DE3124719C2

DE3124719C2 - 10-(1,2-Propadienyl)-östr-4-en-3,17-dion, entsprechendes Zwischenprodukt und pharmazeutische Zubereitungen, die diese Verbindungen enthalten

Info

Publication number: DE3124719C2
Application number: DE3124719A
Authority: DE
Inventors: Brian W Metcalf; J O'neal Johnston
Original assignee: Merrell Dow Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Aventis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1980-06-27
Filing date: 1981-06-24
Publication date: 1994-03-03
Anticipated expiration: 2001-06-25
Also published as: AU539215B2; IT1171340B; NL8103098A; US4289762A; IE811435L; AT377989B; IL63142A0; CH647532A5; SE8103988L; NO812509L; IE51352B1; GB2078750B; DK163129B; DK163129C; IT8148781A1; ES8400449A1; CA1173432A; SE448878B; GB2078750A; JPS5738798A

Description

Die Erfindung betrifft 10-(1,2-Propadienyl)-östr-4-en-3,17- dion, das als irreversibler Inhibitor von Aromatase-Enzymen wirksam ist, sowie ein Verfahren zur Herstellung dieses Steroids und seine Verwendung.

Für das Auftreten sekundärer Geschlechtseigenschaften von Männern oder Frauen sind in erster Linie divergierende Geschlechtshormone verantwortlich, die durch die Gonaden und zu einem geringeren Ausmaß durch die Nebennieren synthetisiert werden. Diese Steroide werden durch eine Anzahl von Enzymen reguliert. Das Enzym-Aromatase ist das geschwindigkeits begrenzende Enzym bei der Umwandlung von Androgenen (männliche Hormone) in Östrogene (weibliche Hormone). Die nicht reversible Umwandlung von Androgenen in Östrogene umfaßt die Oxidation und Eliminierung der Methylgruppe von dem Kohlenstoffatom C10 in Form von Ameisensäure. Die 1β- und 2β-Wasserstoffatome von den Kohlenstoffatomen C1 und C2 werden ebenfalls unter Bildung des aromatischen A-Ringes der Östrogene entfernt. Die Androgene, Testosteron und Androstendion oder die Östrogene, Östradiol und Östron können durch die 17β- Hydroxy-steroid-dehydrogenase wie folgt ineinander umgewandelt werden:

Die Regulierung der Umwandlung von Androgen in Östrogen oder die Hemmung dieser Umwandlung kann therapeutisch ausgenutzt werden bei der Regulierung klinischer Zustände, die durch die Gegenwart von Östrogenen potenziert werden.

Es gibt wesentliche klinische Anzeichen dafür, daß viele Tumorarten mit einer erhöhten Östrogenbildung verbunden sind. Bei Patienten mit Brustkrebs wird üblicherweise die Entfernung eines Eierstockes, der Nebenniere und/oder der Hypophyse vorgenommen, um die Menge an Östrogen zu verringern. Zu den nichtchirurgischen Verfahren gehören Behandlungen mit großen Mengen an Steroiden, Antiöstrogenen und Inhibitoren enzymatischer Steroidreaktionen. Eine Behandlung mit Anti östrogenen führt bei etwa einem Drittel der Patienten zu objektiven Tumor-Rückbildungen. Eine Entfernung der Nebenniere bewirkt eine Rückbildung von Brustkrebs bei Frauen nach den Wechseljahren, die hormonabhängige Tumoren aufweisen, voraussichtlich als Ergebnis der Verringerung an dem zur Verfügung stehenden Östrogen, das von Andostendion abgeleitet ist, dessen Quelle in erster Linie in den Nebennieren sitzt. Es wurde gezeigt, daß das Wchstum verschiedener Arten (lines) von Brustkrebszellen von Östrogen abhängig ist und durch Verbindungen gehemmt werden kann, die der Wirkung von Östrogen entgegenwirken.

Unter Verwendung von Enzympräparaten aus Protoplasmakörnchen aus menschlicher Placenta wurden Inhibitoren der Ölstrogen- Biosynthese identifiziert. Aromatase-Inhibitoren, wie 4- Hydroxy- und 4-Acetoxy-androsten-3,17-dion, Aminoglutethimid und Testololacton, sind fähig, die Aromatisierung von Androgenen zu Östrogenen zu blockieren, und können wirksam verhindern, daß die biologisch aktiven Östrogene die endokrinen Tumoren erreichen, oder sie können die Östrogen-Biosynthese in solchen Tumoren, die zur endogenen Östrogensynthese fähig sind, verringern und dadurch Remissionen von metastatischem Brustkrebs bewirken.

Gebärmutterkrebs wurde mit der Gegenwart von übermäßigen Mengen an endogenem oder exogenem Östrogen in Verbindung gebracht. Gonaden- und trophoblastische Tumoren verursachen somatische Hyperöstrogenisierung, was zu unterschiedlichen Graden der Feminisierung bei Männern führt. Bei Frauen hängen die Symptome vom Alter der Patienten ab und können von frühreifer Pseudopubertät über Anomalitäten der Menses zu Blutungen nach den Wechseljahren führen. Aromatase-Inhibitoren können bei der erhaltenden Behandlung von Patienten mit solchen Tumoren als Zusatztherapie eingesetzt werden, da sie das somatische Auftreten von erhöhter Östrogen-Biosynthese verringern. Aromatase-Inhibitoren wurden zur Behandlung von Hyperöstrogenämie bei Zuständen, wie Gynäkomastie, verabreicht und führten zu klinischen Verbesserungen.

