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DE3029111A1 - Neue glykoproteine von klebsiella pneumoniae, verfahren zu deren herstellung, deren verwendung als arzneimittel und die diese enthaltenden zusammensetzungen - Google Patents

Neue glykoproteine von klebsiella pneumoniae, verfahren zu deren herstellung, deren verwendung als arzneimittel und die diese enthaltenden zusammensetzungen

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DE3029111A1
DE3029111A1 DE19803029111 DE3029111A DE3029111A1 DE 3029111 A1 DE3029111 A1 DE 3029111A1 DE 19803029111 DE19803029111 DE 19803029111 DE 3029111 A DE3029111 A DE 3029111A DE 3029111 A1 DE3029111 A1 DE 3029111A1
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DE
Germany
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new
glycoproteins
glycoproteins according
molecular weight
precipitate
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DE19803029111
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Bernard Fournet
Rene Zalisz
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Sanofi Aventis France
Original Assignee
Roussel Uclaf SA
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Publication date
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Description

ROUSSEL-UCLAF, Paris/Frankreich
Neue Glykoproteine von Klebsiella Pneumoniae, Verfahren zu deren Herstellung, deren Verwendung als Arzneimittel und die diese enthaltenden Zusammensetzungen
Beschreibung
Die Erfindung betrifft neue aus Klebsiella Pneumoniae extrahierte Glykoproteine, ein Verfahren zu ihrer Herstellung, ihre Anwendung als Arzneimittel und die diese enthaltenden Zusammensetzungen.
Eine Anzahl französischer Patentschriften hat bereits aus Klebsiella Pneumoniae extrahierte Glykoproteine beschrieben wie beispielsweise die FR-PSS 2 OKj> 4-75, 2 088 112 und 2 171 907·
Die vorliegende Anmeldung betrifft genauer definierte Glykoproteine und somit neue aus Klebsiella Pneumoniae extrahierte wasserlösliche Glykoproteine, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie 10 - 20 % Proteine, 50 - 70 % neutrale Ösen, 15 - 25 # Glucuronsäure und 1 - 2 % Osamine umfassen, und ein Molekulargewicht zwischen 80 000 und 350 000 Dalton besitzen.
Als neutrale Ösen werden insbesondere neutrale Hexosen wie Glucose, Mannose und Galactose bezeichnet.
Vorzugsweise greift man auf vorstehend definierte Glykoproteine zurück, die dadurch gekennzeichnet sind, daß ihr durch Ultrazentrifugation ermitteltes Molekulargewicht °twa 100 000 Dalton beträgt.
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Die erfindungsgemäßen Glykoproteine können aus verschiedenen Klebsiella-Pneumonlaestämmen extrahiert werden. Man greift jedoch ganz besonders auf diejenigen zurück, die dem Stamm entstammen, der in dem PASTEUR-Institut unter der Nummer 52 145 hinterlegt wurde.
Die Untersuchung der Struktur dieser Glykoproteine mit Hilfe verschiedener chemischer Techniken, insbesondere der Reduktion der Uronsäurereste mit Carbodiimid, der Permethylierung,des Uronsäureabbaus,der periodischen Oxydation oder der Oxydation mit Chromoxyd; machten es möglich die Zusammensetzung und die Struktur der erfindungsgemäßen Produkte zu bestimmen.
Die erfindungsgemäßen Glykoproteine werden von einer Proteinkette gebildet, auf die die Polysaccharidfraktion aufgepfrppft ist.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen Glykoproteine sind diejenigen, bei denen die Proteinfraktion zu etwa j5O % aus sauren Aminosäuren besteht. Unter sauren Aminosäuren sind Aminosäuren zu verstehen wie Asparaginsäure oder Glutaminsäure, d. h. Aminosäuren,die eine Seitenkette besitzen, die eine COOH-Gruppe enthält.
Man greift aunh vorzugsweise auf erl'indungsgemäße Glykoproteine zurück, bei denen die N-endständige Aminosäure der Proteinfraktion Asparaginsäure ist.
