DE3111522A1

DE3111522A1 - Arzneimittel mit antiulcus-wirkung, entzuendungshemmender und antiallergischer wirkung

Info

Publication number: DE3111522A1
Application number: DE19813111522
Authority: DE
Inventors: Masatoshi Tokyo Harada; Akira Chiba Kumagai; Hiroshi Tokyo Saito; Shibata Tokyo Shoji; Kunio Urawa Saitama Takahashi; Shingo Chiba Yano
Original assignee: Minophagen Pharmaceutical Co Ltd
Current assignee: Minophagen Pharmaceutical Co Ltd
Priority date: 1980-04-01
Filing date: 1981-03-24
Publication date: 1982-01-07
Also published as: GB2134525A; US4374284A; IT8109373A0; GB2075835A; IT1167857B; IT8109373A1; GB8324020D0; GB2075835B; GB2134525B; DE3111522C2

Description

1A-54 581 3 ' ■

B e s c h r e 1 b u η g

Arzneimittel mit Antiulcus-Wirkung, entzündungshemmender und antiallergischer Wirkung

Die Erfindung entzündungshemmende, antiallergische und Antiulcus Mittel, die als Hauptbestandteil Olean-12-en-3ß,30-diol enthalten, das nicht die Nebenwirkungen von Glyzirrhetinsäure besitzt, sowie ein Verfahren zur Herstellung von 0lean-12-en-3ß»30-diol.

Glyzlrrhizin, ein Saponin der Süßholzwurzel, dessen Aglykon, Glyzirrhetinsäure und deren lösliche Derivate besitzen eine ausgezeichnete entzündungshemmende Wirkung und ihre pharmakologischen Wirkungen als Arzneimittel gegen Magengeschwüre und allergische Erkrankungen sind klinisch untersucht und anerkannt. Ihre Verabreichung in höheren Dosen über längere Zeiten führt Jedoch zu sogenanntem Pseudoaldosteronlsmus wie Hypertension, Hypokaliämie und Ödemen aufgrund eines abnormen Metabolismus von Elektrolyten. Daher ist die Anwendung dieser Arzneimittel begrenzt, bezüglich der zu verabreichenden Mengen.

Es wurde nun angenommen, daß die oben erwähnte aldosteronartige Wirkung (Nebenwirkung) von Glyzirrhetinsäure der Tatsache zuzuschreiben ist, daß Glyzirrhetinsäure die Aktivität von 2V-50C- und -5ß-Reductase hemmt,

1300C1/G669

die den Metabolismus von Aldosteron in der Leber bewirkt _f was zu einer Verstärkung der Aktivität von Aldosteron führt. Es wurden nun umfangreiche Untersuchungen durchgeführt, um eine Verbindung zu finden, bei der die aldosteronartige Wirkung (Nebenwirkung) von Glyzirrhetinsäure verringert oder nicht auftritt, bei der Jedoch die charakteristischen physiologischen Wirkungen von Glyzirrhetinsäure erhalten oder verstärkt sind.

Es hat sich nun gezeigt, daß 0lean-12en-3ß,30-diol diese Aufgabe erfüllt. Die Verbindung 0lean-12-en-3ß,30-diol besitzt nicht die Nebenwirkungen von Glyzirrhetinsäure und zeigt dennoch ausgezeichnete Ergebnisse bei Versuchen bezüglich der Antiulcus Wirkung, entzündungshemmenden Wirkung und antiallergischen Wirkung, wie aus den Versuchsergebnissen in den Versuchen (B, C und D) hervorgeht.

Ein Verfahren zur Herstellung von 0lean-12-en-3ßj30-diol ist beschrieben von L.- Canonica et al.; in Gazz. Chim. Ital., 96, 833 (66')· Dieses Verfahren ist in dem folgenden Reaktionsschema I angegeben.

130061/0669

es S <D Λ

Das in dem Reaktionsschema I angegebene Verfahren umfaßt komplizierte Stufen, bei denen das aufwendige Platinoxid angewandt wird. Außerdem ist bei diesem Verfahren in den Zwischenprodukten noch unverändertes Ausgangsmaterial enthalten, wodurch die Trennung und Reinigung der Zwischenprodukte schwierig und die Ausbeute gering wird. Dieses Verfahren ist daher kaum durchführbar und beitzt den starken Nachteil, daß eine industrielle Herstellung unmöglich ist. Es wurden nun wiederum Versuche unternommen, diese Nachteile des bekannten Verfahrens zu vermeiden. Es wurde nun ein neues und günstiges Verfahren entwickelt, das die Erfordernisse für die industrielle Produktion erfüllt, d. h. ein Verfahrende! dem die einzelnen Verfahrensstufen einfach und sicher sind und die Produktionskosten gering.

Es ist Aufgabe der vorliegenden Erfindung _f ein Arzneimittel zu entwickeln, das nicht die als Pseudoaldosteronismus bezeichnete Nebenwirkung der Glyzirrhetinsäure besitzt, jedoch eine ausgezeichnete Antiulcus-Wirkung, entzündungshemmende und antiallergische Wirkung besitzt, obwohl es bekannt ist, daß Glyzirrhetinsäure^ deren Derivate und Salze gute klinische Wirkungen gegen Magengeschwüre, Entzündungen und Allergie besitzen, jedoch bei Langzeitanwendung zu Pseudoaldosteronismus führen. Es hat sich nun gezeigt, daß die Verbindung Olean-12-en-3ß,30-diol ein sehr geeignetes Arzneimittel ist, das die erwähnten Anforderungen erfüllt. Die Erfindung betrifft ferner ein Verfahren zur industriellen Herstellung der Verbindung 0lean-12-en-3ß,30-diol, bei dem die einzelnen Verfahrensstufen wesentlich einfacher sind als bei dem bekannten Verfahren und die Verbindung in hoher Ausbeute zu geringen Kosten erhalten wird«

Die ausgezeichneten Wirkungen der Verbindung Olean-12-en-3|3>30-diol, die nicht die Nebenwirkungen von Glyzirrhetinsäure besitzt_# als Antiulcus-Mittel, entzündungshemmendes

und antiallergisches Mittel wurden durch verschiedene Versuche bestätigt.

