DE3590080T - 1α-Hydroxyvitamin D↓2↓-Analogverbindungen und Verfahren zu deren Herstellung - Google Patents
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Description
| 3 590080 | -1"- | PATENTANWÄLTE |
| I | Dr. rer. nat. DIETER LOUIS | |
| Pipl.-Phys. CLAUS PÖHLAU | ||
| ΓίΙρΙ.-lng. FRANZ LOHRENTZ | ||
| yipl.-Phys.WOLFGANG SEGETH | ||
| KESSLERPLATZ 1 | ||
| 8500 NÜRNBERG 20 |
Wisconsin Alumni Research Foundation North Walnut Street 614
Madison, Wisconsin 53705 / USA
Madison, Wisconsin 53705 / USA
1a-Hydroxyvitamin D„-Analogverbindungen
und Verfahren zu deren Herstellung
Die Erfindung wurde mit der Hilfe der Regierung unter Ge-Währung der Förderung NIH Nr. AM 14881 seitens des Ministeriums
für Gesundheit und Humandienste durchgeführt. Die Regierung besitzt bestimmte Rechte an dieser Erfindung.
Die Erfindung betrifft biologisch aktive Vitamin D-Verbindüngen.
Insbesondere betrifft die Verbindung 1a-Hydroxyvitamin
D -Analogverbindungen, welche unerwartete biologische Eigenschaften aufweisen.
Aufgrund der gut bekannten und deutlich festgelegten Wirksamkeit von 1a-Hydroxyvitamin D-Verbindungen bei der
Calcium- und Phosphathomöostase bei Tieren oder Menschen bestand* ein Interesse an der Herstellung der natürlichen
Metaboliten und an der Entdeckung von Analogverbindungen
mit geeigneten biologischen Eigenschaften. Dies hat zur Herstellung einer Vielzahl von Verbindungen geführt, die
biologische Aktivität aufweisen (beispielsweise vgl.
DeLuca et al., Topics in Current Chem., Band ίϊ3_, Seite 1
(1979)·, Ann. Rev. Biochem. 5_2, 411 (1983)>
Yakhimovich, Russian Chem. Rev. _4_9, 371 (1980)). Das Interesse an der-
artigen Verbindungen besteht weiterhin, insbesondere deswegen, weil erkannt wurde, daß zusätzlich zu ihrer klassischen
Funktion als Regulatoren der Calcium-Homöostase bestimmte
Vitamin D-Derivate, insbesondere 1ot,25-Dihydroxyvitamin
D, und 1 a-Hydroxyvitamin D-. ebenso Zell-Differenzierungsprozesse
beeinflussen und in der Lage sind, das Wachstum und die Verbreitung bestimmter Leukämiezellen
zu inhibieren [Suda et al., US-PS 4 391 802; Suda et al., Proc. Natl. Acad. USA 8£, 201 (1983); Reitsma et al.,
Nature, 3£6, 492-494 ' (1983)].
Die meisten der bekannten Vitamin D-Metaboliten und -Analogverbindungen
sind Derivate der Vitamin D_-Serie, d.h. sie besitzen gesättigte Steroid-Seitenketten. In der Seitenkette
ungesättigte Vitamin D-Verbindungen sind jedoch ebenfalls bekannt, nämlich bestimmte Hydroxyderivate von
Vitamin D~ , wie 25-Hydroxyvitamin D~ (US-Patentschrift
3 585 221), 1ct,25-Dihydroxyvitamin D2 (US-Patentschrift
3 880 894), die 24-Hydroxy- und 24,25-Dihydroxyvitamin D--Metaboliten
(Jones et al., Arch. Biochem. Biophys. 20 2, 450 (1980)), 1a-Hydroxyvitamin D2 (US-Patentschrift
3 907 843) , wie auch bestimmte verwandte 22-trans-Dehydro-Verbindungen,
welchen der 24-Methylsubstituent fehlt, wie sie beschrieben sind in der US-Patentschrift 3 786 062
und von Bogoslovskii et al., (J. Gen. Chem. USSR 48(4), 828 (1978); Chem. Abstr. £9, 163848J, 8j)/ 209016s).
Es sind nun neue Vitamin D-Analogverbindungen hergestellt worden, welche durch die Struktur
charakterisiert sind, worin R ein Wasserstoffatom oder
eine Hydroxylgruppe bedeutet. Die erfindungsgemäße Verbindung, worin R ein Wasserstoffatom darstellt, kann als eine
Zwischenverbindungen bei der Herstellung der Verbindung
erhalten werden, in der R eine Hydroxylgruppe ist.
Strukturmäßig sind die erfindungsgemäßen Verbindungen Analogverbindungen
der Hydroxyvitamin D2-Verbindungen, denen
der 24-Methylsubstituent fehlt, d.h. die Verbindungen
sind 1a-Hydroxy-28-norvitamin D2 bzw. 1a,25-Dihydroxy-28-norvitamin
D_.
Sowohl das Produkt als auch die Zwischenverbindung zeigen eine starke biologische Aktivität und sind durch ein unerwartetes
und neues Muster an Aktivität, wie es näher weiter unten beschrieben wird, charakterisiert.
Eine Ausführungsform des chemischen Verfahrens, welches
zu den oben angegebenen Verbindungen führt, ist in dem Verfahrensschema
I aufgezeichnet. In der folgenden Beschreibung dieses Verfahrens und in den Beispielen und Tabellen
beziehen sich die durch arabische Zahlen angegebenen Verbindungsbezeichnungen (z.B. (Y), (2), (3), ... (JH)), (11),
(jl_2) ) auf die so numerierten Strukturen in dem Verfahrensschema.
Das Ausgangsmaterial ist der Dien-geschützte Aldehyd der Struktur (Y) (vgl. Verfahrensschema I), der aus dem Ergosterolacetat
nach dem Verfahren von Barton et al., (J.Chem. Soc. (C) 1968 (1971)) hergestellt worden ist. Die Umsetzung
des Aldehyds (JU mit 3-Methyl-1-butylphenylsulfon der nachstehend
angegebenen Struktur
in einem organischen Lösungsmittel und in Gegenwart einer starken organischen Base ergibt die Hydroxysulfon-Zwischen
verbindung der Struktur (2), wie sie in dem Verfahrensschema
I dargestellt ist. Die Behandlung der Zwischenverbindung {2} mit Natriumamalgam in gepufferter Alkohollösung liefert dann das 22,23-trans-Ölefin (22E-Olefin) der
Struktur (3).