Es wurde vermutet, daß eine Hyperöstrogenämie einem Myokard infarkt vorangeht. Daher kann eine Verringerung der peripheren Aromatisierung von Androgenen durch Verabreichung von Aromatase-Inhibitoren zur Behandlung von Individuen mit einem hohen potentiellen Risiko für Myokardinfarkte brauchbar sein.

Aromatase-Inhibitoren haben sich als wirksam bei der Behandlung von Unfruchtbarkeit bei Männern und bei der Verhinderung einer Östrogenbildung, die für den Follikelsprung bei Frauen erforderlich ist, erwiesen. Da für die Einpflanzung befruchteter Einer in vielen Arten eine Östogensynthese erforderlich ist, liegt in der Verabreichung von Aromatase-Inhibitoren nach dem Koitus die Möglichkeit, die Fruchtbarkeit, insbesondere in Haustieren und Wild, zu regulieren. Insbesondere könnte sowohl bei männlichen als auch bei weiblichen Nagetieren während kontrollierter Paarungsprogramme unter Anwendung von Aromatase-Inhibitoren eine Unterdrückung der Fortpflanzung bewirkt werden.

In THL, 23 (1979), S. 2105-2108, wird die Herstellung von 10-(1-Hydroxy-2-propinyl)-östr-4-en-3,17-dion beschrieben. Ferner wird offenbart, daß die Verbindung möglicherweise bei der Behandlung östrogen-abhängiger Tumore eingesetzt werden könnte. Definitive Aussagen hierzu werden jedoch nicht getroffen.

Aufgabe vorliegender Erfindung ist die Bereitstellung neuer Steroide der obengenannten Reihe, die wirksam als Aromatase- Inhibitoren eingesetzt werden können.

Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Bereit stellung von 10-(1,2-Propadienyl)-östr-4-en-3,17-dion der Formel

Die Erfindung umfaßt weiterhin ein neues Zwischenprodukt, das für die Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindung brauchbar ist und die folgende Formel aufweist:

Die Erfindung umfaßt auch Verfahren zur Herstellung und Anwendung der erfindungsgemäßen Verbindungen.

Die erfindungsgemäßen Steroidverbindungen weisen alle eine ungewöhnliche 10-Allenylgruppe als Substituenten auf. (Die Ausdrücke "Allenyl", "Propadienyl" und "1,2-Propadienyl" werden hier austauschbar verwendet.)

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind optisch aktiv und besitzen an den Ringverbindungen die gleiche Stereochemie wie die natürliche Androstanreihe. So haben die 10-Allenylgruppe, das axiale Wasserstoffatom am Kohlenstoffatom C8 und die Alkylsubstituenten am Kohlenstoffatom C13 die β-Konfiguration. In den Verbindungen der Formeln I und II sind die Ringverbindungen B/C und C/D in trans-Konfiguration, und in den Verbindungen der Formel II ist auch die Ring verbindung A/B in trans-Konfiguration. Es wird zwar angenommen, daß die Verbindungen mit der Konfiguration der natürlichen Steroide die wirksamen Inhibitoren sind, die Erfindung umfaßt jedoch auch Gemische dieser Verbindungen mit ihren optischen Antipoden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen der Formeln I und II können aus bekannten Steroid-Vorstufen, und zwar sowohl aus natürlichen Quellen erhaltene Steroide als auch aus synthetischen oder halbsynthetischen Steroiden, synthetisiert werden. Die folgenden Synthesen erläutern die Herstellung von Ver bindungen der Östradionreihe. Analoge Reaktionen können mit den 18-Methyl-, 6-Alkyl-, 7-Alkyl- und/oder 16-Alkylreihen durchgeführt werden.

In jedem Schema, bei dem die Zwischenverbindungen in den Ringen C und D oder in den Ringen A, B und C keine Veränderungen erfahren, wird für die Formeln die übliche vereinfachte Darstellung angewendet, wobei davon auszugehen ist, daß der weggelassene Teil unverändert bestehen bleibt.

Nachstehend werden zwei verschiedene Verfahren zur Einführung einer 10-(1,2-Propadienyl)-gruppe erläutert. Das Ausgangs material ist in jedem Fall das bekannte Diketal, das durch Ketalisierung von 19-Acetoxy-androst-4-en-3,17-dion mit Ethylenglykol, wobei die Doppelbindung in bekannter Weise in die 5,6-Stellung wandert, anschließende Hydrolyse des Acetats und Oxidation des 19-alkohols zu einem Aldehyd erhalten wird.

Das bekannte Aldehyd-diketal 1 wird weiter nach Schema 1 umgesetzt.

Schema 1

Das Aldehyd-diketal 1 wird 1 bis 10 Stunden bei 25 bis 45°C mit einem acetylenischen Grignard-Reagens in Ether oder Tetrahydrofuran (THF) behandelt. Das Reaktionsgemisch wird auf übliche Weise aufgearbeitet und der acetylenische Alkohol 2 wird nach dem Verfahren von Covey u. a., Tet. Let. 2105 (1979), erhalten. Der Alkohol wird durch Umsetzung mit Methansulfonylchlorid in Pyridin bei -20 bis 0°C für die Dauer von 12 bis 48 Stunden in den Methansulfonatester (Mesylat) umgewandelt. Das Mesylat 3 wird 12 bis 48 Stunden bei -70 bis -20°C nach dem Verfahren von Stork u. a., J. Am. Chem. Soc., Bd. 101 (1979), S. 7107, mit einem Hydrid reduktionsmittel behandelt, um das Propadien 4 zu bilden. Durch Entketalisierung mit p-Toluolsulfonsäure in Aceton bei etwa 25°C für die Dauer von 1 bis 24 Stunden oder mit HCl in wäßrigem Alkohol unter gleichzeitiger Konjugation der Doppelbindung wird das 10-(1,2-Propadienyl)-4-en-3,17-dion 5 erhalten.

