DE3590021C2 - 1alpha-Hydroxyvitamin D-Derivat und dieses enthaltendes Arzneimittel - Google Patents

Description

Die Erfindung betrifft eine biologisch aktive, neue 1α,25- dihydroxylierte Vitamin D-Verbindung mit einer 22,23-cis- Doppelbindung in der Seitenkette, sowie ein diese Verbindung enthaltendes Arzneimittel.

Die Calcium- und Phosphat-Homöostase bei Tieren und Menschen wird durch Vitamin D-Metaboliten reguliert. Dabei wird die Verbindung 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ allgemein als der aktivste und bedeutsamste vom Vitamin D abgeleitete Regulator des normalen Calcium- und Phosphat-Gleichgewichts angesehen. Dieser natürliche Metabolit und die Verbindungen, die ihm strukturell verwandt sind, sind somit von großem pharmazeutischen Interesse als wirksame Mittel zur Verhinderung und Behandlung von Knochenerkrankungen und verwandten Unregelmäßigkeiten des Calcium-Metabolismus. Zusätzlich zu den natürlichen D₃-Metaboliten sind in den letzten Jahren eine Reihe von Verbindungen hergestellt worden, die aufgrund ihrer hohen Wirksamkeit Anwendung finden oder als therapeutische Mittel sehr vielversprechend sind, wozu 1α-Hydroxyvitamin D₃, 1α- Hydroxyvitamin D₂, 1α,25-Dihydroxyvitamin D₂ und bestimmte fluorierte Analogverbindungen gehören (US-Patente 37 41 996, 39 07 843, 38 80 894, 42 26 788, 43 58 406). Die meisten der bekannten aktiven Analogverbindungen sind durch den Typ einer Sterol- Seitenkette charakterisiert, wie sie beim Vita­ min D₃ auftritt (d. h. gesättigte Seitenkette). Bekannte Analogverbindungen mit einer 22,23-ungesättigten Seiten­ kette werden durch die Verbindungen der Vitamin D₂-Serie repräsentiert (d. h. 22,23-trans-ungesättigt mit einem C-24-Methylsubstituenten). Sie umfassen zusätzlich zu den oben angegebenen Verbindungen 25-Hydroxyvitamin D₂ (US-PS 35 85 221) und die 24- und 24,25-Dihydroxyderivate (Jones et al., Arch. Biochem. Biophys. 202, 450 (1980)) sowie drei Verbindungen ohne den 24-Methylsubstituenten (US-PS 37 86 062; Bogoslovskii et al., J. Gen. Chem. USSR, 48(4) 828 (1978); Chem. Abstr. 89, 163848j, 209016s).

Es wurde nun eine neue Analogverbindung des Vitamin D ge­ funden, welche durch die nachstehende Formel I darge­ stellt wird

und ein 1α,3β(9,10-Secocholesta-5Z,7E,10(19))-22Z- tetraen-1,3,25-triol darstellt.

Diese neue Verbindung ist charakterisiert durch eine 22,23-Doppelbindung in der Seitenkette mit der cis(oder Z)-Geometrie. Aufgrund der Gegenwart dieser 22Z-Doppel­ bindung, welche zu einer Seitenkettengeometrie führt, die recht unterschiedlich ist von derjenigen der Verbin­ dungen mit der normalen gesättigten Seitenkette (bei­ spielsweise beim 1α,25-Dihydroxvitamin D₃) oder einer 22,23-trans-(22E)-ungesättigten Seitenkette (beispiels­ weise in 1α,25-Dihydroxyvitamin D₂), wurde angenommen, daß dieses cis-ungesättigte Produkt eine geringe biolo­ gische Aktivität aufweisen würde, sofern überhaupt eine biologische Aktivität vorhanden wäre. Überraschenderweise zeigt diese Verbindung trotz ihrer geänderten Seitenkettenstruktur eine hohe Aktivität; sie ist so aktiv wie 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ in seiner Fähigkeit, die Serum-Calcium-Niveaus bei Testtieren zu erhöhen.

