DE2926463C2

DE2926463C2 -

Info

Publication number: DE2926463C2
Application number: DE2926463A
Authority: DE
Inventors: Karl Heinrich Dr. Durban Natal Za Pegel
Original assignee: Roecar Holdings (netherlands Antilles) Nv Willemstad Curacao Niederlaendische Antillen Nl
Current assignee: HOYER GMBH & CO KG, 41469 NEUSS, DE
Priority date: 1978-07-05
Filing date: 1979-06-30
Publication date: 1988-08-11
Also published as: IL57729A0; YU41343B; IL57729A; ES8101624A1; DK283579A; JPS5536471A; NZ190925A; CA1140857A; ES482253A0; YU163879A; LU81467A1; IT7949665A0; NL7905258A; IT1116894B; PT69875A; AU4865179A; CH641678A5; DE2926463A1; FR2430233B1; FR2430233A1

Description

Die Erfindung betrifft Spiroketaline (3-β-Hydroxy-5-en- oder 3-β-hydroxy-5-α-spiroketalsteroid-3-monosaccharide enthaltende Arzneimittel und ihre Anwendung zur Bekämpfung menschlicher und tierischer Krankheiten.

Spiroketalsteroid-glykoside sind vom 16β-26-Dihydroxycholestan-22- on abgeleitete Steroidsaponine, die eine 16,22,26-Spiroketal- gruppe tragen. Außerdem verfügen sie über eine 3β-Hydroxygruppe in glykosidischer Bindung und sie weisen eine Doppelbindung oder ein Alpha- oder Beta-Wasserstoffatom in der Stellung 5 auf. Die Aglycone dieser Verbindung haben entweder eine Doppelbindung in Stellung 5 (6) oder ein 5α-Wasserstoffatom. Typische Verbindungen der ersten Gruppe sind Diosgenin, Yamogenin, Botogenin und Cor relogenin, während Tigogenin, Neotigogenin, Hecogenin und Sisa logenin Beispiele der zweiten Gruppe darstellen. Herstellung und Eigenschaften sind zum Beispiel von M. H. Briggs und J. Brotherton in "Steroid Biochemistry and Pharmacology", Academic Press, 1970, Seiten 288-294 und R. Tschesche und G.Wulff in Fortschr. Chem. Org. Naturp., 973, 30, 461-606 beschrieben worden.

In der Natur liegen die Aglycone der Saponine als Glykoside vor, die meist 2 oder mehr Monosaccharideinheiten im Zuckeranteil ent halten. Aus diesem Grunde sind diese verhältnismäßig zuckerreichen Verbindungen meist gut wasserlöslich und bilden häufig einen seifen ähnlichen Schaum.

Es ist bereits bekannt, daß die intestinale Absorption der Saponine verhältnismäßig niedrig ist und daß sie bei oraler Gabe als nicht toxisch bei Menschen und Tieren gelten. Allerdings können sie aufgrund ihrer schaumbildenden Fähigkeiten zu Schwellungen führen. Die meisten Saponine sind bei Untersuchungen in vitro hämolytisch wirksam. Das Aglycon Diosgenin hat sich als nicht toxisch bei Tierexperimenten mit Ratten, Kaninchen und Hühnern erwiesen; es senkt den Serumcholesterolspiegel bei diesen Tieren, vergleiche J. L. Diaz-Zagoya et al: Biochem. Pharmacol, 1971, 20, 3473-3480; J. Laguna et al: J. Atheroscl. Res. 1962, 2, 459-470. Die Ver wendung dieser Verbindung als cholesterolsenkendes Mittel ist in den DE-OS 23 48 176 und US-PS 38 90 438 beschrieben.

Therapeutische Eigenschaften sind für einige Saponine beschrieben worden, niemals bisher aber spezifisch für Spiroketalsteroid saponine oder Spiroketaline.