Um festzustellen, daß die Verbindung Qlean-12-en-3ß,30-diol nicht zu primären Aldosteronismus führt, wurde folgendermaßen gearbeitet: Zunächst wurden·, drei Verbindungen der folgenden Formeln hergestellt.

/6

.130061/0569

~tf -

^ CH₂OH

(Olean-12-en-3ß,30-diol)

	H	H	^c >	^ COOH
	H		J
H₃C	X^3j
r	Π=3	⁵^H₃

¹H

(Olean-12-en-3ß-ol-30-säure)

(I)

(III)

CH₂OH

..·*Χ Η

H₃C

(Olean-12-en-11-oxo-3ß,30-diol)

H₃C H₃C

130061/0669

/7

Diese verschiedenen Verbindungen wurden erhalten durch unterschiedliche Modifikationen von Glyzirrhetinsäure (0lean-12-en-11-oxo-3ß"-ol-30-säure) der Formel

H₃C H₃C

..^ COOH

( H)

Die oben angegebenen Verbindungen (I), (II), (III) und (IV) wurden auf ihre Wirkung auf δ -5(X-5ß-Reductase, die den Metabolismus von Aldosteron in der Leber bewirkt, untersucht. Es zeigte sich, daß während Glyzirrhetinsäure (II) die Aktivität der Reductase stark hemmte, Olean-12-en-3ß,30-diol (I), das durch Modifikation in den Stellungen 11 und 30 der Glyzirrhetinsäure (II) durch Reduktion erhalten worden ist, keine Hemmung der Aktivität von 5Öl-, 5ß-Rductase in der Leber zeigte· Folglich wurde angenommen, daß 0lean-12-en-3ß,30-diol (I) nicht zur Entwicklung von primärem Aldosteronismus führen würde, der üblicher Weise bei der Verabreichung von Glyzirrhetinsäure über lange Zeiten und in hohen Dosen auftritt (die experimentiellen Ergebnisse sind in Versuch A angegeben). Die Verbindung 0lean-12-en-3ß,30-diol führt nicht zu Nebenwirkungen wie Aldosteronismus, ist geeignet als Arzneimittel mit ausgezeichneter Wirkung gegen Ulcus (Geschwüre), entzündungshemmender¹ und anti-

130061/0669

allergischer Wirkung. Diese pharmakologischen Wirkungen werden im einzelnen anhand der experimentiellen Ergebnisse (Versuche B, C und D) näher erläutert.

Zunächst werden die experimentiellen Ergebnisse, daß Olean-12-en»-3ß,30-diol nicht zum Auftreten eines primären Aldosteronismussyndroms führt, das bei der Verabreichung von Glyzirrhetinsäure über lange Zeiten und in hohen Dosen auftritt, anhand des Versuchs A erläutert.

Versuch A (Hemmung von Reductase)

Im folgenden sind invitro Versuche angegeben zur Untersuchung der Wirkung von Glyzirrhetinsäure (II) und deren modifizierten Verbindungen (III), (IV) und (I) auf δ -5 OC- und -5ß-Reductase für Aldosteron in der Rattenleber angegeben.

Bestimmung der Aktivität von Δ -500- und -5ß-Reduetase. 1. Herstellung von Enzymlösungen

Rattenlebern wurden mit Salzlösung durchgespült und entnommen, um ein 25 oder 50%iges Homogenat mit einer Lösung von 0,25 m Saccharose und 0,001 m EDTA herzustellen. Das Homogenat wurde 20 Minuten mit 10 000 g zentrifugiert, um die überstehende Flüssigkeit abzutrennen, die erneut mit 105 000 g zentrifugiert wurde, wobei man δ -5ß-Reductase als Überstand erhielt. Die am Boden entstandene Perle wurde entsprechend mit einer Lösung von 0,25 m Saccharose 0,001 m EDTA verdünnt und als 5 ft-Reductaselösung verwendet .

/9 130061/0669

/l/l

2. Bedingungen der Inkubation und Bestimmung

CD Aldosteron 0,173 /UM/0,05 ml Äthanol-Lösung

0,173 /uM/0,05 ml Äthanol-Lösung Kontrolle .... 0,05 ml Äthanol-Lösung

Q) Enzym-Lösung

506-Reductase-Lösung 0,1 ml 5ß -Reductase-Lösung 0,1 ml bzw. 0,2 ml

(§> NADPH₂ 2 mg

O Phosphat-Puffer (0,1 M, pH 7,2) 1 ml © Destilliertes Wasser

Die oben erwähnten Komponenten φ _f (g) , (^), (§), (g) und © wurden miteinander vermischt auf ein Gesamtvolumen von 2,5 ml. Das Gemisch wurde 20 Minuten bei 37⁰C inkubiert. Vor der Inkubation wurde ein ml von den 2,5 ml Gemisch entommen und mit 5 ml Methylendichlorid extrahiert. Nach der Inkubation wurden die verbleibenden 1,5 ml mit 5 ml Methylenchlorid extrahiert. Die optische Dichte der beiden Methylendichlorid-Lösungen, die vor und nach der Inkubation hergestellt worden waren, wurde mit einem Spektrophotometer (Hitachi) bei 240 nm gemessen. Die prozentuale Hemmung der a*-5öi- und 5ß-Reductaseaktivität wurde aus dem Unterschied der optischen Dichten berechnet. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

^\Enzym Ver- ν. bindung ^v^	5oC -Reductase Hemmung (%)	5ß-Reductase Hemmung (%)
Kontrolle	0+2,5%	0 + 3,4%
tu]	9,2 + 2,2% (n.s)	87,7 + 2,2% (p< 0_f0Ql)
Uli]	-0,5 + 6,6% (n.s)	20,5 + 4,1% ( " 0_;01)
[IV]	26,5 + 5,6% (p< 0,001)	88_T4 + 4₇7% ( " 0_;001)
ti]	-7_;1 + 2,2% (n.s)	0 + 1_;1% (n.s)

/10

Die Molverhältnisse von Aldosteron zu Glyzirrhetinsäure und deren modifizierten Verbindungen waren gjeich. Aldosteron wurde als Substrat angewandt.