Die erfindungsgemäße Verbindung gemäß obiger Formel I wurde aus einem 22Z-Dehydrovitamin D-Vorläufer mit der nachstehenden Formel II hergestellt durch enzymatische Hydroxylierung in vitro am Kohlenstoffatom 25 unter Ver­ wendung einer Leber-Homogenat-Präparation von Ratten mit einem Vitamin D-Mangel.

Das folgende Vorgehen wurde angewendet: Männliche Wean­ ling-Ratten wurden mit einer Diät mit geringem Calcium- und Vitamin D-Mangel, wie sie von Suda et al. [J. Nutr. 100, 1049 (1970)] beschrieben wurde, während zwei Wochen ge­ füttert. Sie wurden durch Enthauptung getötet und ihre Lebern wurden entfernt. Ein 20% (w/v)-Homogenat wurde in eiskalter 0,25 M Sucrose hergestellt. Die Inkubation wurde durchgeführt in 10 ml Inkubationsmedium in einem 125 ml fassenden Erlenmeyer-Kolben der ein Aliquot des Leberhomogenats enthielt, bestehend aus 1 g Gewebe, 0,125 M Sucrose, 50 mM Phosphatpuffer (pH 7,4), 22,4 mM Glucose-6-phosphat, 20 mM ATP, 160 mM Nicotinamid, 25 mM Succinat, 0,4 mM NADP, 5 mM MgCl₂, 0,1 M KCl und 0,5 Ein­ heiten Glucose-6-phosphat-dehydrogenase. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 400 µg des Substrats, der obigen Verbindung II, gelöst in 100 µl 95%igen Ethanols, initiiert. Das Inkubationsgemisch wurde bei 37°C inku­ biert unter Schütteln mit 80 Schwingungen/Minute während 3 Stunden. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 20 ml Methanol und 10 ml Dichlormethan abgebrochen. Nach weite­ rer Zugabe von 10 ml Dichlormethan wurde die organische Phase gesammelt, während die wäßrige Phase mit 10 ml Dichlormethan erneut extrahiert wurde. Die organischen Phasen aus den gesamten drei Extraktionen wurden vereint und mit einem Rotationsverdampfer eingedampft. Der Rück­ stand, welcher das gewünschte Produkt enthielt, wurde in 1 ml eines Gemisches von CHCl₃ : Hexan (65 : 35) gelöst und auf eine mit Sephadex LH-20 gepackte Säule (0,7 cm · 14 cm) aufgebracht, äqulibriert und mit demselben Lösungsmittel eluiert. Die ersten 10 ml wurden verworfen, während die folgenden 40 ml gesammelt und eingedampft wurden. Der Rückstand wurde sodann gelöst in 8%igem 2-Propanol in Hexan und einer Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie unterworfen (Modell LC/GPC 204 HPLC, Firma Waters Associa­ tes, Medford, MA) unter Verwendung einer Zorbax-SIL-Säule (4,6 mm · 25 cm, DuPont, Wilmington, Delaware), die unter einem Druck von 70,3 kg/cm² mit einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min betrieben wurde. Das gewünschte 25-hydroxy­ lierte Produkt wurde bei 44 ml eluiert. Dieses Produkt wurde weiter durch Hochleistungs-Flüssigkeitschromato­ graphie gereinigt, wobei eine Umkehrphasen-Säule verwendet wurde (Richrosorb Rp-18, 4,6 mm · 25 cm, E. Merck, Darm­ stadt, Deutschland), die unter einem Druck von 84 kg/cm² und einer Fließgeschwindigkeit von 2 ml/min betrieben wurde. Die Säule wurde mit 22% H₂O in Methanol eluiert und die Verbindung wurde bei 50 ml eluiert. Dieses Produkt wurde ferner durch HPLC gereinigt, wobei die Zorbax-SIL- Säule und die oben beschriebenen Bedingungen angewandt wurden. Das erhaltene Produkt wurde sodann der physikali­ schen Charakterisierung unterworfen.