Überraschenderweise wurde nunmehr festgestellt, daß bestimmte Spiroketaline, also die 3β-Mono-glucoside, und zwar sowohl der 5-En- als auch der 5-α-Spiroketalsteroidsapogenine mit oder ohne einer zusätzlichen Ketogruppe in Stellung 12, aber ohne besondere freie Hydroxigruppen, unerwartete prophylaktische und arzneiliche Wirkungen in der Prävention und der Behandlung verschiedener menschlicher und tierischer Krankheiten aufweisen. Einige dieser Verbindungen sind nach Kenntnis der Anmelderin bisher niemals in der Literatur beschrieben worden, so beispielsweise Hecogenin glucosid.

Die in den erfindungsgemäßen Arzneimitteln enthaltenen Verbindungen entsprechen der folgenden allgemeinen Formel,

in der in der 5-Stellung entweder eine Doppelbindung oder ein α-Wasserstoffatom vorliegen und in der Z ein Monosaccharid rest und in der R entweder zwei Wasserstoffatome oder eine Keto gruppe bedeuten.

Erfindungsgemäß werden die Glucoside eingesetzt, und die bevor zugt angewandten Verbindungen sind Diosgenin-β-D-glucosid, das auch unter dem Namen Trillin bekannt ist, und Hecogenin-β-D- glucosid. Trotz der geringen Wasserlöslichkeit dieser Verbin dungen - beispielsweise lösen sich etwa 6 mg Diosgenin-glucosid in 1 Liter Wasser bei Zimmertemperatur zu einer kolloidalen Lösung und Hecogeninglucosid scheint sogar noch eine etwas ge ringere Löslichkeit aufzuweisen - war es überraschend festzu stellen, daß sie pharmazeutisch wirksam sind, ohne dabei die in vitro übliche hämolytische Aktivität aufzuweisen, die meist den Saponinen einschließlich den Spiroketal-Steroidsaponinen eigen ist.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in an sich bekannter Weise nach der Koenigs-Knorr Synthese (W. Koenigs und E. Knorr, Chem. Ber., 1901, 34, 957-986) oder einer ihrer Modifikationen C. Meystre und K. Mioscher: Helv. Chim. Acta, 1944, 27, 231-236, R. B. Courow und S. Berstein: Org. Chem., 1971, 36, 363-870, J. J. Schneider: Cabohyd. Res., 1970, 12, 369-389, G. Wulff und G. Roehle: Angew. Chemie, 1974, 86, 173-87, N. Weber: Chem. Phys. Lipids, 1977, 18, 145-148 oder durch die orthoester Methode N. I. Uvarova: Carbohyd. Res., 1973, 27, 79-87 hergestellt werden, und zwar durch Behandeln der 3b-Hydroxyspiroketalsteroid-Aglykone mit entweder einem am C-1 bromierten oder einem 1,2-Orthoester monosaccharid-acetat in Gegenwart von Silberoxyd oder Silbercarbonat oder einem anderen geeigneten Katalysator. Außerdem können die Monosaccharidglykoside durch kontrollierte Fermentation oder Säurehydrolyse der zuckerreicheren Spiroketalsteroid-Saponine gewonnen werden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen können in an sich bekannter Weise in Nahrungsmittel oder zu pharmazeutischen Spezialitäten wie Pulvern, Pillen, Tabletten, Kapseln, Dragees, Emulsionen oder Lösungen für Injektion, Infusion oder orale Verabreichung verarbeitet werden. Da die Verbindungen verhältnismäßig unlöslich sind (etwa 5 mg/1 l Wasser bei 25°C für Diosgenin- und Heco geninglykosid) werden sie vorzugsweise in pharmazeutischen Zube reitungen in amorpher, hoch-disperser Form verwendet. Die Über führung hoch-disperser Formen erfolgt in an sich bekannter Weise, beispielsweise durch Erhitzen, Mikronisieren, Fällung auf fein teiligen Trägern usw. Die festen pharmazeutischen Zubereitungen weisen vorzugsweise eine Teilchengröße von etwa 0,1 mm und vor zugsweise von 0,06 mm oder kleiner auf.

Im allgemeinen werden die Spiroketaline, insbesondere Diosgenin- β-D-glucosid und Hecogenin-β-D-glucosid in täglichen Dosen von etwa 0,01-100 mg oder mehr eingesetzt.