Die bevorzugten erfindungsgemäßen Glykoprsteine sind auch diejenigen;bei denen die Polysaccharidfraktion annähernd 9»5 10,5 Glucosemoleküle, 4-5 Mannosemoleküle und 3 - 3»5 Glucuronsäuremoleküle je 1 Molekül Galactose enthält.
Unter diesen greift man ganz besonders auf diejenigen zurück, bei denen die Polysaccharidfraktion im wesentlichen aus einer
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Wiederholung der Tetrasaccharideinheit mit der folgenden Struktur besteht:
Glucose 1 4 Mannose 1 4 Glucose 1
Glucuronsäure
Unter den neuen erfix^dungsgemäßen Glykoproteinen greift man auch ganz besonders auf diejenigen zurück, deren Polysaccharidfraktion aus zwei Polysaccharidketten gebildet wird, von denen jede mit der Proteinfraktion über eine N-glykosidische Bindung zwischen einem Glucosaminmolekül von einem Ende der Polysaccharidkette und einem Asparaginmolekül der Proteinkette verbunden ist.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von neuen wasserlöslichen Glykoproteinen, die wie vorstehend definiert sind, wobei dieses Verfahren dadurch gekennzeichnet ist, daß man eine Glykoproteinlösung,erhalten durch Diafiltration eines Extrakts des Lysats von Klebsiella Pneumoniae-Kulturen mit einem quaternären Ammonium behandelt, den erhaltenen Niederschlag isoliert und ihn danach mit Hilfe einer wäßrigen Natriumchloridlösung löst. Die so erhaltene Salzlösung der Glykoproteine in der Kälte mit einem Alkanol mit niedrigem Molelculargewicht behandelt, auf diese Weise eir.en neuen Niederschlag erhält, den man in Wasser wieder auflöst, dialysiert" und danach· lyophilisiert.
Man kann zu Beginn des Verfahrens verschiedene Glykoproteinlösungen verwenden, wobei diese Lösungen durch die Diafiltration der Lysate von Klebsiella Pneumoniae-Kultüren über kilibrierten bzw. geeichten porösen Membranen erhalten werden, die Moleküle mit einem Molekulargewicht entsprechend o°der höher als ein gegebenes Molekulargewicht, das eine Konstante für diese Membranen ist, zurückhalten können.
Die verv/endeten !"'-mbranen sind beispielsweise Membranen, die unter den Handelsbezeichnungen AMICON XM5O, PM]JO und UM 2 ver-
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kauft werden, jedoch ist es bevorzugt Membranen zu verwenden, deren Retentionsschwelle 100 000 Dalton beträgt, wie die unter der Bezeichnung XM 100 oder Kl PlOO von der Firma AMICON in den Handel gebrachten Membranen. Die ganz besonders bevorzugten Membranen gestatten es,Moleküle, deren Molekulargewicht höher als 500 000 Dalton liegt, zurückzuhalten. Bei diesen handelt es sich vorteilhafterweise um die Membranen, die unter der Bezeichnung XM 300 von den Firmen AMICON und ROMICON in den Handel gebracht werden.
Die Diafiltration gestattet es, in Lösung Moleküle^deren Molekulargewicht höher ist als ein gegebenes Molekulargewicht.wie gesagt durch die Wahl der Membran in Abhängigkeit von der gewünschten Retentionsschwelle auszuwählen. Für den Fachmann ist es offensichtlich, daß die Verwendung anderer Lösungen mit den gleichen Eigenschaften, die durch andere Mittel wie beispielsweise durch Chromatographie über einem hydrophilen polymerisierten Gel erhalten wurden, ganz und gar möglich ist.
Vor diesem Verfahrensschritt einer Selektion kann das Lysat sehr vorteilhaft entfettet und von Nukleinsäuren befreit werden.
Gemäß ganz besonders bevorzugten Bedingungen für die Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens wird die Ausgangslösung der Glykoproteine gemäß dem im zweiten Zusatz No. 2 I7I zu der FR-PS 2 043 475 beschriebenen Verfahren erhalten, in den? das Molekulargewicht der Glykoproteine durch die Technik einos Ausschlusses von Gelen bestimmt wurde.
