DE3448154C2

DE3448154C2 -

Info

Publication number: DE3448154C2
Application number: DE3448154A
Authority: DE
Inventors: Masanori Tachikawa Tokio/Tokyo Jp Ikuzawa; Yoshiharu Oguchi; Kenichi Tokio/Tokyo Jp Matsunaga; Noriyuki Sagamihara Kanagawa Jp Toyoda; Takao Machida Tokio/Tokyo Jp Furusho; Takayoshi Tokio/Tokyo Jp Fujii; Chikao Kunitachi Tokio/Tokyo Jp Yoshikumi
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1983-08-11
Filing date: 1984-08-10
Publication date: 1989-11-02
Also published as: DE3448152C2; DE3429551C2; DE3448153C2; US5008243A; US4820689A; DE3429551A1; DE3448144C2; DE3448155C2; DE3448148C2; DE3448150C2; DE3448151C2; DE3448145C2; DE3448149C2

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Glycoproteinen mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 300 000 und 18 bis 38 Gew.-% Proteinanteil, hergestellt durch Kultivieren von Coriolus versicolor (Fr.) Quel., zur Behandlung von Thrombose.

Das von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (FERM-P Nr. 2 412) stammende Glycoprotein ist auf dem Markt bereits erhältlich als Antitumor-Arzneimittel unter dem Warenzeichen Krestin.

Die Stämme Coriolus versicolor (Fr.) Quel. FERM-P Nr. 2 412 und FERM-P Nr. 2 414 wurden von dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology bei der American Type Culture Collection am 30. Juli 1979 unter der ATCC Nr. 20 547 und der ATCC Nr. 20 545 hinterlegt.

Da das Glycoprotein eine geringe Säugetiertoxizität aufweist und die Intestinalmikroflora nicht stört, kann eine das Glycoprotein als aktiven Bestandteil (Wirkstoff) enthaltende pharmazeutische Zubereitung über einen langen Zeitraum hinweg verabreicht werden. Außerdem ist das Glycoprotein frei von der Gefahr der Verursachung von Mißbildungen und/oder allergischen Reaktionen und daher stellt das Glycoprotein eine extrem sichere (gefahrlose) Substanz dar.

Das Glycoprotein ist eine bereits bekannte Substanz und ist beispielsweise in den japanischen Patentpublikationen Nr. 17 149/1971, 36 322/1976, 14 274/1981, 14 276/1981, 39 288/1981 und der japanischen Patentanmeldung 57-1 34 496 beschrieben, wonach das Glycoprotein durch Kultivieren einer Basidiomyceten-Fungi-Species, die zum Genus Coriouls gehört, Extrahieren der auf diese Weise stark vermehrten Mycele oder Fruchtkörper mit heißem Wasser oder einer wäßrigen Alkalilösung und Entfernen der niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 erhalten, wobei die auf diese Weise in Form eines Extrakts erhaltene Substanz etwa 18 bis 38 Gew.-% Proteine enthält und ein Molekulargewicht von 5000 bis 300 000, bestimmt nach dem Ultrazentrifugenverfahren, aufweist.

Zahlreiche pharmakologische Eigenschaften sind in der Firmenschrift "Outline of PSK", Seite 28-30 beschrieben.

Aus der DE-AS 26 59 808 ist die Verwendung dieses Glycoproteins zur Bekämpfung von Tumoren bekannt.

Das aus den Mycelen von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. stammende Glycoprotein hat eine leberbraune Farbe und einen Stickstoffgehalt von 2 bis 8%, in vielen Fällen von 3 bis 6%. Verschiedene Farbreaktionstests, die mit dem Glycoprotein durchgeführt wurden, ergaben die folgenden Ergebnisse:

α-Naphthol-Schwefelsäure-Reaktion (Molish-Reaktion)
Purpurrot
Indol-Schwefelsäure-Reaktion (Dische-Reaktion)	Braun
Anthron-Schwefelsäure-Reaktion	Grünlich-Blau
Phenol-Schwefelsäure-Reaktion	Braun
Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion	Purpurrot-Braun
Lowry-Folin-Verfahren	Blau
Ninhydrin-Reaktion nach der Chlorwasserstoffsäure-Hydrolyse	Grünlich-Blau

Das Molekulargewicht des Glycoproteins beträgt 5000 bis 300 000, gemessen unter Anwendung eines Ultrazentrifugenverfahrens. Das Glycoprotein enthält etwa 18 bis 38 Gew.-% Proteine.