Die Umsetzung des 22E-Olefins O) mit einem starken Hydrid-Reduktionsmittel
(z.B. LiAlH.) in einem Ether-Lösungsmittel ergibt die 5,7-Dien-Zwischenverbindung (4_) . Diese Zwischenverbindung
wird sodann mit ultraviolettem Licht in einem organischen Lösungsmittel bestrahlt, um das entsprechende
Provitamin D-Derivat zu erhalten, welches isoliert wird und in einem organischen Lösungsmittel auf eine Temperatur
erhitzt wird, die sich im Bereich von Raumtemperatur bis zur Rückflußtemperatur bewegt, um das Provitamin D-Chromophor
zu dem Vitamin D-Chromophor zu isomerisieren, wodurch die 2 2E-Dehydrovitamin D-.-Verbindung der Struktur
(_5) erhalten wird. Verbindung (5_) ist eine bekannte Vitamin
D-Analogverbindung, die zuvor nach einem weniger bequemen Verfahren hergestellt wurde (Bogoslovskii et al.,
an oben angegebener Stelle).
Die Zwischenverbindung (5.) wird sodann am Kohlenstoffatom
1 hydroxyliert nach dem allgemeinen Verfahren von DeLuca et al. (US-Patentschriften 4 195 027 und 4 260 549). Diese
Reaktionsschritte umfassen die Reaktion der Verbindung {5} mit Toluolsulfonylchlorid in herkömmlicher Weise, um das
entsprechende 3ß-Tosylatderivat zu erhalten, welches direkt in gepuffertem Methanol solvolysiert wird, um die
3,5-Cyclovitamin D-Zwischenverbindung zu erhalten, welche
durch die Struktur (6) im Verfahrensschema I angegeben
ist. Durch Behandlung der letzteren Verbindung mit Selendioxid und tert.-Butylhydroperoxid wird nach chromatographischer
Reinigung das entsprechende 1-hydroxylierte Produkt erhalten, welches überwiegend die 1a-Hydroxycyclovitamin
D-Verbindung der Struktur [J) enthält. Eine kleine Menge des entsprechenden 1ß-Hydroxy-Epimers kann
ebenfalls in dem Produkt erhalten sein, jedoch ist die
Trennung der Epimeren, obwohl diese mittels Chromatographie möglich ist, in dieser Stufe nicht erforderlich. Das Erhitzen
dieser 1-Hydroxycyclovitamin D-Zwischenverbindung in Eisessig bei 40 bis 600C liefert sodann ein Gemisch
der 3-acetylierten Solvolyseprodukte, woraus durch Chromatographie
die 5,6-cis- bzw. 5,6-trans-Verbindungen der Strukturen (8.) und (9J isoliert werden. Wenn das 1-Hydroxycyclovitamin
D-Produkt, welches der Solvolyse unterworfen wird, einen Anteil 1ß-Hydroxy-Epimer enthielt, so enthält
das Solvolysegemisch ebenfalls die 1ß-Hydroxy-Epimeren
entsprechend zu den Verbindungen (I8) oder (SO und, sofern
dies gewünscht wird, können diese Verbindungen durch Chromatographie isoliert werden.
Die herkömmliche Basenhydrolyse der Acetatfunktion in der Verbindung (£) ergibt das Diolprodukt der Struktur (10).
Dieses Diol (_1_0_) wird sodann einer enzymatischen Hydroxylierung
am Kohlenstoffatom 25 in vitro unterworfen, wobei ein Leberhomogenisat verwendet wird, welches von Ratten
mit Vitamin D-Mangel hergestellt wurde (gemäß der Beschreibung in der US-Patentschrift 4 307 025), um nach
chromatographischer Trennung des Produktgemisches das gewünschte 1 α,25-dihydroxylierte Produkt in reiner Form zu
erhalten, welches durch die Struktur (J_2) angegeben ist.
In der folgenden detaillierten Beschreibung des Syntheseverfahrens,
welches oben in Grundzügen dargestellt wurde, wurden die physikochemischen Daten erhalten unter Verwendung
der unten angegebenen Verfahren und Vorrichtungen. Hochdruck-Flüssigkeitschromatographie (HPLC) wurde mittels
der Vorrichtung der Firma Waters Associates Model ALC/GPC 204 unter Verwendung einer Säule aus Zorbax-Sil (DuPont)
(6,2 mm χ 25 cm Abmessungen der Säule, Fließgeschwindigkeit 4 ml/min, 1500 psi) durchgeführt. Die Säulenchromatographie
wurde durchgeführt über Silikagel 60, 70-230 mesh
—»—
ASTM (Merck). Die präparative Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde durchgeführt über Silika 60 PF-254 (20 χ 20 cm-Platten,
1 mm Silikagel). Die Bestrahlungen wurden durchgeführt unter Verwendung einer Quecksilberdampflampe
Hanovia 608A36, die mit einem Vycor-Filter ausgerüstet
war. Alle Reaktionen werden vorzugsweise unter einer Inertgasatmosphäre durchgeführt (z.B. Argon).
3-Methyl-i-butylphenylsulfon (Isopentylphenylsulfon)
PhSO2Na (1,97 g, 12 mMol) wurde zu einer gerührten Lösung
von 3-Methyl-1-brombutan (1,51 g, 1,2 ml, 10 mMol) in DMF (20 ml) bei 75°C gegeben. Das Gemisch wurde 5 Stunden auf
75°C erhitzt, sodann abgekühlt, in Wasser eingegossen und mit Benzol extrahiert. Die organische Schicht wurde
mit 5 % HCl, 5 % NaHCO3 und Wasser gewaschen, über Na2SO.
getrocknet und eingedampft. Das ölige Sulfonprodukt (1,69 g, 80 %) war im wesentlichen rein und wurde ohne
jegliche Reinigung verwendet; NMR δ 0,88 (6H, d, J=6,5 Hz, 2XCH3), 1,61 (3H, m, -CH2-CH), 3,08 (2H, m, SO2-CH2-),
7,50-7,95 (5H, m,.Ar-H); IR: 1300 (br), 1147, 1088, 745,
692, 564, 539 cm"1; Massenspektrum m/e 212 (M+, 3), 143
(92), 77 (57), 71 (73), 70 (73), 55 (42), 43 (100), 41 (47).
