DE2130113C3

DE2130113C3 - Gentamicin B, Gentamicin B1 und Gentamicin X, Verfahren zu deren Gewinnung und diese Gentamicine enthaltende pharmazeutische Zubereitungen

Info

Publication number: DE2130113C3
Application number: DE2130113A
Authority: DE
Inventors: David J. Bloomfield Cooper; Mae New York N.Y. Counelis; Jay Allan Fairfield Waitz; Jay West New York N.J. Weinstein
Original assignee: Scherico Ltd
Current assignee: MSD International Holdings GmbH
Priority date: 1970-06-22
Filing date: 1971-06-18
Publication date: 1980-07-03
Also published as: DE2130113A1; FR2104762A1; AT322742B; US3915955A; CY913A; GB1355260A; DK499474A; IL37105A0; US4110439A; AT321458B; MY7700325A; KE2748A; ZA714013B; DE2130113B2; US4049796A; NL7108580A; DK129044B; JPS551798B1; US4389398A; BE768796A

Description

OH	H	NHj
OH	CH,	NHj
NF,	H	OH

und deren pharmazeutisch anr-bmbare Säureadditionssalze, Hydrate und Solvate.

2. Äthanolsolvate der Verbindungen gemäß Anspruch 1.

3. Verfahren zur Gewinnung von Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X gemäß Anspruch 1 aus einem auf mikrobiologischem Wege erhaltenem Gemisch von Gentamicinen durch Adsorption an und Desorption von einem schwach sauren Kativnenaustauscher und anschließende Abtrennung einer Teilmenge von Gentamicin C, dadurch gekennzeichnet, daß man das so erhaltene Gentamicin-Gemisch in der unteren Phase eines Lösungsmittelsystems, das aus Methanol, Chloroform und konzentriertem wässerigen Ammoniak im Volumenverhältnis 1:1:1 besteht, löst, die Lösung an Silikagel chromatographiert, das Silikagel mit diesem Lösungsmittelsystem eluiert und die Gentamicine B, Bi und X aus den jeweiligen Fraktionen gewinnt.

4. Pharmazeutische Zubereitungen, enthaltend eine Verbindung gemäß Anspruch 1 zusammen mit üblichen Hilfs- und Trägerstoffen.

Gewinnung und diese Verbindungen enthaltende pharmazeutische Zubereitungen.

Die Antibiotika können durch den für die Herstellung von Gentamycin bekannten Fermentationsprozeß erhalten werden. Die Herstellung, Isolierung und Reinigung von Gentamycin wird in der US-PS 30 91 572 beschrieben. Gentamycin, nun als Gentamicin bekannt, ist in dieser US-PS als Hauptkomponente beschrieben und wird darin als C-Komponente oder Gentamicin C

IQ bezeichnet. In der Patentschrift werden auch die neben Gentamicin C hergestellten Antibiotika BA-3 (Fraktion A) und BA-3 (Fraktion B) erwähnt, die als Gemisch einen niedrigen Grad von antibakterieller Aktivität zeigen und von Gentamicin C getrennt worden sind.

is Durch die Verwendung von speziellen chromatographischen Systemen, die später beschrieben werden, wurde festgestellt, daß die Substanzen, die in der US-PS 30 91 572 als Antibiotikum BA-3 (Fraktion A) und BA-3 (Fraktion B) bezeichnet wurden, kein einheitliches

μ Material darstellen, sondern zusammen aus einer Mischung von wenigstens 4 Komponenten bestehen. Es wurde gefunden, daß jede der Komponenten überraschende und unerwartete Anwendungsmöglichkeiten bietet

Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X sind zuvor nie voneinander getrennt worden. Es konnte festgestellt werden, daß diese Substanzen wertvolle Eigenschaften als Antibiotika aufweisen, aber auch als Antheiminthika und als Mittel gegen Protozoen sind.

μ Die Antibiotika Gentamicin B₁ Gentamicin Bi und Gentamicin X zeigen merklich reduzierte Nebeneffekte. Daher ist es vorteilhaft. Gentamicin B und Gentamicin Bi für langer dauernde Behandlungen von bakteriellen Infektionen einzusetzen. In der Behandlung von

r> Helminthiasis, die durch bakterielle Infektionen oder das Auftreten von Protozoen erschwert ist, kann die Anwendung der Antibiotika Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X ebenfalls sehr nützlich sein.

Die Antibiotika Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X sind einander struic:.urell ähnlich, wie durch Formel (I) gezeigt wird, die die planare Struktur der Verbindungen zeigt:

HO j
H₁CNH

OH

HO

R²C HR'

NH₂
/

NH₂

HO

O /

HO

R¹

Die Erfindung betrifft neue Aminoglykosidantibiotika, genannt Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X, deren pharmazeutisch annehmbare Säüreadditionssalze, Hydrale und Solvate, ein Verfahren zu ihrer

Gentamicin B	OH	H	NH₂
Gentamicin B\|	OH	CH₃	NH₂
Gentamicin X	NH₂	H	OH

Nach den neuesten Erkenntnissen der Forschung kann nunmehr mit an Sicherheit grenzender Wahrscheinlichkeit die Stereochemie der erfindungsgemäBen Verbindungen angegeben werden. Die Formet, umfassend die Stereoisomeren, ist wie folgt;

NH₂

H,C

Die Verbindungen dieser Erfindung bilden leicht Hydrate und Solvate, die sehr schwer zu brechen sind. Daher basieren die physikalischen Konstanten von Gentamicin B und Gentamicin Bi auf den verhältnismäßig stabilen Hydraten oder Solvaten. Ferner muß berücksichtigt werden, daß, obwohl Gentamicin Bi kristalline Solvate mit Äthanol bilden, diese keine reproduzierbaren Schmelzpunkte zeigen, sondern erweichen und gelegentlich viskose Flüssigkeiten über einen ziemlich breiten Temperaturbereich bilden.