Vorzugsweise wird der acetylenische Alkohol 2 nach dem folgenden Schema 2 in das Propadien umgewandelt.

Schema 2

Der acetylenische Alkohol 2 wird mit Essigsäureanhydrid in Pyridin bei 25°C für die Dauer von 4 bis 20 Stunden in das Acetat 6 umgewandelt. Durch Behandlung mit einem Lithium- alkinylalkylkupfer oder Lithium-dimethylkupfer bei -70°C für die Dauer von 0,1 bis 4 Stunden nach dem Verfahren von Baret u. a., Tetrahedron, Bd. 35 (1979), S. 2931, wird das Propadien 4 erhalten, das anschließend nach dem Verfahren von Schema 1 entketalisiert wird.

Das 10-Allenyldiketon 5 kann durch Reduktion mit Natrium borhydrid in Ethanol bei 0°C für die Dauer von 1 Stunde nach dem Verfahren von Norymberski u. a., J. Chem. Soc., 3426 (1955), in den 17β-Alkohol 26 umgewandelt werden. Der Alkohol kann mit einem niederen Alkanoylchlorid in Pyridin bei 0 bis 25°C für die Dauer von 1 bis 24 Stunden verestert werden.

Entweder das 10-allenyldiketon 5 oder der entsprechende 17-Alkohol 26 kann nach dem folgenden Schema 3 hydriert werden:

Schema 3

Das Diketon 5 oder der entsprechende 17-Alkohol 26 wird 2 Stunden nach dem Verfahren von Burn u. a., J. Chem. Soc. 1232 (1962) in Dioxan am Rückfluß mit Dichlordicyanochinon umgesetzt, um unter Bildung der Verbindung 9 eine 1,2-Doppel bindung einzuführen. Die Doppelbindung an dieser Stelle kann auch nach dem Verfahren von Bernstein u. a., J. Am. Chem. Soc., Bd. 82 (1960), S. 1235, durch Behandlung von Verbindung 5 mit Selendioxid in t-Butylalkohol am Rückfluß für die Dauer von 20 Stunden eingeführt werden.

Eine 6,7-Doppelbindung kann nach dem Verfahren von Agnello u. a., J. Am. Chem. Soc., Bd. 82 (1960), S. 4293, durch Um setzung von Verbindung 5 oder dem entsprechenden 17-Alkohol 26 mit Chloranil in t-Butylalkohol am Rückfluß für die Dauer von 3 Stunden unter Bildung der Verbindung 10 eingeführt werden.

Eine 1,2-Doppelbindung und eine 6,7-Doppelbindung können gleichzeitig nach dem Verfahren von Agnello u. a., vergleiche oben, durch Umsetzung der Verbindung 5 oder des entsprechenden 17-Alkohols 26 mit Chloranil in sek.-Amylalkohol am Rückfluß für die Dauer von 3 Stunden unter Bildung der Verbindung 11 eingeführt werden.

Das gesättigte System des Ringes A mit der 5α-Konfiguration kann nach dem Schema 4 erhalten werden. Typischerweise wird durch Reduktion des 17β-Hydroxy-4-en-3-ons 26 mit Lithium in flüssigem Ammoniak nach dem Verfahren von Stork u. a., J. Am. Chem. Soc., Bd. 86 (1964), S. 1761, die 4,5-Doppelbindung unter Bildung der Verbindung 12 reduziert. Eine Reoxidation des 17-Alkohols in diesem und in jedem der anderen entsprechenden Alkohole kann durch übliche Oxidation mit Chromsäure in Aceton bei etwa 25°C nach dem Verfahren von Jones erreicht werden.

Die 5α-Reihen können auch durch Umwandlung des von Hauser u. a., Helv. Chim. Acta, Bd. 47 (1964), S. 1961, hergestellten Acetats des bekannten 19-Hydroxy-5α-androstan-3,17-dions oder von dessen analog hergestellten 18-Methyl-, 6-Alkyl- und/oder 16-Alkyl-analoga in ein Bisketal, Hydrolyse des Acetats und Oxidation zu dem 19-Aldehyd, sowie Umwandlung in die 10-Allenylverbindung nach einem der Verfahren der Schemata 1 und 2 erhalten werden.

Entweder der 17-Alkohol 26 oder dessen reduziertes 5α-Analogon 12 kann nach dem Schema am Kohlenstoffatom 16 alkyliert werden.

Schema 4

Am Beispiel des durch Borhydrid-Reduktion der Verbindung 5 erhaltenen 17β-Alkohols 26 als Erläuterung der Reaktion wird das Enon mit Ethylenglykol und p-Toluolsulfonsäure in Benzol am Rückfluß mit einer Wasserfalle unter Bildung des Hydroxyketals 20 ketalisiert. Durch Oxidation des 17-Alkohols mit einem Komplex aus Chromtrioxid/Pyridin in Dichlormethan nach dem Verfahren von Ratcliffe u. a., J. Org. Chem., Bd. 35 (1970), S. 4000, wird das 17-Keton 21 regeneriert, das z. B. durch Umsetzung mit Methylchlorformiat und Kalium-t- butoxid und anschließend mit einem niederen Alkylhalogenid unter Bildung des alkylierten Ketoesters 22 am Kohlenstoffatom 16 monoalkyliert werden kann. Eine alkalische Hydrolyse, anschließendes Ansäuern und Erwärmen führt zur Decarboxylierung und Entketalisierung unter Bildung des alkylierten Ketons 23. Das Verfahren gemäß Schema 4 kann auch eingesetzt werden, um die 18-Methyllanaloga am Kohlenstoffatom 16 zu alkylieren.