(22E)-5g,8a-(4-Phenyl-1,2-urazol)-cholesta-6,22-dien-3ßol
Q)
n-Butyllithium (1,7 M-Lösung in Hexan, 4,12 ml, 7 mMol)
wurde einer gerührten Lösung von Diisopropylamin (707 mg, 1 ml, 7 mMol) in wasserfreiem THF (14 ml) zugesetzt und
das Gemisch wurde 15 Minuten bei Raumtemperatur gerührt. Das SuIfon gemäß der Herstellung in Beispiel 1 (1,50 g,
7,07 mMol) in wasserfreiem THF (11 ml) wurde innerhalb
von 10 Minuten tropfenweise zugesetzt. Die Lösung wurde (
bei Raumtemperatur gerührt für weitere 15 Minuten, sodann abgekühlt auf 00C und der Aldehyd Q) (545 mg,
1 mMol) in wasserfreiem THF (7 ml) wurde zugesetzt. Das Rühren wurde 2 Stunden bei 00C fortgesetzt und die Lö-
sung wurde langsam auf Raumtemperatur erwärmt (30 Minuten).
Das Gemisch (welches das Hydroxysulfonprodukt (2) enthielt) wurde in gesättigte Lösung von Na-HPO, in Methanol (200 ml)
eingegossen, Natriumamalgam (5,65 %, 10 g) wurde zugesetzt und das Reaktionsgemisch wurde für 17 Stunden bei 40C
gerührt. Ausgefallenes Quecksilber wurde abfiltriert und nach der Einengung des Reaktionsgemisches auf etwa 5 ml
wurde es mit Wasser verdünnt und mit Methylenchlorid extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit Wasser gewaschen,
getrocknet (Na3SO4), unter vermindertem Druck eingeengt
und der ölige Rückstand wurde über eine Silikagelsäule
chromatographiert. überschüssiges Sulfonreagens wurde
mit Benzol-Ether (7:3)-Gemisch eluiert. Die Eluation mit
Benzol-Ether (6:4) lieferte das reine Produkt (3) (375 mg,
!5 67 %) als einen Schaum: NMR δ 0,81 (3H, s,.18-H-), 0,86
(6H, d, J=6,7 Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,97 (3H,s, 19-H3),
1,03 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H3), 3,16 (1H, dd, J1=4,4 Hz,
J2=14Hz, 9-H), 4,44 (1H, m, 3-H), 5,25 (2H, br m, 22-H und
23-H) , 6,22 und 6,39 (2H, AB q, J=8,5 Hz, 6-H und 7-H)-,
7,40 (5H, br m, Ar-H)> IR: 3444, 1754, 1701 , 1599, 1402,
969, 757 cm"1; Massenspektrum, m/e 557 (M+, 1 %), 382 (70),
349 (51), 253 (28), 251 (45), 119 (PhNCO, 83), 55 (100).
(22E)-Cholesta-5,7,22-trien-3ß-Ol (4)
Das Addukt Q) (330 mg, 0,6 mMol) und Lithiumaluminiumhydrid
(700 mg) in wasserfreiem THF (40 ml) wurden unter Rückfluß für 18 Stunden erhitzt. Das überschüssige Reagens
wurde mit einigen Tropfen Wasser zersetzt. Wasserfreies Na3SO4 wurde zugesetzt und die organische Phase wurde
dekantiert und eingeengt, um einen kristallinen Rückstand zu ergeben, der über einer Silikagelsäule gereinigt wurde.
Die Eluation mit Benzol-Ether (94:6)-Gemisch ergab reines
Dien (£) (180 mg, 80 %), welches aus Methanol umkristallisiert wurde: Schmelzpunkt 119 ,5-122 ,50C-, [a]^4 = -118°
(c=1,2, CHCl3)J NMR δ 0,63 (3H, s, 18-H3), 0,87 (6H, d,
J=6,7Hz, 26-H3 und 27-H3), 0,95 (3H, s, 19-H3), 1,03 (3H,
d, J=6,8Hz, 21-H3), 3,64 (1H, m, 3-H), 5,25 (2H, br m,
■ s '
22-H und 23-H), 5,38 und 5,57 (2H, AB q, J=6 Hz, 7-H und
6-H); UV >m 281 nm; IR: 3436, 1461, 1382, 1366, 1062,
ma5
5i +
1036, 968 cm ; Massenspektrum, m/e 382 (M , 100), 349
(M+-H2O-Me, 71), 323 (34), 271 (M+-Seitenkette, 16),
253 (M+-Seitenkette-H2O, 32).
(5Z,7E,22E)-9,10-Secocholesta-5,7,10(19),22-tetraen-3ß-ol
(5)
Eine Lösung der Verbindung (4_) (100 mg, 0,26 mMol) in
Ether (120 ml)-Benzol (30 ml)-Gemisch wurde mit Argon
für 4 0 Minuten entgast. Die Lösung wurde bei 00C für
13 Minuten bestrahlt in einer Quarztauchquelle, die mit einer UV-Lampe und einem Filter ausgerüstet war- Das Lösungsmittel
wurde unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand durch HPLC getrennt, wobei 1 % 2-Propanol
in Hexan als Eluationsmittel verwendet wurde, um das reine Provitamin D-Derivat zu erhalten (40,4 mg, 40 %) , welches
bei 24 ml gesammelt wurde; NMR δ 0,72 (3H, s, 18-H3),
0,87 (6H, d, J=6,7 Hz, 26-H3 und 27-H3), 1,04 (3H, d,
J=6,8 Hz, 21-H3), 1,65 (3H, s, 19-H3), 3,91 (1H, m, 3-H),
5,28 (2H, br m, 22-H und 23-H), 5,50 (1H, m, 11-H), 5,69
und 5,96 (2H, AB q, J=12,5 Hz, 7-H und 6-H); UV }m 260,5
nm; λ . 234 nm.