Untersuchungen haben gezeigt, daß die erfindungsgemäßen Spiroketaline wertvolle Verbindungen bei der Behandlung von Entzündungen ver schiedener Genese sind. Hierbei ist es wichtig zu bedenken, daß die gegenwärtig verwendeten entzündungshemmenden Verbindungen wie beispielsweise Corticosteroide, Phenylbutazon, Acetylosalicyl säure, Indomethacin und andere meist in hohen Dosen von 100 mg oder mehr täglich verwendet werden müssen, wodurch häufig Neben wirkungen verschiedener Schwere ausgelöst werden, während die erfindungsgemäßen Spiroketaline, sowohl oral als auch parenteral, keine solchen Nebenwirkungen zeigen und daß sie auch nicht in so hohen Dosen genommen werden müssen, sondern daß die Dosis meist weniger als 1 mg täglich beträgt. Allerdings ist auch zu berück sichtigen, daß die entzündungshemmende Reaktion nicht sehr stark ist und erst nach einer gewissen Zeitspanne der Behandlung eintritt.

Die orale Wirksamkeit einer entzündungshemmenden Verbindung kann in einfacher Weise dadurch nachgewiesen werden, daß sie entweder oral oder parenteral an Tiere, wie beispielsweise Ratten ver füttert wird, bevor in eine der Hinterpfoten eine Lösung oder Suspension einer Entzündungen hervorrufenden Verbindung wie Kaolin, Eiweiß, Formaldehyd, Carragenin oder Hefe injiziert wird. Die entzündungshemmende Wirkung der Spiroketaline wurde mit Hilfe einer Suspension von Hefe, einem der milderen entzündungsfördernden Mittel untersucht. In Abhängigkeit von der Dosis und der Zu führungsart wurden deutliche Verringerungen bei der Bildung des akuten Oedems von 10 - etwa 40% beobachtet. Um diese Verringerung mit den Glucosiden des Diogenins, Hecogenin und Tigogenins zu er reichen, wurden Dosen von 500-1000 mg/kg Körpergewicht oral oder 50-100 mg/kg intraperitoneal zugeführt, und zwar 24 Stunden bevor die Tiere mit einer frischen 2%igen Hefesuspension in physiologischer Kochsalzlösung behandelt wurden.

Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind auch wirksam bei der Be handlung der Symptome der benignen Prostatahypertrophie.

Die geringste wirksame tägliche Spiroketalindosis beträgt für den Menschen ungefähr 0,03 mg, es können aber bis 100 g gegeben werden. Meist werden die Verbindungen in täglichen Dosen von 0,3-0,75 mg in drei oder vier Einzeldosen oder einer einzigen Dosis mit protrahierter Abgabe verabreicht, die bevorzugte tägliche Dosis ist 0,30-0,45 mg in drei täglichen Einzeldosen von jeweils 0,10-0,15 mg. Es wurde auch festgestellt, daß tägliche Dosen von weniger als 0,01 mg Spiroketaline keinen nach weisbaren Effekt bei der Behandlung der verschiedenen Krankheiten aufweisen.

Bei der Behandlung von Tieren kann die benötigte tägliche Dosis auf Basis eines durchschnittlichen menschlichen Körpergewichtes von 75 kg berechnet werden.

Die Erfindung wird im folgenden anhand der Beispiele näher erläutert:

Beispiel 1 Gewinnung von Spiroketalsteroid-glykosiden

Die Synthese von Diosgenin-β-D-glucosid und anderen Spiroketalinen wurde bereits von verschiedenen Autoren beschrieben (E. A. Sofowora und R. Hardman: Lloydia, 1976, 32, 141-143, G. Wulff et al: Chem. Ber., 1972, 105, 1097-110, J.J. Schneider: Carbohyd. Res., 1970, 12, 369-389).