Die 18-Methylreihe kann aus der bekannten, nach dem Verfahren von Paddely u. a., J. Org. Chem., Bd. 31 (1966), S. 1026, hergestellten Vorstufe 29 hergestellt werden. Das Hydroxyenon 29 wird in die 10-Allenylreihe gemäß Schema 5 umgewandelt.

Schema 5

Das bekannte Hydroxyenon 29 wird mit Isopropenylacetat in das Enoldiacetat 30 umgewandelt. Durch Reduktion mit Natriumborhydrid nach dem Verfahren von Dauben u. a., J. Am. Chem. Soc., Bd. 73 (1951), S. 4463, wird das Endiol 31 erhalten, das durch übliche Behandlung mit Essigsäureanhydrid und Pyridin in sein Diacetat 32 umgewandelt wird.

Das Diacetat 32 wird in Analogie zu der bekannten Verbindung mit einer Methylgruppe am Kohlenstoffatom C13 nach dem Verfahren von Bowers u. a., J. Am. Chem. Soc., Bd. 84 (1962), S. 3204, weiter verarbeitet.

Das Diacetat 32 wird mit N-Bromsuccinimid in das Bromhydrin 33 umgewandelt. Eine Behandlung mit Bleitetraacetat ergibt den cyclischen Ether 34, der durch Hydrolyse des Acetats und Oxidation in das Keton 35 umgewandelt wird. Durch Behandlung mit metallischem Zink wird eine reduktive Öffnung des Ethers und eine Konjugation der Enon-Doppelbindung unter Bildung des 19-Hydroxy-4-en-3-ons 36 bewirkt. Der 19-Alkohol 36 kann zu dem Aldehyd oxidiert und weiter nach den Verfahren der vor stehenden Reaktionsschemata umgewandelt werden.

Die vorstehenden Synthesen stellen eine mögliche Erläuterung der Herstellung der erfindungsgemäßen Verbindungen dar, wobei jedoch auch viele andere übliche Reaktionen eingesetzt werden können, um diese Verbindungen herzustellen oder ineinander umzuwandeln. Diese üblichen Reaktionen und Reaktionsbedingungen können z. B. in Fieser u. a., "Steroids" (Reinhold, New York 1959); Djerassi, Ed., "Steroid Reactions" (Holden-Day, San Francisco, 1963); Kirk u,. a., "Steroid Reaction Mechanisms" (Elsevier, Amsterdam u. a., 1968); Carruthers, "Some Modern Methods of Organic Synthesis" (Cambridge U. Press, Cambridge, 1971); und Harrison u. a., "Compendium of Organic Synthetic Methods" (Wiley-Interscience, New York u. a., 1971) nachgelesen werden.

Die erfindungsgemäße Verbindung hat eine hohe Affinität für Aromatase-Enzyme. Darüber hinaus binden sich die als Aromatase-Inhibitoren wirksamen erfindungsgemäßen Verbindungen an das Enzym in einer Weise, die von der Zeit abhängig ist, wodurch das Enzym nach und nach inaktiviert wird. Daher sind diese Inhibitoren wirksam in der Behandlung von Zuständen, von denen bereits bekannt ist, daß sie auf Aromatase-Inhibitoren reagieren, wobei sie jedoch wegen der Irreversibilität ihrer Hemmwirkung eine verlängerte Wirkung aufweisen.

Die Aromatase-Hemmwirkung der erfindungsgemäßen Verbindungen kann unter Anwendung eines radioenzymatischen Versuches getestet werden. Dazu wird ein aus menschlicher Placenta isoliertes Aromataseenzym-Präparat aus der Protoplasmakörnchenfraktion eingesetzt. Um die Geschwindigkeit der Enzymreaktion im Verlauf von in vitro Inkubationen zu messen, wird eine stereospezifische Eliminierung von 1β- und 2β-Tritium markierungen aus Androgensubstraten, wie Testosteron oder Androstendion, und das anschließende Auftreten von tritiiertem Wasser angewendet.

Die Aromatase-Inhibitoren werden durch Messen ihrer konkurrierenden Hemmung der Umwandlung von ³H-Testosteron in Östrogene auf ihre Enzym-Affinität bewertet. Das 1β,2β-³H-Testosteron (spezifische Aktivität 40 bis 60 Ci/mMol) wird in einer Testpufferlösung zu einer Testkonzentration von etwa 1,7·10^-9 Mol mit etwa 200 000 Zerfallsvorgängen pro Minute in 100 µl gelöst. Die Testpufferlösung enthält 100 mMol KCl, 10 mMol KH₂PO₄, 10 mMol Dithiothreit und 1 mMol Ethylendiamin tetraessigsäure und hat einen pH-Wert von 8,0. Die Hemmverbindungen (etwa 10 mg) werden in Ethanol und/oder Dimethylsulfoxid gelöst und mit Testpufferlösung verdünnt, um Testkonzentrationen von 10^-4 Mol bis 10^-9 Mol zu erhalten. 100 µl an mit Tritium markiertem Testosteron und 100 µl Enzym- Inhibitor werden in ein 35 ml fassendes Zentrifugenrohr gegeben, das 600 µl eines Nikotinamid-adenindinukleotid- phosphat (NADPH) bildenden Systems enthält. Die Aromatase erfordert Nikotinamid-adenindinukleotidphosphat als Cofaktor, und deshalb wird ein diesen Cofaktor bildendes System zugesetzt, welches 0,5 mMol Nikotinamid-adenindinukleotidphosphat (NADP⁺), 2,5 mMol Glucose-6-phosphat und 1,0 Einheit/ml an Glucose-6- phosphat-dehydrogenase in Testpufferlösung enthält. Die Enzym reaktion wird durch den Zusatz von 700 µl des Aromatase präparates, gewöhnlich 50 µg Protoplasmakörnchenprotein pro ml Testpufferlösung, in Gang gesetzt. Diese Präparate werden unter Anwendung eines Mischers (vortex mixer) gemischt und 30 Minuten bei 37°C in einer Gasphase aus 95% O₂ und 5% CO₂ in einem Schüttelinkubator nach Dubinoff inkubiert.