Charakterisierung des Produkts

Die UV-Absorption des Produkts in 95%igem Ethanol zeigte ein λ_max=265 nm und ein λ_min=228 nm, wodurch das Vor­ handensein des 5,6-cis-Trien-chromophoren angezeigt wurde.

Das Massenspektrum der Substanz enthält ein Molekülion bei m/e 414, wie es für ein 25-hydroxyliertes Produkt er­ forderlich ist. Die Eliminierung von einem und zwei Mole­ külen H₂O ergibt Fragmentionen bei m/e 396 und 378. Der Verlust der gesamten Steroid-Seitenkette (Abspaltung der C₁₇/C₂₀-Bindung) führt zu demm Fragment m/e 287, welches durch Eliminierung von einem oder zwei Molekülen H₂O zu den Peaks bei m/e 269 und 251 führt. Das Spektrum zeigt deutliche Peaks bei m/e 152 und 134 (152-H₂O), welche Ring A-Fragmente repräsentieren und Hinweise für 1α,3β-Di­ hydroxyvitamin D-Verbindungen sind. Zusätzlich zeigt das Spektrum einen sehr deutlichen Fragmentpeak bei m/e 59, welcher sich aus der Abspaltung der C₂₄/C₂₅-Bindung ergibt. Das Vorhandensein diese Ions bestätigte die Gegenwart der 25-Hydroxygruppe in dem Produkt. Somit bestätigten diese Daten die Struktur des Produktes, welches als die 1α,25- dihydroxylierte Verbindung erhalten wurde, welche durch die obige Struktur I dargestellt ist.

Biologische Aktivität

Die biologischen Aktivitäten der neuen Analogverbindung wurden durch in vivo-Versuche bei Ratten demonstriert. Männliche Weanling-Ratten wurden mit einer Diät mit einem geringem Calcium- und Vitamin D-Mangel nach Suda et al. (obige Literaturangabe) für 3 Wochen gefüttert. Sie wurden sodann in Gruppen von jeweils 5 Ratten eingeteilt. Die Ratten in einer Kontrollgruppe empfingen 0,05 ml 95%igen Ethanols intrajugular, während die Ratten in den anderen Gruppen 325 pMol der Verbindung I oder von 1α,25-Dihydroxy­ vitamin D₃ gelöst in 0,05 ml 95%igem Ethanol erhielten. 18 Stunden später wurden sie durch Enthauptung getötet und das Blut wurde gesammelt. Das Serum, welches durch Zentrifugieren des Blutes erhalten wurde, wurde mit 0,1%iger Lanthanchlorid-Lösung (1 : 20) verdünnt und die Serum-Calcium-Konzentration wurde mit einem Atomabsorp­ tions-Spektrophotometer ermittelt. Die Ergebnisse sind in der nachstehenden Tabelle dargestellt:

Ansteigen der Serum-Calcium-Konzentration als Reaktion auf eine Einzeldosis von 325 pMol der Verbindung I oder von 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃, welche 18 Stunden vor der Tötung verabreicht werden

Die obigen Ergebnisse zeigen, daß die neue Analogverbin­ dung in hohem Maße wirksam ist und eine biologisch Akti­ vität aufweist, die im wesentlichen zu derjenigen von 1α,25-Dihydroxyvitamin D₃ äquivalent ist.

Aufgrund dieser hohen Wirksamkeit wird diese erfindungs­ gemäße Verbindung als ein therapeutisches Mittel Anwendung finden in der Therapie oder Prophylaxe von Erkrankungen derartig verschiedener Arten, wie Rachitis, Hypopara­ thyroidismus, Knochendystrophie, Knochenerweichung oder Osteoporose beim Menschen oder zur Behandlung von ver­ wandten Calcium-Mangelerkrankungen (z. B. Milchfieber, Beinschwäche, geringe Eierschalenstärke) bei Tieren. In gleicher Weise kann die Verbindung bei der Behandlung von bestimmten malignen Erkrankungen angewandt werden, wie bei Leukämie beim Menschen.

