DE60117849T2

DE60117849T2 - Säureempfindliches isotop-codiertes extrahiermittel (alice) in massenspectrometrieanalyse

Info

Publication number: DE60117849T2
Application number: DE60117849T
Authority: DE
Inventors: Yongchang Arlington QIU; H. Jack Lexington WANG; M. Rodney Boston HEWICK
Original assignee: Genetics Institute LLC
Current assignee: Genetics Institute LLC
Priority date: 2000-10-23
Filing date: 2001-10-22
Publication date: 2006-09-21
Anticipated expiration: 2021-10-23
Also published as: AU4338502A; JP2004531694A; AU2002243385B2; US20020164809A1; US20050014278A1; WO2002048717A2; EP1330654B1; US7122377B2; US6902936B2; EP1330654A2; CA2426731A1; WO2002048717A3; DE60117849D1; ATE320007T1; AU2002243385C1

Description

HINTERGRUND DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft das Gebiet quantitativer Proteinanalyse mit hohem Durchsatz und genauer gesagt neue Reagenzien zur Verwendung in derartiger Analyse.
Die meisten Herangehensweisen für quantitative Proteinanalyse werden durch Kombinieren von Proteintrennung, am gebräuchlichsten durch zweidimensionale Polyacrylamid-Gelelektrophoreses mit hoher Auflösung (2D-PAGE), mit auf Massenspektrometrie (MS) basierender Sequenz oder auf Tandem-Massenspektrometrie (MS/MS)-basierender Sequenzidentifizierung von ausgewählten, getrennten Proteinspezies bewerkstelligt.
S. P. Gygi et al., Nature Biotech, 17;994–999 (Oktober 1999) beschreiben eine Herangehensweise für quantitative Proteinanalyse, basierend auf einer Klasse von Reagenzien, genannt Isotop-codierte Affinitäts-Kennzeichnungen (ICAT), welche aus drei funktionellen Elementen besteht: einer spezifischen chemischen Reaktivität, einem isotopisch codierten Linker und einer Affinitäts-Kennzeichnung. Die von Gygi beschriebenen Reagenzien benutzen Biotin als Affinitäts-Kennzeichnung und stützen sich auf Biotin-Avidin-Affinitätsbindung, um die Cystein enthaltenden Peptide aus dem komplexen Peptidgemisch zu isolieren.
Obwohl die ICAT-Herangehensweise viele Vorteile gegenüber den traditionellen 2D-PAGE/MS-Herangehensweisen hat, besitzt sie einige innerliche Begrenzungen. Zum Beispiel fügt ICAT eine relativ große chemische Einheit zu den Cyctein enthaltenden Peptiden hinzu und diese Funktionalität ist unter dem Zustand Kollisions-induzierter Dissoziation (CID) sehr labil und kompliziert so die Datenanalyse stromabwärts. Nichtspezifische Bindung ist ebenfalls ein Problem, da sich die Anreicherung auf nichtkovalente Affinitätsbindung zwischen einem Protein (Avidin) und den biotinylierten Peptiden stützt. Schließlich werden die eingefangenen Peptide unter Verwendung MS-kompatibler Bedingungen nicht ohne weiteres mit hoher Rückgewinnung aus den Avidinkügelchen eluiert. So gibt es einen Bedarf auf dem Fachgebiet für zusätzliche Reagenzien und Verfahren zum Verbessern der Leistung in quantitativer massenspektrometrischer Analyse von Proteingemischen.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die Erfindung stellt Verbindungen auf Polymerbasis bereit, die für quantitative Analyse von Gemischen verwendbar sind, die Proteine enthalten. Vorteilhafterweise verbinden sich die Verbindungen der Erfindung kovalent mit den Peptiden, für welche sie zur Kennzeichnung verwendet werden, wobei sie den gekennzeichneten Peptiden gestatten, rigoroseren Waschtechniken unterworfen zu werden. So werden die gekennzeichneten Peptide, ohne nicht-spezifisch gebundene Spezies, leichter gereinigt. Dies führt zu einem geringeren Hintergrundrauschen in MS-Spektren und stellt so eine Zunahme von dynamischem Bereich und Empfindlichkeit bei der quantitativen Bestimmung und Identifizierung der Proteine bereit.
In einem Aspekt stellt die Erfindung ein Verfahren für die quantitative Analyse von Proteine enthaltenden Gemischen bereit, wobei das Verfahren die Schritte umfaßt, (a) Reduzieren der Disulfidbindungen in den Proteinen einer Probe, dadurch Bereitstellen freier Thiolgruppen in Cystein enthaltenden Proteinen; (b) Blockieren freier Thiole mit einem Blockierungsreagenz in der Probe; (c) Digestieren der Proteine in der Probe, um Peptide bereitzustellen; (d) Reduzieren der Disulfidbindungen in den digestierten Peptiden, dadurch Bereitstellen von Thiolgruppen in Cystein enthaltenden Peptiden zur Reaktion; (e) Umsetzen von Cystein enthaltenden Peptiden mit einem Reagenz, wobei das Reagenz eine Thiol-spezifische reaktive Gruppe umfaßt, welche über einen Linker an eine Polymerkennzeichnung gebunden ist, wobei der Linker differentiell mit stabilen Isotopen markiert sein kann und wobei die Polymerkennzeichnung eine kovalente Bindung mit den Cystein enthaltenden Peptiden bildet; (f) Waschen der Polymer-gebundenen Peptide, um nicht kovalent gebundene Spezies zu entfernen; (g) Eluieren der Cystein enthaltenden Peptide; und (h) Unterwerfen der eluierten Peptide quantitativer Massenspektrometrie-(MS)-Analyse. In einer Ausführungsform beinhaltet das Verfahren weiterhin Durchführen der Schritte (a) bis (d) an einer zweiten Probe; Umsetzen der Cystein enthaltenden Peptide in der zweiten Probe mit einer mit stabilem Isotop markierten Form des Reagenzes, wobei in Reaktionsschritt (e) das verwendete Reagenz eine nicht Isotop-markierte Form des Reagenzes ist; Mischen der Peptide der umgesetzten Probe nach Schritt (e) und der umgesetzten zweiten Probe; und Durchführen der Schritte (g) und (h) an den Peptiden in dem Gemisch.
In einem anderen Aspekt stellt die Erfindung eine Verbindung, verwendbar zum Einfangen von Cystein enthaltenden Peptiden, bereit. Diese Verbindung besteht aus einer Thiol-spezifischen reaktiven Gruppe, gebunden an ein nichtbiologisches Polymer über einen Linker. In einer wünschenswerten Ausführungsform hat das Reagenz die Formel: A1-Linker-A2-Polymer, wobei A1 eine Thiol-reaktive Gruppe ist und A2 eine säurelabile Gruppe ist, an welche das Polymer gebunden ist.
Huang, S.Y. et al.: "A polyethylene glycol copolymer for carrying and releasing multiple copies of cysteine-containing peptides (Ein Polyethylenglycolcopolymer zum Tragen und Freisetzen mehrfacher Kopien von Cystein enthaltenden Peptiden)", Bioconjugate Chemistry, Bd. 9, 1998, S. 612–617 offenbaren ein Polyethylenglycol-(PEG)-Copolymer zum Tragen und Freisetzen von Cystein enthaltenden Peptiden, wobei das PEG-Copolymer an eine Thiol-spezifische reaktive Gruppe über einen Linker gebunden ist, die Thiol-reaktive Gruppe Cysteamin-Thiopyridin ist und der Linker eine Carbonylgruppe ist.
