DE3851268T2

DE3851268T2 - Zyklische Peptolide.

Info

Publication number: DE3851268T2
Application number: DE3851268T
Authority: DE
Inventors: Michael Morris Dreyfuss; Alexander Dr Haslberger; Max H Schreier; Hans Tscherter; Roland Wenger
Original assignee: Sandoz AG
Current assignee: Novartis AG
Priority date: 1987-06-19
Filing date: 1988-06-15
Publication date: 1995-01-26
Anticipated expiration: 2008-06-16
Also published as: FI882926L; AU1812488A; PT87763A; AU623078B2; DE3851268D1; EP0296123B1; ES2056954T3; IE64008B1; PT87763B; PH25933A; NZ225071A; IL86789A; CA1338183C; MY103735A; KR970010928B1; IL86789A0; KR890000518A; US5116816A; ATE110784T1; HUT50220A

Description

Diese Erfindung betrifft neue cyclische Peptolide, die als Pharmazeutika brauchbar sind.
Der Ausdruck Peptolid wird hierin verwendet, um eine natürliche oder synthetische Verbindung zu bezeichnen, die aus miteinander sowohl über Amid- als auch Esterbindungen verbundenen α-Hydroxy- und α-Aminosäuren besteht. Eine solche Struktur, die durch Ersetzen einer Amidbindung durch eine Esterbindung in einem Peptid erhalten wird, ist daher ein Peptolid.
Eine wichtige Klasse von Peptiden sind die Cyclosporine, die durch eine cyclische Struktur gekennzeichnet sind, die aus 11 Aminosäureresten besteht, wobei einer der N-Methyl-(4R)-4-but-2E- en-1-yl-4-methyl-(L)-threonylrest, als MeBmt bezeichnet, oder ein Derivat hiervon ist. Viele Cyclosporine haben pharmakologische Eigenschaften, insbesondere immunsuppressive und antiinflammatorische Eigenschaften. Das erste isolierte Cyclosporin war der natürlich auftretende Metabolit Cyclosporin A, (Ciclosporin), das im Handel unter dem eingetragenen Warenzeichen Sandimmun verkauft wurde. Diese Verbindung hat die in der Formel I gezeigte Struktur
(Eine vollständige Liste der hierin verwendeten Abkürzungen ist in Tabelle II angegeben).
Nach der Konvention werden die Aminosäurereste von Cyclosporinen im Uhrzeigersinn beginnend mit dem MeBmt Rest nummeriert. Alle α-Aminosäuren haben die L-Konfiguration, falls dies nicht anders angegeben ist, daher hat in Formel I das Alanin an Position 8 die D-Konfiguration. Das Symbol Me vor der Abkürzung für eine Aminosäure zeigt an, daß der Aminosäurerest am Stickstoff der Amidbindung N-methyliert ist.
Die vorliegende Erfindung liefert ein cyclisches Peptolid, dadurch gekennzeichnet, daß es die Struktur eines Cyclosporins aufweist, worin eine Amidbindung durch eine Esterbindung ersetzt ist, und daß es sich aus einem MeBmt Rest oder einem Derivat dieses Rests, 9 anderen α-Aminosäureresten und einem α- Hydroxysäurerest zusammensetzt.
Der α-Hydroxysäurerest sitzt vorzugsweise an der Position 8.
Bevorzugte Derivate von MeBmt sind das 8'-Hydroxyderivat (8'-OHMeBmt) und das gesättigte Dihydroderivat MeBmtH&sub2;, die die im folgenden gezeigten Strukturen aufweisen:
Das erfindungsgemäß bevorzugte cyclische Peptolid hat die Struktur der folgenden Formel II
worin W für MeBmt, 8'-OH-MeBmt oder MeBmtH&sub2; steht,
X für Sar oder Gly steht,
Y für MeLeu oder Leu steht,
Z für Leu, Ile oder Val steht,
und A für den Rest einer α-Hydroxycarbonsäure steht
vorzugsweise der Formel III
worin R für C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl steht.
Bevorzugter steht in Formel III R für Isopropanol, so daß A
darstellt, den Rest einer α-Hydroxyisovaleriansäure, abgekürzt Hiv. Die bevorzugteste erfindungsgemäße Verbindung ist die, bei der in Formel II W für MeBmt, X für Sar, Y für MeLeu, Z für Leu und A für D-Hiv steht. Diese kann durch die komplette Strukturformel dargestellt werden, die in Formel IV gezeigt ist
oder mittels der jetzt konventionellen Nomenklatur für Cyclosporine, die auf der Struktur von Ciclosporin (Cyclosporin A) basiert, das in Formel I gezeigt ist. Dies wird erreicht, indem man der Reihe nach jeden Rest im Molekül auf führt, der sich von dem in Ciclosporin gefundenen unterscheidet, und den Ausdruck "Ciclosporin" anfügt. Daher kann die Verbindung der Formel IV folgendermaßen dargestellt werden
(Thr)² (Leu)&sup5; (D-Hiv)&sup8; (Leu)¹&sup0;-Ciclosporin
was für ein Ciclosporin steht, worin Abu in Position 2 durch Thr ersetzt wird, Val in Position 5 durch Leu ersetzt wird, D-Ala in Position 8 durch D-Hiv ersetzt wird und MeLeu in Position 10 durch Leu ersetzt wird, wobei die anderen Reste zu denen im Ciclosporin identisch sind.