Gentamicin X wurde bisher noch nicht in kristalliner Form erhalten. Es wird in Form einer weißen amorphen festen Substanz isoliert, die ebenfalls keinen bestimmten Schmelzpunkt aufweist.

Die folgende Tabelle I enthält die physikalischen

Eigenschaften der hierin beschriebenen Antibiotika: (Alle Werte für Sauerstoff wurde»i als Differenz ermittelt.)

Tabelle 1

Physikalische Konstanten

Verbindung

Elementaranalyse

berechneter Analysen-Wert*) wert

Sulfat

Analysenwert

Gentamicin B	C = 47,70	C	= 47,78	+ 155°	C
berechnet fur	H = 8,41	H	= 8,38	(C = 0,3/H₂O)	H
Ci₈H₃₈N₄O₁₀-C₂H₅OH	N = 10,60	N	- 10,59		N
	O = 33,29	0	= 33,25		S
Gentamicin B,	C = 47,22	C	= 48,58	+ 161°	C
berechnet für	H = 8,34	H	= 8,56	(C = 0,3/H₂O)	H
C₂₁₁H_4nN₄O₁₀-C₂H₅OH	N = 10,41	N	= 10,52		N
	O = 34,03	O	= 32,44		S
Gentamicin X		C	= 43,54	+ 154°	C
C₁₉H₁₈N₄O₁₀		H	= 7,22	(C = 0,3/H₂O)	H
		N	= 9,90		N
		O	= 39,34		S

30,35 6,59 7,49 8,48

31,26 6,83 7,34 8,72

31,96 6,57 8,64 8,70

+ 116°

(C = 0,3/H₂O)

+ 117°

(C = 0,3/H₂O)

+ 121°

(= 0,3/H₂O)

Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X haben charakteristische Infrarotabsorptionsspektren in Mineralöl (Nujol), entsprechend den F i g 1 (Gentamicin B), 3 (Gentamicin B,) und 5 (Gentamicin X). Diese Spektren wurden mit dun entsprechenden Solvaten der Antibiotika aufgenommen.

Diese Antibiotika haben auch charakteristische magnetische Kernresonanzspektren (NMR-Spektren), die in F i g. 2 (Gentamicin B), F i g. 4 (Gentamicin Bi) und Fig.6 (Gentamicin X) gezeigt werden. Alle NMR-Spektren wurden mit den freien Antibiotikabasen aufgenommen. Die Proben von Gentamicin X lagen jedoch in der hydratisierten Form vor und die von Gentamicin B und Gentamicin Bi in der Form von Äthanolsolvaten. Diese Spektren wurden mit einem Varian A-60-A Spektrometer mit ungefähr 0,4 ml einer Lösung, deren Konzentration ungefähr 20 mg/ml des Antiobitikums im Deuteriumoxid (D2O) betrugj aufgenommen. Die Spektren sind in ppm bezogen auf das Natriumsalz von 3-(Trimethylsilyl)-propansulfonsäure als internem Standard aufgezeichnet worden.

In der folgenden Tabelle U werden die charakteristischen Absorptionsbanden der F i g. 1,3 und 5 aufgeführt

Tabelle II	(M-S.br)
	(Nujol)
Charakteristische Infrarotabsorptionsbanden	(Nujol)
Bezeichnungen:	(schw.br)
M = mittei;S = stark; S = SeHr;	(M)
schw = sch wach; br = breit;	(M)
su = SchuIter	(Nujol)
Sulfat von Gentamicin B	(Nujol)
2,95-3,25 μ	(schw)
3,40 μ	/C » U~\
3,51 μ	(schw - M)
4,85 μ	(s schw, br)
6,16μ	(schw, br)
6,55 μ
6.83 μ	' (M-S, br)
7.26 μ	(Nujol)
7,75 μ	(Nujol)
ο ic η 7C ..	(schw, br)
1θ!28μ	(M)
12,95 μ	(M)
13,90 μ	(Nujol)
Sulfat von Gentamicin Bi	(Nujol)
2,95-3,25 μ	(schw)
3,38 μ	(S, s br)
3,50 μ	(schw — M)
4,85 μ	(schw)
6,16 μ	(s — schw,
6,55 μ	br)
6,83 μ	(schw, br)
7,25 μ
7,75 μ	rs.bri
8.75-9,75 μ	(Nujol)
10,27 μ	(M. br)
10,75 μ	(schw, br)
13,05 μ	(schw, su)
	(M)
13,90 μ	(M)
Sulfat von Gentamicin X	(Nujol)
3.0-33 a	(Nujol)
337-331 μ	(schw — M)
3,65-4,33 u	(s-S, br)
4,82 μ	(br.su)
5,94 μ	(schw, br)
6,17 μ	(s — schw, br)
6,54 μ	(Nujol)
6.83 μ	(s — schw)
7,25 μ
7,75 μ
8,7-10,0 μ
1030 μ
11,50 μ
13,03 μ
13,90 μ
15,08 μ

Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X enthalten Aminogruppen oder substituierte Aminogruppen, die fähig sind, Säureadditionssalze mit organischen oder anorganischen Säuren zu bilden. Wenn solche Salze von mehrbasigen Säuren abgeleitet sind, können diese freie Säuregruppen und/oder Säuregruppen, die mit anderen Basen neutralisiert sind, wie beispielsweise mit Alkalibasen, enthalten. (Der Ausdruck nichttoxische Salze, der in dieser Beschreibung verwendet wird, bezeichnet Salze, die keinen nachteiligen Nebeneffekl verursachen, wenn sie in üblicher Dosis angewendet werden.) im allgemeinen können Salze mil anorganischen Säuren gebildet werden, indem man verdünnte Säure (1,0N) zu eitler wässerigen Lösung des freien Antibiotikunis gibt, den pH-Wert der Lösung auf ungefähr 4,5 einstellt und die so erhaltene Lösung gefriergetrocknet. Dementsprechend können Säureadditionssalze mit Salzsäure, Schwefelsäure, Phosphorsäure usw. gebildet werden, sowie die entsprechenden Alkalisalze von 2wei- und dreibasigen Säuren. Im allgemeinen sind die Salze von anorganischen Säuren wassserlöslich, aber im wesentlichen unlöslich in organischen Lösungsmitteln. Jedoch können solche Salze, wie beispielsweise Hydrochloride, eine sehr beschränkte Löslichkeit in polaren organischen Lösungsmitteln, wie beispielsweise in niedrigen Alkoholen, haben. Salze von organischen Säuren, wie

basige Säuren, wie beispielsweise Bernsteinsäure, Weinsäure, Maleinsäure, Fumarsäure, Glutarsäure usw, werden im allgemeinen hergestellt, indem man eine wässerige Lösung des Antibiotikums mit der stöchiometrischen Menge der Säure umsetzt und die so erhaltene Lösung entweder gefriergetrocknet oder das Produkt ausfällt. Das Ausfällen kann erreicht werden, indem man ein mischbares organisches Lösungsmittel, wie beispielsv -Mse Aceton, Dioxan, Tetrahydrofuran, Methanol oder ähnliches zusetzt. Auch Solvate von Säureadditionssalzen der Antibiotika können hergestellt werden.

Das Verfahren zur Gewinnung der Verbindungen erfolgt aus einem auf mikrobiologischem Wege erhaltenen Gemisch von Gentamicinen. Es umfaßt die Abtrennung einer Teilmenge von Gentamicin C nach Adsorption an und Desorption von einem schwach sauren Kationenaustauscher und ist dadurch gekennzeichnet, daß man das so erhaltene Gentamicin-Gemisch in der unteren Phase eines Lösungsmittelsystems, das aus Methanol, Chloroform und konzentriertem wässerigen Ammoniak im Volumenverhältnis 1:1:1 besteht, löst, die Lösung an Silikagel Chromatographien, das Silikagel mit diesem Lösungsmittelsystem eluiert und die Gentamicine B, Bi und X aus den jeweiligen Fraktionen gewinnt.

Ein Gemisch, das Gentamicin B, Gentamicin Bi, Gentamicin X, Gentamicin A und Gentamicin C enthält, wird durch das Bebrüten von Micromonospora purpurea und Micromonospora echinospora erhalten, wie es in der US-PS 30 91 572 beschrieben wird. Das so erhaltene Gemisch wird vorzugsweise einer Trennung durch Säulenchromatographie unterworfen, woLd man die untere Phase eines Lösungsmittelsystems, das aus Methanol, Chloroform und Ammoniumhydroxid besteht, als Eluierungsmittel verwendet. Vor dem Chromatographieren mischt man gleiche Teile der genannten Lösungsmittel, läßt absetzen und trennt die Schichten. Gentamicin C, das aus 3 Komponenten, nämlich Ci, Ci₂ und C2 besteht wird zuerst eluiert worauf Gentamicin Bi, Gentamicin X, Gentamicin B und zuletzt Gentamicin A folgen.

Das Trennungsverfahren des Gemisches wird im folgenden genauer beschrieben:

Am Ende der Bebrütung werden die Antibiotika aus der Fermentationsbrühe extrahiert wobei man den ganzen Antibiotikakomplex aus der Fermentationsbrühe auf einem Kationenaustauscherharz adsorbiert vorzugsweise auf einem schwach sauren mit Carboxylgruppen (Methacrylsäure-Divinylbenzol-Copolymeri-