Das Provitamin (4 0 mg, 0,1 mMol) in Ethanol (100 ml) wurde unter Rückfluß für 3 Stunden erhitzt. Nach dem Abzug des
Lösungsmittels wurde das Produktgemisch durch HPLC getrennt (Eluation mit 1 % 2-Propanol in Hexan). Die Ausbeute
des Vitamins (5_) (gesammelt bei 34 ml) betrug 30,8 mg (77 %); Schmelzpunkt (Hexan) 99-1010C; NMR δ 0,56 (3H, s,
18-H3), 0,88 (6H, d, J=6,7 Hz, 26-H3 und 27-H3), 102 (3H,
d, J=6,6 Hz, 21-H3), 3,96 (1H, m, 3-H), 4,82 und 5,05 (2H,
jeweils enges m, 19-H2), 5,27 (2H, br m, 22-H und 23-H),
6,03 und 6,24 (2H, AB q, J=11,4 Hz, 7-H und 6-H); UVA max 265 nm, ^ min 228 nm; IR: 3420, 1458, 1441, 1378,
1366, 1050, 970, 943, 891, 862 cm ; Massenspektrum, m/e (M+, 22), 349 (M+-H2O-Me, 4), 271 (M+-Seitenkette, 8),
253 (M+-Seitenketten-H2O, 13), 136 (100), 118 (80).
(5Z,7E,22E)-3ß-Acetoxy-9,1O-secocholesta-5,7,10(19),22-tretraen-ΐα-οΐ
(J3)
Ein frisch umkristallisiertes p-Toluolsulfonylchlorid
(50 mg, 0,26 mMol) wurde einer Lösung des Vitamins (5_) (30 mg, 0,08 mMol) in wasserfreiem Pyridin (300 μΐ) zugesetzt.
Nach 30 Stunden bei 40C wurde das Reaktionsgemisch
in Eis/gesättigte NaHCO- unter Rühren eingegossen. Das Gemisch wurde 15 Minuten gerührt und mit Benzol extrahiert.
Der organische Extrakt wurde mit gesättigter NaHCOn., gesättigtem
Kupfersulfat und Wasser gewaschen, getrocknet (Na2SO4) und unter vermindertem Druck.eingeengt, um das
ölige 3ß-Tosylderivat zu erhalten. Das rohe Tosylat wurde
mit NaHCO3 (150 mg) in wasserfreiem Methanol (10 ml) behandelt
und das Gemisch wurde 8,5 Stunden bei 550C gerührt. Nach dem Abkühlen und Einengen auf etwa 2 ml wurde
das Gemisch mit Benzol (80 ml) verdünnt, mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na2SO.) und unter vermindertem Druck
eingeengt.
Die erhaltene ölige 3,5-Cyclovitamin D-Analogverbindung
(6) war hinreichend rein, um für die folgende Oxidationsstufe ohne jegliche Reinigung eingesetzt zu werden. Einer
heftig gerührten Suspension von SeO2 (4 mg, 0,036 mMol)
in wasserfreiem CH2Cl2 (5 ml) wurde tert.-Butylhydroperoxid
(13,2 μΐ, 0,094 mMol) zugesetzt. Nach 30 Minuten
wurde wasserfreies Pyridin (40 μΐ) zugesetzt und das Gemisch
wurde weitere 25 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, mit CH2Cl2 (3 ml) verdünnt und auf 00C abgekühlt. Das
rohe 3,5-Cyclovitaminprodukt (6) in QLCL (4,5 ml) wurde
go sodann zugegeben und die Reaktion wurde bei 00C für 15 Minuten
fortschreiten gelassen. Das Gemisch wurde sodann langsam (30 Minuten) auf Raumtemperatur erwärmen gelassen.
Das Gemisch wurde in einen Trenntrichter überführt und mit 30 ml 10 %-iger NaOH geschüttelt. Ether (150 ml) wurde zugesetzt
und die abgetrennte organische Phase wurde mit 10 % NaOH, Wasser gewaschen und über Na3SO4 getrocknet.
Die Einengung zur Trockne unter vermindertem Druck ergab
einen gelben öligen Rückstand, der über Silikagel-TLC-Platten
gereinigt wurde, welche entwickelt wurden in einem 7:3-Gemisch von Hexan-Ethylacetat (Rf 0,35), wodurch das
1-Hydroxycyclovitaminprodukt erhalten wurde (14,4 mg, 45 %): NMR 60,55 (3H, s, 18-H3), 0,64 (1H, m, 3-H), 0,88
(6H, d, J=6,9 Hz, 26-H3 und 27-H3), 1,03 (3H, d, J=6,9 H7,
21-H,), 3,26 (3H, s, -OCH·,) , 4,2 (2H, m, 1-H und 6-H) ,
■J -3
4,95 (1H, d, J=9,3 Hz, 7-H), 5,1-5,4 (4H, br m, 19-H2,
22-H und 23-H); Massenspektrum, m/e 412 (M+, 27), 380
(M+-MeOH, 46), 339 (22), 269 (M+-Seitenketten-MeOH), 29),
245 (18), 135 (100). Das oben angegebene Produkt enthielt überwiegend die 1<x-Hydroxycyclovitamin D-Analogverbindung
der Struktur (2) und eine kleine Menge des entsprechenden
1ß-Epimers. Eine Lösung dieses 1-Hydroxycyc lovi tainin ΟΙ
5 Produkts (12 mg) in Eisessig (0,5 ml) wurde für 15 Minuten auf 550C erhitzt. Das Gemisch wurde sorgfältig in
Eis/gesättigte NaHCO., eingegossen und mit Benzol und
Ether extrahiert. Die vereinten Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na^SO,) und eingeengt. Das erhaltene
Produktgemisch wurde der HPLC unterworfen (1,5 % 2-Propanol in Hexan als Eluationsmittel), um 4,9 mg der Verbindung
(8^) zu erhalten (Eluation bei 42 ml) und 3,1 mg
der Verbindung (9^) (Eluation bei 50 ml) .