Bestimmte Beispiele von anderen erfindungsgemäß bevorzugten Verbindungen sind (Thr)² (D-Hiv) 8 (Leu)¹&sup0;-Ciclosporin, (Thr)² (Ile)&sup5; (D-Hiv)&sup8; (Leu) ¹&sup0;-Ciclosporin, (Thr)² (Leu)&sup4; (Leu)&sup5; (D-Hiv)&sup8; (Leu)¹&sup0;-Ciclosporin, und (8'-OH MeBmt)¹ (Thr)² (Leu)&sup5; (D-Hiv)&sup8; (Leu)¹&sup0;-Ciclosporin.
Die erfindungsgemäßen cyclischen Peptolide können durch Kultivierung eines produzierenden Mikroorganismenstamms in einem Nährmedium und Gewinnung des cyclischen Peptolids hergestellt werden. Bevorzugte Mikroorganismen sind Pilzstämme der Gattung Cylindrotrichum Bonorden, insbesondere der Stamm NRRL 18230, der ein cyclisches Peptolid der Formel II bildet.
Der Stamm wurde aus einer Blattprobe aus Waldenburg im schweizer Jura isoliert, und eine lebensfähige Kultur des Stamms wurde am 17. Juni 1987 beim US Departement of Agriculture (North Central Region, Northern Regional Research Centre), Peoria, Ill. hinterlegt und mit der Hinterlegungsnummer NRRL 18230 bezeichnet. Die Kultur kann auch von Sandoz Ltd. Basel, Schweiz, erhalten werden.
Der Pilzstamm NRRL 18230 ist ein Hyphomycet, der bei Inkubation bei 21-24ºC auf 2%igem Malzextraktagar (=MA, 2% Malzextrakt, 0,4% Hefeextrakt, 2% Agar in entmineralisiertem Wasser) unseptierte oder oft einmal septierte bacillenförmige hyaline Konidien bildet, die 6-15 um · 1,5-2,7 um (meistens 9,5- 13,5 um) groß sind.
Die Konidien-bildenden Zellen sind im allgemeinen zylindrisch und haben einen auffälligen kleinen Kragen, einige Zellen erscheinen sympodial-polyphialid. Nach dem Bestimmungsschlüssel von M.B. Elles (Dematiaceous Hyphomycetes, Commenwealth Mycological Institute, Kew, Surrey, England, 1971) kann der Stamm am besten in die Gattung Cylindrotrichum Bonorden klassifiziert werden.
Der Pilzstamm NRRL 18230 wächst relativ langsam und bildet nach zehntägiger Inkubation bei einer Temperatur von 21ºC Kolonien mit 4-7 mm Durchmesser mit einem samtig grauen Luftmycel. Die optimale Wachstumstemperatur liegt zwischen 18ºC und 27ºC und oberhalb von 33ºC tritt kein Wachstum auf. Das verzweigte und septierte Luftmycel der auf MA bei 21ºC kultivierten Kolonien ist im allgemeinen 1,5-3,5 um (gewöhnlich 2-3 um) breit, während bei Substratmycelhyphen eine Breite bis zu 5,5 um beobachtet werden kann.
Die Erfindung liefert auch eine Fermentationsbrühe, die durch die Kultivierung des Stamms NRRL 18230 erhalten wird. Der neue Stamm NRRL 18230 kann durch aerobe Oberflächenverfahren oder Immersionsverfahren bei geeigneten Temperaturen in einer Vielzahl an Nährmedien kultiviert werden, die die Nährstoffe und Mineralien in brauchbarer Form enthalten.
Daher sollte das Medium eine assimilierbare Kohlenstoffquelle und wahlweise Mineralsalze und Wachtumsfaktoren enthalten. Alle diese Bestandteile können in Form von gut definierten einfachen Verbindungen oder in Form von komplexen Gemischen zugegeben werden, die aus biologischen Quellen erhalten wurden. Die Kultivierung wird nach herkömmlichen Verfahren durchgeführt, und die während der Fermentation gebildeten cyclischen Peptolide können schließlich mittels bekannter Chromatographieverfahren aus dem Kulturmedium isoliert werden. Die erfindungsgemäßen cyclischen Peptolide können auch durch Kultivierung von Stammvarianten oder mutierten Stämmen erhalten werden, die beispielsweise durch Selektion oder die Wirkung mutationserzeugender Mittel, beispielsweise Uv Licht, Röntgenstrahlen oder chemische Mutagene auf NRRL 18230 oder andere Stämme von Cylindrotrichum Bonorden erhalten wurden.
Die erfindungsgemäßen cyclischen Peptolide können auch durch synthetische oder halbsynthetische Verfahren hergestellt werden, beispielsweise durch die Cyclisierung eines linearen Peptolids oder eines linearen Peptids, das eine endständige -OH Gruppe anstatt der endständigen -NH&sub2; Gruppe aufweist, oder durch Ersetzen einer Amidbindung in einem natürlichen, synthetischen oder semisynthetischen Cyclosporin durch eine Esterbindung.
Die Totalsynthese der bevorzugten Verbindungen der Formel II kann in analoger Weise zur Totalsynthese von Cyclosporin A und dessen Analoga ausgeführt werden, wie es beispielsweise in der EP- A 0 034 567 oder von R. Wenger in Transplantation Proceedings, Band XV Seiten 2230-2241 (1983) beschrieben ist. Gemäß diesem Verfahren wird zuerst das C-geschützte Heptapeptid der Formel V hergestellt
