DE2019778B2 - Verfahren zur bestimmung der intrazellulaeren verteilung von ribonukleinsaeuren - Google Patents
Verfahren zur bestimmung der intrazellulaeren verteilung von ribonukleinsaeurenInfo
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Description
Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren strukturen sich orthochromatisch, d. h. hellblau
zur Bestimmung der intrazellulären Verteilung der 25 färben.
Ribonukleinsäuren durch Anfärben von vorher fixier- Zum Testen des erfindungsgemäßen Verfahrens
ten Schnitten tierischer und pflanzlicher Gewebe mit wurden Mäuse- und Rattenleber, Rattenhepatom,
basischen Farbstoffen der Thioningruppe. Larven von Chironomus tetans und Drosophilla me-
Die Kenntnis der Ribonukleinsäureverteilung in lanogaster und Wurzelspitzen verschiedener Pflanzenden
Zellen ist von hervorragender Bedeutung für die 30 arten verwendet.
Zellbiologie. Zur Bestimmung der Ribonukleinsäure- Im folgenden wird das erfindungsgemäße Verfah-
verteilung sind bereits zahlreiche Verfahren bekannt. ren an Hand eines Ausführungsbeispiels näher cr-Man
kennt z.B. metachromatische Methoden, welche läutert:
auf der Eigenschaft des Toluidinblaus und des Kleine Teilchen von Tiergeweben (Volumen == 1 bis
Azurs I und II basieren, rotfarbige Verbindungen 35 2 mm3), Larven oder Wurzelspitzen (2 bis 3 mm lang)
mit der Ribonukleinsäure und den Fettstoffen zu werden 12 bis 24 Stunden bei 5 bis 80C mit einem
bilden (vgl. zum Beispiel B. Romeis, Mikrosko- der unten angegebenen Fixiermittel behandelt:
pische Technik, 16. Auflage, München 1968, S. 151,
pische Technik, 16. Auflage, München 1968, S. 151,
152, 171, 172); diese Methoden sind jedoch unspezi- I· 0,5gewichtsprozentige Chromsäurefisch
und unselektiv. Demselben Zweck dient das 40 lösung ° ml
Pyronin, das die ribonukleinischen Zellstrukturen rot Eisessig 0,4 ml
färbt; mit dieser Methode erreicht man jedoch weder 4O°/oiges Formol 1,6 ml
den Nachweis der chromosomischen Ribonuklein- Jj- Kobaltnitrat 0,1g
säure, noch erhält man Auskunft über die Nukleol- Uranylnitrat 0,1 g
struktur. 45 50/oige Kaliumbichromatlösung 3 ml
Weiterhin sind elektronenmikroskopische und auto- Äthanol 6 ml
radiograpbische Methoden bekannt, bei welchen man Äthyläther 2 ml
tritiumhaltiges Uridin (H3) als Vorgänger in der Ri- 4O°/oiges Formol 4 ml
bonukleinsäurebiosynthese benutzt; beide Verfahren Eisessig 1 ml
setzen jedoch eine teure Apparatur voraus und sind 50
schwierig durchzuführen. Das Fixiermittel wird unter Verwendung von ana-
Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es daher, lysenreinen Substanzen hergestellt,
die bekannten unspezifischen Anfärbeverfahren mit Nach Fixierung werden die Teile mit kaltem Was-
die bekannten unspezifischen Anfärbeverfahren mit Nach Fixierung werden die Teile mit kaltem Was-
Thioninfarbstoffen so zu verbessern, daß ein spezi- ser gewaschen, entwässert, in Paraffin eingelagert und
fischer Nachweis der Ribonukleinsäuren ermöglicht 55 gemäß der üblichen Technik Schnitte von 3 bis 5 Miwird.
krön hergestellt. Nach Entparaffinieren werden die
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß dadurch ge- Präparate in zwei Gruppen A und B geteilt,
löst, daß die Schnitte vor dem Anfärben zuerst mit Die Präparate der Gruppe A werden 20 Minuten
löst, daß die Schnitte vor dem Anfärben zuerst mit Die Präparate der Gruppe A werden 20 Minuten
0,8 Volumprozent konzentrierte Salzsäure enthalten- lang bei 60° C, in 0,1 N HCl-Lösung gebracht, gedem
Methanol und dann mit 0,5- bis lgewichtspro- 60 waschen und entwässert.