41,4 g Diosgenin und 55,2 g Silverkarbonat wurden in siedendes Toluol eingebracht, und die Mischung wurde unter Rühren so lange destilliert, bis das Destillat wasserfrei überging. Dann wurde in die gerührte siedende Mischung eine Lösung aus 82,2 g Bromacetylglucose in 100 ml Toluol eingetropft. Die Mischung wird kontinuierlich weiter destilliert, um das sich bei der Reaktion bildende Wasser zu entfernen. Während dieser Zeit wird das Reaktionsgefäß vor Licht geschützt. Falls notwendig, wird das Volumen der Reaktionsmischung durch Zugabe von trockenem Toluol konstant gehalten. Nach der Zugabe der Aceto bromglukoselösung wird so lange weiter destilliert, bis das Destillat wasserfrei übergeht. Die Reaktionsmischung wird dann abgekühlt und filtriert. Der Rückstand wird mit frischem heißen Toluol ausge waschen. Die vereinigten Filtrate und Waschflüssigkeiten werden unter vermindertem Druck zur Trockne eingeengt. Der Rückstand wird aus Aethanol oder Hexan umkristallisiert. Die Ausbeute an Diosgenin-3-β-D-glucosid-tetraacetat betrug 25,5 g oder 34,3%. Fp 201-203°C ( α ) _D-76° (C 1,19 CHCl₃).

1 g Natrium wurde in 100 ml absoluten Aethanols gelöst. Von dieser Lösung wurden 15 ml unter Rühren schnell zu einer Lösung von 10 g Diosgenin-glucosid-tetraacetat in 600 ml Aethanol bei 45°C zuge geben. Die Mischung wird eine Stunde gerührt, bevor 2 l Wasser zugesetzt werden und die Mischung dann wiederum eine Stunde ge rührt wird. Das ausgefallene Diosgenin-β-D-glucosid wird abfiltriert und mit Wasser neutral gewaschen, bevor es im Vakuum 12 Stunden getrocknet wird. Die Ausbeute betrug 7 g oder 90%, Fp 277-285°C (kristallisiert bei etwa 250°C).

Entsprechend können auch die Glykoside des Hecogenin, Tigogenin und Diosgenin hergestellt werden. Einige Verbindungen sind in der folgenden Tabelle angegeben:

Tabelle

Beispiel 2 Herstellung pharmazeutischer Zubereitungen a) Herstellung von Lactose-Maisstärke-Pulvern mit einem Gehalt an Diosgenin-β-D-glucosid

15 g Diosgenin-β-D-glucosid werden in 3 l einer siedenden Mischung aus Chloroform und Aethanol im Verhältnis 3 : 1 gelöst. Die Lösung wird dann zu 1 kg Lactose mit einer Teilchengröße von nicht über 0,15 mm zugegeben. Die so entstehende Auf schlämmung wird unter ständigem Rühren zur Trockne eingedampft. Die trockene imprägnierte Lactose wird auf die ursprüngliche Teilchengröße wieder zerkleinert und schließlich mit 9 kg Maisstärke und 50 g Magnesiumsterat gemischt. Diese Mischung ist ausgezeichnet zur Abfüllung in Kapseln geeignet. Jede Kapsel kann beispielsweise 100 mg der Mischung enthalten, was einem Gehalt an 0,15 mg Diosgenin-β-D-glucosid 10 mg Lactose, 90 mg Maisstärke und 0,5 mg Magnesiumsterat entspricht.

b) Herstellung von Lactosegranulaten mit einem Gehalt an Diosgenin- β-D-glucosid

5 g Diosgenin-β-D-glucosid werden in 5 l siedendem Aethanols gelöst. Die Lösung wird dann zu 3,32 kg Lactose mit einer Teilchengröße von nicht über 0,15 mm zugesetzt. Die Auf schlämmung wird unter ständigem Rühren zur Trockne einge engt. Die trockene imprägnierte Lactose wird auf die ur sprüngliche Teilchengröße zerkleinert, bevor sie zu Granu laten mit einer bevorzugten Teilchengröße von etwa 0,7 bis 1,2 mm verarbeitet wird. Dieses granulierte Produkt ist eben falls besonders zur Weiterverarbeitung in Kapseln geeignet, wobei beispielsweise eine Kapsel mit 100 mg des Granulates dann 0,15 mg Diosgenin-β-D-glucosid enthält.

