DE69905265T2

DE69905265T2 - Charakterisierung von polypeptiden durch spaltung und massenspektrometrie

Info

Publication number: DE69905265T2
Application number: DE69905265T
Authority: DE
Inventors: Guenter Schmidt; Hugin Thompson
Original assignee: Xzillion GmbH and Co KG
Current assignee: Proteome Sciences PLC
Priority date: 1998-10-01
Filing date: 1999-10-01
Publication date: 2003-11-27
Anticipated expiration: 2019-10-02
Also published as: JP2002526778A; GB9821393D0; NO20011552L; PT1117999E; CA2344642C; IL142314A0; EP1117999B1; US6846679B1; NO20011552D0; AU768902B2; CA2344642A1; DE69905265D1; NZ510873A; ATE232300T1; CN1411555A; IL142314A; EP1117999A1; AU6109699A; DK1117999T3; JP3730121B2

Description

Diese Erfindung bezieht sich auf ein Verfahren zur Charakterisierung von Polypeptiden unter Anwendung einer Massenspektrometrie zur Identifizierung der Endfragmente der Polypeptide. Das Verfahren umfasst das Spalten der Polypeptide und das Isolieren eines einzelnen terminalen Peptids von jedem Protein in einer Population. Diese Erfindung bezieht sich weiters auf die Anwendung der obenstehenden Verfahren bei Verfahren zur Bestimmung der Expression von Proteinen in einem Gewebe, einem Zelltyp oder einem subzellulären Kompartiment oder bei der Analyse von großen Proteinkomplexen.
Die Techniken zum Profilieren von Proteinen, d. h. zum Katalogisieren der Identitäten und Mengen von Proteinen in einem Gewebe, sind hinsichtlich einer Automatisation oder eines hohen Durchsatzes nicht gut entwickelt. Das klassische Verfahren zum Profilieren einer Population von Proteinen erfolgt durch eine zweidimensionale Elektrophorese (R. A. Van Bogelen, E. R. Olson "Application of two-dimensional protein gels in biotechnology.", Biotechnol. Annu. Rev.; 1: 69-103, 1995). Bei diesem Verfahren wird eine aus einer biologischen Probe extrahierte Proteinprobe auf einem schmalen Gelstreifen aufgetrennt. Diese erste Trennung trennt Proteine üblicherweise auf Basis ihres isoelektrischen Punkts. Der gesamte Gelstreifen wird danach gegen einen Rand eines rechteckigen Gels gelegt. Die getrennten Proteine im Streifen werden daraufhin im zweiten Gel auf Basis ihrer Größe elektrophoretisch getrennt. Diese Technologie ist langsam und sehr schwierig zu automatisieren. In ihren einfachsten Verkörperungen ist sie auch relativ unempfindlich.
Eine Anzahl von Verbesserungen wurde durchgeführt, um durch 2-D- Gelelektrophorese die Auflösung von Proteinen zu verstärken und die Empfindlichkeit des Systems zu verbessern. Ein Verfahren zur Verbesserung der Empfindlichkeit einer 2-D- Gelelektrophorese und ihrer Auflösung besteht in der Analyse des Proteins an spezifischen Stellen am Gel durch Mass enspektrometrie (Jungblut P, Thiede B. "Protein identification from 2-DE gels by MALDI mass spectrometry." Mass Spectrom. Rev. 16: 145-162, 1997). Ein derartiges Verfahren ist das tryptische In-Gel-Aufschließen, gefolgt von der Analyse der tryptischen Fragmente durch Massenspektrometrie zwecks Erzeugung eines Peptidmassen- Fingerabdrucks. Sind Sequenzinformationen gefordert, so kann eine Tandern- Massenspektrometrieanalyse durchgeführt werden.
In jüngerer Zeit wurden Versuche hinsichtlich der Ausnutzung der Massenspektrometrie unternommen, um ganze Proteine, die durch Flüssig-Chromatographie oder Kapillarelektrophorese fraktioniert wurden, zu analysieren (Dolnik V. "Capillary zone electrophoresis of proteins", Electrophoresis 18, S. 2353-2361, 1997). In-line-Systeme, welche die Kapillarelektrophorese-Massenspektrometrie ausnutzten, wurden getestet. Die Analyse von ganzen Proteinen durch Massenspektrometrie ist jedoch durch eine Reihe von Schwierigkeiten beeinträchtigt. Die erste Schwierigkeit ist die Analyse der komplexen Massenspektren, die aus von einzelnen Proteinen erreichbaren, mehrfachen Ionisierungszuständen resultieren. Der zweite große Nachteil besteht darin, dass die Massenauflösung von Massenspektrometern für Arten mit hohem Molekulargewicht, d. h. für Ionen, die eine Masse von mehr als etwa 4 Kilodalton haben, zur Zeit ziemlich schlecht ist. Somit ist das Auflösen von Proteinen, die in ihrer Masse nahe beeinander liegen, schwierig. Ein dritter Nachteil besteht darin, dass eine weitere Analyse von ganzen Proteinen mittels Tandern- Massenspektrometrie schwierig ist, da die Fragmentierungsmuster für ganze Proteine extrem komplex und schwierig zu interpretieren sind.
Die WO 98/32876 offenbart Verfahren zum Profilieren einer Population von Proteinen durch Isolierung eines einzelnen Peptids aus jedem Protein in der Population. Das in dieser Anmeldung geoffenbarte Verfahren umfasst die folgenden Schritte:
1. das Einfangen einer Population von Proteinen auf einem Festphasenträger durch einen Terminus jedes Proteins in der Population.
2. das Spalten der eingefangenen Proteine mit einem sequenzspezifischen Spaltmittel.
3. das Fortwaschen von durch das Spaltmittel erzeugten Peptiden, die am Festphasenträger nicht zurückgehalten werden.
4. das Freisetzen der am Festphasenträger zurückgehaltenen terminalen Peptide.
5. das Analysieren der freigesetzten terminalen Peptide, wobei vorzugsweise jedes Peptid in der Mischung identifiziert und quantitativ bestimmt wird. Die Analyse wird vorzugsweise durch Massenspektrometrie durchgeführt.
Bei dieser Anwendung zeigt sich, dass der C-Terminus als jener Terminus, durch den eine Population von Proteinen einzufangen ist, vorzuziehen ist, da der N-Terminus oft blockiert ist. Um eine Population von Proteinen durch den C-Terminus einzufangen, muss die C-terminale Carboxylgruppe von anderen reaktiven Gruppen auf einem Protein unterschieden werden und muss spezifisch mit einem Reagens, das eine Immobilisierung bewirken kann, umgesetzt werden. Bei vielen C-terminalen Sequenzierungschemien wird die C-terminale Carboxylgruppe aktiviert, um die Bildung einer Oxazolongruppe am C- Terminus zu fördern. Während der Aktivierung des C-terminalen Carboxyls werden Seitenkettencarboxyle ebenfalls aktiviert, diese können jedoch keine Oxazolongruppe bilden. Es wurde berichtet, dass das C-terminale Oxazolon unter basischen Bedingungen weniger reaktiv hinsichtlich Nucleophilen ist, als dies die aktivierten Seitenkettencarboxyle sind, wodurch ein Verfahren zum selektiven Abdecken der Seitenkettencarboxylgruppen geboten wird (V. L. Boyd et al., Methods in Protein Structure Analysis: 109-118, Plenum Press, herausgegeben von M. Z. Atassi und E. Appella, 1995). Andere reaktivere Seitenketten können vor der Aktivierung der Carboxyle abgedeckt werden, wobei eine Vielfalt von herkömmlichen Reagenzien verwendet wird. Auf diese Weise können alle reaktiven Seitenketten abgedeckt werden und kann der C-Terminus spezifisch markiert werden.
Die EP-A-0 594 164 beschreibt ein Verfahren zur Isolierung eines C-terminalen Peptids aus einem Protein in einem Verfahren, um die Sequenzierung des C-terminalen Peptids zu erlauben, wobei N-terminale Sequenzierreagenzien verwendet werden. Bei diesem Verfahren wird das Protein, das von Interesse ist, mit einer Endoprotease, die an der C-terminalen Seite der Lysinreste spaltet, aufgeschlossen. Die resultierenden Peptide werden mit DITC-Polystyrol, das mit allen freien Aminogruppen reagiert, umgesetzt. N-terminale Aminogruppen, die mit dem DITC-Polystyrol reagiert haben, können mit Trifluoressigsäure (TFA) gespalten werden, wodurch der N-Terminus aller Peptide freigesetzt wird. Die Epsilon-Aminogruppe von Lysin wird jedoch nicht gespalten, und alle nicht terminalen Peptide werden somit am Träger zurückgehalten, und nur C-terminale Peptide werden freigesetzt. Gemäß diesem Patent werden die C-terminalen Peptide für eine Mikrosequenzierung gewonnen.
Keines der obenstehenden Verfahren ist jedoch in der Lage, alle in einer Population vorhandenen Proteine leicht zu identifizieren, und in der Tat können viele dieser Verfahren überhaupt nicht alle vorhandenen Proteine eindeutig identifizieren.
