DE3448148C2

DE3448148C2 -

Info

Publication number: DE3448148C2
Application number: DE3448148A
Authority: DE
Inventors: Masanori Tachikawa Tokio/Tokyo Jp Ikuzawa; Yoshiharu Oguchi; Kenichi Tokio/Tokyo Jp Matsunaga; Noriyuki Sagamihara Kanagawa Jp Toyoda; Takao Machida Tokio/Tokyo Jp Furusho; Takayoshi Tokio/Tokyo Jp Fujii; Chikao Kunitachi Tokio/Tokyo Jp Yoshikumi
Original assignee: Kureha Corp
Current assignee: Kureha Corp
Priority date: 1983-08-11
Filing date: 1984-08-10
Publication date: 1989-09-21
Also published as: DE3448152C2; DE3429551C2; DE3448153C2; DE3448154C2; US5008243A; US4820689A; DE3429551A1; DE3448144C2; DE3448155C2; DE3448150C2; DE3448151C2; DE3448145C2; DE3448149C2

Description

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Glycoproteinen mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 300 000 und 18 bis 38 Gew.-% Proteinanteil, hergestellt durch Kultivieren von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. zur Verbesserung des Deformationsvermögens von Erythrozyten.

Das von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. (FERM-P Nr. 2412) stammende Glycoprotein ist auf dem Markt bereits erhältlich als Antitumor-Arzneimittel unter dem Warenzeichen Krestin.

Die Stämme Coriolus versicolor (Fr.) Quel. FERM-P-Nr. 2412 und FERM-P-Nr. 2414 wurden von dem Fermentation Research Institute, Agency of Industrial Science and Technology bei der American Type Culture Collection am 30. Juli 1979 unter der ATCC-Nr. 20547 und der ATCC-Nr. 20545 hinterlegt.

Da das Glycoprotein eine geringe Säugetiertoxizität aufweist und die Intestinalmikroflora nicht stört, kann eine das Glycoprotein als aktiven Bestandteil (Wirkstoff) enthaltende pharmazeutische Zubereitung über einen langen Zeitraum hinweg verabreicht werden. Außerdem ist das Glycoprotein frei von der Gefahr der Verursachung von Mißbildungen und/oder allergischen Reaktionen und daher stellt das Glycoprotein eine extrem sichere (gefahrlose) Substanz dar.

Das Glycoprotein ist eine bereits bekannte Substanz und beispielsweise beschrieben in den japanischen Patentpublikationen Nr. 17149/1971, 36 322/1976, 14 274/1981, 14 276/1981, 39 288/1981 und der japanischen Patentanmeldung 57-1 34 496, wonach das Glycoprotein erhalten wird durch Kultivieren einer Basidiomyceten-Fungi-Species, die zum Genus Coriolus gehört, Extrahieren der auf diese Weise stark vermehrten Mycele oder Fruchtkörper mit heißem Wasser oder einer wäßrigen Alkalilösung und Entfernen der niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000, wobei die auf diese Weise in Form eines Extrakts erhaltene Substanz etwa 18 bis 38 Gew.-% Proteine enthält und ein Molekulargewicht von 5000 bis 300 000, bestimmt nach dem Ultrazentrifugenverfahren, aufweist.

Zahlreiche pharmakologische Eigenschaften sind in der Firmenschrift "Outline of PSK", Seiten 28 bis 30, beschrieben.

Aus DE-AS 26 59 808 außerdem die Verwendung dieses Glycoproteins zur Bekämpfung von Tumoren bekannt.

Das aus den Mycelen von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. stammende Glycoprotein hat eine leberbraune Farbe und einen Stickstoffgehalt von 2 bis 8%, in vielen Fällen von 3 bis 6%. Verschiedene Farbreaktionstests, die mit dem erfindungsgemäßen Glycoprotein durchgeführt wurden, ergaben die folgenden Ergebnisse:

α-Naphthol-Schwefelsäure-Reaktion (Molish-Reaktion)
Purpurrot
Indol-Schwefelsäure-Reaktion (Dische-Reaktion)	Braun
Anthron-Schwefelsäure-Reaktion	Grünlich-Blau
Phenol-Schwefelsäure-Reaktion	Braun
Tryptophan-Schwefelsäure-Reaktion	Purpurrot-Braun
Lowry-Folin-Verfahren	Blau
Ninhydrin-Reaktion nach der Chlorwasserstoffsäure-Hydrolyse	Grünlich-Blau

Das Molekulargewicht des Glycoproteins beträgt 5000 bis 300 000, gemessen unter Anwendung eines Ultrazentrifugenverfahrens. Das Glycoprotein enthält etwa 18 bis 38 Gew.-% Proteine.