In noch einem anderen Aspekt stellt die Erfindung einen Reagenzkit für die Massenspektralanalyse von Proteinen bereit, der eine Verbindung der Erfindung umfaßt.
Andere Aspekte und Vorteile der vorliegenden Erfindung werden in der folgenden ausführlichen Beschreibung der bevorzugten Ausführungsformen davon weiter beschrieben.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1A und 1B stellen eine schematische Darstellung des automatisierten 2D-LC/MS-Systems der Erfindung bereit.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung stellt eine neue Herangehensweise für die quantitative Analyse von Proteinen bereit, die säurelabile Isotop-codierte Extraktionsmittel (ALICE) verwendet, welche zum Einfangen von Cystein enthaltenden Peptiden nützlich sind. Der Vorteil dieser Herangehensweise gegenüber dem Stand der Technik ist, daß sie Biotin-Avidin-Affinitätsbindung mit säurelabiler kovalenter Bindung ersetzt, um Cystein enthaltende Peptide aus dem Gemisch herauszuholen. Da die Bindung kovalent ist, können stringentere Detergenzien oder organische Lösungsmittel während der Prozedur verwendet werden, um hydrophobe Proteine und Peptide in der Lösung zu halten und so die Gesamtpeptidausbeute zu maximieren. Weiterhin vermeiden die Verbindungen und das Verfahren der Erfindung nichtspezifische Peptid-Protein-Bindung. Entfernung aller nachweisbaren nicht kovalent gebundenen Spezies während des (der) Waschschritts(e) wird ebenfalls bewerkstelligt. So ist die finale Cystein enthaltende Peptidlösung viel weniger kontaminiert, was zu höherer Empfindlichkeit und höherem dynamischen Bereich der MS-Analyse führt. Letztlich beeinträchtigt die ALICE-Markierung, da sie klein in der Größe ist und während der MS/MS-Analyse keiner Fragmentierung unterliegt, die MS-Analyse stromabwärts und das Durchsuchen der Datenbank nicht.
In einer Ausführungsform stellt die vorliegende Erfindung eine Verbindung der Formel: A1-Linker-A2-Polymer bereit, wobei A1 eine Thiol-reaktive Gruppe ist und A2 eine säurelabile Gruppe ist, an welche das Polymer gebunden wird. Alternativ kann die säurelabile Gruppe abwesend sein und kann das Polymer direkt an den Linker gebunden sein.
Am meisten bevorzugt ist das Polymer ein nichtbiologisches Polymer. Wie hier verwendet schließt ein nichtbiologisches Polymer anorganische Polymere und organische Polymere ein, welche eine kovalente Bindung mit der säurelabilen Gruppe, wo vorhanden, oder dem Linker bilden. Geeigneterweise beeinträchtigt ein ausgewähltes organisches Polymer nicht die Verfahrensschritte in dem Verfahren der Erfindung, ist z.B. unter basischen Bedingungen und in Gegenwart der Detergenzien und/oder organischen Lösungsmittel, erforderlich, um das Gemisch in Lösung zu halten, stabil. In einer geeigneten Ausführungsform ist das in der Erfindung verwendete Polymer ein festes Substrat, bestehend aus einem Homopolymer oder einem Heteropolymer, enthaltend Polystyrol, Polyethylen, Polyacrylamid, Polyacrylein, Polyethylenglycol oder dergleichen. Geeignete Polymere und feste Substrate, z.B. Harze, Kügelchen oder dergleichen, sind aus einer Vielzahl von kommerziellen Quellen einschließlich Sigma-Aldrich, NovaBiochem und Beckman-Coulter erhältlich oder können unter Verwendung bekannter Techniken synthetisiert werden. Ein Beispiel einer geeigneten Synthesetechnik wird nachstehend in Beispiel 1 bereitgestellt. Jedoch ist die Erfindung nicht so begrenzt.
In einer Ausführungsform ist das Polymer kovalent an den Linker über eine säurelabile Gruppe gebunden, die die Verbindung der Erfindung mit der Fähigkeit ausstattet, leicht unter Verwendung eines sauren Reagenzes eluiert zu werden. In einer bevorzugten Ausführungsform hat die an das Polymer gebundene säurelabile Gruppe die folgende Struktur:
in der der Linker -CONH-, -COO- oder ein anderes Amid oder ein Ester ist. Jedoch können andere Strukturen leicht synthetisiert werden, um andere geeignete Gruppen zu enthalten, die ähnliche Qualitäten für die Verbindung hinsichtlich Stabilität und Zugänglichkeit zu Säureelution bereitstellen. Zu Beispielen säurelabiler Gruppen gehören:
Rink Amide Linker:
DHP Linker:
Siber Linker:
Trityl Linker:
Wang Linker:
In bestimmten Ausführungsformen kann diese Funktion durch den Linker bereitgestellt werden und kann die säurelabile Gruppe abwesend sein.
Der Linker kann eine beliebige Struktur haben, die zur Verwendung in MS-Techniken differentiell mit stabilen Isotopen markiert werden kann. In einer Ausführungsform enthält der Linker von 1 bis 100 Atome in der Länge, etwa 3 bis etwa 50 Atome in der Länge oder etwa 5 bis etwa 15 Atome in der Länge, welche aus Kohlenstoff, und gegebenenfalls ein oder zwei Atomen, ausgewählt aus O, S, NH, NR, NR'. CO, C(O)O, C(O)S, S-S, SO₂, C(O)-NR', C(S)-NR' oder Si-O, bestehen. Gegebenenfalls kann eines oder mehrere der C-Atome mit einer kleinen Alkyl- (C₁-C₆), Alkenyl-, Alkoxy-, Aryl- oder Diarylgruppe substituiert sein. Zum Beispiel kann der Linker eine Alkyl-, Alkenyl- oder Alkinylgruppe, gegebenenfalls substituiert wie vorstehend beschrieben, sein. In einem anderen Beispiel kann der Linker selbst ein oder mehrere O-, S-, NH-, NR-, NR'-, CO-, C(O)O-, C(O)S-, S-S-, SO₂-, C(O)-NR'-, C(S)-NR'-, Si-O-Gruppen, gebunden an ein oder mehrere C-Atome, enthalten, welche gegebenenfalls substituiert sein können.
In einer Ausführungsform hat der Linker eine Struktur (z.B. eine Alkylgruppe), welche eine Substitution von etwa vier bis etwa zwölf Atomen mit einem stabilen Isotop enthält. Jedoch ist es in bestimmten Ausführungsformen für den Linker wünschenswert, Substitutionen von mindestens sechs Atomen mit einem stabilen Isotop zu enthalten. Zum Beispiel kann es für Peptide an dem höheren Ende des Molekulargewichtsbereichs, bei welchem MS verwendbar ist (z.B. etwa 2000 Da bis 3500 Da), wünschenswert für den Linker sein, acht, zehn, zwölf oder mehr Substitutionen zu enthalten, um die geforderte differentielle Analyse zu erreichen; wohingegen Peptide an dem niedrigeren Ende des Molekulargewichtsbereichs für MS (z.B. etwa 500 bis 2000 Da) nur vier bis sechs Substitutionen erfordern mögen. Für die ausgewählte Anzahl von Substitutionen kann ein jedes oder mehrere von den Wasserstoff-, Stickstoff-, Sauerstoff-, Kohlenstoff oder Schwefelatomen in dem Linker mit ihren isotopisch stabilen Isotopen: ²H, ¹³C, ¹⁵N, ¹⁷O, ¹⁸O oder ³⁴S ersetzt werden.