worin Bz für die Benzylgruppe steht und W, X, Y und Z wie oben definiert sind, und dies dann mit einem Tetrapeptid gemäß der Sequenz 8 bis 11 umgesetzt wird.
Dieses Tetrapeptid der Formel VI
enthält drei normale Peptidbindungen, aber weist einen O-Terminus anstelle eines N-Terminus auf, da der Rest an der Position 8 von einer α-Hydroxysäure anstatt einer α-Aminosäure stammt.
Das Tetrapeptid kann gemäß der im folgenden Fließschema gezeigten Methode hergestellt werden:
worin BOC die N-Schutzgruppe t-Butyloxycarbonyl ist und R' eine geeignete O-Schutzgruppe ist. Daher ist das oben als R'-A-OH dargestellte Reagenz eine OH-geschützte α-Hydroxycarbonsäure, die, wenn A die Formel III hat, die Formel VII aufweist
worin R wie oben definiert ist.
Vorzugsweise wird die Gruppe R' aus den Gruppen
und tBuSi(CH&sub3;)&sub2;- ausgewählt. Die bevorzugten Verbindungen der Formel VII können durch Umsetzung der α-Hydroxysäure in Carbonyl-geschützter Form, beispielsweise als Benzylester, jeweils mit Dihydrofuran, Ethoxyethylen, t-Butyldimethylchlorsilan oder Chlordimethylether erhalten werden.
Die Umsetzung des COOH-geschützten Heptapetids V mit dem Hydroxytetrapeptid VI in OH-geschützter Form führt zu einem linearen Hydroxyundecapeptid der Formel VII, das die Sequenz 8 bis 7 aufweist.
Die schließliche Cyclisierung dieses linearen Hydroxypeptids kann unter Entfernung der Schützgruppen durch saure und basische Hydrolyse und Kuppeln des Rests 8 an den Rest 7 unter Bildung einer Esterbindung ausgeführt werden. Die Kupplungsreaktion wird vorzugsweise in Methylenchlorid mittels eines Carbodiimidreagenzes ausgeführt, beispielsweise N-Ethyl-N'-(3-dimethyl-amino)propylcarbodiimid.
Das Heptapeptid der Formel V und das Tetrapeptid der Formel VI können ebenfalls durch kontrollierte Hydrolyse der durch Fermentation erhaltenen cyclischen Peptolide der Formel II erhalten werden. Diese Behandlung mit Trifluoressigsäure bei niedrigen Temperaturen spaltet die Bindung zwischen den Resten 11 und 1 unter Bildung eines linearen Undecapeptolids, das die Reste 1 (N-terminal) bis 11 (C-terminal) mit einer Esterbindung bei 7-8 enthält. Die alkalische Hydrolyse ergibt das 1-7 Heptapeptid und das 8-11 Hydroxytetrapeptid. Halbsynthetische cyclische Peptolide können dann beispielsweise durch Umsetzung des auf diese Weise hergestellten Hydroxytetrapeptids mit einem synthetischen Heptapeptid, oder umgekehrt, und Cyclisierung des linearen Produkts hergestellt werden.
Zum Zweck der Cyclisierungsreaktion kann das Peptid, falls gewünscht, in O-geschützter Form vorliegen, das heißt, daß die Hydroxygruppen in 1-MeBmt oder einem Derivat hiervon und/oder im 2-Threoninrest Schutzgruppen tragen können, wie dies in EP-A 0 034 567 beschrieben ist. Solche O-Schutzgruppen werden dann anschließend an den Ringschluß durch Standardverfahren entfernt. Beispielsweise kann die Entfernung einer Benzylgruppe durch Hydrierung auch zur Hydrierung von MeBmt zu MeBmtH&sub2; führen, und in jedem Fall werden dann anfänglich gebildete cyclische Peptolide, die einen MeBmt Rest an der Position 1 enthalten, zu der entsprechenden MeBmtH&sub2; Verbindung durch Hydrierung umgewandelt.
Demnach liefert die Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines cyclischen Peptolids der oben angegebenen Formel II, wobei das Verfahren gekennzeichnet ist durch
a) Entfernen von O-Schutzgruppen von einem cyclischen Peptolid der Formel II in O-geschützter Form,
b) Cyclisierung eines geradkettigen Hydroxyundecapeptids der Formel VIII in ungeschützter Form oder an einem oder beiden Resten 1 und 2 O-geschützt , und, falls erforderlich, Durchführung des Verfahrensschritts (a),
und, falls erwünscht
c) Hydrierung eines so erhaltenen cyclischen Peptolids der Formel II, worin W für MeBmt steht unter Erhaltung des entsprechenden cyclischen Peptolids, worin W für MeBmtH&sub2; steht.
Die erfindungsgemäßen cyclischen Peptolide zeigen pharmakologische Wirkung und können daher als Pharmazeutika nützlich sein. Insbesondere zeigen die Verbindungen immunsuppressive, antiinflammatorische und antiparasitäre Wirkung in den folgenden Tests.

