DE2911332A1 - Antikomplementaere mittel, verfahren zu deren herstellung und arzneimittel, welche diese enthalten - Google Patents

Description

. .3.1. .860 o/wa

OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD., TOKYO/JAPAN

Antikomplementäre Mittel, Verfahren zu deren Herstellung und Arzneimittel, welche diese enthalten

Die Erfindung betrifft antikomplementäre Mittel, die als aktiven Bestandteil wenigstens eine Sojasapogenol B-Verbindung der allgemeinen Formel (I)

..••OH

COOI

(D

^H0 OR¹

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oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon enthalten, worin bedeuten:

R ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der Formel

R² HOf

■fy'-

r, OR³

R ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxymethylgruppe, R ein Wasserstoffatom oder eine Rhamnopyranosylgruppe,

und
R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis

6 Kohlenstoffatomen.

Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung von antikomplementären Mitteln, welche die Verbindung der Formel (I) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon als aktiven Bestandteil enthalten. Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung des antikomplementären Mittels gemäss der Erfindung bei der Behandlung von Nephritis.

Zahlreiche Verbindungen, die zu den aktiven Bestandteilen der erfindungsgemässen antikomplementären Mittel eine Beziehung haben, sind bekannt. Zum Beispiel wird Glycyrrhizin (Yasuhiro Ariga, Hiroyuki Sumi, Yumiko Takada und Akikazu Takada,"Abridgements of Lecture Programs on Seminar of Plasmin Research Association", Seite 65 (1977); Koretsugu Arimoto, Kaneyuki Mineta, Hiroyuki Sumi, Yumiko Takada und Akikazu Takada, "Proceedings of the 14th Symposium on Complements", Seiten 79 bis 82 (1977)) und 3-0-(G-O-Methyl-ß-D-glucuronopyranosyl)-sojasapogenol B (Isao Kitagawa, Masayuki Yoshikawa und Ichiro Yoshioka, "Chem. Pharm, Bull.", 22, Seite 1339 (1974); Ibid., 24, Seite 121 (1976)) etc. beschrieben. Die letztere Verbindung

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hat eine steroidartige Struktur und entwickelt eine ähnliche Aktivität wie Steroide. Sie zeigt z.B. eine Inhibierungsaktivität gegenüber Plasmin/ Urokinase, Kallikrein, Thrombin und Komplemente. Andererseits sind die physiologischen Aktivitäten dieser letzteren Verbindung bisher nicht berichtet worden. Dagegen haben die Verbindungen der Formel (I) und deren Salze, die in den erfindungsgemassen Mitteln verwendet werden, eine antikomplementäre Aktivität, die überraschend überlegen gegenüber der von Glycyrrhizin ist und die gegenüber 3-0-(6-0-Methylß-D-glucuronpyranosyl)-sojasapogenol B ganz unerwartet ist, wie aus den nachfolgend beschriebenen, pharmakologischen Versuchen hervorgeht.

Es ist eine Aufgabe der Erfindung, wirksame antikomplementäre Mittel zur Verfügung zu stellen, die Sojasapogenol B-Verbindungen oder deren pharmazeutisch annehmbaren Salze enthalten.

Eine weitere Aufgabe der Erfindung ist es, ein Verfahren zur Herstellung solcher antikomplementären Mittel zu zeigen.

Schliesslich ist es eine weitere Aufgabe der Erfindung, ein Verfahren aufzuzeigen, das zur Behandlung von nephritischen Patientien unter Verwendung der antikompiementären Mittel geeignet ist.

Durch die Erfindung werden pharmazeutische Zusammensetzungen offenbart, die eine therapeutisch wirksame Menge an Sojasapogenol B-Derivaten der Formel (I) oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon enthalten und die eine antikomplementäre Aktivität bei Lebewesen bewirken. Durch die Erfindung wird auch die Verwendung der pharmazeutischen Zusammensetzungen der vorher angegebenen Art, insbesondere zur Behandlung von Nephritis (Nierenentzündung) bei Tieren gezeigt, indem man einem

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mit dieser Erkrankung befallenen Patienten eine pharmazeutische Zusammensetzung verabreicht.

Die antikomplementären pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäss der Erfindung können verwendet werden, um pathologische Reaktionen, bei denen die Wirkung eines Komplementes erforderlich ist, zu erleichtern oder zu verhindern, und um immunologische Erkrankungen, wie rheumatische Arthritis, systemisches Lupuserythem, Glomerulonephritis, autoallergische hämolytische Anämie, Plättchenkrankheiten, Vasculitis und dergleichen therapeutisch zu behandeln. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäss der Erfindung könnten auch zur Therapie von nicht-immunologischen Krankheiten, wie krampfartige nächtliche Hämoglobinurie, angeborenes angioneurotisches ödem und Entzünduiigszustände, die durch bakterielle oder lysosomale Enzyme bei den jeweiligen komplementären Komponenten hervorgerufen wurden, z.B. bei einer Entzündung im Anschluss an einen Koronaverschluss, angev/endet werden. Sie sind auch geeignet für die Behandlung von Transplantatzurückweisungen und als Blutkultur und Transportmedien. Schliesslich können sie auch für die therapeutische Behandlung von disseminierten intravaskulären Koagulationen verwendet werden.

In den letzten Jahren wurden intensive Forschungen über die theoretische Analyse des Komplementsystems und dessen Wirkung auf Menschen und Tiere durchgeführt und es wird allgemein anerkannt, dass gewisse Verbindungen eine antikomplementäre Aktivität haben und dann eine therapeutische Wirkung auf verschiedene der vorher angegebenen Symptome ausüben. Zum Beispiel wird in US-PS 4 021 544 folgendes dargelegt:

"Der Ausdruck "Komplement" betrifft eine Komplexgruppe von Proteinen in Körperflüssigkeiten, die bei der Zusammenwirkung

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-li

mit Antikörpern oder anderen Faktoren eine wichtige Rolle als Mittler von Immun-, allergischen, immunochemisehen und/oder

immunopathologischen Reaktionen dienen. Die Reaktionen,

an denen ein Komplement teilnimmt, finden im Blutserum oder in anderen Körperflüssigkeiten statt und sie gelten deshalb

als humorale Reaktionen."

"Beim menschlichen Blut sind im Komplementsystem mehr als 11 Proteine vorhanden. Diese Komplementproteine werden durch den Buchstaben C und durch die Zahlen C1, C2, C3 usw. bis C9 bezeichnet. Das Komplementprotein C1 ist eigentlich eine Anordnung von Untereinheiten, die mit C1q, C1r und C1s bezeichnet werden. Die den Komplementproteinen zugeordneten Zahlen geben die Sequenz an, in welcher sie .aktiv werden, mit der Ausnahme des Komplementproteins C4, das nach C1 und vor C2 wirkt. Die Zahlenzuordnung für die Proteine im Komplementsystem wurde vorgenommen bevor man die Reaktionsfolge vollständig erkannt hatte. Eine detaillierte Beschreibung des Komplemetsystems und dessen Rolle in den Körperprozessen wird z.B. in

"Bull. World Health Org." ,.3_2' 935-938 (1968); "Scientific American", 22£ (Nr. 5), 54-66 (1973); "Medical World News", 11. Oktober 1974, Seiten 53-58, 64-66; ;Harvey Lectures", 6β_, 75-104 (1972); "The New England Journal of Medicine", 287, 489-495, 545-549, 592-596, 642-646 (1972); "The John Hopkins Med. J.", ^28, 57-74 (1971) und "Federation Proceedings", 22., 134-137 (1973) gegeben."

"Das Komplementsystem kann man in drei Untersysteme aufteilen: (1) Eine Erkennungseinheit (C1q), die es ermöglicht, dass eine Kombination mit einem Antikörpermolekül, das einen fremden Eindringling aufgespürt hat, stattfindet; (2) eine Aktivierungseinheit (C1r, C1s, C2, C4, C3) die eine Stelle an der benachbarten Membrane bereitet; und (3) eine Angriffseinheit

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(C5, C6, C7, C8 und C9) die ein Loch in der Membrane bildet. Die Membran-Angriffseinheit ist unspezifisch, sie zerstört Eindringlinge nur/ weil sie in deren Nachbarschaft erzeugt . wird und um eine Zerstörung in den eigenen Zellen des Gasttieres zu minimalisieren, muss seine Aktivität rechtzeitig begrenzt sein. Diese Limitierung wird zum Teil durch einen spontanen Zerfall des aktivierten Komplements bewirkt und zum Teil durch Einwirkung von Inhibitoren und abbauenden Enzymen. Die Kontrolle des Komplements ist jedoch nicht vollständig und manchmal wird in den Zellen des Gasttieres oder Menschen eine Zerstörung vorgenommen. Die Immunität ist deshalb ein zweiseitiges Messer."

