DK153145B - 1alfa-hydroxyvitamin d2 analoge - Google Patents

Description

i

DK 153145 B

Den foreliggende opfindelse angår hidtil ukendte la-hydroxyvitamin D^analoge, der udviser uventede biologiske egenskaber, samt farmaceutiske præparater indeholdende disse.

5 På grund af den velkendte og klart påviste virkning ved 1 α-hydroxyvitamin D-forbindelser til at regulere calcium- og phosphathomeostase hos dyr eller mennesker, har der været interesse for at fremstille naturlige metaboliter og at finde analoge, der har værdifulde 10 biologiske egenskaber. Dette har ført til fremstillingen af en hel række forbindelser, der udviser biologisk aktivitet (se f.eks. DeLuca et al, Topics in Current Chem., Vol. 83, p. 1 (1979) og Ann. Rev. 49, 371 (1980)). Interessen for disse forbindelser er stadig stigende, 15 specielt nu da det har vist sig, at de ud over deres klassiske funktion som regulatorer for calciumhomeostase også for visse vitamin D-derivaters vedkommende, specielt 1a,25-dihydroxyvitamin D^ og 1a-hydroxyvitamin D^, har indvirkning på celledifferentieringsprocesserne og er 20 i stand til at hæmme væksten og proliferationen af visse leukemiceller [Suda et al., US patentskrift nr. 4 391 802; Suda et al., Nature, 306,492-494 (1983)].

De fleste af de kendte vitamin D-metaboliter og analoge er derivater af vitamin D^-rækken, det vil sige, at 25 de er i besiddelse af mættede steroidsidekæder. Imidlertid kendes sidekæde-umættede vitamin D-forbindelser, nemlig specielt hydroxyderivater af vitamin D2 som f.eks. 25-hydroxyvitamin D^ (US patentskrift nr. 3 585 221), 1 a, 25-dihydroxyvitamin D2 (US patentskrift nr. 3 880 30 894), 24-hydroxy- og 24,25- dihydroxyvitamin D2-metabolit- erne (Jones et_ al., Arch. Biochem. Biophys. 202, 450 (1980)), la-hydroxyvitamin D2 (US patentskrift nr.

3 907 843), samt visse beslægtede 22-trans-dehydroforbin-delser, der mangler 24-methylsubstituenten, således som 2

DK 153145 B

beskrevet i US patentskrift nr. 3 786 062 og af Bogoslovskii £t al. (J. Gen. Chem. USSR 48(4), 828 (1978); Chem. Abstr. 89, 163848j, 89, 209016s).

De Ια-hydroxyvitamin D^-analoge ifølge opfindelsen er 5 ejendommelige ved, at de har den almene formel:

„f^oH

hvori R betegner hydrogen eller en hydroxygruppe. Den omhandlede forbindelse, hvor R betegner hydrogen, kan fremstilles som et mellemprodukt til brug ved fremstilling af forbindelsen, hvori R betegner hydroxy.

10 De farmaceutiske præparater ifølge opfindelsen er ejendommelige ved, at de består af en af ovennævnte la-hydroxy-vitamin D2~analoge og et farmaceutisk acceptabelt hjælpestof.

Strukturelt er de omhandlede forbindelser analoge med 15 hydroxyvitamin D2~forbindelser, der mangler 24-methylsub-stituenten, det vil sige forbindelserne er henholdsvis lo'-hydroxy-24-norvitamin D2 og le,25-dihydroxy-2 4-nor-vitamin D2.

Både slutforbindelsen og mellemproduktet udviser høj 20 biologisk aktivitet og er karakteriseret ved et uventet og hidtil ukendt aktivitetsmønster, der beskrives nærmere nedenfor.

En udførselsform for den kemiske proces, der fører til de oven for angivne forbindelser, er angivet i reaktions 3

DK 153145 B

skema I. I den følgende beskrivelse af denne metode og i eksempler og i tabeller refererer de angivne numre (f.eks. 1, 2, 3, ...... 10, 11, 12) også til formlerne, der er nummeret på samme måde i reaktionsskemaet.

5 Udgangsmaterialet er det dienbeskyttede aldehyd med formlen 1 (se reaktionsskema I), der fremstilles ud fra ergosterolacetat som beskrevet af Barton et^ al.

(J. Chem. Soc. (C) 1968 (1971)). Omsætning af aldehydet 1 med 3-methyl-l-butylphenylsulfon med formlen: 10 (CH3)2CHCH2CH2-S02Ph i et organisk opløsningsmiddel og i nærværelse af en stærk organisk base giver hydroxy-sul fonmellemproduktet med formlen 2, således som angivet i reaktionsskema I. Behandling af mellemproduktet 2 med natriumamalgam 13 i pufret alkoholopløsning giver herefter 22,23-transole-fin (22£-olefin) med formlen 3.