Der Saccharidanteil des Glycoproteins besteht hauptsächlich aus β-D-Glycan und die Struktur des Glycan-Restes ist eine verzweigte Struktur, die 1 → 3-, 1 → 4- und 1 → 6-Bindungen aufweist. Von den Aminosäuren, die den Proteinanteil des Glycoproteins bilden, ist die Menge der sauren Aminosäuren, wie z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure und dgl., und diejenige der neutralen Aminosäuren, wie Valin, Leucin und dgl., verhältnismäßig groß und die Menge der basischen Aminosäuren, wie z. B. Lysin, Argenin und dgl., ist verhältnismäßig klein. Das Glycoprotein ist in Wasser löslich und in Hexan, Benzol, Chloroform, Methanol und Pyridin fast unlöslich. Das Glycoprotein zersetzt sich langsam bei einer Temperatur von etwa 120°C, wenn es erhitzt wird.

Wie aus der folgenden Tabelle I ersichtlich, ist die Säugetier-Toxizität des Glycoproteins extrem niedrig und es ruft bei Tieren kaum irgendwelche Nebenwirkungen hervor. Insbesondere ist es bekannt als eine sehr sichere (gefahrlose) Substanz für Lebewesen.

Tabelle I

Die in dem Test zur Bestimmung des obengenannten akuten Toxizitätswertes (LD₅₀ mg/kg) verwendeten Mäuse waren solche vom Stamm ICR-JCL, 4 bis 5 Wochen nach der Geburt und mit einem Körpergewicht von 21 bis 24 g. Die in dem gleichen Test verwendeten Ratten waren solche vom Stamm Donryu, 4 bis 5 Wochen nach der Geburt und mit einem Körpergewicht von 100 bis 150 g. Das Glycoprotein wurde in einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst und auf jedem in der Tabelle I angegebenen Weg verabreicht. Nach der Verabreichung wurden die generellen Symptome, die Mortalität und das Körpergewicht jedes der so behandelten Tiere 7 Tage lang beobachtet und dann wurden sie getötet und einer Autopsie unterworfen.

Wie in der Tabelle I angegeben, wurde sowohl im Falle der Mäuse als auch im Falle der Ratten selbst bei der maximalen Dosis, die verabreicht werden konnte, kein Todesfall festgestellt, so daß das Glycoprotein für Lebewesen extrem sicher (gefahrlos) ist bis zu einem solchen Grade, daß der Wert für die LD₅₀ tatsächlich nicht festgestellt werden konnte.

Als Ergebnis der Prüfung der physiologischen und pharmazeutischen Eigenschaften des von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. stammenden Glycoproteins wurde gefunden, daß das Glycoprotein eine antithrombotische Aktivität aufweist und darauf beruht die vorliegende Erfindung.

Die vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Glycoproteinen mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 300 000 (bestimmt nach dem Ultrazentrifugenverfahren und 18 bis 38 Gew.-% an Proteinanteil, hergestellt durch Kultivieren von Coriolus versicolor (Fr.) Quel., Extrahieren der auf diese Weise stark vermehrten Mycele oder Fruchtkörper mit heißem Wasser oder einer wäßrigen Alkalilösung und Entfernen der Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 aus dem Extrakt zur Behandlung von Thrombose.

Nachfolgend werden die pharmakologischen Eigenschaften des Glycoproteins beschrieben und zwar die antithrombotische Aktivität.

Die Aggregation von Blutplättchen inhibierende Aktivität

Wenn Collagen und dgl., das unterhalb des Endothels vorliegt, dem Blutstrom ausgesetzt ist als Folge einer Arteriosklerose und einer Schädigung von Intima, haften die Blutplättchen an dem Teil und dann tritt eine Aggregation der auf diese Weise anhaftenden Blutplättchen auf. Die Aggregation (Verklumpung) der Blutplättchen, die auf das Collagen zurückzuführen ist, ruft die Freisetzung von Adenosindiphsphorsäure (ADP), Serotonin und dgl. aus dem dichten Körper der Thrombozyten hervor. ADP weist eine starke Aktivität in bezug auf die Aggregation der Blutplättchen auf und daher ruft ADP eine irreversible zweite Aggregation hervor.

Wie aus Beispiel 3 ersichtlich, ist in dem erfindungsgemäßen Glycoprotein eine Aktivität in bezug auf die Inhibierung der Aggregation von Blutplättchen zu erkennen.