"Die Aktivierung des Komplementsystems beschleunigt auch die Blutgerinnung. Diese Wirkung tritt durch die komplementvermittelte Freigabe eines Gerinnungsfaktors aus den Plättchen ein. Das biologisch aktive Komplementfragment und Komplexe wirken zusammen bei den Reaktionen, welche die Zellen des Gastträgers (Tier oder Mensch) schädigen und diese pathogenen Reaktionen können die Entwicklung von Immunkomplexerkrankungen bewirken. Bei einigen Formen der Nephritis zerstört das Komplement die Basismembran der Niere und dadurch tritt Protein aus dem Blut in den Urin ein. Zu dieser Kategorie von Krankheit gehört die disseminierte Lupuserythematosie und zu diesen Symptomen gehören Naphritis, viscerale Läsionen und Hautausschläge. Bei der Behandlung von Diphtherie oder Tetanus durch Injektionen von grossen Mengen Antitoxin, tritt manchmal eine Serumerkrankung, eine Immunkomplexerkrankung, ein. Auch rheumatische Arthritis schliesst einen Immunkomplex ein. Ähnlich wie bei der disseminierten Lupuserythematosie liegt hier eine autoimmune Erkrankung vor, bei welcher die Krankheitssymptome durch pathologische Wirkungen des Immunsystems auf das Gewebe des Trägers verursacht werden. Zusammengefasst kann festgestellt

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werden, dass das Komplementsystem bei Entzündungen, Koagulationen, Fibrinolyse, Antikörper-Antigen-Reaktionen und anderen metabolischen Verfahren eine Rolle spielt."

"In Gegenwart von Antikörper-Antigen-Komplexen nehmen die Komplementproteine an einer Reihe von Reaktionen teil, bei denen irreversible Membranzerstörungen eintreten können, wenn sie in der Nähe von biologischen Membranen auftreten. Obwohl das Komplement ein Teil des Selbstverteidigungsmechanismus des Körpers gegenüber Infektionen bildet, wird durch das Komplement auch eine Entzündung und Gewebeschädigung bei dem immunopathologischen Prozess bewirkt. Die Art gewisser Komplementproteine, Vermutungen, wie die Komplemente an biologische Membrane gebunden sind, und die Art wie die Komplemente eine Membranstörung bewirken, wird in "Annual Review in Biochemistry", 3_8, 389 (1969) beschrieben."

"Es wurde berichtet, dass die bekannten Komplementinhibitoren, Epsilon-Aminocapronsäure, Suramin-natrium und Transexamsäure mit Erfolg bei der Behandlung von angeborenen angioneurotischen Ödemen eingesetzt wurden, einer Krankheit, die aus der angeborenen Deffizienz oder einem Funktionsmangel des Seruminhibitors der aktivierten ersten Komponente des Komplements (C1-Inhibitor) resultiert "The New England Journal of Medicine", 286, 808-812 (1972); "Allergol",' Et. "Immunipath" II, 163-168 (1974); "J. Allergy Clin. Immunol.", 5_3, Nr. 5, 298-302 (1974); und "Annals of Internal Medicine", J34, 580-593 (1976)."

Einige der Sojasapogenolderivate der Formel (I) sind bekannt, während andere neu sind. Zu den Alkylgruppen, die durch R

4«
oder R dargestellt werden (in der Formel (Ia) nachfolgend) gehören lineare oder verzweigte Alkylgruppen mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen, wie eine Methylgruppe, eine Äthylgruppe, eine

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Propylgruppe, eine Isopropylgruppe, eine Butylgruppe, eine tert.-Butylgruppe, eine Pentylgruppe, eine Hexylgruppe und dergleichen.

Die Verbindungen der Formel (I) können auf verschiedene Weise hergestellt werden. Man kann z.B. eine Verbindung der Formel (I) herstellen, indem man zunächst Sojasaponin B aus Sojabohnen gewinnt und dann diese Verbindung nach dem nachfolgend beschriebenen Reaktionsschema 1 behandelt.

Die Abtrennung von Sojasaponin B kann mittels bekannter Abtrennverfahren und -vorrichtungen durchgeführt werden. Geeignete chemische Behandlungen sind z.B. Hydrolyse, Alkoholyse, Verätherung, Acylierung und dergleichen. Beispiele für geeignete physikalische Behandlungen sind Lösungsmittelextraktion, Lösungsmittelverdünnung, Flüssigchromatografie, Gaschromatografie, Umkristallisieren und dergleichen.

Die Verbindungen der Formel (I) können hergestellt werden, indem man Sojasaponin B, das nach dem Verfahren von Kitagawa et al (Isao Kitagawa, Masayuki Yoshikawa und Ichiro Yoshioka, "Che. Pharm. Bull.", 2J2, Seite 1339 (1974); Ibid. 2±, Seite 121 (1976)) erhalten wurde, einer Alkoholyse mit einem niedrigen Alkohol, wie Methanol, Äthanol, Propanol, Isopropanol, Butanol, Pentanol, Hexanol und dergleichen, in Gegenwart einer Säure unterwirft und wobei sich 3-0-(6-0-Alkyl-ß-D-glucuronpyranosyl)-sojasapogenol B bildet und worauf man dann hydrolysiert (Reaktionsschema 1) Die hier verwendete Bezeichnung "Sojasaponin B" bezieht sich auf ein Gemisch von Sojasaponin I, II und III, welches Sojasapogenol B als Aglycon enthält, wie es in der vorher angeführten Literatur erwähnt ist.

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Reaktionschema 1

Sojasaponin B (II) Alkoholyse

.--OH (Ia)

Hydrolyse (Entesterung)

•OH

(Ib)

CH₂OH

"... OR¹

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In den vorstehenden Formeln (Ia) und (Ib) bedeutet R ein
Wasserstoffatom oder eine Gruppe der Formel

worin R ein Wasserstoffatom oder eine Hydr oxymethy 1 gruppe, R ein Wasserstoffatom oder eine Rhamnopyranosylgruppe, und R eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen bedeutet.

Es können verschiedene üblicherweise bei einer Alkoholyse
verendete Säuren für die Alkoholyse von Sojasaponin B verwendet werden. Beispiele hierfür sind Säuren wie Halogenwasserstoff säuren, z.B. Chlorwasserstoff, Bromwasserstoff und dergleichen, starke anorganische Säuren, wie Schwefelsäure, Salpetersäure und dergleichen, starke organische Säuren, wie
Trichloressigsäure, Triluoressigsäure und dergleichen, Lewissäuren wie Aluminiumchlorid, Bortrifluorid, Titatetrachlorid, Titantetrabromid und dergleichen.

Die Alkoholyse kann vorzugsweise zwischen etwa Raumtemperatur und etwa 150⁰C, insbesondere zwischen etwa 50 bis 100°( während 1 bis 6 Stunden durchgeführt werden.

Das Verfahren zum Isolieren der durch die Formel (Ia) wiedergegebenen Verbindungen aus der Reaktionsmischung ist nicht
besonders begrenzt und verschiedene bekannte Verfahren, bei
denen die physikochemischen Eigenschaften der gebildeten
Substanzen angewendet werden, einschliesslich der, die zum
Abtrennen von Sojasaponin B angewendet werden, können verwendet werden. Beispiele für diese Verfahren sind z.B. die Ausnutzung der Löslichkeitsunterschiede zwischen den Produkten

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und den Verunreinigungen, ein Verfahren, bei dem man die Adsorptionskraftsunterschiede ausnutzt und die Affinität für gewöhnliche Adsorbentien, wie Aktivkohle, XAD-2, Kieselgel, Ionenaustauschharze, Sephadex und dergleichen, oder ein Verfahren, bei dem man den Unterschied im Verteilungskoeffizienten zwischen zwei Flüssigphasen ausnutzt und auch eine Kombination dieser Verfahren.

Zum Beispiel wird das Alkoholisat mit Wasser unter Ausbildung eines Niederschlags vermischt, der dann einer Kieselgel-Säulenchromatografie unterworfen wird, und stufenweise mit einem Eluirmittel, z.B. einer Mischung aus Chloroform und Äthanol, eluiert wird, wobei man alle Verbindungen, die in der Formel (Ia) angegeben sind, isoliert.

Die Hydrolyse der durch Formel (Ia) angegebenen Verbindungen kann im allgemeinen in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart eines Katalysators unter üblichen Hydrolysebedingungen für Ester durchgeführt werden. Bei dieser Umsetzung können übliche Katalysatoren verwendet werden. Beispiele für geeignete Katalysatoren sind Mineralsäuren, wie Chlorwasserstoffsäure, Schwefelsäure, Salpetersäure und dergleichen, anorganische basische Verbindungen, wie Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Natriumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat, Kaliumcarbonat, Kaliumhydrogencarbonat und dergleichen. Als Katalysatoren bevorzugt werden anorganische basische Verbindungen.