Der Saccharidanteil des Glycoproteins besteht hauptsächlich aus β-D-Glycan und die Struktur des Glycan-Restes ist eine verzweigte Struktur, die 1→3-, 1→4- und 1→6-Bindungen aufweist. Von den Aminosäuren, die den Proteinanteil des Glycoproteins bilden, ist die Menge der sauren Aminosäuren, wie z. B. Asparaginsäure, Glutaminsäure und dgl., und diejenige der neutralen Aminosäuren, wie Valin, Leucin und dgl., verhältnismäßig groß und die Menge der basischen Aminosäuren, wie z. B. Lysin, Argenin und dgl., ist verhältnismäßig klein. Das Glycoprotein ist in Wasser löslich und in Hexan, Benzol, Chloroform, Methanol und Pyridin fast unlöslich. Das Glycoprotein zersetzt sich langsam bei einer Temperatur von etwa 120°C, wenn es erhitzt wird.

Wie aus der folgenden Tabelle I ersichtlich, ist die Säugetier-Toxizität des Glycoproteins extrem niedrig und es ruft bei Tieren kaum irgendwelche Nebenwirkungen hervor. Insbesondere ist es bekannt als eine sehr sichere (gefahrlose) Substanz für Lebewesen.

Tabelle I

Die in dem Test zur Bestimmung des obengenannten akuten Toxizitätswertes (LD⁵⁰ mg/kg) verwendeten Mäuse waren solche vom Stamm ICR-JCL, 4 bis 5 Wochen nach der Geburt und mit einem Körpergewicht von 21 bis 24 g. Die in dem gleichen Test verwendeten Ratten waren solche vom Stamm Donryu, 4 bis 5 Wochen nach der Geburt und mit einem Körpergewicht von 100 bis 150 g. Das Glycoprotein wurde in einer physiologischen Kochsalzlösung aufgelöst und auf jedem in der Tabelle I angegebenen Weg verabreicht. Nach der Verabreichung wurden die generellen Symptome, die Mortalität und das Körpergewicht jedes der so behandelten Tiere 7 Tage lang beobachtet und dann wurden sie getötet und einer Autopsie unterworfen.

Wie in der Tabelle I angegeben, wurde sowohl im Falle der Mäuse als auch im Falle der Ratten selbst bei der maximalen Dosis, die verabreicht werden konnte, kein Todesfall festgestellt, so daß das Glycoprotein für Lebewesen extrem sicher (gefahrlos) ist bis zu einem solchen Grade, daß der Wert für die LD₅₀ tatsächlich nicht festgestellt werden konnte.

Als Ergebnis der Prüfung der physiologischen und pharmazeutischen Eigenschaften des von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. stammenden Glycoproteins wurde gefunden, daß das Glycoprotein eine des Deformationsvermögen von Erythrozyten erhöhende Aktivität bei einem Säugetier aufweist, und darauf beruht die vorliegende Erfindung.

Die Erfindung betrifft die Verwendung von Glycoproteinen mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 300 000 (bestimmt nach dem Ultrazentrifugenverfahren) und 18 bis 38 Gew.-% an Proteinanteil, hergestellt durch Kultivieren von Coriolus versicolor (Fr.) Quel., Extrahieren der auf diese Weise stark vermehrten Mycele und Fruchtkörper mit heißem Wasser oder einer wäßrigen Alkalilösung und Entfernen der Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 aus dem Extrakt, zur Verbesserung des Deformationsvermögens von Erythrozyten.

Das Glycoprotein weist eine Aktivität zur Verbesserung des Deformationsvermögens von Erythorzyten auf und wird für die Behandlung ischämischen Cerebralerkrankungen verwendet.