Den Tod als Folge einer Thromboembolie verhindernde Aktivität

Wenn eine Bluttplättchen aggregierende Substanz, wie z. B. ADP oder wasserlösliches Collagen, intravenös einer Maus verabreicht wird, aggregieren die Blutplättchen in dem Blutstrom unter Verstopfung der Kapillarblutgefäße, was schließlich zu einer Lungenembolie führt, und die Ratte stirbt innerhalb von 5 Minuten.

Wenn das Glycoprotein vor der Injektion der Blutplättchen aggregierenden Substanz verabreicht wurde, wurde ein den Tod als Folge der Thromboembolie inhibierender Effekt festgestellt (vgl. Beispiel 4).

Das Glycoprotein ist daher wirksam als antithrombotisches Mittel aufgrund seiner Aktivität, die Blutplättchenaggregation zu inhibieren und den Tod als Folge der Aggregation von Blutplättchen zu verhindern.

Wenn das Glycoprotein in einer pharmazeutischen Zubereitung zur Behandlung von Thrombose verabreicht wird, kann sie wie folgt verwendet werden:

Durch kombinierte Verwendung mit einem konventionellen antithrombotischen Mittel kann eine Verstärkung der Wirksamkeit der pharmazeutischen Zubereitung erwartet werden.

Die Verabreichung der pharmazeutischen Zubereitung kann unter Anwendung eines von mehreren Wegen erfolgen.

Das Glycoprotein kann oral oder parenteral, vorzugsweise oral, an Menschen verabreicht werden. Die orale Verabreichung umfaßt die sublinguale Verabreichung und die parenterale Verabreichung umfaßt die subkutane Injektion, die intramuskuläre Injektion, die intravenöse Injektion und die Instillation. Die wirksame Menge der Verabreichung des Glycoproteins hängt von der Species, dem Alter, individuellen Unterschieden und dem Krankheitszustand des Patienten ab, im Falle der Behandlung von Humanpatienten beträgt die tägliche Dosis jedoch 10 bis 1000 mg, vorzugsweise 200 bis 600 mg pro kg Körpergewicht, die gleichmäßig aufgeteilt wird in 1 bis 3 Portionen, um 1 bis 3mal pro Tag verabreicht zu werden.

Im Falle der oralen Verabreichung kann die pharmazeutische Zubereitung in fester Form vorliegen, beispielsweise in Form einer Tablette, eines Granulats, eines Pulvers und einer Kapsel, sie kann in flüssiger Form vorliegen, beispielsweise in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen und Sirupen, sie kann in Form von Mischungen vorliegen, die nach dem Schütteln verwendet werden, oder sie kann in einer festen Form vorliegen, die nach dem Auflösen in sterilisiertem Wasser, das keine pyretische Substanz enthält, verwendet wird. Die in fester Form vorliegende pharmazeutische Zubereitung kann konventionelle Zusätze enthalten, wie z. B. Bindemittel, Verdünnungsmittel, Gleitmittel, Desintegratoren, Netzmittel, und die in flüssiger Form vorliegende pharmazeutische Zubereitung kann üblicherweise verwendete Zusätze und Konservierungsmittel enthalten. Im Falle einer Injektion kann die pharmazeutische Zubereitung weitere Zusätze, wie z. B. Stabilisatoren, Puffer, Konservierungsmittel und isotonische Agentien enthalten, und das Produkt wird nach dem Abfüllen in eine Dosierungseinheitsampulle oder in einen konventionellen Behälter auf den Markt gebracht.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.

Beispiel 1 Herstellung des Glycoproteins

In 4 l einer wäßrigen 0,1 n Natriumhydroxidlösung wurden 200 g getrocknetes Mycel von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (ATCC 20 545) mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 8,8% und einem ungefähren Stickstoffgehalt von 2,5% eingeführt und die Mycele wurden unter Rühren bei einer Temperatur von 90 bis 95°C 1 h lang extrahiert und dann wurde die Mischung auf unter 50°C abgekühlt und nach dem Einstellen des pH-Wertes der auf diese Weise abgekühlten Mischung auf 7,0 mit einer wäßrigen 1 n Chlorwasserstoffsäurelösung wurde das gelöste Material durch Saugfiltrieren aus der Mischung entfernt und das auf diese Weise entfernte feste Material wurde mit 500 ml Wasser gewaschen. Die Mischung aus dem Filtrat und den Waschwässern, die 4,2 l betrug, wurde unter Verwendung eiens Desktop-Ultrafilters der Firma Amicon Inc. (ausgestattet mit der Ultrafiltrationsmembram PM-5) unter Rühren und Kühlen unter einem Arbeitsdruck von 1,5 kg/cm² bei 10°C einer Ultrafiltration unterworfen, wodurch die niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 entfernt wurden, wonach eingeengt wurde, so daß man 300 ml des behandelten wäßrigen Extrakts erhielt. Der wäßrige Extrakt wurde einer Gefriertrocknung unterworfen, wobei man etwa 26,6 g einer pulverförmigen Substanz mit einer leberbraunen Farbe in einer Ausbeute von 13%, bezogen auf die Mycele, erhielt. Die auf diese Weise erhaltene pulverförmige Substanz hatte einen Feuchtigkeitsgehalt von 7,5% und eine Elementaranalysezusammensetzung von 40,5% Kohlenstoff, 6,2% Wasserstoff, 5,8% Stickstoff und Rest Sauerstoff. Die pulverförmige Substanz war in Wasser leicht löslich.