Omsætning af 22E!-olefinen 3 med et stærkt reducerende reagens i form af et hydrid (f.eks. LiAlH^) i et ether-opløsningsmiddel giver 5,7-dienmellemproduktet 4. Dette 20 mellemprodukt bestråles herefter med ultraviolet lys i et organisk opløsningsmiddel til opnåelse af det tilsvarende prævitamin D-derivat, der isoleres og opvarmes i et organisk opløsningsmiddel ved en temperatur, der ligger fra stuetemperatur til tilbagesvalingstemperaturen» 25 for at isomerisere prævitamin D-chromophoren til vitamin D-chromophoren, hvorved der opnås 22£-dehydrovitamin D^-forbindelsen med formlen 5. Forbindelsen 5 er en velkendt vitamin D analog, der forud er fremstillet ved en mindre bekvem metode af Bogoslovskii et. sQ. , 30 supra.

Mellemproduktet 3 hydroxyleres herefter ved carbon 1

DK 153145 B

4 som beskrevet af DeLuca e_t (US patentskrifter nr.

4 195 027 og 4 260 549). Disse reaktioner indebærer omsætning af forbindelsen 5 med toluensulfonylchlorid på almindelig måde til fremstilling af det tilsvarende 5 3p-tosylderivat, der direkte solvolyseres i pufret methanol til fremstilling af 3,5-cyclovitamin D-mellempro-duktet med formlen 6 i reaktionsskema I. Ved behandling af sidstnævnte forbindelse med selendioxid og tert.-butylhydroperoxid fås efter chromatografisk op-10 rensning det tilsvarende 1-hydroxylerede produkt, der hovedsageligt består af la-hydroxycyclovitamin D-for-bindelsen med formlen 7. En ringe mængde af den tilsvarende Ιβ-hydroxyepimer kan også forefindes i forbindelsen, men adskillelse af de epimere, skønt det er mu-15 ligt ad chromatografisk vej, er ikke nødvendig på dette trin. Opvarmning af dette 1-hydroxycyclovitamin D-mellemprodukt i iseddikesyre ved 40-60°C giver herefter en blanding af de 3-acetylerede solvolyseforbin-delser, hvorfra der chromatografisk kan isoleres hen-20 holdsvis 5,6-cis og 5,6-transforbindelserne med formlerne 8 og 9.

Dersom 1-hydroxycyclovitamin D-forbindelsen, der solvolyseres, indeholder noget Ιβ-hydroxyepimer, så vil solvo-lyseblandingen også indeholde de Ιβ-hydroxyepimere sva-25 rende til forbindelserne 8 eller 9, og disse kan eventuelt også isoleres chromatografisk.

Almindelig basehydrolyse af acetatfunktionen i forbindelsen 8 giver diolforbindelsen med formlen 10.

Denne diol 10 underkastes herefter _in vitro enzymatisk 30 hydroxylering ved carbon 25 under anvendelse af et lever-homogenat, der er fremstillet ud fra vitamin D-manglende rotter (som beskrevet i US patentskrift nr. 4 307 025), hvorved der efter chromatografisk adskillelse af produkt- 5

DK 153145 B

blandingen fås det ønskede la,25-dihydroxylerede produkt med formlen 12 i ren form.

I den følgende detaljerede beskrivelse af syntesen angivet ovenfor opnåedes de fysisk-kemiske resultater 5 under anvendelse af nedenfor anførte metoder og apparater. Højtryksvæskechromatografi (HPLC) blev udført på en Waters Associates Model ALC/GPC 204 under anvendelse af en Zorbax-Sil (Dupont)-søjle (6,2 mm x 25 cm søjle, strømningshastighed 4 ml/min., 1500 psi). Søjle-10 chromatografi udføres på Silica Gel 60, 70-230 mesh ASTM (Merch). Præparativ tyndlagschromotografi (TLC) udføres på Silica 60 PF-254 (20 x 20 cm plader, 1 mm silicagel). Bestrålingen udføres under anvendelse af en Hanovia 608A36 kviksølvbuelampe udstyret med et 15 l/ycor-filter. Alle omsætninger udførtes under en inert atmosfære (f.eks. argon).

3-methyl-l-butylphenylsulfon (isopentylphenylsulfon).

PhS02Na (1,97 g, 12 mmol) sattes til en omrørt opløsning af 3-methyl-l-brombutan (1,51 g, 1,2 ml, 10 mmol) 20 i DMF (20 ml) ved 75°C. Blandingen opvarmedes 5 timer ved 75°C, afkøledes herefter, udhældtes i vand og extra-heredes med benzen. Det organiske lag vaskedes med 5%

NaHCOj og vand, tørredes over Na2S0^ og inddampedes.

Den olieagtige sulfonforbindelse (1,69 g, 80%) var i 23 det væsentlige ren, og den kunne anvendes uden yderligere rensning; NMR«S0,88 (6H, d, J=6,5 Hz, 2xCH^), 1,61 (3H, m, -CH2-CH), 3,08 (2H, m, S02-CH2-), 7,50-7,95 (5H, m, Ar-H); IR: 1300 (br), 1147,1088,745,692,564,539 cm”·*·; massespektrum, m/e 212 (M+, 3), 143 (92), 77 (57), 30 71 (73), 70 (73), 55 (42), 43 (100), 41 (47).