Zu therapeutischen Zwecken kann die Verbindung nach jeder herkömmlichen Verabreichungsart und in jeder geeigneten Form für die ausgewählte Verabreichungsweise angewandt werden. Die Verbindung kann mit jedem verträglichen und unschädlichen pharmazeutischen Träger in Form von Pillen, Tabletten, Gelatinekapseln oder Suppositorien oder in Form von Lösungen, Emulsionen, Dispersionen oder Suspensionen in unschädlichen Lösungsmitteln oder Ölen formuliert werden. Derartige Formulierungen können auch andere therapeutisch wirksame und vorteilhafte Bestandteile enthalten, wie sie für die spezifischen Anwendungen geeignet sein können. Für Anwendung beim Menschen wird die Verbindung vorteilhafterweise in Mengen von 0,25 bis 10 µg pro Tag verabreicht, wobei die spezifische Dosierung unter Berücksichtigung der zu behandelnden Krankheit und der medizinischen Entwicklung, des Zustands und der Reaktion des Patienten ausgewählt wird.

Das 22Z-Dehydro-Vorläufersubstrat, die obige Verbindung II, welche für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung erforderlich ist, wird selber nach dem Verfahrensschema I und gemäß nachfolgender Beschreibung hergestellt. In der Beschreibung beziehen sich die Verbindungsbezeichnungen mit arabischen Ziffern (z. B. (1), (2), (3) etc.) auf die so durchnumerierten Strukturen in dem Verfahrensschema. Das gewünschte Substrat (Verbindung II) für die oben beschriebene 25-Hydroxylierungsreaktion wird durch die arabische Ziffer (11) im Verfahrensschema I und in der folgenden Beschreibung identifiziert.

(22Z)-3β-(Methoxymethoxy)-5α,8α-(4-phenyl-1,2-urazol)- cholesta-6,22-dien (2)

Isopentylphosphoniumbromid [(CH₃)₂CHCH₂CH₂PPh₃Br] (1,67 g, 4,04 mMol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (73 ml) wurde mit n-Butyllithium (1,7 M Lösung in Hexan, 2,42 ml, 4,11 mMol) bei 3-5°C unter Rühren behandelt. Nach 1stündigem Rühren bei Raumtemperatur wurde die orange-rote Lösung auf 3°C gekühlt und der Aldehyd (1) (1,84 g, 3,36 mMol) in wasserfreiem Tetrahydrofuran (24 ml) zugesetzt. Das farblose Reaktionsgemisch wurde über Nacht bei Raumtemperatur gerührt und sodann in Wasser eingegossen und mit Benzol extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit 5% HCl, gesättigtem Natriumbicarbonat und Wasser gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter vermindertem Druck zu einem Öl eingeengt, welches über einer Säule mit Silikagel gereinigt wurde. Die Eluation mit einem Gemisch von Benzol-Ether (94 : 6) lieferte das Addukt (2) (1,38 g, 68%) als einen Schaum: NMR δ 0,83 (3H, s, 18-H₃), 0,89 und 0,91 (6H, jeweils d, J=6,8 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 0,97 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H₃), 0,98 (3H, s, 19-H₃), 3,30 (1H, dd, J₁=4,4 Hz, J₂=14 Hz, 9-H), 3,38 (3H, s, OCH₃), 4,33 (1H, m, 3-H), 4,70 und 4,81 (2H, ABq, J=6,8 Hz, OCH₂O), 5,21 (2H, br m, 22-H und 23-H), 6,23 und 6,39 (2H, ABq, J=8,5 Hz, 6-H und 7-H), 7,41 (5H, br m, Ar-H); IR: 1756, 1703, 1601, 1397, 1046 cm⁻¹; Massenspektrum m/z 601 (M⁺, 1%), 426 (4), 364 (61), 349 (16), 253 (18), 251 (18), 119 (PhNCO, 100).