(II) Olean-12-en-11 -oxo-Jß-ol- 30-.säur e

(III) Olean-12-en-3ß-ol-30-säure

(IV) Olean-12-en-11-oxo-3ß,30-diol

(I) Olean-12-en-3ß,30-diol

Als nächstes wurde die Antiulcus-Wirkung von Olean-12-en-3ß,30-diol (I) nach der Erfindung mit derjenigen von Glyzirrhetinsäure (II) verglichen.

Versuch B (Antiulcus Aktivität)

Die folgenden Versuche wurden durchgeführt, um die Antiulcus- Aktivität des erfindungsgemäßen Olean-12-en-3ß,30-diols (I) mit derjenigen von Glyzirrhetinsäure zu vergleichen.

(a) Versuche an Mäusen bei durch Streß induziertem Ulcus. Versuchsverfahren

Männliche ddY-Mäuse mit einem Gewicht von ungefähr 20 g erhielten 18 Stunden keine Nahrung. Sie hatten freien Zugang zu Wasser. Die zu untersuchenden Verbindlangen wurden in Tween 80 suspendiert, um eine wäßrige Suspension zu erhalten und oral verabreicht. Unmittelbar danach wurden die Mäuse 6 Stunden lang einem Streß durch Festhalten und Eintauchen in Wasser von 25°C (restraint plus water immersion stress) ausgesetzt. Anschließend wurde der Magen entnommen und mit Formalin fixiert. Der Grad der Ulcusbildung wurde auf die Gesamtlänge bezogen. Die Kontrollgruppe erhielt nur das Lösungsmittel. Man erhielt die folgenden Ergebnisse :

130061/0669 /11

-M-

Hemmwirkung auf die Ulcuablldung

Verbindung	■ Anzahl der Tiere	Dosis mg/kg (p.o.y	Ulcus-Index	/>
Kontrolle	8		5,63 + 0,55
(D	8	200	2,94 + 0,81	< 0_;05
Kontrolle	8		4,13 + 0,8
(D	8	200	2,19 + 0,6
Kontrolle	8		6,00 ± 0,87
(D	8	200	3j88 + 0,79	< 0,10
(H)	8	200	4,00 + 1.07
Kontrolle	10		4,20 + 0,70
(D	9	200	1_?89 + 0,53	< 0,05
(ID	9	200	3,11 + 0,63
Kontrolle	- 8		4_;13 + 0_;53
(ID	8	200	2,39 + 1,14
(III)	8	200	3,38 + 0_;79

(b) Durch Aspirin induzierter Ulcus bei Ratten a) Versuchsverfahren

Männliche Wister-Ratten mit einem Gewicht von ungefähr 220 g erhielten 24 Stunden keine Nahrung, hatten jedoch freien Zugang zu Wasser. Den Ratten wurde unter Ätheranästhesie die Bauchhöhle eröffnet, der Magen-herausge-

130061/0669

A4

zogen und am Ausgang abgebunden. Unmittelbar anschließend wurde eine 196ige Suspension von Aspirin in CMC oral in einer Dosis von 100 mg pro kg in 5 ml verabreicht. Wäßrige Suspensionen der zu untersuchenden Verbindungen wurden wie bei Versuch a hergestellt und gleichzeitig intraduodenal verabreicht. Die Wunde wurde verschlossen und die Ratten wurden frei gelassen. Nach 7 Stunden wurde der Magen entnommen und die Ulcusbildung wie bei Versuch a gemessen. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Hemmwirkung

Verbindun gen	Anzahl der Tiere	Dosis mg/kg p.o.	Ulcus-Index	f
Kontrolle	5		14,1 + 3,14
II	5	320	13,3 + 3_;99
I	5	320	6,2 + 2_;37	< 0,10

b) Versuchsverfähren

Männliche Wister-Ratten mit einem Gewicht von 120 bis 140 g erhielten 24 Stunden keine Nahrung und die zu untersuchenden Verbindungen wurden oral verabreicht. Nach 5 Stunden wurden die Ratten durch einen Schlag getötet. Der Magen wurde entnommen und das Vorhandensein eines Ulcus beobachtet.

Die Größe des Ulcus wurde durch den Ulcus-Index (Länge χ Breite des Ulcus in mm ) gemessen.

130061/0669

A'b

Hemmwirkung

Verbindun gen	Anzahl der Tiere	Dosis mg/kg (p.o.)	Ulcus-Index
Kontrolle	7		0
Aspirin	7	200	7_;11 ± 1,1
[I]	8	200	0
Aspirin + [I]	4	200 + 200	3,6 + 0,3

(c) Durch Essigsäure induzierter Ulcus bei Ratten

Ein chronischer gastritischer Ulcus (Magengeschwür) wurde induziert durch Eindringen von 100 % Essigsäure durch die Serosa in die Magenwand innerhalb von 60 Sekunden, wobei ein kleiner Becher (Durchmesser 6 mm, Höhe 5 mm) verwendet wurde·

Vom nächsten Tag an wurden die zu untersuchenden Verbindungen zweimal am Tag (morgens und abends)