(22E)-5g,8a-(4-phenyl-l,2-urazolo)-cholesta-6,22-dien-36-qI (3).

n-Butyllithium (1,7 M opløsning i hexan, 4,12 ml, 7 mmol) sattes til en omrørt opløsning af di-isopropy-

DK 153145 B

6 lamin (707 mg, 1 ml, 7 mmol) i tør THF (14 ml), og blandingen omrørtes i 15 min. ved stuetemperatur. Sulfonen fremstillet i eksempel 1 (1,50 g, 7,07 mmol) i tør THF (11 ml) tilsattes dråbevis i løbet af 10 min. Opløsningen 5 omrørtes ved stuetemperatur i yderligere 15 min., der afkøledes herefter til 0°C, og aldehydet 1 (545 mg, 1 mmol) i tør THF (7 ml) tilsattes. Omrøringen fortsatte i 2 timer ved 0°C, og opløsningen opvarmedes langsomt til stuetemperatur (30 min.). Blandingen (der indeholdt 10 hydroxysulfonforbindelsen 2) udhældtes i en mættet opløsning af Na2HP0^ i methanol (200 ml), natriumamalgam (5,65?ό, 10 g) tilsattes, og reaktionsblandingen omrørtes 17 timer ved 4°C. Udfældet kviksølv frafiltreredes, og efter koncentrering af reaktionsblandingen til ca.

15 5 ml fortyndedes denne med vand, og der extraheredes med methylenchlorid. Den organiske ekstrakt vaskedes med vand, der tørredes (Na^SO^), koncentreredes i vakuum, og den olieagtige remanens chromatograferedes på en silicagelsøjle. Overskud af sulfonreagens elueredes 20 med benzen: ether (6:4) og gav det rene additionsprodukt 3 (375 mg, 61%) som et skum: NMR£0,81 (3H, s, 18-H^), 0,86 (6H, d, J=6,7 Hz, 26-H3 og 27-H3), 0,97 (3H, s, 19-H3), 1,03 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-Hj), 3,16 (IH, dd, J1=4,4 Hz, J2=14 Hz, 9-H), 4,44 (IH, m, 3-H, 5,25 (2H, 25 br m, 22-H og 23-H), 6,22 og 6,39 (2H, AB q, J=8,5 Hz, 6-H og 7-H), 7,40 (5H, br m, Ar-H; ) IR: 3444,1754,1701, 1599,1402,969,757 cm-"*·; massespektrum, m/e 557 (M+, 1%), 382 (70), 349 (51), 253 (28), 251 (45), 119 (PhNCO, 83), 55 (100).

30 (22E)-cholesta-5,7., 22-trien-3R-ol (4).

Additionsproduktet 3 (330 mg, 0,6 mmol) og lithiumalumi-niumhydrid (700 mg) i tør THF (40 ml) opvarmedes i 18 timer ved tilbagesvaling. Overskud af reagens dekomponere- 7

DK 153145 B

des med nogle få dråber vand. Vandfrit Na2S0^ tilsattes, og den organiske fase afdekanteredes og inddampedes til opnåelse af en krystallinsk rest, der rensedes på en søjle af silicagel. Eluering med benzen: ether (94:6) 5 gav den rene dien 4 (180 mg, 80¾), der udkrystalliseredes 24 med methanol og smeltede ved 119,5-122,5°C$ [α]β =-118° (c = 1,2, CHC13); NMR S 0,63 (3H, s, 18-H3), 0,87 (6H, d), (6H, d, J = 6,7 Hz, 26-H3 og 27-H3), 0,95 (3H, s, 19-H3), 1,03 (3H, d, J = 6,8 Hz, 21-H3), 3,64 (IH, m, 3-H), 5,25 10 (2H, br m, 22-H og 23-H), 5,38 og 5,57 (2H, AB q, J=6

Hz, 7-H og 6-H); UV λ 281 nm; IR: 3436,1461,1382, 1366,1036,968 cm~ ; massespektrum, m/e 382 (M+, 100), 349 (M+-H20-Me, 71), 323 (34), 271 (M+-sidekæde, 16), 253 (M+-sidekade-H20, 32).

15 (5Z,7E,22E)-9,lQ-secocholesta-5,7,10(19),22-tetraen-3P-ol (5).

En opløsning af forbindelse 4 (100 mg, 0,26 mmol) i ether (120 ml)-benzen (30 ml) blev afgasset med argon i 40 min. Opløsningen bestråledes i 13 min. ved 0°C 20 i en kvarts immersionsbeholder udstyret med UV-lamper og filter. Opløsningsmidlet fjernedes under reduceret tryk, remanensen adskiltes ved HPLC, idet der anvendtes 1% 2-propanol i hexan som elueringsmiddel til opnåelse af det rene prævitamin D-derivat (40,4 mg, 40?ό), der 25 indsamledes ved 24 ml; NMR S 0,72 (3H, s, 18-H3), 0,87 (6H, d, J=6,7 Hz, 26-H3 og 27-Hj), 1,04 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H3), 1,65 (3H, s, 19-H.j), 3,91 (IH, m, 3-H),

5,28 (2H, br m, 22-H og 23-H), 5,50 (IH, m, 11-H), 5,69 og 5,96 (2H, AB q, J=12,5 Hz, 7-H og 6-H); UVA

max.

