DE936471C - Verfahren zur Herstellung einer Staupevaccine - Google Patents

Description

• Verfahren zur Herstellung einer Staupevaccine Die Erfindung betrifft die Herstellung einer neuen Staupevaccine und insbesondere die Herstellung einer Vaccine, welche einen lebenden, avirulenten Virus enthält, der bei der Injektion in Tiere der Familien canis und mustela immune Antikörper zu erzeugen vermag, welche mit denjenigen identisch sind, welche durch die Erreger von Hundestaupe, Hartballenkrankheit und Hundeencephalitis erzeugt werden.
• Bisher wurden verschiedene Methoden zur Immunisierung von Angehörigen der Familien canis und mustela (wie Hunde, Füchse, Nerze usw.) gegen Staupe angewandt. Eine dieser Methoden besteht darin, daß das Tier mehrere Injektionen einer abgetöteten oder inaktivierten Virusvaccine erhält, von der man annimmt, daß sie Antigene der Hundestaupe enthält. Wenn hierdurch eine zeitliche Immunität bewirkt wurde, so wird das Tier mit virulentem Staupevirus geimpft, wonach eine dauernde Immunität hervorgerufen wird. Diese Methode besitzt jedoch den Nachteil, daß die Inaktivierung zu weit geführt werden kann oder daß sie mangelhaft oder überhaupt nicht vorhanden ist. Weiterhin kann das Tier infolge der anschließenden Impfung mit dem virulenten Virus erkranken oder sterben.
• Eine andere Methode besteht in der Injektion eines immunenAntistaupeserums, wobei gleichzeitig eine getrennte Injektion mit virulentem Staupevirus vorgenommen wird. Hierbei muß das Gleichgewicht zwischen Immun&erum und der Virulenz des Virus sorgfältig eingestellt werden, sonst wird nur eine sehr kleine Immunität erzielt oder das Immunserum reicht nicht aus, um die Erkrankung oder den Tod des Tieres durch den virulenten Virus zu vermeiden.
• Bei einer weiteren Methode wird ein Staupevirus verwendet, welcher modifiziert wurde, so daß seine Virulenz reduziert ist. Ein derartiges Präparat soll für Füchse durch Serienpassagen über Frettchen modifiziert worden sein. Obwohl dieses Produkt für die Verwendung bei Füchsen- zuverlässiger sein mag, so sind diesbezügliche Angaben hinsichtlich seiner Verwendung bei Hunden nicht überzeugend.
• Aus in Schweden gemachten Beobachtungen (vgl.
• Bodin, S. Skand, Vet. Tidskr, 37 : 696 (I947)) geht hervor, daß der Sicherheitsfaktor dieses Präparats bei Hunden nicht viel besser ist als bei den vorher beschriebenen Methoden.
• Ganz allgemein kann man sagen, daß verschiedene Viren erheblich in ihrem Wachstumsvermögen auf unnatürlichen Wirten variieren. Obwohl einige der Viren dazu gebracht werden können, in einer unnatürlichen Umwelt zu wachsen, so verlieren nicht alle ihre Virulenz gegenüber ihrem ursprünglichen Wirt in derselben Zeit oder in demselben Ausmaß.
• Selbst Virusstämme desselben Mittels können bis zu einem gewissen Grad untereinander variieren.
• Es ist deshalb schwierig, wenn nicht unmöglich, im voraus Verfahren auszuwählen, durch welche der Virus adaptiert, modifiziert oder seine Wirkung verringert wird. Beispielsweise kann sich ein willkürlich ausgewählter Stamm von Hundestaupevirus unter Umständen in Eiern fortpflanzen oder in geeigentem Maße modifiziert oder abgeschwächt werden.