c) Herstellung von Tabletten mit einem Gehalt an Diosgenin-β-D- glucosid

1,250 g Diosgenin-β-D-glucosid werden in 1 l Chloroform gelöst und mit 900 g Lactose versetzt. Die Aufschlämmung wird unter vermindertem Druck und ständigem Rühren bei Raum temperatur getrocknet. Dann wird die Mischung mit 2100 g Kartoffel stärke versetzt und erneut kräftig gemischt. Die imprägnierte Lactose-Stärke-Mischung wird mit 2500 ml einer wäßrigen Lösung aus 250 g Gelatine und 5 g Glyzerin versetzt und in an sich bekannter Weise granuliert. Diese Granulate werden unter vermindertem Druck bei Raumtemperatur getrocknet. Das Granulat wird dann in an sich bekannter Weise zu Tabletten mit einem Gesamtgewicht von 400 mg verpreßt. Jede Tablette enthält demnach 0,15 mg Diosgenin-β-D-glucosid, 110,56 mg Lactose, 257,97 mg Kartoffelstärke, 30,31 mg Gelatine und 0,61 mg Glyzerin.

d) Herstellung von Drag´es mit einem Gehalt an Hecogenin-β-D- glucosid

Eine Lösung aus 450 mg Hecogenin-β-D-glucosid in 2 l Chloroform wird mit 1850 g Lactose und 300 g Saccharose versetzt. Die Aufschlämmung wird bei 30°C unter vermindertem Druck getrocknet und dann in an sich bekannter Weise unter Zugabe von 1,6 l einer wäßrigen Gelatinelösung mit einem Gehalt an 40 g Gelatine granuliert. Das Granulat wird bei vermindertem Druck und einer Temperatur von 45°C getrocknet. Dann wird das Granulat mit 10 g Magnesiumsterat innig gemischt. Die so hergestellte Mischung (2200 g) wird zu etwa 3000 Kernen verpreßt, die dann im üblichen Dragierverfahren mit einer, gegebenenfalls gefärbten, dünnen Drag´edecke über zogen werden. Jedes Drag´e enthält demnach 0,15 mg Hecogenin- β-D-glucosid, 616,67 mg Lactose, 100,00 mg Saccharose, 13,33 mg Gelatine und 3,33 mg Magnesiumsterat.

Produkte wie unter a) und b) können auch hergestellt werden unter Verwendung von

i)Glykosiden der erwähnten 3-β-Hydroxispiroketalsteroide und insbesondere der β-D-Glucoside von Tigogenin und Hecogenin. ii)Glucose, Ascorbinsäure, Talk oder Siliziumdioxid als Trägern für die Glykoside oder auch unter Verwendung anderer inerter pharmazeutisch unbedenklicher Träger. iii)Der Gehalt an aktiven Glykosidverbindungen in jeder Kapsel kann auf Werte zwischen 0,01 mg und mehr eingestellt werden. iv)Die in a) und b) erwähnten Hilfssubstanzen können in Ent sprechung der üblichen pharmazeutischen Herstellungsver fahren geändert werden. v)In jedem Stadium der Herstellungsprozesse in a) oder b) können andere pharmazeutisch aktive Verbindungen eingearbeitet werden.

e) Herstellung einer Salbe mit einem Gehalt an Hecogenin-b-D- glucosid

1 g Hecogenin-β-D-glucosid werden in 90 g emulgierenden Cetylsteararylalkohol eingearbeitet. Nach Zugabe von 105 g dickflüssigen Paraffins und 105 g weißer Vaseline wird auf dem Wasserbad auf 60°C aufgeschmolzen. Die Schmelze wird mit 699 g Wasser mit etwa der gleichen Temperatur in kleinen Anteilen versetzt. Die Mischung wird bis zum Erkalten gerührt und ergibt eine Salbe mit einem Gehalt an 0,1% Glucosid.

f) Herstellung einer Creme mit einem Gehalt an Tigogenin-β- D-glucosid

1 g Tigogenin-β-D-glucosid wird in 500 g Wollwachsalkohol eingetragen und auf dem Wasserbad auf etwa 50°C erhitzt. Die Mischung wird dann mit 499 g Wasser von etwa gleicher Temperatur in kleinen Anteilen versetzt. Die Creme wird bis zum Erkalten gerührt, wobei verdampfte Wasseranteile ergänzt werden. Die Creme weist einen Gehalt an 0,1% Glucosid auf.