30 260,5 nm;A 234 nm. Prævitaminet (40 mg, 0,1 mmol) min i ethanol (100 ml) opvarmedes 3 timer med tilbagesval-ning. Efter fjernelse af opløsningsmidlet fraskiltes produktblandingen ved hjælp af HPLC (eluering med 1?ί

DK 153145 B

8 2-propanol i hexan). Udbyttet af vitaminet 5 (opsamlet ved 34 ml) var 30,8 mg (77°ό) med smeltepunkt (hexan) 99-101°C; NMR<$0,56 (3H, s, 18-H3), 0,88 (6H, d, J = 6,7 Hz, 26-H3 og 27-H3), 1,02 (3H, d, 3=6,6 Hz, 21-H.j), 5 3,96 (IH, m, 3-H), 4,82 og 5,05 (2H, hver smal m, 19-HZ), 5,27 (2H, br m, 22-H og 23-H), 6,03 og 6,24 (2H, ABq, J=ll,4 Hz, 7-H og 6-H); U\l \ 265 nm,\ . 228 nm; IR: 3420,1458,1441,1378,1366,1050,970,943,891,862 cm ; massespektrum, m/e (M+, 22), 349 (M+-H20-Me, 4), 271 10 (M+-sidekæde, 8), 253 (M+-sidekæde-H20, 13), 136 (100), 118 (80).

(5Z,7E,22E)-3S-acetoxy-9,10-secocholesta-5,7,10(19),11-te-traen-lg-ol (8).

Et frisk omkrystalliseret p-toluensulfonylchlorid (50 mg, 0,26 mmol) sattes til en opløsning af vitaminet 5 (30 mg, 0,08 mmol) i tør pyridin (300yul). Efter 30 15 timer ved 4DC udhældtes reaktionsblandingen i is/mættet

NaHCO^ under omrøring. Blandingen omrørtes i 15 min. og ekstraheredes med benzen. Den organiske ekstrakt vaskedes med mættet NaHCO^, mættet kobbersulfat og vand, tørredes (Na2S0^) og koncentreredes i vakuum, hvorved 20 det olieagtige 33-tosylderivat opnåedes. Det rå tolylat behandledes med NaHCO^ (150 mg) i vandfrit methanol (10 ml), og blandingen omrørtes i 8 1/2 time ved 150°C.

Efter afkøling og koncentrering til omtrent 2 ml fortyndedes blandingen med benzen (180 ml), vaskedes med vand, 25 tørredes (Na2S0^) og inddampedes under reduceret tryk.

Den fremstillede olieagtige 3,5-cyclovitamin D-analog 6 var tilstrækkelig ren til at anvendes under den følgende oxidation uden yderligere oprensning. Til en kraftig omrørt suspension af Se02 (4 mg, 0,036 mmol) i tør CH2C12 30 (5 ml) sattes tert.-butylhydroperoxid (13,2^ul, 0,094 mmol). Efter 30 min. tilsattes tør pyridin (40yul), og blandingen omrørtes yderligere 25 min. ved stuetempe- DK 153145 B ; 9 ratur, fortyndedes med CH^Cl^ (3 ml) og afkøledes til 0°C. Den urensede 3,5-cyclovitaminforbindelse (6) i CH2CI2 (4,5 ml) tilsattes herefter, og omsætningen fortsatte i 15 min. ved 0°C. Herefter lod man langsomt blan-5 dingens temperatur stige til stuetemperatur (30 min.).

Blandingen overførtes til en skilletragt, og der udrys-tedes med 30 ml 10¾ NaOH. Ether (150 ml) tilsattes, og den fraskilte organiske fase vaskedes med 10¾ NaOH, vand, og der tørredes over Na^SO^. Koncentrering i vakuum 10 til tørhed gav en gul olieagtig remanens, der rensedes på silicagel'-TLC-plader, der blev fremkaldt i 7:3 hexan-ethylacetat (R^ 0,35), hvorved 1-hydroxycyclovitaminfor-delsen opnåedes (14,4 mg, 45?ό): NMRS0,55 (3H, s, 18-H^), 0,64 (IH, m, 3-H), 0,88 (6H, d, 3 = 6,9 Hz, 26-H3 og 27-H3), 15 1,03 (3H, d, J=6,9 Hz, 21-H.j), 3,26 (3H, s, -0CH3), 4,2 (2H, m, 1-H og 6-H), 4,95 (IH, d, 3=9,3 Hz, 7-H), 5,1-5,4 (4H, br m, Ι9-Η2» 22-H og 23-H); massespektrum, m/e 412 (M+, 27), 380 (M+-Me0H, 46), 339.(22), 269 (M+ -sidekæde-MeOH, 29), 245 (18), 135 (100). Ovennævnte 20 forbindelse bestod hovedsagelig af den lc-hydroxycyclo- vitamin D-analoge med formlen 7 og en ringe mængde af den tilsvarende Ιβ-epimer. En opløsning af denne 1-hydro-xycyclovitamin D-forbindelse (12 mg) i iseddikesyre (0,5 ml) opvarmedes i 15 min. ved 55°C. Blandingen ud-25 hældtes forsigtigt i is/mættet NaHCOj, og der ekstraheredes med benzen og ether. De samlede ekstrakter vaskedes med vand, tørredes (Na^SO^) og inddampedes. Den fremkomne produktblanding behandledes ved HPLC (1,5¾ 2-propa-nol i hexan som elueringsmiddel), hvorved der opnåedes 30 4,9 mg af forbindelsen (8) (der er elueret ved 42 ml) og 3,1 mg af forbindelsen (9) (der er elueret ved 50 ml).

