregulierung nicht drastisch genug ist, um die schwächeren Isotopensignale vollständig aus der Detektion verschwinden zu lassen, ist es ein gutes Beispiel, um die Vorteile des Ansatzes zu demonstrieren. Wie in 8 gezeigt (A, B) wird das inverse Markierungsmuster leicht nach einer subtraktiven Bereinigung von Signalen von Proteinen ohne signifikant unterschiedliche Expression erkannt. (Man sollte im Kopf behalten, dass der Bereich an Stickstoffatomen pro Peptidsequenz normalerweise größer als 1% des Peptidmolekulargewichts und kleiner als 1,5% des Peptidmolekulargewichts sein sollte und im Mittel etwa 1,2% des Molekulargewichts beträgt). Die Verdaugemische aus den Modellsystemen mit 2 Proteinen werden auch durch Elektrospray LMC/MS (9 (a–c)) analysiert. Die Daten legen nahe, dass die Isotopenpaare keine signifikante Trennung durch Umkehrphasenchromatographie zeigen. Ein schneller Vergleich der zwei Grundpeakionenchromatogramme aus einem inversen Markierungsexperiment (9(a)) führt zur schnellen Identifizierung der Grundpeakpeptide des inversen Markierungsmusters (Massenverschiebungen) oder von Proteinen mit unterschiedlicher Expression. Auf jeden Fall muss man die MS Daten prozessieren, um andere Peptide des inversen Markierungsmusters zu identifizieren, die in geringerer Menge vorkommen oder mit den häufiger vorkommenden Peptiden co-eluieren. Wenn die Peptidsignale mit einem inversen Markierungsmuster identifiziert sind, werden die MS/MS Daten analysiert, die automatisch in einem datenabhängigen Funktionsmodus erhalten wurden. Ihr ähnliches Fragmentierungsmuster würde die Korrelation von Isotopenpaaren und so die korrekte Schlussfolgerung einer unterschiedlichen Proteinexpression bestätigen. Die Daten werden dann zur Suche in den Proteindatenbanken zur Proteinidentifizierung verwendet (9(c)). In diesem Fall wird das PTP-1B Protein leicht aus der Datenbank identifiziert. In der Praxis kann bei der Bearbeitung eines komplexen Proteinsystems ein iteratives Suchschema, das die Ionendaten mit dem inversen Markierungsmuster aus der Peptidkarte und der MS/MS kombiniert, ausgeführt werden. Alle Ionen, die ein klar inverses Markierungsmuster in der Karte zeigen und ferner durch ähnliche Fragmentierungsmuster der MS/MS Daten unterstützt werden, werden zuerst mittels ihrer MS/MS Daten identifiziert (des ¹⁴N-Ions oder einer geringeren Masse). Die mit den identifizierten Proteinen assoziierten Peptide können von der Peptidliste entfernt werden und es wird eine zweite Suchrunde mittels der MS/MS Daten der verbleibenden Peptide mit einem inversen Markierungsmuster gestartet. Für die Ionen, für die keine MS/MS Daten automatisch erhalten wurden, wird eine zweite Analyse mittels der gewonnenen Probe unter Gewinnung ihrer MS/MS Daten ausgeführt. Die Daten werden dann auf dieselbe Weise für die Suche in den Datenbanken zur Proteinidentifizierung verwendet.
Beispiel 14
MS Analyse der inversen ¹⁵N-Markierungsmethode mittels des versetzten Algenzelllysatsystems
Um die Anwendung des Ansatzes auf ein komplexeres Gemisch zu demonstrieren, wird PTP-1B Protein, sowohl unmarkiert als auch ¹⁵N-markiert, zum Algenzelllysat gegeben, und jeweils ¹³C und ¹³C/¹⁵N in verschiedenen Mengen (dreifache und hundertfache Herabregulierung), um die unterschiedliche Proteinexpression nachzuahmen. Das inverse Markierungsexperiment wird dann ausgeführt und die Gemische werden durch LC/MS-MS/MS analysiert. Wenn zwei Datensätze aus jedem inversen Markierungsexperiment verglichen werden, werden mehrere Ionen, die die charakteristischen, inversen Markierungsmassenverschiebungen aufweisen, extrahiert (10 (A, B)). Die aufgespaltenen und gesammelten Proben werden einer zweiten Analyse unterzogen, um MS/MS Daten mit den Ionen zu erhalten, die das inverse Markierungsmuster zeigen. Ihr ähnliches Fragmentierungsmuster validiert klar die Massenverschiebung oder das inverse Markierungsmuster, das mit den Vorläuferpeptiden erhalten wurde und so die unterschiedliche Expression des Vorläuferproteins (10 (C, D)). Eine Datenbanksuche mittels der MS/MS Daten des ¹⁴N-Peptids führt zu der ausschließlichen Identifizierung des humanen PTP-1B Proteins.