Nachfolgend werden die pharmakologischen Eigenschaften des Glycoproteins beschrieben, und zwar die das Deformationsvermögen von Erythorzyten verbessernde Aktivität.

Bei den Erythorzyten eines Tieres, dem das Glycoprotein verabreicht wurde, wurde eine Abnahme der Hämolyserate gegenüber der mechanischen hämolytischen Wirkung, d. h. mit anderen Worten eine Verbesserung des Deformationsvermögens der Erythorzyten, festgestellt. Der Blutdurchfluß im cerebralen ischämischen Zustand war eine Mikrozirkulation und da eine Aktivität in bezug auf die Verbesserung des Deformationsvermögens der Erythorzyten mit dem Glycoprotein festgestellt wurde, wurde daraus abgeleitet, daß der aktive Bestandteil (Wirkstoff), das Glycoprotein, in der Lage war, die Blutzirkulation zu erleichtern. Außerdem war das Glycoprotein aktiv in bezug auf die Inhibierung des Todes des Versuchstiers als Folge einer Thrombose, hervorgerufen durch dem Versuchstier verabreichte Arachidonsäure.

Das Glycoprotein eignet sich als Mittel zur Besserung ischämischer Cerebralerkrankungen sowohl aufgrund seiner das Deformationsvermögen von Erythorzyten verbessernden Aktivität aus auch aufgrund seiner den Tod als Folge einer Thrombose inhibierenden Aktivität. Gemäß der vorliegenden Erfindung eignet sich das Glycoproteinpräparat zur Besserung ischämischer Cerebralerkrankungen, d. h. zur Behandlung der Cerebralthrombose oder von ischämischen Erkrankungen, die den Cerebralinfarkt als Folge der Arteriosklerose begleiten.

Die Verabreichung des Präparates kann dabei wie folgt vorgenommen werden:

Durch kombinierte Verwendung zur Besserung von ischämischen Cerebralerkrankungen mit einem Agens zur Erweiterung der cerebralen Blutgefäße, wie z. B. Kohlendioxid, Papaverin, Buphenin, Isoxsuprin, Hexobendin, Cyclandelat, ATP, ADP, Adenosinphosphat, Acetazolamid, Pyritinol, Raubasin, einer wäßrigen hypertonischen Glucoselösung und dgl., ist ein Kombinationseffekt zu erwarten. Außerdem kann es auch in Kombination mit einem antiarteriosklerotischen Agens verwendet werden.

Das Glycoprotein kann oral oder paraenteral, vorzugsweise oral, an Menschen verabreicht werden. Die orale Verabreichung umfaßt die sublinguale Verabreichung und die parenterale Verabreichung umfaßt die subkutane Injektion, die intramuskuläre Injektion, die intravenöse Injektion und die Instillation. Die wirksame Menge der Verabreichung des Glycoproteins hängt von der Species, dem Alter, individuellen Unterschieden und dem Krankheitszustand des Patienten ab, im Falle der Behandlung von Humanpatienten beträgt die tägliche Dosis jedoch 10 bis 1000 mg, vorzugsweise 200 bis 600 mg pro kg Körpergewicht, die gleichmäßig aufgeteilt wird in 1 bis 3 Portionen, um 1 bis 3mal pro Tag verabreicht zu werden.

Im Falle der oralen Verabreichung kann das Glycoprotein in dem in der Galenik üblichen Formen vorliegen, beispielsweise in Form einer Tablette, eines Granulats, eines Pulvers und einer Kapsel, sie kann in flüssiger Form vorliegen, beispielsweise in Form von Lösungen, Suspensionen, Emulsionen und Sirupen, sie kann in Form von Mischungen vorliegen, die nach dem Schütteln verwendet werden, oder sie kann in einer festen Form vorliegen, die nach dem Auflösen in sterilisiertem Wasser, das keine pyretische Substanz enthält, verwendet wird. Liegt es in fester Form vor, kann es konventionelle Zusätze enthalten, wie z. B. Bindemittel, Verdünnungsmittel, Gleitmittel, Desintegratoren, Netzmittel; in flüssiger Form kann es üblicherweise verwendete Zusätze und Konservierungsmittel enthalten. Im Falle einer Injektion kann das Glycoproteinpräparat weitere Zusätze, wie z. B. Stabilisatoren, Puffer, Konservierungsmittel und isotonische Agentien enthalten, und das Produkt wird nach dem Abfüllen in eine Dosierungseinheitsampulle oder in einen konventionellen Behälter auf den Markt gebracht.

Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele näher erläutert, ohne sie jedoch darauf zu beschränken.

Beispiel 1 Herstellung des Glycoproteins

In 4 l einer wäßrigen 0,1 n Natriumhydroxidlösung wurden 200 g getrocknetes Mycel von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. ATCC 20545 mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 8,8% und einem ungefähren Stickstoffgehalt von 2,5% eingeführt und die Mycele wurden unter Rühren bei einer Temperatur von 90 bis 95°C 1 h lang extrahiert und dann wurde die Mischung auf unter 50°C abgekühlt und nach dem Einstellen des pH-Wertes der auf diese Weise abgekühlten Mischung auf 7,0 mit einer wäßrigen 1 n Chlorwasserstoffsäurelösung wurde das gelöste Material durch Saugfiltrieren aus der Mischung entfernt und das auf diese Weise entfernte feste Material wurde mit 500 ml Wasser gewaschen. Die Mischung aus dem Filtrat und den Waschwässern, die 4,2 l betrug, wurde unter Verwendung eines Desktop-Ultrafilters der Firma Amicon Inc. (ausgestattet mit der Ultrafiltrationsmembran PM-5) unter Rühren und Kühlen unter einem Arbeitsdruck von 1,5 kg/mc² bei 10°C einer Ultrafiltration unterworfen, wodurch die niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 entfernt wurden, wonach eingeengt wurde, so daß man 300 ml des behandelten wäßrigen Extrakts erhielt. Der wäßrige Extrakt wurde einer Gefriertrocknung unterworfen, wobei man etwa 26,6 g einer pulverförmigen Substanz mit einer leberbraunen Farbe in einer Ausbeute von 13%, bezogen auf die Mycele, erhielt. Die auf diese Weise erhaltene pulverförmige Substanz hatte einen Feuchtigkeitsgehalt von 7,5% und eine Elementaranalysezusammensetzung von 40,5% Kohlenstoff, 6,2% Wasserstoff, 5,8% Stickstoff und Rest Sauerstoff. Die pulverförmige Substanz war in Wasser leicht löslich.

Die pulverförmige Substanz wies eine Aktivität in bezug auf die Inhibierung der Vermehrung des transplantierten Sarkoms 180 von bis zu 90%, wenn sie intraperitoneal der transplantierten Maus injiziert wurde, und bis zu 65%, wenn sie oral der transplantierten Maus verabreicht wurde, auf.

Nachgereichtes Beispiel 1a) Herstellung des Glycoproteins

In 4 l einer wäßrigen 0,1 n Natriumhydroxidlösung wurden 200 g getrocknetes Mycel von Coriolus versicolor (Fr.) Quel. ATCC 20547 mit einem Feuchtigkeitsgehalt von 8,8% und einem ungefähren Stickstoffgehalt von 2,5% eingeführt und die Mycele wurden unter Rühren bei einer Temperatur von 90 bis 95°C 1 h lang extrahiert und dann wurde die Mischung auf unter 50°C abgekühlt und nach dem Einstellen des pH-Wertes der auf diese Weise abgekühlten Mischung auf 7,0 mit einer wäßrigen 1 n Chlorwasserstoffsäurelösung wurde das gelöste Material durch Saugfiltrieren aus der Mischung entfernt und das auf diese Weise entfernte feste Material wurde mit 500 ml Wasser gewaschen. Die Mischung aus dem Filtrat und den Waschwässern, die 4,1 l betrug, wurde unter Verwendung eines Desktop-Ultrafilters der Firma Amicon Inc. (ausgestattet mit der Ultrafiltrationsmembran PM-5) unter Rühren und Kühlen unter einem Arbeitsdruck von 1,5 kg/mc² bei 10°C einer Ultrafiltration unterworfen, wodurch die niedermolekularen Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 entfernt wurden, wonach eingeengt wurde, so daß man 280 ml des behandelten wäßrigen Extrakts erhielt. Der wäßrige Extrakt wurde einer Gefriertrocknung unterworfen, wobei man etwa 28,3 g einer pulverförmigen Substanz mit einer leberbraunen Farbe in einer Ausbeute von 14%, bezogen auf die Mycele, erhielt. Die auf diese Weise erhaltene pulverförmige Substanz hatte einen Feuchtigkeitsgehalt von 7,3% und eine Elementaranalysezusammensetzung von 41,2% Kohlenstoff, 6,1% Wasserstoff, 5,8% Stickstoff und Rest Sauerstoff. Die pulverförmige Substanz war in Wasser leicht löslich.

