DE2728893A1

DE2728893A1 - Verfahren zur demethylierung von cholinhaltigen phospholipiden

Info

Publication number: DE2728893A1
Application number: DE19772728893
Authority: DE
Inventors: Hans Dipl Chem Dr Betzing; Guenter Dipl Chem Dr Heidemann; Dac Dipl Chem Dr Lekim
Original assignee: A Natterman und Cie GmbH
Current assignee: A Natterman und Cie GmbH
Priority date: 1977-06-27
Filing date: 1977-06-27
Publication date: 1979-01-18
Also published as: DE2728893C2; GB1552397A

Description

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Anmelder: A. Nattermann & Cie. GmbH

Nattermannallee 1, 5000 Köln 30

Titel:

Verfahren zur Demethylierüng von cholinhaltigen Phospholipiden

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Beschreibung

Cholinhaltige Phospholipide kommen in pflanzlichen und tierischen Phospholipidgemisehe» hauptsächlich in Form des Phos-^ phatidylcholins (Lecithin) und Sphiagomyelins vor* !Daneben enthalten diese handelsüblichen Phospholipide, die meist als Rohphosphatide bezeichnet werden, noch Phosphatidyläthanolamin (Kephalin), Phosphatidylinosit sowie eine Reihe anderer Begleitlipide und Phospholipide, die jedoch nur in untergeordneten Mengen vorhanden sind.

Die Phospholipide eignen sich u.a. zur Verwendung als Emulgatoren, wobei für die Verwendung als Öl-in-Wasser- bzw. Wasser-in-Öl-Emulgatoren das Verhältnis der einzelnen Phospholipide in einem Gemisch zueinander eine entscheidende Rolle spielt. Von besonderer Bedeutung ist dabei das Verhältnis von Phosphatidylcholin zu Phosphatidyl-N,N-dimethyläthanolamin. Letzteres kommt aber in natürlichen Phospholipid gemischen nur in relativ kleinen Mengen vor. Es wird daher meist entweder durch Methylierung von Phosphatidyläthanolamin oder durch die Demethylierung des Phosphatidylcholins hergestellt.

In der deutschen Patentschrift 2 226 291 ist bereits ein Verfahren zur Methylierung von Phosphatidyläthanolamin mit Hilfe von Formaldehyd und Ameisensäure beschrieben. Diese Methode ist vor allem für Rohphosphatide und kephalinreiche Phospholipidfraktionen geeignet.

In solchen Phospholipidgemischen, die besonders reich an cholinhaltigen Phospholipiden (Lecithin) sind, wie z.B.

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bestimmte alkohollösliche Phospholipid-fraktionen, kann dagegen durch eine Demethylierung von Phosphatidylcholin das Phosphatidyl-NjN-dimethyläthanolamin auf einfache Weise angereichert werden. So ist die Umwandlung des Phosphatidylcholins in das gewünschte Phosphatidyl-N^-dimethyläthanolamin unter Verwendung von Natriumthiophenolat als Demethylierungsreagenz bekannt. Diese Reaktion ist jedoch nicht nur von der Bildung einer Reihe von Nebenprodukten begleitet, sondern sie ist auch wegen der sehr unangenehmen Geruchsbelästigung durch das Natriumthiophenolat für den technischen Einsatz nicht sehr geeignet.

Es wurde nun überraschenderweise festgestellt, dass man cholinhaltige Phospholipide allein oder im Gemisch mit anderen Phospholipiden in einfacher und schonender Weise mit Diazabicyclooctan in die entsprechenden dimethyl-ierten Phospholipide überführen kann. Dabei ist es von besonderer Bedeutung, dass bei der Übertragung dieser neuen Demethylierungsmethode auf Phospholipidgemische oder kephalinhaltige Phospholipidfraktionen neben der eigentlichen Abspaltung einer Methylgruppe aus dem Phosphatidylcholin auch gleichzeitig noch eine Methylierung der äthanolaminhaltigen Phospholipide stattfindet, so dass mit diesem neuen Verfahren auch praktisch kephalinfreie Phospholipidfraktionen erhalten werden können. Durch die Wahl der Menge an Diazabicyclooctan kann die Demethylierung des Phosphatidylcholins in den Gemischen in einfacher Weise gesteuert werden, so dass vollständig oder partiell demethylierte Produkte erhalten werden.