IN VITRO MODELLE (1-3)

1. Interleukin 2 (IL-2) Hemmung

Interleukin 2 wird durch mitogene Stimulation von Milzzellen der Maus induziert. Achtundvierzig Stunden alte Überstände werden gewonnen und auf ihren IL-2 Gehalt durch eine IL-2 abhängige Zellinie (CTLL) getestet. Das Wachstum dieser Zellen wird nach 48 Stunden mittels eines Enzymassays getestet, der die Mitochondrienaktivität mißt.
[T. Mosmann J. Immunol. Methods 65 : 55-63 (1983)].
Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen eine inhibitorische Wirkung bei Konzentrationen der IC&sub5;&sub0; von 0,01 bis etwa 0,1 ug/ml auf.

2. Proliferationsreaktion von Lymphozyten auf allogene Stimulation

Gemischte Lymphozytenreaktion (MLR) der Maus

Milzzellen (0,5 · 10&sup6;) von Balb/c Mäusen (weiblich, 8-10 Wochen) werden für 5 Tage zusammen mit 0,5 · 10&sup6; bestrahlten (2000 rad) oder Mitomycin C-behandelten Milzzellen aus CBA Mäusen (weiblich, 8-10 Wochen) inkubiert. Die bestrahlten allogenen Zellen induzieren eine Proliferationsreaktion bei den Balb/c Milzzellen, die durch den Einbau von markierten Bausteinen in die DNA gemessen werden kann. Da die stimulierenden Zellen bestrahlt sind (oder Mitomycin C behandelt sind) reagieren sie nicht auf die Balb/c Zellen mit Proliferation, aber behalten ihre Antigenität.
[T. Meo "Immunological Methods", Herausgeber L. Lefkovits and B. Pernis, Academic Press, N.Y., Seiten 227-239 (1979)].
Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen eine Hemmwirkung bei Konzentrationen von IC&sub5;&sub0; = 0,0001 bis etwa 0,001 ug/ml auf.

3. Primäre humorale Immunantwort auf rote Blutkörperchen vom Schaf in vitro (Mishell-Dutton Assay)

Milzzellen der Maus (OFI, weiblich, 8-10 Wochen, 1 · 10&sup7;) werden zusammen mit Schaferythrocyten (SRBC, 3 · 10&sup7;) für 3 Tage in 1 ml Endvolumen in 24 Probenlöcher enthaltenden Platten kultiviert. Die Lymphocyten werden gewonnen, gewaschen und in einer Dichte von 1 · 10&sup6; Zellen auf Weichagar mit frischem Antigen (SRBC) ausplattiert. Komplement (Meerschweinchenserum) wird nach einer 60-90 minütigen Inkubationsperiode zugegeben und die Inkubation für weitere 60 Minuten fortgesetzt, wonach der Test durch Zählen der Plaques unter dem Mikroskop ausgewertet wird. Während der dreitägigen Inkubation werden die Lymphocyten gegenüber dem Antigen (SRBC) sensibilisiert. Wenn sie mit dem Antigen inkubiert werden, sekretieren die B-Lymphocyten spezifische Antikörper, die an das in der Nachbarschaft des sekretorischen Lymphocyten liegende Antigen binden. Der Zusatz des Komplements verursacht die Lyse der mit Antikörper beschichteten Erythrocyten, was zu einem Plaque führt. Jeder Plaque repräsentiert eine einzelne Antikörper-bildende Zelle.
[R. I. Mishell und R.W. Dutton J. Exp. Med. 126 : 423-442 (1967)].
Die Unterdrückung von plaquebildenden Zellen wird bei Konzentrationen der erfindungsgemäßen Verbindung bei IC&sub5;&sub0; von 0,01 bis etwa 0,1 ug/ml beobachtet.