Das quaternäre Ammonium, das man zur Behandlung der Ausgangslösung der Glykoproteine verwendet, kann z. B. das Pyridylcetylammoniumchlorid sein, jedoch ganz besonders das Trimethylcetylammoniumbromid oder Cetavlon.
Nach der Behandlung mit dem quaternären Ammonium kann der Niederschlag von der überstehenden Flüssigkeit mit Hilfe klassischer
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Verfahren wie die Dekantation oder die Filtration abgetrennt werden, jedoch ist es bevorzugt durch Zentrifugieren abzutrennen.
Der Niederschlag wird dann vorteilhafterweise erneut mit Hilf»= einer 0,2M Natriurachloridlösung gelöst.
Die erhaltene Lösung wird dann in der Kälte bei etwa +40C mit einem Alkanol mit niedrigem Molekulargewicht wie Methanol, Äthanol, n-Propanol oder Isopropanol behandelt, wobei man jedoch vorzugsweise Äthanol verwendet. Die interessantesten Ergebnisse werden unter Verwendung von sechs Volumenteilen Äthanol je Volumenteil der Salzlösung während einer Nacht bei einer Temperatur von +40C erhalten.
Der Niederschlag wird erneut in Wasser gelöst und zu beiner Reinigung dialysiert. Die Dialyse wird mit Zellen vom klassischen Typ, die durch Membranen abgedichtet sind, beispielsweise aus Kollodium oder Zellulose, durchgeführt. T-?an greift vor allem auf Zellen zurück,deren Membran aus regenerierter Zellulose mit einem mittleren Porendurchmesser entsprechend etwa 24A besteht, die die Substanzen zurückhalten, deren Molekulargewicht höher ist als der sich von 12 - 14 000 Dalton erstreckende Wert. Unter den Dialysezellen kann man ganz besonders die VISKING — Röhren nennen.
Diese Dialyse gestattet es aus der Lösung der Glykoproteine verbliebene Verunreinigungen mit geringem Molekulargewicht wie Alkanolspuren zu entfernen.
Man kann offensichtlich die erfindungsgemäßen Glykoproteine etwas weniger rein erhalten, indem man die Dialysestufe nicht durchführt .
Gemäß bevorzugten Durchführungsbedingungen ist das vorstehend
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beschriebene Verfahren dadurch gekennzeichnet, daß: das verwendete quaternäre Ammonium das Cetyl-trimethylammoniumbromid ist,
daß man den ersten Niederschlag durch Zentrifugieren gewinnt
daß das Alkanol mit niedrigem Molekulargewicht Äthanol ist.
Die Erfindung betrifft auch Glykoproteine wie sie nach dem erfindungsgemäßen Verfahren erhalten werden.
Die erfindungsgemäßen Produkte besitzen sehr interessante pharmakologische Eigenschaften. Sie sind insbesondere mit bemerkenswerten antibakteriellen und immunostimulierenden Eigenschaften ausgestattet sowie mit einer sehr guten Toleranz.
Diese Eigenschaften werden nachstehend im experimentellen Teil veranschaulicht.
Diese Eigenschaften rechtfertigen die Vorwendung der vorliegenden Glykoproteine als Arzneimittel.
Die Erfindung betrifft auch die Verwendung der vorstehend definiarten Glykoproteine als Arzneimittel.
Unter den erfindungsgemäßen Arzneimitteln greift man auch auf diejenigen zurüok, die dadurch gekennzeichnet sind, daß sie aus den nach der. erfindungsgemäßen Verfahren erhaltenen Glykoproteinen bestehen.
Diese Arzneimittel finden beispielsweise Anwendung bei der Behandlung oder Verhinderung von durch Bakterien oder Viren bei Menschen oder bei Tieren verursachten Infektionskrankheiten, bei der Behandlung von durch Parasiten bzw. Schädlinge herbeigeführten Krankheiten, bei der Behandlung von toxischen Infektionen und bei der Behandlung von posthospitalen und postchirurgischen Infektionen.
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Die übliche Dosis variiert entsprechend dem verwendeten Produkt, dem zu behandelnden Patienten und der jeweiligen Erkrankung und kann z. B. beim Menschen 0,5mg - 10mg pro Tag bei oraler Verarbreichnung, 2 - 10mg pro Tag bei rektaler Verabreichung, und 0,25 - 5mg pro Tag bei parentaler Verabreichung betragen.