14 Tage lang oral verabreicht. Die Autopsie wurde

15 Tage nach der Verabreichung durchgeführt.

/14

130061/0669

Vf -

Verbindung	Dosis mg/kg (halbe Do-> sierung 2x/ pro Tagj	Ulcuswert (große Achse χ kleine Achse	Versuch 2	- Gesamt
Kontrolle.		Versuch 1	8,9 + 1.7 ' (8) '	10,4 + 1,4 (15)
II	200	12.0 + 2,3 (7)	11_? 5 + 2₇2 (7)	10,9 + 1,7 (14)
I	400	10,4 + 2_;7 (7)	5,8 + 1.0 (7)	7.1 + 1.2 '(13) ^;
200	8,6 + 2,2 (6)	6,7 + 2,2 (7)	8,4 + 2,0 ⁷(14) ^;
400	10.1 + 3.4 (7)	5,2 + 1,2 (8)	6, 2 + O₇ 8* (14)
7,5 + 0,7 (6)

( ) .... Anzahl der Tiere * ρ < 0,05

Ergebnisse des Versuchs B

(a) die folgenden Wirkungen wurden als Hemmwirkungen gegen Ulcus beobachtet«

(2) Die erfindungsgemäße Verbindung 0lean-12-en-3ß, 30-diol (I) zeigte eine stärkere Hemmwirkung als Glyzirrhetinsaure (II).

Q) 0lean-12-en-3ß-ol-30-säure (III) bei der nur die 11-Stellung reduziert war, zeigte die Wirkung bei einer Dosis von 200 mg/kg wie Glyzirrhetinsaure (II).

/15

130061/0669

(b) Die folgenden Wirkungen wurden als Hemmwirkung gegen durch Aspirin Induzierten Ulcus bei Ratten beobachtet·

Bei Versuch a) zeigte die erfindungsgemäße Verbindung 0lean-12-en-3ß,30-diol (I) eine Hemmwirkung, während Glyzirrhetinsäure (II) diese Wirkung kaum zeigte.

Bei Versuch b) führte0lean-12-en-3ß,30-diol (I) nicht zur Bildung eines Ulcus und hemmte die Entwicklung von durch Aspirin induziertem Ulcus.

(c) Die folgenden Ergebnisse wurden bei der Untersuchung der Bildung von durch Essigsäure induziertem Ulcus bei Ratten erhalten.

Die Hemmwirkungen von 0lean-12-en-3ß,30-diol (i) und Glyzirrhetinsäure (II) wurden untersucht. Bei einer Dosis von 200 mg zeigte die Verbindung (I) eine gewisse Hemmwirkung. Bei einer höheren Dosis von 400 mg zeigten jedoch sowohl (I) als auch (II) Hemmwirkungen. Besonders deutlich ist die Wirkung von (I) verglichen mit derjenigen von (II). Die Heilungsrate bei Verabreichung von (I) betrug mehr als 40 %,

Die oben angegebenen Versuche, bezüglich der Antiulcus-Aktivität,bestehend aus Versuchen gegenüber (a) durch Streß induzierten Ulcus und (b) und (c) durch Chemikalien induzierten Ulcus.bestätigten, daß die erfindungsgemäße Verbindung Olean-12-en-3ß>30-diol (I) wie erwartet bei allen Versuchen eine bessere Wirkung zeigte, als Glyzirrhetinsäure.

/16 130081/0669

- -ve -

Ferner wurden Versuche bezüglich der entzündungshemmenden und analgetischen Wirkung der erfindungsgemäßen Verbindung Olean-12-en-3ß_t 30-diol (I) durchgeführt.

Versuch C (entzündungshemmende und anaigetische Wirkung)

(a) Untersuchung des durch Karrageen Induzierten Rattenpfotenödems.

An der Fußsohle der hinteren Pfote von männlichen Wlster-Ratten wurden subkutan 0,05 ml pro Ratte einer 10%igen Salzlösung von Karrageen verabreicht. Nach 3 Stunden wurde das Ödem durch die Volumenmethode gemessen und die Hemmung bestimmt. Die Verbindungen wurden oral 30 Minuten vor der Verabreichung von Karrageen verabreicht.

Stärke des Ödems

(Volumen des Fußes nach der Verabreichung der Entzündung verursachenden Substanz)
- (Volumen vor der Verabreichung der Entzündung verursachenden Substanz)

(Volumen des Fußes vor Verabreichung der Entzündung verursachenden Substanz)

Stärke der Hemmung

(Ödembildung bei der Kontroll-· gruppe) - (Ödembildung nach Verabreichung eines Arzneimittels)

Ödembildung bei der Kontrollgruppe

130081/066$

- vr

Versuchsergebnisse;

Ödem-Hemmung

Verbindung	Anzahl der Tiere	Dosis mg/kg p.o.	ödem (90	Hemmung (#)
Kontrolle	4		71 + 6	0 76 ,1
Aspirin	4	200	17 + 3	26_f 8
U]	4	200	52+5	73_;2
[I] + Aspirin	4	200 + 200	19 + 4

(b) Wirkung auf das durch Essigsäure induzierte Krümmen der Versuchstiere (analgetische Wirkung)

Versuchsverfahren:

Die erfindungsgemäße Verbindung Olean~12-en-3ß,30-diol (i) wurde männlichen ddY-Mäusen mit einem Gewicht von 25 bis 27 g oral verabreicht. Nach 30 Minuten wurde Salzlösung, enthaltend 0,7 % Essigsäure intraperitoneal verabreicht. Die Anzahl der Krümmungen der Mäuse wurde 10 Minuten nach der Verabreichung 10 Minuten lang gezählt. Aspirin wurde als Vergleich verwendet.

/18

- 18 -

so

Versuchsergebnlsse

Verbindungen	Anzahl der Tiere	Dosis mg/kg (p.ο.)	Anzahl der; Krümmungen
Kontrolle	8		24,9 + 1,6
Aspirin	8	200	0**
[I]	00 00 00	100 200 400	15,5 + 2,8 11,1 + 1,6 8,0 + 1,7**
[II]	8 δ δ	100 200 400	12,2 + 3.5 15_t2 + 3_r6 ll_t7 + 2,9**

** ρ < 0,01

Ergebnisse des Versuchs C

(a) Die erfindungsgemäße Verbindung 0lean-12-en-3ß,30-diol (I) besitzt eine Hemmwirkung gegenüber dem Auftreten von

Entzündungen. Es beeinträchtigt die Hemmwirkung von Aspirin nicht.