Beispiel 15
Inverse ICAT Markierung mittels eines Modellsystems mit 6 Proteinen
Im Handel erhältliche Proteine wie BSA, Aldolase, β-Casein, Apotransferrin, β-Lactoglobulin und Cytochrom C (Sigma) werden ohne weitere Reinigung verwendet. Die sechs Proteine werden in einem molaren Verhältnis von 1:1:1:1:1:1 für die "Kontrolle" und 0,3:3:1:1:1:1 für den "behandelten" Pool gemischt. Das empfohlene Protokoll ist folgendes. Die Proteingemische der Kontrolle und der "behandelten" Probe werden zuerst reduziert und denaturiert. Dann wird eine ICAT Derivatisierung mittels inverser Markierung (1) ausgeführt, wobei eine Hälfte des Gemisches mit dem D₀-ICAT Reagenz und die verbleibende Hälfte mit dem D₈-ICAT Reagenz umgesetzt wird. Die inverse Markierung läuft durch Mischen der D₀-Kontrolle mit der D₈-"behandelten" und der D₈-Kontrolle mit der D₀-"behandelten". Der Trypsinverdau wird dann mit beiden Gemischen mit einem 1:50 (Gewicht : Gewicht) Trypsin-zu-Protein Verhältnis für ~16 Stunden bei 37°C ausgeführt. Die entstehenden Peptidgemische gehen zuerst durch einen Kationenaustauschschritt, um die überschüssigen Reagenzien, Denaturierungsmittel und Reduktionsmittel usw. wegzureinigen. Dann gehen sie durch eine Avidinsäule zur Affinitätsanreicherung der markierten (Cystein-enthaltenden) Peptide. Aliquots, die jeweils 10 pmol der unveränderten Komponenten enthalten, werden aus jedem Pool entnommen und mittels einer Speedvac getrocknet. Sie werden mit einer mobilen Phase A vor der LC/MS und der MALDI TOF MS Analyse rekonstituiert.
Beispiel 16
LC/MS und LC/MS/MS Peptidanalysen von inversen ICAT-markierten Peptidgemischen
Die MS Analyse der ICAT-markierten Peptidgemische (siehe Beispiel 15) wird ausgeführt, wie dies in Beispiel 3 beschrieben ist, außer dass ein 5 Da Fenster für die Vorläuferionenselektion verwendet wird.
Beispiel 17
MALDI TOF MS Peptidanalyse von invers ICAT-markierten Peptidgemischen
Aliquots der mittels Speedvac getrockneten Gemischproben aus Beispiel 15 werden demselben Verfahren unterzogen, wie dies in Beispiel 4 beschrieben ist.
Beispiel 18
Datenbanksuche der invers ICAT-markierten Peptide
Die Suchsoftware PROWL (Proteometrics, New York, NY) und MASCOT (Matrix Science, London, UK) werden zur Suche der Proteindatenbanken zur Identifizierung von Proteinen mittels Peptidfingerabdrücken und MS/MS Fragmenten verwendet. Für die Suche unter Verwendung der Peptidfingerabdruckinformation werden Peptidionen, die ein inverses Markierungsmuster der Massenverschiebungen zwischen den zwei inversen Markierungsexperimenten aufweisen, auf der Grundlage der Richtung der Massenverschiebung (zunehmend oder abnehmend) aussortiert. Jede Liste wird getrennt für eine Datenbanksuche zur Identifizierung der Proteine verwendet. Eine iterative Suche, die die Ionendaten der inversen Markieurngsmuster aus der Peptidkarte und der MS/MS kombiniert, wird ebenfalls durchgeführt. Alle Ionen, die ein klares, inverses Markierungsmuster in der Karte zeigen und ferner in den MS Daten durch ihr ähnliches Fragmentierungsmuster und Fragmente mit und ohne Massenverschiebungen unterstützt werden, werden mittels ihrer MS/MS Fragmente identifiziert. Die mit den identifizierten Proteinen assoziierten Peptide werden dann aus der Liste entfernt und es wird eine zweite Suchrunde mittels der Massen der verbleibenden Peptide mit inversen Markierungsmustern gestartet. Für die Ionen, für die keine überzeugende Schlussfolgerung getroffen werden kann, wird eine zweite Analyse mittels der gewonnenen Probe ausgeführt, um MS/MS Daten von ihnen zu erhalten. Die entstehenden Daten werden auf dieselbe Weise verwendet, um die Datenbanken bezüglich einer Proteinidentifizierung zu durchsuchen.