So hat die Linkergruppe eine Struktur, die die gewünschte Anzahl von Isotopensubstitutionen unterbringt. Die Auswahl dieser Struktur ist keine Begrenzung der vorliegenden Erfindung. Ein oder mehrere von den Atomen in dem Linker können mit einem stabilen Isotop substituiert werden, um ein oder mehrere im wesentlichen chemisch identische, aber isotopisch unterscheidbare Verbindungen zu erzeugen. Zusätzlich oder alternativ stellt der Linker gegebenenfalls auch säurelabile Eigenschaften für die Verbindung bereit.
Die Verbindung der Erfindung enthält weiterhin eine funktionelle Gruppe, die reaktiv, vorzugsweise spezifisch, mit Cysteinresten ist. Wünschenswerterweise ist die reaktive Gruppe aus der Gruppe, bestehend aus entweder Maleinsäureimid (siehe nachstehend)
oder α-Halogenacetylgruppen wie beispielsweise X-CH₂CO-, ausgewählt. Am meisten geeignet ist das X aus Halogen wie beispielsweise Iod, Brom und Chlor ausgewählt, um Iodacetyl-, Bromacetyl- oder Chloracetylfunktionalitäten zu erzeugen.
In einer anderen Alternative kann die Thiol-reaktive Gruppe aus anderen α-, β-konjugierten Doppelbindungsstrukturen, wie beispielsweise
und dergleichen, ausgewählt werden. Eine noch andere reaktive Gruppe kann leicht synthetisiert werden, um andere Thiol-spezifische reaktive Gruppen zur Verwendung beim Binden von Cystein enthaltenden Peptiden zu enthalten.
In einer bevorzugten Ausführungsform hat eine Verbindung der Erfindung die Formel:
In einer wünschenswerten Ausführungsform ist diese Verbindung isotopisch wie folgt modifiziert.
Jedoch ist die Erfindung nicht so begrenzt. Der Fachmann kann ohne weiteres leichte ALICE mit anderen stabilen Isotopen bereitstellen. Weiterhin kann der Fachmann im Hinblick auf die hier bereitgestellte Anleitung ohne weiteres andere geeignete Verbindungen herstellen.
VERFAHREN DER VERWENDUNG DER VERBINDUNGEN DER ERFINDUNG
Die Verbindungen der Erfindung sind besonders nützlich in massenspektrometrischen Verfahren zur quantitativen Bestimmung und Identifizierung von einem oder mehreren Proteinen in einem Gemisch. Die durch das Verfahren der Erfindung analysierten Peptide haben am meisten bevorzugt eine Größe von etwa 500 Dalton (Da) bis etwa 3500 Da, aber können größer sein. Geeigneterweise werden diese Peptide bei enzymatischer Digestion von Proteinen in einem komplexen Gemisch erzeugt. Das Proteingemisch kann eine Probe aus einer Zell- oder Gewebekultur oder aus biologischen Flüssigkeiten, Zellen oder Geweben sein. Proben aus einer Kultur schließen Zellhomogenate und Zellfraktionen ein. Zu biologischen Flüssigkeiten gehören Urin, Blut (einschließlich z.B. Vollblut, Plasma und Seren), Zerebrospinalflüssigkeit, Tränen, Faeces, Speichel und Spülflüssigkeiten. Die Gemische können Proteine, Lipide, Kohlenhydrate und Nucleinsäuren einschließen. Die Verfahren der Erfindung wenden MS und (MS)ⁿ-Verfahren an. Gegenwärtig werden Verfahren der Matrix-unterstützten Laserdesorptions-Ionisations-MS (MALDUMS) und Elektrosprayionisations-MS (ESI/MS) bevorzugt. Jedoch kann eine Vielfalt anderer MS- und (MS)ⁿ-Verfahren ausgewählt werden.
In einer Ausführungsform stellt die Erfindung ein Verfahren für quantitative Analyse eines Proteoms unter Verwendung der Verbindung der Erfindung bereit. Typischerweise wird eine Probe aus einem wie vorstehend definierten Ausgangsstoff erhalten. Die Probe kann mit einem Referenzproteingemisch verglichen werden, welches als Probe aus dem gleichen Ausgangsstoff erhalten wird oder aus einem anderen Ausgangsstoff erhalten werden kann. Wo ein Proteingemisch einer Probe mit dem einer zweiten Probe oder einem Referenzproteingemisch verglichen werden soll, werden diese Gemische gesondert verarbeitet, wobei identische Reaktionsbedingungen angewendet werden, mit der Ausnahme, daß eine Probe mit der Verbindung umgesetzt wird, die schwere stabile Isotope enthält. Wo Proben nicht zu vergleichen sind, ist gesonderte Verarbeitung bis zu dem Punkt der Reaktion mit der (den) Verbindung(en) der Erfindung nicht notwendig, aber ist gestattet.
Typischerweise wird die Proteinprobe in einem geeigneten Puffer solubilisiert, der ein organisches Lösungsmittel enthalten kann. Während der gesamten Prozedur, ausgenommen der finale Peptidelutionsschritt, wird der pH des Gemisches unter basischen Bedingungen gehalten. Am meisten geeignet wird der pH zwischen 6,5 und 9, stärker bevorzugt etwa 7,5 bis 8,5 und am meisten bevorzugt etwa 7,2 bis 7,5, gehalten.
Die Disulfidbindungen der Proteine in der (den) Probe(n) oder den Referenzgemischen werden zu freien SH-Gruppen reduziert. Gegebenenfalls kann dieser Schritt mit der Solubilisation des Proteins oder Proteingemischs, bezeichnet wie vorstehend, kombiniert werden. Zu geeigneten Reduktionsmitteln gehören Tri-n-butylphosphin (TBP), 2-Mercaptoethanol, Dithiothreitol und Tris-(β-carboxyethyl)phosphin. Jedoch können andere geeignete Reduktionsmittel eingesetzt werden. In einer Ausführungsform werden Disulfidbindungen in 2 mg eines Proteins denaturiert, indem 8M Harnstoff, 200 mM Ammoniumbicarbonat, 20 mM CaCl₂, 5 μmol TBP, welches in 20 μl Acetonitril (ACN) vorgelöst und für eine Stunde bei etwa 37°C inkubiert worden ist, verwendet werden. In einer anderen Ausführungsform kann ein Protein in 50 mM Tris-Puffer, 6 M Guanidin-HCl, 5 mM TBP bei pH 8,5 für 1 Stunde bei 37°C inkubiert werden. Jedoch können andere Konzentrationen dieser Komponenten und/oder andere Reduktionsmittel, gepuffert auf einen pH im basischen Bereich, ausgewählt und für variierende Zeitlängen inkubiert werden.
Freie Thiole (SH) werden blockiert, indem ein geeignetes Blockierungsreagenz, z.B. Methylmethanthiosulfonat (MMTS), verwendet wird, welches unter den bereitgestellten basischen Bedingungen funktioniert und die Ausführung der folgenden Schritte nicht beeinträchtigt. Obwohl MMTS bevorzugt wird, können andere geeignete Blockierungsreagenzien, die ohne Begrenzung O-Methylisoharnstoff einschließen, vom Fachmann ausgewählt werden Die Proteine in den Proben werden enzymatisch digestiert. Eine geeignete Protease zur Verwendung in diesem Verfahren kann leicht aus Proteasen ausgewählt werden, die mit den basischen Bedingungen und der Verfahrensweise kompatibel sind. Unter bestimmten Umständen kann es notwendig sein, das Probengemisch zu verdünnen, bis alle denaturierenden Solubilisierungsmittel in der Probe bis zu einem Punkt verdünnt sind, an welchem sie mit der Aktivität der verwendeten Protease oder der Proteasen kompatibel sind. In einer Ausführungsform ist die Protease Trypsin. In einer anderen Ausführungsform ist die Protease die Endoproteinase Lys-C (im Handel erhältlich, z.B. von Promega, Roche Molecular Biochemical). In noch einem anderen Beispiel wird ein Gemisch von Proteasen, die ähnliche Aktivitätsniveaus bei basischem pH haben, verwendet. Zu derartigen Proteasen können unter anderem Aminopeptidasen, Carboxypeptidasen gehören. Alternativ wird das Proteingemisch mehr als einem Digestionsschritt unterworfen. Zum Beispiel kann das Proteingemisch der Digestion mit Lys-C und nachfolgender Digestion mit Trypsin unterworfen werden. Mehrfache Digestionen sind besonders wünschenswert, wo das Gemisch ein komplexes Gemisch ist. Der Fachmann kann leicht bestimmen, ob ein einziger Digestionsschritt oder mehrfache Schritte erforderlich sind. In noch einer anderen Alternative kann Proteindigestion weggelassen werden, wo die Probe Peptide, Polypeptide oder kleine Proteine (z.B. etwa 500 bis 5000 Da) enthält.