(b) Durch Essigsäure induziertes Krümmen der Versuchstiere (analgetische Wirkung).

Zunehmende Dosen, sowohl an der erfindungsgemäßen Verbindung 0lean-12-en-3ß,30-diol (I) und Glyzirrhetinsäure (II), setzen die Anzahl der durch Essigsäure hervorgerufenen Krümmungen deutlich herab. Die Aktivität von (I) ist etwas stärker als von (II).

Die antiallergische Aktivität der erfindungsgemäßen Verbindung 0lean-12-en-3ß,30-diol (I) wurde untersucht.

/19

Versuch D (antiallergische Aktivität) <a) PCA-Test (Typ I Allergie) Versuchsverfahren:

Männliche Wister-Ratten mit einem Gewicht von 200 bis 240 g wurden am Bauch rasiert. Nach 24 Stunden wurden 0,05 ml mit Salzlösung verdünntes Serum intradermal am Bauch injiziert. (Zur Herstellung des Serums wurden Blutproben auf 1:32 und 1:64 verdünnt, die von Ratten dreiWochen nach der Verabreichung von Pertussis Vaccine und Eialbumin gewonnen worden waren) Nach 48 Stunden wurden die zu untersuchenden Verbindungen intraperitoneal verabreicht. Zwei Stunden danach wurden 0,5 ml pro 100 g (Körpergewicht) einer Lösung von Antigen und Pigment (einer Lösung von 0,4 % Eialbumin und 0,5 % Pontamin Himmelblau) verabreicht. Nach 45 Minuten wurde den Ratten der Kopf abgetrennt und die Tiere ausgeblutet und der Durchmesser der Stellej an der das Pigment unter der Haut durchtrat gemessen, um die Fläche zu berechnen. Man erhielt die folgenden Ergebnisse:

Verbindung	Anzahl der Tiere	Dosis mg/kg U.p.)	Bereich (mm²)(Hemmung %)	1/64
Kontrolle	5		1/32	16.4 + 2,8
[II]	5	200	35,2 + 5,3	7,7 ± 6,5 (46,9%)
[I]	5	100	25,2 + 6.6 (71,6%)	6.8 + 4,6 (41,5%)
5	200	22,3 ± 9,1 (63,4%)	6,3 + 4.8 (38,4%)
—

130061/0669

- 20 -

(b) Arthus-Phänomenon-Teet (Typ III Allergie) Versuchsverfahren:

10 mg/kg Eialbumin wurden weiblichen Meerschweinchen mit einem Gewicht von 250 bis 300 g am Rücken (Hinterteil) subkutan injiziert. Nach 21 Tagen wurden 2 mg/kg Eialbumin intravenös indiziert, wobei der Tod der Meerschweinchen aufgrund eines anaphylaktischen Schocks als Bestätigung für das Auftreten einer Sensibilisierung angesehen wurde. 30 Minuten nach dem die zu untersuchenden Verbindungen intraperitoneal verabreicht worden waren, wurden 0, 10, 100 bzw* 1000 ,ug/0,1 ml Eialbumin an der Bauchseite, die rasiert worden war, verabreicht. Nach 12 Stunden wurde die Bauchseite beobachtet, um den Bereich der Stelle der inneren Blutung festzustellen.

Verbindun gen	Anzahl der Tiere .	Dosis mg/kg (i.p.)	Bereich (mm^) (Hemmung %)	f oo	1000«. g/0 _;1 ml
Kontrolle	4		10	110 + 67 (100)	409 + 130 (100)
[I]	4	100	0	98 + 98 (89,1)	334 + 174 (81_;7)
[I]	4	200	0	30 + 30 (27_f3)	76 + 62 (18,6)
0

Ergebnisse des Versuchs D
(antiallergische Wirksamkeit)

(a) PCA-Reaktion (Typ I Allergie)

Bei einer Verdünnung auf 1:64 zeigten die beiden Verbindungen Olean-12-en-3S,30-diol (i) und Glyzirrhitin-

/21

säure (II) eine Hemmung von weniger als 50 96. Dabei ist die Aktivität von (I) etwas stärker als von (II).

(b) Artus-Phänomen-Tests (Typ III Allergie)

Bei der Hemmung des Arthus-Phenomens wurde beobachtet, daß die innere Blutung offensichtlich auf ein Maß von 27,3 bzw. 18,6 % zurückging durch Verabreichung von 200 mg/kg der zu untersuchenden Verbindung.

Wie oben angegeben führt die erfindungsgemäße Verbindung 0lean-12-en-3ß>30-diol (I), die durch reduktive Modifikation der 11- und 30-Stellungen der Glyzirrhetinsäure (II) erhalten wird, in keiner Weise zu der aldosteronartigen Wirkung von Glyzirrhetinsäure· Wie aus den pharmakologischen Daten der Versuche B, C und D hervorgeht, besitzt die Verbindung Jedoch noch die Antiulcus-Wirkung, die für Glyzirrhetinsäure charakteristisch ist und diese Wirkung ist sogar noch stärker. Die erfindungsgemäße Verbindung zeigt auch entzündungshemmende und antiallergische Wirkungen und erfüllt damit die erfindungsgemäße Aufgabe.

Akute Toxizität

Es wurde die akute Toxizität von Glyzirrhetinsäure (II) und 0lean-12-en-3ß,30-diol (I) bei Mäusen, bei oraler und intraperitonealer Verabreichung bestimmt.