(22Z)-5α,8α-(4-Phenyl-1,2-urazol)cholesta-6,22-dien-3β-ol (3)

Eine Lösung des Addukts (2) (601 mg, 1 mMol) und p-Toluolsulfonsäure (523 mg, 2,75 mMol) in einem Gemisch aus Methanol (20 ml)-THF (12 ml) wurde 2 Tage bei Raumtemperatur gerührt. Das Reaktionsgemisch wurde in gesättigtes Natriumbicarbonat eingegossen und einige Male mit Benzol extrahiert. Die Extrakte wurden mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter vermindertem Druck eingedampft. Die Reinigung des Rohprodukts durch Säulenchromatographie (Benzol-Ether 70 : 30 als Eluationsmittel) ergab das Hydroxyaddukt (3) (550 mg, 99%) als einen Schaum: NMR δ 0,83 (3H, s, 18-H₃), 0,89 und 0,91 (6H, jeweils d, J=6,8 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 0,95 (3H, s, 19-H₃), 0,98 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H₃), 3,16 (1H, dd, J₁=4,4 Hz, J₂=1,4 Hz, 9-H), 4,44 (1H, m, 3-H), 5,22 (2H, br m, 22-H und 23-H), 6,22 und 6,39 (2H, ABq, J=8,5 Hz, 6-H und 7-H), 7,40 (5H, br m, Ar-H); IR: 3447, 1754, 1700, 1600, 1397 cm⁻¹; Massenspektrum m/z 557 (M⁺, 1%), 382 (35), 349 (33), 253 (20), 251 (33), 119 (100), 55 (82).

(22Z)-Cholesta-5,7,22-trien-3β-ol (4)

Das Addukt (3) (530 mg, 0,95 mMol) wurde in das Dien (4) überführt durch Reduktion mit Lithiumaluminiumhydrid (1 g) in Tetrahydrofuran (60 ml) unter Rückfluß für 18 Stunden. Nach der herkömmlichen Aufarbeitung wurde das Produkt durch Chromatographie über Kieselerde gereinigt (Benzol-Ether 94 : 6 als Eluationsmittel), um das reine Dien (4) (290 mg, 76%) nach der Umkristallisation aus Ethanol zu ergeben: Schmelzpunkt 148-151°C; [α]=-132° (c=0,9, CHCl₃); NMR δ 0,66 (3H, s, 18-H₃), 0,90 und 0,91 (6H, jeweils d, J=6,8 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 0,96 (3H, s, 19-H₃), 0,98 (3H, d, J=6,9 Hz, 21-H₃), 3,64 (1H, m, 3-H), 5,20 (2H, br m, 22-H und 23-H), 5,39 und 5,57 (2H, ABq, J=6 Hz, 7-H und 6-H); UV_max 281 nm; IR: 3346, 1463, 1375, 1364, 1067, 1040, 831 cm⁻²; Massenspektrum m/z 382 (M⁺, 100), 349 (65), 323 (32), 271 (15), 253 (30).

(5Z,7E,22Z)-9,10-Secocholesta-5,7,10(19),22-tetraen-3β-ol (5)

Die Bestrahlung des 5,7-Diens (4) (150 mg, 0,39 mMol), welches in Ether (120 ml) und Benzol (30 ml) (mit Argon für 40 Minuten entgast) gelöst war, wurde bei 0°C für 13 Minuten unter Verwendung einer UV-Lampe und eines Vycor-Filters durchgeführt. Die HPLC (1% von 2-Propanol in Hexan) des erhaltenen Gemisches lieferte das Provitamin (56,9 mg, 38%) als ein farbloses Öl: NMR δ 0,75 (3H, s, 18-CH₃), 0,90 und 0,91 (6H, jeweils d, J=6,7 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 0,99 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H₃), 1,64 (3H, s, 19-H₃), 3,90 (1H, m, 3-H), 5,20 (2H, br m, 22-H und 23-H), 5,69 und 5,95 (2H, ABq, J=12 Hz, 7-H und 6-H); UVλ_max 261 nm, λ_min 234 nm.