IN VIVO MODELLE (4-9)

4. Bildung von plaquebildenden Zellen (humorale Immunantwort)

Weibliche Ratten (OFA) werden durch die i.v. Injektion von (1 · 10&sup8;) Schaferythrocyten (SRBC) immunisiert und an drei auf einanderfolgenden Tagen mit den zu untersuchenden Arzneimitteln behandelt. 6 Tage nach der Immunisierung werden Milzzellsuspensionen hergestellt und 1 · 10&sup6; Lymphocyten werden auf Weichagar in Gegenwart von Indikatorzellen (SRBC) und Komplement ausplattiert. Die Lyse der Indikatorzellen aufgrund der Sekretion des spezifischen Antikörpers und der Gegenwart des Komplements ergibt Plaques. Die Anzahl der Plaques pro Platte wird gezählt und auf die Anzahl der Plaques pro Milz umgerechnet.
[N.K. Jerne und A.A. Nordin, Science 140 : 405 (1969), N.K. Jerne, A.A. Nordin und C. Henry (1963) in : "Cell Bound Antibodies", Herausgeber B. Amos und H. Koprowski, Wistar Inst. Press, Philadelphia, Seiten 109-125 (1963)].
Die erfindungsgemäßen Verbindungen rufen diese Wirkung in der Ratte hervor, wenn sie oral in einer ED&sub5;&sub0; von etwa 6,0-8,0 mg/kg verabreicht werden.

5. Lokale graft-versus-host Reaktion

Milzzellen (1 · 10&sup7;) von 6 Wochen alten Wistar/Furth (WF) Ratten werden subcutan am Tag 0 in die linke hintere Pfote von weiblichen (F344 · WF)FI Ratten injiziert, die etwa 100 g wiegen. Die Tiere werden an 4 aufeinanderfolgenden Tagen behandelt und die poplitealen Lymphknoten werden am Tag 7 entfernt und gewogen. Der unterschied im Gewicht zwischen den zwei Lymphknoten wird als Auswertungsparameter der Reaktion verwendet.
[W.L. Ford, W. Burr und M. Simonsen, Transplantation 10 : 258-266 (1970)].
Die erfindungsgemäßen Verbindungen weisen in diesem Test eine orale ED&sub5;&sub0; von etwa 20-30 mg/kg auf.

6. Freund'sche Adjuvansarthritis

OFA und Wistar Ratten (männlich oder weiblich, 150 g Körpergewicht) werden i.c. am Schwanzansatz oder in der hinteren Pfote 0,1 ml Mineralöl injiziert, das 0,6 mg lyophilisierte hitzegetötete Mycobacterium smegmatis enthält. Die Behandlung wird am Tag 14 begonnen, wenn die sekundäre Entzündung gut entwickelt ist (Tage 14-20). Am Ende des Experiments wird die Schwellung des Gelenks durch ein Mikrometer gemessen. ED&sub5;&sub0; ist die orale Dosis in mg/kg, die die Schwellung (primär oder sekundär) auf die Hälfte der Schwellung der Kontrollen reduziert. Für die erfindungsgemäßen Verbindungen beträgt die orale ED&sub5;&sub0; bis zu 30 mg/kg.
[C.A. Winter und G.W. Nuss, Arthritis and Rheumatism 9 : 394-404 (1966)].

7. Nierenallotransplantatsreaktion in der Ratte

Eine Niere von einer weiblichen Fischer 344 Ratte wird an das Nierengefäß einer einseitig (linke Seite) nephrectomierten Wistar/Furth Empfängerratte mittels End zu End Anastomose transplantiert. Die Ureteranastomose ist ebenfalls End zu End. Die Behandlung beginnt am ersten Tag der Transplantation und wird für 14 Tage fortgesetzt. Eine kontralaterale Nephrectomie wird sieben Tage nach der Transplantation durchgeführt, wobei dann der Empfänger auf die Tauglichkeit der Spenderniere angewiesen ist. Das überleben des Empfängers wird als Parameter für ein funktionelles Transplantat genommen.
[P.C. Hiestand, et al, Immunology 55 : 249-255 (1985)].
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind in der Ratte bei einer oralen ED&sub5;&sub0; von 6 bis etwa 9 mg/kg wirksam.

8. UV Erythemtest

Der Test wird mit weiblichen Albinomeerschweinchen mit einem ungefähren Gewicht von 150 g durchgeführt. Die Tiere werden an beiden Flanken mit einem Braunmikrorasierer rasiert, ohne die Haut zu reizen. Für jede Testsubstanz werden fünf Tiere einer definierten Intensität der UV Bestrahlung für 10 Sekunden auf jeweils 4 Hautbereiche (10 mm Durchmesser) unterzogen. Anschließend werden sofort 50 ul einer Lösung der Testsubstanz in Ethanol/Propylenglykol/Dimethylacetamid (19 : 19 : 2 v/v) auf zwei der bestrahlten Hautbereiche auf jedem Tier aufgetragen und 50 ul des Lösemittelgemisches auf die anderen zwei als Kontrolle aufgetragen. Vier Stunden nach der Verabreichung wird das Erythemausmaß visuell bestimmt.
[Raake, W. Arzneim.-Forsch. 34(I) Nr. 4 (1984)].
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind in einer Konzentration von 1 bis 10% wirksam.