Verfahren

Männlichen Mäusen (ddY) mit einem Gewicht von 24 bis 26 g wurden jeweils in Gruppen von 10 Mäusen die zu unter-

130061/0669 _/22

suchenden Verbindungen (suspendiert in Tween 80) in verschiedenen Dosen (Verhältnis 1:2) oral und intraperitoneal verabreicht und die LD₅₀-Werte nach der Litchfield-Wilcoxon-Methode bestimmt.

Ergebnisse

Glyzirrhetinsäure (II)

Orale Verabreichung: LDcn = 560 mg/kg Grenzwerte 518 bis 605 mg/kg P < 0,05 Intraperitoneale Verabreichung: LD₅₀ = 455 mg/kg Grenzwerte 433 bis 478 mg/kg P < 0,05

0lean-12-en-3ß,30-diol (I)

Orale Verabreichung: LD₅₀ ^" 5 g/kg Intraperitoneale Verabreichung: LDc₀ ^ 4 g/kg.

Die überlebenden und toten Tiere werden 48 Stunden und 1 Woche nach der Verabreichung gezählt aber es bestand kein Unterschied.

0lean-12-en-3ß,30-diol (I) besitzt eine sehr geringe Toxizität.

Die erfindungsgemäße Verbindung 0lean-12-en-3ß,30-diol bildet mit organischen und anorganischen Säuren Ester, die ebenfalls unter die Erfindung fallen.

Diese Ester sind in Wasser besser löslich als Olean-12-en-3ß,30-diol. Derartige Ester sind z. B. :

/23

130061/0663

Bernsteinsäureester von 0lean-1?~en-3ß,30-diol:

a) 3-0-Hemisuccinat und dessen Alkalisalze.

b) 3, 30-0-Dihemisuccinat und dessen Alkalisalze.

Phosphorsäureester von Qlean-12-en-3ß _t 30-diol a) 3-O-Phosphat und dessen Dialkalisalze.

Schwefelsäureester von 0lean-12-en-3ß,30-diol

a) 3-O-Sulfat und dessen Alkalisalze.

b) 3,30-Disulfat und dessen Dialkalisalze.

Diese Verbindungen werden vorzugsweise oral verabreicht, sie können jedoch auch perenteral verabreicht werden oder zur topischen Behandlung angewandt werden.

Geeignete Formen zur oralen Verabreichung sind unter anderem Flüssigkeiten (wie Lösungen in Polyäthylenglykol) Tabletten, Suspensionen und Kapseln.

Die tägliche Dosis für einen Erwachsenen beträgt im allgemeinen ungefähr 0,6 bis 20 mg/kg Körpergewicht bei oraler Verabreichung und ungefähr 30 bis ungefähr 1000 mg/Tag bei oraler Verabreichung berechnet auf ein Körpergewicht eines Erwachsenen von 50 kg.

Es hat sich gezeigt, daß die erfindungsgemäße Verbindung 0lean-12-en-3ß,30-diol die erfindungsgemäßen Aufgaben erfüllt, wie aus den pharmakologischen Untersuchungen verschiedener Verbindungen hervorgeht, die synthetisiert worden sind durch Modifizierung von Glyzirrhetinsäure wie oben beschrieben.

Im folgenden wird die Herstellung von 0lean-12-en-3ß,30-diol nach dem in der Literatur angegebenen Verfahren (L. Canonica et al.; Gazz. Chim. Ital.) beschrieben.

130061/0669

- 24 -

(1) Verfahren zur Herstellung von 0lean-12-en-3ß-ol« 30-säure (Hl)

Zu 20 ml Essigsäure wurden 2,4 g Platinoxid gegeben und das Gemisch in einer Hydriervorrichtung 30 h in Gegenwart von Wasserstoff gerührt. Zu der Suspension von Platinoxid wurden 170 ml Essigsäure, enthaltend 4,0 g Glyzirrhetinsäure gegeben und das Gemisch durch achtstündiges Rühren bei Raumtemperatur und Atmosphärendruck reduziert. Man erhielt einen Niederschlag von Olean-12-en-3ß-ol-30-säure. Zu diesem Reaktionsgemisch wurden 100 ml Essigsäure gegeben und das Gemisch auf dem Wasserbad erwärmt. Unlösliches Platin wurde entfernt, die Essigsäure abdestilliert und der Rückstand mehrmals aus Essigsäure umkristallisiert. Man erhielt 0lean-12-en-3ß-ol-30-säure in einer Ausbeute von 80 %,

(2) Verfahren zur Herstellung der gewünschten Verbindung aus 0lean-12-en~3ß-on-30-söure

In 300 ml Chloroform wurden 4,5 g Olean-12-en-3ß-ol-30-säure, die entsprechend (1) erhalten worden war, gegeben. Zu dieser Lösung wurde ein großer Überschuß einer ätherischen Lösung von Diazomethan gegeben. Nach 30 Minuten wurde das Lösungsmittel abgedampft und bei 60°C unter vermindertem Druck eine Stunde getrocknet, wobei man Kristalle erhielt. Diese Kristalle wurden in 100 ml Tetrahydrofuran gelöst. Die Lösung wurde nach und nach zu einer Lösung von 0,36 g Lithiumaluminiumhydrid in 300 ml Tetrahydrofuran gegeben und 1 Stunde gerührt. Nach dem der Aluminiumkomplex in dieser Lösung mit 20 ml Methanol und 20 ml Wasser zersetzt worden war, wurde die Lösung filtriert und das Filtrat mit Salzsäure neutralisiert. Zu dieser Lösung wurden 400 ml Wasser und 400 ml Chloroform gegeben und 3 mal extrahiert. Die Chloroformschicht wurde 3 mal mit Wasser gewaschen und 6 Stunden über Natriumsulfat getrocknet. Nach Abdampfen

/25

1/0669

des Lösungsmittels wurde der Rückstand durch Chromatographie über eine Silicagel-Säule unter Verwendung von Chloroform-Methanol als Entwicklungsmittel gereinigt, wobei man das gewünschte Olean-12-en-3ß,30-diol in einer Ausbeute von 68,3 % erhielt.

