DE3019554A1 - Gewinnung von attenuierten viren fuer lebendimpfstoffe - Google Patents

Description

• Verfahren zur Gewinnung von mittels Transfektion in ihrer Pathoqenität
• abgeschwächten Viren für Lebendimpfatoffe Bei der Bekdmpfung von virusbedingten Infektionskrankheiten des Menschen kommt der Verwendung sog. Lebendimpfstoffe, d. h. Impfstoffe, die in ihrer Pathogenität abgeschwächte, aber im Impfling voll vermehrungsfähige (-attenuierte) Erreger enthalten, ganz besondere Bedeutung zu.
• Als Beispiel seien die Iebendimpfstoffe gegen Polio, Masern, Röteln, Mumps und Gelbfieber genannt.
• Bisher war die Gewinnung von attenuierten Impfstoffviren nur durch langwierige Passagierung des Wildvirus im Tier und in für die Vermehrung des Virus nicht optimalen Gewebekultursystemen möglich, wobei die zur Attenuierung führenden Schritte nicht vorhersehbar waren und in mühseligen Versuchen durch Erprobung gefunden werden mußten.
• tiberraschenderweise hat sich gezeigt, daß man attenuierte Viren, wie sie für die Herstellung von Lebendimpfstoffen benötigt werden, gezielt in vergleichsweise kurzer Zeit dadurch gewinnen kann, daß man die Nukleinsäure des Virus extrahiert und in geeigneten Zellkulturen unter Zusatz von die Infektiosität der Nukleinsäure steigernden Substanzen zur Auslösung der Virusproduktion verwendet (Transfektion) Als Beispiel sind in Tabelle 1 entsprechende Befunde für Coxsackievirus des Types A7 dargestellt.
• Die Konzentration an infektiösem Virus, ausgedrückt in der für 50% der vorgelegten Zellen infektiösen Virusdosis (TCID50), wurde für ein Wildvirus Coxsackie A7 und ein durch Transfektion daraus gewonnenes, attenuiertes Coxsackie A7 ermittelt.
• Abgestufte Verdünnungen dieser Virussuspensionen wurden an Gruppen neugeborener Saugmäuse innerhalb von 24 Stunden nach Geburt verabfolgt (pro Tier 0,1 ml Virussuspension subcutan dorsal, pro Virusverdünnung 12 Tiere). Für eine Beobachtungszeit von 14 Tagenwurde die Rate der als Folge der Infektion qestorbenen Tieren ermittelt und nach der Methode von Reed und Muench die Virusverdünnung ermittelt, die- gerade ausreichte, um 50% der Tiere zu töten.
• Danach wurde die dieser Verdünnung entsprechende Dosis an infektiösem Virus (TCID50) berechnet. Es zeigte sich, daß zur Tötung von 508 der Tiere etwa 105fach mehr durch Transfektion gewonnenes Virus erforderlich war als im Falle des Wildvirus. Dies bedeutet eine etwa 105fache Abschwächung der pathogenen Wirkung des Ooxsackievirus als Folge der Transfektion.
• Wegen der bek-annten Parallelität der Pathogenität von Coxsackie-Viren bei Saugmaus und Mensch kann hieraus geschlossen werden, daß das attenuierte Virus beim Menschen als Impfvirus mit voller Immunogenität und fehlender pathogener Auswirkung anwendbar wäre.
• Beispiel: 12,5 ml Coxsackievirus A7 (TCIDS0/0,2 ml) wurden nach Zusatz von 18 SDS (Natriumdodecylsulfat) mit 12,5 ml mit Wasser gesättigten Phenol bei 600C für 5 Minuten kräftig geschüttelt. Die Phasen wurden durch Zentrifugation in einer Minifuge II im Rotor 3350 getrennt (20', 40C,'4000 upm).
• Die wässerige Schicht wurde vorsichtig mit einer Ribonuclease-freien Pasteurpipette abgebebert und nochmals wie heschrieben behandelt. Danach wurde das Phenol durch 7 maliges Schütteln mit 40 ml kaltem, puffergesättigtem Äther entfernt. Anschließend wurde der Äther durch Durchperlen von Stickstoff durch eine Ribonuclease-freie Pasteurpipette eliminiert.
• Geeignete Zellkulturen (HSp-2) wurden mit PBS (0,15 M NaCl, 0,01 M Phosphat pH 7,0) oder nHank's Salzlösung sehr gründlich gewaschen, um Serumreste komplett zu entfernen. Danach wurden die Kulturen 30' bei Raumtemperatur mit 250 ug/ml DEAE-Dextran (5 ml auf 680 cm" Zellrasen) inkubiert. Anschließend wurde nach Abgießen der 5 ml die Ribonukleinsäure in 250 ug/ml DEAE-Dextran suspendiert den Zellen zugegeben (3 ml Nukleinsäure pro 680 cm2 Zellrasen) und 60' bei Raumtemperatur inkubiert.
• Anschließend wurden 300 ml tßedius Eagle mit Earle's Salzen, 2% Kälberserum, 100 IcE. Penicillin und 100 mcg Streptomycin/ml zugegeben und inkubiert bei 370C bis zum Auftreten eines vollständigen cytopathischen Effekts 4 - 5 Tage nach Infektion.
• Das aus der Transfektion mit Ribonukleinsäure erhaltene Virus wurde durch wiederholtes Einfrieren und Auftauen vom Zelldetritus gelöst und dieser durch Zentrifuqation abgetrennt. Danach erfolgte eine TCID50-Bestimmung und eine bakterielle Sterilitätskontrolle.
• Tabelle 1 Verglich der Pathogenität von Wildvirus Coxsachie A/ und des darus durch Transfektion gewonnen attenuierten Virus im Saugnausversuch.
• TCID50 Anzahl an infektiösen HEp-2 Zellen Viruseinheiten (TCID50) zur Tötung on 50% der Tiere gerade ausreichend Coxsachie A7 (wild) 106,16 104,98 Coxsachie A7 (trans- 107,39 1010,1 feriert)

Claims (1)

1. Ansprüche Anspruch 1: Verfahren zur Herstellung von attenuierten Viren für Lebendimpfstoffe, dadurch gekennzeichnet, daß s3afi im Impfstoff vorlieqendt Virus durch Transfektion (Infektion von Gewebekulturen mit zuvor isolierter Virusnukleinsäure unter Zusatz von die Infektiosität der Virusnukleinsäure steigernder Substanz) gewonnen wird.

   Anspruch 2: Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß die virale Nukleinsaure von Mitgliedern der Picornavirusgruppe Coxsackie A (1 - 24) und B (1 - 6), Echo (1 - 34), Polio 1, 2, 3 sowie rhino (1 - 80) gewonnen wird.

   Anspruch 3: Verfahren nach Anspruch 1 dadurch gekennzeichnet, daß als die Infektiosität der Nukleinsäure steigernder Zusatz bei der Beimpfung der Zellkulturen DEAE-Dextran (MW 500.000) in einer Konzentration von 250 uq/nl verwendet wird.