Jedes übliche inerte Lösungsmittel kann bei der obigen Reaktion verwendet werden. Geeignete Beispiele für inerte Lösungsmittel schliessen Wasser, niedrige Alkohole, wie Methanol, Äthanol, Propanol und dergleichen, A'ther, wie Dioxan, Tetrahydrofuran und dergleichen. Dimethylsulfoxid, Dimethylformamid und dergleichen oder eine Mischung davon ein. Die Hydrolysereaktion wird vorzugsweise zwischen Raumtemperatur und 150⁰C,

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insbesondere 50 bis 1OO°C, während etwa 1 bis 6 Stunden durchgeführt .

Die Verbindung der Formel (Ib) kann aus dem Hydrolysat mittels Isolierverfahren abgetrennt werden, die gleich oder ähnlich denen sind, die man bei der Isolierung der Verbindung der Formel (Ia) angewendet hat.

Die durch die Formel (Ib) wiedergegebenen erfindungsgemässen Verbindungen können aus Produkten aus der Teilhydrolyse von Sojasaponin B gewonnen werden, wobei die Hydrolyse in Wasser oder einer Mischung aus Wasser und einem oder mehreren der vorher erwähnten Lösungsmittel durchgeführt wird, und zwar in Gegenwart von Halogenwasserstoff säuren, wie Chlorwasserstoff säure, Bromwasserstoffsäure und dergleichen, starken anorganischen Säuren, wie Schwefeläsure, Salpetersäure und dergleichen, oder starken organischen Säuren, wie Trichloressigsäure, Trifluoressigsäure und dergleichen. Der Ausdruck "Teilhydrolyse" wie er hier verwendet wird, bedeutet eine Hydrolyse in welcher keine oder praktisch keine Abspaltung von Aglycon aus dem Ausgangssaponinmaterial eintritt. Die Teilhydrolyse wird im allgemeinen zwischen Raumtemperatur und 150°C, vorzugsweise 50 bis 110°C, 1 bis 6 Stunden durchgeführt .

Die Isolierung der in der Formel (Ib) wiedergegebenen Verbindung aus dem Teilhydrolysat kann nach dem vorher erwähnten Isolationsverfahren durchgeführt werden. Zum Beispiel kann man das Teilhydrolysat mit n-Butanol extrahieren, um die wasserlöslichen Komponenten zu entfernen und das Teilhydrolysat wird dann einer Kieselgel-Säulenchromatografie unterworfen, wobei die jeweiligen Komponenten abgetrennt werden und die Fraktion, die 3-0-(ß-D-Glucuropyranosyl)-sojasapogenol B

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entspricht, wird kristallisiert aus einem geeigneten Lösungsmittel, z.B. einer Mischung aus Chloroform und Aceton (1:1 Vol/Vol).

Typische Beispiele für Verbindungen der Formel (I) sind:

(1) 3-0-(ß-D-Glucoronpyranosyl)-sojasapogenol B

(2) 3-0-/ß-D-Galactopyranosyl(1 -> 2)-ß-D-glucuronpyranosyl/-sojasapogenol B

(3) 3-0-^oO-L-Arabinopyranosyl (1 -> 2) -ß-D-glucuronpyranosyl7~ sojasapogenol B

(4) 3-0-^oO-L-Rhamnopyranosyl(1 ■» 2) -ß-D-galactopyranosyl (1 -5-2)· ß-D-glucuronpyranosyl7~soj asapogenol B

(5) 3-0-^~ -L-Rhamnopyranosyl (1 -*■ 2)-ct-L~arabinopyranosyl-(1 - 2)-ß-D-glucuronpyranosyl7~sojasapogenol B

(6) 3-0-(6-0-Methyl-ß-D-glucuronpyranosyl)-sojasapogenol B

(7) 3-0-(6-0-Hexyl-ß-D-glucuronpyranosyl)-sojasapogenol B

(8) 3-0-/ß-D-Galactopyranosyl(1 -> 2)-(6-0-methyl-ß-D-glucuronpyranosyl]_7~so j asapogenol B

(9) 3-0-(6-0-Äthyl-ß-D-glucuronpyranosyl)-sojasapogenol B

Die Verbindungen der Erfindung, die so erhalten wurden, bilden mit verschiedenen, pharmazeutisch annehmbaren, basischen Verbindungen Salze. Diese Salze sind in die vorliegende Erfindung eingeschlossen.

Beispiele für basische Verbindungen, die verwendet werden können für die Salzbildung, sind anorganische basische Verbindungen, z.B. Natriumhydroxid, Kaliumhydroxid, Aluminiumhydroxid, Natriumcarbonat, Kaliumcarbonat, Natriumhydrogencarbonat und dergleichen, und organische basische Verbindungen, wie Piperazin, Morpholin, Piperidin, Äthylamin, Dimethylamin, Triäthylamin und dergleichen.

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Die Verbindungen der Formel (I) können als Nephritis-Behandlungsmittel verwendet werden und bei deren Verwendung für diesen Zweck werden sie zu pharmazeutischen Zusammensetzungen zusammen mit üblichen pharmazeutisch annehmbaren Trägern formuliert. Geeignete Träger sind z.B. Verdünnungsmittel oder Exzipientien, wie Füllstoffe, Extender, Bindemittel, Befeuchtungsmittel, Zerfallmittel, oberflächenaktive Mittel und Schmiermittel, die üblicherweise, je nach der Dosierungsform, bei der Herstellung solcher Arzneimittel verwendet werden.

Es können zahlreiche Dosierungsformen für die therapeutischen Mittel als Behandlungsmittel für Nephritis, je nach dem Zweck der Therapie, ausgewählt werden. Typische Dosierungsformen sind Tabletten, Pillen, Pulver, flüssige Zubereitungen, Suspensionen, Emulsionen, Granulate, Kapseln, Suppositorien und injizierbare Zubereitungen (Lösungen, Emulsionen, Suspensionen und dergleichen) .

Beim Formen von pharmazeutischen Zusammensetzungen, welche die erfindungsgemässen.Verbindungen als aktive Bestandteile enthalten, zu Tabletten kann ein grosser Bereich von bekannten Trägern verwendet werden. Geeignete Träger schliessen Exzipientien, wie Lactose, weissen Zucker, Natriumchlorid, Glucose, Harnstoff, Stärke, Kaliumcarbonat, Kaolin, kristalline Zellulose und Kieselsäure; Bindemittel, wie Wasser, Äthanol, Propanol, Sirup, Glucose, Stärkelösungen, Gelatinelösungen, Carboxymethylzellulose,Schellack,Methylzellulose, Kaliumphosphat und Polyvinylpyrrolidon; Zerfallmittel, wie trockene Stärke, Natriumalginat, Agarpulver, Laminarienpulver, Natriumhydrogencarbonat, Kaliumcarbonat, Tween, Natriumlaurylsulfat, Stearinsäuremonoglycerid, Stärke und Lactose; Zerfallinhibitoren, wie weissen Zucker, Stearinsäureglycerinester, Kakaobutter und hydrierte öle; Absorptionsbeschleuniger,

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wie quaternäre Ammoniumbasen und Natriumlaurylsulfat; Befeuchtungsmittel, wie Glycerin und Stärke; Adsorbentien, wie Stärke, Lactose, Kaolin, Bentonit und kolloidale Kieseksäure; und Schmiermittel, wie Talkum, Stearinsäuresalze, Borsäurepulver, Macrogol und festes Polyäthylenglykol, ein.

Beim Verformen zu pharmazeutischen Zusammensetzungen in Pillenform kann eine Vielzahl von üblichen Trägern, wie sie aus dem Stand der Technik bekannt sind, verwendet werden. Beispiele für geeignete Träger sind Exzipientien, wie Glucose, Lactose, Stärke, Kakaobutter, gehärtete Pflanzenöle, Kaolin und Talkum; Bindemittel, wie Gummiarabicumpulver, Tragacanthpulver, Gelatine, Äthanol; und Zerfallsmittel, wie Laminarien und Agar. Gewünschtenfalls können die Tabletten beschichtet sein und zu zuckerbeschichteten Tabletten, gelatinebeschichteten Tabletten, enterisch beschichteten Tabletten, filmbeschichteten Tabletten oder Tabletten, die mit zwei oder mehr Überzügen versehen sind, beschichtet werden.

Beim Verformen der pharmazeutischen Zusammensetzung zu Suppositorien kann eine Vielzahl von Trägern der bekannten Art verwendet werden. Beispiele für geeignete Träger sind Polyäthylenglykol, Kakaobutter, höhere Alkohole, Ester von höheren Alkoholen, Gelatine und halbsynthetische Glyceride.