Analyse (8): NMRi 0,56 (3H, s, 18-H3), 0,88 (6H, d, 3=7,0 Hz, 26-H3), 1,02 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H3), 2,04 (3H, s, -0C0CH3), 4,41 (IH, m, 1-H), 5,02 (IH, smal 35 m, 19-H), 6,03 og 6,35 (2H, ABq, J=ll,4 Hz, 7-H og 6-H;

DK 153145B

10 UV λ _ 264 nm, Ά. . 227,5 nm; massespektrum, m/e 440 max. ’ min. ’ r ’ (M+-H0Ac, 84), 362 (M+-H0Ac-H20, 9), 269 (M+-sidekæde-HOAc, 40), 251 (15), 135 (100), 134 (94).

Analyse (9): NMR £ 0,57 (3H, s, 18-H3), 0,89 (6H, d, 5 J = 7,0 Hz, 26-H3 og 27-H3), 1,03 (3H, d, J = 6,8 Hz, 21-H3), 2,04 (3H, s, -OCOCH3), 4,49 (IH, m, 1-H), 5,00 og 5,14 (2H, hver smal m, 19-H2), 5,25 (3H, br m, 3-, 22- og 23-H), 5,81 og 6,58 (2H, AB q, J=12,0 Hz, 7-H og 6-H); U\l X 269,5 nm; X . 228 nm; massespektrum, m/e max. min.

10 440 (M+, 6), 380 (47), 269 (15), 135 (100), 134 (62).

Fra solvolyseproduktblandingen opnåedes også en ringe mængde (0,87 mg) af den Ιβ-hydroxyepimere, der svarer til forbindelse (8), kendetegnet ved følgende data: NMR (^0,55 (3H, d, J = 6,9 Hz, 21-H.j) 2,06 (3H, s, OCOCHj), 15 4,17 (IH, m, 1-H), 4,99 (2H, m, 3-H og 19-H), 5,1-5,4 (3H, br m, 19-, 22-, og 23-H), 6,00 og 6,38 (2H, AB q, J = ll,3 Hz, 7-H og 6-H); UV A 262,5 nm,A . 227 nm; massespektrum, m/e 440 (M+, 27), 380 (78), 362 (12), 269 (28), 251 (20), 135 (100), 134 (78).

Hydrolyse af 3B-acetoxyqrupperne i forbindelsegne(8) og (9).

20 En opløsning af 38-acetoxyderivatet (8) (0,76 mg) i ethanol (0,1 ml) behandledes med 10¾ Κ0Η i methanol (0,8 ml), og blandingen opvarmedes i en time ved 50°C.

Efter sædvanlig oparbejdning og afsluttende HPLC rensning (8¾ 2-propanol i hexan som elueringsmiddel) opnåedes 25 ip,3p-diol med formlen 10 i et udbytte på 84?i: NMR

S 0,56 (3H, s, 18-H3), 0,87 (6H, d, J=7,0 Hz, 26-H3 og 27-H3), 1,02 (3H, d, J=6,9 Hz, 21-H3), 4,22 (IH, m, 3-H), 4,42 (IH, m, 1-H). 5,00 (IH, smal m, 19-H), 5,1-5,4 (3H, br m, 19-, 22- og 23-H), 6,01 og 6,38 (2H, 11

DK 153145 B

AB q, J=ll,4 Hz, 7-H og 6-H); υνλ^^ 264,5 nm,^min> 227,5 nm; massespektrum, m/e 398 (M+ -H2O, 9), 2.,87 (M+-sidekæde, 6), 269 (!M+-sidekæde-H20, 8), 251 (5), 152 (38), 134 (100). Forbindelse (10) eluerer veid 40 5 ml i nævnte HPLC system.

Analog behandling af acetoxyderivatet (9) gav efter HPLC rensning 5,6-trans-loi, 30-diolen med formlen (il) i 72% udbytte: NMR<fo',58 (3H, s, 18-H3), 0,87 (6Ή, d, J = 7,0 Hz,.26-H3 og 27-H3), 1,03 (3H, d, J=6,8 Hz, 10 21-H3), 4,24 (IH, m, 3-H), 4,49 (IH, m, 1-H), 4,97 og

5,13 (2H, hver smal m, 19-H2), 5,25 (2H, br m, 22-H

og 23-H), 5,88 og 6,58 (2H, AB q, J=ll,5 Hz, 7-H og 6-H); UV λ 273 nm,^- . 229,5 nm; massespektrum, ni3x · min* m/e 398 (M+, 21), 380 (5), 287 (6), 269 (5), 251 (4), 15 152 (33), 134 (100). Forbindelse (11) eluerer ve.d 38 ml.

