DE3029111C2

DE3029111C2 -

Info

Publication number: DE3029111C2
Application number: DE3029111A
Authority: DE
Inventors: Bernard Villeneuve D'ascq Fr Fournet; Rene Saint-Ouen L'aumone Fr Zalisz
Original assignee: Roussel Uclaf SA
Current assignee: Sanofi Aventis France
Priority date: 1979-07-31
Filing date: 1980-07-31
Publication date: 1990-03-22
Also published as: NL8004406A; GB2060645A; JPS6363560B2; JPS5622793A; FR2462477B1; CH645130A5; FR2462477A1; GB2060645B; DE3029111A1

Description

Die Erfindung betrifft neue Klebsiella pneumoniae extrahierte Glykoproteine, ein Verfahren zu ihrer Herstellung und die diese enthaltenden pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäß den Patentansprüchen.

Eine Anzahl französischer Patentschriften hat bereits aus Klebsiella pneumoniae extrahierte Glykoproteine beschrieben wie beispielsweise die FR-PS 20 43 475, 20 88 112 und 21 71 907.

Die vorliegende Anmeldung betrifft zunächst anspruchsgemäß definierte Glykoproteine. Diese Glykoproteine enthalten 10-20% Proteine, 50-70% neutrale Osen, 15-25% Glucuronsäure und 1-2% Osamine und besitzen ein Molekulargewicht zwischen 80 000 und 350 000 Dalton.

Als neutrale Osen werden insbesondere neutrale Hexosen wie Glucose, Mannose und Galactose bezeichnet.

Vorzugsweise greift man auf vorstehend definierte Glykoproteine zurück, die dadurch gekennzeichnet sind, daß ihr durch Ultrazentrifugation ermitteltes Molekulargewicht etwa 100 000 Dalton beträgt.

Die erfindungsgemäßen Glykoproteine können aus verschiedenen Klebsiella-pneumoniaestämmen extrahiert werden. Man greift jedoch ganz besonders auf diejenigen zurück, die dem Stamm entstammen, der in dem PASTEUR-Institut unter der Nummer 52 145 hinterlegt wurde.

Die Untersuchung der Struktur dieser Glykoproteine mit Hilfe verschiedener chemischer Techniken, insbesondere der Reduktion der Uronsäurereste mit Carbodiimid, der Permethylierung, des Uronsäureabbaus, der periodischen Oxydation oder der Oxydation mit Chromoxyd, machten es möglich, die Zusammensetzung und die Struktur der erfindungsgemäßen Produkte zu bestimmen.

Die erfindungsgemäßen Glykoproteine werden von einer Proteinkette gebildet, auf die die Polysaccharidfraktion aufgepfropft ist.

Die bevorzugten erfindungsgemäßen Glykoproteine sind diejenigen, bei denen die Proteinfraktion zu etwa 30% aus sauren Aminosäuren besteht. Unter sauren Aminosäuren sind Aminosäuren zu verstehen wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure, d. h. Aminosäuren, die eine Seitenkette besitzen, die eine COOH-Gruppe enthält.

Man greift auch vorzugsweise auf erfindungsgemäße Glykoproteine zurück, bei denen die N-endständige Aminosäure der Proteinfraktion Asparaginsäure ist.

Die bevorzugten erfindungsgemäßen Glykoproteine sind auch diejenigen, bei denen die Polysaccharidfraktion annähernd 9,5-10,5 Glucosemoleküle, 4-5 Mannosemoleküle und 3-3,5 Glucuronsäuremoleküle je 1 Molekül Galactose enthält.

Unter diesen greift man ganz besonders auf diejenigen zurück, bei denen die Polysaccharidfraktion im wesentlichen aus einer Wiederholung der Tetrasaccharideinheit mit der folgenden Struktur besteht:

Unter den neuen erfindungsgemäßen Glykoproteinen greift man auch ganz besonders auf diejenigen zurück, deren Polysaccharidfraktion aus zwei Polysaccharidketten gebildet wird, von denen jede mit der Proteinfraktion über eine N-glykosidische Bindung zwischen einem Glucosaminmolekül von einem Ende der Polysaccharidkette und einem Asparaginmolekül der Proteinkette verbunden ist.

Die Erfindung betrifft ferner das anspruchsgemäße Verfahren zur Herstellung der neuen wasserlöslichen Glykoproteine, die wie vorstehend definiert sind.