Wird die pharmazeutische Zusammensetzung zu einer injizierbaren Zubereitung formuliert, so wird die erhaltene Lösung oder Suspension vorzugsweise sterilisiert und hinsichtlich Blut isotonisch gemacht. Beim Formulieren der pharmazeutischen Zusammensetzung zu einer Lösung oder Suspension können alle üblicherweise verwendeten Verdünnungsmittel verwendet werden. Beispiele für übliche Verdünnungsmittel sind Wasser, Äthylalkohol', Propylenglykol, äthoxylierter Isostearylalkohol,

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Polyoxyathylensorbitol und Sorbitester. Natriumchlorid, Glukose oder Glyzerin können als therapeutisches Mittel zugegeben werden, z.B. bei einem Behandlungsmittel gegen Nephritis in einer Menge, die ausreicht, um eine isotonische Lösung herzustellen. Weiterhin können als therapeutische Mittel übliche Auflösungshilfen, Puffer, Schmerzmittel und Konservierungsmittel und gewünschtenfalls Färbungsmittel, Parfüms, Geschmacksstoffe, Süssstoffe und andere Arzneimittel enthalten.

Die Menge, in welcher die erfindungsgemässen Verbindungen als aktiver Bestandteil in eine pharmazeutische Zusammensetzung eingebracht werden, damit diese für eine Nephritisbehandlung geeignet ist, ist nicht besonders beschränkt und kann in einem weiten Bereich variieren. Eine geeignete therapeutische wirksame Menge bei den Verbindungen der Formel (I) innerhalb der Erfindung liegt im allgemeinen bei 1 bis etwa 70 Gew.% (vorzugsweise 5 bis 50 Gew.%), bezogen auf die gesamte Zusammensetzung.

Hinsichtlich der Verwendung des therapeutischen Mittels als antikomplementäres Mittel besteht keine besondere Begrenzung und das therapeutische Mittel kann auf dem Wege verabreicht werden, für den die jeweilige Form des therapeutischen Mittels bestimmt ist. Zum Beispiel kann man Tabletten, Pillen, flüssige Zubereitungen, Suspensionen, Emulsionen, Granulate und Kapseln oral verabreichen. Die injizierbaren Zubereitungen werden intravenös verabreicht und zwar entweder allein oder zusammen mit üblichen Hilfsmitteln, wie Glucose und Aminosäuren. Gewünschtenfalls kann das therapeutische Mittel auch intramuskulär, intrakutan, subkutan oder intraperitoneal verabreicht werden. Suppositorien werden rektal verabreicht.

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Die Dosis des Nephritis-Behandlungsmittels wird je nach dem Anwendungszweck/ den Symptomen und dergleichen gewählt. Im allgemeinen beträgt die Dosis für die erfindungsgemässen Verbindungen etwa 0,5 bis etwa 20 mg/kg Körpergewicht pro Tag. Die Ergebnisse von Untersuchungen über die pharmakologischen Wirkungen der Verbindungen der Formel (I), die als aktive Bestandteile in pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäss der Erfindung vorlagen, werden nachfolgend gezeigt.

PHARMAKOLOGISCHE PRÜFUNG

(1) Geprüfte Verbindungen

A. 3-0-(ß-D-Glucuronpyranosyl)-sojasapogenol B

B. 3-0-^ß-D-Galactopyranosyl(1 ·» 2)-ß-D-glucuronpyranosyl/-sojasapogenol B

C. 3-O-/0U -L-Rhamnopyranosyl(1 -> 2)-ß-D-galactopyranosyl-(1 ·*· 2) -fi-D-glucuronpyranosyiy-sojasapogenol B

D. 3-0-/5/ -L-Arabinopyranosyl-(1 -* 2)-ß-D-glucuronpyranosyl/-sojasapogenol B

E. 3-0-/5/-L-Rhamnopyranosyl-(1 ■*· 2) -oO -L-arabinopyranosyl-(1 -J> 2)-ß-D-glucuronpyranosyl7-sojasapogenol B

F. 3-0-(6-0-Methyl-ß-D-glucuronpyranosyl)-sojasapogenol B

G. Glycyrrhizin (Vergleich)

(2) Antikomplementäre Aktvität

Die antikomplementäre Aktivität der geprüften Verbindungen wurde gemessen und bestätigt nach dem Prüfverfahren gemäss

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Meneki Kagaku (Immuno Chemistry), Yuichi Yamamura et al., Ed. Seiten 830-834, Asakura Shoten, Tokyo, Japan (1973). Ein Reagenzglas wurde mit 0,5 ml einer wässrigen Dispersion jeder der Prüfverbindungen gefüllt und 0,'5 ml sensibilislerter

Erythrocyten (EA), enthaltend 1 χ 10 Zellen/ml, 1 ml einer 5-fach verdünnten Lösung einer Veronal-Pufferlösung, enthaltend isotonische Gelatine (diese 5-fach verdünnte Lösung wird als GVB⁺⁺ der Einfachheit halber bezeichnet) und 0,5 ml des Komplementserums (Meerschweinchenkomplement), 150-fach mit GVB⁺⁺ verdünnt, wurden zugegeben. Die Mischung wurde 60 Minuten bei 37°C gehalten. Dann wurden 5 ml einer eiskalten physiologischen Kochsalzlösung zugegeben und die Mischung wurde zentrifugiert. Die Adsorption der überstehenden abgetrennten Lösung wurde bei OD₄₁₃ gemessen und der Grad, in dem die Testverbindung die Hämolyse von sensibilisierten Erythrocyten hemmte, wurde bestimmt. Die 50 %-ige Hämolysehemmungs-Aktivitätszahl (^VmI), die nach dem obigen Verfahren gemessen wurde, wird für jede der geprüften Verbindungen in Tabelle 1 gezeigt.

Tabelle 1

Prüfverbindung	Antikomplementäre Aktivität( TVmI)	Humankomplement
A B C D E G	Meerschweinchenkomplement	5 5-10 500
5 1 - 2 125 3-5 100 - 150 500 - 1000

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Aus den Ergebnissen in Tabelle 1 geht hervor, dass die geprüften Verbindungen A bis E, die in den pharmazeutischen Zusammensetzungen gemäss der Erfindung verwendet werden, unerwarteterweise eine höhere antikomplementäre Aktivität gegenüber der Vergleichsverbindung G (Glycyrrhizin) aufweisen.

(3) Inhibierung der Forssman-Reaktion

Die von Forssman 1911 entdeckte Forssman-Reaktion basiert auf der Feststellung, dass Kaninchen, die mit Gewebe von Meerschweinchen immunisiert worden sind, und auch andere Tiere Antikörper bilden, die in der Lage sind, Schaf-Erythrocyten in Lösung zu bringen. Dies Phänomen bedeutet, dass die Gewebe von Meerschweinchen und anderen Tieren das gleiche Antigen wie Schaf-Erythrocyten enthalten. Dieses Antigen wird als "Forssman-Antigen" bezeichnet und der entsprechende Antikörper wird als "Forssman-Antikörper" bezeichnet. Das Forssman-Antigen findet man im Gewebe des Menschen, des Meerschweinchens, des Schafes, von Pferden, Katzen, Hausgeflügel, Landschildkröten, Bakterien und dergleichen, aber nicht bei Ratten, Schweinen, Küken, Kaninchen, Gänsen, Tauben und Fröschen (J. Buchbinder, "Heterophile Phenomena in Immunology", Rieview Arch., Pathol. , 1_9, 841-880 (1935)).

Im allgemeinen wird die Forssman-Reaktion durchgeführt, indem man Tiere, die kein Forssman-Antigen aufweisen, wie Kaninchen, mit Schaf-Erythrocyten als Antigen immunisiert und dabei ein Antiserum (d.h. Forssman-Antikörper) erhält und das Antiserum Meerschweinchen intravenös injiziert. Die Reaktion wird dadurch bestätigt, dass das Meerschweinchen, dem die intravenöse Injektion verabreicht wurde, innerhalb weniger Minuten stirbt.

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Mit anderen Worten kann gesagt werden, dass die Forssman-Reaktion eine zellenauflösende letale Reaktion ist (Allergie Typ II/ gemäss der Definition von Gell & Coombs), die durch Injektion der Antikörper in ein Tier mit dem entsprechenden Antigen verursacht wird und wobei die Antikörper von anderen Tieren erhalten wurden, die mit Forssman-Antigen (Glycolipids) , die in der Zelloberfläche oder in dem Verbindungsgewebe vorkommen, immunisiert worden waren.. (Clinical Aspects of Immunology, 3. Ausgabe, herausgegeben durch P.G.H. Gell, R.R.A. Coombs und P.J. Lachmann, Blackwell Scientific Publications Osney Mead, Oxford, 85 Marylebone High Street, London WqM 3DE; Alicja B. Palczarka und Adolph P. Roszkowski "Inhibitors of Forssman Guinea Pig 'Anaphylaxis'" in Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics, 185, Nr. 1, 116-126 (1973)).