sat); Das Harz wird vorzugsweise in der Ammonium-Form verwendet, Und das rohe Antibiotikumgemisch wird mit verdünntem Ammoniumhydroxid eluiert. Das Eluat wird entfärbt, indem man es durch eine Säule leitet, die Aktivkohle oder vorzugsweise ein Anionenaustauschharz, insbesondere ein Harz des oben erwähnten Typs, enthält. Für das Entfärben des Eluats von obigem Harz wird vorzugsweise ein stärk basischer Anionenaustauscher in der OH-Form verwendet. Nach dem Entfärben wird das Eluat im Vakuum auf eine Lösung, die ungefähr 30 bis 60% Festkörper enthält, konzentriert, und für die Weiterbehandlung bereitgehalten. Zu diesem Zeitpunkt enthält die Lösung alle Antibiotika wie sie durch die Fermentation erzeugt worden sind im wesentlichen in dem Verhältnis, das dabei anfällt. Gentamicin C-Komponenten stellen ungefähr 60 bis 80% des Gemisches dar und die neben Gentamicin C erzeugten Antibiotika den Rest. Daher ist es vorteilhaft, wenigstens einen Teil des Gentamicin C abzuscheiden, um die neben Gentamicin C erzeugten Antibiotika zu erhalten. Es gibt eine beachtliche Zahl von Harzen, die dafür geeignet sind. Beispiele für solche Harze sind Anionenaustauschharze. wie beispielsweise Amberlit® IRA-400, Amberlit® IRA-401, Dowex® 1-X2 und Dowex"¹ 2-X4. Im allgemeinen sind poröse, stark basische Harze des quaternären Amintyps zweckmäßig. Es wird Dowex® 1-X2 in der OH-Form bevorzugt.

Die Komponenten von Gentamicin C werden davon unter Verwendung von deionisiertem Wasser, das einen ungefähren Widerstand von 50 000 bis ungefähr 150 000 Ohm aufweist, selektiv desorbiert. Die Säule kann vorzugsweise in Serie geschaltet sein und durch eine Leitfähigkeitsbrücke mit einem automatischen Fraktionssammler verbunden sein, so daß ein scharfer Anstieg der Leitfähigkeit im ausfließenden Lösungsmittel den Fraktionensammler auslöst. Ähnlich wird ein Abfallen der Leitfähigkeit (Ansteigen des Widerstandes) gefolgt von einem scharfen Anstieg der Leitfähigkeit das Sammeln einer neuen Fraktion veranlassen. Die Sorgfalt, mit der diese Säule betrieben wird, regelt zu einem wesentlichen Grad die Menge von Gentamicin C. die in dem Gemisch der neben Gentamicin C erzeugten Aniibiuiika zurückbleibt, und becinfiuBt ^u einem gewissen Grad die Wirksamkeit der folgenden Säule, die zum Auftrennen der übrigen Antibiotika verwendet wird.

Die neben Gentamicin C erzeugten Antibiotika werden von der Dowex® 1-X2 Säule eluiert, nach dem die Gentamicin C-Komponenten entfernt worden sind. Das wässerige Eluat wird im Vakuum auf ein geeignetes Volumen eingeengt und gefriergetrocknet In dieser Stufe ist es vorteilhaft, das Antibiotikagemisch in heißem Methanol zu lösen und abzukühlen, wobei die Lösung gleichzeitig der Luft ausgesetzt wird. Gentamicin A adsorbiert Kohlendioxid aus der Luft, wobei es ein schwer lösliches Karbonat bildet, das aus der Methanollösung auskristallisiert, durch Filtrieren davon abgetrennt und anschließend im Vakuum getrocknet wird. Man konzentriert das Filtrat zu einem Rückstand und löst diesen in ungefähr 3 Volumteilen der unleren Phase eines Lösungsmittelgemisches bestehend aus Methanol zu Chloroform zu Ammoniumhydroxid im Volumverhältnis 1:1:1, auf. Die so erhaltene Lösung bringt man auf eine entsprechend dimensionierte Säule aus vorzugsweise Silikagel auf und eluiert die Säule mit dem oben genannten Lösungsmittelgemisch, wobei man die Durchflußmenge kontrolliert. Gentamicin B und Gentamicin Bi können in kristalliner Form erhalten werden.

indem man die Rückstände der entsprechenden Fraktionen in Äthanol löst, die Lösung im Vakuum zu einem Rückstand einengt, diesen wieder in Äthanol auslöst, die Lösung wieder zu einer kristallinen Suspension einengt. Dieses Vorgehen ergibt im wesentlichen reines Gentamicin B und Gentamicin Bi in Form von Äthanolsolvaten, die ungefähr ein Mol Äthanol pro Mol Antibiotikum enthalten. Gentamicin X wird im allgemeinen als amorphes Produkt erhalten und

ίο verhält sich in dieser Beziehung wie die Gentamicin ^Komponenten.

Eine andere Möglichkeit besteht darin, das gesamte Antibiotikagemisch, das auch die Gentamicin C-Komponenten enthält, der Silikagelchromatographie zu unterwerfen. Aber die so erzielte Trennung ist nicht so scharf wie die Trennung, bei der die Hauptmenge des Gentamicin C und des Gentamicin A abgetrennt werden, bevor die Silikagelchromatographie durchgeführt wird.