Beispiel 19
MS Analyse der inversen ICAT Markierungsmethode unter Verwendung des Modellsystems mit 6 Proteinen
Die inverse Markierung und MS Analyse werden auf dieselbe Weise, wie sie in 1 gezeigt sind, mit dem Modellsystem mit 6 Proteinen ausgeführt, worin BSA dreifach "herabreguliert" und die Aldolase dreifach "heraufreguliert" wird. Eine MALDI TOF MS, die direkt mit dem Gemisch ohne Trennung ausgeführt wird, zeigt immer noch deutlich, obwohl sie ein hohes Maß an Signalüberlappung zeigt, wie die inverse Strategie hilft, die Peptidsignale schnell zu identifizieren, die aus Proteinen mit einer unterschiedlichen Expression abgeleitet sind. Ohne die inverse Markierungsstrategie müsste man ein einzelnes Spektrum (beispielsweise 11(A)) evaluieren und nach dem ±8/16/24 Da Paar für jedes und alle Peptide suchen und eine Quantifizierung ausführen. Unter Verwendung der inversen Markierungsstrategie muss man nur die zwei Spektren übereinanderlegen (11 (A, B)) und ein "fokussieren und herausfischen" zur Identifizierung der Peaks ausführen, die die charakteristische Massenverschiebung zwischen den zwei Spektren zeigen. Sehr schnell (in diesem Fall nur einige Minuten) nach dieser Ausführung des qualitativen Vergleichs werden die Peaks des charakteristischen inversen Markierungsmusters identifiziert (beispielsweise Massen-markierte Peaks). Es ist ersichtlich, dass bei einer Anwendung der inversen Markierung ein schneller quantitativer Vergleich der zwei Datensätze zur schnellen Identifizierung der Peptide von Interesse führen kann. Eine Quantifizierung und eine PSD oder MS/MS Analyse für eine Proteinidentifizierung kann dann mit diesen Peptiden ausgeführt werden. Wenn die Proben mittels einer LCQ mit einer unmittelbar anschließenden RP LC analysiert werden, wird das charakteristische inverse Markierungsmuster der Massenverschiebung auch deutlich bei mehreren Peptiden beobachtet (12 (A, B)). Die Massenverschiebungen variieren in Abhängigkeit der Anzahl an Cysteinen in der Sequenz und des Ladungszustands des detektierten Peptids. Nach einer Datenanalyse werden schnell zwei Listen an Peptidmassen erzeugt, die auf der Richtung der Massenverschiebung beruhen. Diese zwei Listen werden zur Suche in der Datenbank verwendet. Die Aldolase wird ausschließlich mittels der Liste der Abnahme in der Massenverschiebung detektiert, die einer Herabregulierung der Proteinexpression entspricht. Das BSA wird mittels der Liste der zunehmenden Massenverschiebung identifiziert, was einer Herabregulation der Proteinexpression entspricht. Man erhält MS/MS Spektren automatisch in einer datenabhängigen Weise für mehrere Peptide. Um eine Breitbandspektrumsituation zu emulieren, bei der mehrere Proteine herauf- oder herabreguliert werden, wird auch ein iteratives Suchschema angewendet. In diesem Fall wird eine kombinierte Massenliste aller Peptide, die eine Massenverschiebung zeigen, ohne Berücksichtigung der Richtung der Verschiebung verwendet. Nachdem ein Protein mit hoher Sicherheit entweder unter Verwendung der Massenliste oder eines MS/MS Spektrums identifiziert ist (Aldolase im vorliegenden System), werden alle Peptide, die von diesem Protein stammen, aus der Massen liste entfernt. Das Verfahren wird dann wiederholt, um das nächste Protein zu identifizieren, das die Massenverschiebung zeigt (BSA im vorliegenden Fall). Es sollte herausgestellt werden, dass zusätzliche Information in den MS und MS/MS Daten enthalten ist. Die Massenverschiebungen zeigen an, wie viele Cysteine in einer Sequenz vorhanden sind. Wenn dies für eine Datenbanksuche verwendet wird, hilft diese zusätzliche Spezifität die Kandidatenliste einzuengen und die Effizienz und Genauigkeit der Suchergebnisse zu erhöhen.