Bei der Typ II -zeilauflösenden Allergie wird das Komplementsystem während der Antigen-Antikörper-Reaktion im Blut aktiviert und dabei wird Anaphylatoxin von C3a oder C5a freigegeben, wodurch eine Vergrösserung der Durchlässigkeit der Blutgefässe eintritt. Insbesondere bei der Forssman-Reaktion beim Meerschweinchen gehen Blutkomponenten in die Lungenalveolen über und verursachen dort eine Blockierung im Respirationstrakt, was dann zum Tod des Individuums führt (J. Pharm. Exp. Ther. , J_85_, Nr. 1, 116-125 (1973)).

Deshalb wird durch die Inhibierung der Bildung von Anaphylatoxin von C3a, C5a und dergleichen durch antikomplementäre Mittel ein Überleben ermöglicht, selbst nach der Verabreichung von Forssman-Antikörper (Hämolysin).

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Methode

Durch eine femorale Vene wurden einem Meerschweinchen 1 ml/ kg Hämolysin (d.h. Forssman-Antikörper Anti-Schaf erhitztes Stromata Kaninchenserum, das nach dem Verfahren von dem vorerwähnten Meneki Kagaku gewonnen wurde) und unmittelbar darauf wurden die zu prüfenden Verbindungen, gelöst in einer 5 %-igen, wässrigen Äthanollsöung, durch eine andere femorale Vene verabreicht. Der Überlebensgrad nach 24 Stunden nach der Verabreichung wurde aufgezeichnet und die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 2 gezeigt.

Tabelle 2

Prüfverbindung	Menge (mg/kg)	Überlebend/ gesamt	Überlebens grad (%)
A	25	5/5	100
	3	5/5	100
F	100	5/5	100
	50	5/5	100
G	500	1/5	20
Kontrolle	5 %-ige wässrige Äthanol- lösung	0/5	0

Die Versuchstiere, denen eine 5 %-ige wässrige Äthanollösung (Kontrolle) verabreicht wurde, waren innerhalb 5 Minuten alle tot.

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Aus den in Tabelle 2 gezeigten Ergebnissen geht hervor, dass die Verbindungen A und F gemäss der Erfindung eine überlegene Inhibierungswirkung gegenüber der Fossman-Reaktion im Vergleich zur Vergleichsverbindung (Glycyrrhizin) haben.

Aus den Ergebnissen in den Tabellen 1 und 2 wird ersichtlich, dass die Verbindungen gemäss der Erfindung eine unerwartete überlegene antikomplementäre Aktivität gegenüber der Vergleichsverbindung G (Glycyrrhizin) haben.

(4) Therapeutische Wirkung bei einer nephrotoxinartigen Nephritis

Ratten-Nephrotoxin (nachfolgend mit "NT" abgekürzt) wurde wie folgt erhalten:

Rattennierenrinde wurde mit der gleichen Menge einer physiologischen Kochsalzlösung homogenisiert. Die homogenisierte Mischung wurde mit Freund¹s Complete Adjuvant (ein Produkt der Difco Company) im Volumenverhältnis 1:1 vermischt. 2 ml der erhaltenen Mischung wurden einem Kaninchen (Körpergewicht 3100 g) zur Immunisierung des Kaninchens intramuskulär injiziert. Nach 1 1/2 Monaten wurde Blut aus dem Herzen des Kaninchens entnommen und das Serum gewonnen. Das Serum wurde 30 Minuten bei 56°C inaktiviert, dann mit einer 40 %-igen gesättigten wässrigen Ammoniumsulfatlösung ausgesalzen und franktioniert. Die /f-Globulin (¹^G) Fraktion wurde gesammelt, wobei man NT erhielt.

Die therapeutische Bewertung wurde durchgeführt, indem man männliche Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von 150 bis

909841/0591

16Og mit jeweils drei Wiederholungen für jede zu prüfende Verbindung verwendete. Die zu prüfende Verbindung wurde intraperitoneal einmal alle 24 Stunden 7 Tage lang verabreicht. Eine Stunde nach der Verabreichung der zu prüfenden Verbindung am 3. Tag wurde NT zugegeben. Das NT wurde intravenös in einer Menge von 1 ml in die Schwanzvene einer jeden Ratte injiziert. Als Kontrolle wurde eine physiologische Kochsalzlösung verwendet.

Das Niveau des Proteinharnstoffs (Gesamtmenge des ausgeschiedenen Urins innerhalb eines Zeitraums von 24 Stunden) wurde durch Trübungsmessung gemessen unter Verwendung von Rinderserumalbumin als Kontrolle mittels Sulfosalicylsäure.

Die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 3 gezeigt.

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Tabelle 3

PROTEINHARNSTOFFNIVEAU (mg/Tag)

Prüfverbindung	1	1	Tag	7	10
	2	14	4	22	32
Kontrolle	3	20	17	27	37
	Durch schnitt	12	25	20	31
	1	15	19	23	33
	2	1,9	20	0,9	7
A (3 mg/Körper)	3	5,3	1,2	1,8	13
	Durch schnitt	2,5	2,9	1,1	9
	1	3,2	2,7	1,3	9,7
	2	2,4	2,3	3,1	11
B (3 mg/Körper)	3	6,1	1,9	7,3	15
	Durch schnitt	4,2	5,1	3,5	8
	1	4,2	2,8	4,6	11,3
	2	5,8	3,3	6,2	9
F (3 mg/Körper)	3	4,7	4,6	5,3	15
	Durch schnitt	4,1	3,8	5,6	7
		4,9	5,2	5,7	10,3
	4,5

Θ09841/0591

Die Anzahl der Tage wird von der Zeit der Verabreichung der zu prüfenden Verbindung berechnet, was 1 Stunde vor der Anwendung von NT erfolgte.

Das Proteinharnstoffniveau bei einer gesunden Ratte beträgt 0/5 bis 5 mg/Tag. Übersteigt das Proteinharnstoffniveau diesen Bereich, insbesondere wenn das Proteinharnstoffniveau grosser als 10 mg/Tag ist, kann man mit Sicherheit sagen, dass eine Nephritis eingetreten ist. Aus den Ergebnissen der Tabelle 3 wird ersichtlich, dass eine Nephritis bei der Kontrollgruppe auftrat und bei den Fällen, bei denen die Verbindungen der vorliegenden Erfindung verwendet wurden, ist die Menge an Proteinharnstoff vom Tag der Verabreichung von NT bis zum Tage 10 nach der Verabreichung im wesentlichen die gleiche wie bei einer gesunden Ratte. Das heisst, dass durch die Verabreichung der Verbindungen gemäss der Erfindung eine primäre und sekundäre Immunreaktion inhibiert wird.

(5) Therapeutische Wirkung bei heymannartiger Nephritis

Bei diesem Versuch wurden männliche Wistar-Ratten mit einem Körpergewicht von 180 bis 200 g verwendet. Rattennierenrinde wurde extrahiert und mit einer gleichen Volumenmenge einer physiologischen Kochsalzlösung homogenisiert. Die homogene Lösung wurde mit 1500 G 1 Stunde lang zentrifugiert. Die überstehende Flüssigkeit wurde nach dem Verfahren von T. S. Edington et al_# Journal of Experimental Medicine, 127, 555 (1968) gereinigt und mit Freund¹s Complete Adjuvant 37 Ra (ein Produkt der Difco Company) im Volumenverhältnis von 0,4:1 vermischt. Die Mischung wurde dann intraperitoneal isologen Ratten in einer Menge von 0,5 ml/Ratte injiziert. Dann wurde

909841/0591 " ³² '

die gleiche Menge dieser Mischung alle 2 Wochen verabreicht bis das Proteinharnstoffniveau 100 mg/Tag überstieg (diese Zeit betrug etwa 6 bis 8 Wochen).

Jede der zu prüfenden Verbindungen wurde intraperitoneal den unter einer heymannartigen Nephritis leidenden Ratten verabreicht (Körpergewicht 300 bis 350 g) und zwar 7 Tage lang 1 mal täglich, und die Mengen an Proteinharnstoff (mg/Tag) wurden in der vorher angegebenen Weise gemessen. Als Kontrolle wurde eine physiologische Kochsalzlösung verwendet.

Die Ergebnisse werden in Tabelle 4 gezeigt.