Die thermische Isomerisierung dieser Provitamin-Zwischenverbindung (56 mg, 0,15 mMol) in unter Rückfluß siedendem Ethanol (3 Stunden) ergab die ölige Vitamin-Analogverbindung (5) (43 mg, 77%) nach der Trennung mittels HPLC. NMR δ 0,60 (3H, s, 18-H₃), 0,89 und 0,90 (6H, jeweils d, J=6,7 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 0,97 (3H, d, J=6,6 Hz, 21-H₃), 3,96 (1H, s, 3-H), 4,82 und 5,05 (2H, jeweils schmales Multiplet, 19-H₂), 5,20 (2H, br m, 22-H und 23-H), 6,04 und 6,24 (2H, ABq, J=11,4 Hz, 7-H und 6-H); UVλ_max 265,5 nm, λ_min 228 nm; IR: 3427, 1458, 1379, 1048, 966, 943, 892 cm⁻¹; Massenspektrum m/z 382 (M⁺, 21), 349 (5), 271 (8), 253 (14), 136 (100), 118 (82). Die Vitamin-Analogverbindung (5) ist eine bekannte Verbindung (Bogoslovskii et al., obige Literaturangabe).

1-Hydroxylierung der Verbindung (5)

Frisch umkristallisiertes p-Toluolsulfonylchlorid (50 mg, 0,26 mMol) wurde zu einer Lösung des Vitamins (5) (50 mg, 0,13 mMol) in wasserfreiem Pyridin (300 µl) zugesetzt. Nach 30 Stunden bei 4°C wurde das Reaktionsgemisch in Eis/gesättigte NaHCO₃ unter Rühren eingegossen. Das Gemisch wurde 15 Minuten gerührt und mit Benzol extrahiert. Der organische Extrakt wurde mit gesättigter NaHCO₃, gesättigtem Kupfersulfat und Wasser gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter vermindertem Druck eingeengt, um das ölige Tosylat (6) zu ergeben. Das rohe Tosylat (6) wurde mit NaHCO₃ (150 mg) in wasserfreiem Methanol (10 ml) behandelt, und das Gemisch wurde 8,5 Stunden bei 55°C gerührt. Nach dem Kühlen und dem Einengen auf 2 ml wurde das Gemisch mit Benzol (80 ml) verdünnt, mit Wasser gewaschen, getrocknet (Na₂SO₄) und unter vermindertem Druck eingeengt. Die ölige 3,5-Cyclovitamin-D-Verbindung (7), die so erhalten wurde, war von hinreichender Reinheit, um für die folgende Oxidationsstufe ohne jegliche Reinigung verwendet zu werden. Zu einer heftig gerührten Suspension von SeO₂ (5,1 mg, 0,046 mMol) in wasserfreiem CH₂Cl₂ (5 ml) wurde tert.-Butylhydroperoxid (16,5 µl, 0,118 mMol) zugesetzt. Nach 30 Minuten wurde wasserfreies Pyridin (50 µl) zugesetzt, und das Gemisch wurde weitere 25 Minuten bei Raumtemperatur gerührt, mit CH₂Cl₂ (3 ml) verdünnt und auf 0°C gekühlt. Das rohe 3,5-Cyclovitamin-Produkt (7) in CH₂Cl₂ (4,5 ml) wurde sodann zugegeben. Die Reaktion schritt bei 0°C für 15 Minuten fort, und das Reaktionsgemisch wurde sodann langsam (30 Minuten) auf Raumtemperatur erwärmen gelassen. Das Gemisch wurde in einen Trenntrichter überführt und mit 30 ml 10%iger NaOH geschüttelt. Ether (150 ml) wurde zugesetzt, und die abgetrennte organische Phase wurde mit 10%iger NaOH, Wasser gewaschen und über Na₂SO₄ getrocknet. Die Einengung zur Trockne unter vermindertem Druck ergab einen gelben öligen Rückstand, der gereinigt wurde über einer Silikagel-TLC-Platte unter Entwicklung mit 7 : 3 Hexan-Ethylacetat, und das 1-Hydroxycyclovitamin-Produkt (20 mg, 37%) ergab: NMR δ 0,59 (3H, s, 18-H₃), 0,63 (1H, m, 3-H), 0,89 und 0,90 (6H, jeweils d, J=6,9 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 0,96 (3H, d, J=6,9 Hz, 21-H₃), 3,25 (3H, s, -OCH₃), 4,17 (2H, m, 1-H und 6-H), 4,96 (1H, d, J=9,3 Hz, 7-H), 5,1-5,4 (4H, br m, 19-H₂, 22-H und 23-H); Massenspektrum m/z 412 (M⁺, 26), 380 (48), 339 (22), 269 (28), 245 (20), 135 (100). Dieses Produkt setzte sich hauptsächlich zusammen aus der 1α-Hydroxycyclovitamin-D-Verbindung der Struktur (8), wie auch aus einer geringen Menge des entsprechenden 1β-Hydroxy-Epimeren. Diese Komponenten können in dieser Stufe getrennt werden, sofern dies gewünscht wird, jedoch ist eine derartige Trennung nicht erforderlich.