Geeigneterweise werden die Peptide wieder reduziert, bevor sie mit den Verbindungen der Erfindung umgesetzt werden, um die Blockierungsreagenzien zu entfernen. Der Reduktionsschritt wird unter Verwendung der vorstehend beschriebenen Reagenzien durchgeführt. In einer geeigneten Ausführungsform wird das Gemisch durch Inkubation mit 5 μmol TBP bei 37°C für eine Stunde reduziert. Jedoch können andere geeignete Konzentrationen, Reagenzien, Inkubationstemperaturen und Zeiten ohne weiteres eingesetzt werden.
Eine ausgewählte Verbindung der Erfindung und eine entsprechende isotopisch schwere Verbindung werden mit den Proben umgesetzt. Typischerweise wird die Referenzprobe mit der isotopisch schweren Verbindung markiert und wird (werden) die experimentelle(n) Probe(n) mit der isotopisch leichten Form der Verbindung markiert. Jedoch kann die Markierung umgekehrt werden. Gegebenfalls kann diese Markierungsreaktion in einem beliebigen Stadium des Verfahrens, z.B. vor einem der Reduktionsschritte, durchgeführt werden.
Nach Abschluß der Kennzeichnungsreaktion werden definierte Aliquots der Proben, markiert mit isotopisch unterschiedlichen Verbindungen (z.B. entsprechende leichte und schwere Verbindungen), vereinigt und alle nachfolgenden Schritte werden an den zusammengefaßten Proben durchgeführt. Vorzugsweise werden gleiche Mengen von jeder Probe zusammengefaßt.
Die zusammengefaßten Proben werden gewaschen, um alle nicht kovalent gebundenen Spezies zu entfernen. Die Verwendung der Verbindungen der Erfindung gestattet die Verwendung rauherer Waschschritte, als Reagenzien des Standes der Technik widerstehen können. Zum Beispiel benutzt ein geeignetes Verfahren 5 × 1 ml 50 %iges Acetonitril (ACN), 5 × 1 ml 30 %iges ACN, 5 × 1 ml 90 %iges ACN, 5 × 1 ml (nicht verdünntes) ACN und 10 × 5 ml Dichlormethan. Jedoch kann die Konzentration von ACN variiert werden. Alternativ können andere geeignete Lösungsmittel ausgetauscht werden. Zu Beispielen geeigneter Lösungsmittel gehören organische Lösungsmittel mit Polaritätseigenschaften ähnlich Acetonitril oder Dichlormethan. Noch ein anderes geeignetes Verfahren benutzt hohe Konzentrationen von organischen Lösungsmitteln, was wirksam alle restlichen Detergenzien oder grenzflächenaktive Mittel entfernt.
Die gekennzeichneten Peptide werden selektiv durch Säureelution herausgeholt, welche die Bindung zwischen dem Linker oder der säurelabilen Gruppe und dem Polymer, an welches sie kovalent gebunden sind, bricht, was den Peptiden, die mit den leichten oder schweren Verbindungen der Erfindung gekennzeichnet sind, erlaubt, eluiert zu werden. Zum Beispiel kann die letzte Waschung unter Verwendung von 1% bis 5% Trifluoressigsäure (TFA) in Dichlormethan (CH₂Cl₂) eluiert werden. Unter Verwendung des Verfahrens der Erfindung wird die Peptidgewinnung auf über 75% geschätzt. Geeigneterweise kann die Rückgewinnung noch höher sein, z.B. über 80%, 85% und 90%, abhängig von der Probe und den benutzten Lösungsmitteln.
Die herausgeholten isolierten derivatisierten Peptide werden dann unter Verwendung von MS-Techniken analysiert. Sowohl die Quantität als auch die Sequenzidentität der Proteine, von welchen die gekennzeichneten Peptide herstammten, können durch automatisierte Mehrstufen-MS bestimmt werden. Dies wird durch den Betrieb des Massenspektrometers in einem dualen Modus erreicht, in welchem er in aufeinanderfolgenden Abtastungen zwischen Messen der relativen Quantitäten von Peptiden, eluierend von der Kapillarsäule, und Aufzeichnen der Sequenzinformation von ausgewählten Peptiden alterniert. Peptide werden quantifiziert, indem die relativen Signalintensitäten für Paare von Peptid-Ionen mit identischer Sequenz im MS-Modus gemessen werden, die mit den isotopisch leichten bzw. schweren Formen der Verbindungen der Erfindung gekennzeichnet sind und welche sich daher in der Masse durch das Massendifferential, codiert innerhalb des Affinitäts-gekennzeichneten Reagenzes, unterscheiden. Peptidsequenzinformation wird automatisch erzeugt, indem Peptid-Ionen eines speziellen Verhältnisses Masse-zu-Ladung (m/z) für stoßinduzierte Dissoziation (CID) in dem Massenspektrometer, arbeitend in dem MSⁿ-Modus, ausgewählt werden. Unter Verwendung von Computersuchalgorithmen werden die resultierenden CID-Spektren dann automatisch mit Sequenzdatenbanken korreliert, um das Protein zu identifizieren, von welchem das sequenzierte Peptid herstammte. Eine Kombination der Ergebnisse, erzeugt durch MS- und MSⁿ-Analysen der differentiell markierten Peptidproben, bestimmt daher die relativen Quantitäten ebenso wie die Sequenzidentitäten der Komponenten der Proteingemische in einer einzigen automatisierten Operation. Alternativ kann genauere relative quantitative Bestimmung durch MS-Analyse der isolierten Peptide mit dem Massenspektrometer, arbeitend nur im MS-Modus, erhalten werden [siehe Automatisierte LC/MS in Beispiel 2: Instrumentation].
Apparaturen zum Durchführen von MALDI-MS und Techniken zum Verwenden derartiger Apparaturen sind in der internationalen Veröffentlichung WO 93/24835, der US-Patentschrift 5288644, bei R. Beavis und B. Chait, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:6873–6877 (1990); B. Chait und K. Standing, Int. J. Maß Spectrom. Ion Phys., 40:185 (1981) und Mamyrin et al., Sov. Phys. JETP, 37:45 (1973) beschrieben. Kurz gesagt wird der Frequenz-verdreifachte Ausstoß von z.B. einem gütegeschaltem Neodym/Yttrium-Aluminium-Granat-Laser Lumonics HY400 („Nd-YAG") (355 nm, 10-ns-Ausstoßimpuls) durch eine Linse (12 Zoll Brennweite) durch ein Quarzglasfenster auf eine Probe im Inneren des Massenspektrometers fokussiert. Die durch den Laser erzeugten Produkt-Ionen werden durch ein statisches elektrisches Potential von 30 kV beschleunigt. Die Ionen treiben dann ein 2-m-Rohr, gehalten bei einem Vakuum von 30 μPa, abwärts und ihre Ankunft am Ende des Rohrs wird unter Verwendung von z.B. einem Transientenrecorder Lecroy TR8828D nachgewiesen und aufgezeichnet. Die Transienten-Aufzeichnungen von bis zu 200 individuellen Laseraufnahmen werden zusammengefaßt und das resultierende Histogramm wird als Massenspektrum aufgezeichnet. Peakschwerpunktbestimmungen und Datenverdichtung kann unter Verwendung einer VAX-Arbeitsstation oder eines anderen Computersystems durchgeführt werden. Jedoch sind andere Apparaturen und Techniken bekannt und können ohne weiteres zur Analyse der Peptide der Erfindung benutzt werden.