Beispiel 1

A. Isolierung von Geniamicin C und den neben

Gentamicin C erzeugten Antibiotika aus der

Fermentationsbrühe

Man stellt den pH-Wert der Fermentationsbrühe, die entsprechend dem Verfahren der US-PS 30 91572 erhalten worden ist, mit 6 N Schwefelsäure auf 2,0 ein. Man rührt die Mischung während etwa 30 Minuten, filtriert durch ein entsprechend dimensioniertes Filter, das vorher mit einer etwa 2,5 cm dicken Schicht einer Filterhilfe beschichtet worden ist. Man stellt den pH-Wert des Filtrates mit 6N Ammoniumhydroxid auf ungefähr 7 ein und fügt Oxalsäure zu, bis ein pH-Wert von 4 erreicht ist. Diese Menge von Oxalsäure ist meist ausreichend, um die Kalziumionen in der Fermentationsbrühe als unlösliches Kalziumoxalat auszufällen. Man stellt den pH-Wert mit 6N Ammoniumhydroxid auf ungefähr 7 ein und rührt die Mischung während ungefähr 1 bis 4 Stunden bei einer Temperatur von 20 bis 35°C. Man filtriert die Mischung unter Verwendung eines entsprechend dimensionierten und beschichteten Filters und bewahrt das Fiiirai. rvian adsorbiert das Antibiotikagemisch an einem schwach sauren Kationenaustauscher mit Carboxylgruppen (Methacrylsäure-DivinylbenzoI-Copolymerisat) (Ammonium-Form), indem man ungefähr 10 g Harz pro Liter des ursprünglichen Brühenvolumens einsetzt. Man wäscht das Harz mit deionisiertem Wasser farbfrei und eluiert die Antibiotika mit 2 N Ammoniumhydroxyd und konzentriert das Eluat im Vakuum zu einer Lösung, die ungefähr 50% Festkörper enthält.

B. Abtrennung der Gentamicin C-Komponenten von

Gentamicin A, Gentamicin B, Gentamicin Bi und

Gentamicin X

Man bringt 1,3 m³ Dowex® 1-X2 Harz (OH-Form) in eine Chromatographiesäule ein, die 91 cm Durchmesser und wenigstens 244 cm Höhe aufweist und durch eine Leitfähigkeitsbrücke mit einem Fraktionsammler verbunden ist. Man pumpt deionisiertes Wasser durch das Harzbett, bis das ausfließende Wasser einen Widerstand von wenigstens 65 000 Ohm hat Man bringt eine wässerige Lösung von ungefähr 1201, die ungefähr 60 kg Festkörper der Verfahrensstufe A enthält, auf die Säule auf und adsorbiert das Antibiotikagemisch, wobei man dieses in einer Geschwindigkeit von ungefähr 2 Liter pro Minute durch die Säule leitet. Man entwickelt

ίο

die Säule mit deionisiertem Wasser bei einer Geschwindigkeit von ungefähr 2 Liter pro Minute und sammelt die Fraktionen entsprechend der Leitfähigkeit der Eluate. im allgemeinen werden 7 Fraktionen gesammelt, die zwischen ungefähr 14 und 750 Liter aufweisen. Die ersten 5 Fraktionen umfassen ungefähr 5001 und enthalten die Hauptmenge der Gentamicin C-Komponenten. Die verbleibenden 2 Fraktionen betragen Ungefähr 1500 bis 1600 I und enthalten die Hauptmenge von Gentamicin A, Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X. Die zuletzt genannten zwei Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum auf ein kleines Volumen eingeengt und entweder gefriergetrocknet oder durch Versprühen getrocknet

C Isolierung von Gentamicin A

Man löst 19,8 kg des Fermentationsproduktes, von dem der Hauptteil des Gentamicin C (Schritt B) entfernt worden ist. in 45 I heißem Methanol. Man klärt die Lösung durch Filtrieren, kühlt sie auf Raumtemperatur, wobei man sie der Luft aussetzt, und impft mit Gentamicin A. Gentamicin A kristallisiert in Form von farblosem Karbonat, das man abfiltriert, etwas mit Methanol wäscht und bei 80°C im Vakuum trocknet, wobei man 1119 g des Produktes dieses Beispiels erhält.

Die Mutterlauge und die Waschlösungen vereinigt man, engt sie im Vakuum auf einen Rückstand ein und chromatographiert wie in Schritt D beschrieben wird.

D. Chromatographische Trennung von
Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X

Man füllt zwei in Serie miteinander verbundene Chromatographiesäulen von einer Größe von 152 cm χ 10 cm mit Silikagel. das vorher durch Kontakt mit der unteren Phase einer Mischung von Chloroform, Methanol und konzentriertem Ammoniumhydroxid in einem Verhältnis von 1:1:1 vorbereitet worden ist. Man stellt eine Lösung von 750 g des Rückstandes von Stufe C in einem möglichst kleinen Volumen her, etwa in 2 Litern der unteren Phase des oben genannten Lösungsmittelgemisches Man bringt die Antibiotikalösung auf die erste Säule auf und eluiert die Säule mit einer Geschwindigkeit von etwa 3 bis etwa 4,5 I pro Stunde, wobei man die Fraktionen von je ungefähr 2 Litern sammelt. Man überwacht die ausfließende Flüssigkeit durch Dünnschichtchromatographie auf Silikagelplatien, wobei man dasselbe Lösungsmittelsystem verwendet, das auf der Säule verwendet wird. Man vereinigt die Fraktionen, die gleiche Antibiotika enthalten, und dampft sie zu einem Rückstand ein. Wenn die Menge von Gentamicin B, das eluiert wird, abnimmt oder verschwindet, eluiert man die Säule vollständig mit ,einer Mischung, die aus gleichen Volumenteilen Methanol und konzentriertem Ammoniumhydroxid besteht. Die Fraktionen, die Gentamicin B und Gentamicin Bi enthalten, löst man in Äthanol auf und konzentriert die Lösung zu einem Rückstand. Die Wiederholung des vorherigen Schrittes führt zu einer kristallinen Suspension von Äthanolsolvat von Gentamicin B und Gentamicin Bi- Wenn man die vorher beschriebene chromatographische Trennung durchführt, erhält man Produkte in einer Menge und in einer Reihenfolge wie folgt:

Gentamicin C Ϊ
Gentamicin Bi j
•Gentamicin Bi

67.8 g
12,3 g

74.9 g
85,8 g

165,0 g

[<x]F 153.8°

r 132°

Gentamicin BiI
Gentamicin X I
Gentamicin X
. Gentamicin Xl
Gentamicin B f
Gentamicin B
Gentamicin B1
Gentamicin Al

Die Fraktionen, die Gemische der Antibiotika enthalten, können neuerlich chromatographiert werden, um die Ausbeute der einzelnen Fraktionen zu erhöhen.

Γ j B e i s ρ i e I 2

Herstellung des Sulfates von Gentamicin B

Man löst 5,0 g Gentamicin B in 25 ml Wasser und stellt den pH-Wert der Lösung mit 1 N Schewefelsäure auf 4,5 ein. Man behandelt die Lösung und filtriert. Man gießt unter heftigem Bewegen das Filtrat in ungefähr 300 ml Methanol, setzt die Bewegung während etwa 10 bis 20 Minuten fort und filtriert. Man wäscht den Rückstand mit Methanol und trocknet bei ungefähr 60" C im Vakuum, um das Produkt dieses Beispiels zu erhalten.

Beispiel 3

Herstellung des Hydrochlorids von
Gentamicin Bi

198,6 g
42,0 g

157°

Man löst 5,0 g Bi in 1000 ml Wasser. Man bereitet eine Säule vor, die 500 g eines schwach basischen Ionenaustauschharz im Chloridzyklus, vorzugsweise IR-45 (Handelsmarke von Rohm und Haas, Philadelphia), enthält. Man leitet die Antibiotikalösung durch die Säule, gefolgt von 500 ml Wasser. Man konzentriert die ausfließende Flüssigkeit im Vakuum auf ungefähr 100 ml und gefriertrocknet das Produkt, wobei man das Produkt dieses Beispiels erhält.

Die vorliegende Erfindung betrifft auch pharmazeutische Zubereitungen zur Verabreichung bei bakteriellen Infektionen. Beispielsweise kann man einem Tier, das eine solche Infektion hat, eine therapeutisch wirksame Menge von wenigstens einem der Antibiotika Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X, deren nicht giftigen pharmazeutisch annehmbaren Säureadditionssalze, Soivate und Hydrate verabreichen.
Gentamicin X und zu einem geringeren Ausmaß Gentamicin B und Gentamicin Bi sind wirksam gegen Protozoen, wie Entamoeba histolytica, Histomonas meleagridis, Trichomonas foetus und Trichomonas vaginalis. Histomonas meleagridis ist ein Parasit, der Enterohepatitis bei Truthähnen verursacht, (»blackhead disease«).

Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X sind auch wirksam als anthelminthische Agentien gegen Madenwürmer, wie beispielsweise Syphazia obveata.
Es ist überraschend, daß Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X Wirkung gegen Protozoen aufweisen. Es ist berichtet worden, daß Gentamicin C, das den vorhergenannten Antibiotika strukturell ähnlich ist, nur schwache Aktivität gegen T. vaginalis bei verhältnismäßig hohen Doesen zeigt. Es ist ferner von Albach et al in American Journal of Tropical Medicine und Hygiene, 15, 885 (1965) berichtet worden, daß Gentamicin C verhältnismäßig unwirksam gegen E. histolytica ist

Im Hinbück auf diese Eigenschaften können Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X in vitro in Waschiösungen für sanitäre Zwecke verwendet werden, wie beispielsweise für das Reinigen von Laborgeräten, die mit Protozoen der oben genannten Art infiziärt sind.

Diese Verbindungen sind besonders zweckmäßig bei intestinalen Erkrankungen, da sie nicht nennenswert vom Gastrointestinaltrakt absorbiert werden. So kann eine beachtliche Konzentration des therapeutischen Mittels eingenommen werden, ohne toxische Erscheinungen im Patienten zu verursachen und gleichzeitig kann das Mittel in Mengen vorliegen, die ausreichen, den infizierenden Organismus zu zerstören oder wenigstens wesentlich einzudämmen. Um allgemeine bakterielle Infektionen des Systems zu bekämpfen,

Tabelle III
MIC ^g/ml)

erfolgt die Verabreichung des Antibiotikums vorzugsweise mittels Injectionen.

Antibiotische Aktivität — in vitro

In der folgenden Tabelle III ist die minimale Inhibitionskonzentration (MlC) von Gentamicin B, Gentamicin Bi Und Gentamicin X in Vergleich mit der MIC des bekannten Antibiotikums Kanamycin gegei'

ίο eine Vielzahl von grampositiven und gramnegativen Mikroorganismen zusammengestellt. Die Antibiotika wurden in der Form der freien Base eingesetzt. Die Untersuchungen wurden in einem Medium bestehend aus Hefe-Rindfleischbrühe mit einem pH-Wert Von 7,4

is ausgeführt.