Verbindung (8^) : NMR 6 0,56 (3H, s, 18-H3), 0,88 (6H, d,
J=7,0 Hz, 26-H3 und 27-H3), 1,02 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H3),
2,04 (3H, s, -OCOCH3), 4,41 (1H, m, 1-H), 5,02 (1H, enges
. m, .19-H)7 5,1-5,4 (4H, br m, 3-, 19-, 22- und 23-H), 6,03
und 6,35 (2H, AB q, J=11,4 Hz, 7-H und 6-H); UV 'λ 264
max nm, Amin 227,5 nm; Massenspektrum, m/e 440 (M , 15), 380
(M+-HOAc, 84) , 362 (M+-HOAc-H2O, 9), 269 (M+-Seitenketten-HOAc,
40), 251 (15), 135 (100), 134 (.94).
Verbindung (9^): NMR δ 0,57 (3H, s, 18-H3), 0,89 (6H, d,
J=7,0 Hz, 26-H3 und 27-H3), 1,03 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H3),
2,04 (3H, s, -OCOCH3), 4,49 (1H, m, 1-H), 5,00 und 5,14
(2H, jeweils enges m, 19-H9), 5,25 (3H, br m, 3-, 22- und
23-H), 5,81 und 6,58 (2H, AB q, J=12,0 Hz, 7-H und 6-H);
UV /\ 269,5 rim, /\ . 228 nm; Massenspektrum, m/e 440
ITlclX .ItHIl-
(M+, 6), 380 (47),269 (15), 135 (100), 134 (62).
Ebenfalls wurde aus dem Solvolyse-Produktgemisch eine geringe
Menge (0,87 mg) des 1ß-Hydroxy-Epimers entsprechend der Verbindung (I3) erhalten, welches durch die folgenden
Daten charakterisiert ist: NMR δ 0,55 (3H, s, 18-H3),
0,87 (6H, d, J=6,9 Hz, 26-H3 und 27-H3), 1,01 (3H, d,
J=6,9 Hz, 21-H-.) , 2,06 (3H, s, -OCOCH,), 4,17 (1H, m, 1-H),
4,99 (2H, m, 3-H und 19-H), 5,1-5,4 (3H, br m, 19-, 22-
und 23-H), 6,00 und 6,38 (2H, AB q, -J=11,3 Hz, 7-H und 6-H)·; UV λ . 262,5 nm, ^.„ 227 nm; Massenspektrum, m/e
ΓΠ3.Χ IuXIl
440 (M+, 27), 380 (78), 362 (12), 269 (28), 251 (20),
135 (100) , 134 (78).
und (9) -...■'.
Eine Lösung des 3ß-Acetoxyvitamin-Derivats (£5) (0,7-6 mg)
in Ethanol (0,1 ml) wurde mit 10 % KOH in Methanol (0,8
ml) behandelt und das Gemisch wurde für 1 Stunde auf 500C
erhitzt. Nach der üblichen Aufarbeitung und abschließenden HPLC-Reinigung (8 % 2-Propanol in Hexan als Eluationsmittel)
wurde das 1a,3ß-Diol der Struktur (J_0) in 84 %-iger
Ausbeute erhalten: NMR δ 0,56 (3H, s, 18-H3), 0,87 (6H,
d, J=7,0 Hz, 26-H3 und 27-H3), 1,02 (3H, d, J=6,8 Hz,
21-H3), 4,22 (1H, m, 3-H), 4,42 (1H, m, 1-H), 5,00 (1H,
enges m, 19-H), 5,1-5,4 (3H, br m, 19-, 22- und 23-H), 6,01 und 6,38 (2H, AB q, J=11,4 Hz, 7-H und 6-H)J
UV Lav 264,5 nm, λ .„ 227,5 nm; Massenspektrum, m/e 398
IUclX UlX Π
(M , 21), 380 (M -H2O, 9), 2,87 (M+-Seitenkette, 6),
269 (M+-Seitenketten-H2O, 8), 251 (5), 152 (38), 134 (100).
Die Verbindung C^O) eluiert bei 40 ml in dem obigen HPLC-System.
35
35
Die analoge Behandlung des Acetoxyderivats (9_) ergab nach
HPLC-Reinigung das 5,6-trans-1α,3ß-Diol der Struktur (11)
in 72 %-iger Ausbeute: NMR δ 0,58 (3H, s, 18-Hj , 0,87 (6H,
d, J=7,0 Hz, 26-H3 und 27-H3), 1,03 (3H, d, J=6,8 Hz,
21-H3), 4,24 (1H, m, 3-H), 4,49 (iH,m, 1-H), 4,97 und
5,13 (2H, jeweils enges m, 19-H2), 5,25 (2H, br m, 22-H
und '23-H) , 5,88 und 6,58 (2H, AB q, J=11,5 Hz, 7-H und
6-H) ; UVl 273 nm,V . 229,5 nra; Massenspektrum, m/e
IUcLX IuI Il
398 (M+, 21), 380 (5), 287 (6), 269 (5), 251 (4), 152 (33),
134 (100). Die Verbindung (Vt) eluiert bei 38 ml.
25-Hydroxylierung der Verbindung (10)
Das 5,6-cis-1a,3ß-Diol der Struktur (JK)) gemäß obiger Darstellung
wurde sodann 25-hydroxyliert nach dem folgenden Verfahren: Männliche Weanling-Ratten wurden mit einer
Diät mit geringem Calcium-Vitamin D-Mangel nach der Beschreibung von Suda et al-, J. Nutr. 100, 1049 (1970)
für 2 Wochen behandelt. Sie wurden durch Enthauptung getötet und ihre Lebern wurden entfernt. Ein 20 %-iges (w/v)
Homogenisat wurde hergestellt in eisgekühlter 0,25 M Sucrose. Die Inkubation wurde in 10 ml Inkubationsmedium
in einem 125 ml fassenden Erlenmayer-Kolben durchgeführt, der eine aliquote Menge an Leberhomogenisat enthielt,
die 1 g Gewebe, 0,125 M Sucrose, 50 inM Phosphatpuffer
(pH 7,4), 22,4 mM Glucose-6-phosphat, 20 mM ATP, 160 mM
Nicotinsäureamid, 25 mM Succinat, 0,4 mM NADP, 5 mM MgCl3,
0,1 M KCl und 0,5 Einheiten Glucose-6-phosphat-dehydrogenase
enthielt. Die Reaktion wurde initiiert durch Zugabe von 400 μg der Verbindung (J[O) , die in 100 μΐ 95 %-igem
Ethanol gelöst war. Das Gemisch wurde bei 37°C inkubiert unter Schütteln mit 80 Auslenkungen/min für 3 Stunden.