In entsprechender Weise können andere Spiroketaline, insbesondere die Verbindungen des Diosgenin, Hecogenin und Tigogenin in Cremes, Salben und Lotions eingearbeitet werden, die darüber hinaus auch andere pharmazeutisch aktive, unbedenkliche, gegebenenfalls auch alternativ wirkende Substanzen enthalten können.

Beispiel 3 Herstellung einer Lösung mit einem Gehalt an Diosgenin-β-D-glucosid

4 l einer Lösung von Polyvinylpyrrolidon (PVP) in destilliertem Wasser wurde bei einer Temperatur von 65°C mit einer siedenden Lösung von 600 mg Diosgenin-glucosid in 6 l Aethanol gemischt. Die auf ±22°C abgekühlte 60% aethanolische Lösung wurde auf 250 ml Flaschen abgefüllt und mit der Angabe für die Patienten versehen, daß Dosen von einem halben Teelöffel voll (d. h. also 3×2,5 ml täglich) einzunehmen sind. Die Mischung ergab 40 250-ml-Flaschen, die jeweils ungefähr 100×2,5 ml Dosen enthielt, also ausreichend für eine Behandlungszeit von 33 Tagen.

Die Dosis von einem halben Teelöffel enthält etwa 0,15 mg Spiroketaline, 2,5 mg PVP und 1,5 g Aethanol in dem Gesamt volumen von 2,5 ml.

Um das Problem von instabilen Lösungen zu umgehen, ist es empfehlenswert, nicht die Konzentration von 7,5 mg Spiro ketalinen und 100 mg PVP je 100 ml der Lösung zu überschreiten, d. h., daß in einer 2,5 ml Dosis nicht mehr als 0,1875 mg Spiro ketaline enthalten sein werden.

Nach dem obenbeschriebenen Verfahren können auch andere Spiro ketaline in Lösung gebracht werden. Wegen der geringen Löslich keit dieser Verbindungen sollten die Lösungen aber nicht einer niedrigen Temperatur ausgesetzt werden, um die Möglichkeit von Ausfällen oder Flockung zu unterbinden.

Beispiel 4 Toxizitätsprüfungen

a) Einzeln untergebrachte Gruppen von je 10 männlichen Sprague- Dawley Ratten wurden oral mit Einzeldosen von Hecogenin-3-β- D-glucosid oder Diosgenin-3-β-D-glucosid behandelt. Aus Gründen der Homogenität wurden die schlecht wasserlöslichen Verbindungen in eine wäßrige Cellulosederivatsuspension (Tylose®) eingearbeitet.
Unmittelbar vor der Anwendung wurden solche Konzentrationen hergestellt, die die Zuführung der relevanten Dosis mit etwa 1,0 ml/100 g Körpergewicht erlaubten. Dosen zwischen 125 mg/kg bis 1250 mg/kg der Verbindungen wurden untersucht. Die Beobachtungszeit betrug 14 Tage, nach der die Tiere ge tötet und eine makroskopische Untersuchung der Gewebe durch geführt wurde. Den Tieren wurde Futter und Wasser ad libitum angeboten.
Keines der Tiere aus den Gruppen starb während der festge legten Beobachtungszeit. Bei den Gruppen, welche die höchsten Dosierungen, d. h. also 1250 mg/kg erhielten, wurde während der ersten 72 Stunden eine leichte Abnahme des Körpergewichtes festgestellt. Nach Beendigung der Versuche zeigten aber alle Gruppen ein ähnliches Körpergewicht. Auch die Nahrungsaufnahme war in der Gruppe mit der höchsten Dosierung während der ersten 2 Tage etwas niedriger, aller dings konnte keine Verringerung der Flüssigkeitsaufnahme festgestellt werden, im Gegenteil, es ergab sich sogar eine leichte, allerdings nicht signifikante Zunahme des täglichen Wasserverbrauchs.
In keiner der Gruppen konnten makroskopisch feststellbare Veränderungen beobachtet werden. Besondere Aufmerksamkeit wurde auf mögliche Läsionen im Gastrointestinaltrakt gerichtet, bei der Autopsie wurde aber kein Hinweis auf aktive oder ab heilende Geschwüre gefunden.
Es kann daher festgestellt werden, daß die beiden Testver bindungen, Hecogenin-3-β-D-glucosid und Diosgenin-3-β-D- glucosid von Sprague-Dawley Ratten bei oralen Einzeldosen von 125,0; 312,5; 625,0 und 1250 mg/kg Körpergewicht gut vertragen werden.
b) Das Standardlaborfutter wurde sorgfältig mit 0,1% Diosgenin- oder Hecogenin-glucosid gemischt und an Gruppen von 20 jungen männlichen Sprague-Dawley Ratten mit einem Durchschnitts gewicht von 150 g verfüttert. Während der 100tägigen Be obachtungszeit trat kein Todesfall auf. Die Wachstumskurven bei den behandelten Tieren waren ähnlich wie die in der Kontrollgruppe. 10 Ratten jeder Gruppe wurden getötet und einer Autopsie unterzogen. Die Organe und einige Körpergewebe wurden makroskopisch und mikroskopisch untersucht. In keinen Geweben konnten substanzbedingte pathologische Veränderungen festgestellt werden.