Organismus

Gentamicin B

Gentamicin Bι

Gentamicin X

Kanamycin

Aerobacter 1
aerogenes J
Bacillus I
tubtilis I
Escherichia coli

Klebsiclla 1
pneumoniaej

iPseudomonasl
aeruginosa I
Sarcina lutea

Staphylococcusl
aureus J

Streptococcus!
pyogenes j
Shigellasp M 324
Salmonella sp. 1
Salmonella sp.2
Salmonella sd. B

0,08

0,8	3,0	0,03	0,3
0,03-0,3	0,08-0,3	0,3	5
3,0	3,0	0,75	1
0,03-0,08	0,08	0,3-0,75	62,5
0,3	0,3	-	4
0,3-3,0	0,3-3,0	0,08-0,75	0,25
3,0	3,0	0,3-0,75	50
5,0	5,0
0,8	0,3	0,75
0,8	0,3	-
0.8	0.3

Antibiotische Aktivität — in vivo

45

Die Schutzaktivität von Gentamicin B, Gentamicin Bi und Gentamicin X wird ermittelt, indem man die betreffende Verbindung eine Stunde nach dem Verabreichen einer infizierenden Dosis des pathogenen Organismus subkutan verabreicht und die überlebenden Versuchstiere 48 Stunden nach der Infekti«., zählt. Infizierte, nicht behandelte Kontrolltiere sterben in ungefähr 18 bis 24 Stunden. Im allgemeinen werden den Mäusen 5 bis 7 verschiedene Dosen verabreicht. Die Mäuse wiegen 20 g und sind in Gruppen von 7 bis 10 Stück zusammengefaßt. Die PD50-Werte werden in der folgenden Tabelle IV zusammengefaßt:

Tabelle IV

Schutzaktivität von Gentamicin B, B, und X bei Mäusen

Microorganismus	PD₃₀ (mg/kg)	Gentamicin B\|	Gentamicin X
	Gentamicin B	30,0	4,0
Staphylococcus aureus Gray	20,0	50,0	-
Staphylococcus aureus W	50,0	2,5	—
Staphylococcus aureus	5,0
Smith		18,0	-
Streptococcus pyogenes C	15,0	4,0	-
Salmonella paratyphi B	5,0	2,0	7,0
Pseudomonas aeruginosa SC	2,0		1.5
Escherichia coli SC	—

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Akute Toxizität

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Die akute Toxizität von Gentamicin B, Gentamicin Bi dieser Untersuchung sind in der folgenden Tabelle V und Gentamicin X wird ein männlichen CF-I Mäusen, zusammengestellt:
die ungefähr je 20 g wiegen, ermittelt. Die Resultate 5

Tabelle V

Akute Toxizität von Gentamicin B, Gentamicin B, und Gentamicin X

Art der Verabreichung

LD₅₀ (mg/kg) Gentamicin B

Gentamicin B

Gentamicin X

Intravenös	228	230	225
Intraperitoneal	1750	1600	>1000
Subkutan	>1500	>1500
Oral	> 250	> 250

In vitro Aktivität gegen Trichomonas vaginalis

In der folgenden Tabelle VI ist die in vitro Aktivität wesentlichen durchgeführt, wie es von R. J. Schnitzer auf der Verbindungen dieser Erfindung gegen Trichonionas Seiten 289 — 331 in Experimental Chemotherap, Volume vaginalis zusammengefaßt. Die Untersuchung wurde im I, Academic Press, New York (1963) beschrieben wird.

Tabelle VI

Verbindung

Minimaler Gehalt Unterdrückung	für 99%	Minimaler Gehalt für vollständigen Schutz	(ug/ml) 48 Std.
(■ig/ml) 24Std.	(ug/ml) 48Std.	24 Std.	25
25	25	>250	25
25	10-25	>250	10
-	2.5	-	100
250	100	>250

Gentamicin B Gentamicin B, Gentamicin X Gentamicin C

Vereinfachtes Tripticaseserummedium, Baltimore Biolgical Laboratories, Baltimore, Maryland. Gegen Entamoeba hystolytica hat Gentamicin X eine

minimale Inhibitior.skonzentration von 4 mcg/ml (48 Stunden) und eine minimale Schutzkonzentration von 7 mcg/ml (48 Stunden).

Anthelminthische Aktivität in vivo

Gentamicin B und Gentamicin X zeigen anthelminthi- Millerton Mäusen im wesentlichen nach O. D. Standen, sehe Aktivität gegen Syphacia obvelala, wenn die Seite 701-892, Experimental Chemotherapy, Volume 1, Untersuchungen an Gruppen von 7 männlichen so durchgeführt werden.

Tabelle VII

Verbindung

mg/kg/ pro Tag

% in Diät

% infiziert

Mittlere Wurmmenge

Gentamicin B	259	0,25	0	0
Gentamicin B	100	0.0625	0	0
Gentamicin B	39	0,02	0	0
Gentamicin B	8	0,008	67	29,5
Gentamicin X	310	0,25	0	0
Gentamicin X	62	0,05	83	27
Kontrollgruppe	0	0	100	53
Kontrollgruppe	0	0	100	22
Kontrollgruppe	0	0	75	6,8

Die Daten in Tabelle ViI zeigen, daß Gentamicin B eine anthelminthische Aktivität gegen Syphacia obvelata bei einer Mindestdosis von 39 mg/kg pro Tag bei Verabreichung an männliche Millerton Mäuse hat. Gentamicin X erreicht einen totalen Erfolg bei 310 mg/kg pro Tag und einen teilweisen Erfolg bei 62 mg/kg pro Tag unter den gleichen Untersuchungsbedingungen.