Die enzymatische Reaktion wird durch den Zusatz von 10 ml CHCl₃ beendet. Nach einem weiteren Mischen für die Dauer von 20 Sekunden werden die wäßrig-organischen Emulsionen dispergiert, und dann wird nach dem Zentrifugieren bei 600×g für die Dauer von 10 Minuten eine Phasentrennung bewirkt. Doppelte Proben von 500 µl der oberen wäßrigen Phase jeder Inkubationsprobe werden zu 10×75 mm Kulturröhrchen gegeben. Diese Röhrchen werden mit 500 µl einer kalten, 0,25%igen Suspension von mit Dextran überzogener Kohle versetzt, gemischt, 15 Minuten bei 4°C inkubiert und dann bei 2600×g in einer gekühlten Zentrifuge (4°C) zentrifugiert. Die überstehende Fraktion wird in ein Scintillationsgefäß mit einem Fassungsvermögen von 20 ml dekantiert, und 15 ml eines wäßrigen Scintillationsgemisches (scintillation cocktail) werden zugesetzt. Die Radioaktivität von ³H₂O, das aus während der enzymatischen Reaktion freigesetzten 1- und 2-Tritiumatomen entstanden ist, wird durch Zählen in einem Flüssigkeits-Scintillationszähler für die Dauer von 10 Minuten bestimmt. Dieses Testverfahren wurde nach den Verfahren von Reed u. a., J. Biol. Chem., Bd. 251 (1976), S. 1625, und von Thompson u. a., J. Biol. Chem., Bd. 249 (1974), S. 5364 und 5374, angepaßt.

Die enzymatische Wirksamkeit steht im Zusammenhang mit dem Prozent satz an Tritium, das aus dem ³H-Testosteron freigesetzt wurde und als ³H₂O erscheint. Die Wirksamkeit jeder Inhibitorkonzen tration wird als Prozentsatz der Trägerkontrolle berechnet, die willkürlich als 100% gesetzt wird. Die molare Konzentration jedes Inhibitors, die die Enzymwirksamkeit um 50% verringert, wird als 50%ige Hemmkonzentration, IC₅₀, bezeichnet. Diese Werte für eine erfindungsgemäße Verbindung, nämlich 10-(1,2-Propa dienyl)-östr-4-en-3,17-dion, als Inhibitor und für die Bezugs verbindungen Aminoglutethimid, Androsta-1,4-6-trien-3,17-dion und 1-Dehydrotestololacton, werden in Tabelle I gezeigt. Die 10-Allenylverbindung hat eine größere Enzymaffinität als andere bekannte Inhibitoren, die bereits entweder als Anti fertilitätsmittel bei Nagetieren oder zur Blockierung der peripheren Aromatisierung in Patienten mit Brustkrebs eingesetzt wurden.

Tabelle I
Konkurrierende Hemmung von Aromatase-Inhibitoren
Inhibitorverbindung
IC₅₀
10-(1,2-Propadienyl)-östr-4-en-3,17-dion
7,5×10^-8
α-(p-Aminophenyl)-α-ethylglutarimid (Aminoglutethimid)	1,0×10^-6
Androsta-1,4,6-trien-3,17-dion	1,0×10^-7
1,2,3,4,4a,4b,7,9,10,10a-Decahydro-2-hydroxy-2,4b-dimethyl-7-oxo-1-p-henanthren-propionsäure-O-lacton (1-Dehydrotestololacton)	2,5×10^-6

Die erfindungsgemäße Verbindung, die eine gute Hemmung, IC₅₀ 10^-7 M, zeigte, wurde auf eine zeitabhängige Hemmung untersucht. In diesem Test wurde der Inhibitor mit dem Enzym vorinkubiert, bevor die Enzymwirksamkeit in Gegenwart hoher Substratmengen getestet wurde. Ein zeitabhängiger Abfall der Enzymwirksamkeit zeigt eine irreversible Bindung des Inhibitors an das Enzym an.

In dem zeitabhängigen Test werden solche Mengen des Enzym- Inhibitors in 100 µl der vorstehend beschriebenen Testpufferlösung die Testkonzentrationen ergeben, die etwa 1mal und 10mal dem IC₅₀-Wert entsprechen, in Zentrifugenröhrchen mit einem Fassungsvermögen von 35 ml gegeben, die bereits 600 µl des vorstehend beschriebenen Nikotinamid-adenindinukleotid phosphat bildenden Systems enthalten. Die Vorinkubation wird durch Zusatz von 700 µl Aromatase-Präparat, gewöhnlich 500 bis 800 µg Protoplasmakörnchenprotein pro ml Testpufferlösung, eingeleitet. Diese Präparate werden unter Anwendung eines Mischers (vortex mixer) gemischt und für die Dauer von 0, 10, 20 oder 40 Minuten bei 25°C inkubiert. Anschließend werden 100 µl 1β,2β-³H-Testosteron in Testpufferlösung zugesetzt, so daß eine Testkonzentration des Substrats (4,5×10^-7 Mol), die mindestens 10mal die Km von Testosteron (0,045 µMol) darstellt, bereitgestellt wird. Nach dem Mischen wird die Inkubation des Enzyms noch 10 Minuten fortgesetzt, bevor sie durch Zusatz von Chloroform beendet wird. Die Menge der Radioaktivität in der wäßrigen Fraktion wird durch Scintillations verfahren bestimmt. Die enzymatische Wirksamkeit wird aus dem Prozentsatz von ³H-Testosteron, das in ³H₂O umgewandelt wurde, berechnet. Die Enzymwirksamkeit für jede Inhibitorkonzentration bei jeder Vorinkubationsdauer wird als Prozentsatz der Träger kontrolle bei "0" Minuten, die willkürlich als 100% festgesetzt wird, berechnet. Daher wird die prozentuale Enzymhemmung aus gedrückt als Prozentsatz des Wertes für 100% Enzymwirksamkeit.