Die Erfindung betrifft schließlich pharmazeutische Zusammensetzungen, die die vorliegenden Glycoproteine als Wirkstoff enthalten.
Als Arzneimittel können die vorliegenden Glycoproteine über den Verdauungswegj den parenteralen oder lokalen Weg verabreicht werden.
Dia entsprechenden pharmazeutischen Zusammensetzungen können z. B. fest oder flüssig sein und in üblicherweise in der Humanmedizin verwendeten pharmazeutischen Formen vorliegen, wie beispielsweise einfache oder dragierte Tabletten , Gelkapseln, Granulate, Lösungen, Sirupe, Suppository en, injizierbare Präparate, Ovula, Cremes, Pommaden, Lotionen, Tropfen und Augentropfen. Sie werden nach üblichen Methoden hergestellt. Der oder die Wirkstoffe werden hierbei üblicherweise bei derartigen pharmazeutischen Zusammensetzungen verwendeten Excipienten einverleibt wie Talk, Gummiarabicum, Lactose, Stärke, Magnesiumstearat, Kakaobutter, wäßrige oder nichtwäßrige Träger, Fettkörper tierischen oder pflanzlichen Ursprungs, Paraiflnderivate, Glykole, verschiedene Netzmittel, Dispergiermittel oder Emulgiermittel und Konservierungsmittel.
Die folgende Beispiele erläutern die Erfindung.
BEISPIEL 1
Man löst 20 g des in Beispiel 1 der FR-PS 2 171 907 erhaltenen Produkts in 2 1 · einer Austauschbehandlung unterzogenem Wasser.
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Man fügt langsam etwa 1,6 1 j5#iges Cetavlon zu, rührt das Ganze 1 Stunde und zentrifugiert danach 15 Minuten bei IO OCO u/Min.
Der Niederschlag wird mit 0,5 1 einer 0,2M Natriumchoridlösung aufgenommen. Man fügt dann 3 1 Äthanol von 95° während 15 Minuten zu. Nach einstündigem Rühren zentrifugiert man bei 10 000 U/Min, während 15 Minuten, entfernt die so gebildete überstehende Flüssigkeit und löst den Niederschlag erneut in 1 1 Wasser auf und dialysiert danach 48 Stunden inVisking-Röhren gegen einer Austauscher-Behandlung unterzogenes Wasser von +4 C. Nach Beendigung dieser Dialyse wird die Lösung lyophilisiert. Man erhält 8,16 g der gewünschten Glykoproteine.
BEISPIEL 2
Man löst 20 g des gemäß Beispiel 1 der FR-PS 2 I7I 907 erhaltenen Produkts in 1 1 einer Austauscherbehandlung unterzogenem Wasser. Man fügt unter Rühren 0,800 1 j5 #iges Cetavlon zu. Nach einstündigem Rühren zentrifugiert man bei 10 000 U/Min, während 15 Minuten.
Der so erhaltene Niederschlag wird erneut in 0,250 1 einer 0,2M Natriumchloridlösung aufgelöst. Unter Rühren gibt man 1,5 1 Äthanol von 95 zu. Nach einstündigem Rühren zentrifugiert man 15 Minuten bei 10 000 U/Min. Die Übersteheade Flüssigkeit wird entfernt und der Niederschlag in O.5OO 1 Wasser aufgenommen und 48 Stunden in Visking-Röhren gegen einer Austauscherbehandlung unterzogenes Wasser von +4 C dialysiert.
Nach Beendigung dieser Dialyse lyophilisiert man die Lösung und erhält 9*4 g der gewünschten Glykoproteine.
BEISPIEL 3
Man stellte Tabletten der folgenden Formulierung her:
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Glykoproteine, erhalten in Beispiel 1 5 mg
Exipient quantum satis für eine Tablette mit einem Dndgewicht von 100 mg
(Bestandteile des Excipienten: Lactose, Stärke, Talk, Magnesiumstearat).