Die pulverförmige Substanz wies eine Aktivität in bezug auf die Inhibierung der Vermehrung des transplantierten Sarkoms 180 von bis zu 95%, wenn sie intraperitoneal der transplantierten Maus injiziert wurde, und bis zu 68%, wenn sie oral der transplantierten Maus verabreicht wurde, auf.

Beispiel 2 Aktivität in bezug auf die Verbesserung des Deformationsvermögens von Erythrozyten

Das Glycoprotein wurde an jede von sechs Gruppen von Wistar-Ratten, wobei jede Gruppe aus 5 Tieren bestand, in einer Dosis von 10-1000 mg/kg oral bzw. intraperitoneal verabreicht. 3 Stunden nach der Verabreichung wurde das Blut aus jeder Ratte entnommen und zu dem 10fachen des Gewichts einer physiologischen Kochsalzlösung zugegeben. Nach dem Rühren der Mischung in einem Mixer, wodurch die Erythrozyten in der Mischung mechanisch hämolysiert wurden, wurde die Mischung einer Zentrifugentrennung unterworfen. Die Hämoglobinmenge (A _i) in der dabei erhaltenen überstehenden Flüssigkeit wurde colorimetrisch gemessen. Es wurden die gleichen Verfahren durchgeführt, wobei diesmal jedoch verdünntes Wasser anstelle der physiologischen Kochsalzlösung verwendet wurde, wobei die Hämoglobinmenge (B _i) in der überstehenden Flüssigkeit erhalten wurde, und das Ausmaß der Hämolyse (H _i) wurde unter Verwendung der folgenden Formel errechnet:

Das Ausmaß der Hämolyse, das in dem Blut der Vergleichsratte erzielt wurde, der destilliertes Wasser anstelle von Glycoprotein verabreicht worden war, wurde nach dem gleichen Verfahren wie oben als H _c errechnet.

Die relative Hämolyserate wurde unter Verwendung der folgenden Formel berechnet, wobei der Mittelwert von H _i und H _c verwendet wurde:

Die dabei erzielten Ergebnisse sind in der folgenden Tabelle II nach der Klassifizierung in den Verabreichungsweg und die Dosierungsrate angegeben.

Wie aus der Tabelle II ersichtlich, wurde eine Abnahme der relativen Hämolyserate bei den Gruppen festgestellt, denen Glycoprotein verabreicht worden war, ungeachtet des Verabreichungsweges des Glycoproteins. Die Verabreichung des Glycoproteins führt somit zu einer Verbesserung des Deformationsvermögens der Erythrozyten.

Tabelle II

Aktivität in bezug auf die Herabsetzung des relativen Hämolysegrades

Beispiel 3 Formulierung einer pharmazeutischen Zubereitung

Kapseln, die jeweils 330 mg des Glycoproteins enthielten, wurden hergestellt durch Füllen von harten Kapseln Nr. 0 mit dem Glycoprotein, so wie es vorlag, unter Verwendung einer automatischen Füllvorrichtung unter Druck.

Claims

Verwendung von Glycoproteinen mit einem Molekulargewicht von 5000 bis 300 000 (bestimmt nach dem Ultrazentrifugenverfahren) und 18 bis 38 Gew.-% Proteinanteil, hergestellt durch Kultivieren von Coriolus versicolor (FR.) Quel., Extrahieren der auf diese Weise stark vermehrten Mycele oder Fruchtkörper mit heißem Wasser oder einer wäßrigen Alkalilösung und Entfernen der Substanzen mit einem Molekulargewicht von weniger als 5000 aus dem Extrakt, zur Verbesserung des Deformationsvermögens von Erythrozyten.