DE3032072C2

DE3032072C2 - Verfahren zur Analyse von Protein-Untereinheiten mit Hilfe der Elektrophorese an dünnen Schichten, welche Tetramethylharnstoff o.ä. Harnstoffderivate enthalten

Info

Publication number: DE3032072C2
Application number: DE19803032072
Authority: DE
Inventors: Nikolaus Dr. 6900 Heidelberg Grubhofer
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 1980-08-26
Filing date: 1980-08-26
Publication date: 1982-10-28
Also published as: DE3032072A1

Description

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Analyse von Protein-Untereinheiten gemäß dem Gattungsbegriff des Patentanspruchs.

Die Elektrophorese von Proteinen, also deren Trennung aufgrund verschiedenen Beweglichkeitsverhaltens im elektrischen Gleichspannungsfeld, hat auf dem Gebiet der Biochemie und der medizinischen Diagnostik eine große Bedeutung erlangt Ein Spezialgebiet besteht hier in der Auftrennung der Untereinheiten von Proteinen, welche dadurch entstehen, daß man die Proteine in eine 50%ige Hamstofflösung bringt Menschliches Hämoglobin zerfällt dabei z. B. in vier Untereinheiten, deren elektrophoretische Analyse bei krankhaften Veränderungen diagnostisch viel klarere Aussagen liefert als die Analyse der ganzen Hämoglobine (Altland, K. und Kämpfer, M. (1979) Human Genetics 53.97-100).

Führt man diese Trennung an labormäßig frisch hergestellten Schichten von Agarose oder Polyacrylamid durch, so müssen diesa eine entsprechende Beimischung von Harnstoff enthalten, damit die Untereinheiten nicht wieder in natürlicher Weise zusammentreten und den Trennvorgang komplizieren. Will man nun solche Elektrophorese-Schichten gebrauchsfertig für längere Zeit aufbewahren und in einer für den Handel und für den Versand brauchbaren Formen herstellen, so ergibt sich, daß fertige Schichten, welche solch hohe Konzentrationen von Harnstoff enthalten, gravierende Nachteile haben.

1. Harnstoff zerfällt nach folgender Gleichung

H₂N- CO—NH₂ «-»CNCr+ NH₄ ⁺ (1)

in Ammoniumcyanat.

Das freie Cyanat reagiert mit den in den Proteinen enthaltenen freien Aminogruppen sehr rasch in folgender Weise, unter Bildung von Harnstoffderivaten (Carbamylierung):

Protein-NHj + O=C=NH -»Protein-NH — CO-NH₂

Das führt dazu, daß derartige Lösungen schon im Laufe der Zeitspanne, welche für die Elektrophorese erforderlich ist, neue Umsetzungsprodukte bilden, so daß das Ergebnis der Elektrophorese dann nicht mehr eindeutig ist, weil zusätzlich zunächst im Präparat nicht vorhandene Verbindungen aufgetreten sind. Bei fertig gelieferten Schichten muß damit gerechnet werden, daß diese vor Anwendung monatelang und nicht einmal bei Kühltemperatur gelagert wurde. Aus der bekannten Gleichgewichtslage und den kinetischen Daten für das Gleichgewicht gemäß Gleichung (1) muß mit Konzentrationen bis 5 μπιοΐ/ΐ Cyanat gerechnet werden. Andererseits ist aber bekannt, daß bereits Konzentrationen von 2,5 μΐηοΐ/l Cyanat bei Hämoglobin schon innerhalb der für die Elektrophorese benötigten Zeitspanne mindestens 1 Mol Proteinstickstoff nach Gleichung (2) modifizieren (vgl. Abb. C).

Die Lagerung von Schichten, welche 50% Harnstoff enthalten, ist ohnehin nur bei Zimmertempera- «ι tür möglich. Kühlt man auf die allgemein übliche und auch erforderliche Kühlschranktemperatur von 0—4⁰C ab, so kristallisiert der Harnstoff aus und führt zu irreversiblen Änderungen der Schicht. Es ist bekannt, daß verschiedene Derivate des Harnstoffs ähnliche, zum Teil sogar stärkere »chaotrope« Wirkung haben, welche im Aufbrechen von Wasserstoffbrücken zwischen den Pro- teinmolekülen besteht: z. B. Baum, D. und Herkovits T. T. (1947) Biochemistry 13,68 - 78.

Die Aufgabe der vorliegenden Erfindung besteht nun darin ein einwandfrei arbeitendes. Verfahren zur Analyse von Protein-Untereinheiten mittels Elektrophorese zu schaffen, bei dem die Gefahr der Bildung unerwünschter und das Ergebnis verfälschender Umsetzungsprodukte weitgehend ausgeschaltet ist.

Die Lösung dieser Aufgabe wird durch die im

Kennzeichen des Patentanspruchs beschriebene technische Lehre vermittelt.