Die Erfindung betrifft auch ein neues und günstiges Verfahren zur Herstellung von 0lean-12-en-3ß,30-diol der Formel

^H3^C·.. J⁰CH₂OH

Dieses Verfahren wird im folgenden näher erläutert.

Bei dem erfindungsgemäßen Verfahren zur Herstellung von 0lean-12-en-3ß_f30-diol wird Glyzirrhetinsäure (0lean-12-en-11-oxo-3ß-on-30-säure) zu der Triolverbindung (Olean-12-en-3ß-1if-30-triol) reduziert und die erhaltene Triolverbindung anschließend unter Bildung des gewünschten Produktes katalytisch reduziert. Es gibt zwei Möglichkeiten, die Ausgangsverbindung, Glyzirrhetinsäure, zu der Triolverbindung zu reduzieren. Bei einem Verfahren wird die Reduktion -. direkt unter Verwendung von Natrium-bis-(2-methoxy- J äthoxy)-aluminiumhydrid sls r durchgeführt.

13QD61/Q669

Bel dem anderen Verfahren wird die -COOH-Gruppe der Glyzlrrhetinsäure zunächst mit einer ätherischen Lösung von Diazomethan in die -COOCH,-Gruppe umgewandelt und dann mit Lithiumaluminiumhydrid reduziert.

Nachstehend ist das Reaktionsschema für die am meisten bevorzugte Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens angegeben.

/27

coob

NäA1H₂(0C₂H₄0CH₃)₂

HO

CH₂OH

H₃C CH₂OH

Reaktionsschema 2

CJl Ni

- 28 - - . ■

Das im dem Reaktionsschema 2 angegebene Verfahren ist in dem folgenden Beispiel 1 näher beschrieben bei dem Glyzirrhetinsäure® in Tetrahydrofuran gelöst und direkt mit Natrium-bis-(2-methoxyäthoxy)-aluminiumhydrid reduziert wird unter Bildung der Triolverbindung d), die dann^Athanol gelöst und katalytisch mit dem billigen Pd-C reduziert wird um das gewünschte 0lean-12-en-3ß,30-diol Q) zu erhalten. Dieses Verfahren stellt das günstigste industrielle Verfahren dar, das auch zur Massenproduktion geeignet ist, da die einzelnen Verfahrensstufen sehr einfach und sicher durchgeführt werden können und zu einer hohen Gesamtausbeute von zumindest mehr als 86 % führen.

Als nächstes soll die andere Methode für die erste Stufe des erfindungsgemäßen Verfahrens beschrieben werden, d. h. die Stufe, bei der die Glyzirrhetinsäure zu der Triolverbindung reduziert wird. Bei dieser Ausführungsform wird die -COOH-Gruppe der Glyzirrhetinsäure φ zunächst in die -COOCKU-Gruppe © umgewandelt mit Hilfe einer ätherischen Lösung von Diazomethan und das entstandene Produkt wird dann mit Lithiumaluminiumhydrid in Tetrahydrofuran als Lösungsmittel reduziert, wobei man die Triolverbindung © erhält. Die daran anschließenden Verfahrensstufen sind die gleichen wie bei dem oben angegebenen Verfahren, d. h. die Triolverbindung wird katalytisch mit dem billigen Pd-C katalytisch reduziert unter Bildung der gewünschten erfindungsgemSßen Verbindung. Dieses Verfahren ist in dem Reaktionsschema (^) angegeben.

/29

130Q61

COOH

LiAlH₄

HO

H₅C

CH₂N₂

H₃C _% CH₂CH

Pd/C

H₅C, COOCH₅

ψη*

H₃C CH₂OH

Reaktionsschema 3

- yo -

Dieses Verfahren ist insofern weniger günstig als das in dem Reaktionsschema 2 angegebene, da die Reaktion nicht direkt durchgeführt werden kann und eine zusätzliche Stufe erforderlich ist, in der die COQH-»Gruppe in eine. COOCH,-Gruppe umgewandelt wird. Dieses Verfahren ist in dem folgenden Beispiel 2 beschrieben und führt zu einer Gesaniausbeute von 62 %, die noch wesentlich höher ist als die mit Hilfe des bekannten Verfahrens erreichbaren 53 %.

In den nun folgenden Beispielen sind die in den Reaktionsschemata 2 und 3 angegebenen Verfahren zur Herstellung von Olean-12-en-3ß,30-diol beschrieben.

Beispiel 1

Verfahren nach Reaktionsschema 2

In einen 300 ml Dreihalskolben, der mit einem dichtschließenden Rühren einem RückflußkUhler mit Trockenrohr und einem Tropftrichter mit Seitenarm versehen war, wurden 30 ml getrocknetes Tetrahydrofuran gegeben. Dazu wurden 14,1 ml einer 70%igen Toluollösung von Natrium-bis-(2-methoxyäthoxy)aluminiumhydrid gegeben. Dann wurden zu dem Gemisch nach und nach 4,7 g Glyzirrhetinsäure in 40 ml getrocknetem Tetrahydrofuran über den Tropftrichter mit einem Seitenarm zugetropft. Nach dem Zutropfen wurde das Gemisch 1 Stunden unter Rückfluß erhitzt und anschließend gekühlt. Dann wurde nach und nach 10%ige Salzsäure zugegeben, wobei sich der Aluminiumkomplex unter Aufschäumen zersetzte. Der Niederschlag wurde abfiltriert und zu dem Filtrat wurden 50 ml Wasser zugegeben. Das Filtrat wurde 3 mal mit 200 ml Chloroform extrahiert.