Die pulverförmige Substanz wies eine Aktivität in bezug auf die Inhibierung der Vermehrung des transplantierten Sarkoms 180 von bis zu 90%, wenn sie intraperitoneal der transplantierten Maus injiziert wurde, und bis zu 65%, wenn sie oral der transplantierten Maus verabreicht wurde, auf.

Nachgereichtes Beispiel 1a) Herstellung des Glycoproteins

In 4 l einer wäßrigen 0,1 n Natriumhydroxidlösung wurden 200 g getrocknetes Mycel von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (ATCC 20 547) mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 8,8% und einem ungefähren Stickstoffgehalt von 2,5% eingeführt und die Mycele wurden unter Rühren bei einer Temperatur von 90 bis 95°C 1 h lang extrahiert und dann wurde die Mischung auf unter 50°C abgekühlt und nach dem Einstellen des pH-Wertes der auf diese Weise abgekühlten Mischung auf 7,0 mit einer wäßrigen 1 n Chlorwasserstoffsäurelösung wurde das gelöste Material durch Saugfiltrieren aus der Mischung entfernt und das auf diese Weise entfernte feste Material wurde mit 500 ml Wasser gewaschen. Die Mischung aus dem Filtrat und den Waschwässern, die 4,1 l betrug, wurde unter Verwendung eines Desktop-Ultrafilters der Firma Amicon Inc. (ausgestattet mit der Ultrafiltrationsmembran PM-5) unter Rühren und Kühlen unter einem Arbeitsdruck von 1,5 kg/cm² bei 10°C einer Ultrafiltration unterworfen, wodurch die niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 entfernt wurden, wonach eingeengt wurde, so daß man 280 ml des behandelten wäßrigen Extrakts erhielt. Das wäßrige Extrakt wurde einer Gefriertrocknung unterworfen, wobei man etwa 28,3 g einer pulverförmigen Substanz mit einer leberbraunen Farbe in einer Ausbeute von 14%, bezogen auf die Mycele, erhielt. Die auf diese Weise erhaltene pulverförmige Substanz hatte einen Feuchtigkeitsgehalt von 7,3% und eine Elementaranalysezusammensetzung von 41,2% Kohlenstoff, 6,1% Wasserstoff, 5,8% Stickstoff und Rest Sauerstoff. Die pulverförmige Substanz war in Wasser leicht löslich.

Die pulverförmige Substanz wies eine Aktivität in bezug auf die Inhibierung der Vermehrung des transplantierten Sarkoms 180 von bis zu 98%, wenn sie intraperitoneal der transplantierten Maus injiziert wurde, und bis zu 68%, wenn sie oral der transplantierten Maus verabreicht wurde, auf.

Beispiel 2 Aktivität in bezug auf die Verhinderung des Todes als Folge einer Thromboembolie

Nach dem Verfahren von Furlow et al. (vgl. "Science", 187, 658, 1975) wurde das Glycoprotein an jede von 10 Ratten der beiden folgenden Gruppen verabreicht:

Erste Gruppe: Intraperitoneal in einer Dosis von 100 mg/kg
Zweite Gruppe: Oral in einer Dosis von 1000 mg/kg
Kontrollgruppe: Es wurde kein Glycoprotein verabreicht.

30 min nach der Verabreichung wurde jeder Ratte Arachidonsäure von der linken Carotid-Arterie aus in der Blutströmungsrichtung injiziert und es wurde die Mortalität der Ratten festgestellt. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II angegeben.

Tabelle II

Aktivität in bezug auf die Verhinderung des Todes durch Thromboembolie

Wie aus der Tabelle II ersichtlich, wurde die Aktivität des Glycoproteins in bezug auf die Inhibierung des Todes als Folge einer Thromboembolie dadurch demonstriert.