REAGENZKIT
Die Erfindung stellt weiterhin einen Reagenzkit für die Analyse von Proteinen durch Massenspektralanalyse bereit. Typischerweise enthält ein derartiger Kit eine oder mehrere Verbindungen der Erfindung. Am geeignetsten enthält der Kit eine Gruppe von im wesentlichen identischen, differentiell markierten (isotopisch leichten und schweren) Verbindungen. In einer wünschenswerten Ausführungsform enthält der Kit die Verbindungen der Erfindung, derart, daß der Polymeranteil der Verbindung auch als fester Träger, z.B. ein Kügelchen oder Harz, dient. Der Kit kann weiterhin ein oder mehrere proteolytische Enzyme, Blockierungsreagenzien, solubilisierende Detergenzcocktails oder Waschlösungen enthalten. Andere geeignete Komponenten sind für den Fachmann leicht ersichtlich.
Das Verfahren und der Kit der Erfindung können für eine Vielfalt von klinischen und diagnostischen Assays verwendet werden, in denen die Anwesenheit, Abwesenheit, der Mangel oder Überschuß eines Proteins in Zusammenhang mit einem normalen oder Krankheitszustand gebracht wird. Das Verfahren und der Kit der Erfindung können für qualitative und quantitative Analyse von Proteinexpression in Zellen und Geweben verwendet werden. Das Verfahren und der Kit können auch verwendet werden, um auf Proteine zu screenen, deren Expressionsniveaus in Zellen oder biologischen Flüssigkeiten durch ein Arzneimittel, Toxin, Umweltveränderung oder durch eine Änderung in Kondition oder Zellzustand, z.B. Krankheitszustand, Malignität, auf die Stelle gerichtete Mutation, Gentherapie oder Genknockouts, beeinflußt werden.
BEISPIELE
BEISPIEL 1 – SYNTHESE DER VERBINDUNG DER ERFINDUNG
A. Herstellung von Linker und Affinitätskennzeichnung
Eine Lösung von Maleinsäureanhydrid (0,98 g, 10,0 mmol in 15 ml Esssigsäure) wurde zu einer Lösung von 6-Aminocapronsäure (1,31 g, 10 mmol in 5 ml Essigsäure) hinzugegeben. Das resultierende Gemisch wurde bei Raumtemperatur für zwei Stunden gerührt. Nach zwei Stunden wurde das Gemisch für vier und eine halbe Stunde zum Rückfluß erhitzt (Ölbadtemperatur etwa 110–120°C). Die Essigsäure wurde im Vakuum entfernt und 3,3 g eines hellgelben Feststoffes wurden erhalten. Dieser Feststoff wurde chromatographiert (20% Ethylacetat in Hexanen, dann 50% Ethylacetat in Hexanen) und ergab 0,92 g der reinen Zielverbindung (6-(2,5-Dioxo-2,5-dihydro-pyrrol-1-yl)-hexansäure; 43% Ausbeute). Diese Reaktion wird in dem nachstehend bereitgestellten Schema veranschaulicht, in welchem Essigsäure als HOAc abgekürzt ist.
B. Herstellung von Harz
Das geschützte Polymer, gekauft im Handel als Harz NovaSyn TG Seiber (1 g, 0,15 mmol/g), wurde in N,N-Dimethylformamid (DMF) (8 ml) gerührt und dann wurde Piperidin (2 ml) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für zehn Minuten gerührt und dann wurde der Feststoff abfiltriert und mit Methylenchlorid gewaschen und dann unter Vakuum getrocknet. Dieser trockene Feststoff wurde dann wieder mit Piperidin (2 ml) in DMF (8 ml) für weitere zehn Minuten gerührt. Die Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde aufgezeichnet und zeigte keine Spur des Fluorenylmethyloxycarbonyls (Fmoc). Der Feststoff wurde dann abfiltriert und mit Methylenchlorid gewaschen, unter niedrigem Druck getrocknet, wobei sich etwa 1 g des Polymers mit freiem Amin ergab. Diese Reaktion wird durch das nachstehende Syntheseschema veranschaulicht.
Das Polymer ist ein Copolymer von Polyethylenglycol und Polystyrol.
C. Herstellung der Verbindung der Erfindung
Das entschützte Polymer (1 g, 0,15 mmol/g), synthetisiert wie in Teil B beschrieben, wurde in DMF (10 ml) gerührt. Zu diesem Gemisch wurden nacheinander die Verbindung, welche aus der in Teil A beschriebenen Reaktion resultierte (0,095 g, 0,45 mmol), 1-Hydroxybenzotriazol (HOBT) (0,06 g, 0,45 mmol) und N,N-Dicyclohexylcarbodiimid (DCC) (0,102 g, 0,5 mmol) hinzugegeben. Das Reaktionsgemisch wurde für drei Stunden gerührt und der Feststoff abfiltriert und nacheinander mit Ethylacetat, Ether und Methylenchlorid gewaschen. Der Feststoff wurde dann im Vakuum getrocknet und ergab etwa 1 g des nachstehend veranschaulichten Produkts (ALICE der Erfindung).
BEISPIEL 2 – INSTRUMENTATION
Die vorliegende Erfindung wurde ausgeführt, indem dem Fachmann bekannte Techniken und Instrumentation, kombiniert mit einem neuen Verfahren zur Verwendung derselben, benutzt wurden. Genau gesagt wurden Werte unter Verwendung automatisierter LC/MS allein ebenso wie unter Verwendung eines neuen automatisierten 2-dimensionalen LC/LC/MS-Systems unter Verwendung von auf dem Fachgebiet verfügbarer Instrumentation erhalten. Diese Instrumente und Verfahren zur Verwendung derselben sind nachstehend beschrieben.
A. Automatisierte LC/MS
Automatisierte LC/MS wurde unter Verwendung eines LC/MS-Massenspektrometers MicroMass Q-ToF² (Micromass, Manchester, UK), ausgestattet mit einem Mikrogradienten-Spritzenpumpsystem ABI 140 C (Applied Biosystems, Framingham, MA), ausgeführt. Die Probe wurde auf eine starke Kationenaustausch-(SCX)-Säule, eine IntegraFrit-Säule von 100 μm × 6 cm (New Objectives, Woburn, MA), gepackt mit PolySULFOETHYL A, 12 μm, 300 Å (PolyLC Inc., Columbia, MD), injiziert. Die Probe wurde dann auf eine RP-C18-Säule, eine PicoFrit-Säule von 75 μm × 10 cm (New Objectives, Woburn, MA), gepackt mit 10-μM-C18-Kügelchen aus YMC-Gel (YMC Inc., Wilmington, NC), eluiert, indem eine Lösung von 500 mM KCl in 0,1 M Essigsäure verwendet wurde. Die RP-C18-Säule wurde mit 96% Essigsäure/4% ACN äquilibriert und dann wurde der folgende Gradient durchgeführt: (i) 4–65% RP-B über 75 Minuten, (ii) 65–98% RP-B über die nächsten 7 Minuten, (iii) einem Halt mit 98% RP-B für 5 Minuten und (iv) 98–1% RP-B über die nächsten 3 Minuten mit 250 μl/min. Puffer der mobilen Phase waren für RP-A: 0,1 M Essigsäure, 1% ACN und für RP-B: 0,1 M Essigsäure, 90% ACN. Die Werte wurden nur im MS-Modus erreicht.