Das nach dem oben beschriebenen Verfahren erhaltene 1-Hydroxycyclovitamin-Produkt (18 mg) wurde erhitzt (55°C/15 min) in Eisessig (0,8 ml), das Gemisch wurde neutralisiert (Eis/gesättigte NaHCO₃) und mit Benzol und Ether extrahiert, um nach der HPLC (1,5% von 2-Propanol in Hexan als Eluationsmittel)-Trennung die reinen 1α-Hydroxy-3β-acetoxyvitamine (9) (6,60 mg, 34%, Eluation bei 42 ml) und (10) (4,20 mg, 22%, Eluation bei 50 ml) zu ergeben.

Verbindung (9): NMR δ 0,60 (3H, s, 18-H₃), 0,90 und 0,92 (6H, jeweils d, J=7,0 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 0,97 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H₃), 2,04 (3H, s, -OCOCH₃), 4,41 (1H, m, 1-H), 5,02 (1H, schmales Multiplet, 19-H), 5,1-5,4 (4H, br m, 3-, 19-, 22- und 23-H), 6,03 und 6,35 (2H, ABq, J=11,4 Hz, 7-H und 6-H); UVλ_max 264,5 nm, λ_min 227,5 nm; Massenspektrum m/z 440 (M⁺, 10), 380 (72), 362 (7), 269 (31), 251 (12), 135 (100), 134 (99).

Verbindung (10): NMR δ 0,60 (3H, s, 18-H₃), 0,90 und 0,91 (6H, jeweils d, J=7,0 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 0,97 (3H, d, J=6,9 Hz, 21-H₃), 2,05 (3H, s, -OCOCH₃), 4,49 (1H, m, 1-H), 5,00 und 5,14 (2H, jeweils schmales Multiplet, 19-H₂), 5,20 (3H, br m, 3-, 22- und 23-H), 5,82 und 6,59 (2H, ABq, J=12,0 Hz, 7-H und 6-H); UVλ_max 270 nm, λ_min 228 nm; Massenspektrum m/z 440 (M⁺, 4), 380 (30), 269 (10), 135 (100), 134 (52).