Die Reaktion wurde durch Zugabe von 20 ml Methanol und 10 ml Dichlormethan gestoppt. Nach weiterer Zugabe von
10 ml Dichiormethan wurde die organische Phase gesammelt,
während die wässrige Phase mit 10 ml Dichlormethan erneut extrahiert wurde. Die organischen Phasen von insgesamt
drei Extraktionen wurden vereint und mit einem Rotations-
Verdampfer eingeengt. Der Rückstand, der das gewünschte
Produkt enthielt, wurde in 1 ml GHCl3:Hexan (65:35)-Gemisch
gelöst und auf eine Sephadex-LH-20-Säule (0,7 cm χ
14 cm) gepackt, äquilibriert und mit demselben Lösungsmittel
eluiert. Die ersten 10 ml wurden verworfen, während die nächsten 40 ml gesammelt und eingedampft wurden. Der
Rückstand wurde sodann in 8 % 2-Propanol in Hexan gelöst und der Hochleistungs-Flüssigchromatographie unterworfen
(Modell LC/GPC 204 HPLC, Waters Associates, Medford, MA) unter Verwendung einer Zorbax-Sil-Säule (4,6 mm χ 25 cm,
DuPont, Inc., Wilmington, DE), welche unter einem Druck von 1000 psi mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min
arbeitete. Das gewünschte 25-hydroxylierte Produkt wurde bei 4 2 ml eluiert. Das Produkt wurde ferner durch Hochleistungs-Flüssigchromatographie
gereinigt, wobei eine Umkehrphasen-Säule verwendet wurde ( Richrosorb Rp-18,
4,6 mm χ 25 cm, E. Merck, Darmstadt, West-Deutschland),
die unter einem Druck von 1200 psi und einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min betrieben wurde. Die Säule wurde mit
22 % H3O in Methanol eluiert und das Produkt wurde bei
50 ml eluiert. Das Produkt wurde ferner durch HPLC unter Verwendung von Zorbax-Sil gereinigt und die Bedingungen
entsprachen der obigen Beschreibung. Das erhaltene Produkt
wurde durch die folgenden Daten charakterisiert: UV-Absorption (95 % Ethanol) λ 265 nm, \ . 228 nm; Massenmax mm
spektrum, m/z 414 (Molekül-Ion M+), 396 (M+-H2O), 378
(M+-2xH2O), 287 (M+-Seitenkette), 269 (M+-Seitenketten-H2O),
251 (M+-Seitenketten-2xK2O), 152 (Ring A, C 7/8
Bindungsspaltung), 134 (152-H-O) und 59 ((CH-J9C=OH)+ erhalten
aus der C24/25-Bindungsspaltung).
Die obigen Daten, insbesondere die charakteristische Ultraviolett-Absorption und die hervortretenden und
diagnostischen Peaks bei m/z 152, 134 und 59 in dem Massenspektrum
zeigen, daß es sich bei dem Produkt um die gewünschte 25-hydroxylierte Verbindung handelt, die durch
die Struktur (J_2) (Verfahrensschema I) angegeben wird.
AS
Wenn es gewünscht wird, können die erfindungsgemäßen Verbindungen
leicht in kristalliner Form erhalten werden durch Umkristallisation aus geeigneten Lösungsmitteln,
z.B. Hexan, Ethern, Alkoholen oder Gemischen davon, wie den Fachleuten auf diesem Gebiet bekannt ist.
Biologische Aktivität der Seitenketten-Dehydrovitamin D-Verbindungen
Die biologische Wirksamkeit der oben beschriebenen Dehydrovitamin D-Analogverbindungen wurde durch Versuche in vivo
an Ratten und im Vergleich mit 1 oc-Hydroxyvitamin D-Verbindungen
bekannter Wirksamkeit nachgewiesen. Beide Produkte, (12) und die Schlüssel-Zwischenverbindung, Verbindung (JjO) ,
wurden getestet und als hoch aktiv befunden.
Biologische Aktivität der Verbindung (10)
Der Versuch wurde folgendermaßen durchgeführt: Männliche Weanling-Ratten wurden von der Firma Holtzman Co., Madison,
WI gekauft und ad libtum mit Wasser und einer Diät mit geringem Calciumgehalt, adäquatem Phosphor und Vitamin D-Mangel
gemäß der Beschreibung von Suda et al (J. Nutr. 100, 1049
(1970)) für drei Wochen gefüttert. Die Ratten wurden sodann in Gruppen von jeweils 6 Ratten eingeteilt und sie
erhielten 650 pMol der Verbindung (JjO) oder von 1a-Hydroxyvitamin
D, (Ia-OH-D7) gelöst in 0,05 ml 95 %-igem Ethanol
intrajugular 18 Stunden vor ihrer Tötung. Die Ratten in
der Kontrollgruppe bekamen den Ethanolträger in der gleichen Weise. Die Ratten wurden sodann durch Enthauptung getötet
und das Blut wurde gesammelt. Das durch Zentrifugieren erhaltene Serum des Blutes wurde mit 0,1 % Lanthanchloridlösung
(1:20) verdünnt und die Serum-Calcium-Konzentration wurde mit einem Atomabsorptionsspektrophotometer
gemessen. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle I angegeben:
TABELLE I
Anstieg der Serum-Calcium-Konzentration in Ansprache auf eine Einzeldosis von 6 50 pMol der Verbindung
(J_0) oder der Verbindung Ia-OH-D3, verabfolgt
18 Stunden vor der Tötung
Verabfolgte Verbindung Serum-Calcium-Konzentration
(mg/100 ml) _+ Standardabweichung
Ethanol 3,2 + 0,1 a'
Verbindung (j[0) 4,5 _+ 0,4 b)
Ia-OH-D- 4,7+0,5 b)
ist deutlich unterschiedlich von ρ <0,001
Biologische Aktivität der Verbindung (12)
Die Untersuchung wurde gemäß folgender Beschreibung durchgeführt:
Männliche Weanling-Rätten wurden mit einer Diät mit geringem Calciumgehalt und Vitamin D-Mangel für 3 Wochen gemäß
obiger Beschreibung behandelt. Sie wurden sodann in Gruppen von jeweils 5 Ratten unterteilt. Ratten in einer
Kontrollgruppe erhielten 0,05 ml 95 %-iges Ethanol iritrajugular, während Ratten in den Testgruppen 325 pMol der
Verbindung (J_2) oder von 1 α ,25-Dihydroxyvitamin D-,
(1a,25-(OH)2D3) gelöst in 0,05 ml 95 %-igem Ethanol erhielten.