9. Anti-Malariatest

Mäuse (OFI, männlich) werden i.p. am Tag 0 mit 0,2 ml einer Erythrocytensuspension infiziert, die 10&sup7; Zellen enthält, welche von plasmodium berghei (Stamm NK 65) befallen sind. Die Testsubstanz wird s.c. in unterschiedlichen Dosierungen unter Verwendung von 5 bis 10 Mäusen/Dosis verabreicht. Die Überlebenszeit wird gemessen und die minimal wirksame Dosis (MED) wird durch den Vergleich der Überlebenszeit mit der der unbehandelten Kontrollen errechnet. Für die Kontrollen beträgt die Überlebenszeit etwa 7 Tage. Die MED ist die Dosierung, bei der die Überlebenszeit verdoppelt wird.
[L. Rane in "Chemotherapy and Drug Resistence in Malaria", Herausgeber W. Peters, Academic Press, New York, (1979)].
In Anbetracht ihrer immunsuppressiven Wirkung sind die Verbindungen für die Anwendung in der Prophylaxe und Behandlung von Zuständen und Krankheiten angezeigt, die einer Unterdrückung der Immunantwort bedürfen, beispielsweise bei der Behandlung von Autoimmunerkrankungen, bei der Verhinderung der Gewebsabstoßung bei der Transplantation, beispielsweise Knochenmarks- und Nierentransplantation. Bestimmte Autoimmunerkrankungen, für die die erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden können, beinhalten aplastische Anämie, reine Erythrocytenanämie, idiopathische Thrombocytopenie, systemischer Lupus erythematodes, Polychrondritis, Sclerodermien, Wegener'sche Granulomatose, Dermatomyositis, chronisch aktive Hepatitis, Myasthenia gravis, Steven-Johnson Syndrom, Psoriasis, idiopathische Sprue, Morbus Crohn, Graves'sche Opthalmopathie, Sarcoidose, Multiple Sklerose, primäre biliäre Zirrhose, primärer juveniler Diabetes, posteriore Uveitis, interstitielle pulmonale Fibrose und psoriatische Arthritis.
Aufgrund ihrer antiinflammatorischen Eigenschaften sind die erfindungsgemäßen Verbindungen für die Anwendung bei der Behandlung von Entzündungszuständen angezeigt, insbesondere Entzündungszuständen mit einer Ätiologie, die eine autoimmune Komponente beinhalten, beispielsweise die Behandlung von Arthritis und rheumatischen Erkrankungen, wie die chronisch progressive Arthritis.
In Anbetracht ihrer antiparasitären Wirkung sind die Verbindungen ebenfalls für die Anwendung von parasitären Krankheiten angezeigt, beispielsweise Schistosomiasis, Filariasis, Leishmaniasis, Coccidioidiomykose und insbesondere Malaria.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen sind ebenfalls zur Anwendung bei der Behandlung von bestimmten Hautkrankheiten und Zuständen angezeigt, die zusätzlich zu den oben erwähnten folgende beinhalten, Alopecia areata, Urticaria, Vasculitis, Erytheme, atopische Dermatitis, Ekzeme, kutane Eosinophilie und Angiodermen.
Für diese Indikationen liegt eine indizierte tägliche Dosis im Bereich von etwa 70 bis etwa 3000 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung, die bequemerweise in aufgeteilten Dosen bis zu viermal am Tag verabreicht wird.
Die erfindungsgemäßen Verbindungen können auf jede herkömmliche Art verabreicht werden, insbesondere oral, beispielsweise in Form von Tabletten oder Kapseln, parenteral in Form von injizierbaren Lösungen oder Suspensionen oder topisch in Form einer Lotion, Creme oder eines Gels.
Die vorliegende Erfindung liefert auch pharmazeutische Zusammensetzungen, die eine erfindungsgemäße Verbindung zusammen mit zumindest einem pharmazeutischen Träger oder Verdünnungsmittel enthalten. Eine solche Zusammensetzung kann auf herkömmliche Weise hergestellt werden. Einheitsdosierungsformen enthalten beispielsweise etwa 20 mg bis etwa 1500 mg einer erfindungsgemäßen Verbindung.
Die folgenden Beispiele, in denen alle Temperaturen in Grad Celsius angegeben sind, erläutern die Erfindung.

Beispiel 1

Kultivierung des Stamms NRRL 18230 in einem Erlenmeyerkolben

Die Starterkulturen des Stamms NRRL 18230 werden bei 21ºC für 14 Tage auf MA in Schrägagarröhrchen inkubiert. Eine Vorkultur wird dann hergestellt, indem man die gesamten Bestandteile einer Starterkultur unter sterilen Bedingungen homogenisiert, in einen 500 ml Erlenmeyerkolben überführt, der 200 ml Nährlösung M (2% Malzextrakt, 0,4% Hefeextrakt in entmineralisiertem Wasser) enthält, und auf einem Rundschüttler bei 200 U/min für 10 Tage bei 21ºC inkubiert.
Zwischenkulturen werden dann erhalten, indem man 20 ml der Vorkultur in einen 500 ml Erlenmeyerkolben überführt, der 200 ml Nährlösung M enthält und auf einem Rundschüttler bei 200 U/min für 7 Tage bei 21ºC inkubiert.
Schließlich werden für eine Produktionskultur 100 Erlenmeyerkolben (500 ml), die jeweils 200 ml der Nährlösung M enthalten, jeweils mit 20 ml der Zwischenkulturen angeimpft. Die Kolben werden bei 21ºC in einem Rundschüttler bei 200 U/min inkubiert. Nach 10 Tagen werden die 20 Liter Fermentationsbrühe zur Extraktion des Produkts vereinigt.