Hydrolyse des 3β-Acetoxyrestes in den Verbindungen (9) und (10)

Jede der 3β-Acetoxy-Derivate (9) oder (10) wurde getrennt hydrolysiert unter Verwendung des gleichen Verfahrens. Eine Lösung von 3β-Acetoxyvitamin (0,7-6 mg) in Ethanol (0,1 ml) wurde mit 10% KOH in Methanol (0,8 ml) behandelt, und das Gemisch wurde für 1 Stunde auf 50°C erhitzt. Nach der üblichen Aufarbeitung und der abschließenden HPLC-Reinigung (8% von 2-Propanol in Hexan als Eluationsmittel) wurden die entsprechenden 1-Hydroxyvitamine erhalten, nämlich:

Verbindung (11): NMR δ 0,59 (3H, s, 18-H₃), 0,89 und 0,90 (6H, jeweils d, J=7,0 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 0,96 (3H, d, J=6,8 Hz, 21-H₃), 4,23 (1H, m, 3-H), 4,43 (1H, m, 1-H), 5,00 (1H, schmales Multiplet, 19-H), 5,1-5,4 (3H, br m, 19-, 22- und 23-H), 6,02 und 6,39 (2H, ABq, J=11,4 Hz, 7-H und 6-H); UVλ_max 264,5 nm, λ_min 227,5 nm; Massenspektrum m/z 398 (M⁺, 21), 380 (8), 287 (6), 269 (7), 251 (5), 152 (36), 134 (100) (Eluationsvolumen 39 ml).

Verbindung (12): NMR δ 0,61 (3H, s, 18-H₃), 0,89 und 0,91 (6H, jeweils d, J=7,0 Hz, 26-H₃ und 27-H₃), 0,97 (3H, d, J=6,9 Hz, 21-H₃), 4,25 (1H, m, 3-H), 4,51 (1H, m, 1-H), 4,98 und 5,13 (2H, jeweils schmales Multiplet, 19-H₂), 5,21 (2H, br m, 22-H und 23-H), 5,89 und 6,59 (2H, ABq, J=11,5 Hz, 7-H und 6-H); UVλ_max 273 nm, λ_min 229,5 nm; Massenspektrum m/z 398 (M⁺, 17), 380 (4), 287 (5), 269 (5), 251 (4), 152 (29), 134 (100) (Eluationsvolumen 38 ml).

In dem oben beschriebenen Verfahren wurde die Hochdruck-Flüssigchromatographie (HPLC) durchgeführt mittels einer Vorrichtung der Firma Waters Associates, Modell ALC/GPC 204 unter Verwendung einer Säule mit Zorbax-Sil (DuPont) (6,2-mm×25-cm-Säule, Fließgeschwindigkeit 4 ml/min, 1500 psi). Die Säulenchromatographie wurde durchgeführt mit Silikagel 60, 70-230 mesh ASTM (Merck). Die präparative Dünnschichtchromatographie (TLC) wurde durchgeführt über Silica 60 PF-254 (Platten mit 20×20 cm, 1 mm Silicagel). Die Bestrahlungen wurden durchgeführt mit einer Quecksilberdampf-Bogenlampe Hanovia 608A36, welche mit einem Vycor-Filter ausgerüstet war. Alle Reaktionen werden vorzugsweise unter einer Inertgasatmosphäre (z. B. Argon) durchgeführt.

Die erfindungsgemäße Verbindung kann, sofern dies gewünscht wird, in kristalliner Form durch Umkristallisation aus geeigneten Lösungsmitteln, wie Hexan, Ethern und Alkoholen (absolut oder wäßrig) und Gemischen davon, erhalten werden.

Verfahrensschema I

Claims (2)

1. 1α,3β(9,10-Secocholesta-5Z,7E,10(19))-22Z-tetraen-1,3,25-triol

2. Arzneimittel, enthaltend die Verbindung gemäß Anspruch 1 zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Exzipienten.