• Die Erfindung betrifft nun ein Verfahren zur Herstellung einer Vaccine, welche einen lebenden, avirulenten Virus enthält, der bei Injizierung in Tiere der Familien canis und mustela immune Antikörper zu erzeugen vermag, welche mit denjenigen identisch sind, die durch die Erreger von Hundestaupe, Hartbalienkrankheit und Hundeencephalitis erzeugt werden. Das erfindungsgemäße Verfahren besteht darin, daß man lebenden virulenten Staupevirus von Hunden, welche die klinischen Merkmale der Hundeencephalitis aufweisen, gewinnt, daß man das Gewebe von embryonalen Küken in angebrüteten Eiern mit einer Suspension dieses Virus impft, daß man nach einer Periode weiteren Bebrütens eine Suspension des embryonalen Gewebes herstellt, daß man in gleicher Weise angebrütete Eier damit weiterimpft und daß man die aufeinanderfolgenden Passagen des Virus über im Brutstadium befindliche Kükenembryos wiederholt, bis der Virus auf diese adaptiert wurde und gegen Frettchen avirulent geworden ist.
• Bei der Durchführung der Erfindung zur Erzeugung der neuen Vaccine wurde aus einer Anzahl von Hunden ein Hund, der als von Hundeencephalitis befallen festgestellt wurde, getötet und das Milz-, Leber- und Hirngewebe entfernt, vereinigt und zu einer 2o0/oigen (Naßgewicht) wäßrigen Sustension verarbeitet. Das Material wurde intraperitoneal und intranasal in zwei Frettchen injiziert.
• Beide Frettchen zeigten die Symptome, welche gewöhnlich in Verbindung mit Staupe auftreten, und eines der Frettchen wurde in extremis am vierzehnten Tage getötet. Um nachzuprüfen, daß das infizierende Mittel Staupevirus war, wurde eine 200/obige Suspension des vereinigten Lungen-, Milz-und Lebergewebes des getöteten Frettchens hergestellt und seinerseits zwei weiteren Frettchen intraperitoneal injiziert. Beide Frettchen zeigten nach dem achten bzw. neunten Tag die für Staupe typischen Symptome, wodurch die Natur des infizierenden Mittels, das aus dem encephalitischen Hund isoliert worden war, als Staupevirus festgestellt wurde.
• Es sei erwähnt, daß die oben beschriebene Passage des Virus über die Frettchen dazu diente, um dessen Identität mit dem Erreger der typischen Hundestaupe festzustellen und um das Volumen des Gewebes für die weiteren Untersuchungen zu vergrößern. Der aus dem encephalitischen Hund erhaltene Virus kann in Kükenembryos fortgepflanzt werden, wie weiter unten beschrieben. Aus leicht begreiflichen Gründen ist jedoch die Identifizierung des Virus als Hundestaupevirus erwünscht, bevor die Adaptierungs- und Modiflzierungsmaßnahmen fortgesetzt werden.
• Nach der Identifizierung des Virus wird eine 20°/oige Suspension der vereinigten Leber- und Milzgewebe der Frettchen in einem physiologischen Verdünnungsmittel (Rinderherzextraktbouillon) in die Chorio-Allantois-Membran von 7 Tage alten Kükenembryos geimpft und weitere 7 Tage bebrütet. Bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens kann das Beimpfen in Kükenembryogewebe von 6 bis 9 Tage alten Kükenembryos erfolgen und weitere 4 bis 7 Tage bebrütet werden.
• Die Bebrütungstemperatur in irgendeinem dieser Stadien beträgt 34 bis 400, wird jedoch vorzugsweise bei 37 bis 380 gehalten.
• Nach der Bebrütungszeit, welche der Impfung der Virussuspension folgte, hatte man drei überlebende Embryos, welche alle normal aussehende Chorio-Allantois-Mtembraneaufw.ilesen. DileseMembranen wurden gewonnen, zu einer 20°/oigen Suspension in Bouillon vermahlen und dazu verwendet, die Chorio-Allantois-Membranen von weiteren 7 Tage alten Kükenembryos, wie oben angegeben, zu beimpfen. Diese aufeinanderfolgende Ubertragung des Virus wurde über vier Generationen von Eiern fortgesetzt. Die Membranen der vierten Passage zeigten keine merkliche Verdickung und keine mikroskopischen Veränderungen. Um festzustellen, ob der Virus in dem Kükenembryogewebe fortgepflanzt worden war, wurde eine 5o0/ge Gewebesuspension von der letzten Passage der Eier hergestellt und intraperitoneal in je zwei Frettchen injiziert. Beide Frettchen begannen am siebenten Tage die der Staupe ähnlichen Symptome zu zeigen und wurden allmählich sehr krank.