25-Hydroxylerinq af forbindelse (10) 5,6-Cis-la,30-diolen med formelen (10) fremstillet ovenfor hydroxy leredes, herefter på følgende måde: fravænnede hanrotter blev fodret med en lav calciumholdig vitamin D-fattig diæt som beskrevet af Suda et al. J. Nutr. 100, 20 (1970) i 2 uger. De aflivedes ved dekapitation, og deres levere blev fjernet. Et 20 vægt/rumfang homogenat fremstilles i iskoldt 0,25 M saccharose. Inkubation udførtes i 10 ml inkubationsmedium i en 125 ml Erlenmeyerkolbe, der indeholdt en prøve af leverhomogenatet s var.ende 25 til 1 g væv, 0,125 M saccharose, 50 mM phophatpuffer (pH7,4), 22,4 mM glucose-6-phosphat, 20 mMATP, 160 mM nicotinamid, 25 mM succinat, 0,4 mM NADP, 5 mfi MgC^, 0,1 M KC1 og 0,5 enheder glucose-6-phosphat-dehydrogenase. Omsætningen startedes ved. tilsætning af 400^ug af for-30 bindeisen (10) opløst i lOO^ul 95% ethanol. Blandingen inkuberes ved 37°C under omrystning med 80 omrystninger/ minut i 3 timer. Reaktionen blev afbrudt ved tilsætning

DK 153145 B

: 12 af 20 ml methanol og 10 ml dichlormethan. Efter yderligere tilsætning af 10 ml dichlormethan opsamledes den organiske fase, medens den vandige fase atter eks-traheredes i 10 ml dichlormethan. Den organiske fase 5 fra ialt 3 ekstraktioner blev slået sammen og inddampet på en roterende inddamper. Remanensen, der indeholdt den ønskede forbindelse, opløstes i 1 ml CHC1,: hexan Æ) -> (65:35) blanding og påførtes en Sephadex^ LH-20 søjle (0,7 cm x 14 cm) pakket, bragt i ligevægt og elueret 10 med det samme opløsningsmiddel. De første 10 ml bort- kastedes, medens de næste 40 ml opsamledes og inddampe des. Remanensen opløses herefter i 8¾ 2-propanol i hexan og underkastedes højtryksvæskechromatografi (Model LC/GPC 204 HPLC, Waters Associates, Medford, MA), 15 idet der anvendtes en Zorbax-Sil søjle (4,5 mm x 25 cm,

Dupont, Inc., Wilmington, DE), der arbejdede med tryk på 1000 psi med en strømningshastighed på 2 ml/min.

Det ønskede 25-hydroxylerede produkt elueredes ved 42 ml. Forbindelsen rensedes yderligere ved højtryksvæs-20 kechromatografi under anvendelse af omvendt fasesøjle (Richrosorb Rp-18,4,6 mm x 25 cm, E. Merck, Darmstadt, Vesttyskland), der arbejdede ved et tryk på 1200 psi og en strømningshastighed på 2 ml/min. Søjlen elueredes med 22/d h^O i methanol, og forbindelsen elueredes ved 25 50 ml. Forbindelsen rensedes yderligere ved HPLC under anvendelse af Zorbax-Sil, og de ovenfor beskrevne betingelser. Det fremstillede produkt havde følgende data: UV absorption (95/¾ ethanol)\ 265 nm, ^ 228 nm: r max min.

massespektrum, m/z 414 (mol. ion M+), 396 (M+-H20), 30 378 (M+-2xH20), 287 (M+-sidekæde), 269 (M+-sidekæde-H20), 251 (M+-sidekæde-2xH20), 152 (ring A, C 7/8 spaltning af binding), 134 (152-H20) og 59 ((CHj)2C=0H)+ stammende fra C24/25-bindingsspaltning.

Ovennævnte resultater, specielt den karakteristiske

DK 153145B

13 ultraviolette absorption og de prominente og diagnostiske toppe ved m/z 152, 134 og 59 i massespektret fastslår, at forbindelsen er den ønskede 25-hydroxylerede forbindelse afbildet med formlen (12) i reaktionsskema I.

5 Eventuelt kan de omhandlede forbindelser let fås i krystallinsk form ved øankrystallisation med passende opløsningsmidler som hexan, ethere, alkoholer eiller blandinger heraf, hvilket vil være kendt for fagmanden.

Biologisk aktivitet af sidekæde dehydrovitamin I) forbindelser

Den biologiske virkning af de ovenfor beskrevne dehydro-10 vitamin D analoge undersøgtes ved in vivo forsøg i rotter og ved sammenligning med la-hydroxyvitamin D forbindelser med kendt virkning. Både forbindelse (12) og hovedmellemproduktet, forbindelse (10), blev undersøgt og viste sig at have særdeles kraftig virkning.