Beispiel 5

Nach bisheriger Kenntnis spielen Prostanoide, also die ver schiedenen Prostaglandine und einige nah verwandte Verbindungen und Vorläufer wie Arachidonsäure, Endoperoxide, Thromboxane, Prostacycline und ähnliche eine wichtige Rolle bei der Induktion oder Verhinderung von rheumatoider Arthritis. Die erfindungs gemäßen Verbindungen wurden daher mit Hilfe einer pharmakolo gischen Methode indirekt auf ihre möglichen prostanoidregu lierenden Eigenschaften untersucht.

Bei einem Vergleich der Arthritis nach experimentellem Rotlauf beispielsweise bei der Ratte mit der rheumatischen Arthritis des Menschen läßt sich eine weitgehende Übereinstimmung der einzelnen morphologischen Veränderung erkennen. Die Unter suchungen erfolgten nach den Angaben von Schulz et al. Beitr. Path. 154, 1-26, 27-51 (1975). Die rotlaufbedingte Arthritis bei Ratten läßt sich durch eine einmalige Injektion mit nahezu 100%iger Sicherheit reproduzieren. Bei der Rotlaufarthritis sind stets mehr als 6 Gelenke verändert, und zwar große und kleine Gliedmaßengelenke in gleicher Ausprägung. Beim experimentellen Rotlauf weisen sämtliche Tiere noch nach 3 Monaten hochgradig proliferative Prozesse auf.

Zur Prüfung der Substanzen werden aus der Manifestationsphase folgende Parameter zur Beurteilung der Präparatwirksamkeit herangezogen:

Pfotenvolumgen

Die Arthritis der Ratte ist klinisch bei Tieren mit 150 g Körpergewicht schon ab dem 3. Tag bei etwa 200 g ab dem 5. Tag durch ein hochgradiges periartikuläres Oedem gekennzeichnet.

Niere (Eiweißausscheidung)

Durch Mikrothromben bedingte Nephrosen können bei ca. 30-40% der Tiere am 7.-8. Tag auftreten.

Auge

Entzündungen (Trübungen) der Cornea etwa am 8. Tag.

Äußere Geschlechtsorgane, Schwanzspitze

Durch Thromben bedingte Nekrosen ab 6.-8. Tag.

Aorta

Zwischen dem 6. und 11. Tag treten bei der Ratte fibrinreiche Thromben auf der Aortenintima auf. Die größte flächenhafte Ausdehnung wird etwa am 8. Tag erreicht.

Für die Untersuchung wurden männliche Wistarratten mit Gewichten zwischen 150 bis 180 g verwendet. Die Tiere wurden in Einzel käfigen gehalten und erhielten eine Rattenstandarddiät (Ssniff R) und Wasser ad libitum.