Beispiel 2

Isolierung von (Thr) (Leu) (D-Hiv) (Leu)- -Ciclosporin

Die in Beispiel 1 erhaltenen 20 Liter Kulturmedium werden einem Mischen unter hohen Scherkräften in einem Stabmixer (Lutz, Wertheim, Deutschland) unterzogen, um die Zellen auf zubrechen, dann dreimal mit 20 Litern Ethylacetet extrahiert. Die 60 Liter organische Phase werden vereinigt, über wasserfreiem Natriumsulfat getrocknet und zur Trockne unter Bildung eines Rests von 17,4 g im Vakuum eingedampft.
Der Rückstand wird in 80 ml Methanol gelöst und auf einer Säule mit 90 mm Durchmesser chromatographiert, die 1300 g Sephadex LH-20 (Pharmacia Fine Chemicals AB, Uppsala, Schweden) enthält. 100 ml Fraktionen werden gesammelt, wobei (Thr)² (Leu) &sup5; (D-Hiv)&sup8; (Leu)¹&sup0; -Ciclosporin in den Fraktionen 22-30 auftritt. Diese werden vereinigt und unter Bildung von 8400 mg eines leicht gefärbten festen Schaums im Vakuum eingedampft. Dieser Rückstand wird in nassem Ethylacetat gelöst und auf einer Säule mit einem Durchmesser von 55 mm chromatographiert, die 500 g Kieselgel (Merck) mit einer Korngröße von 0,04-0,063 mm enthält. Das gewünschte Produkt wird in den Fraktionen 9-14 (100 ml Fraktionsgröße) detektiert. Das Eindampfen ergibt einen hellgelben Rückstand (4200 mg). Die Behandlung mit entfärbender Aktivkohle (Merck) in Diethylether und die Filtration durch Talk ergibt (Thr)² (Leu)&sup5; (D-Hiv)&sup8; (Leu)¹&sup0;-Ciclosporin ein weißes Pulver, das nach Umkristallisation aus Ether folgende physikalische Daten aufweist: Schmelzpunkt: 163-164ºC (Zersetzung), [α]²&sup0; = -186º, (c = 1 in MeOH), [α]²&sup0; = -223º, (c = 1 in CHCl&sub3;).

Beispiele 3-7

Durch Modifizierung der obigen Chromatographietechniken können die folgenden Verbindungen in geringen Mengen aus der Produktionsfermentationsbrühe isoliert werden:
Beispiel Nummer Verbindung
3 (Thr)² (D-Hiv)&sup8; (Leu)¹&sup0;-Ciclosporin
4 (Thr)² (Ile)&sup5; (D-Hiv)&sup8; (Leu)¹&sup0;-Ciclosporin
5 (Thr)² (Leu)&sup4; (Leu)&sup5; (D-Hiv)&sup8; (Leu)&sup0;-Ciclosporin
6 (Thr)² (Gly)³ (Leu)&sup5; (D-Hiv)&sup8; (Leu)¹&sup0;-Ciclosporin
7 (8'-OH MeBmt)¹ (Thr)² (Leu)&sup5; (D-Hiv)&sup8; (Leu)¹&sup0;-Ciclosporin
Die Verbindungen haben die in Tabelle I gezeigten Eigenschaften: Tabelle I

Beispiel 8

Synthese von (Thr) (Leu) (D-Hiv) (Leu) -Ciclosporin durch Cyclisierung

Bei Raumtemperatur werden 2,4 g (2,29 mmol) des ungeschützten Hydroxyundecapeptids HO-(D)Hiv-MeLeu-Leu-MeVal-MeBmt-Thr-Sar-MeLeu-Leu-MeLeu-Ala-OH, 0,84 g (6,88 mmol) 4-Dimethylaminopyridin und 0,66 g (1,5 Äquivalente, 3,44 mmol) N-Ethyl-N-(3-dimethylamino)propylcarbodiimid in 145 ml Methylenchlorid gelöst und für drei Tage unter Rühren und Feuchtigkeitsausschluß umgesetzt. Die entstehende Lösung wird mit 300 ml Methylenchlorid verdünnt, mit 100 ml auf pH 2 mit 1 N HCl angesäuertem Wasser ausgeschüttelt, durch Talk filtiert und eingedampft. Der Rückstand wird auf 100 g Kieselgel mittels 10% MeOH/CH&sub2;Cl&sub2; unter Bildung der Titelverbindung (2,55 g, 89%) chromatographiert. Die Identität mit der Verbindung von Beispiel 2 wird durch NMR Spektroskopie und [α] 20 = -220º (c = 1 in CHCl&sub3;) bestätigt.