18 Stunden später wurden sie durch Enthauptung getötet und das Blut wurde gesammelt. Die Serum-Calcium-Konzentration
wurde mit einem Atomabsorptionsspektrophotometer gemäß obiger Beschreibung ermittelt. Die Ergebnisse
sind in der nachstehenden Tabelle II angegeben:
TABELLE II
Anstieg der Serum-Calcium-Konzentration in Ansprache
auf eine Einzeldosis von 325 pMol der Verbindung [Yl) oder der Verbindung 1a,25-(OH)2D3,
verabfolgt 18 Stunden vor der Tötung
Verabfolgte Verbindung Serum-Calciuin-Konzentration
(mg/100 ml) + Standardabweichung
Ethanol 4,2 +_ 0,1 a)
Verbindung (JJ!) 5,0 J1 0,4 b)
1a,25-(OH)2D3 5,4 _+ 0,4 b)
ist deutlich unterschiedlich von ρ <0,001.
15
Die obigen Ergebnisse zeigen, daß beide Verbindungen (10)
und das Endprodukt [V2) gemäß der Erfindung hoch aktiv
sind bezüglich der Förderung eines Anstiegs der Serum-Calcium-Niveaus
von Ratten mit Vitamin D-Mangel. Sie sind tatsächlich äquivalent bezüglich ihrer biologischen Wirksamkeit
im Vergleich zu entsprechenden bekannten, in der Seitenkette gesättigten Verbindungen, Ia-OH-D.. und
1 a,25-(OH)„D_, deren hohe Wirksamkeit und pharmazeutische
Verwendbarkeit durch viele Berichte allgemein und in der Patentliteratur (z.B. vgl. US-Patentschrift 4 225 596)
dokumentiert ist.
Besonders bemerkenswert und unerwartet ist die überlegene Aktivität von Verbindung (J_0) bei der Mineralisierung
der Knochen von Tieren (Küken), die sich gegenüber der physiologischen Verwendung von Vitamin D„-Verbindungen
unterscheidet. Dies ist eine Verstärkung, welche durch die folgenden Daten erläutert wird.
Verfahren
1 Tag alte weiße männliche Leghorn-Küken wurden von der
; Firma Northern Hatcheries (Beaver Dam, WI) erhalten. Sie
wurden mit der Sojaproteindiät mit Vitamin D-Mangel gemäß
-yr-
χ der Beschreibung in Omdahl et al (Biochemistry J_0_, 2935
2940, 1971) für 3 Wochen gefüttert, wonach sie einen Vitamin D-Mangel aufwiesen. Sie wurden sodann in Gruppen von jeweils 6 Küken eingeteilt. Eine Gruppe erhielt Wesson-Öl-Träger oral verabfolgt; die anderen Gruppen erhielten die angegebene Verbindung (vgl. Tabelle III) gelöst in derselben Menge von Wesson-Öl jeden Tag für eine Zeit von
7 Tagen. 24 Stunden nach der letzten Verabfolgung wurden alle Küken durch Umdrehen des Halses getötet. Ihre Tibiae (Schienbeine) wurden entfernt und von anhaftendem weichem und Verbundgewebe befreit und für 24 Stunden in Alkohol
extrahiert, woran sich 24 Stunden in Diethylether unter
Verwendung eines Soxhlet-Extraktors anschlos.sen. Die Knochen wurden sodann bei 1000F auf ein konstantes Gewicht getrocknet und gewogen. Sie" wurden sodann bei 6500C für
2940, 1971) für 3 Wochen gefüttert, wonach sie einen Vitamin D-Mangel aufwiesen. Sie wurden sodann in Gruppen von jeweils 6 Küken eingeteilt. Eine Gruppe erhielt Wesson-Öl-Träger oral verabfolgt; die anderen Gruppen erhielten die angegebene Verbindung (vgl. Tabelle III) gelöst in derselben Menge von Wesson-Öl jeden Tag für eine Zeit von
7 Tagen. 24 Stunden nach der letzten Verabfolgung wurden alle Küken durch Umdrehen des Halses getötet. Ihre Tibiae (Schienbeine) wurden entfernt und von anhaftendem weichem und Verbundgewebe befreit und für 24 Stunden in Alkohol
extrahiert, woran sich 24 Stunden in Diethylether unter
Verwendung eines Soxhlet-Extraktors anschlos.sen. Die Knochen wurden sodann bei 1000F auf ein konstantes Gewicht getrocknet und gewogen. Sie" wurden sodann bei 6500C für
24 Stunden in einem Muffelofen verascht. Die Asche wurde gewogen und der prozentuale Aschegehalt in jedem der
Tibiae wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle III nachfolgend aufgeführt.
Tibiae wurde berechnet. Die Ergebnisse sind in der Tabelle III nachfolgend aufgeführt.