Verbindungen, die eine zeitabhängige Hemmung zeigen, werden dann getestet, um die Hemmkonstante K_i zu bestimmen, die die scheinbare Dissoziationskonstante des Komplexes aus Enzym und Inhibitor darstellt. Diese Bestimmung erfordert Messungen bei Anfangsgeschwindigkeiten der Enzymreaktion. Die Enzym wirksamkeit wird nach unterschiedlichen Vorinkubationszeiten bei verschiedenen Inhibitor-Konzentrationen bestimmt, wenn sie bei einer Substratkonzentration von mindestens 10× der Km von Testosteron getestet werden. Die Halbwertszeit (t_1/2) des Enzyms bei diesen verschiedenen Inhibitorkonzentrationen ([In]) wird verwendet, um die K_i durch die lineare Regressions gleichung der Halbwertszeit gegen 1/[In] zu bestimmen. Die K_i ist äquivalent der Inhibitorkonzentration, wenn die Halb wertszeit gleich 0 ist. Die Ergebnisse der zeitabhängigen Versuche sind in Tabelle II zusammengestellt.

Tabelle II

Zeitabhängige Hemmung von Aromatase

Tabelle II zeigt die prozentuale Hemmung nach unterschiedlichen Vorinkubationsdauern vor der Zugabe des markierten Substrates für unterschiedliche Konzentrationen an 10-(1,2-Propadienyl)- östren-dion und Bezugsverbindungen. Die Allenylverbindung zeigt eine bedeutende zeitabhängige Hemmung der Aromatase bei sehr geringen Konzentrationen, d. h. 0,01 bis 0,05 µMol. Bezogen auf diese Wirksamkeiten hat das 10-(1,2-Propadienyl)-östren-dion eine überlegene Wirksamkeit gegenüber bekannten therapeutischen Mitteln, die bei der Therapie von Brustkrebs eingesetzt werden und ebenfalls die Aromatase hemmen.

Die K_i für das 10-(1,2-Propadienyl)-östren-dion beträgt 1,4×10^-8 Mol. Diese Daten zeigen, daß dieser Inhibitor irreversibel an das Enzym mit einer 3× größeren Affinität für den Enzymsitz als derjenigen des natürlichen Substrats Testosteron gebunden ist, welches eine Enzymaffinität (Km) von 4,48×10^-8 Mol aufweist. Die Enzymaffinität der 10-Allenyl verbindung übersteigt die Enzymaffinität von Androsta-1,4,6- trien-3,17-dion um einen Faktor von 8,1, von 1-Dehydrotestololacton um einen Faktor von 58,1 und von Aminoglutethimid um einen Faktor von 1491,2.

Diese Daten zeigen ferner, daß das 10-(1,2-Propadienyl)- östr-4-en-3,17-dion bekannten Aromatase-Inhibitoren überlegen ist.

Die erfindungsgemäße Verbindung ist als Aromatase-Inhibitor therapeutisch anwendbar zur Behandlung jedes normalen oder pathologischen Zustandes, der durch Östrogenbildung vermittelt wird und verantwortlich für die Hemmung der Östrogenbildung ist. Derartige Zustände umfassen diejenigen, die vorstehend bereits beschrieben wurden und von denen gezeigt wurde, daß sie auf Aromatase-Inhibitoren reagieren, sind jedoch darauf nicht begrenzt. Die erfindungsgemäße Verbindung kann auch als irreversibler Inhibitor für Aromatase-Enzyme bei allen Anwendungen, wo hohe Wirksamkeit und Spezifität erfordert werden, verwendet werden.

Im allgemeinen kann die Verbindung der Formel I analog bekannten Aromatase-Inhibitoren, wie z. B. Androsta-1,4,6-trien-3,17-dion, Testololacton oder Amino glutethimid, verabreicht werden. Sie kann oral oder parenteral in fester oder flüssiger Form und gegebenenfalls in Gegenwart eines pharmazeutisch verträglichen Trägers ver abreicht werden. Feste Einheitsdosierungsformen, z. B. Kapseln, Pillen, Tabletten u. dgl., sind geeignet. Einzelne feste Dosierungseinheiten können neben den wirksamen Bestandteilen einen pharmazeutisch verträglichen Träger, z. B. Stärke, Zucker, Sorbit, Gelatine, Gleitmittel, Kieselsäure, Talkum u. dgl., enthalten. Flüssige Dosierungsformen zur oralen Verabreichung oder sterile Injektionslösungen sind zur Anwendung des Verfahrens geeignet. Wenn es sich als klinisch brauchbar erweist, kann mehr als eine Verabreichungsform angewendet werden.