Tabelle II

Abkürzungen
Abu α-Aminobuttersäure
Ala Alanin
BOC t-Butyloxycarbonyl
Bz Benzyl
Gly Glycin
Hiv α-Hydroxyisovaleriansäure
Ile Isoleucin
Leu Leucin
MeBmt N-Methyl-(4R)-4-but-2E-en-1-yl-4-methyl-(L)-threonin
MeBmtH2 N-Methyl-(4R)-4-but-1-yl-4-methyl-(L)-threonin
8'OHMeBmt N-Methyl-(4R)-4-(4'-hydroxybut2E-en-1-yl)-4-methyl- (L)-threonin
Sar Sarcosin
Thr Threonin
Val Valin

Claims

1. Cyclisches Peptolid, dadurch gekennzeichnet, daß es die Struktur eines Cyclosporins aufweist, worin eine Amidbindung durch eine Esterbindung ersetzt ist, und dadurch, daß es sich aus einem MeBmt Rest oder eines Derivats hiervon, 9 anderen α-Aminosäureresten und einem α-Hydroxysäurerest zusammensetzt.

2. Cyclisches Peptolid gemäß Anspruch 1, das eine α-Hydroxycarbonsäure an der Position 8 aufweist.

3. Cyclisches Peptolid nach Anspruch 2 der Formel II

worin W für MeBmt, 8'-OH-MeBmt oder MeBmtH&sub2; steht,

X für Sar oder Gly steht,

Y für MeLeu oder Leu steht,

Z für Leu, Ile oder Val steht,

und A der Rest einer α-Hydroxycarbonsäure ist.

4. Cyclisches Peptolid nach Anspruch 3, worin A eine Gruppe der Formel III ist

worin R für C&sub1;&submin;&sub4;-Alkyl steht.

5. Cyclisches Peptolid nach Anspruch 4, worin R für Isopropyl steht.

6. (Thr)² (Leu)&sup5; (D-Hiv)&sup8; (Leu)¹&sup0;-Ciclosporin.

7. (Thr)² (D-Hiv)&sup8; (Leu)¹&sup0;-Ciclosporin.

8. (Thr)² (Ile)&sup5; (D-Hiv) 8 (Leu)l&sup0;-Ciclosporin.

9. (Thr)² (Leu)&sup4; (Leu)&sup5; (D-Hiv)&sup8; (Leu)¹&sup0;-Ciclosporin.

10. (Thr)² (Gly)³ (Leu)&sup5; (D-Hiv)&sup8; (Leu) ¹&sup0;-Ciclosporin.

11. (8'-OH MeBmt)¹ (Thr)² (Leu)&sup5; (D-Hiv)&sup8; (Leu)¹&sup0;-Ciclosporin.

12. Verfahren zur Herstellung eines cyclischen Peptolids nach einem der vorangehenden Ansprüche, gekennzeichnet durch den Kultivierungsschritt eines Mikroorganismus, der zur Synthese dieses cyclischen Peptolids fähig ist, in Gegenwart eines Nährmediums und Gewinnung des cyclischen Peptolids.

13. Verfahren zur Herstellung eines cyclischen Peptolids nach einem der Ansprüche 3 bis 11, gekennzeichnet durch den Kultivierungsschritt eines Pilzstamms der Gattung Cylindrotrichum Bonorden, der zur Synthese dieses cyclischen Peptolids fähig ist, in Gegenwart eines Nährmediums und Gewinnung des cyclischen Peptolids.

14. Verfahren zur Herstellung eines cyclischen Peptolids nach Anspruch 6, gekennzeichnet durch den Kultivierungsschritt des Stamms NRRL 18230 in Gegenwart eines Nährmediums und Gewinnung des cyclischen Peptolids.

15. Fermentationsbrühe, die durch die Kultivierung des Stamms NRRL 18230 erhalten wurde.

16. Pharmazeutische Zusammensetzung, die ein cyclisches Peptolid nach einem der vorangehenden Ansprüche 1 bis 11 zusammen mit einem pharmazeutisch annehmbaren Verdünnungsmittel oder Träger enthält.

17. Biologische Reinkultur des Pilzstamms NRRL 18230.

18. Verfahren zur Herstellung eines cyclischen Peptolids nach einem der Ansprüche 1-11 durch Cyclisierung eines linearen Peptolids oder eines Peptids, das eine endständige Hydroxylgruppe anstelle einer endständigen Aminogruppe aufweist.

19. Verfahren zur Herstellung eines cyclischen Peptolids der Formel II, wie sie in Anspruch 3 dargestellt ist, wobei dieses Verfahren gekennzeichnet ist durch

a) Entfernen von O-Schutzgruppen von einem cyclischen Peptolid der Formel II in O-geschützter Form,

b) Cyclisierung eines geradkettigen Hydroxyundecapeptids der Formel VIII in ungeschützter Form oder an einem oder beiden Reste 1 und 2 O-geschützt , und, falls erforderlich, Durchführung des Verfahrensschritts (a),

und, falls erwünscht

c) Hydrierung eines so erhaltenen cyclischen Peptolids der Formel II, worin W für MeBmt steht unter Erhaltung des entsprechenden cyclischen Peptolids, worin W für MeBmtH&sub2; steht.