zentiger wäßrig-alkoholischer Uranylacetatlösung vor- Sowohl die auf diese Weise behandelten Präparate
behandelt werden und anschließend die Färbung mit der Gruppe A, wie auch diejenigen der Gruppe B
einer 0,005- bis 0,01gewichstprozentigen, wäßrig- werden derselben Behandlung unterworfen: Die
alkoholischen gepufferten Lösung des Farbstoffs Präparate werden nacheinander in drei Bäder mit
durchgeführt wird. 65 absolutem Methanol gebracht und anschließend
Das Verfahren stützt sich auf die Eigenschaft der 1 Stunde bei 37° C in absolutem Methanol, welches
basischen Farbstoffe aus der Thioningruppe und be- 0,8 ml konz. HCl (D = 1,19) pro 100 ml Alkohol
sonders des O-Toluidinblaus, alle ribonukleinischen enthält, stehengelassen. Anschließend werden die
3 - 4
■ herausgenommen, wenigstens zehnmal mit
erw^gekühltem destilliertem Wasser bei 5 bis 8° C ^™™^^ Unter3uchung der auf diese
gewaschen und nachher in eine 0,5- bis l<
>/oige Essig- Die ™™^' zei^ daß aUe ribonuklei-
uranyllösung in SOVoigem Methanol eingetragen und ^""^t gefärbt sind. So erscheint
!Stunde bei Zimmertemperatur stehengelassen; 5 ^^*"J2KRibonlikleinsäure in Form von
darauf werden die Schnitte wemgstens zehnmal mit ^.^^SSSi rotgefärbten Granulationen,
gekühltem Wasser bei 5 bis 8° C gewaschen und ^^^^^bon^Meinsäure ist gekenn-
fo Minuten bei Zimmertemperatur in einer Puffer- Οι^°^°^ε Gramiiationen, die längs der
lösung vom pH-Wert 3,4 bis 3,6 stehengelassen, die ^^^ten Chromosome angeordnet sind,
wie folgt zusammengesetzt ist: ™ ^^^i^Mie aus den Riesenchromosomen
12,5 ml der Speicheldrüsen voi
8 ml haben die Form von
4 ml schrägen Streifen anj
45,5 ml
30 ml schieaener uroncu, ^ m — ——
(Der pH-Wert wird bei der Lösung ohne Methanol ^o^^ndSSmiß^erfahren kann vorteilhaft
eingestellt.) mm Studium des Nukleclverhaltens während der
Schließlich trägt man die Präparate direkt in die *o ^«gHf^VSS. Ä und
frisch hergestellte Farbstofflösung ein, welche durch schtose ^ ^ ™ ^^ in den krebs-Auflösen
von 0,005- bis 0,01 gewichtsprozentigem ^^^Prozessen geben und kann Aufschluß
O-Toluidinblau (Merck) in obiger Pufferlosung her- ^|^η^°η^εί5ε der nukleol-organisierenden
bestellt wurde, und läßt_45 bis 48 Stunden toZmi- ^ ^ä^STüber die Herkunft der Mikro-
nukleole, Nukleoline und Karyosome geben.
Claims (2)
1. Verfallen zur Bestimm.aig der intrazellu- Die Spezifität des, Verfahrens besteht darin, daß
lären Verteüung der Ribonukleinsäuren durch 5 durch Behandlung der Tier- oder Pflanzengewebe-Anfärben
von vorher fixierten Schnitten tierischer schnitte mit salzsaurehaltigeui Methanol die Grup-
und pflanzlicher Gewebe mit basischen Färb- pierungen — COOH (durch Methyherung) und
stoffen der Thioningruppe, dadurchgekenn- — O — SO3H (durch Methanolyse) der sauren PoIyz
e i c h η e t. daß die Schnitte vor dem Anfärben saccharide blockiert werden, wodurch verhindert
zuerst mit 0,8 Volumprozent konzentrierte Salz- ">
wird, daß diese an metachromatischen Reaktionen säuren enthaltendem Methanol und dann mit teilnehmen. _
0,5-bis lgewichtsptpzentiger wäßrig-alkoholischer Durch die Anwendung des Farbstoffs in wäßriger
Uranylacetatlösung vorbehandelt werden und an- alkoholischer Lösung wird weiterhin der Gefahr beschließend
die Färbung mit einer 0,005- bis 0,01- gegnet, daß die sauren Zellfettstoffe metachromatisch
gewichtsprozentigen wäßrig-alkoholischen gepuf- 15 reagieren, da auch die geringsten Alkoholmengen die
feiten Lösung des Farbstoffs durchgeführt wird. von diesen Fettstoffen gebildete Metachromasie ver-
2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch ge- nichten. Durch Verwendung der Uranylacetatlösung
kennzeichnet, daß als basischer Farbstoff aus der wird bei den Arbeitsbedingungen dieses Verfahrens
Thioningruppe O-Toluidinblau verwendet wird. gewährleistet, daß nur die Zellribonukleinsäure
20 wegen der im Molekül enthaltenden Phosphat-
gruppen — beständige metachromatische Komplexe
d. h. rotfarbige Komplexe mit dem Farbstoff bildet, während die anderen nicht ribonukleinischen ZeIi-
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