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Tabelle 4

PROTEINHARNSTOFFNIVEAU (mg/Tag)

Prüfverbindung	1	vor der Verab reichung	Tag	4	7	14	21
Kontrolle	2	132	1	135	126	135	114
	3	121	127	121	109	103	105
	Durch schnitt	135	105	137	132	121	109
	1	129	117	131	122	119	109
A (3 mg/Körper)	2	117	116*	42	27	3	8
	3	129	89	75	39	17	13
	Durch schnitt	123	127	58	18	9	7
	1	123	119	58	28	3	9
B (3 mg/Körper)	2	151	112	121	46	29	20
	3	108	152	110	81	54	37
	Durch schnitt	124	119	105	65	31	29
	1	128	108	112	64	38	29
F (3 mg/Körper)	2	162	126	132	72	32	13
	3	126	154	102	56	27	21
	Durch schnitt	137	121	115	82	43	26
		142	141	116	70	34	20
	139

909641/OSO 1

Zwei bis drei Wochen nach Beginn der Versuchsserie hatte das Körpergewicht der Ratten auf 400 bis 500 g zugenommen und es lagen normale Proteinharnstoffniveaus, die 5 bis 15 mg/Tag betragen, vor. Aus der Tabelle 4 wird ersichtlich, dass die erfindungsgemassen Verbindungen Heymann-artige Nephritis heilen können.

(6) Wirkung auf Endotoxin-Schock

Glycolipide in der Zellwand von gramnegativen Bakterien dienen bekanntlich als ein Endotoxin, das bei vielen Tieren einen Endotoxin-Schock verursacht. Endotoxin-Schock wird als ein Modell für eine disseminierte intravaskuläre Koagulation (" DIC " abgekürzt) beim Menschen angesehen.

Aus verschiedenen Berichten wird die Ansicht unterstützt, dass eine Verbindung oder ein Mittel, das bei der Forssman-Reaktion eine inhibierende Wirkung zeigt auch eine therapeutische Wirkung bei der humanen DIC hat (Abstracts of Proceedings of International Symposium on Quinines vom 6. bis 9. November 1978 in Tokyo).

Methode

Jede der zu prüfenden Verbindungen A und Predonisolonhemisuccinat (Produkt der Shionogi Seiyaku Co., Ltd.), gelöst in einer 5 %-igen wässrigen Äthanollösung, wurde intraperitoneal einer männlichen Maus (dd-Stamm) mit einem Gewicht von 18g verabreicht. Nach 30 Minuten wurden 60 mg/kg Endotoxin, isoliert aus E. coli K-12 Stamm, nach dem in Carbohydrate Chemistry,

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Band 15, Seite 83 (1965), Academic Press, beschriebenen Verfahren intravenös verabreicht. 24 Stunden nach der Verabreichung von Endotoxin wurde der Überlebensgrad der Tiere aufgezeichnet. Die erzielten Ergebnisse werden in der Tabelle 5 gezeigt.

Tabelle 5

Prüfverbindung	Dosis (mg/kg)	Überlebens grad (%)
A	50	78,3
	25	73,7
	12,5	50,0
Predonisolon-hemi- succinat (Vergleich)	50	66,7
	25	86,7
	12,5	62,5
Kontrolle	5 %-ige wässrige Äthanol lösung	13,6

Aus den Ergebnissen der Tabelle 5 geht hervor, dass die meisten Mäuse der Kontrollgruppe innerhalb 24 Stunden nach der Verabreichung von Endotoxin tot waren.

Aus den Ergebnissen geht auch hervor, dass die Tiere, denen die erfindungsgemässen Verbindungen verabreicht worden waren, augenscheinlich einen grösseren Überlebensgrad gegenüber

909841/0591

den Tieren der Kontrollgruppe aufwiesen und dass der Uberlebensgrad im wesentlichen in der gleichen Grössenordnung liegt wie bei den Tieren, denen Predonisolon-hemisuccinat verabreicht worden war.

Aufgrund der Tatsache, dass Endotoxin unter verschiedenen Aktivitäten auch eine komplementaktivierende Aktivität aufweist, ist anzunehmen, dass der hohe Überlebensgrad der durch die erfindungsgemässen Verbindungen erzielt wird, auf deren inhibierende Wirkung auf die Aktivierung dieser Komplemente zurückzuführen ist.

(7) Dosis-Ansprechbarkeit der Verbindung A bei der Aktivierung der Komplemente C1, C2 und C-EDTA (C3 bis C9)

Die Dosis-Ansprechbarkeit für C1, C2 und C-EDTA wurde unter Verwendung von EAC4-,EAC14-oder EAC142-Zellen bestimmt. Jedes bei diesem Versuch verwendete Komplement wurde nach dem Verfahren gewonnen, das in "Molecular Basis of Complement Action", Seiten 75-109 (1978), Meredith Corporation, beschrieben wird.

Unter Verwendung einer Mikrotitertafel, hergestellt von der Cooke Engineering Co., wurden zweifach serienverdünnte Lösungen von Verbindungen A und C1, jeweils verdünnt mit GVB , hergestellt. Die für die Verdünnung verwendete Ausgangslösung A wurde hergestellt, indem man die Verbindung A in einer 5 %-igen wässrigen äthanolischen Lösung (pH 7,5) bis zu einer Konzentration von 5000 ^/ml löste. In zwei Löcher der

909841/0591 " ³⁷ "

Mikrotitertafel wurden die folgenden Reagentien 1 bis 5 in der nachfolgenden Reihenfolge eingefüllt:

1. ein Tropfen der serienverdünnten Verbindung A in GVB⁺⁺;

2. ein Tropfen serienverdünntes C1 (x 1/20 bis χ 1/1280) in GVB⁺⁺;

3. ein Tropfen EAC4-Zellen (1 χ 10⁸/ml) in GVB⁺⁺
(15 Minuten unter Vibration bei 37°C inkubiert);

4. ein Tropfen C2 (x 1/10) in GVB⁺* (10 Minuten bei 30°C unter Vibration inkubiert);

5. zwei Tropfen 1/37,50 C-EDTA (60 Minuten bei 37°C unter Vibration inkubiert und .anschliessend zentrifugiert) .

Die jeweiligen Mischungen wurden nach folgenden Standard
bewertet:

Grad	0	1	2	3	4
% Hämolyse	0%	25%	50%	75%	100%

Die erzielten Ergebnisse werden in Tabelle 6 angegeben.

909841/0591

Tabelle -6

Verdün nung von C1	x2	x4	x8	Verdünnung	x32	der	Verbindung A	x256	x512	X1O24	keine Zugabe	keine Zugabe
x20	4	4	4	x16	4	x64	x128	4	4	4	4	4
x40	3,5	3,5	3,5	4	4	4	4	4	4	4	4	4
x80	2	2	2	3,5	2	4	4	4	4	4	4	4
x160	0	0	0	2	1	4	4	4	4	4	4	4
x32O	0	0	0	0	0	3	4	4	4	4	4	4
x64O	0	0	0	0	0	2	4	4	4	4	4	4
X128O	2	0	0	0	0	2	4	4	4	4	4	4
keine Zugabe	2	0	0	0	0	1	3	0	0	0	0	0
			0	0	0

U)

Ca) CO Κ»

(ii) 52§is-Ansgrechbarkeit_für_C2

Serienverdünnte Lösungen der Verbindungen A und C2 wurden in gleicher Weise hergestellt wie beim Verfahren für die Dosis-Ansprechbarkeit von C1, mit der Ausnahme, dass C2 anstelle von C1 verwendet wurde. In zwei Löcher einer Mikrotitertafel (hergestellt von Cooke Engineering Company, wurden die folgenden Reagentien 1 bis 4 in der nachfolgend angegebenen Reihenfolge zugegeben.

1. ein Tropfen Verbindung A, serienverdunnunt mit GVB⁺⁺;

2. ein Tropfen C2, serienverdünnt in GVB ;

3. ein Tropfen EAC14-Zellen (1 χ 10⁸ZmI) in GVB⁺⁺ (10 Minuten bei 30⁰C inkubiert);

4. zwei Tropfen 1/37,5 C-EDTA (60 Minuten bei 37°C inkubiert).

Die jeweiligen Mischungen wurden in gleicher Weise wie bei (i) zuvor bewertet. Die erzielten Ergebnisse sind in Tabelle 7 enthalten.