• Der Virus wurde aus dem Milzgewebe der Frettchen erhalten und in eine 200/obige Suspension in Bouillon gebracht und in den Dottersack von embryonalen Küken geimpft und 7 Tage bebrütet.
• Aus dem Kükenembryogewebe wurde Impfmaterial hergestellt und nacheinander auf die Chorio-Allantois-Membran von Küken wie oben angegeben geimpft. Nach der dritten Passage konnte an einigen Eiern eine leichte Verdickung der Membran und einige verstreute, kleine, undurchsichtige Veränderungen beobachtet werden. Diese makroskopischen Veränderungen nahmen mit jeder zusätzlichen Passage allmählich an Intensität zu, und bei der sechsten Generation waren sie sehr ausgedehnt und bedeckten den bloßgelegten Teil der Chorio-Allantois-Membran an der Basis des künstlichen Luftsacks fast vollständig. Diese Veränderungen zeigten an, daß sich der Virus adaptiert hatte, im Kükenembryogewebe zu wachsen. Die aufeinanderfolgende Übertragung des Virus von Kükenemb ryo auf Kükenlembryo wurde fortgesetzt, und in regelmäßigen Abständen wurden Suspensionen von der Chorio-Allantois-Membran hergestellt und Frettchen damit geimpft.
• Bis zur 23. aufeinanderfolgenden Passage in dem Embryogewebe war der an das Ei adaptierte Virus gegen Frettchen so virulent wie der ursprüngliche Stamm. Jedoch von der 28. Passage an trat eine Modifizierung des Virus auf, so daß einige der Frettchen, welche mit der aus dem Kükenembryo hergestellten Vaccine geimpt wurden, nur schwache Symptome zeigten, überlebten und bei anschließenden Reizungen normal blieben. Nach etwa 38 aufeinanderfolgenden Passagen auf dem Kükenembryo war der Virus so modifiziert, daß er in Frettchen ohne lebensgefährliche Folgen intraperitoneal injiziert werden konnte. Es wurde jedoch gefunden, daß die Frettchen als Ergebnis der Impfung milder Vaccine Immunität erlangten und Impfungen oder anderweitige schädliche Dosen des nicht modifizierten Staupevirus, der die beschriebene Modifizierung durch Pasagen über Eier nicht mitgemacht hatte, überlebten. Kreuzimmunisierungs- und Kreuzneutralisationsversuche an Eiern und Frettchen zeigten immunologische Identität zwischen dem aus dem embryonalen Kükengewebe durch das beschriebene Verfahren isolierten Virus und gewöhnlichem Hundestaupevirus. Andere ähnliche Versuche zeigten ebenfalls die immunologische Identität des modifizierten Virus mit dem Erreger der Hundeencephalitis und der Hartballenkrankheit und zeigten an, daß Vaccinen, welche aus dem modifizierten Virus hergestellt wurden, beim Schutz von Angehörigen der Familien canis und mustela gegen diese Krankheit wirksam sind.
• Infolge der äußerst geringen Größe der Virenkörper und des Fehlens von positiven Kenntnissen bezüglich ihrer Natur und Wachstumsgewohnheiten ist es schwierig, die Gründe für die erfolgreiche Adaptierung und Modifizierung des bei dem vorliegenden Verfahren angewendeten Virus anzugeben. Es ist möglich, daß die Hundeencephalitis die Manifestation eines besonderen Hundestaupevirusstammes darstellt, welcher derartig teilweise modifiziert wurde, daß er durch das beschriebene Verfahren auf Eier adaptiert werden kann. Diese Annahme wird noch durch die Tatsache bestärkt, daß gewöhnlicher Hundestaupevirus in Kükenembryogewebe ohne wechselweise Passage über Frettchen ohne Erfolg fortgepflanzt wurde. Selbst im vorliegenden Fall beim Arbeiten mit Viren, welche von encephalitischen Hunden erhalten werden, kann es erwünscht sein, den Virus über eine oder mehrere wechselweise Generationen von Frettchen zu führen, um den Stamm fortzusetzen, bis er auf Kükenembryogewebe adaptiert ist. Die Entwicklung des Virus in diesem Stadium kann leicht durch das makroskopische Aussehen der Chorio-Allantois-Membran, wie oben beschrieben, fest-.gestellt werden.