Demgemäß besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung in der Überwindung der mit dem Stand der Technik zusammenhängenden Probleme und in der Schaffung eines Verfahrens zur Charakterisierung von Polypeptiden, das in der Lage ist, einen größeren Anteil von in einer Probe vorhandenen Proteinen eindeutig zu identifizieren, als unter Anwendung von Verfahren des Standes der Technik möglich ist. Somit besteht ein Ziel der vorliegenden Erfindung in der Schaffung von verbesserten Verfahren zur Isolierung eines einzelnen terminalen Peptids aus jedem Protein in einer Mischung, einem Komplex oder einer Population (auf beliebige Weise hergestellt). Ein weiteres Ziel dieser Erfindung besteht in der Schaffung solcher Verfahren, die einer Automatisierung zugänglich sind. Ebenso besteht ein Ziel dieser Erfindung in der Schaffung von Verfähren zur Verbesserung der Empfindlichkeit der Massenspektrometrieanalyse von durch die Verfahren dieser Erfindung hergestellten, terminalen Peptiden.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Charakterisierung eines Polypeptids oder einer Population von Polypeptiden bereit, welches Verfahren Folgendes umfasst:
(a) das In-Kontakt-Bringen einer ein oder mehrere Polypeptide umfassenden Probe mit einem ersten Spaltmittel zwecks Herstellung von Palypeptidfragmenten;
(b) das Isolieren eines oder mehrerer Polypeptidfragmente, wobei jedes Fragment den N- Terminus oder C-Terminus des Polypeptids; aus dem es herausgebrochen wurde, umfasst;
(c) das Identifizieren der isolierten Fragmente durch Massenspektrometrie;
(d) das Wiederholen der Schritte (a)-(c) an der Probe unter Verwendung eines zweiten Spaltmittels, das an einer anderen Stelle als das erste Spaltmittel spaltet; und
(e) das Charakterisieren des einen oder der mehreren Polypeptide in der Probe aus den in den Schritten (c) und (d) identifizierten Fragmenten.
Im Kontext der vorliegenden Erfindung inkludiert ein Polypeptid jedes Peptid, das zwei oder mehr Aminosäuren umfasst, und inkludiert jedes Protein. Im vorliegenden Kontext ist die im Wiederholungsschritt (d) verwendete Probe die gleiche Probe wie jene, die im Schritt (a) verwendet wurde. Die "gleiche Probe" kann (beispielsweise) eine von einer Mehrzahl von Portionen, die von einer ursprünglichen Probe getrennt wurden, bedeuten, wobei für jede Wiederholung der Schritte (a)-(c) eine Portion existiert.
Die Schritte (a)-(c) können beliebig oft, d. h. einmal, zweimal oder mehrere Male, wiederholt werden. Für jede Wiederholung wird ein Spaltmittel verwendet, das an einer anderen Stelle als die zuvor verwendeten Spaltmittel spaltet. Dies ergibt für jede Wiederholung ein anderes Set von Endfragmenten, obwohl dieselbe Probe behandelt wird. Wenn zwei oder mehr Proteine durch ihre Endfragmente, die durch Spaltung an einer bestimmten Stelle hergestellt wurden, nicht unterschieden werden können (wenn z. B. zwei oder mehr Proteine Endfragmente haben, die dieselbe oder eine nicht unterscheidbare Masse besitzen), dann kann eine Spaltung an einer anderen Stelle (für dieselben zwei oder mehr Proteine) Endfragmente von verschiedenen Massen erzeugen. Somit wird die Auflösung des Verfahrens durch Wiederholung verstärkt, wobei eine Mehrzahl von verschiedenen Spaltmitteln eingesetzt wird.
Die bei der vorliegenden Erfindung verwendeten Spaltmittel sind nicht besonders eingeschränkt. Bevorzugte Spaltmittel umfassen eine Endopeptidase oder ein chemisches Spaltmittel. Noch bevorzugter umfasst das eingesetzte Spaltmittel Lys-C-Endopeptidase, eine Thiocyanatverbindung, Cyanbromid, BNPS-Skatol, Trypsin, Chymotrypsin und/oder Thrombin.
Die vorliegende Erfindung stellt auch ein Verfahren zur Charakterisierung eines Polypeptids oder einer Population von Polypeptiden bereit, welches Verfahren Folgendes umfasst:
(f) das In-Kontakt-Bringen einer ein oder mehrere Polypeptide umfassenden Probe mit einem ersten Abdeckmittel in einem ersten Abdeckschritt zwecks Einführung von Abdeckgruppen an einer oder mehreren reaktiven Seitenketten der Polypeptide;
(g) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Spaltmittel zwecks Herstellung von Polypeptidfragmenten;
(h) das Isolieren eines oder mehrerer Polypeptidfragmente, wobei jedes Fragment den N- Terminus oder C-Terminus des Polypeptids, aus dem es herausgebrochen wurde, umfasst;
(j) das Identifizieren der isolierten Fragmente durch Massenspektrometrie;
(k) das Wiederholen der Schritte (f)-(j) an der Probe unter Verwendung eines zweiten Abdeckmittels, das an denselben Seitenketten wie im ersten Abdeckschritt Abdeckgruppen einführt, jedoch Abdeckgruppen verwendet, die eine andere Masse haben als die im ersten Abdeckschritt verwendeten Abdeckgruppen; und
(1) das Charakterisieren des einen oder der mehreren Polypeptide in der Probe aus den in den Schritten (j) und (k) identifizierten Fragmenten.
Das Verfahren kann dasselbe Spaltmittel oder für jede Wiederholung andere Spaltmittel einsetzen, so lange für jede Wiederholung Abdeckgruppen mit anderen Massen eingesetzt werden. Die Schritte (f)-(j) können beliebig oft, d. h. einmal, zweimal oder mehrere Male, wiederholt werden. Für jede Wiederholung wird eine Abdeckgruppe eingesetzt, die eine andere Masse besitzt als die entsprechende vorhergehende Abdeckgruppe, die verwendet wurde. Dies ergibt für jede Wiederholung ein anderes Set von Endfragmenten, obwohl dieselbe Probe mit demselben Spaltmittel behandelt wird. Wenn zwei oder mehr Proteine von ihren Endfragmenten, die mit einer bestimmten Abdeckgruppe oder bestimmten Abdeckgruppen abgedeckt sind, nicht unterschieden werden können (wenn z. B. zwei oder mehr Proteine Endfragmente haben, die dieselbe oder eine nicht unterscheidbare Masse besitzen), dann kann die Verwendung einer oder mehrerer Abdeckgruppen mit einer anderen Masse als die im vorhergehenden Abdeckschritt eingesetzten, entsprechenden Gruppen (für dieselben zwei oder mehr Proteine) Endfragmente von verschiedenen Massen erzeugen. Somit wird die Auflösung des Verfahrens durch Wiederholung verstärkt, wobei eine Mehrzahl von Abdeckgruppen eingesetzt wird, von denen jede eine andere Masse hat.
Bei den obenstehend beschriebenen Verfahren können die abzudeckenden Seitenketten eines oder mehr des Folgenden umfassen, wenn die Seitenketten der Proteine in der Population abgedeckt werden sollen:
die NH&sub2;-Seitenkette in Arginin;
die NH&sub2;-Seitenkette in Asparagin;
die NH&sub2;-Seitenkette in Glutamin;
die NH&sub2;-Seitenkette in Lysin;
die COOH-Seitenkette in Asparaginsäure;
die COOH-Seitenkette in Glutaminsäure;
die OH-Seitenkette in Serin;
die OH-Seitenketxe in Threonin;
die OH-Seitenkette in Thyroxin;
die OH-Seitenkette in Tyrosin; und
die SH-Seitenkette in Cystein.
Die bei der vorliegenden Erfindung eingesetzten Abdeckmittel sind nicht besonders eingeschränkt. Bevorzugte Abdeckmittel umfassen Iodacetatverbindungen, Isocyanatverbindungen (z. B. Phenylisocyanat), Silylverbindungen (z. B. Trimethylchlorsilan), Anhydridverbindungen (z. B. Acetanhydrid und Trimethylacetanhydrid), Vinylsulfonverbindungen (z. B. Phenylvinylsulfon und Methylvinylsulfon) und Vinylpyridinderivate (z. B. 4-Vinylpyridin). Die Masse der Abdeckgruppe kann durch Substitution geändert werden. Eine derartige Substitution ist nicht besonders eingeschränkt, vorausgesetzt, dass die Abdeckreaktion noch fortschreiten kann. Eine Substitution mit Deuterium oder einem Halogen, wie z. B. einer Iodgruppe, wird bevorzugt.
Somit stellt diese Erfindung in einem bevorzugten Aspekt ein Verfahren zur Herstellung eines Proteinexpressionsprofils mit einer verbesserten Auflösung bereit, indem zwei oder mehr Proteinexpressionsprofile kombiniert werden, wobei die Profile aus derselben Proteinmischung hergestellt wurden, jedoch mit zwei oder mehr verschiedenen sequenzspezifischen Spaltmitteln behandelt wurden. Ein anderes sequenzspezifisches Spaltmittel wird bei der Herstellung jedes einzelnen Profils verwendet. In diesem Zusammenhang bezieht sich die Auflösung auf den Anteil an Proteinen in einer Population, die allein auf Basis ihrer terminalen Peptidmasse eindeutig aus einer Datenbank identifiziert werden können.
In einem weiteren bevorzugte Aspekt stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Proteinexpressionsprofils mit einer verbesserten Auflösung bereit, indem zwei oder mehr Expressionsprofile kombiniert werden, wobei die Profile aus derselben Proteinmischung hergestellt und mit demselben sequenzspezifischen Spaltreagens gespalten wurden, wobei jedoch spezifische Seitenketten, wie z. B. Aminosäureseitenketten, mit zwei oder mehr Abdeckreagenzien mit verschiedenen Massen abgedeckt wurden. Ein anderes Set von Abdeckmitteln wird bei der Herstellung jedes einzelnen Profils verwendet.