Beispiel 3 Aktivität in bezug auf die Inhibierung der Aggregation von Blutplättchen

Human-Venenblut wurde in einer wäßrigen Citratlösung (als Antikoagulans) in einem Gewichtsverhältnis von 9 : 1 gesammelt und nachdem die Mischung (aus Blut und der Lösung) 6 min lang einer Zentrifugentrennung bei 400 G unterworfen worden war, wurde die überstehende Flüssigkeit gesammelt. Aus der dabei erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde ein an Blutplättchen reiches Plasma (nachstehend als PRP bezeichnet) hergestellt und der Zentrifugenrückstand wurde weitere 20 min lang einer Zentrifugentrennung bei 700 G unterworfen, wobei man eine überstehende Flüssigkeit, ein an Blutplättchen armes Plasma (nachstehend als PPP bezeichnet), erhielt.

1) Ohne Zugabe von Glycoprotein

Jedes der drei Koagulantien, Arachidonsäure in einer Konzentration von 1,64 mM, Collagen in einer Konzentration von 0,26 mg/ml und Adenosindiphosphorsäure (ADP) in einer Konzentration von 50 µM wurden zu PRP zugegeben und die Durchlässigkeit der Aggregation, angezeigt durch die Differenz der Durchlässigkeit (Transmission) zwischen PRP und PPP) wurde mittels eines Agligometers (hergestellt von der Firma Biodata Co., Modell PAP-3) gemessen. Der Wert entspricht dem Ausmaß der Aggregation der Blutplättchen durch jedes der Koagulantien und wird als bezeichnet.

2) Glycoprotein-Zugabe

Das Glycoprotein wurde zu PRP bzw. PPP in einer Rate von 1 mg/kg zugegeben und 2 min nach der Zugabe wurde jedes der drei Koagulantien dem so behandelten PRP zugesetzt und es wurde die Blutplättchen-Aggregation gemessen. In diesem Fall (2) entspricht der Wert dem Grad der Aggregation der Blutplättchen durch jedes der Koagulantien in Gegenwart des Glycoproteins und wird als bezeichnet.

Die Rate der Inhibierung der Aggregation von Blutplättchen, hervorgerufen durch jedes der Koagulantien, durch das Glycoprotein (I.R. %) wurde aus der folgenden Formel errechnet:

Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle III angegeben.

Tabelle III

Wie aus der Tabelle III ersichtlich, weist das Glycoprotein eine Aktivität in bezug auf die Inhibierung der Aggregation, hervorgerufen durch eines der Koagulantien, auf.

Beispiel 4 Verhinderung des Todes als Folge einer Thromboembolie

Das Glycoprotein wurde an jede von 10 männlichen ddY-Mäusen mit einem Körpergewicht von 20 bis 22 g oral in einer Dosis von 1 g/kg verabreicht und 3 h nach der Verabreichung wurde ADP in einer Rate von 400 mg/kg oder lösliches Collagen (hergestellt von der Firma Sigma Co.) in einer Rate von 0,2 mg/kg intravenös an jede der Mäuse verabreicht. Danach wurde die Mortalität der Gruppe von Mäusen 10 min nach der Verabreichung des Koagulans festgestellt. Jeder der anderen 10 männlichen ddY-Mäuse wurde destilliertes Wasser oral verabreicht anstelle des erfindungsgemäßen Glycoproteins, wobei diese als Kontrolle verwendet wurden. Die Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle IV angegeben.

Wie aus der Tabelle IV hervorgeht, weist das erfindungsgemäße Glycoprotein eine Aktivität in bezug auf die Verhinderung des Todes als Folge einer Thromboembolie durch das Koagulans auf.

Tabelle IV

Beispiel 5 Formulierung einer pharmazeutischen Zubereitung

Kapseln, die jeweils 330 mg des Glycoproteins enthielten, wurden hergestellt durch Füllen von harten Kapseln Nr. 0 mit dem Glycoprotein, so wie es vorlag, unter Verwendung einer automatischen Füllvorrichtung unter Druck.

Claims

Verwendung von Glycoproteinen mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 300 000 (bestimmt nach dem Ultrazentrifugenverfahren) und 18 bis 38 Gew.-% Proteinanteil, hergestellt durch Kultivieren von Coriolus versicolor (Fr.) Quel., Extrahieren der auf diese Weise stark vermehrten Mycele oder Fruchtkörper mit heißem Wasser oder einer wäßrigen Alkalilösung und Entfernen der Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 aus dem Extrakt, zur Behandlung von Thrombose.