Man kann zu Beginn des Verfahrens verschiedene Glykoproteinlösungen verwenden, wobei diese Lösungen durch die Diafiltration der Lysate von Klebsiella pneumoniae-Kulturen über kalibrierten bzw. geeichten porösen Membranen erhalten werden, die Moleküle mit einem Molekulargewicht entsprechend oder höher als ein gegebenes Molekulargewicht, das eine Konstante für diese Membranen ist, zurückhalten können.

Die verwendeten Membranen sind beispielsweise Membranen, die unter den Handelsbezeichnungen AMICON XM50, PM30 und UM 2 verkauft werden, jedoch ist es bevorzugt Membranen zu verwenden, deren Retentionsschwelle 100 000 Dalton beträgt, wie die unter der Bezeichnung XM 100 oder H1 P100 in den Handel gebrachten Membranen. Die ganz besonders bevorzugten Membranen gestatten es, Moleküle, deren Molekulargewicht höher als 300 000 Dalton liegt, zurückzuhalten. Bei diesen handelt es sich vorteilhafterweise um die Membranen, die unter der Bezeichnung XM 300 in den Handel gebracht werden.

Die Diafiltration gestattet es, in Lösung Moleküle, deren Molekulargewicht höher ist als ein gegebenes Molekulargewicht, wie gesagt durch die Wahl der Membranen in Abhängigkeit von der gewünschten Retentionsschwelle auszuwählen.

Vor diesem Verfahrensschritt einer Selektion kann das Lysat sehr vorteilhaft entfettet und von Nukleinsäuren befreit werden.

Gemäß ganz besonders bevorzugten Bedingungen für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Ausgangslösung der Glykoproteine gemäß dem im zweiten Zusatz Nr. 21 71 907 zu der FR-PS 20 43 475 beschriebenen Verfahren erhalten, in dem das Molekulargewicht der Glykoproteine durch die Technik eines Ausschlusses von Gelen bestimmt wurde.

Das quaternäre Ammonium, das man zur Behandlung der Ausgangslösung der Glykoproteine verwendet, kann z. B. das Pyridylcetylammoniumchlorid sein, jedoch ganz besonders das Trimethylcetylammoniumbromid oder Cetavlon.

Nach der Behandlung mit dem quaternären Ammonium kann der Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit mit Hilfe klassischer Verfahren wie die Dekantation oder die Filtration abgetrennt werden, jedoch ist es bevorzugt, durch Zentrifugieren abzutrennen.

Der Niederschlag wird dann vorteilhafterweise erneut mit Hilfe einer 0,2M Natriumchloridlösung gelöst.

Die erhaltene Lösung wird dann in der Kälte bei etwa +4°C mit einem Alkanol mit niedrigem Molekulargewicht wie Methanol, Äthanol, n-Propanol oder Isopropanol behandelt, wobei man jedoch vorzugsweise Äthanol verwendet. Die interessantesten Ergebnisse werden unter Verwendung von sechs Volumenteilen Äthanol je Volumenteil der Salzlösung während einer Nacht bei einer Temperatur von +4°C erhalten.

Der Niederschlag wird erneut in Wasser gelöst und zu seiner Reinigung dialysiert. Die Dialyse wird mit Zellen vom klassischen Typ, die durch Membranen abgedichtet sind, beispielsweise aus Kollodium oder Zellulose, durchgeführt. Man greift vor allem auf Zellen zurück, deren Membran aus regenerierter Zellulose mit einem mittleren Porendurchmesser entsprechend etwa 24 Å besteht, die die Substanzen zurückhalten, deren Molekulargewicht höher ist als der sich von 12-14 000 Dalton erstreckende Wert. Unter den Dialysezellen kann man ganz besonders die Visking- Röhren nennen.

Diese Dialyse gestattet es, aus der Lösung der Glykoproteine verbliebene Verunreinigungen mit geringem Molekulargewicht wie Alkanolspuren zu entfernen.

Gemäß bevorzugten Durchführungsbedingungen ist das vorstehend beschriebene Verfahren dadurch gekennzeichnet,
daß das verwendete quaternäre Ammonium das Cetyl-trimethylammoniumbromid ist,
daß man den ersten Niederschlag durch Zentrifugieren gewinnt und
daß das Alkanol mit niedrigem Molekulargewicht Äthanol ist.

Die Erfindung betrifft demnach Glykoproteine, wie sie nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden.

Die erfindungsgemäßen Produkte besitzen sehr interessante pharmakologische Eigenschaften. Sie sind insbesondere mit bemerkenswerten antibakteriellen und immunostimulierenden Eigenschaften ausgestattet sowie mit einer sehr guten Toleranz.

Diese Eigenschaften werden nachstehend im experimentellen Teil veranschaulicht.