Die Raumtemperatur betrug konstant 22°C, die relative Luft feuchtigkeit zwischen 50 und 60%. Die tägliche Beleuchtungs dauer betrug 12 Stunden. Vor Testbeginn hatten die Tiere eine Akklimatisationszeit von 10 Tagen.

Die Infektion erfolgte mit dem Rotlaufstamm T 28. Die Dosierung betrug 2 ml subkutan (ca. 100-200 Millionen Keime). Die hier zu prüfenden Verbindungen wurden in steriler physiologischer Kochsalzlösung suspensiert und in einer Dosierung von 5 mg/kg i. p. appliziert. Die Behandlung lief vom Infektionstag ab bis zum Versuchsende oder dem Tod der Tiere, 5× pro Woche.

Bei diesen Untersuchungen wurden einige unerwartete Wirkungen festgestellt. Die wichtigsten Ergebnisse sind in den nach folgenden Tabellen enthalten.

Die Parameter für die Aortathromben werden nach den Angaben von Schulz et al., Beitrag. Path. 154, 1-26 und 27-51, 1975 ausgewertet.

Schlüssel für die Bewertung von Aortathromben

0 = keine Änderung
1 = geringfügige Veränderungen
2 = leichte bis mittlere Veränderungen
3 = mittlere bis schwere Veränderungen
4 = schwere Veränderungen

Aortathromben

Cornealäsionen

Sowohl im Schweregrad wie auch im prozentualen Anteil der von Aortathromben und Cornealäsionen befallenen Tiere läßt sich eine deutliche Verringerung feststellen und kann aus den Tabellen entnommen werden.

Beispiel 6 Nachweis der Wirksamkeit als Prostaglandinsynthetaseninhibitor

Die Wirksamkeit der Verbindungen als Prostaglandinsynthetasen inhibitor wurde nach dem Verfahren von A.L. Willis nachgewiesen. Entsprechende Versuchsbedingungen sind beispielsweise in Proceedings of a Workshop Held during the VIII th European Rheumatology Congress Helsinki 1975 beschrieben.

Silikonisierte Kuvetten des Aggregometers werden bei einer Temperatur von 37°C als Inkubationsgefäß benutzt, in dem eine Arachidonatlösung schnell mit einem Prostaglandin synthetaseenzymsystem, meist aus Schafsblase hergestellt, zugegeben und verrührt wird. Zu dieser Lösung in der Kuvette wird dann mit Antikoagulantien behandeltes blutplättchenreiches Plasma zugeführt, das ebenfalls auf 37°C erwärmt wurde. Die Lichttransmission durch die Kuvette wird sofort nach Zugabe aufgezeichnet. In der Kontrollprobe zeigt sich nach 45 Sekunden Inkubationszeit ein deutlicher Peak in der Plättchenaggregation, der die Bildung von Prostaglandinen PGE₂ und PGF_2α und die da durch bedingte Plättchenaggregation anzeigt.

In den Untersuchungsproben mit einem Gehalt an 0,00001% Spiro ketalsteroidglucoside trat keine Plättchenaggregation ein. Dies zeigt deutlich, daß die Bildung von PGE₂ über Endoperoxydver bindungen aus dem Arachidonat unterbunden war.

Claims

1. Entzündungshemmende Arzneimittel, gekennzeichnet durch einen Gehalt an Spiroketalsteroidmonosacchariden der allgemeinen Formel in der R₁ und R₂ entweder eine Doppelbindung oder R₁ ein α-Wasserstoffatom und R₂ ein Wasserstoffatom bedeuten und Z ein Monosaccharid und R entweder zwei Wasserstoffatome oder eine Ketogruppe bedeuten.

2. Arzneimittel nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß es Diosgenin-, Hecogenin- und/oder Tigogenin β-D-glucosid enthält.

3. Arzneimittel nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß es in der Dosierungseinheit etwa 0,3 bis 0,75 mg Wirk stoffe enthält.

4. Hecogenin β-D-glucosid.