Die Eignung des Diazabicyclooctans zur Dealkylierung quarternärer Ammoniumsalze ist zwar schon aus SYNTHESIS 1972,

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Seite 702, bekannt gewesen, dennoch muss es als überraschend angesehen werden, dass die Dealkylierungsreaktion, die ausschliesslich für quarternäre Ammoniumsalzverbindungen vorbeschrieben ist, auch zur Demethylierung der cholinhaltigen Phospholipide angewendet werden kann, da diese bekanntlich nicht in Form von Ammoniumsalzen, sondern aufgrund einer starken Wechselwirkung der basischen Cholin- mit der sauren Phosphatgruppe in einer zwitterionischen inneren Komplexstruktur vorliegen. Darüberhinaus sind diese Phospholipide wegen ihres hohen Gehalts an ungesättigten und mehrfach ungesättigten Fettsäuren im Molekül thermisch sehr instabil und unterliegen durch reaktive Stoffe einer schnellen Spaltung.

Ein zusätzlicher Überraschungseffekt liegt noch darin begründet, dass bei der erfindungsgemässen Demethylierung von kephalinhaltigen Phospholipidfraktionen und handelsüblichen Rohphosphatiden mit 1,A-Diazabicyclooctan nicht nur eine Abspaltung der Methylgruppe von cholinhaltigen Phospholipiden stattfindet, sondern auch gleichzeitig eine Methylierung der NHp-Gruppe der äthanolaminhaltigen Phospholipide (Phosphatidyläthanolamin und Phosphatidylserin) zu den entsprechenden Dimethylverbindungen erfolgt. Diese bisher nicht bekannte Methylierung der Aminogruppe durch die Wirkung des Diazabicyclooctans lässt sich durch dünnschichtchromatographische Trennung des Reaktionsgemisches auf Kieselgelplatten und Nachweis mit Ninhydrinreagenz sehr einfach belegen. Mit zunehmender Demethylierung des Phosphatidylcholins verschwindet nämlich gleichzeitig das ninhydrinpositive Phosphatidyläthanolamin und es findet eine entsprechende Zunahme des Dimethyl-phosphatidyläthanolamins statt.

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Dieses neue Verfahren ist daher in zweifacher Hinsicht von praktischer Bedeutung: 1. kann durch eine teilweise Deraethylierung der cholinhaltigen Phospholipide in handelsüblichen ölhaltigen bzw. entölten Phospholipiden durch die gleichzeitige Methylierung der äthanolaminhaltigen Phospholipide ein kephalinarmes bzw. praktisch kephalinfreies Phospholipidgemisch mit vorzüglichen Öl-in-Wasser- und Wasser-in-Öl-Eigenschaften hergestellt werden und 2. lässt sich durch Anwendung des erfindungsgemässen Verfahrens bei phosphatidylcholinangereicherten Fraktionen, z.B. alkohollösliche Phospholipide, in einfacher und auf bequeme Art ein kephalinfreies, emulgatoraktives Produkt herstellen, das in besonderer Weise für die intravenöse Anwendung brauchbar ist.

Praktisch geht man bei der Durchführung der Demethylierung des cholinhaltigen Phospholipids so vor, dass man die reinen Cholinphospholipide oder deren Gemische mit anderen pflanzlichen oder tierischen Phospholipiden, insbesondere kephalinhaltige Phospholipide, in einem inerten Lösungsmittel für Phospholipide, vorzugsweise in aromatischen oder höher siedenden aliphatischen bzw. hydroaromatischen Kohlenwasserstoffen oder in chlorierten Kohlenwasserstoffen bzw. in Dimethylformamid und Dimethylsulfoxid, löst und die Lösung nach Zugabe von 1,4-Diazabicyclooctan einige Zeit erhitzt, zweckmässigerweise bei der Siedetemperatur des betreffenden Lösungsmittels unter Rückfluss. Der Reaktionsverlauf kann ζ J3. durch Dünnschichtchromatographie auf Kieselgel mit einem Chloroform/Methanol/ 2 η Ammoniak-Gemisch (65:25:4) und Sichtbarmachung mit Chromschwefelsäure verfolgt werden. Folgende Rf-Werte können bei Verwendung dieses Gemisches bei der Entwicklung des Chromatogramms zugrunde gelegt werden:

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Phosphatidylcholin 0,3

demethyliertes Produkt 0,8

Sphingomyelin 0,2

demethyliertes Produkt 0,5

Nach Beendigung der Reaktion kann das Lösungsmittel im Vakuum unter dem Schutz eines inerten Gases abdestilliert und das Reaktionsprodukt zunächst durch Behandlung mit verdünnter wässriger Säure z.B. mit Salzsäure, oder durch Aceton vom Demethylierungsreagenz befreit und in üblicher Weise aufgearbeitet werden. Die Phospholipide können zweckmässigerweise noch einer zusätzlichen Acetonbehandlung unterworfen werden, um sehr reine Phospholipidfraktionen, die völlig frei von nicht-lipidischen Verunreinigungen sind, zu erhalten.

Das erfindungsgemässe Verfahren sei im folgenden noch anhand einiger Beispiele näher erläutert.

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Beispiel 1

1 kg chemisch reines Phosphatidylcholin aus Sojabohnen wird unter dem Schutz eines inerten Gases in 5 1 Dimethylformamid gelöst und die Lösung nach Zugabe von 600 g Diazabicyclooctan 4 Stunden unter Rückfluß in einer Stickstoffatmosphäre erhitzt. Die Beendigung der Reaktion wird durch Dünnschichtchromatographie kontrolliert. Nach dem Abdestillieren des Lösungsmittels im Vakuum wird der verbleibende Rückstand wiederholt mit kaltem Aceton behandelt. Nach dem Trocknen im Vakuum verbleiben 800 g Phosphatidyl-N,N-dimethyläthanolamin in Form einer hellgelben, plastischen Masse mit folgender Fettsäurezusammensetzung:

	12,6 %	Phosphatidylcholin vor der Demethylierung
Palmit insäure	3,8 %	12,9 %
Stearinsäure	10,2 %	3,8 %
Ölsäure	67,8 %	10,2 %
Linolsäure	5,6 %	67,9 %
Linolensäure	5,2 %

Beispiel 2

48 g Eilecithin werden in 1000 ml Dimethylformamid in der Wärme gelöst und mit 43 g Diazabicyclooctan versetzt. Das Reaktionsgemisch wird dann ca. 4 Stunden lang unter Rückfluß in einer Argonatmosphäre erhitzt. Der Reaktionsverlauf kann durch Dünnschichtchromatographie verfolgt werden. Nach Beendigung der Reaktion wird das Lösungsmittel unter Vakuum abgezogen, der Rückstand in 1000 ml Chloroform aufgenommen, die Chloroformphase zunächst mit 5 %iger wässeriger Salzsäureläsung, dann mit Wasser gewaschen, schließlich mit Natriumsulfat getrocknet und eingeengt. Ein chemisch reines Dimethylprodukt wird durch Säulenchromatographie auf Kieselsäure als Adsorbens gewonnnen. Ausbeute: 43 g Phosphatidyl-NjN-dimethyläthanolamin mit einem Phosphor-Gehalt von 3,95 %.

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Beispiel 3

1 kg ölhaltiges Sojabohnenrohphosphatid (33 % Öl, 20 % Phosphatidylcholin, 18 % Phosphatidyläthanolamin und 14 % Phosphatidylinositid) wird unter Erwärmen in einer Stickstoffatmosphäre in 2,5 1 Methylcyclohexan gelöst und die Lösung nach Zugabe von 50 g l^-Diazabicyclooctan 15 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Nach dem Abkühlen des Reaktionsgemisches auf 5 C wird das ausgefallene Diazabicyclooctan abgetrennt und dann das Lösungsmittel im Vakuum abdestilliert. Den verbleibenden Rückstand behandelt man 2 χ mit je 10 1 kaltem Aceton und trocknet anschließend das plastische Phospholipidgemisch im Vakuum. Es resultieren 980 g eines ölfreien Produktes mit folgender Zusammensetzung:

11 % Phosphatidylcholin

16 % Phosphatidyläthanolamin

30 % Phosphatidyl-NjN-dimethyläthanolamin

14 % Phosphatidylinositid

Beispiel 4

100 g einer alkohollöslichen Fraktion von ölhaltigem Sojabohnenrohphosphatid, mit 36 % Phosphatidylcholin und 8 % Phosphatidyläthanolamin, die durch einmalige Extraktion mit dem 8-fachen Volumen Äthanol bei einer Temperatur von 60 hergestellt wurde, werden in der Wärme in 300 ml Dimethylsulfoxid gelöst. Zur Lösung gibt man 3 g Diazabicyclooctan und erhitzt 15 Stunden unter Rückfluß in einer N.-Atmosphäre. Nach dem Entfernen des Lösungsmittels im Vakuum behandelt man den Rückstand mit 1 1 kaltem Aceton. Nach dem Trocknen im Vakuum erhält man 65 g eines praktisch ölfreien Phosphatidgemisches, das aus 42 % Phosphatidylcholin und 14 % Phosphatidyl-NjN-dimethyläthanolamin besteht.

Beispiel 5

1000 g eines entölten Sojarohphosphat ids mit 33 % Phosphatidylcholin, 25 % Phosphatidyläthanolamin und 21 % Phosphatidylinositid werden in 3000 ml n-Butanol durch Erwärmen gelöst. Nach Zugabe von 50 g Diazabicyclooctan wird die Lösung unter Rückfluß zum Sieden gebracht und in Gegenwart eines inerten Schutzgases

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bei dieser Temperatur 12 Stunden gehalten. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum wird der Rückstand zur Entfernung des Diazabicyclooctans mit 500 ml Aceton behandelt. Man erhält so 950 g eines Phospholipidgemisches, das aus 18 % Phosphatidylcholin, 37 % Phosphatidyl-N.N-dimethyläthanolamin und 20 % Phosphatidylinositid besteht.

Beispiel 6

200 g eines Alkoholauszuges aus entöltem Sojarohphosphat id mit 58 % Phosphatidylcholin und 22 % Phosphatidyläthanolamin, hergestellt durch Extraktion mit Äthanol bei 50 - 60 °, werden in 600 ml 1,4-Dichlorbutan gelöst. Man gibt 6 g 1,4-Diazabicyclooctan hinzu und erwärmt 10 Stunden unter Rückfluß. Nach Entfernung des Lösungsmittels im Vakuum wird dau Produkt in 600ml Petroläther (Kp. 60 - 80 ) aufgenommen und die Lösung auf + 5 abgekühlt. Nach dem Abtrennen des ausgefallenen Diazabicyclooctans wird der Petroläther im Vakuum abdestilliert. Man erhält auf diese Weise 190 g eines Phospholipids, das zu 45 % aus Phosphatidylcholin und 30 % aus Phosphatidyl-N,N-dimethyläthanolamin besteht.

Beispiel 7

2,5 g Rinderhirn-Sphingomyelin werden in 100 ml Dimethylformamid gelöst, mit 2,5 g Diazabicyclooctan versetzt und 4 Stunden unter Rückfluß erhitzt. Die Aufarbeitung des Reaktionsgemisches erfolgt analog zu Beispiel 1. Man erhält 2,1 g Ceramidphosphoryl-N,N-dimethyläthanolamin als farbloses Pulver.

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Claims

Patentansprüche

1./Verfahren zur Demethylierung von Phosphatidylcholin önd/oder Sphingomyelin, dadurch gekennzeichnet dass man Phosphatidylcholin und/oder Sphingomyelin allein oder im Gemisch mit anderen pflanzlichen oder tierischen Phospholipiden, die in aliphatischen, aromatischen sowie chlorierten Kohlenwasserstoffen und/oder Dimethylformamid gelöst sind, unter dem Schutz eines inerten Gases mit 1,4-Diazabicyclooctan unter Erwärmung, vorzugsweise bei Rückflusstemperatur des jeweiligen Lösungsmittels, behandelt.

2. Verfahren zur gleichzeitigen Demethylierung-cholinhaltiger Phospholipidgemische und Methylierung des darin vorhandenen Kephalinanteils, dadurch gekennzeichnet, dass man pflanzliche oder tierische Rohphosphatide oder Phospholipidfraktionen, die Kephalin und Phosphatidylcholin enthalten, gemäss Anspruch 1 mit 1^-Diazabicyclooctan behandelt.

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ORIGINAL INSPECTED