Die erfindungsgemäßen pharmazeutischen Zusammensetzungen finden beispielsweise Anwendung bei der Behandlung oder Verhinderung von durch Bakterien oder Viren bei Menschen oder bei Tieren verursachten Infektionskrankheiten, bei der Behandlung von durch Parasiten bzw. Schädlinge herbeigeführten Krankheiten, bei der Behandlung von toxischen Infektionen und bei der Behandlung von posthospitalen und postchirurgischen Infektionen.

Die übliche Dosis variiert entsprechend dem verwendeten Produkt, dem zu behandelnden Patienten und der jeweiligen Erkrankung und kann z. B. beim Menschen 0,5 mg-10 mg Glykoprotein pro Tag bei oraler Verabreichung, 2-10 mg pro Trag bei rektaler Verabreichung, und 0,25-5 mg pro Tag bei parentaler Verabreichung betragen.

Die entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzungen können z. B. fest oder flüssig sein und in üblicherweise in der Humanmedizin verwendeten pharmazeutischen Formen vorliegen, wie beispielsweise einfache oder dragierte Tabletten, Gelkapseln, Granulate, Lösungen, Sirupe, Suppositorien, injizierbare Präparate, Ovula, Cremes, Pommaden, Lotionen, Tropfen und Augentropfen. Sie werden nach üblichen Methoden hergestellt. Der oder die Wirkstoffe werden hierbei üblicherweise bei derartigen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendeten Excipienten einverleibt wie Talk, Gummiarabicum, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Kakaobutter, wäßrige oder nichtwäßrige Träger, Fettkörper tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, Paraffinderivate, Glykole, verschiedene Netzmittel, Dispergiermittel oder Emulgiermittel und Konservierungsmittel.

Die folgenden Beispiele erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Man löst 20 g des in Beispiel 1 der FR-PS 21 71 907 erhaltenen Produkts in 2 l einer Austauschbehandlung unterzogenem Wasser.

Man fügt langsam etwa 1,6 l 3%iges Cetavlon zu, rührt das Ganze 1 Stunde und zentrifugiert danach 15 Minuten bei 10 000 U/Min.

Der Niederschlag wird mit 0,5 l einer 0,2 M Natriumchloridlösung aufgenommen. Man fügt dann 3 l Äthanol von 95° während 15 Minuten zu. Nach einstündigem Rühren zentrifugiert man bei 10 000 U/Min. während 15 Minuten, entfernt die so gebildete überstehende Flüssigkeit und löst den Niederschlag erneut in 1 l Wasser auf und dialysiert danach 48 Stunden in Visking-Röhren gegen einer Austauscher- Behandlung unterzogenes Wasser von +4°C. Nach Beendigung dieser Dialyse wird die Lösung lyophilisiert. Man erhält 8,16 g der gewünschten Glykoproteine.

Beispiel 2

Man löst 20 g des gemäß Beispiel 1 der FR-PS 21 71 907 erhaltenen Produkts in 1 l einer Austauscherbehandlung unterzogenem Wasser. Man fügt unter Rühren 0,800 l 3%iges Cetavlon zu. Nach einstündigem Rühren zentrifugiert man bei 10 000 U/Min. während 15 Minuten.

Der so erhaltene Niederschlag wird erneut mit 0,250 l einer 0,2 M Natriumchloridlösung aufgelöst. Unter Rühren gibt man 1,5 l Äthanol von 95° zu. Nach einstündigem Rühren zentrifugiert man 15 Minuten bei 10 000 U/Min. Die überstehende Flüssigkeit wird entfernt und der Niederschlag in 0,500 l Wasser aufgenommen und 48 Stunden in Visking-Röhren gegen einer Austauscherbehandlung unterzogenes Wasser von +4°C dialysiert.

Nach Beendigung dieser Dialyse lyophilisiert man die Lösung und erhält 9,4 g der gewünschten Glykoproteine.

Beispiel 3

Man stellte Tabletten der folgenden Formulierung her:

Glykoproteine, erhalten in Beispiel 1\|5 mg
Exipient quantum satis für eine Tablette mit einem Endgewicht von	100 mg

(Bestandteile des Excipienten: Lactose, Stärke, Talk, Magnesiumstearat).