Es ist verständlich, dass verschiedene Modifikationen ausgeführt werden können, um die Ausführungsformen und/oder Beispiele zu verstehen, die hierin beschrieben sind. Daher sollte die obige Beschreibung nicht als beschränkend, sondern als beispielsgebend für die bevorzugten Ausführungen betrachtet werden.

Claims

Verfahren zur Identifizierung eines unterschiedlich exprimierten Proteins in zwei unterschiedlichen Proben, die eine Proteinpopulation enthalten, das umfasst: a) Bereitstellung von zwei gleichen Proteinpools aus jeweils einer Referenzprobe und einer Experimentalprobe, b) Markierung der Proteinpools mit einem im wesentlichen chemisch identischen isotopisch unterschiedlichen Proteinmarkierungsreagenz für Proteine, worin ein Pool jeweils aus dem Referenz- und Experimentalpool mit einem isotopisch schweren Proteinmarkierungsreagenz unter Bildung eines isotopisch schwer markierten Referenzpools und eines isotopisch schwer markierten Experimentalpools markiert wird und worin die verbleibenden Referenz- und Experimentalpools mit einem isotopisch leichten Proteinmarkierungsreagenz unter Bildung eines isotopisch leicht markierten Referenzpools und eines isotopisch leicht markierten Experimentalpools markiert werden, c) Kombination des isotopisch leicht markierten Referenzpools mit dem isotopisch schwer markierten Experimentalpool unter Bildung eines ersten Proteingemisches, d) Kombination des isotopisch schwer markierten Referenzpools mit dem isotopisch leicht markierten Experimentalpool unter Bildung eines zweiten Proteingemisches, e) Detektion der markierten Proteine jeweils aus den zwei Gemischen, und f) Vergleich des für die markierten Proteine aus den ersten und zweiten Gemischen erhaltenen Markierungsmusters, worin ein inverses Markierungsmuster eines Proteins im zweiten Gemisch im Vergleich mit dem Markierungsmuster des Proteins im ersten Gemisch das unterschiedlich exprimierte Protein in den zwei unterschiedlichen Proben anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die enzymatische oder chemische Spaltung der markierten Proteine in den ersten und zweiten Gemischen unter Bildung von Peptidgemischen vor dem Schritt (e) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, das ferner die Sequenzierung eines der Peptide zur Identifizierung des unterschiedlich exprimierten Proteins umfasst, von dem das Peptid stammt.
Verfahren nach Anspruch 3, worin die Sequenzierung des Peptids mittels einer Tandemmassenspektrometrie oder Post-Source-Decay (PSD) ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die Sequenzierung des unterschiedlich exprimierten Proteins zur Identifizierung des Proteins umfasst.
Verfahren nach Anspruch 5, worin die Sequenzierung des unterschiedlich exprimierten Proteins mittels Tandemmassenspektrometrie oder PSD ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die Abtrennung der markierten Proteine jeweils aus den ersten und zweiten Gemischen vor Schritt (e) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 7, worin der Abtrennungsschritt der markierten Proteine aus den zwei Gemischen mittels einer Technik ausgeführt wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus Ammoniumsulfatfällung, isoelektrischer Fokussierung, Größenausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatograpie, Adsorptionschromatographie, Umkehrphasenchromatographie, Affinitätschromatographie, Ultrafiltration, Immunfällung und Kombinationen hiervon.
Verfahren nach Anspruch 2, das ferner die Abtrennung der markierten Peptide aus jeweils den ersten und zweiten Gemischen vor dem Schritt (e) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 9, worin der Abtrennungsschritt der markierten Peptide aus den zwei Gemischen mittels einer Technik ausgeführt wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus Größenausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatograpie, Adsorptionschromatographie, Umkehrphasenchromatographie, Affinitätschromatographie, Immunfällung und Kombinationen hiervon.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die markierten Proteine durch Massenspektrometrie detektiert werden.
Verfahren nach Anspruch 2, worin die markierten Peptide durch Massenspektrometrie detektiert werden.