BEISPIEL 4
Man stellte eine Salbe entsprechend der folgenden Formulierung her:
Glycoproteine, erhalten in Beispiel 2 200 mg
Excipient quantum satis für lOO g
PHARMAKOLOGISCHE UNTERSUCHUNG
A_-_Antibakterielle_Aktivität_der_gemäß_der_erfindungsgemäßen_Ausführungsform_erhaltenen_GlYkoproteine
Die erfindungsgemäßen Glycoproteine führen zu einem intensiven und dauerhaften antibakteriellen Schutz bei sehr geringen Dosen. Diese Wirkung ist vielseitig und erstreckt sich sowohl auf Gram-positive als aucü Gram-negative Stämme. Die Wirkung ist stärker präventiv als heilend.
Das Produkt wird vor der Injektion aer Stämme an Mäuse verabreicht.
Bei einer Dosis von 10t-/kg gewährleiten die "Glykoproteine" der Beispiele 1 und 2 einen prozentualen Schutz von 100 % gegenüber einer Infektion entsprechend 500 LD 50 von Klebsiella Pneumoniae. Bei der gleichen Dosis und bei den gleichen Produkten beträgt der Schutz 85 % gegenüber einer Infektion entsprechend 12 500 LD 50 von Klebsiella Pneumoniae. Bei einer Dosis von 100^/kg beträgt er 100 % gegenüber 12 500 LD 50 des gleichen Mikro-Organismus.
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Die antibakterielle Aktivität gegenüber Klebsieila Pneumoniae variiert in Abhängigkeit vom Zeitpunkt der Verabreichung der Glykoproteine und jenachdem^ob sie 48 oder 86 Stunden yor der Infektion verabreicht werden, beträgt der prozentuale Schutz 30 bzw. 100 %. Die erfindungsgemäßen Glykoproteine besitzen so mit eine sehr ausgeprägte antibakterielle Schutzwirkung.
Diese Stimulierung wurde mit Hilfe des "clearance"-Tests mit Kohlenstoff bei der Maus unter Zugrundelegung der von HALPERN entwickelten Technik untersucht, die darin besteht, dem Tier in die Augenhöhle eine kolloidale Kohlenstoffsuspension zu injizieren, und in Abhängigkeit von der Zeit die Geschwindigkeit des Verschwindens des Kohlenstoffs in dem Blut zu bestimmen, wobei man Messungen der optischen Dichte durchführt.
Die Produkte werden dem Tier intraperitoneal 24 und 48 Stunden vor dem Test verabreicht, und die Ergebnisse werden als prozentuale Aktivität, bezogen auf die Vergleichstiere, die lediglich die kolloidale Kohlenstoffinjektion erhalten haben, ausgedrückt.
PRODUKT 0,
0,		 DOSEN mg/kg
mg/kg		 ^-Aktivität Γ
Vergleichstiere
von
Beispiel:		 8 Minuten
nach d.Injektio:		 30 Minuten
ι nach d.Injektion
1
2		 ro ro
VJl VJl		 42 %
43 % 		65 %
; 65 %
Die Untersuchung dieser Resultate gestattet eine intensive Stimulierung, hervorgerufen durch diese beiden Produkte in Bezug auf die Abwehrreaktionen des Organismus^festzustellen.
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C - Akute_Toxicität
Die zu 50 % letale Dosis (LD 50) bsi intraperitonealer Verabreichung an die Maus wurde nach der Methode von BEHRENS und KÄRBER bestimmt.
Sie beträgt für die Glycoproteine der Beispiele 1 und 100 mg/kg.
Die subkutane Injektion von 0,2 ml der Glykoproteine der Beispiele 1 und 2 bei einer Dosis von lOOOf/'Kg Dei der Maus verursacht keine lokale oder allgemeine Unverträglichkeit.