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809841/ÖE91

Tabelle; 7

co

ca

σ cn co

Verdün nung von C2	x2	x4	x8	x1	Verdünnung der	x64	Verbindung A	x256	x512	x1O24	keine Zugabe	keine Zugabe
x40	4	4	4	4	6 x32	4	x128	4	4	4	4	4
x80	4	3,5	3,5	3,	4	3,5	4	3,5	3,5	3,5	3,5	3,5
x160	4	3	3	3	5 3,5	3	3,5	3	3	3	3	3
x32O	4	2	2	2	3	2	3	2	2	2	2	2
x64O	4	1	1	1	2	1	2	1	1	1	1	1
X128O	4	0,5	0,5	0,	1	0,5	1	0,5	0,5	0,5	0,5	0,5
X256O	4	0	0	0	5 0,5	0	0,5	0	0	0	0	0
keine Zugabe	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
				0	0

to

CO ro

(iii) 52Sis-Ansgrechbarkeit_fUr_-C-EDTA

Serienverdünnte Lösungen der Verbindungen A und C-EDTA wurden in gleicher Weise hergestellt wie für die Dosis-Ansprechbarkeit von C1, mit der Ausnahme, dass anstelle von C1 C-EDTA verwendet wurde.

In die Löcher einer Mikrotitertafel (hergestellt von Cooke Engineering Company) wurden die folgenden Reagentien 1 bis 3 in der angegebenen Reihenfolge eingefüllt:

1. ein Tropfen der in GVB serienverdünnten Lösung von A; ·

2. zwei Tropfen C-EDTA, serienverdünnt in GVB ⁺;

3. zwei Tropfen EAC142-Zellen (5 χ 10⁸/ml) in GVB⁺⁺ (60 Minuten unter Vibration bei 37°C inkubiert).

Die jeweiligen Mischungen wurden in gleicher Weise wie in (i) bewertet. Die erzielten Ergebnisse werden in der nachfolgenden Tabelle 8 angegeben.

809841/0591

• Tabelle ·8· ■

co ο co QO

cn

Verdün	χ2	χ4	χ8	Verdünnung	χ32	der	Verbindung A	χ256	χ512	Χ1Ο24	keine Zugabe	keine Zugabe
nung von C-EDTA	4	4	4	χ16	4	χ64	χ128	4	4	4	4	4
χ20	4	3	3	4	3	4	4	3	3	3	3	3
x40	4	2	2	3	2	3	3	2	2	2	2	2
χ80	4	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2	2
χ160	4	1	1	2	1	2	2	1	1	1	1	1
χ32Ο	4	0	0	1	0	1	1	0	0	0	0	0
χ640	4	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0	0
Χ128Ο	4	0	0	0	0	0	0	0	. 0	0	0	0
keine Zugabe			0	0	0

»Ρ» NJ

CO

Ca) CO

Aus den Ergebnissen, die in Tabellen 6 bis 8 gezeigt werden, wird ersichtlich, dass die Verbindung A eine Dosis-Ansprechbarkeit gegenüber der Inhibierung der C1-Aktivierung auf EAC4-Zellen zeigte aber keinerlei Dosis-Ansprechbarkeit gegenüber der Inhibierung einer C2-Aktivierung von EAC14-Zellen oder C-EDTA (C3 bis C9) Aktivierung von EAC142-Zellen. Obwohl das Verhalten der Verbindung A gegenüber C4 noch aufzuklären ist, kann man doch schon mit Sicherheit in Betracht ziehen, dass die Verbindung A die C1-Aktivierung inhibiert und eine antikomplementäre Aktivität aufweist.

(8) Akute Toxizität

Die akute Toxizität (LD^q mg/kg) der Prüfverbindungen wurde bei Mäusen bestimmt, denen die Verbindungen A bis F intraperitoneal verabreicht wurden und die Verbindung G intravenös verabreicht wurde.

Die Ergebnisse werden in Tabelle 9 gezeigt.

Tabelle	9
Prüfverbindung	Akute Toxizität LDςη (mg/kg) bU
A	> 300
B	> 300
C	> 300
D	>300
ε	>300
F	>300
G	>300

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Eine weitere Erläuterung der Erfindung erfolgt in den nachfolgenden Referenzbeispielen und Beispielen.

Referenzbeispiel 1

(a) Sojasaponin B (500 mg) wurde in 30 ml Methanol gelöst. Nach Zugabe von 1,5 ml 15 η Schwefelsäure wurde die Lösung 3,5 Stunden unter Rückfluss behandelt. Zu dem Reaktionsgemisch wurde kaltes Wasser gegeben, wobei sich ein Niederschlag bildete der gesammelt und ausreichend mit Wasser gewaschen wurde. Der Niederschlag wurde auf einer Kieselgelsäule adsorbiert und mit einem Gemisch aus Chloroform/ Äthanol abwechselnd (20:1 V/V, 200 ml; 10:1 V/V, 150 ml; 5:1 V/V, 200 ml und 2:1 V/V, 200 ml) in der nachfolgenden Reihenfolge entwickelt, wobei man die folgenden Verbindungen aus einem Teil der jeweiligen Eluatfraktionen gewann.

Eluatfraktion Gewonnene Verbindung
(CHC1₃/C₂H₅OH V/V) . .

20:1 3-0-(6-0-Methyl-ß-D-glucuronpyrano-

syl)-sojasapogenol B (71 mg) (249-25O°C)

10:1 3-0-^ß-D-Galactopyranosyl-O ->2)-

(6-0-methyl-ß-D-glucuronpyranosyl]_7" sojasapogenol B (262-263°C) und 3-0-^00 -L-Arabinopyranosyl- (1 -> 2) -

(6-0-methyl-ß-D-glucuronpyranosyl]_7-sojasapogenol B (26O-265°C)

5:1 3-0-^oi/ -L-Rhamnopyranosyl- (1 -» 2) -ß-D-

galactopyranosyl-(1 -» 2)-(6-0-methylß-D-glucuronpyranosyl]_7~sojasapogenol B (27O-274°C)

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3-0-(6-0-Methyl-ß-D-glucuronpyranosyl)-sojasapogenol B (71 mg) das so erhalten worden war, wurde in 2 ml Methanol gelöst und zu der Lösung wurden 2 ml 1 η einer wässrigen NaOH-Lösung gegeben und anschliessend wurde 2 Stunden unter Rückfluss gekocht. Nach dem Vermischen des Reaktionsgemisches mit kaltem Wasser und der Einstellung des pH-Wertes auf etwa 1 mit 1 η wässriger HCl-Lösung wurde das Gemisch mit n-Butanol extrahiert. Die n-Butanolfraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockene konzentriert. Beim Umkristallisieren des Rückstandes aus einer Mischung von Chloroform/Aceton (1:1 V/V) erhielt man 50 mg 3-0-(ß-D-Glucuronpyranosyl)-sojasapogenol B.

Schmelzpunkt: 231-232°C (Zersetzung) Elemtaranalyse für ^C ₃6^H58°9

Berechnet %:	C	68	,11	H	9	,21
Gefunden %:		67	,85		9	,08

Dünnschichtchromatografie über"Kieselgel F₃₅₄" (Handelsname für ein Produkt der Merck Co.)

1. Chloroform-Methanol-Wasser (65:35:8 V/V/V) Rf = 0,38

2. Isopropanol-2 η wässrige Ammoniaklösung (100:15 V/V) Rf = 0,21

Löslichkeit: Sehr löslich in Methanol, Äthanol, n-Propanol, n-Butanol, wässriger Alkalilösung, Pyridin, Dimethylsulfoxid und Dimethylformamid; löslich in Aceton, Äthylacetat und Methyläthy!keton und schwach löslich in Benzol, Chloroform,

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Diäthyläther, η-Hexan und Petroläther.

(b) Sojasaponin B (500 mg) wurde in 30 ml in mit HCl gesättigtem Äthanol gelöst und die Lösung wurde 3 Stunden Rückflussbehandelt. Zu dem Reaktionsgemisch wurde kaltes Wasser gegeben, wobei sich ein Niederschlag bildete der gesammelt und mit Wasser gewaschen wurde. Der Niederschlag wurde dann über einer Kieselgelsäule chromatografisch gereinigt (Eluiermittel: Chloroform/Äthanol 20:1 V/V, 200 ml; 10:1 V/V, 150 ml; 5:1 V/V, 200 ml und 2:1 V/V, 200 ml) in der genannten Reihenfolge und die nachfolgenden Verbindungen wurden aus den jeweiligen Eluatfraktionen gewonnen.