Mineralisierung von rachitischen Kükenknochen
| Verbindung | D3 | Menge (pMol/d/7 Tage) |
Anzahl der Tiere |
% | Asche |
| -D | 0 | 6 | 32,0 | ± 1,0 | |
| 1,25-(OH)2 | 130 | 6 | 41 ,0 | 1 3'4* | |
| Ia-OH-D3 | ü | 130 | 6 | 42,0 | + 3,2* |
| Ia-OH-D2 | 1300 | 6 | 38,0 | + 4,0* | |
| Verbindung | JD) 130 | 6 | 38,0 | J1 3,9* | |
* Diese Werte sind nicht wesentlich unterschiedlich
Die Ergebnisse zeigen, daß 130 pMol von 1,25-(OH)3D3 oder
Ia-OH-D oder von der neuen Verbindung (J_0) gemäß der Erfindung
in gleichem Maß wirksam sind bezüglich der Steige-
rung des Mineralgehaltes der rachitischen Tibia. Um jedoch
das gleiche Maß an Effektivität zu erreichen, waren
1300 pMol Ia-OH-D2 erforderlich. Dies stimmt mit den vorangehenden
Ergebnissen überein, worin gezeigt wurde, daß eine 10-fach größere Dosis von Ia-OH-D2 als von Ia-OH-D3
erforderlich ist, um die gleiche Mineralisierung der Tibia von rachitischen Küken zu erzeugen. Diese Ergebnisse zeigen überraschenderweise, daß die Verbindung (10),
obwohl sie eine Analogverbindung von Ia-OH-D2 ist, eine
unerwartete und überlegene Wirksamkeit bezüglich der Mineralisierung der Knochen von Tieren bietet, als sie
bekannt ist zur Unterscheidung gegen die Vitamin D2~Verbindungen
in physiologischer Verwendung. Dies ist ein unerwartetes Merkmal dieser neuen Analogverbindung und
zu deren Anwendung. Da diese unerwartete Aktivität in vivo der Verbindung (J_0) unzweifelhaft nach der Hydroxylierung
zur entsprechenden 1 α,25-Dihydroxyverbindung (Verbindung (J_2) ) in vivo auftritt, sollte die Verbindung,
d.h. Verbindung (J^), welche die 24-Desmethyl-Analogverbindung
von der bekannten Verbindung 1 α,25-Dihydroxyvitamin
D- ist, wirksam sein, um eine Knochenmineralisation bei Küken zu schaffen, die äquivalent zu derjenigen
ist, die durch 1 α,25-Dihydroxyvitamin D, gezeigt wird; somit würde diese neue Vitamin D2~Analogverbindung in
Küken voll wirksam sein. Diese hohe Wirksamkeit der Verbindungen (J_0) und (Jj_2) in einem Tier, welche sie gegenüber
Derivaten vom Vitamin D~-Typ unterscheidet ist neu und ein unterscheidendes Merkmal dieser Substanzen.
Aufgrund der ausgeprägten biologischen Aktivität werden
die erfindungsgemäßen Verbindungen leicht Anwendung finden als Ersatzstoffe für verschiedene der bekannten Vitamin
D-Metaboliten in der Therapie oder Prophylaxe von Unregelmäßigkeiten des Calcium-Metabolismus, wie Rachitis,
Hypoparathyroidismus, Osteodystrophie, Knochenerweichung
oder Osteoporose bei Menschen oder verwandten Calcium-Mangel-Erkrankungen (z.B. Milchfieber) bei Tieren. Ent-
sprechend können diese Verbindungen bei der Behandlung
von bestimmten bösartigen Erkrankungen, z.B. bei menschlicher Leukämie eingesetzt werden. Unter Berücksichtigung
der ausgeprägten und unerwarteten Wirksamkeit der erfindungsgemäßen
Verbindungen (Verbindungen (J_0) und (12) ) bei der Förderung der Mineralisierung von Knochen bei
Vögeln (vgl. Tabelle III) können diese Verbindungen eine
spezielle Verwendung haben bei der Abwendung oder der Behandlung von Zuständen, die durch Calcium-Ungleichge-
IQ wicht erzeugt werden (z.B. Dünne der Eischale, Schwäche
von Geflügelbeinen) bei Geflügel, wobei alle die bekannten Vitamin D~-Derivate eine sehr schlechte Wirksamkeit
aufweisen.
Zu therapeutischen Zwecken können die Verbindungen auf
jeden herkömmlichen Verabfolgungswege und in jeder Form, die für die ausgewählte Verabfolgungsmethode geeignet ist,
verabfolgt werden. Die Verbindungen können mit jedem verträglichen und unschädlichen pharmazeutischen Träger formuliert
werden in Form von Pillen, Tabletten, Gelatinekapseln oder Suppositorien oder als Lösungen, Emulsionen,
Dispersionen oder Suspensionen in unschädlichen Lösungsmitteln oder ölen, und eine derartige Formulierung kann
ebenfalls andere therapeutisch wirksame und vorteilhafte Bestandteile enthalten, wie sie für die speziellen Verabfolgungen
zweckmäßig sein können. Für Verabfolgung an Menschen werden die Verbindungen vorteilhafterweise in
Mengen von 0,5 bis 10 μg pro Tag verabfolgt, wobei die
spezielle Dosis eingestellt wird in Übereinstimmung mit der speziellen verabfolgten Verbindung, der zu behandelnden Krankheit und dem Zustand und der Ansprache des
Patienten, wie den Fachleuten auf diesem Gebiet verständlich ist.
10
15
20
25
30
35
IA
,CHO
AeO
(A)
(Z)Y-OH
(9) X«Ac IU) Χ«Η
Claims (7)
1. Verbindungen der Formel
^g worin R ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxylgruppe
ist.
2. Verbindung nach Anspruch 1, worin R ein Wasserstoffatom
ist.
3. Verbindung nach Anspruch 2 in kristalliner Form.
4. Verbindung nach Anspruch 1, worin R eine Hydroxylgruppe
ist.
5. Verbindung nach Anspruch 4 in kristalliner Form.
6. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche die Verbindung
nach Anspruch 2 und einen pharmazeutisch unbe-
QQ denklichen Exzipienten enthält.
7. Pharmazeutische Zusammensetzung, welche die Verbindung nach Anspruch 4 und einen pharmazeutisch unbedenklichen
Exzipienten enthält.
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