/31

130001/0669

Die vereinigten Chloroformschichten wurden 3 mal mit 200 ml Wasser gewaschen und über Natriumsulfat (waarerfrei) 6 Stunden getrocknet. Das Natriumsulfat wurde abfiltriert und das Lösungsmittel bei nicht mehr als 40°C von dem Filtrat abgedampft, wobei ein Gemisch entstand, das hauptsächlich aus der Triolverbindung bestand. Das Gemisch wurde in 50 ml Äthanol gelöst mit 23 g Pd-C (10 %) und Wasserstoff in einer Hydriervorrichtung 8 Stunden gerührt. Der Katalysator wurde abfiltriert, das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand durch Säuleüchromatographie über Silicagel mit Chloroform-Methanol als Entwicklungsmittel gereinigt. Das Produkt wurde aus Tetrahydrofuran umkristallisiert. Man erhielt 3,81 g eines kristallinen weißen Pulvers von Olean-12-en-3ß,30-diol.

Beispiel 2 Verfahren nach Reaktionsschema 3

4,7 g Glyzirrhetinsäure wurden in Chloroform gelöst und eine ätherische Lösung von Diazomethan zugegeben bis das Reaktionsgemisch gelb wurde* Das Lösungsmittel wurde abgedampft und der Rückstand bei nicht mehr als 60°C unter vermindertem Druck getrocknet. In einen 30 ml Dreihalskolben, der mit einen dicht schließenden Rührer, Rückfluß kühler mit Trockenrohr und einem Tropftrichter mit Seitenarm versehen war» wurden 150 ml getrocknetes Tetrahydrofuran und 0,54 g Lithiumaluminiumhydrid gegeben. Zu diesem Gemisch wurde nach und nach der Methylester von Glyzirrhetinsäure in 50 ml trockenem Tetrahydrofuran über den Tropftrichter zugetropft. Nach einstündigem Rühren wurde der Aluminiumkomplex mit 50 ml Methanol und 50 ml Wasser zersetzt unddes enstandene Gemisch filtriert. Zu dem mit 1Obiger Salzsäure

/32 130061/0669

neutralisierten Filtrat wurden 200 ml Wasser gegeben und das Gemisch 3 mal mit 300 ml Chloroform extrahiert. Die vereinigten Chloroformschichten wurden 3 mal mit 300 ml Wasser gewaschen und 6 Stunden über Natriumsulfat (wasserfrei) getrocknet. Das Natriumsulfat wurde abfiltriert und das Lösungsmittel bei nicht mehr als 40⁰C abgedampft. Man erhielt 3,91 g eines Gemisches, das hauptsächlich die Triolverbindung enthielt. Das Produkt wurde in 300 ml Äthanol gelöst und mit 10 g Pd-C (10 %) und Wasserstoff in einer Hydriervorrichtung 8 Stunden gerührt. Der Katalysator wurde abfiltriert, das Lösungsmittel abgedampft und der Rückstand durch Säulenchromatographie über Silicagel unter Verwendung von Chloroform-Methanol als Entwicklungsmittel gereinigt. Das Produkt wurde aus Tetrahydrofuran umkristallisiert. Man erhielt 2,73 g eines kristallinen weißen Pulvers von Olean-12-en-3ß,30-diol.

Das in den Beispielen 1 und 2 erhaltene Olean-12-en-3ß,30-diol besaß die folgenden Eigenschaften.

(1) Schmelzpunkt 250 bis 251⁰C

(2) IR-Spektrum (cm"¹)

3600-3050 (C^-Stellung, C^-Stellung V-OH

Valenzschwingung) 1630 (Δ¹²"¹³Vc=C)

(3) ¹³C-NMR-Spektrum (Pyridin-d^) appm (TMS) 145,0 (C,,,χ , 123,5 (

78,2 (C₍₃₎-OH), 66,0 (C_(3Q)-OH), 55,9 (C₍₅₎) (4) Massen-Spektrum (m/e) M⁺ gefunden berechnet

442,38 442,73 ^C30^H50°2 234,20 234,38 ^C16^H26°

130061/0669

Claims

Patentansprüche

' 1.j Arzneimittel mit Antiulcus-Wirkung, entzündungshemmender und antiallergischer Wirkung, dadurch gekennzeichnet , daß es als Wirkstoff Olean-12-en-3ß,30-diol der Formel

CH₉OH

oder einen pharmakologisch verträglichen Ester davon enthält, gegebenenfalls zusammen mit üblichen Trägern und/oder Zusätzen.
2. Verfahren zur Herstellung des Wirkstoffs nach Anspruch 1 , dadurch gekennzeichnet , daß man Glyzirrhetinsäure (Olean-12-en-11-oxo-3ß-ol-30-säure) zu der Triolverbindung (Olean-12-en-3ß-11f-30-triol)

130061/0869

/2

reduziert und diese anschließend katalytisch reduziert.
3· Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet , daß man Glyzirrhetinsäure mit einem Alkalialuminium- oder Alkalibor-Komplex der Formel

"RV-G

R-M-R :© '

in der Z ein Alkaliatom, M ein Bor- oder Aluminiumatom und R jeweils ein Wasserstoffatom oder die Gruppe OR bedeutet, in der R ein aliphatischer Rest ist, reduziert unter Bildung der Triolverbindung,die dann mit Hilfe von Wasserstoff und einem Katalysator wie Palladium auf Kohle oder Raney Nickel reduziert wird.
4. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß man die Glyzirrhetinsäure direkt mit Natrium-bis-(2-methoxyäthoxy)aluminiumhydrid unter Bildung der Triolverbindung reduziert, die dann katalytisch mit einem Pd-C-Katalysator reduziert wird.
5. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch g e k e η η nzelchnet, daß man die Glyzirrhetinsäure zu der Triolverbindung reduziert, indem man die COOH-Gruppe durch Behandlung mit einer ätherischen Lösung von Diazomethan in die COOCH^-Gruppe überführt und das Produkt mit Lithiumaluminiumhydrid reduziert und die entstandene Triolverbindung katalytisch mit einem Pd-C-Katalysator reduziert.

6226

130061/0669