Eluatfraktion
.CHC1₃/C₂H₅OH V/V Gewonnene Verbindung

20:1 3-0-(6-0-Äthyl-ß-D-glucuronpyranosyl)·

sojasapogenol B (75 mg) 10:1 3-0-/ß-D-Galactopyranosyl-(1 ->2)-(6-

0-äthyl-i3-D-glucuronpyr anosyl2.7~so j a-

sapogenol B und

3-O-/p6 -L-Arabinopyranosyl-(1 -> 2)-

(6-0-äthyl-ß-D-glucuronpyranosyl)_7~ sojasapogenol B

5:1 3-O-£J0 -L-Rhamnopyranosyl- (1 -> 2) -ß-D-galactopyranosyl-(1 -> 2)-(6-0-äthyl-ß-D-glucuronpyranosyl)_7~^sojasapogenol B

3-0-(6-0-Äthyl-ß-D-glucuronpyranosyl)-sojasapogenol B (75 mg) die so erhalten wurden, wurden in 2 ml Äthanol und 2 ml einer

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1 η wässrigen KOH-Lösung gelöst und die Mischung wurde 2 Stunden unter Rückfluss gekocht. Das Reaktionsgemisch wurde mit kaltem Wasser vermischt und der pH-Wert wurde auf etwa 1 mit einer 1 η wässrigen HCL-Lösung eingestellt und anschliessend wurde mit n-Butanol extrahiert. Die n-Butanolfraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft und der Rückstand wurde aus einer Mischung von Chloroform und Aceton (1:1 V/V) umkristallisiert, wobei man 45 mg 3-0-(ß-D-Glucuronpyranosyl)-sojasapogenol B erhielt.

Schmelzpunkt: 231 bis 232°C (Zersetzung)

Referenzbeispiel 2

Sojasaponin (1 g) wurde in 70 ml destilliertem Wasser gelöst und die Lösung wurde mit 5 ml einer 15 η wässrigen Schwefelsäurelösung vermischt und anschliessend 2,5 Stunden unter Rückfluss gehalten. Das Reaktionsgemisch wurde mit n-Butanol extrahiert. Die n-Butanolfraktion wurde unter vermindertem Druck zur Trockene eingedampft. Der Rückstand wurde auf einer Kieselgelsäule absorbiert und mit einer Mischung aus Chloroform/Äthanol (20:1, 10:1 und 2:1 V/V) entwickelt, wobei man 350 mg 3-0-(ß-D-Glucuronpyranosyl)-sojasapogenol B erhielt.

Schmelzpunkt: 231 bis 232°C (Zersetzung)

Beispiel 1

Natriumsalz der erfindungsgemässen

Verbindung A 500 mg

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Glucose

Destilliertes Wasser zum injizieren

250 mg

bis zu einem Gesamtvolumen von 5 ml

Das Natriumsalz und die Glucose wurden in destilliertem Wasser für Injektionszwecke gelöst und die Lösung wurde in eine 5 ml Ampulle gegeben. Die Luft wurde durch Stickstoff verdrängt und die Ampulle 15 Minuten zur Sterilisierung der Lösung auf 121°C erhitzt. Man erhielt eine injizierbare Zubereitung.

Beispiel 2

Erfindungsgemasse Verbinddung B

halbsynthetische Glyceridbase

500 mg

bis zu einer Gesamtmenge von 2000 mg

Die erfindungsgemä-se Verbindung wurde zu der halbsynthetischen Glyceridbase gegeben und das Ganze wurde bei 50⁰C vermischt und suspendiert. Die Mischung wurde in eine Form gegeben und ohne Hilfe abkühlen gelassen. Das Produkt wurde aus der Form entnommen, wobei man ein Suppositorium erhielt.

Beispiel 3

Erfindungsgemä-se Verbindung B

150 g

Avicel (Handelsname für ein Produkt der Asahi Kasei Kabu-

shiki Kaisha) - 40 g

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- 49 -

- 49 -	Maisstärke	30	g	2911332
Magnesiumstearat	2	g
TC-5 (Handelsname für Hydroxy-
propylmethylzellulose)	10	g
Polyäthylenglykol	3	g
Castoröl	40	g
Methanol	40	g

Die erfindungsgemässe Verbindung B, Avicel, Maisstärke und Magnesiumstearat wurden vermischt und zerkleinert und dann in einer üblichen Tablettiervorrichtung (10 mm Radius)" für eine Zuckerbeschichtung tablettiert. Die erhaltenen Tabletten wurden mit einem überzugsbildenden Mittel aus TC-5, Polyäthylenglykol 6000, Castoröl und Methanol unter Ausbildung von überzogenen Tabletten beschichtet.

Die Erfindung wurde ausführlich und hinsichtlich besonderer Ausführungsformen beschrieben, aber es ist für den Fachmann ersichtlich, dass zahlreiche Änderungen und Modifikationen möglich sind, ohne vom Geist und Umfang der Erfindung abzuweichen.

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Claims (1)

1. ,31 860 o/wa

   OTSUKA PHARMACEUTICAL CO., LTD., TOKYO/JAPAN

   Antikomplementäre Mittel, Verfahren zu deren Herstellung und Arzneimittel, welche diese enthalten

   PATENTANS PRÜCHE

   1· Pharmazeutische Zusammensetzung mit antikomplementärer Aktivität, dadurch gekennzeichnet , dass sie eine therapeutisch aktive Menge wenigstens einer
   Sojasapogenol B-Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon der allgemeinen Formel (I)

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   "OH

   (D

   worin bedeuten: R¹

   ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der Formel

   ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxymethylgruppe, ein Wasserstoffatom oder eine Rhamnopyranosylgruppe,

   und

   ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis

   6 Kohlenstoffatomen

   und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

   2. Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, dadurch g e k e η η zeichnet , dass die Menge an Sojasaponinderivat

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   oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon 1 bis etwa 70 Gew.%, bezogen auf das Gesamtgewicht der pharmazeutischen Zusammensetzung, beträgt.

   Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet , dass die Menge an Sojasaponinderivat oder des pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon 5 bis 50 Gew.%, bezogen auf das Gesamtgewicht der pharmazeutischen Zusammensetzung, beträgt.

   Antinephritische pharmazeutische Zusammensetzung, dadurch gekennzeichnet , dass sie eine therapeutisch aktive Menge wenigstens einer Sojasapogenol B-Verbindung oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon der allgemeinen Formel (I)

   ,""OH

   COOR

   -0 Γ" 0

   (D

   ·*' CH₂OH

   worin bedeuten:

   R ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der Formel

   .2

   9 0 9 8 4 1°/^R0 5 9 1

   R ein Wasserstoffatom oder eine HydroxymethyIgruppe, R ein Wasserstoffatom oder eine Rhamnopyranosylgruppe,

   • und

   R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis 6 Kohlenstoffatomen,

   und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger enthält.

   5. Verwendung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäss Anspruch 4 zur Behandlung von Nephritis unter Verabreichung einer Tagesdosis von etwa 0,5 bis etwa 20 mg/kg Körpergewicht pro Tag an einen nephritischen Patienten.

   6. Verfahren zur Herstellung einer pharmazeutischen Zusammensetzung gemäss Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man Sojasaponin (B') aus Sojabohneb: abtrennt, das abgetrennte Sojasaponin (B ) mit einem niedrigen Alkohol umsetzt unter Ausbildung einer Verbindung der allgemeinen Formel (I)

   COOR

   r—0

   ""0H

   (D

   CH₂OH

   — 5 —

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   worin bedeuten:

   R ein Wasserstoffatom oder eine Gruppe der Formel

   R² H0^R

   R ein Wasserstoffatom oder eine Hydroxymethylgruppe, R ein Wasserstoff atom oder eine Rhainnopyranosylgruppe,

   und
   ein
   6 Kohlenstoffatomen,

   R ein Wasserstoffatom oder eine Alkylgruppe mit 1 bis

   dass man gegebenenfalls die so erhaltene Verbindung in ein pharmazeutisch annehmbares Salz überführt und dass man wenigstens eine der Verbindungen der Formel (I) oder eines pharmazeutisch annehmbaren Salzes davon mit einem Träger vermischt.

   7« Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass die Alkoholbehandlung bei einer Temperatur von etwa 150°C während 1 bis etwa 6 Stunden vorgenommen wird.

   8. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch ge kennzeich net, dass
   geführt wird.

   net, dass die Alkoholbehandlung bei 50 bis 100°C durch-

   9. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, dass das Alkoholisat in einem inerten Lösungsmittel in Gegenwart eines Katalysators hydrolysiert wird.

   10. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet, 'dass die Hydrolyse zwischen Raumtemperatur und etwa 150°C durchgeführt wird.

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   11. Verfahren gemäss Anspruch 9, dadurch gekennzeichnet
   wird.

   net, dass die Hydrolyse bei 50 bis 110°C durchgeführt

   12. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekenn, zeich net, dass wenigstens eine der durch die Formel (I) gekennzeichneten Verbindungen oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon in einer Menge von 1 bis etwa 70 Gew.%, bezogen auf das Gesamtgewicht der pharmazeutischen Zusammensetzung, verwendet wird.

   13. Verfahren gemäss Anspruch 6, dadurch gekennzeich net, dass wenigstens eine der durch die Formel (I) angegebenen Verbindungen oder ein pharmazeutisch annehmbares Salz davon in einer Menge von 5 bis 50 Gew.%, bezogen auf das Gesamtgewicht der pharmazeutischen Zusammensetzung, angewendet wird.

   mm *7 —

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