• Es sei erwähnt, daß auch Eier von anderen Vögeln, z. B. Enten, bei der Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens verwendet werden können, daß jedoch Eier von Küken infolge ihrer niedrigeren Kosten und ihrer größeren Zugänglichkeit bevorzugt sind.
• Die Herstellung der Vaccine aus dem Kükenemb roygewebe wird durch einfaches Vermahlen oder Homogenisieren des infizierten Gewebes in einem geeigneten Medium, wie physiologische Kochsalzlösung, Fleischaufguß, Wasser od. dgl., bewirkt werden. Gewünschtenfalls können diese Präparate durch Zentrifugieren, Filtrieren, Extrahieren u. dgl. weiterbehandelt werden, um Gewebe, Fett und andere unerwünschte Bestandteile der Suspension zu entfernen. Natürlich kann vor der Freigabe des Produkts zur Verwendung eine geeignete Prüfung der Vaccine auf Sterilität, Stärke und Sicherheit durchgeführt werden. Verfahren zur Durchführung dieser Arbeitsgänge sind dem Fachmann bekannt und brauchen hier nicht näher beschrieben zu werden.
• Es sei auch noch erwähnt, daß das Produkt durch Methoden, welche die Lebensfähigkeit des Virus nicht zerstören, getrocknet werden kann, z. B. durch Einfrieren und Trocknen unter vermindertem Druck, und daß diese getrockneten Produkte zu einem späteren Zeitpunkt, wenn sie gebraucht werden, durch Verdünnung mit einem geeigneten Verdünnungsmittel wiederhergestellt werden könen.

Claims (5)

1. PATENTANSPRUCHE: I. Verfahren zur Herstellung einer Vaccine, welche einen lebenden avirulenten Virus enthält, der bei Injizierung in Tiere der Familien canis und mustela immune Antikörper zu erzeugen vermag, welche mit denjenigen identisch sind, welche durch die Erreger von Hundestaupe, Hartballenkrankheit und Hundeencephalitis erzeugt werden, dadurch gekennzeichnet, daß man lebenden virulenten Staupevirus aus Hunden gewinnt, welche die klinischen Merkmale der Hundeencephalitis aufweisen, daß man das Gewebe embryonaler Küken in angebrüteten Eiern mit einer Suspension dieses Virus impft, daß man nach einer Zeit weiteren Bebrütens eine Suspension des embryonalen Gewebes herstellt, daß man in gleicher Weise weitere angebrütete Eier damit impft, und daß man die aufeinanderfolgenden Passagen des Virus über im Brutstadium befindliche Kükenembryos wiederholt, bis der Virus auf dies adaptiert wurde. und gegen Frettchen avirulent geworden ist.
2. 2. Verfahren nach Anspruch I, dadurch gekennzeichnet, daß die verwendeten Kükenembryos 6 bis 9 Tage bebrütet wurden und daß die Bebrütung nach der Beimpfung für einen weiteren Zeitraum von 4 bis 7 Tagen fortgesetzt wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Bebrütung in irgendeinem Stadium bei 34 bis 400, vorzugsweise bei 37 bis 380 durchgeführt wird.
4. 4. Verfahren nach einem der Ansprüche I bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die Chorio-Allantois-Membran der Kükenembryos geimpft wird.
5. 5. Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß die aufeinanderfolgenden Passagen des Virus auf den Kükenembryos - durch Passage über wenigstens ein Frettchen unterbrochen werden, bevor der Virus auf die angebrüteten Kükenembryos adaptiert wurde.

   Angezogene Druckschriften: J. Am. Med. Ass. 56 (I9II), S. 74I ff; Am. J. Path. 7 (1931), S.209 ff; Deutsche Tierärztlicbe Wochlenschrift, 46 (I938), S.497ff; Canad. J. comp. Med. 3 (I939), S. 96; Onderstepoort J. Vet. Sci. and An. Industiy 23 (I948), Heft I/2, S. I49 ff; Journ. South Africa Vet. Med. Ass. (in50), S.73; J. Am. Vet. Med. Ass. (I939), S. 465 und 469.