Verfahren nach Anspruch 1, das ferner die Anwendung von zumindest einer Fraktionierungstechnik auf die Proben zur Verringerung der Komplexität der Proteine in den Proben vor dem Schritt (a) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 2, das ferner die Anwendung zumindest einer Fraktionierungstechnik auf die isotopisch markierten Proteine der ersten und zweiten Gemische zur Verringerung der Komplexität der Proteine in den ersten und zweiten Gemischen vor der Spaltung der markierten Proteine in den ersten und zweiten Gemischen umfasst.
Verfahren nach Anspruch 13, worin die Fraktionierungstechnik aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Ammoniumsulfatfällung, isoelektrischer Fokussierung, Größenausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatograpie, Adsorptionschromatographie, Umkehrphasenchromatographie, Affinitätschromatographie, Ultrafiltration, Immunfällung und Kombinationen hiervon.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die zwei Proben sich im Zelltyp, Gewebetyp, physiologischen Zustand, Krankheitszustand, Entwicklungszustand, Umgebungsbedingungen, Ernährungsbedingungen, chemischen Stimuli oder physikalischen Stimuli unterscheiden.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das isotopisch schwere Proteinmarkierungsreagenz ein stabiles schweres Isotop ausgewählt aus der Gruppe enthält, die besteht aus ²H, ¹⁴C, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O und ³⁴S.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das isotopisch leichte Proteinmarkierungsreagenz ein stabiles leichtes Isotop ausgewählt aus der Gruppe enthält, die besteht aus H, ¹²C, ¹⁴N, ¹⁶O, und ³²S.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das isotopisch schwere Proteinmarkierungsreagenz ¹⁸O enthält und das isotopisch leichte Proteinmarkierungsreagenz ¹⁶O enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das Proteinmarkierungsreagenz einen Affinitätsanhang enthält.
Verfahren nach Anspruch 1, worin die Proben aus der Gruppe ausgewählt sind, die besteht aus Zellhomogenaten, Zellfraktionen, Gewebehomogenaten, biologischen Flüssigkeiten, Tränen, Fäkalien, Speichel und Lavageflüssigkeiten.
Verfahren nach Anspruch 1, worin das unterschiedlich exprimierte Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Oberflächenproteinen, Membranproteinen, cytosolischen Proteinen und Organellproteinen.
Verfahren zur Identifizierung eines unterschiedlich exprimierten Proteins in zwei unterschiedlichen Proben, die eine Proteinpopulation enthalten, das umfasst a) Bereitstellung von zwei gleichen Proteinpools aus jeweils einer Referenzprobe und einer Experimentalprobe, b) Proteolyse jedes Proteinpools während der Markierung jedes der Proteinpools mit isotopisch markiertem Wasser, worin jeweils ein Pool der Referenz- und der Experimentalpools mit ¹⁸O-Wasser unter Bildung eines ¹⁸O-markierten Referenzpools und eines ¹⁸O-markierten Experimentalpools markiert wird und worin die verbleibenden Referenz- und Experimentalpools mit ¹⁶O-Wasser unter Bildung eines ¹⁶O-markierten Referenzpools und eines ¹⁶O-markierten Experimentalpools markiert werden, c) Kombination des ¹⁶O-markierten Referenzpools mit dem ¹⁸O-markierten Experimentalpool unter Bildung eines ersten Gemisches, das ¹⁶O- und ¹⁸O-markierte Peptide enthält, d) Kombination des ¹⁸O-markierten Referenzpools mit dem ¹⁶O-markierten Experimentalpool unter Bildung eines zweiten Gemisches, das¹⁸O- und ¹⁶O-markierte Peptide enthält, e) Detektion der markierten Peptide jeweils aus den zwei Gemischen, und f) Vergleich der für die markierten Peptide in den ersten und zweiten Gemischen erhaltenen Markierungsmuster, worin ein inverses Markierungsmuster, das für ein Peptid im zweiten Gemisch erhalten wurde, im Vergleich mit dem Markierungsmuster, das für das Peptid im ersten Gemisch erhalten wurde, das unterschiedlich exprimierte Protein anzeigt, von dem das Peptid stammt.
Verfahren nach Anspruch 23, das ferner die Abtrennung der markierten Peptide in den zwei Gemischen vor dem Schritt (e) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 24, worin der Trennschritt der markierten Peptide in den zwei Gemischen mittels einer Technik ausgeführt wird, die aus der Gruppe ausgewählt ist, welche besteht aus Größenausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatographie, Adsorptionschromatographie, Umkehrphasenchromatographie, Affinitätschromatographie, Immunfällung und Kombinationen hiervon.