Mehr bevorzugte Aspekte der Erfindung werden nunmehr im Detail besprochen. In einem ersten bevorzugten Aspekt stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Population von terminalen Peptiden bereit, umfassend die folgenden Schritte:
1. das Immobilisieren einer Population von Proteinen auf einem festen Träger.
2. das In-Kontakt-Bringen der immobilisierten Population von Proteinen mit einem Reagens, das mit der Alpha-Aminogruppe am N-Terminus der Proteine und mit allen Lysin- Epsilon-Aminogruppen reagiert. Dieses Reagens kann gegebenenfalls auch mit irgendwelchen Serin- und Threonin-Seitenketten reagieren, um diese abzudecken. In diesem Zusammenhang bedeutet Abdecken das Umsetzen der Seitenketten mit einem Reagens, das die Seitenketten reaktionsunfähig hinsichtlich irgendwelcher anderen, in den nachfolgenden Schritten dieses Verfahrens eingesetzten Reagenzien macht. Deckt das Reagens keine anderen Seitenketten als Amingruppen ab, so können zusätzliche Abdeckmittel zur Abdeckung anderer reaktiver Seitenketten eingesetzt werden, so dass im Wesentlichen alle reaktiven Seitenketten abgedeckt werden.
3. das In-Kontakt-Bringen der Proteinpopulation mit einem Reagens, das die freien Carboxylgruppen der Proteine "aktivieren" wird. Das Aktivierungsreagens sollte vorzugsweise die Bildung einer Oxazolongruppe an den C-terminalen, aktivierten Carboxylen der Proteine in der Population fördern.
4. das In-Kontakt-Bringen der resultierenden derivatisierten Proteine mit einem Nucleophil unter basischen Bedingungen, um die aktivierten Seitenketten-Carboxylderivate abzudecken. Das C-terminale Oxazolinon ist hinsichtlich Nucleophilen weniger reaktiv als die aktivierten Seitenkettencarboxyle. Auf diese Weise werden alle reaktiven Seitenkettenfunktionalitäten abgedeckt. Vorzugsweise wird das Nucleophil als Thiocyanatsalz beigefügt.
5. das In-Kontakt-Bringen der Reaktionsmischung mit einer geeigneten Säure, vorzugsweise TFA, welche die Reaktion der C-terminalen Oxazolongruppe mit Thiocyanat fördert, um ein C-terminales Thiohydantoinderivat zu ergeben.
6. das In-Kontakt-Bringen der Proteine mit einem Spaltmittel zur Abspaltung des C- terminalen Thiohydantoins von den derivatisierten Proteinen, um das Carboxyl der vorletzten Aminosäure in jedem Protein freizulegen.
7, das In-Kontakt-Bringen des freigelegten vorletzten Carboxyls mit einem geeigneten Reagens, um ein Festphäsen-Einfangen von Proteinen durch den C-Terminus zu erlauben.
8. das In-Kontakt-Bringen der C-terminal modifizierten Proteine mit einem sequenzspezifischen Spaltmittel.
9. das Einfangen der C-terminalen Peptide auf einem Festphasenträger und das Fortwaschen der nicht terminalen Peptide.
10. gegebenenfalls das Umsetzen der terminalen Amingruppe der eingefangenen Peptide mit einem Massenspektrometrie-Sensibilisierungsreagens.
11. das Freisetzen der eingefangenen C-terminalen Peptide aus dem Festphasenträger
12. das Gewinnen der freigesetzten Peptide.
13. das Analysieren der C-terminalen Peptide durch Massenspektrometrie.
Irgendeiner der obenstehenden bevorzugten Schritte oder jegliche Kombination der obenstehenden bevorzugten Schritte kann bei den allgemeinen Verfahren der Erfindung, wie obenstehend bereits beschrieben, angewandt werden.
In einem zweiten bevorzugten Aspekt stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Population von terminalen Peptiden bereit, umfassend die folgenden Schritte:
1. das Immobilisieren einer Population von Proteinen auf einem Festenphasenträger.
2. das In-Kontakt-Bringen der iminobilisierten Population von Proteinen mit einem Reagens, das mit der Alpha-Aminogruppe am N-Terminus der Proteine und mit allen Lysin- Epsilon-Aminogruppen reagiert. Dieses Reagens kann gegebenenfalls auch mit irgendwelchen Serin- und Threonin-Seitenketten reagieren, um diese abzudecken. In diesem Zusammenhang bedeutet Abdecken das Umsetzen der Seitenketten mit einem Reagens, das die Seitenketten reaktionsunfähig hinsichtlich irgendwelcher anderen, in den nachfolgenden Schritten dieses Verfahrens eingesetzten Reagenzien macht. Deckt das Reagens keine anderen Seitenketten als Amingruppen ab, so können zusätzliche Abdeckmittel zur Abdeckung anderer reaktiver Seitenketten eingesetzt werden, so dass im Wesentlichen alle reaktiven Seitenketten abgedeckt werden.
3. das In-Kontakt-Bringen der Proteinpopulation mit einem Reagens, das die freien Carboxylgruppen der Proteine "aktivieren" wird. Das Aktiverungsreagens sollte vorzugsweise die Bildung einer Oxazolongruppe an den C-terminalen, aktivierten Carboxylen der Proteine in der Population fördern.
4. das In-Kontakt-Bringen der resultierenden derivatisierten Proteine mit einem Nucleophil unter basischen Bedingungen, um die aktivierten Seitenketten-Carboxylderivate abzudecken. Das C-terminale Oxazolinon ist hinsichtlich Nucleophilen weniger reaktiv als die aktivierten Seitenketterkarboxyle. Auf diese Weise werden alle reaktiven Seitenkettenfunktionalitäten abgedeckt. Vorzugsweise wird das Nucleophil als Salz mit einem inerten Anion beigefügt.
5. das Hydrolysieren des C-terminalen Oxazolons zwecks Regenerierung der C- terminalen Carboxylspezies.
6. das In-Kontakt-Bringen der Proteine mit einem Aktivierungsmittel zwecks Aktivierung der C-terminalen Carboxylgruppe.
7. das In-Kontakt-Bringen der aktivierten terminalen Carboxylgruppe mit einem geeigneten Reagens, um ein Festphasen-Einfangen von Proteinen durch den C-Terminus zu erlauben.
8. das In-Kontakt-Bringen der C-terminal modifizierten Proteine mit einem sequenzspezifischen Spaltmittel.
9. das Einfangen der C-terminalen Peptide auf einem Festphasenträger und das Fortwaschen der nicht terminalen Peptide.
10. gegebenenfalls das Umsetzen der terminalen Amingruppe der eingefangenen Peptide mit einem Massenspektrometrie-Sensibilisierungsreagens.
11. das Freisetzen der eingefangenen C-terminalen Peptide aus dem Festphasenträger.
12. das Gewinnen der freigesetzten Peptide.
13. das Analysieren der C-terminalen Peptide durch Massenspektrometrie.
Irgendeiner der obenstehenden bevorzugten Schritte oder jegliche Kombination der obenstehenden bevorzugten Schritte kann bei den allgemeinen Verfahren der Erfindung, wie obenstehend bereits beschrieben, angewandt werden.
In einem dritten bevorzugten Aspekt stellt diese Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Population von terminalen Peptiden aus einer Population von Proteinen bereit, umfassend die folgenden Schritte:
1. das vollständige Aufschließen einer Population von Proteinen mit einem Lys-C- spezifischen Spaltenzym, d. h. einem Reagens, das an der Peptidbindung unmittelbar an einem Lysinrest auf der C-terminalen Seite dieses Rests schneidet.
2. das In-Kontakt-Bringen der resultierenden Peptide mit einem aktivierten festen Träger, der mit freien Aminogruppen reagiert.
3. das In-Kontakt-Bringen der eingefangenen Peptide mit einem Reagens, das an den Alpha-Aminogruppen jedes Peptids am Träger spaltet. Alle Peptide, die nicht C-terminal sind, haben einen Lysinrest, der sie kovalent an den festen Träger bindet. Somit werden freie C-terminale Peptide selektiv freigesetzt.
4. das Gewinnen der freigesetzten Peptide.
5. gegebenenfalls das In-Kontakt-Bringen des freigesetzten Peptids mit Reagenzien, um reaktive Seitenketten abzudecken.
6. gegebenenfalls das Umsetzen der terminalen Amingruppe der eingefangenen Peptide mit einem Massenspektrometrie-Sensibilisierungsreagens.
7. das Analysieren der Peptide durch Massenspektrometrie.
Irgendeiner der obenstehenden bevorzugten Schritte oder jegliche Kombination der obenstehenden bevorzugten Schritte kann bei den allgemeinen Verfahren der Erfindung, wie obenstehend bereits beschrieben, angewandt werden.
Damit nur jene Fragmente, die Lysinreste enthalten, über zwei Aminogruppen an den festen Träger gebunden bleiben (so dass alle Fragmente außer jenen, die Lysingruppen enthalten, während des Freisetzungsschritts vom festen Träger freigesetzt werden), werden die Fragmente vorzugsweise bei einem pH-Wert, bei dem die Seitenkette NH&sub2; von Lysin nicht protoniert ist, an der festen Phase angebracht. Somit wird dieser Schritt vorzugsweise bei einem pH-Wert von 11-11,5 ausgeführt.