Der Harnstoff in Schichten aus wäßrigem Polyamid-Gel oder Agarose kann gemäß Erfindung durch Harnstoff-Derivate ersetzt werden, welche in Wasser keine Cyanat-Ionen bilden und welche bei tieferer Temperatur nicht auskristallisieren. Es handelt sich hierbei insbesondere um alkylsubstituierte Harnstoffe, nämlich die Derivate:

1 ¹V₄ I-"3 *-Γ»4Γΐ9,

i \

N —CO —N

(3)

Dabei ergibt sich als Vorteil, daß solche Präparate in

wesentlich verdünnter Lösung ihre dissoziierenden Eigenschaften entfalten, so daß geringe Mengen zugesetzt werden müssen. So genügt beispielsweise beim Tetramethylharnstoff, also Ri — R4 = CH3, bereits eine Konzentration von 50 g/l, um die vollkommene Auflösung in diesem Zustand während der Elektrophorese zu sichern.

Beispiel 1

Eine zweckmäßig durch Polymerisation von aliphatischen Diolen und Dicarbonsäuren hergestellte Polyesterfolie wird mit einer wäßrigen Schicht von Polyacrylamid-Gel insofern modifiziert, als dem Monomer nach 50 g/l Tetramethylharnstoff in flüssiger Form zugesetzt werden. Die Polymerisation verläuft ähnlich wie die solcher Schichten, welche keinen Tetramethylharnstoff zugesetzt bekommen haben.

Beispiel 2

Eine analog Beispiel 1 hergestellte S-hicht wird dadurch modifiziert, daß dem Monomer 150 g/l Butylharnstoff zugefügt werden.

Beispiel 3

Bei der Herstellung einer wäßrige Harnstoff-Derivate gemäß Formel (3) (Tetramethylharnstoff) enthaltenden Schicht von Polyacrylamid-Gel auf einer Polyester-Folie gemäß Beispiel 1 mit Haftvermittler wurden vor der Polymerisation noch drei Gewichtsprozent (bezogen auf Festkörper) eines Ampholyten gemäß Patent 21 37 617 zugemischt, und zwar insbesondere ein gemäß Beispiel 5c der Patentschrift hergestellter Schnitt zwischen pH 6 und 6,9.

Beispiel 4

Auf eine gemäß Beispiel 1 bis 3 hergestellte Tetramethylharnstoff und Ampholyte zwischen pH 6 und 6,9 enthaltende wäßrige Schicht von Polyacrylamid-Gel auf einer Kunststoff-Folie mit Haftvermittler wurden in einer Elektrophorese-Apparatur Proben von 5 μΐ einer Lösung von Hämoglobin eines menschlichen Neugeborenen in 50% Harnstoff aufgetragen. Einzelheiten siehe Altland, K. und Kaempfer, N. (1980) Electrophoresis 1, 57-62. Sie wurden der Elektrophorese unterworfen.

Vergleichsversuch:

Zum Nachweis des technischen Fortschritts wurden in einem Vergleichsversuch drei verschieden hergestellte dünne Schichten von wäßrigem Polyacrylamid-Gel auf Polyester-Folien miteinander verglichen, welche folgende Zusätze enthielten:

A) 59% Harnstoff, frisch hergestellt,

B) 5% Tetramethylharnstoff, anschließend 126 Tage

bei 18° C gelagert

C) 50% Harnstoff, anschließend 126 Tage bei 18° C gelagert.

Alle drei Schichten wurden unter einheitlichen Bedingungen gemäß Beispiel 4 zur Elektrophorese der Globinfragmente in neonatalem menschlichen Blut verwendet Die Zonen wurden photometriert, wobei in bezug auf die Details auf die deutschen Patentschriften 2127 617 und 23 30 743 hingewiesen wird. Aus den Abbildungen A-C (Fig. I-III) ersieht man, daß eine unter ungünstigen Bedingungen gelagerte Schicht mit Harnstoffgehalt die Auflösung der Globinkomponenten praktisch verhindert, während die unter denselben Bedingungen gelagerte erfindungsgemäß mit Tetramethylharnstoff hergestellte Schicht im Vergleich zu einer nach den gegenwärtig üblichen Methoden frisch mit Harnstoff bereiteten Schicht sich nicht unterscheidet, also eine viermonatige Lagerung bei Raumtemperatur ohne Beeinträchtigung übersteht.

Hierzu 1 Blatt Zeichnungen

Claims

Patentanspruch:

Verfahren zur Analyse von Protein-Untereinheiten mit Hilfe der Elektrophorese an dünnen Schichten unter Verwendung von Schichten wäßriger Polyacrylamid-Gele auf Polyesterfolien, insbesondere durch Polymerisation aliphatischen Diole mit Dicarbonsäuren gewonnenen Polyesterfolien, dadurch gekennzeichnet, daß die Gele substituierte Harnstoffderivate enthalten, in welchen die freien Wasserstoffmoleküle des Harnstoffs teilweise oder ganz durch Alkylreste mit geraden oder verzweigten Ketten ersetzt sind, welche 1 bis 4 Kohlenstoffreste enthalten.