B. Automatisierte 2D-LC/MS/MS
Automatisierte 2D-LC/MS/MS wurde unter Verwendung des Systems ausgeführt, wie es in den 1A und 1B gezeigt ist. Genau gesagt wurde ein Ion-Trap-Massenspektrometer 2D LC/MS/MS Finnigan LCG Deca mit einem Mikrogradienten-Spritzenpumpsystem Applied Biosystems 140C (Applied Biosystems, Framingham, MA) als der Umkehrphasenpumpe (RP) und einer binären Pumpe Agilent 1100-Serie als der Pumpe für starken Kationenaustausch (SCX) und Entsalzung ausgestattet. Die Pumpen wurden mit einem VICI-10-Öffnungen-Microbore-zwei-Positionen-Ventil mit einem mikroelektrischen Antrieb (Valco Instruments CO Inc., Houston, TX) verbunden. Eine starke Kationenaustauschsäule, 50 × 1 mm PolySULFOETHYL A (PolyLC Inc., Columbia, MD), wurde mit Öffnung 9 verbunden und zwei IntegraFrit-Säulen 75 mm × 10 cm (New Objectives, Woburn, MA), gepackt mit 10-μm-C18-Kügelchen aus YMC-Gel (YMC Inc., Wilmington, NC), wurden zwischen den Öffnungen 2 und 5 bzw. 7 und 10 verbunden. Eine weitere C18-Säule von 75 μm × 3 cm, gepackt in einer PicoFrit-Säule (New Objectives), wurde zwischen die Titan-Spannungseinheit und die beheizte Kapillare des Massenspektrometers plaziert, um einen Verlust an Auflösung von dem Ventil und der Titaneinheit wiederherzustellen.
Automatisierung zwischen dem Massenspektrometer, den Pumpen und dem Ventil wurde unter Verwendung von Kontaktverschlüssen bewerkstelligt. Zuerst wurde die Probe auf die SCX-Säule aufgegeben, wobei ein Rheodyne-Injektionsventil (Rheodyne, Rohnert Park, CA) mit dem Öffnungsventil an Position 10 wie in 1B gezeigt verwendet wurde, so daß alle ungebundenen Peptide sich an die RP-18-Säule binden und in Fraktion 0 eluieren würden. Mit dieser dualen Gestaltung der C18-Säule, während eine RP-C18-Säule (Säule A in 1A) an das Massenspektrometer für Peptidtrennung angeschlossen ist, wird die andere C18-Säule (Säule B in 1A) regeneriert, mit der Peptidprobe, eluiert aus der SCX-Säule, beladen und entsalzen. Nachdem jeder HPLC-Gradientdurchlauf abgeschlossen ist, wurden die Positionen der zwei RP-C18-Säulen unter Verwendung des zwei-Positionen-zehn-Öffnungen-Ventils (1B) umgeschaltet, so daß die Zeitverzögerung für das Äquilibrieren, Aufgeben der Probe aus SCX und Entsalzen wirksam eliminiert wurde. Peptidfraktionen wurden aus der SCX-Säule auf eine RP-C 18-Säule unter Verwendung der folgenden Salzschritte eluiert: (i) 5%, (ii) 10%, (iii) 15%, (iv) 20%, (v) 30%, (vi) 40%, (vii) 50%, (viii) 65%, (ix) 85%, (x) 98%, (xi) 98%, (xii) 98% und (xiii) 98%, SCX-B:SCX-A, für 10 Minuten mit 1 μl/min. Vor jeder Elution wurden 100% SCX-A mit 1 μl/min für 20 Minuten durchströmen gelassen, um die RP-C18-Säule zu äquilibrieren, und nach jeder Salzelution wurden 100% SCX-A mit 1 μl/min für 20 Minuten für die Elutionen (i) bis (iv), 25 Minuten für die Elutionen (v) und (vi), 30 Minuten für die Elutionen (vii) und (viii) und 35 Minuten für die Elutionen (ix) bis (xiii) durchströmen gelassen. Der Strom wurde dann für den Rest der Zeit bis 200 nl/min verlangsamt, um das Salz aus der RP-C18-Säule zu spülen. Peptide wurden aus einer C18-Säule in den Massenspektrometer eluiert, indem ein linearer RP-Gradient verwendet wurde: a) 1–65% RP-B über 75 Minuten, b) 65–98% RP-B über die nächsten 7 Minuten, c) ein Halt bei 98% RP-B für 5 Minuten und d) 98–1% RP-B über die nächsten 3 Minuten mit 400 nl/min. Puffer der mobilen Phase waren RP-A: 0,1 M Essigsäure, 1% ACN; RP-B: 0,1 M Essigsäure, 90% ACN; SCX-A: 0,1 M Essigsäure, 1% ACN; SCX-B: 500 mM KCl (1A und 1B).
BEISPIEL 3 – HERSTELLUNG VON PROTEOMEN FÜR MS-ANALYSE
2 mg Rinderserumalbumin (BSA) wurden in 200 μl 8 M Harnstoff, 200 mM Ammoniumbicarbonat und 20 mM CaCl₂ solubilisiert. 5 μmol Tributylphosphin (TBP), vorgelöst in 20 μl Acetonitril (ACN), wurden in das solubilisierte Proteingemisch gegeben und die entstandene Lösung wurde bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Zu dem Proteingemisch wurden 11 μmol MMTS gegeben und das Gemisch wurde für 10 Minuten verwirbelt. Die Proteinlösung wurde 1:1 mit 100 mM Ammoniumbicarbonat verdünnt und 40 μg Lys-C (2% Gew./Gew.) wurden hinzugegeben. Dieses Gemisch wurde dann bei 37°C für 5 Stunden inkubiert. Die entstandene Lösung wurde 1:1 mit Wasser verdünnt und dann wurden die Proteine weiter mit Trypsin (2% Gew./Gew.) bei 37°C für 15 Stunden digestiert. Die entstandene Peptidlösung wurde getrocknet und dann mit 50% Acetonitril/200 mM Natriumphosphat (pH 7,2) rekonstituiert. Disulfidbindungen an den Cystein enthaltenden Peptiden wurden mit TBP (5 μmol) bei 37°C für eine Stunde reduziert. Dann wurden 50 mg des ALICE-Harzes (etwa 11,5 μmol reaktive Stellen) in die Peptidlösung gegeben und die Lösung wurde für 1 Stunde bei Raumtemperatur verwirbelt. Die Lösungen wurden vereinigt und auf eine Säule (Glastyp mit Teflonstopfen) aufgegeben und das Harz wurde mit dem folgenden Lösungsmittel der Reihe nach gewaschen: 1) 5 X 1 ml 50 %iges ACN, 2) 5 X 1 ml 30 %iges ACN, 3) 5 X 1 ml 90 %iges ACN, 4) 5 X 1 ml reines ACN, 5) 10 X 5 ml Dichlormethan (DCM).