Herstellung einer Population von C-terminalen Peptiden

Verwendung von C-termiralen Sequenzierreagenzien

Verschiedene bevorzugte Ausführungsformen der obenstehenden Aspekte dieser Erfindung werden untenstehend besprochen.
Im ersten Schritt des ersten und zweiten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung wird eine Population von Proteinen vorzugsweise nicht kovalent an einem Festphasenträger immobilisiert. Zitex (poröses Teflon von Norton Performance Plastics, Wayne, NJ)- Membrane können verwendet werden, um eine nicht kovalente Immobilisierung von Proteinen an einem Festphasenträger zu bewirken (Bailey et al., "Automated carboxyterminal sequence analysis of peptides and proteins using diphenyl phosphoroisothiocyanatidate", Protein Science 1: 1622-1633, 1992; Bailey et al., Anal. Biochem. 212: 366- 374, 1993). Polyvinylidendifluorid-Membrane (Millipore) können ebenfalls zur Immobilisierung von Proteinen eingesetzt werden.
Der Schritt 2 des ersten und zweiten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung umfasst die Abdeckung der reaktiven Seitenketten einer Population von Proteinen. Im Stand der Technik ist gut bekannt, dass die reaktiven Seitenkettenfunktionalitäten selektiv abgedeckt werden können. Reaktive Seitenketten umfassen Lysin, Serin, Threonin, Tyrosin und Cystein. Cystein wird oft mit sich selbst vernetzt, um Disulfidbrücken zu bilden. Für die Zwecke dieser Erfindung wird bevorzugt, dass diese Brücken zerbrochen werden. Dies kann durch die Reduktion der Disulfldbrücke zu einem Paar Thiole mit Mercaptethanol bewerkstelligt werden. Thiole können unter leicht basischen Bedingungen, welche die Bildung eines Thiolations fördern, durch Iodacetat (Aldrich) selektiv abgedeckt werden (Mol. Microbiol 5: 2293, 1991). Ein Carbonat wäre eine geeignete milde Base. Bei anderen Ausführungsformen kann die Population von Proteinen mit einer Isocyanatverbindung behandelt werden. Isocyanate reagieren beinahe ausschließlich mit der Alpha-Aminogruppe am N-Terminus der Proteine und mit allen Lysin-Epsilon-Aminogruppen, d. h. mit primären Aminen unter milden Bedingungen, d. h. bei Raumtemperatur in einem neutralen Lösungsmittel, um ein Harnstoffderivat zu ergeben. Diese Reagenzien können auch dazu gebracht werden, mit allen hydroxyltragenden Seitenketten, wie z. B. Serin-, Threonin- und Tyrosin-Seitenketten, zu reagieren, und zwar in Gegenwart eines geeigneten Katalysators, wie z. B. Pyridin, oder einer Zinnverbindung, wie z. B. Dibulylstanyllaurat, um ein Urethanderivat zu ergeben. Bei einer alternativen Ausführungsform kann die Population von Proteinen mit einer Silylverbindung, wie z. B. Trimethylchlorsilan (Sigma), behandelt werden. Diese Verbindungen reagieren leicht mit den meisten reaktiven funktionellen Gruppen. Aminderivate sind unter wässrigen Bedingungen nicht stabil und können somit, falls gewünscht, zum freien Amin zurückhydrolysiert werden. Die obenstehenden Beispiele sind zur Veranschaulichung von Verfahren zur Abdeckung reaktiver Seitenkettenfunktionalitäten vorgesehen und sind nicht zur Einschränkung des Umfangs der Ansprüche gedacht. Eine breite Vielfalt von Schutzgruppen ist im Stand der Technik bekannt, und es ist vorgesehen, dass ein großer Anteil davon zur Vervollständigung der Schritte dieser Erfindung eingesetzt werden könnte.
Im Schritt 3 des ersten und zweiten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung werden daraufhin die Carboxylseitenketten "aktiviert". Acetanhydrid wurde zu diesem Zweck weitgehend eingesetzt, was, gemischte Anhydride an Carboxylgruppen erzeugt. Bei manchen Ausführungsformen kann der Schritt 2 des ersten und zweiten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung mit dem Schritt 3 kombiniert werden. Eine Aktivierung von Seitenkettencarboxylen mit einer Anhydridverbindung führt auch zur Abdeckung von reaktiven Seitenketten, wie z. B. Lysin, Serin, Threonin und Tyrosin. Bei Ausführungsformen, wo die Schritte 2 und 3 kombiniert sind, wird bevorzugt, dass das gewählte Aktivierungsreagens als Abdeckmittel für die reaktiven Seitenketten stabil ist, da einige Anhydridderivate unter basischen oder sauren Bedingungen nicht stabil sind. Unter diesen Bedingungen ist Trimethylacetanhydrid beispielsweise durch sterische Wirkungen stabiler. Ein alternatives, bevorzugteres Aktivierungsreagens ist Woodwards Reagent K (N-Ethyl-5-phenylisoxazolium-3-sulfonat, erhältlich bei Sigma). Bei einer anderen bevorzugten Ausführungsform dieses Aspekts der Erfindung wird die Aktivierung durch Behandlung mit einem reaktiven Phosphat, wie z. B. Tetraphenylpyrophosphat (Aldrich) oder Diphenylphosphochloridat, erzielt. Gemäß dem US-Patent 5,665,603 kann der Aktivierungsschritt, der bei Peptidsequenzierverfahren erforderlich ist zur Herstellung eines Carboxylderivats am C- Terminus eines Peptids oder Polypeptids, das zwecks Bildung eines Thiohydantoins reagieren kann, wirksamer unter milderen Bedingungen bewerkstelligt werden, und zwar mit Acylphosphatverbindungen, wie z. B. Diphenylphosphochloridat oder Tetraphenylpyrophosphat (Aldrich). Das C-terminale Carboxyl wird in Gegenwart einer Base mit dem reaktiven Phosphat umgesetzt, um die Carboxylgruppe zu deprotonieren. Bevorzugte Basen sind Triethylamin, Diisopropylethylamin oder Pyridine, d. h. eine Base, die mit den resultierenden Acylphosphaten nicht reagiert. Die Phosphorylierungsreaktion zur Aktivierung des C-terminalen Carboxyls setzt vorzugsweise äquimolare Mengen eines reaktiven Phosphats und einer Base ein. Diese beiden Reagenzien werden einem Polypeptid in einem polaren, aprotischen Lösungsmittel, z. B. Acetonitril (ACN), Dimethylformamid oder einem Ether, vorzugsweise ACN, in großem Überschuss beigefügt. Die Reaktion ist typischerweise in 5 bis 10 Minuten und bei Raumtemperatur üblicherweise in weniger als 30 Minuten komplett. Die Temperatur kann schwanken: die Reaktionen werden bei 55ºC in einem automatischen Sequenzierer in Übereinstimmung mit anderen stattfindenden Reaktionen durchgeführt. Die C-terminalen aktivierten Derivate von Carboxylgruppen bilden spontan Ringe, um eine Oxazolonzwischenverbindung zu bilden, während die Seitenkettencarboxyle aktiviert bleiben.
Die aktivierten Seitenkettencarboxylderivate reagieren unter basischen Bedingungen offensichtlich mit Nucleophilen, während die C-terminale Oxazolongruppe viel weniger reaktiv hinsichtlich Nucleophilen ist (V. L. Boyd et al., Methods in Protein Structure Analysis: 109-118, Plenum Press, herausgegeben von M. Z. Atassi und E. Appella, 1995). Folglich wird im Schritt vier des ersten und zweiten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung die Proteinpopulation unter basischen Bedingungen mit einem Nucleophil in Kontakt gebracht. Ein bevorzugtes Nucleophil ist eine primäre Aminverbindung. Bei Verwendung von Aminnucleophilen können die Seitenketten amidiert werden. Bevorzugte Aminnucleophile sind Piperidin, Methylamin, Ethylamin oder ein anderes Amin, hinzugefügt mit einer geeigneten Base. Zur Durchführung der Amidierungsreaktion werden äquimolare Mengen einer Base und eines Nucleophils in einem polaren, aprotischen Lösungsmittel, vorzugsweise Acetonitril, beigefügt, wobei die Reagenzien gegenüber der Mischung von Proteinen in großem Überschuss vorliegen. Ammoniak bildet Asparagin aus aktivierten Asparaginsäureresten und Glutamin aus Glutaminsäureresten. Dies kann die Information bezüglich der Peptidmasse reduzieren, und Ammoniak mag kein bevorzugtes Nucleophil sein. Bei einer alternativen Ausführungsform kann ein Alkohol zur Veresterung der aktivierten Seitenkettencarboxylderivate unter sauren Bedingungen eingesetzt werden. Ein geeigneter Alkohol, z. B. Methanol, kann in einem passenden wasserfreien, sauren Lösungsmittel, z. B. TFA, beigefügt werden.
Im ersten bevorzugten Aspekt dieser Erfindung kann das Nucleophil als Thiocyanatsalz beigefügt werden. Das Oxazolon reagiert unter sauren Bedingungen mit Isothiocyanat, und somit wird nach einer anfänglichen Periode unter basischen Bedingungen zur Förderung einer Amidierung die Reaktion mit Trifluoressigsäure angesäuert, um die Bildung von C-terminalem Thiohydantoin zu fördern.