Verfahren nach Anspruch 23, worin die Detektion der markierten Peptide durch Massenspektrometrie ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 23, das ferner die Sequenzierung eines der Peptide zur Identifizierung des unterschiedlich exprimierten Proteins umfasst, von dem das Peptid stammt.
Verfahren nach Anspruch 27, worin die Sequenzierung des Peptids mittels Tandemmassenspektrometrie oder PSD ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 23, das ferner die Anwendung zumindest einer Fraktionierungstechnik auf die Proben zur Verringerung der Komplexität von Proteinen in den Proben vor dem Schritt (a) umfasst.
Verwendung nach Anspruch 23, das ferner die Anwendung einer Fraktionierungstechnik auf die markierten Peptide der ersten und zweiten Gemische zur Abtrennung von unerwünschten Peptiden aus den ersten und zweiten Gemischen vor dem Schritt (e) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 29, worin die Fraktionierungstechnik aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus Ammoniumsulfatfällung, isoelektrischer Fokussierung, Größenausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatograpie, Adsorptionschromatographie, Umkehrphasenchromatographie, Affinitätschromatographie, Ultrafiltration, Immunfällung und Kombinationen hiervon.
Verfahren nach Anspruch 23, worin die Proben aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus Zellhomogenaten, Zellfraktionen, Gewebehomogenaten, biologischen Flüssigkeiten, Tränen, Fäkalien, Speichel und Lavageflüssigkeiten.
Verfahren nach Anspruch 23, worin das unterschiedlich exprimierte Protein aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Zelloberflächenproteinen, Membranproteinen, cytosolischen Proteinen und Organellproteinen.
Verfahren nach Anspruch 23, worin die zwei Proben sich im Zelltyp, Gewebetyp, physiologischen Zustand, Krankheitszustand, Entwicklungszustand, Umgebungsbedingungen, Ernährungsbedingungen, chemischen Stimuli oder physikalischen Stimuli unterscheiden.
Verfahren zur Identifizierung eines unterschiedlich exprimierten Proteins in zwei unterschiedlichen Proben, die eine Proteinpopulation enthalten, das umfasst: a) Bereitstellung von zwei gleichen Proteinpools aus jeweils einer Referenzprobe und einer Experimentalprobe, b) Proteolyse der Proteine in jedem Proteinpool unter Bildung von Peptidpools, c) Markierung jedes Peptidpools mit isotopisch markiertem Wasser, worin jeweils ein Peptidpool der Referenz- und der Experimentalpools mit ¹⁸O-Wasser unter Bildung eines ¹⁸O-markierten Referenzpeptidpools und eines ¹⁸O-markierten Experimentalpeptidpools markiert wird und worin die verbleibenden Referenz- und Experimentalpeptidpools mit ¹⁶O-Wasser unter Bildung eines ¹⁶O-markierten Referenzpeptidpools und eines ¹⁶O-markierten Experimentalpeptidpools markiert werden, d) Kombination des ¹⁶O-markierten Referenzpools mit dem ¹⁸O-markierten Experimentalpool unter Bildung eines ersten Gemisches, das ¹⁶O- und ¹⁸O-markierte Peptide enthält, e) Kombination des ¹⁸O-markierten Referenzpools mit dem ¹⁶O-markierten Experimentalpool unter Bildung eines zweiten Gemisches, das ¹⁸O- und ¹⁶O-markierte Peptide enthält, f) Detektion der markierten Peptide jeweils aus den zwei Gemischen, und g) Vergleich der für die markierten Peptide in den ersten und zweiten Gemischen erhaltenen Markierungsmuster, worin ein inverses Markierungsmuster, das für ein Peptid im zweiten Gemisch erhalten wurde, im Vergleich mit dem Markierungsmuster, das für das Peptid im ersten Gemisch erhalten wurde, das unterschiedlich exprimierte Protein anzeigt, von dem das Peptid stammt.
Verfahren nach Anspruch 35, das ferner die Abtrennung der markierten Peptide aus den ersten und zweiten Gemischen vor dem Schritt (f) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 36, worin der Abtrennschritt der markierten Peptide aus den zwei Gemischen mittels einer Technik ausgeführt wird, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus Größenausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatograpie, Adsorptionschromatographie, Umkehrphasenchromatographie, Affinitätschromatographie, Immunfällung und Kombinationen hiervon.
