DE2819094A1 - Cyclosporin-derivate, ihre verwendung und herstellung - Google Patents

Description

SANDOZ-PATENT-GMBH Case 100-4801

7850 Lörrach

Cyclosporin-Derivate, ihre Verwendung und Herstellung

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100-4801

2B19094

Cyclosporin-Derivate, ihre Verwendung und Herstellung

Die vorliegende Erfindung betrifft Cyclosporin-Derivate der Formel I,

CH J ^

CH₂ CH₃ CH

CH₃-N-CH-CO-N-L

CO

CH₃

\ I

CH-CH₂-CH L

CH₃

CH

CH₃

-CO N CH C N CH₂

I L Il

H O

CO

CH₃-N

I H OHl

j O. L I L H L I t| OC-CH N CO-CH — N CO CH N C CH N-CO CH

III III i

CH₃ H CH₃ CH₂ CH₃ ^CH CH₂

CH

N-CH₃ I

CH₃ ^CH₃

CH₃ CH₃

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worin A =

(nachstehend als h"^^CvV Cyclosporin D " Ho^R^iS

bezeichnet) , ^V ^

Ch₃ oder |

C N CH-

Il L

CH₃.

MjC

(nachstehend als >ch₂

I R Dihydro-cyclosporin D HO.R/Ch

CH CH₃

bezeichnet), _CH, j

oder _c—ν cu

ll t

H (nachstehend als ^/Cnn-

Iso-cyclosporin D IR

bezeichnet), / ch ch₃

—c ην ch—

Il I

bedeutet,

Verfahren zu ihrer Herstellung und pharmazeutische Zubereitungen.

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Erfindungsgemäss gelangt man zu Cyclosporin D, Dihydro-cyclosporin D und Iso-cyclosporin D, indem man

a) Cyclosporin D erhält/ indem man einen Cyclosporin D produzierenden Stamm der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Garns in Gegenwart eines Nährmediums züchtet und Cyclosporin D isoliert, oder indem man

b) Dihydro-cyclosporin D erhält, indem man Cyclosporin D hydriert, oder indem man

c) Iso-cyclosporin D erhält, indem man Cyclosporin D einer Säurebehandlung unterwirft.

Die Züchtung nach Verfahren a) lässt sich nach an sich bekannten Methoden für die Züchtung von analogen Stämmen, z.B. wie in Beispiel 1 beschrieben, durchführen.

Ein bevorzugter Cyclosporin D produzierender Stamm ist der frei zugängliche Stamm NRRL 80 44 der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Garns. Eine Kultur davon wurde beim United States Department of Agriculture (Northern Research and Development Division), Peoria, 111., USA deponiert. Dieser Stamm wurde vormals der Pilzspecies Trichoderma polysporum (Link ex. Pers.) zugeordnet und ist z.B. in der DOS 2,455,859 beschrieben.

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Für die Herstellung von Cyclosporin D lassen sich auch Stämme der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Gams verwenden, wie sie z.B. durch Selektion oder Mutation des Pilzstammes NRRL 8044 unter der Einwirkung von Ultraviolett- oder Röntgenstrahlen oder durch Anwendung anderer Massnahmen, z.B. durch Behandlung von Laboratoriuraskulturen mit geeigneten Chemikalien, gewonnen werden können.

Cyclcsporin D kann auf an sich bekannte Weise isoliert werden, z.B. wie in Beispiel 1 beschrieben. Hierbei kann Cyclosporin D abgetrennt werden von gleichzeitig in grösseren Mengen vorhandenen Naturprodukten, z.B. das etwas polarere Cyclosporin A (auch bekannt als S 7481/F-l), das polarere Cyclosporin B (auch bekannt als S 7481/F-2) und das noch polarere Cyclosporin C.

Das erfindungsgemässe Verfahren b) lässt sich nach an sich bekannten Methoden ausführen, z.B. durch katalytische Hydrierung.

Als Lösungsmittel kommen vorzugsweise niedere aliphatische Alkohole, wie z.B. Methanol, Aethanol, Isopropanol, oder Aethylacetat in Frage. Die Hydrierung erfolgt zweckmässigerweise im neutralen Bereich bei Temperaturen zwischen 20 und 30⁰C und bei Atmosphärendruck oder wenig erhöhtem Druck. Als Katalysator kommt vorzugsweise Palladium, z.B. Palladium auf Kohle, in Frage.

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Die Säurebehandlung nach dem Verfahren c) lässt sich nach an sich bekannten Methoden ausführen, z.B. mit Trifluoressigsäure, vorzugsweise Methansulfonsäure oder p-Toluolsulfonsäure.