Im zweiten bevorzugten Aspekt dieser Erfindung kann das Aminnucleophil als Salz mit einer inerten Gruppe, z. B. einem Carbonat, beigefügt werden. Vorzugsweise wird ein flüchtiges Salz verwendet, um die Entfernung von unverbrauchten Reagenzien zu erleichtern. Auf diese Weise kann das Oxazolon am Reagieren gehindert werden, so dass das Oxazolon hydrolysiert werden kann, um am C-Terminus ein freies Carboxyl wiederzugewinnen. Bei einer weiteren Ausführungsform kann das Aminnucleophil als Salz mit einem Biotinylierungsmittel mit einer passenden Funktionalität für die Reaktion mit dem Oxazolon beigefügt werden.
Im ersten Aspekt dieser Erfindung, wobei das Nucleophil als Thiocyanatsalz beigefügt wird, wird die Reaktionsmischung danach mit einer geeigneten Säure, vorzugsweise TFA, angesäuert, welche die Reaktion der C-terminalen Oxazolongruppe mit Thiocyanat fördert, um ein. C-terminales Thiohydantoinderivat zu ergeben. Das C-terminale Thiohydantoin wird daraufhin von den derivatisierten Proteinen abgespalten, um das Carboxyl der vorletzten Aminosäure in jedem Protein freizulegen. Die Spaltung des Thiohydantoins vom C-Terminus kann durch eine Reihe von Verfahren einschließlich der Hydrolyse durch eine Säure oder Base bewerkstelligt werden. Noch bevorzugter wird die Spaltung durch ein Reagens, wie z. B. Natriumtrimethylsilanolat, in einem alkoholischen Lösungsmittel bewerkstelligt (J. M. Bailey et al., Protein Science 1: 68-80, 1992).
Im Schritt 7 des ersten und zweiten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung kann das freigelegte Endcarboxyl danach mit einem geeigneten Reagens umgesetzt werden, um das Festphasen-Einfangen von Proteinen durch den C-Terminus zu erlauben. Ein Reagens, wie z. B. Biotinamidocaproylhydrazid, ist mit freien Carbonsäuren reaktiv. Ein Reagens, wie z. B. 5-(Biotimamido)pentylamin, kann eingesetzt werden, wobei ein Einfangen durch Avidin erlaubt wird. Vor der Reaktion mit diesem Biotinylierungsreagens müssen freie Carboxytermini aktiviert werden. Eine Vielfalt von Aktivierungsmitteln kann verwendet werden, diese sollten vorzugsweise jedoch nicht die Bildung eines Oxazolons fördern. Eine Anhydridverbindung, die sterisch gehemmt ist, könnte geeignet sein. Bei einer alternativen Ausführungsform kann das aktivierte Endcarboxyl mit einem Festphasenträger umgesetzt werden, der mit einer geeigneten Gruppe funktionalisiert ist, um mit dem aktivierten Carboxyl zu reagieren. Eine freie Amingruppe wäre geeignet. Um eine selektive Freisetzung zu gestatten, sollte die reaktive Carboxylfunktionalität durch einen spaltbaren Linker mit dem Träger verbunden sein. Eine Vielfalt von spaltbaren Linkem ist im Stand der Technik bekannt. Photospaltbare Linker sind im Stand der Technik wohlbekannt (Lloyd-Williams et al., Tetrahedron 49: 11065-11133, 1993). Es gibt auch zahlreiche chemisch spaltbare Linker, z. B. können Thioester durch Hydroxylamin gespalten werden.
Im Schritt 8 des ersten und zweiten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung werden die C-terminal modifizierten Proteine daraufhin mit einem sequenzspezifischen Spaltmittel behandelt. Bevorzugte Spaltmittel sind chemische Reagenzien, die flüchtig sind, wobei sie die leichte Entfernung eines nicht umgesetzten Reagens erlauben. Geeignete chemische Spaltreagenzien umfassen Cyanbromid, das an Methioninresten spaltet, und BNPS-Skatol, das an Tryptophanresten spaltet (D. L. Crimmins et al., Anal. Biochem. 187: 27-38, 1990). Bei anderen Ausführungsformen können sequenzspezifische Endoproteinasen, wie z. B. Trypsin, Chymotrypsin, Thrombin oder andere Enzyme, eingesetzt werden.
Im Schritt 9 des ersten und zweiten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung werden die terminal modifizierten Peptide auf einem Festphasenträger eingefangen. Bei Ausführungsformen, wo das Endcarboxyl biotinyliert ist, können die C-terminalen Peptide daraufhin auf einem mit Streptavidin derivatisierten Festphasenträger eingefangen werden. Die nicht terminalen Peptide können danach fortgewaschen werden.
Im Schritt 10 des ersten und zweiten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung werden die eingefangenen C-terminalen Peptide gegebenenfalls mit einem Massenspektrometrie- Sensibilisierungsreagens umgesetzt. Die Ionendetektoren eines Massenspektrometers sind extrem empfindlich und können das Eintreffen einzelner Ionen detektieren. Somit ist die Ionendetektion nicht der einschränkende Faktor, welcher die Empfindlichkeit eines Massenspektrometers bestimmt. Im Allgemeinen ist der am meisten einschränkende Faktor die Ionisierung des Analyts. In einer typischen Elektrospray-Quelle oder FAB-Quelle ionisiert in der Tat nur eines von eintausend Molekülen eines Analyts und wird detektiert. Zum Zweck der Verbesserung dieses Verfahrens ist es wünschenswert, eine Sensibilisierungsverbindung in die Peptide einzuführen, und zwar für eine Detektion, die das Peptid vorionisiert. Bevorzugte Verbindungen umfassen quartäre Ammoniumionen oder Metallion-Chelatbildner. Eine beispielhafte Verbindung körnte 4-(3-Pyridylmethylaminocarboxypropyl)phenylisocyanat sein (E. J. Bures et al., "Synthesis and evaluation of a panel of novel reagents for stepwise degradation of polypeptides", Methods in Protein Structure Analysis, Plenum Press, New York, 1995, offenbaren die Verwendung der Isothiocyanatform dieser Verbindung als Massenspektrometrie-Sensibilisator). Die Einführung einer Sensibilisierungsgruppe verbessert nicht nur die Empfindlichkeit, sondern verringert auch das Risiko einer Konkurrenz für die Ionisierung durch Analytmoleküle. Dies bedeutet, dass alle Peptide im Massenspektrum gleichmäßiger repräsentiert sein sollten.
Im Schritt 11 des ersten und zweiten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung werden die eingefangenen C-terminalen Peptide daraufhin aus dem Festphasenträger freigesetzt. Bei Ausführungsformen, wo das Endcarboxyl biotinyliert ist, können die Avidin-eingefangenen Peptide durch Behandlung mit Säure freigesetzt werden. Vorzugsweise wird TFA eingesetzt, um die Rückgewinnung der freigesetzten Peptide zu erleichtern, da diese flüchtig ist und leicht abgedampft werden kann, um die Rückgewinnung der Peptide zu gestatten.
Im Schritt 12 des ersten und zweiten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung werden die freigesetzten Peptide zurückgewonnen. Im Schritt 13 des dritten und vierten Aspekts dieser Erfindung werden die Peptide mittels Massenspektrometrie analysiert. Bei einer Ausführungsform sind die Peptide auf einem geeigneten Träger in einer MALDI-Matrix, wie z. B. Zimtsäure, eingebettet und werden durch eine MALDI-Massenspektrometrie analysiert, um für die Population von C-terminalen Peptiden einen Peptidmassen-Fingerabdruck zu bestimmen. MALDI ist eine bevorzugte Analysetechnik, da diese Ionisierungstechnik die Bildung von [M + H]+-Ionen bevorzugt. Somit gibt es im Massenspektrum für jedes Peptid üblicherweise nur einen Hauptpeak.
Bei einer weiteren Ausführungsform können die zurückgewonnenen Peptide in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst werden und können durch ein Sprüh-Einlasssystem, wie z. B. eine Elektrospray-Ionisierungsmassenspektrometrie, analysiert werden. Gleichermaßen können ein schneller Atombeschuss (FAB) und damit in Verbindung stehende Schnittstellen eingesetzt werden. Dies kann eine In-line-Flüssig-Chromatographietrennung von Peptiden vor der Analyse durch Massenspektrometrie umfassen. Eine Kapillarelektrophorese kann angewandt werden, oder HPLC oder eine isoelektrische Kapillarfocussierung. Der dynamische FAB ist ein besonders bevorzugtes Verfahren, da dieses Ionisierungsverfahren die Erzeugung von Ionen in jener Form fördert, in welcher sie in der Matrix, die zu ihrer Einführung in den Massenspektrometer verwendet wird, existieren. Dies bedeutet, dass die im Massenspektrum vorhandenen Ionen die gleichen sein sollten wie in Lösung, wenn eine flüssige Matrix verwendet wird. Da bei der vorliegenden Erfindung reaktive Seitenketten abgedeckt werden können und ein Massenspektrometrie-Sensibilisierungsmittel in die zu analysierenden Peptide eingeführt werden kann, ist es möglich sicherzustellen, dass alle Peptide nur eine einzige Ladung in Lösung haben, die als einzelner Massenpeak im endgültigen Massenspektrum einer Peptidpopulation dargestellt ist. Tandern-Massenspektrometer können an eine Sprüh-Schnittstelle oder eine FAB-Schnittstelle gekoppelt werden. Die Tandern-Massenspektrometrie erlaubt die Bestimmung von Sequenzinformationen für ein Peptid und erlaubt die Identifizierung von kovalenten Modifikationen des Proteins.