Verfahren nach Anspruch 35, worin die Detektion der markierten Peptide durch Massenspektrometrie ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 35, das ferner die Sequenzierung eines der Peptide zur Identifizierung des unterschiedlich exprimierten Proteins umfasst, von dem das Peptid stammt.
Verfahren nach Anspruch 39, worin die Sequenzierung des Peptids durch Tandemmassenspektrometrie oder PSD ausgeführt wird.
Verfahren nach Anspruch 35, das ferner die Anwendung von zumindest einer Fraktionierungstechnik auf die Proben zur Verringerung der Komplexität der Proteine in den Proben vor dem Schritt (a) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 35, das ferner die Anwendung zumindest einer Fraktionierungstechnik auf die markierten Peptide der ersten und zweiten Gemische zur Abtrennung von unerwünschten Peptiden aus den ersten und zweiten Gemischen vor Schritt (e) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 41, worin die Fraktionierungstechnik aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus Ammoniumsulfatfällung, isoelektrischer Fokussierung, Größenausschlusschromatographie, Ionenaustauschchromatograpie, Adsorptionschromatographie, Umkehrphasenflüssigchromatographie, Affinitätschromatographie, Ultrafiltration, Immunfällung und Kombinationen hiervon.
Verfahren nach Anspruch 35, worin die Proben aus der Gruppe ausgewählt werden, die besteht aus Zellhomogenaten, Zellfraktionen, Gewebehomogenaten, biologischen Flüssigkeiten, Tränen, Fäkalien, Speichel und Lavageflüssigkeiten.
Verfahren nach Anspruch 35, worin das unterschiedlich exprimierte Protein aus der Gruppe ausgewählt wird, die besteht aus Oberflächenproteinen, Membranproteinen, cytosolischen Proteinen und Organellproteinen.
Verfahren nach Anspruch 35, worin die zwei Proben sich im Zelltyp, Gewebetyp, physiologischen Zustand, Krankheitszustand, Entwicklungszustand, Umgebungsbedingungen, Ernährungsbedingungen, chemischen Stimuli oder physikalischen Stimuli unterscheiden.
Verfahren zur Identifizierung eines unterschiedlich exprimierten Proteins in zwei unterschiedlichen Proben, die eine Proteinpopulation enthalten, das umfasst: a) Bereitstellung von zwei gleichen Proteinpools aus jeweils einer Referenzprobe und einer Experimentalprobe, worin ein Pool aus jedem der Referenz- und Experimentalpools durch Kultivierung in einem Medium, das eine isotopisch schwer markierte, assimilierbare Quelle enthält, unter Bildung eines isotopisch schwer markierten Referenzpools und eines isotopisch schwer markierten Experimentalpools hergestellt wird und worin die verbleibenden Referenz- und Experimentalpools durch die Kultivierung in einem Medium, das eine isotopisch leicht markierte, assimilierbare Quelle enthält, unter Bildung eines isotopisch leicht markierten Referenzpools und eines isotopisch leicht markierten Experimentalpools hergestellt werden, b) Kombination des isotopisch leicht markierten Referenzpools mit dem isotopisch schwer markierten Experimentalpool unter Bildung eines ersten Proteingemisches, c) Kombination des isotopisch schwer markierten Referenzpools mit dem isotopisch leicht markierten Experimentalpool unter Bildung eines zweiten Proteingemisches, d) Detektion der markierten Proteine jeweils aus den zwei Gemischen, und e) Vergleich des für die markierten Proteine aus den ersten und zweiten Gemischen erhaltenen Markierungsmusters, worin ein inverses Markierungsmuster eines Proteins im zweiten Gemisch im Vergleich mit dem Markierungsmuster des Proteins im ersten Gemisch das unterschiedlich exprimierte Protein in den zwei unterschiedlichen Proben anzeigt.
Verfahren nach Anspruch 47, das ferner die enzymatische oder chemische Spaltung der markierten Proteine in den ersten und zweiten Gemischen unter Bildung von Peptidgemischen vor dem Schritt (d) umfasst.
Verfahren nach Anspruch 47, worin die assimilierbare Quelle aus der Gruppe ausgewählt ist, die besteht aus Ammoniumsalzen, Glucose, Wasser und Aminosäuren.