Biologisk aktivitet af forbindelse (10) 15 Forsøg udførtes på følgende måde: Fravænnede hanrotter blev købt fra Holtzman Co., Madison WI og fodret ad libitum med vand og et vitamin D-fattigt foder med et lavt indhold af calcium og et passende indhold af phosphor som beskrevet af Suda et al. (J. Nutr. 100, 1049 (1970)) 20 i tre uger. Herefter opdeltes rotterne i grupper med 6 rotter i hver, og de fik indgivet 650 pmol af enten forbindelse (10) eller lec-hydroxyvitamin (la-OH-D^) opløst i 0,05 ml 9555 ethanol intrajugulart 18 timer inden de blev aflivet. Rotterne i kontrolgruppen fik 25 ethanolbærestoffet på samme måde. Rotterne blev aflivet ved dekapitation og blodet blev udtaget. Serum blev opnået ved centrifugering af blodet og fortyndet med 0,1% lanthanchloridopløsning (1:20), og calciumkoncentra-

DK 153145B

14 tionen i serum måltes med et atomabsorptionsspektrofoto-meter. Resultaterne er angivet i tabel 1 nedenfor: T A B E L 1

Forøgelse af calciumkoncentration i serum som respons på en enkelt dosis bestående af 650 pmol af enten for-5 bindelse (10) eller loi-OH-D^ indgivet 18 timer inden aflivning.

Serum calciumkoncentration

Forbindelse indgivet (mg/100 ml)i standardafvigelse ethanol 3,2 - 0,1 a) forbindelse (10) 3,5 - 0,4 lo'-0H-Dj 4,7 - 0,5 b) b) er signifikant forskellig fra a) p <0,001.

Biologisk aktivitet af forbindelse (12)

Forsøg blev udført på følgende måde: fravænnede hanrotter blev fodret med et vitamin D-fattigt foder med lavt calciumindhold i tre uger som angivet ovenfor. De opdeltes 10 herefter i grupper bestående af 5 rotter i hver gruppe.

Rotterne i en kontrolgruppe fik 0,05 ml 95% ethanol intrajugulart, medens rotterne i forsøgsgrupperne fik 325 pmol af enten forbindelse (12) eller la,25-dihydroxy-vitamin (la,25-(0H)2Dj) opløst i 0,05 ml 95¾ ethanol.

15 18 timer senere blev de aflivet ved dekapitation og blodet blev udtaget. Calciumkoncentrationen i serum bestemtes med atomabsorptionsspektrofotometer som beskrevet ovenfor. Resultaterne er angivet i tabel 2 nedenfor: a

DK 153145 B

15 I A B E L 2

Forøgelse af calciumkoncentration i serum som respons på en enkelt dosis på 325 pmol af enten forbindelse (12) eller lo:, 25-(OH)indgivet 18 timer inden aflivning.

Serum calciumkoncentration

Forbindelse indgivet (mg/100 ml) + standardafvi gelse ethanol 4,2 - 0,1 forbindelse (12) 5,0 - 0,4 b) 1o:,25-(0H)2D3 5,4 - 0,4 b) b) er signifikant forskellig fra a) p <0,001 5 Ovennævnte resultater viser, at både forbindelse (10) og det omhandlede slutprodukt (12) er særdelses :aktive til at fremkalde en forøgelse i serum calciumniveauer hos vitamin D manglende rotter. De er faktisk ækvivalente med hensyn til biologisk effektivitet med de tilsvarende 10 kendte sidekæde-mættede forbindelser lcs-OH-D^ og lcc, 2 5 — (0H)2D3, hvis kraftige virkning og farmaceutiske anvendelighed er veldokumenteret af adskillige rapporter inden for den almene litteratur og patentlitteraturen (se for eksempel USA patentskrift nr. 4 225 596).

15 Særligt bemærkelsesværdigt og uventet er den glimrende virkning af forbindelsen (10) ved mineralisering af knoglerne hos et dyr (kyllinger), der ikke er i stand til fysiologisk at udnytte vitamin D2 forbindelser.

Dette er til fulde illustreret ved følgende resultater.

20 Daggamle hvide italiener hankyllinger blev indkøbt fra

DK 153145 B

16

Northern Hatcheries (Beaver Dam, WI). De blev fodret med en vitamin D fattig soyaprotein-diæt beskrevet af Omdahl et al. (Biochemistry _10, 2935-2940, 1971) i 3 uger, på hvilket tidspunkt de var vitamin D manglende.

5 Herefter opdeltes de i grupper på 6 kyllinger hver.

En gruppe blev kun behandlet med Wesson olie bærestof peroralt; de andre grupper fik de angivne forbindelser (se tabel 3) opløst i samme mængde Wesson olie hver dag i 7 dage. 24 timer efter den sidste dosis blev alle 10 kyllinger aflivet ved at dreje halsen om på dem. Deres skinneben blev udtaget og renset for vedhængende væv og bindevæv og ekstraheret 24 timer i alkohol efterfulgt af 24 timer i diethylether under anvendelse af en Soxhlet ekstraktor. Herefter tørredes knoglerne til konstant vægt 15 ved 100°C og de vejedes. Herefter foraskedes knoglerne ved 650°C i 24 timer i en muffeovn. Asken blev vejet, og askeindholdet i % i hvert af skinnebenene beregnedes. Resultaterne angives i tabel 3 nedenfor.

T A B E L 3

Mineralisering af rachitiske kyllingeknogler

Forbindelse Mængde Antal dyr % Aske (pmol/d/7 dage) -D 06 32,0 - 1,0 1,25-(0H)2D3 130 6 41,0 - 3,4 lcs-0H-D3 130 6 42,0 - 3,2 * la-0H-D2 1300 6 38,0 - 4,0

Forbindelse (10) 130 6 38,0 - 3,9 20 * Disse værdier er ikke signifikant forskellige.