Die Verwendung von DITC-Glas

Verschiedene Ausführungsformen des dritten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung werden hierin besprochen.
Im Schritt 1 des dritten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung wird eine Population von Proteinen mit einem Lys-C-spezifischen Spaltenzym, z. B. Endoproteinase Lys-C von Lysobacter-Enzymogenen (Boehringer Mannheim), vollständig aufgeschlossen.
Im Schritt 2 des dritten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung werden die resultierenden Peptide mit einem festen Träger in Kontakt gebracht, der mit Amin reagiert. Bei einer Ausführungsform wird die Peptidpopulation in Gegenwart einer Base mit einem Isothiocyanat-Glas (DITC-Glas, Sigma) umgesetzt. Dieses fängt durch jegliche freien Aminogruppen alle Peptide am Träger ein.
Im Schritt 3 des dritten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung werden die eingefangenen Peptide mit einem Reagens in Kontakt gebracht, das an den Alpha- Aminogruppen jedes Peptids am Träger spaltet. Bei Ausführungsformen, wo DITC-Glas verwendet wird, werden die Peptide mit einer geeigneten flüchtigen Säure (TFA) behandelt, welche die N-terminale Aminosäure von jedem Peptid am Träger abspaltet. Alle Peptide, die nicht C-terminal sind, haben einen Lysinrest, der sie kovalent an den festen Träger bindet. Somit werden freie C-terminale Peptide selektiv freigesetzt.
Im Schritt 4 des dritten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung können die freigesetzten Peptide aus der TFA zurückgewonnen werden, indem das zur Abspaltung der Peptide vom Träger eingesetzte TFA-Lösungsmittel abgedampft wird.
Im Schritt S des dritten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung können die freigesetzten Peptide zwecks Abdeckung reaktiver Seitenketten mit Reagenzien in Kontakt gebracht werden. Geeignete Reagenzien schließen die obenstehend Besprochenen ein.
im Schritt 6 des dritten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung werden die Peptide gegebenenfalls mit einem Massenspektrometrie-Sensibilisierungsreagens umgesetzt. Siehe obenstehende Besprechung betreffend Schritt 10 des ersten und zweiten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung.
Im Schritt 7 des dritten bevorzugten Aspekts dieser Erfindung werden die Peptide durch Massenspektrometrie analysiert. Bei einer Ausführungsform sind die terminalen Peptide in einer MALDI-Matrix, wie z. B. Zimtsäure, eingebettet und werden durch eine MALDI-Massenspektrometrie analysiert, um für die Population von C-terminalen Peptiden einen Peptidmassen-Fingerabdruck zu bestimmen.
Wie in den anderen bevorzugten Aspekten dieser Erfindung können alternative Verfahren zur Analyse vor. Peptiden durch Massenspektrometrie angewandt werden. Bei alternativen Ausführungsformen können die zurückgewonnenen Peptide somit in einem geeigneten Lösungsmittel aufgelöst werden und können durch ein Sprüh-Einlasssystem, wie z. B. eine Elektrospray-Ionisierungsmassenspektrometrie, analysiert werden. Gleichermaßen können ein schneller Atombeschuss und damit in Verbindung stehende Schnittstellen eingesetzt werden. Dies kann auch eine In-line-Flüssig-Chromatographietrennung vor der Massenspektrometrie umfassen. Tandern-Massenspektrometer können an eine Sprüh- Schnittstelle oder eine FAB-Schnittstelle gekoppelt werden. Die Tandern- Massenspektrometrie erlaubt die Bestimmung von Sequenzinformationen für ein Peptid und erlaubt die Identifizierung von kovalenten Modifikationen des Proteins.

Beispiele

Eine Reihe von kurzen Computerprogrammen (geschrieben in PERL) wurde zur Analyse der SWISSPROT-Public-Domain-Datenbank von Proteinsequenzen eingesetzt, um für einen bestimmten Organismus zu bestimmen, welcher Anteil von Proteinen allein auf Basis ihrer terminalen Peptidmassen eindeutig identifiziert werden konnte. Proteine wurden aus der SWISSPROT-Datenbank, Release 35, genommen. Mit Daten vom H. influenzae- Genom wurden Analysen ausgeführt. Das Genom dieses Organismus wurde vollständig sequenziert, und beinahe alle vorhergesagten offenen Leseraster wurden identifiziert. In dieser Datenbankfreigabe waren 1882 H. influenzae-Proteine vorhanden. Profile mit einer Spaltung bei Methionin durch Cyanbromid und einer Spaltung bei Tryptophan wurden getestet. Es wurde angenommen, dass die terminale Aminosäure durch die profilierende Chemie nicht gespalten wird.
Bei allen Beispielen wurde angenommen, dass der Massenspektrometer eine Massenauflösung von 5000 hat. Dies bedeutet, dass das Instrument einen Massenunterschied von 1 Teil in 5000 auflösen kann, oder in anderen Worten, ein Molekül mit einer Masse von 5000 Dalton von einem Molekül mit einer Masse von 4999 Dalton unterschieden werden kann. Es wird auch angenommen, dass jedes Peptid nur einen einzigen molekularen Ionenpeak hervorruft.