Die Menge der starken Säure, die zur Isomerisierung angewendet wird, liegt vorzugsweise zwischen 1 und 4 Mol pro Mol Cyclosporin D.

Als Lösungsmittel kommen niedrige Alkohole, z.B. Methanol, halogenierte Kohlenwasserstoffe, z.B. Chloroform oder Aether, z.B. Dioxan, in Frage.

Die Reaktionstercperatur kann zwischen 20 und 65 ⁰C; vorzugsweise von 45 bis 55 ° C variieren.

Cyclosporin D, Dihydro-cyclosporin D und Iso-cyclosporin D zeichnen sich durch interessante chemotherapeutische und pharmakologische Eigenschaften aus und können daher als Heilmittel verwendet werden.

Cyclosporin D, Dihydro-cyclosporin D und Iso-cyclosporin D sind insbesondere indiziert als Antiar thritica.

Als Heilmittel können Cyclosporin D, Dihydro-cyclosporin D und Iso-cyclosporin D allein oder in geeigneter Arzneiform mit pharmakologisch indifferenten Hilfsstoffen verabreicht werden.

In den nachfolgenden Beispielen erfolgen alle Temperaturangaben in Celsiusgraden,

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Beispiel 1; Cyclosporin D

500 Liter einer Nährlösung, die pro Liter 40 g Glucose, 2,0 g Natriumcaseinat, 2,5 g Ammoniumphosphat, 5 g MgSO .111 O, 2 g KH PO , 3g NaNO , 0,5 g KCl, 0,01 g FeSO₄ und entmineralisiertes Wasser enthält, werden mit 50 Liter einer Vorkultur des Stammes NRRL 8044 angeimpft und in einem Stahlfermenter unter Rühren (170 UPM) und Belüftung (1 Liter Luft/Min./Liter Nährlösung) 13 Tage bei 27 ° inkubiert (siehe DOS 2 455 859).

Die Kulturbrühe wird mit der

gleichen Menge n-Butylacetat ausgerührt, nach Abtrennung der organischen Phase wird diese im Vakuum konzentriert und der Rohextrakt durch 3-stufige Verteilung zwischen Methanol-Kesser (9 : 1) und Petroläther entfettet. Die methanolische Phase wird abgetrennt, im Vakuum konzentriert und das Rohprodukt durch Zugabe von Wasser ausgefällt. Das nach der Filtration gewonnene Material wird an Kieselgel mit Hexan-Aceton (2:1) als Elutionsmittel chromatographiert, wobei die zuerst eluierten Fraktionen vorwiegend Cyclosporin A und Cyclosporin D enthalten, die später eluierten Anteile vorwiegend Cyclosporin C. Zur v/eiteren Reinigung werden die Cyclosporin A- und D-haltigen Fraktionen aus der 2- bis 2,5-fachen Menge Aceton bei - 15 V kristallisiert und das Kristallisat wird anschliessend

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durch zweimalige Chromatographie an Kieselgel weiter aufgetrennt, wobei die mit Essigester wassergesättigt zuerst eluierten Fraktionen Cyclosporin D in stark angereicherter Form enthalten. Diese v/erden in der doppelten Menge Aceton gelöst und bei - 15 ° kristallisieren lassen. Das dabei erhaltene Rohkristallisat von Cyclosporin D wird zur weiteren Reinigung in der 10-fachen Menge Aceton gelöst, mit 2 Gewichtsprozent Aktivkohle versetzt und während 5 Minuten auf 60 ° erwärmt. Das nach Filtration über Talk erhaltene klare und beinahe farblose Filtrat wird auf ein Drittel des Volumens eingeengt und auf Raumtemperatur erkalten lassen, wobei Cyclosporin D spontan auskristallisiert. Durch Stehenlassen bei - 17 ° wird die Kristallisation vervollständigt. Die durch Abfiltrieren gewonnenen Kristalle werden mit wenig eiskaltem Aceton gewaschen und anschliessend im Hochvakuum bei 80⁰C während 2 Stunden getrocknet.

Charakterisierung von Cyclosporin D:

Farblose, prismatische Kristalle; Smp. 148 - 151 in

[α]*^υ = - 245 ° (c = 0,52 in Chloroform) on

^[a]D = - 211 ° (c = 0,.51 in Methanol)

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' Beispiel 2: Dihydro-cyclosporin D

400 mg Palladium-Kohle (10 % Palladium) werden in 15 ml Aethanol während 20 Minuten vorhydriert. Zu dieser Suspension des Palladiumkatalysators wird die Lösung von 3,66 g Cyclosporin D in 30 ml Aethanol zugegeben und darauf bei 24 ° und einem Druck von 736 mm Quecksilbersäule bis zur beendeten Wasserstoffaufnahme hydriert. Anschliessend filtriert man vom Katalysator ab und dampft das Filtrat im Vakuum bei 20 bis 40 ° zur Trockne ein. Dabei fällt das dünnschichtchromatographisch einheitliche Dihydro-cyclosporin D als farbloses amorphes Pulver an, das im Hochvakuum während 4 Stunden bei 70 ° getrocknet wird.