Cystein enthaltende Peptide wurden dann unter Verwendung einer Durchflußmethodik mit 5% TFA in DCM aus dem Harz eluiert. Die entstandene Peptidlösung wurde getrocknet und mit 1% Essigsäure in Wasser rekonstituiert. Die rekonstituierte Peptidlösung wurde direkt ohne weitere Behandlung automatisierter 2D-LC/MS/MS-Analyse (wie vorstehend beschrieben) unterworfen. MS-Analyse kombiniert mit Datenbanksuche lieferte sowohl Identitäten als auch Quantitäten der Proteine.
Es wurden Proben aus dem Gemisch vor und nach der Säureelution für MS-Analyse genommen, um die Gesamtgewinnung von Cystein enthaltenden Peptiden mit oder ohne Verwendung der ALICE-Herangehensweise zu vergleichen. Die Ergebnisse werden nachstehend mit Bezug auf die folgende veröffentlichte Sequenz von Rinderserumalbumin (unter Verwendung des Einzelbuchstaben-Aminosäure-Codes) bereitgestellt:
SEQ ID NO.1:
Peptide, identifiziert aus Peptidgemischen vor und nach der Verwendung von ALICE zur Isolation von Cystein enthaltenden Peptiden

* Zwei hervorgehobene Cystein enthaltende Peptide: CASIQK (Reste 223–228) und LCVLHEK (Reste 483–489) wurden nur aus der finalen Probe, eluiert aus dem ALICE-Harz, nachgewiesen.

Diese Studie demonstrierte, daß nichtspezifische Bindung, verbunden mit der Verwendung herkömmlicher Reagenzien, bei Verwendung der Verbindungen der Erfindung kein Problem ist, da alle die Peptide, eluiert aus dem Harz nach dem Waschen, ausschließlich Cystein enthaltende Peptide sind. Dies ist der Fall, weil die Verbindungen der Erfindung die Verwendung von im Vergleich zu herkömmlichen ICAT-Reagenzien viel strengeren Waschbedingungen gestatten. So stellen die Verbindungen der Erfindung weniger „Rauschen", einen besseren dynamischen Bereich und Empfmdlichkeit in nachfolgender MS-Analyse bereit.
Genauer gesagt wurden in dieser Studie 33 von 35 Cysteinen eingefangen. Nur ein Cys enthaltendes Peptid, YNGVFQECCQAEDK (Reste 184–197 von SEQ ID NO.1) wurde weder vor noch nach der Isolation gewonnen. CASIQK (Reste 223–228 von SEQ ID NO.1) und LCVLHEK (Reste 483–489 von SEQ ID NO.1) wurden nur nach der Isolation gesehen. Dies ist wahrscheinlich auf den besseren dynamischen Bereich und die Empfindlichkeit zurückzuführen, die durch die Verbindung der Erfindung bereitgestellt werden. Obwohl nicht gemessen, wird erwartet, daß der Prozentsatz der Gesamtgewinnung mehr als 75% beträgt. Sterische Hinderung in dem Schritt des Einfangens ist kein Problem, da die Peptide, die mehr als ein Cystein enthalten, alle gleichmäßig durch ALICE, die Modellverbindung der Erfindung, modifiziert wurden. Aus allen CID-Experimenten waren keine beobachteten Fragmente von der ALICE-Markierung, was anzeigt, daß die Verbindung die MS/MS-Experimente und nachfolgende Proteinidentifizierung durch auf Fragment-Ion basierende Datenbanksuche nicht beeinträchtigen würde.
BEISPIEL 4 – EINFANGEN VON CYSTEIN ENTHALTENDEN PEPTIDEN UNTER VERWENDUNG VON ALICE, EINFACHEN PROTEINGEMISCHEN UND AUTOMATISIERTER LC/MS UND 2D-LC/MS
Zwei Gemische wurden hergestellt, die jeweils acht Proteine enthielten. Die folgende Tabelle veranschaulicht die Zusammensetzung dieser Gemische.
ZUSAMMENSETZUNG VON ZWEI PROTEINGEMISCHEN
Proteingemisch A und Proteingemisch B (323 nmol des Gesamtproteins) wurden jeweils in 325 μl 6 M Harnstoff, 5% 3-[(3-Cholamidopropyl)-dimethylammonio]-1-propansulfonat (CHAPS) und 50 mM Tris-HCl solubilisiert. 11,3 μmol Tributylphosphin (TBP), vorgelöst in 6,3 μl Isopropanol (IPA), wurden zu jedem solubilisierten Proteingemisch hinzugegeben und die entstandenen Lösungen wurden bei 37°C für eine Stunde inkubiert. Zu jedem Proteingemisch wurden 200 μl von 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) und 34 μmol Methanthiosulfonat (MMTS), vorgelöst in 3,5 μl IPA, hinzugegeben und die Gemische wurden für 30 Minuten umgesetzt. Jede Proteinlösung wurde vier Mal mit 50 mM Tris-HCl (pH 8,0) verdünnt und mit Trypsin (5% Gew./Gew.) bei 37°C für 16 Stunden digestiert. Von den gesamten Peptidgemischen wurden 42% (21% von jedem Gemisch) für zukünftige Arbeit zurückgehalten, und die verbliebenen 58% (187 nmol Gesamtprotein) wurden getrocknet und dann mit 1,5 ml von 60% Acetonitril (ACN)/40% 100 mM Tris-HCl (pH 7,0) rekonstituiert. Disulfidbindungen an den Cystein enthaltenden Peptiden wurden durch TBP (18,7 μmol) bei 37°C für eine Stunde reduziert. Jede Lösung wurde dann im Vakuum für 10 Minuten eingeengt, um überschüssiges TBP und ACN zu entfernen, und unter Verwendung von ACN zu dem vorherigen Volumen rekonstituiert. Zu jeder Lösung wurden 55 μmol von entweder leichten oder schweren ALICE-Harzen (3X TBP molares Äquivalent) hinzugegeben und die Lösungen wurden für 1 Stunde bei Raumtemperatur gerührt. Die Reaktionen wurden durch die Zugabe von β-Mercaptoethanol (BME) zu einer Endkonzentration von 1% abgeschreckt.
Die Proteingemische wurden dann vereinigt und auf eine Säule (Fritteglastyp mit Teflonstopfen) aufgegeben und das Harz wurde mit dem folgenden Lösungsmittel der Reihe nach gewaschen: (i) 50 ml einer 50:50-ACN:Wasser-Lösung, (ii) 50 ml reines ACN, (iii) 50 ml einer 50:50-ACN:Dichlormethan-(DCM)-Lösung und (iv) 50 ml reines DCM.
Cystein enthaltende Peptide wurden durch Elution mit 3 × 5 ml von 5% TFA in DCM unter Verwendung von Durchflußmethodik, 15 Minuten Inkubationen mit intermittierendem Schütteln, dann 15 ml kontinuierlichem Fließen isoliert. Die entstandene Peptidlösung wurde getrocknet und mit 2% ACN in 1% Essigsäure/Wasser rekonstituiert. Die rekonstituierte Peptidlösung wurde direkt ohne weitere Behandlung zur Analyse dem HPLC-MS-Instrument MicroMass Q-ToF² (MicroMass, Manchester, UK) und der 2D-LC-MS/MS (Finnigan LCQ Deca, Finnigan Corporation, San Jose, CA) unterworfen. Diese Analysen, kombiniert mit Datenbanksuche, ergaben sowohl Identitäten als auch Quantitäten der Proteine. Die chemischen Reaktionen für die Isolation von Cystein enthaltenden Peptiden sind in dem folgenden Schema veranschaulicht.
Die Ergebnisse der massenspektrometrischen Analyse werden in der folgenden Tabelle bereitgestellt. In dieser Tabelle ist M# = oxidierter Methioninrest; C* = mit leichter und schwerer ALICE markierter Cysteinrest.