Beispiel 1- Spaltung mit Lys-C und SCH

Bei diesem Beispiel werden die 1882 H. influenzae-Proteine mit der Endoproteinase Lys-C gespalten, welche Proteine an der C-terminalen Seite eines Lysinrests schneidet. Die Peptide werden daraufhin mit einem Festphasenträger umgesetzt, der mit Phenylisothiocyanatanteilen derivatisiert ist, welche leicht mit primären Aminen reagieren, die an den Spaltstellen erzeugt wurden und an Lysin-Seitenketten vorhanden sind, wie obenstehend beschrieben. Alle Peptide haben zumindest 1 Lysinrest, mit Ausnahme des C- terminalen Peptids, welches keinen besitzt. Alle Peptide werden durch ihre N-terminalen primären Amine am festen Träger eingefangen. Alle nicht C-terminalen Peptide werden ebenso durch ihre Lysinseitenketten eingefangen. Phenylisocyanat kann zur Spaltung des N- terminalen Rests aller Peptide gebracht werden. Alle Lysinrest-tragenden Peptide bleiben an den Träger gebunden, da Isothiocyanatderivate diese nicht spalten können. Somit werden C- terminale Peptide aus dem Festphasenträger freigesetzt. Die C-terminalen Peptide können daraufhin isoliert werden. Sie können, falls aus den obenstehend besprochenen Gründen gewünscht, weiter modifiziert werden. Nach der Isolierung der C-terminalen Peptide und irgendwelchen zusätzlichen Seitenkettenmodifikationen können die Peptide durch Massenspektrometrie analysiert werden.
Es wird angenommen, dass keinerlei anderen Seitenketten abgedeckt und die nicht modifizierten Peptide direkt analysiert werden.

Ergebnisse

1882 Proteindatensätze analysiert.
7 Proteine hatten fit das verwendete Reagens keine Spaltstelle.
870 Peptidmasse(n), von 1 Protein(en) geteilt
155 Peptidmasse(n), von 2 Protein(en) geteilt
43 Peptidmasse(n), von 3 Protein(en) geteilt
19 Peptidmasse(n), von 4 Protein(en) geteilt
6 Peptidmasse(n), von 5 Protein(en) geteilt
9 Peptidmasse(n), von 6 Protein(en) geteilt
2 Peptidmasse(n), von 7 Protein(en) geteilt
3 Peptidmasse(n), von 8 Protein(en) geteilt
1 Peptidmasse(n), von 9 Protein(en) geteilt
1 Peptidmasse(n), von 10 Protein(en) geteilt
2 Peptidmasse(n), von 11 Protein(en) geteilt
2 Peptidmasse(n), von 12 Protein(en) geteilt
1 Peptidmasse(n), von 13 Protein(en) geteilt
1 Peptidmasse(n), von 17 Protein(en) geteilt
1 Peptidmasse(n), von 19 Protein(en) geteilt
1 Peptidmasse(n), von 23 Protein(en) geteilt
1 Peptidmasse(n), von 33 Protein(en) geteilt
1 Peptidmasse(n), von 205 Protein(en) geteilt
Dieser Peptidmassen-Fingerabdruck identifiziert eindeutig 46,2% der Proteine allein auf Basis ihrer terminalen Peptidmasse.

Beispiel 2 - Abdeckung von Hydroxylseitenketten

Bei diesem Beispiel werden die reaktiven, hydroxyltragenden Seitenketten von Serin, Threonin und Tyrosin mit einer Silyl-Schutzgruppe abgedeckt, die an diesen Seitenketten beispielsweise Trimethylsilylderivate erzeugt. Die Seitenketten-Carboxylgruppen werden mit einen geeigneten Reagens, wie z. B. Tetraphenylpyrophosphat, aktiviert und werden danach durch eine Reaktion mit Piperidin in Piperidinamide umgewandelt, und zwar in Gegenwart einer Base, wie obenstehend beschrieben.

Ergebnisse

1882 Proteindatensätze analysiert.
7 Proteine hatten für das verwendete Reagens keine Spaltstelle.
937 Peptidmasse(n), von 1 Protein(en) geteilt
149 Peptidmasse(n), von 2 Protein(en) geteilt
34 Peptidmasse(n), von 3 Protein(en) geteilt
17 Peptidmasse(n), von 4 Protein(en) geteilt
6 Peptidmasse(n), von 5 Protein(en) geteilt
8 Peptidmasse(n), von 6 Protein(en) geteilt
2 Peptidmasse(n), von 7 Protein(en) geteilt
4 Peptidmasse(n), von 8 Protein(en) geteilt
2 Peptidmasse(n), von 10 Protein(en) geteilt
1 Peptidmasse(n), von 11 Protein(en) geteilt
1 Peptidmasse(n), von 12 Protein(en) geteilt
1 Peptidmasse(n), von 13 Protein(en) geteilt
1 Peptidmasse(n), von 17 Protein(en) geteilt
1 Peptidmasse(n), von 19 Protein(en) geteilt
1 Peptidmasse(n), von 23 Protein(en) geteilt
1 Peptidmasse(n), von 33 Protein(en) geteilt
1 Peptidmasse(n), von 205 Protein(en) geteilt
Dieser Peptidmassen-Fingerabdruck identifiziert eindeutig 49,8% der Proteine allein auf Basis ihrer terminalen Peptidmasse.

Beispiel 3 - C-terminales Einfangen und Spalten mit Cyanbromid

Bei diesem Beispiel werden die 1882 H. influenzae-proteine nicht kovalent auf einem Festphasenträger immobilisiert. Die Proteine werden mit Trifluoracetanhydrid behandelt. Dieses Reagens deckt die reaktiven Seitenketten von Lysin, Serin, Threonin und Tyrosin ab, um Trifluoracetylderivate zu ergeben. Dieses Reagens aktiviert auch Seitenketten- und terminale Carboxylgruppen. Die C-terminalen aktivierten Carboxyle bilden spontan ein Oxazolon. Das nicht umgesetzte Trifluoracetanhydrid wird fortgewaschen. Die aktivierten Seitenketten werden daraufhin mit Piperidin umgesetzt, und zwar in Gegenwart einer nicht wässrigen Base, die an den aktivierten Seitenkettencarboxylen Piperidinamide erzeugt. Das C-terminale Oxazolon wird danach zum ursprünglichen freien Carboxyl zurückhydrolysiert, das daraufhin modifiziert wird, um das Einfangen auf einem Festphasenträger zu gestalten, z. B. durch Biotinylierung. Die modifizierten Proteine werden daraufhin mit Cyanbromid gespalten, welches an Methioninresten spaltet. Die resultierenden Peptide werden in einem inerten Lösungsmittel gewaschen und aus dem Festphasenträger, an dem die Chemie durchgeführt wird, freigesetzt. Die C-terminalen Peptide werden selektiv biotinyliert, wodurch ihnen erlaubt wird, auf einem avidinierten Träger eingefangen zu werden. Dies ermöglicht das Fortwaschen nicht terminaler Peptide. Die C-terminalen Peptide werden daraufhin aus dem festen Träger freigesetzt und durch Massenspektrometrie analysiert.

Ergebnisse

1882 Proteindatensätze analysiert.
18 Proteine hatten für das verwendete Reagens keine Spaltstelle.
1461 Peptidmasse(n), von 1 Protein(en) geteilt
157 Peptidmasse(n), von 2 Protein(en) geteilt
21 Peptidmasse(n), von 3 Protein(en) geteilt
4 Peptidmasse(n), von 4 Protein(en) geteilt
2 Peptidmasse(n), von 5 Protein(en) geteilt
3 Peptidmasse(n), von 6 Protein(en) geteilt
Dieser Peptidmassen-Fingerabdruck identifiziert eindeutig 77,6% der Proteine allein auf Basis ihrer terminalen Peptidmasse.

Beispiel 4 - C-terminales Einfangen und Spalten mit BNPS-Skatol

Bei diesem Beispiel werden die 1882 H. influenzae-Proteine wie im Beispiel 3 behandelt, abgesehen davon, dass nach der Modifikation des C-terminalen Carboxyls zum Erlauben eines Einfangens auf einem Festphasenträger die Proteine mit BNPS-Skatol (3- Brom-3-methyl-2-(o-nitrophenylsulphenyl)indolenin) gespalten werden, welches eher als Cyanbromid Proteine an Tryptophanresten chemisch spaltet. Die resultierenden Peptide werden daraufhin aus ihrem Festphasenträger desorbiert und mit einem avidinierten Träger inkubiert. Dies ermöglicht das Fortwaschen nicht terminaler Peptide. Die C-terminalen Peptide werden daraufhin aus dem festen Träger freigesetzt und durch Massenspektrometrie analysiert. Daher sind bei diesem Beispiel die reaktiven Seitenketten von Lysin, Serin, Threonin und Tyrosin wieder Trifluoracetylderivate und sind die Seitenkettencarboxyle Piperidinamidderivate.