Eigenschaften von Dihydro-cyclosporin D:

Smp. 153 - 156 °

[ct]p° = - 237 ° (C = 0,56 in CHCl₃)

on

[α]!: = - 196 ° (c = 0,58 in CH-OH)

.3

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Beispie1 3: Isocyclosporin D

Zur Lösung von 18,25 g Cyclosporin D in 120 ml absolutem Dioxan gibt man die Lösung von 3/60 g Methansulfonsäure in 60 ml Dioxan und hält das Gemisch bei 50 ° unter Feuchtigkeitsausschluss.' Der Fortgang der Reaktion wird im Dünnschichtchromatogramm verfolgt (Polygram SIL G-Folien, Chloroform-Methanol-Eisessig (90 : 6 : 4)/ Joddampf zur Sichtbarmachung) . Nach 17 Stunden wird auf Raumtemperatur gekühlt. Durch Zufügen von 3,38 g wasserfreiem Natriumacetat wird die Säure abgestumpft, nach Rühren während 15 Minuten das ausgeschiedene Salz abgenutscht und das Filtrat im Vakuum bei 45 ° eingedampft. Die 21 g Rückstand werden an 1,5 kg Kieselgel chromatographiert,

wobei zur Elution Chloroform-Methanol (98 : 2) dient. Die praktisch aus reinem Iso-cyclosporin D bestehenden Fraktionen werden vereinigt, im Vakuum bei 50 ° eingedampft und der Rückstand zwei- bis dreimal aus Aether kristallisiert, wobei Iso-cyclosporin D anfällt.

Eigenschaften von Iso-cyclosporln D;

Farblose Prismen; Smp. 142 - 144 °

in

[cc]* = - 205,5 ° (c = 0,51 in CHCl₃)

[a]^⁰ = - 144,4 ° (c = 0,64 in CH₃OH)

3700/BA/ER

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Claims (3)

100-4801 •Patentansprüche;

1. Die neuen Cyclosporin-Derivate der Formel I,

- ^CH3\ χ"^CH3 ■ . CH, XH,

CH ³V/ ³

I ^CH3\ /-^CH3 · CH

CH₂ CH₃ CH J CH₃

CH_n-N-CH-CO-N CH - A CO N—CH C N CH₂

³Il t I L Il

HO

CO CH₃ I CO

CH-CH₂-CH L

CH₃ N-CH₃ I

CH₃-N

H OH D. L I · I H U I t OC-CH N CO-CH — N CO CH N C CH—N-CO CH

III III I

CH₃ H CH₃ CH₂ CH₃ CH CH₂

I CH₃ ^NCH₃ I

CH3 CH₃ CH₃

worin A =

— C-
Il
O CH_3n ^CH₃ (nachstehend als h' Cyclosporin D HO,. bezeichnet),
oder — N V
η Il R y, CH
-CH-
L -H "CH₂ Ir
CH

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(nachstehend als —C 1
I) bedeutet. «α *~ll
O Ir
R/^CH^ CH₃ Dihydro-cyclosporin D O HO^ CH_3v^ ^-H
C
U CH
ι bezeichnet), CH₃ h^h CH
t oder Ir
O R ,.Cn / CH *> (nachstehend als HN CH
I Iso-cyclosporin D I ■- bezeichnet).

CH₃

2. Verfahren zur Herstellung von Cyclosporin D, Dihydro-cyclosporin D und Isocyclosporin D, dadurch gekennzeichnet, dass man

a) Cyclosporin D erhält, indem man einen Cyclosporin D produzierenden Stamm der Pilzspecies Tolypocladium inflatum Garns in Gegenwart eines Nährmediums züchtet und Cyclosporin D isoliert, oder indem man

b) Dihydro-cyclosporin D erhält, indem man Cyclosporin D hydriert, oder indem man

c) Iso-cyclosporin D erhält, indem man Cyclosporin D einer Säurebehandlung unterwirft.

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3. Pharmazeutische Zubereitungen, die mindestens Cyclosporin D oder eines der Derivate Dihydrocyclosporin D oder Iso-cyclosporin D enthalten.

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