Vermindertes Auftreten von Ataxia

Gentamicin B und zu einem geringeren Ausmaß Gentamicin Bi zeigen eine Eigenschaft, die recht ungewöhnlich für Aminoglykosidantibiotika ist. Wenn man diese Verbindungen entsprechend den Untersuchungsmethoden, die von Weinstein, Wagman und Taber in Antimicrobial Agents and Chemotherapy, 1965. Seiten 227—231, beschrieben sind, verabreicht, so

IO

benötigen diese Verbindungen eine wesentlich längere Zeit der Anwendung bei hohen Dosen um eine Störung des Streckreflexes und das Auftreten von Ataxia zu erreichen. Es scheint ein Zusammenhang zwischen hohen Dosen von aminoglykosidartigen Antibiotika, die Ober eine ausgedehnte Zeit verabreicht werden, und vestibulären Schädigungen zu bestehen, wobei eines der ersten Symptome Ataxia ist. Die Untersuchungsergebnisse in Tabelle VIII zeigen, daß Gentamicin B und Gentamicin B, in Vergleich zu Gentamicin C in Dosen verwendet werden können, die wesentlich über den normalen therapeutischen Dosen liegen. Ferner können sie in solchen Dosen für eine Zeit verwendet werden, die wesentlich über der normalen Zeit liegt, die benötigt wird, um Infektionen zu beheben, ohne Ataxia zu verursachen, wobei minimale wenn überhaupt auftretende toxische Erscheinungen festgestellt werden.

Tabelle VIII

Chronische Toxizitiit bei Katzen nach täglicher subkutaner Verabreichung

Antibiotikum	Dosis	An/ahl von	Mittlere Tagzahl
		Katzen	bis zum Auftreten
	(mg/kg/p ro Tag!		von Attax.a
Gentamicin B,	240	1	21.0
	60	4	69.0
	40	4	108.0
Gentamicin C	60	8	1 Λ.5
	40	Il	1 7.5
	20	S	31.4
Gentamicin B	24(1	1	21.0
	60	4	81.0
	40	4	>.M2*>

Die rnlcrMii'hunp wurde am 1 ntlc von 385 Ligen beendet, als \tj\ia an ; von 4 Kal/e?i nicht aufgetreten »,ir Die angegebenen Zahlen stellen das abgerundete Mittel dar

Die Verbindungen dieser 1 rfindung Gentamicin B. Gentamicin U und Gentamicin X sind geeignet fur orale. äußerliche und p.irenteralc Verabreichung. Wenn sie oral verabreicht werden, können sie in Form von Tabletten. Kapseln. I hveren und ähnlichem oder sogar in Mischung mn Tierluiter » erwendet werden. In dieser Dosisforni sind die Verbindungen besonders im Hinblick .iiif ihre Wirkung als <\nthelininthika und als Mittel gegen Protozoen wirksam Das trifft besonders zu. wenn sie bei vier Behandlung von tniestinaler Amoebiasis oder mehl spe/'lis» her Diarrhöe verwende! werden. Die Verbindungen dieser Erfindung können in Dosiseinheilen als einzige aktiv e Ingredcntien vorliegen od?r sie können in Verbindung mit anderen aktiven Ingrcdeniien vorliegen, wie beispielsweise mit Beruhigungsmitteln, da es bekannt ist. daß Infektionen und Infcstatiorien oft Angsizustande hervorrufen. Wenn der Warmblüter oral behandelt wn J. so ist die verabreichte Menge etwa IO bis etwa lot) mg. vorzugsweise 20 bis 79 mg/kg Körpergewicht und lag. vorzugsweise geteilt in 2 bis 4 Dosen

Bei äußerlicher Anwendung hegen die ertindungsge mäßen Verbindungen in I orm von C renicn. Salben. Suppositorien und dergleichen vor. Solche Dosisformen sollten etwa I bis etwa 10% Antibiotikum enthalten.und sollten an der Stelle der Infekton 2 bis 4mal täglich aufgebracht werden.

Bei der Behandlung von bakteriellen Infektionen können die Antibiotika Gentamicin B. Gentamicin B und Gentamicin X in Mengen von ungefähr 2 mg bis ungefähr 20 mg. vorzugsweise 5 bis 15 kg pro Kilogramm Körpergewicht angewendet werden.

Wie oben in Tabelle VIII gezeigt worden ist. können Gentamicin B und Gentamicin R. in Hinblick auf ihre geringe Fähigkeit Ataxia /\\ verursachen für die Behandlung von schweren bdKtenellen Infektionen verwendet werden, insbesondere für solche, die sich als wiederstandsfähig gegen andere antibakterielle Mittel erwiesen haben. Vorzugsweise wird Gentamicin B und/oder Gentamicin Bi parenteral verabreicht und zwar in Dosen von etwa 2 bis etwa 10 mg/kg Körpergewicht pro Tag. geteilt in mehrere Dosen.

Hierzu 3 I3lall Zeichnungen 030 227/9?

Claims

Patentansprüche:

1. Gentamicin B, Gentamicin B, und Gentamicin X der allgemeinen Formel I

HO

mit folgender Zuordnung R¹, R² und R³

Gentamicin B
Gentamicin 3,
Gentamicin X