DK 153145 B

17

Resultaterne viser, at 130 pmol af enten 1,25-(0H)2D^ eller la-OH-D^ eller den omhandlede forbindelse (10) var lige effektive til at forøge mineralindholdet i rachitiske skinneben. For imidlertid at opnå samme ef-5 fektivitetsgrad, var det nødvendigt at anvende 1300 pmol I01-OH-D2· Dette er i overensstemmelse med tidligere resultater, i hvilke det er blevet påvist, at en 10 fold større dosis af la-OH-D^ end la-OH-D^ var nødvendig for at frembringe samme mineralisering af skinneben 10 hos rachitiske kyllinger. Disse resultater viser overraskende, at skønt forbindelse (10) er en analog af lcn-OH-D^, udviser dem uventet en kraftigere virkning ved mineralisering af knogler hos et dyr, som er kendt for ikke at kunne udnytte vitamin D^ forbindelser fysio-13 logisk. Dette er en uventet evne og anvendelse for denne nye analog. Da den uventede in vivo virkning af forbindelse (10) uden tvivl viser sig efter hydroxy lering til den tilsvarende la, 25-di:hydroxyforbindelse (forbindelse (12)) in vivo, vil denne forbindelse, dvs forbindelse 20 (12), der er den 24-desmethylanaloge af det kendte la,25- dihydroxyvitamin D^, bevirke knoglemineralisering hos kyllinger lig med den, der ses med la,25-dihydroxyvitamin D^j den omhandlede vitamin D2 analog vil således være fuldstændig aktiv hos kyllinger. Den høje virkning af 25 forbindelserne (10) og (12) i dyr, der ikke er i stand til at udnytte vitamin D2~type derivater, er hidtil ukendt og en særpræget egenskab ved disse forbindelser.

På grund af denne udprægede biologiske aktivitet kan de omhandlede forbindelser let anvendes som erstatninger 30 for forskellige kendte vitamin D metaboliter ved terapi og profylakse af sygelige tilstande i forbindelse med calciummetabolismen som f.eks. rachitis, hypoparathyroi-disme, osteodystrophi, osteomalacia eller osteoporose hos mennesket eller beslægtede kalkmangelsygdomme (f.eks.

DK 153145 B

18 kælvingsfeber) hos dyr. På samme måde kan disse forbindelser anvendes til behandling af visse cancerlignende sygdomme som f.eks. human leukæmi. På grund af den udprægede og uventede virkning af de omhandlede forbindelser (for-5 bindelse (10) og (12)) til at fremkalde mineralisering af knogler hos fugle (se tabel 3), vil disse forbindelser specielt have anvendelse ved forhindring eller behandling af calcium-ubalance-inducerede tilstande (f.eks. tynde æggeskaller, svaghed i benene hos fjerkræ), hvor alle 10 de kendte vitamin derivater kun viser ringe virkning.

Til terapeutiske formål kan forbindelserne administreres på almindelig måde og i passende form afhængig af den valgte administreringsmåde. Forbindelserne kan formuleres med et hvilket som helst acceptabelt og uskadeligt 15 farmaceutisk bærestof i form af piller, tabletter, gela tinekapsler eller suppositorier eller som opløsninger, emulsioner, dispersioner eller suspensioner i uskadelige opløsningsmidler eller olier, idet disse præparater også kan indeholde andre terapeutisk aktive og helbredende 20 bestanddele afhængig af det specielle formål. Til human brug administreres forbindelserne med fordel i mængder på fra 0,3 til lO^ug per dag, idet den specifikke dosis afhænger af den specielle administrerede forbin-- delse, af den sygdom, der skal behandles, og af tilstanden 25 og responsen hos den patient, der skal behandles, således som det er velkendt inden for fagområdet.

DK 153145 B

19

Reaktionsskema I

OH

^ .CHO

AcO^s^P^, *e0 \ /NV0 Y Ϊ* i s y-%.

u> ® I

ΗΟ"^ν^/ JH\_ Λ /=0 (d) ^-NPt* ca> yvy ν^Ύ Y -u*°'x

C5) (S)Y-H

(1)Y-0H

>^>k.

,o""^OH H0"",^J"0X

(S) X*Ac '(9) X * Ac

<10)X-H (ii)X*H

V^Yoh

H0^kA0H

Claims (6)

1. 2. Analog ifølge krav 1, kendetegnet 5 ved, at R betegner hydrogen.
2. 3. Analog ifølge krav 2, kendetegnet ved, at den har krystallinsk form.
3. 4. Analog ifølge krav 1, kendetegnet ved, at R betegner hydroxy.
4. 5. Analog ifølge krav 4, kendetegnet ved, at den har krystallinsk form.
5. 6. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det består af forbindelsen ifølge krav 2 og et farmaceutisk acceptabelt hjælpestof.
6. 7. Farmaceutisk præparat, kendetegnet ved, at det består af forbindelsen ifølge krav 4 og et farmaceutisk acceptabelt hjælpestof.