Λ'
130008/088S

Claims (1)

Dr. F. Zumstein sen. - Dr. F.. Asstnann - Dr. R Koenigsberger Dipl.-Phys. R. Holzbauer - Dipl.-ing. F. K lingseisen - Dr. F. Zumstein jun. PATENTANWÄLTE 80OO München 2 · BräuhausstraQe 4 ■ Telefon Sammel-Nr 22 53 41 · !«ijgrammi Zumpat - Telex 5 29 979 14/90/N Cas I892 D Patentansprüche
1. Neue aus Klebsiella Pneumoniae extrahierte wasserlösliche Proteine, dadurch gekennzeichnet, daß sie 10 % Proteine, 50 - 70 % neutrale Ösen, 15 - 25 % Glucuronsäure und 1 - 2 % Osamine enthalten und ein Molekulargewicht zwischen 80 000 und 350 000 Dalton besitzen.
2. Neue Glykoproteine gemäß Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß ihr Molekulargewicht etwa 100 000 Dalton beträgt.
3. Neue Glycoproteine gemäß Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus dem in dem PASTEUR-Institut unter der Nummer 52.145 hinterlegten Stamm extrahiert werden.
4. Neue Glykoproteine gemäß einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Proteinfraktion aus etwa 30 % Aminosäuren besteht.
5. Neue Glykoproteine gemäß einem der Ansprüche 1 bib 4, dadurch gekennzeichnet, daß die N-endständige Aminosäure der Proteinfraktion Asparaginsäure ist.
6. Neue Glykoproteine gemäß einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die Polysaccharidfraktion annähernd 9,5 - 10,5 Glujosemoleküle, 4-5 Mannosemoleküle und 3-3,5 Glucuronsäuremoleküle je 1 Molekül Galactose umfaßt.
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7. Neue Glykoproteine gemäß Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Poly.saccharidfraktion im wesentlichen aus einer Wiederholung der Tetrasaccharideinheit besteht, deren Struktur die folgende ist :
[3 Glucose Mannose — Glucose - j—
1
Glucuronsäure
8. Neue Glykoproteine gemäß einem der Ansprüche 1 bis Jt dadurch gekennzeichnet, daß die Polysaocharidfraktion aus zwei Polysaccharidketten gebildet wird, von denen jede an die Proteinfraktion über eine N-glucosidische Bindung zwischen einem Glucosamin-Molekül von einem Ende der PoIysaccharidkette und einem Asparagin-Molekül der Protein-. kette gebunden ist.
9. Verfahren zur Herstellung der neuen Glykoproteine gemäß einem der Ansprüche 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß man mit einem quaternären Ammonium sine Glykoproteinlösung, erhalten durch Diafiltration eines Lysatextrakts von Klebsiella Pneumoniae-KuItüren, behandelt, den erhaltenen Niederschlag isoliert und danach mit Hilfe einer wäßrigen Natriumchloridlösung löst, die so erhaltene Salzlösung der Glykoproteine in der Kälte mit einem Alkohol mit niedrigem Molekulargewicht behandelt, auf diese Weise einen neuen Niederschlag gewinnt, den man erneut in Wasser auflöst, dialysiert und anschließend lyophllisiert.
10. Verfahren ger.äß Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, daß das verwendete quaternäre Ammonium Cetyl-trimethylammonium ist,
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daß man den ersten Niederschlag durch Zentrifugieren isoliert und
daß das Alkanol mit niearigem Molekulargewicht Äthanol ist.
11. Neue Glykcproteine, erhalten durch das Verfahren gemäß den Ansprüchen 9 oder 10.
12. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus den neuen wasserlöslichen Glykoproteinen gemäß den AnAnsprüchen 1 oder 2 bestehen.
15. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus den neuen wasserlöslichen Glykoproteinen gemäß einem der Ansprüche 3 bis 8 bestehen.
14. Arzneimittel, dadurch gekennzeichnet, daß sie aus den Glykoproteinen gemäß Anspruch 11 bestehen.
15. Pharmazeutische Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff zumindest eines dar Arzneimittel gemäß einem der Ansprüche 12 oder 13 enthalten.
16. Pharmazeutische Zusammensetzungen, dadurch gekennzeichnet, daß sie als Wirkstoff zumindest eines Arzneimittel gemäß Anspruch 14 enthalten.
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DE19803029111 1979-07-31 1980-07-31 Neue glykoproteine von klebsiella pneumoniae, verfahren zu deren herstellung, deren verwendung als arzneimittel und die diese enthaltenden zusammensetzungen Granted DE3029111A1 (de)

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