Ergebnisse

1882 Proteindatensätze analysiert.
361 Proteine hatten für das verwendete Reagens keine Spaltstelle.
1484 Peptidmasse(n), von 1 Protein(en) geteilt
163 Peptidmasse(n), von 2. Protein(en) geteilt
15 Peptidmasse(n), von 3 Protein(en) geteilt
5 Peptidmasse(n), von 4 Protein(en) geteilt
1 Peptidmasse(n), von 7 Protein(en) geteilt
Dieser Peptidmasen-Fingerabdruck identifiziert eindeutig 78,9% der Proteine allein auf Basis ihrer terminalen Peptidmasse.

Beispiel 5 - Kombination zweier Profile

Die Liste der einzigartigen Proteine, die in Beispiel 3 unter Verwendung von Spaltungs-Cyanbromid und in Beispiel 4 unter Anwendung einer Spaltung durch BNPS- Skatol hergestellt wurden, wurde kombiniert, um die Summe von Proteinen, die allein auf Basis ihrer Masse eindeutig identifiziert wurden, zwischen den beiden Profilen zu bestimmen.
1774 Proteine werden zwischen den beiden Profilen eindeutig aufgelöst. Dies läuft auf eine eindeutige Auflösung von 94,3% der H. influenzae-Proteine in der SWISSPROT- Datenbank hinaus, und zwar allein auf Basis der terminalen Peptidmassen. Dies ist eine 19,5%ige Verbesserung der Auflösung gegenüber dem besseren individuellen Profil.

Claims

1. Verfahren zur Charakterisierung einer Population von Polypeptiden, welches Verfahren Folgendes umfasst:

(a) das In-Kontakt-Bringen einer Polypeptide umfassenden Probe mit einem ersten Spaltmittel zwecks Herstellung von Polypeptidfragmenten;

(b) das Isolieren eines oder mehrerer Polypeptidfragmente, wobei jedes Fragment den N- Terminus oder C-Terminus des Polypeptids, aus dem es herausgebrochen wurde, umfasst;

(c) das Identifizieren der isolierten Fragmente durch Massenspektrometrie;

(d) das Wiederholen der Schritte (a)-(c) an der Probe unter Verwendung eines zweiten Spaltmittels, das an einer anderen Stelle als das erste Spaltmittel spaltet; und

(e) das Charakterisieren der Polypeptide in der Probe aus den in den Schritten (c) und (d) identifizierten Fragmenten.

2. Verfahren gemäß Anspruch 1, wobei der Schritt (d) das zwei- oder mehrmalige Wiederholen der Schritte (a)-(c) umfasst, wobei jedes Mal ein weiteres Spaltmittel, das an einer anderen Stelle als die vorhergehenden Spaltmittel spaltet, verwendet wird.

3. Verfahren gemäß Anspruch 1 oder Anspruch 2, umfassend einen weiteren Abdeckschritt vor Schritt (a), welcher Abdeckschritt das Umsetzen der Polypeptide in der Probe mit einem oder mehreren Abdeckmitteln umfasst, und zwar zwecks Einführung von Abdeckgruppen an einer oder mehreren reaktiven Seitenketten der Polypeptide.

4. Verfahren gemäß Anspruch 3, wobei der Abdeckschritt und die Schritte (a)-(c) ein-, zweimal oder mehrere Male wiederholt werden, wobei jedes Mal Abdeckgruppen an denselben Seitenketten wie in den vorhergehenden Abdeckschritten eingeführt werden, dabei jedoch Abdeckgruppen verwendet werden, die eine andere Masse haben als die in den vorhergehenden Abdeckschritten verwendeten, entsprechenden Abdeckgruppen.

5. Verfahren zur Charakterisierung eines Polypeptids, der einer Population von Polypeptiden, welches Verfahren Folgendes umfasst:

(f) das In-Kontakt-Bringen einer ein oder mehrere Polypeptide umfassenden Probe mit einem ersten Abdeckmittel in einem ersten Abdeckschritt zwecks Einführung von Abdeckgruppen an einer oder mehreren reaktiven Seitenketten der Polypeptide;

(g) das In-Kontakt-Bringen der Probe mit einem Spaltmittel zwecks Herstellung von Polypeptidfragmenten;

(h) das Isolieren eines oder mehrerer Polypeptidfragmente, wobei jedes Fragment den N- Terminus oder C-Terminus des Polypeptids, aus dem es herausgebrochen wurde, umfasst;

(j) das Identifizieren der isolierten Fragmente durch Massenspektrometrie;

(k) das Wiederholen der Schritte (f)-(j) an der Probe unter Verwendung eines zweiten Abdeckmittels, das an denselben Seitenketten wie im ersten Abdeckschritt Abdeckgruppen einführt, jedoch Abdeckgruppen verwendet, die eine andere Masse haben als die im ersten Abdeckschritt verwendeten Abdeckgruppen; und

(l) das Charakterisieren des einen oder der mehreren Polypeptide in der Probe aus den in den Schritten (j) und (k) identifizierten Fragmenten.

6. Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Schritte (f)-(j) zweimal oder mehrere Male wiederholt werden, wobei jedes Mal an denselben Seitenketten wie in den vorhergehenden Abdeckschritten Abdeckgruppen eingeführt werden, dabei jedoch Abdeckgruppen verwendet werden, die eine andere Masse haben als die in den vorhergehenden Abdeckschritten verwendeten, entsprechenden Abdeckgruppen.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder Anspruch 6, wobei der Schritt (k) das ein-, zwei- oder mehrmalige Wiederholen der Schritte (f)-(j) umfasst, wobei jedes Mal ein weiteres Spaltmittel, das an einer anderen Stelle als die vorhergehenden Spaltmittel spaltet, verwendet wird.

8. Verfahren nach einem der Ansprüche 3-7, wobei die abzudeckenden Seitenketten eines oder mehr des Folgenden umfassen:

die NH&sub2;-Seitenkette in Arginin;

die NH&sub2;-Seitenkette in Asparagin;

die NH&sub2;-Seitenkette in Glutamin;

die NH&sub2;-Seitenkette in Lysin;

die COOH-Seitenkette in Asparaginsäure;

die COOH-Seitenkette in Glutaminsäure;

die OH-Seitenkette in Serin;

die OH-Seitenkette in Threonin;

die OH-Seitenkette in Thyroxin;

die OH-Seitenkette in Tyrosin; und

die SH-Seitenkette in Cystein.

9. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Fragmente durch Einfangen auf einer festen Phase, wie z. B. einem DITC-Glas oder Polystyrolisothiocyanat, isoliert werden.

10. Verfahren nach Anspruch 9, wobei das Einfangen dass kovalente Binden der Fragmente an die feste Phase umfasst.

11. Verfahren nach Anspruch 10, wobei die Fragmente durch ihre N-Termini an die feste Phase gebunden werden.

12. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei jedes isolierte Fragment den C-Terminus des Polypeptids, aus dem es herausgebrochen wurde, umfasst.

13. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei das eingesetzte Spaltmittel eine Endopeptidase oder ein chemisches Spaltmittel umfasst.

14. Verfahren nach Anspruch 13, wobei das eingesetzte Spaltmittel Lys-C- Endopeptidase, eine Thiocyanatverbindung, Cyanbromid, BNPS-Skatol, Trypsin, Chymotrypsin und/oder Thrombin umfasst.

15. Verfahren nach einem der Ansprüche 3-14, wobei das Abdeckmittel eines oder mehr von einer Iodacetatverbindung, einer Isocyanatverbindung, einer Silylverbindung, einem Anhydrid, einer Vinylsulfonverbindung und einem Vinylpyridinderivat umfasst.

16. Verfahren zur Bestimmung der Expression eines oder mehrerer Proteine in einem Gewebe, welches Verfahren die Charakterisierung einer Population von Polypeptiden gemäß einem Verfahren umfasst, das in einem der vorhergehenden Ansprüche definiert ist.

17. Verfahren zur Analyse eines oder mehrerer spezifischer Polypeptide in einer Probe, welches Verfahren die Charakterisierung einer Population von Polypeptiden gemäß einem Verfahren, das in einem der Ansprüche 1-15 definiert ist, umfasst, sowie die Bestimmung des Vorhandenseins oder Fehlens des einen oder der mehreren spezifischen Polypeptide aus dem Vorhandensein oder Fehlen eines oder mehrerer spezifischer Fragmente, die mit den Polypeptiden übereinstimmen.

18. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, wobei die Massenspektrometrie eine MALDI-Massenspektrometrie umfasst.