Eine orale Verabreichung der erfindungsgemäßen Verbindungen, z. B. zur Behandlung von Brustkrebs, durch Kapseln oder Tabletten, wird vorteilhaft mit einzelnen Dosierungseinheiten vorgenommen, die 1,0 bis 250 mg, vorzugsweise 10 bis 50 mg des Aromatase- Inhibitors enthalten. Eine tägliche Dosierung von 50 bis 1000 mg, vorzugsweise von 10 bis 150 mg, wird empfohlen.

Die Verbindung der Formel I kann auch als flüssige Suspension oder Lösung unter Verwendung einer sterilen Flüssigkeit, wie z. B. Öl, Wasser, ein Alkohol oder Gemische daraus, mit oder ohne Zusatz eines pharmazeutisch geeigneten oberflächenaktiven Mittels, Suspendiermittels oder Emulgiermittels zur oralen oder parenteralen Verabreichung verabreicht werden.

Eine Suspension oder Lösung zur intramuskulären Injektion enthält vorteilhaft 10 bis 200 mg Aromatase-Inhibitor pro ml der Suspension oder Lösung. Eine Lösung zur intravenösen Injektion enthält vorteilhaft 0,1 bis 10 mg pro ml. Wirksame Aromatase hemmende Dosierungen liegen bei 10 bis 200 mg täglich i. m. und bei 10 bis 100 mg täglich i. v.

Die wirksame Verbindung kann auch mit Hilfe eines Systems der ununterbrochenen Freisetzung verabreicht werden, bei dem die Verbindung der Formel I nach und nach mit einer kontrollierten, gleichförmigen Geschwindigkeit aus einem inerten oder bioerodierbaren Träger durch Diffusion, Osmose oder Zerfall des Trägers während der Behandlungsdauer freigesetzt wird. Abgabesysteme mit kontrollierter Freisetzung der Wirkstoffe können in Form eines auf die Haut oder auf die Mund-, sublinguale oder intranasale Schleimhaut aufzubringenden Pflasters, Lappens oder Verbandes, eines in den Blindsack des Auges einzusetzenden Augeneinsatzes oder einer nach und nach erodierenden Tablette oder Kapsel oder einer oral zu verabreichenden Vorratsform für den Magen-Darm-Trakt vorliegen. Eine Verabreichung mit Hilfe derartiger Abgabesysteme mit ununterbrochener Freisetzung ermöglicht, daß die Körpergewebe konstant für eine verlängerte Dauer einer therapeutisch wirksamen Dosis einer Verbindung der Formel I ausgesetzt sind. Die Einheitsdosis der mit Hilfe eines Systems mit ununterbrochener Freisetzung verab reichten Verbindung entspricht etwa der Menge einer wirksamen täglichen Dosierung multipliziert mit der Höchstzahl der Tage, an denen der Träger auf oder in dem Körper des Patienten verbleiben soll. Der Träger für die ununterbrochene Freisetzung kann in Form einer festen oder porösen Einbettungsmasse oder eines festen oder porösen Vorratsbehälters vorliegen und aus einem oder mehreren natürlichen oder synthetischen Polymeren, einschließlich modifizierter oder nicht modifizierter Cellulose, Stärke, Gelatine, Collagen, Kautschuk, Polyolefine, Polyamide, Polyacrylate, Polyalkohole, Polyether, Polyester, Polyurethane, Polysulfone, Polysiloxane und Polyimide sowie Gemische, Schicht stoffe und Mischpolymerisate daraus gebildet werden. Die Ver bindung der Formel I kann in den Träger mit ununterbrochener Freisetzung in reiner Form eingearbeitet werden oder kann in jedem geeigneten flüssigen oder festen Träger einschließ lich der Polymeren, aus denen der Träger mit ununterbrochener Freisetzung gebildet wurde, gelöst werden.

Beispiele für geeignete Dosierungsformen sind nachstehend angegeben, wenn auch die Erfindung in keiner Weise durch die gewählten Beispiele beschränkt ist, da diese Verabreichungsweisen allgemein bekannt sind.

Es wird angenommen, daß der Fachmann in der Lage ist, die vor liegende Erfindung in ihrem vollen Ausmaß aufgrund der vorliegenden Beschreibung auszunutzen. Die folgenden bevorzugten speziellen Ausführungsformen stellen daher lediglich Erläuterungen dar. In den folgenden Beispielen beziehen sich alle Temperatur angaben unkorrigiert auf °C, und alle Teile und Prozentsätze beziehen sich auf das Gewicht, wenn nichts anderes angegeben ist.

A. Herstellungsbeispiele Beispiel 1 Herstellung von 10-(1,2-Propadienyl)-östr-4-en-3,17-dion (5)

1,8 g (4,4 mMol) 3,17-Bis-(ethylendioxy)-19-ethinylandrost-5- en-19-ol (Verbindung 2, erhältlich gemäß Covey u. a., Tet. Let. 2105 [1979]) in 20 ml Pyridin wurden auf 0°C gekühlt und dann mit 700 mg (6 mMol) Methansulfonylchlorid behandelt. Das Gemisch wurde 48 Stunden bei -20°C gehalten, anschließend mit Ether verdünnt und nacheinander mit 1N HCl, gesättigter NaHCO₃- Lösung und Kochsalzlösung gewaschen und dann getrocknet und konzentriert.