TABELLE – SEQUENZIDENTIFIZIERUNG UND QUANTITATIVE BESTIMMUNG DER KOMPONENTEN EINES PROTEINGEMISCHES UNTER VERWENDUNG VON ALICE
Diese Studie hat demonstriert, daß die Quantifizierung durch ALICE genau ist, nachdem die folgenden Faktoren berücksichtigt worden sind: Isotopische Verunreinigung der schweren ALICE; unterschiedliches Elutionsprofil der gleichen Peptide, modifiziert durch schwere und leichte ALICE; nichtspezifische enzymatische Spaltung. Diese verbesserte Genauigkeit der quantitativen Bestimmung 5 durch ALICE ist noch offensichtlicher, wenn mehrfaches Cystein enthaltende Peptide vorhanden sind. Peptide ohne irgendeinen Cysteinrest wurden in dem finalen eingefangenen Peptidgemisch kaum gesehen, da stringentere Waschbedingungen nichtspezifisch gebundene Spezies vollständig entfernten. Weiterhin minimierte die Verwendung großer Mengen von organischen Lösungsmitteln ebenfalls den Verlust von Peptiden während des Verfahrens. Schließlich vergrößert die Vereinfachung des Peptidgemisches durch Isolieren Cystein enthaltender Peptide in Kombination mit der neuen automatisierten 2D-LC/MS-Gestaltung die Gesamtladungskapazität der Probe, die Geschwindigkeit der Probenanalyse sowie den dynamischen Bereich und die Empfindlichkeit der MS-Analyse von Proteingemischen. Dieses Experiment bestätigte ebenfalls weiterhin, daß die Reaktion zwischen ALICE und Cystein enthaltenden Peptiden effizient und stöchiometrisch ist und die Auswirkung sterischer Hinderung kein Problem ist, da Peptide mit mehr als einem Cysteinrest vollständig durch ALICE modifiziert wurden. Zum Beispiel wurde ein tryptisches Peptid mit drei Cysteinresten, abgeleitet von Lysozym (NLC*NIPC*SALLSSDITASVNC*AK, SEQ ID NO:2), gleichmäßig mit entweder schwerer oder leichter ALICE markiert (die Massendifferenz (nicht gezeigt) zwischen diesem schweren und leichten Massepaar beträgt exakt 30 Da). Mit sowohl leichter als auch schwerer ALICE markierte Peptide werden wirksam durch das automatisierte 2D-LC/LC/MS System für MS/MS-Analyse aufgenommen, selbst wenn die Peakintensität für das mit leichter ALICE markierte Peptid sehr niedrig ist. Nachfolgende Datenbanksuche identifizierte das Peptid als NLC*NIPC*SALLSSDITASVNC*AK [SEQ ID NO:2] mit Cysteinresten, modifiziert durch leichte bzw. schwere ALICE.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Verfahren für die Analyse von Gemischen, enthaltend Proteine, wobei das Verfahren die Schritte umfasst: (a) Reduzieren der Disulfidbindungen in den Proteinen einer Probe, dadurch Bereitstellen von Thiolgruppen in Cystein enthaltenden Proteinen; (b) Blockieren freier Thiole mit einem Blockierungsreagenz in der Probe; (c) Digestieren der Proteine in der Probe, um Peptide bereitzustellen; (d) Reduzieren der Disulfidbindungen in den digestierten Peptiden, dadurch Bereitstellen von Thiolgruppen in Cystein enthaltenden Peptiden zur Reaktion; (e) Umsetzen von Cystein enthaltenden Peptiden in der Probe mit einem Reagenz, wobei das Reagenz eine Thiol-spezifische reaktive Gruppe umfasst, welche über einen Linker an eine Polymerkennzeichnung gebunden ist, wobei der Linker differentiell mit stabilen Isotopen markiert sein kann und wobei die Polymerkennzeichnung eine kovalente Bindung mit den Cystein enthaltenden Peptiden bildet; (f) Waschen der Polymer-gebundenen Peptide, um nicht kovalent gebundene Spezies zu entfernen; (g) Eluieren der Cystein enthaltenden Peptide; und (h) Unterwerfen der eluierten Peptide quantitativer Massenspektrometrieanalyse.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei das Verfahren weiterhin die Schritte umfasst: Durchführen der Schritte (a) bis (d) an einer zweiten Probe; Umsetzen der Cystein enthaltenden Markierungen in der zweiten Probe mit einer mit stabilem Isotop markierten Form des Reagenzes, wobei in Reaktionsschritt (e) das verwendete Reagenz eine nicht Isotop-markierte Form des Reagenzes ist; Mischen der Peptide der umgesetzten Probe nach Schritt (e) und der umgesetzten zweiten Probe; und Durchführen der Schritte (g) und (h) an den Peptiden in dem Gemisch.
Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, wobei das Reagenz eine Thiol-spezifische reaktive Gruppe, ausgewählt aus α-Halogenacetyl und Maleinsäureimid, umfasst.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Blockierungsreagenz Methylmethanthiosulfonat ist.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Reagenz die Formel: A1-Linker-A2-Polymer hat, wobei A1 die thiol-reaktive Gruppe ist und A2 eine säurelabile Gruppe ist, an welche das Polymer gebunden ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei A2-Polymer die Struktur:
hat.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Polymer in dem Reagenz ein Polymerharz ist.
Verfahren nach Anspruch 7, wobei das Polymerharz ein Homopolymer oder Heteropolymer, umfassend ein Polymer, ausgewählt aus Polystyrol und Polyethylenglycol, ist.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei der Linker eine Substitution von mindestens sechs Wasserstoffatomen mit einem stabilen Isotop enthält.
Verfahren nach Anspruch 9, wobei der Linker zehn stabile Isotope enthält.
Verfahren nach Anspruch 9 oder 10, wobei das stabile Isotop Deuterium ist.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das nicht Isotop-markierte Reagenz
ist.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei das Isotop-markierte Reagenz die Formel:
hat.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die eluierten Peptide Hochleistungsflüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie-Analyse, zweidimensionaler Flüssigkeitschromatographie-Massenspektrometrie oder Massenspektrometrie/Massenspektrometrie-Analyse unterworfen werden.
Verfahren nach einem vorhergehenden Anspruch, wobei die Proteine unter Verwendung von Trypsin digestiert werden.
Verbindung, verwendbar zum Einfangen von Cystein enthaltenden Peptiden, umfassend eine Thiol-spezifische reaktive Gruppe, gebunden an ein nichtbiologisches Polymer über einen Linker, wobei das Polymer über eine säurelabile Gruppe kovalent an den Linker gebunden ist.
Verbindung nach Anspruch 16, wobei der Linker eine Substitution von mindestens sechs Atomen mit einem stabilen Isotop enthält.
Verbindung nach Anspruch 17, wobei der Linker zehn stabile Isotope enthält.
Verbindung nach Anspruch 16 oder 17, wobei das stabile Isotop Deuterium ist.
Verbindung nach Anspruch 16, ausgewählt aus:
Reagenzkit für die Analyse von Proteinen durch Massenspektralanalyse, der eine Verbindung nach einem der Ansprüche 16 bis 20 umfasst.
Reagenzkit nach Anspruch 21, welcher eine Gruppe von im wesentlichen identischen, differentiell markierten, Cystein kennzeichnenden Reagenzien umfasst.
Reagenzkit nach Anspruch 21 oder 22, weiterhin umfassend ein oder mehrere proteolytische Enzyme zur Verwendung bei der Digestion von zu analysierenden Proteinen.