Beispiel 4

Man stellte eine Salbe entsprechend der folgenden Formulierung her:

Glykoproteine, erhalten in Beispiel 2\|200 mg
Exipient quantum satis für	100 g

Pharmakologische Untersuchung A. Antibakterielle Aktivität der gemäß der erfindungsgemäßen Ausführungsform erhaltenen Glykoproteine

Die erfindungsgemäßen Glykoproteine führen zu einem intensiven und dauerhaften antibakteriellen Schutz bei sehr geringen Dosen. Diese Wirkung ist vielseitig und erstreckt sich sowohl auf Gram-positive als auch Gram-negative Stämme. Die Wirkung ist stärker präventiv als heilend.

Das Produkt wird vor der Injektion der Stämme an Mäuse verabreicht.

Bei einer Dosis von 10 γ/kg gewährleisten die Glykoproteine der Beispiele 1 und 2 einen prozentualen Schutz von 100% gegenüber einer Infektion entsprechend 500 LD 50 von Klebsiella pneumoniae. Bei der gleichen Dosis und bei den gleichen Produkten beträgt der Schutz 85% gegenüber einer Infektion entsprechend 12 500 LD 50 von Klebsiella pneumoniae. Bei einer Dosis von 100 γ/kg beträgt er 100% gegenüber 12 500 LD 50 des gleichen Mikro-Organismus.

Die antibakterielle Aktivität gegenüber Klebsiella pneumoniae variiert in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der Verabreichung der Glykoproteine und je nachdem, ob sie 48 oder 86 Stunden vor der Infektion verabreicht werden, beträgt der prozentuale Schutz 30 bzw. 100%. Die erfindungsgemäßen Glykoproteine besitzen somit eine sehr ausgeprägte antibakterielle Schutzwirkung.

B. Stimulierung unspezifischer Abwehrreaktionen

Diese Stimulierung wurde mit Hilfe des "clearance"-Tests mit Kohlenstoff bei der Maus unter Zugrundelegung der von Halpern entwickelten Technik untersucht, die darin besteht, dem Tier in die Augenhöhle eine kolloidale Kohlenstoffsuspension zu injizieren, und in Abhängigkeit von der Zeit die Geschwindigkeit des Verschwindens des Kohlenstoffs in dem Blut zu bestimmen, wobei man Messungen der optischen Dichte durchführt.

Die Produkte werden dem Tier intraperitoneal 24 und 48 Stunden vor dem Test verabreicht, und die Ergebnisse werden als prozentuale Aktivität, bezogen auf die Vergleichstiere, die lediglich die kolloidale Kohlenstoffinjektion erhalten haben, ausgedrückt.

Die Untersuchung dieser Resultate gestattet eine intensive Stimulierung, hervorgerufen durch diese beiden Produkte in bezug auf die Abwehrreaktionen des Organismus, festzustellen.

C. Akute Toxizität

Die zu 50% letale Dosis (LD 50) bei intraperitonealer Verabreichung an die Maus wurde nach der Methode von Behrens und Kärber bestimmt.

Sie beträgt für die Glykoproteine der Beispiele 1 und 2 100 mg/kg.

D. Verträglichkeit

Die subkutane Injektion von 0,2 ml der Glykoproteine der Beispiele 1 und 2 bei einer Dosis von 1000 γ/kg bei der Maus verursacht keine lokale oder allgemeine Unverträglichkeit.

Claims

1. Aus einer durch Diafiltration eines Lysatextraktes von Klebsiella pneumoniae-Kulturen erhaltenen Glykoproteinlösung extrahierte wasserlösliche Proteine, dadurch erhältlich, daß man

a) mit einem quaternären Ammonium die Glykoproteinlösung, erhalten durch Diafiltration des Lysatextrakts von Klebsiella pneumoniae-Kulturen, behandelt, den erhaltenen Niederschlag isoliert und danach mit Hilfe einer wäßrigen Natriumchloridlösung löst, die so erhaltene Salzlösung der Glykoproteine in der Kälte mit einem Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht behandelt, auf diese Weise einen neuen Niederschlag gewinnt, den man erneut in Wasser auflöst, dialysiert und anschließend lyophilisiert, wobei man
b) vorzugsweise als quaternäres Ammonium Cetyl-trimethylammonium und als Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht Äthanol einsetzt und den ersten Niederschlag durch Zentrifugieren isoliert, und des weiteren
c) vorzugsweise als Klebsiella pneumoniae den am Pasteur-Institut unter der Nummer 52145 hinterlegten Stamm einsetzt.

2. Verfahren zur Herstellung der Glykoproteine des Anspruchs 1, dadurch gekennzeichnet, daß man die im Kennzeichen des Anspruchs 1 genannten Maßnahmen in der dortigen Reihenfolge durchführt.

3. Pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff zumindest ein Glykoprotein nach Anspruch 1 enthält.