Das erhaltene rohe Mesylat 3 wurde in 50 ml Toluol gelöst und auf -70°C gekühlt, anschließend mit 2 ml einer 70%igen Lösung von Natrium-bis-(methoxyethoxy)-aluminiumhydrid in Benzol be handelt und 12 Stunden bei -20°C stehengelassen. Anschließend wurde sorgfältig Wasser zugesetzt und das Gemisch mit Ether extrahiert. Die Etherlösung wurde mit 1N HCl und anschließend mit wäßriger NaHCO₃-Lösung gewaschen, dann getrocknet und konzentriert, wobei ein Rückstand erhalten wurde, der durch Chromatographie über Silicagel in Ethylacetat/Hexan gereinigt wurde, wobei das Allen 4 erhalten wurde.

Das Allen 4 wurde in 30 ml Aceton gelöst und mit 50 mg p-Toluol sufonsäure versetzt, worauf die Lösung über Nacht bei Raum temperatur gerührt und anschließend konzentriert wurde. Der Rück stand wurde in Ether aufgenommen, mit wäßriger NaHCO₃-Lösung gewaschen, getrocknet, konzentriert und über Silicagel chromatographiert. Das als Produkt erhaltene Diketon wurde weiter durch Umkristallisation aus Hexan gereinigt, wobei das Produkt 5 als farblose Kristalle mit einem Schmelzpunkt von 104 bis 105°C erhalten wurde.

Beispiel 2 Herstellung von 3,17-Bis(ethylendioxy)-10-(1,2-propadienyl)- östr-5-en (4)

3,3 g (8 mMol) Propargylalkohol 2 wurden 16 Stunden bei 25°C mit 10 ml Pyridin und 10 ml Essigsäureanhydrid behandelt. Anschließend wurden die Lösungsmittel unter vermindertem Druck entfernt und der Rückstand wurde in Ether gelöst, nacheinander mit 1N HCl und mit wäßriger NaHCO₃-Lösung gewaschen, über MgSO₄ getrocknet und konzentriert. Der Rückstand wurde gut unter Vakuum getrocknet, wobei das rohe Acetat 6 erhalten wurde. 33 ml einer 2,1M-Lösung von n-Butyllithium (70 mMol) wurden zu einer Aufschlämmung von 9,2 g (70 mMol) 1-Pentinyl-kupfer in 150 ml Ether gegeben, die bei -40°C gehalten und mechanisch gerührt wurde. Das Gemisch wurde 1 Stunde bei -40°C gehalten, dann auf -70°C gekühlt und schließlich mit dem rohen Acetat 6 in 20 ml Ether versetzt. Nach 6 Minuten bei -70°C wurden zunächst 2 ml Methanol und dann eine wäßrige Ammoniumchloridlösung zugesetzt. Das Gemisch wurde mit Ether verdünnt und durch Kieselgur (Celite) filtriert, worauf die Etherphase mit 1N HCl und anschließend wäßriger NaHCO₃-Lösung gewaschen, getrocknet und konzentriert wurde. Der Rückstand wurde über Silicagel unter Verwendung von 25% Ethylacetat/Hexan schnell chromatographiert und aus Dichlormethan/Pentan umkristallisiert, um das Allenyl- bis-ketal 4 mit einem Schmelzpunkt von 113 bis 114°C zu erhalten.

B. Galenische Beispiele Beispiel 3 Tablettenformulierung

Nachstehend ist eine beispielhafte Tablettenformulierung angegeben, die für die Zusammensetzung eines erfindungsgemäßen Aromatase-Inhibitors geeignet ist und sich zur Anwendung bei der Behandlung von durch Östrogen vermittelten Zuständen eignet. Die Mengenverhältnisse sind für eine Verabreichung an einen Patienten mit einem Gewicht von etwa 80 kg, der die Tabletten 3× täglich nehmen soll, vorgesehen.

(a) 10-(1,2-Propadienyl)-östr-4-en-3,17-dion\|10 g
(b) Weizenstärke	50 g
(c) Lactose	150 g
(d) Magnesiumstearat	8 g

Ein durch Mischen der Lactose mit einem Teil der Stärke und einer aus dem Rest der Stärke hergestellten granulierten Stärkepaste erhaltenes Granulat wird getrocknet, gesiebt und mit den wirksamen Bestandteilen (a) und (b) und dem Magnesiumstearat gemischt. Das Gemisch wird zu 1000 Tabletten mit einem Gewicht von jeweils 218 mg verpreßt.

Beispiel 4 Intramuskulär injizierbare Formulierungen

Nachstehend sind Beispiele für intramuskulär injizierbare Zusammensetzungen angegeben, die zur Anwendung der erfindungs gemäßen Verbindungen geeignet sind.

A. Öl
10-(1,2-Propadienyl)-östr-4-en-3,17-dion	10 mg
butyliertes Hydroxyanisol	0,01 % Gew./Vol.
butyliertes Hydroxytoluol	0,01% Gew./Vol.
Erdnußöl oder Sesamöl auf	1,0 ml
B. Suspension @	10-(1,2-Propadienyl)-östr-4-en-3,17-dion	10 mg
Natrium-carboxymethylcellulose	0,5% Gew./Vol.
Natriumbisulfit	0,02% Gew./Vol.
Wasser zur Injektion auf	1,0 ml

die vorstehenden Beispiele können mit gleichem Erfolg durch Ersatz der in den vorstehenden Beispielen angegebenen Bedingungen durch die allgemein oder speziell vorgeschriebenen Reaktionsmittel und/oder Anwendungsbedingungen wiederholt werden.

Claims

1. 10-(1,2-Propadienyl)-östr-4-en-3,17-dion der Formel I

2. 10-(1,2-Propadienyl)steroid-Zwischenprodukt der Formel II

3. Pharmazeutische Zusammensetzung, enthaltend die Verbindung gemäß Anspruch 1 zusammen mit üblichen pharmazeutisch verträglichen Hilfs- und Trägerstoffen.